NO165128B - Fremgangsmaate for eliminering av falske positive resultater fra systemiske lupuserythematodes-pasienter ved bestemmelse av et atl-virusantistoff i en testproeve. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for eliminering av falske positive resultater fra systemiske lupuserythematodes-pasienter ved bestemmelse av tilstedeværelsen av et ATL-virusantistoff i en testprøve under anvendelse av ATL-assosiert antigen som skriver seg fra MT-2-celler ved hjelp av en metode valgt fra gruppen bestående av enzym-immunoassaybestemmelse, radioimmunoassaybestemmelse og passiv hemagglutinasjon, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at en testprøve hvortil et ATL-virusantigen er blitt tilsatt, anvendes som en sammen-ligningsprøve sammen med testprøven og en kontrollprøve.

Disse trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravet.

Oppfinnelsen vedrører således bestemmelse av ATL-virusanti-stof fer. Med betegnelsen "ATL-virus" menes voksent T-celle leukemivirus også forkortet som "ATLV". ATLV-virus og ATLV-virusantistoffer som bestemmes ved den foreliggende oppfinnelse er beskrevet detaljert i følgende litteratur som anvendes som referanse heri:

1) Miyoshi, I., et al., Gann, 71, 155 (1980)

2) Miyoshi, I., et al., Jap. J. Clin. Oncol., 9, (Suppl.), 485 (1979) 3) Hinuma, Y., et al.. Proe. Nat. Acad. Sei., 78, 6476

(1981)

4) Miyoshi, I., et al., Gann, 73, 399, (1982)

5) Miyoshi, I., et al., Lancet, 683 (1982)

6) Shimoyama, M., et al., Jap. J. Clin. oncol., 12, 109

(1982)

7) Ohkouchi et al., Immunohaematology, 3 (5), 267 (1983)

Behovet for bestemmelse av ATL-antivirusstoffer, en frem-gangsmåte for fremstilling av ATL-assosiert antigen nødvendig for bestemmelsen, en fremgangsmåte for bestemmelse av ATL-virusantistof fer med bruk av nevnte antigen og et reagens derfor er omhandlet detaljert i offentlig tilgjengelig japansk patentansøkning nr 62527/1984 som også anvendes som en litteraturhenvisning heri.

De ovennevnte litteraturhenvisninger indikerer at et ganske stort antall blodoverføringsdonorer bærer ATL-virus slik at der er en mulighet for at blodoverføring kan spille en viktig rolle ved transmisjon av det nevnte virus. Det er således nødvendig å bestemme ATL-virusantistoffer i serum fra donorer for å utelate ATL-virusbærere slik at man forhindrer smitte ved blodoverføring og det ér også vært ønskelig å utvikle en meget følsom fremgangsmåte for å bestemme de nevnte antistoffer og et reagens for dette.

Under disse forhold har tilgjengelig japansk patentansøkning 187861/1983 åpenbaret en fremgangsmåte for bestemmelse av ATL-virusantistoffer ved hjelp av enzymimmunoassay eller radioimmunoassay med bruk av ATL-assosierte antigenproduserende celler. Den nevnte tilgjengelige japanske patentan-søkning nr 62527/1984 har videre lært en fremgangsmåte for bestemmelse av ATL-virusantistoffer hvori et ATL-assosiert antigen fremstilt ved behandling av ATL-assosierte antigen-produserende celler med et overflateaktivt middel anvendes som et reagens derfor.

Disse ATL-assosierte antigenproduserende celler og det ATL-assosierte antigen som fremstilles ved delvis rensing av disse inneholder forskjellige ikke-spesifikke antigener ved siden av ATL-virusantigen. En bestemmelse hvori noen av disse materialer anvendes kan resultere i deteksjon av ikke bare de angjeldende ATL-virusantistoffer, men også andre ikke-spesif ikke antistoffer som f. eks antinukleære og anti-T-celle membranantistoffer. Resultatet av bestemmelsen vil således ikke alltid nøyaktig indikere nærvær av ATL-virus-antistof f er. F. eks når serum av en systemisk lupuserythematodes-pasient anvendes som en prøve vil denne, som i seg selv er negativ overfor ATL-virusantistoffer, enkelte ganger vise et positivt resultat. Det positive resultat kan tenkes å være bevirket ved en reaksjon mellom antistoffer som følger den systemiske lupus-erythematodes og en ikke-spesifikk komponent i det ATL-assosierte antigen.

For å overvinne det nevnte problem er det i japansk patentan-søkning 144.874/1983 åpenbaret en fremgangsmåte hvori et antigen, fremstilt uavhengig ved behandling av en passende ATL-virusnegativ cellestamme oppnådd f. eks ved å behandle en cellestamme avledet fra en pasient med akutt lymfoblast-leukemi, anvendes i assaybestemmelsen og det således oppnådde resultat anvendes som en sammenligning ved bedømmelsen for derved å forhindre feilaktig resultat ved assaybestemmelsen bevirket av ikke-spesifikke antistoffer. En detalj ved den nevnte metode er imidlertid at den ikke kan sikre at det ikke-spesifikke antistoff som detekteres ved hjelp av det —ATL-assosierte antigen og det antistoff som detekteres ved at det antigen som avledes fra det ATL-virusnegative cellestamme er immunologisk identiske. Det må snarere antas at de to antistoffer er forskjellige fra hverandre. Følgelig vil ikke alltid nærvær eller fravær av det sistnevnte reflekterte nærvær eller fravær at det førstnevnte og bestemmelsen av nærværet av ATL-virusantistoffer i samsvar med den ovennevnte metode er derfor ikke sikker.

Som beskrevet i det foregående er fremgangsmåten for assaybestemmelse av ATL-virusantistoffer omhandlet i den japanske tilgjengelige patentansøkning 144.874/1983 nyttig for praktisk bedømmelse av nærværet av de nevnte antistoffer, men den er ikke sikker. Under disse forhold er det søkt tilveiebragt en fremgangsmåte for nøyaktig assaybestemmelse av ATL-virusantistoffer og som et resultat er det funnet at det nevnte formål kan oppnås ved separat fremstilling av en sammenlig-ningsprøve ved å tilsette et ATL-virusantigen til testprøven og subtrahere det resultat som oppnås med kontrollprøven fra det resultat som oppnås ved å anvende testprøven. Dette er grunnlaget for den foreliggende oppfinnelse.

Det er således et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for assaybestemmelse av ATL-virusantistoffer hvor som nevnt en prøve fremstilt ved å tilsette et ATL-virusantigen til testprøven, anvendes som en sammenligningsprøve, sammen med den nevnte testprøve.

Oppfinnelsen skal nå beskrives mer detaljert.

Det ATL-assosierte antigen som opptrer i oppfinnelsens sammenheng er det såkalte voksen T-celle leukemiassosierte antigen. Mer spesifikt forekommer dette i form av antigen-proteiner eller C-type viralpartikler i ATL-assosiert antigen-produserende celler. Det reagerer spesifikt med ATL-virusantistof f er hvis disse er tilstede. Det ATL-virusasso-sierte antigen kan fremstilles ved at en antigenproduserende cellestamme som f. eks MT-2-celler som skriver seg fra humane funiske leukocytter og dannes ved hjelp av en blandet kultur med leukemiceller samlet fra perifert blod fra en voksen T-celle leukemipasient, behandles med et overflateaktivt middel. Videre beskrivelse av det ATL-assosierte antigen og fremgangsmåten for behandling av MT-2-celler med et overflateaktivt middel finnes i følgende litteraturhenvisninger: 7) Yoshida, M., et al., Proe. Nat. Acad. Sei., 79, 2031

(1982)

8) Miyoshi, I., et al., Gann, 72, 978 (1981)

9) Miyoshi, I., et al., Nature, 294, 770 (1981)

10) Japansk patentansøkning nr 169670/1982

ATL-virusantigenet som opptrer i oppfinnelsens sammenheng er et antigen som er spesielt for det nevnte virus og skriver seg fra patogene viralpartikler ved voksen T-celle leukemi. Det reagerer spesifikt med ATL-virusantistoffer hvis disse er tilstede. ATL-virusantigenet kan fremstilles ved å behandle ATL-virus, fremstilt ved å konsentrere supernatanten av et medium hvori ATL-antigenproduserende celler dyrkes etterfulgt ved rensing med et overflateaktivt middel. F. eks blir supernatanten fra et medium hvori MT-2-celler dyrkes, konsentrert og ultrasentrifugert for separering av ATL-viruset idet det

således samlede ATL-virus ytterligere underkastes sukrosekon-sentrasjonsgradient-ultrasentrifugering for fraksjonering og

antigenpositive fraksjoner blant disse dialyseres og gir renset ATL-virus. Det rensede ATL-virus oppnådd på denne måte behandles ved å tilsette natriumdeoksycholat og dialyseres til å gi det tilsiktede ATL-virusantigen.

De produserende celler for fremstilling av det ATL-assosierte antigen og cellene for fremstilling av ATL-viruset og ATL-virusantigenet er ikke nødvendigvis identiske. Det er imidlertid ønskelig at de to antigener som beskrevet i det foreågende ved den foreliggende oppfinnelse fremstilles fra de samme produserende celler ettersom ATL-virusantigenet i samsvar med den foreliggende oppfinnelse anvendes for fremstilling av en sammenligningsprøve ved assaybestemmelsen ved bruk av det ATL-assosierte antigen.

Behandlingen av de ATL-antigenproduserende celler eller ATL-viruset til å gi det ATL-assosierte antigen henholdsvis ATL-virusantigenet kan gjennomføres på en hvilken som helst måte. F. eks kan en behandling med et overflateaktivt middel som natriumdeoksycholat, oktylfenoksypolyetoksyetanol og polyoksyetylen-(10)-oktylfenyleter gjennomføres. Behandlingen med et overflateaktivt middel"er beskrevet detaljert i japansk tilgjengelig patentansøkning 62527/1984.

Assaybestemmelsesfremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen skal nå beskrives detaljert.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen gjennomføres ved hjelp av en metode valgt fra gruppen bestående av enzym-immunoassaybestemmelse, radioimmunoassaybestemmelse og passiv hemagglutinasjon. De generelle prosedyrer ved disse metoder er i og for seg godt kjent. F. eks kan fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse ved hjelp av en enzym-immunoassaybestemmelse gjennomføres på følgende måte.

Hele assaybestemmelsessystemet omfatter en fast fase, et ATL-assosiert antigen, et ATL-virusantigen, en prøve, et antihuman IgG antistoff som skal merkes, et enzym og et substrat. Eksempler på fastfasen er en skål i en mikrotiter-plate for enzymimmunoassaybestemmelse eller en glasskule. Før assaybestemmelsen oppløses det ATL-assosierte antigen i en 0,15 M fosfatbuffer-fysiologisk saltløsning innført i f. eks en polystyrenskål for enzym-immunoassaybestemmelse og settes bort over natten ved 4°C for derved å belegge overflaten av den faste fase med en ATL-assosierte antigen.

Eksempler på antihumant IgG antistoff som merkes er antihumant IgG monoklonalt antistoff fra geit og antihumant Fc monoklonalt antistoff fra mus. Eksempler på enzym er alkalifosfatase-glukoseoksidase, peroksidaseo g (J-galaktosi-dase. Før assaybestemmelsen kan antistoffet som skal merkes kombineres med enzymet ved bruk av et bindemiddel som f. eks glutaraldehyd til å danne et konjugat slik at et av reagen-sene for assaybestemmelsesprosessen i samsvar med oppfinnelsen tilveiebringes.

Substratet kan eventuelt velges i avhengighet av det enzym som skal anvendes. F. eks når alkalifosfatase velges som enzym kan p-nitrofenylfosfat eller lignende substrater anvendes.

De andre elementene i hele assaybestemmlsessystemet enn prøven og ATL-virusantigenet som omhandlet i det foregående skal illustrere foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen.

Prøven er oftest tilgjengelig som en serumprøve oppnådd

f. eks fra blodoverføring, men en hvilken som helst prøve kan anvendes uansett formen eller opprinnelsen av denne. Prøven kan tilsettes assaybestemmelsessystemet som sådant. Alter-nativt kan den fortynnes med f. eks normalt kaninserum (NRS) til en passende konsentrasjon før assaybestemmelsen.

ATL-virusantigenet kan tilsettes assaybestemmelsessystemet som sådant selv om det kan være ønskelig å fortynne det til en passende konsentrasjon med NRS. Det bør imidlertid unngås at det fortynnes i for sterk grad da dette kan gi usikre resultater. Det er følgelig nødvendig å bestemme det optimale fortynningsforhold ved bruk av ATL-virusantistoff-positiv serum. F. eks var proteinkonsentrasjonen av ATL-virusantigen fremstilt i forsøkseksempel 1 som angitt i det følgende 1,23 ved 0<Do>o„ . I dette tilfelle var det optimalt å fortynne

280 nm

prøven 16 ganger med NRS. To prøver, det vil si testprøven og sammenligningsprøven assaybestemmes. Den sistnevnte fremstilles ved å tilsette ATL-virusantigenet til den først-nevnte . Det er imidlertid generelt nødvendig å fortynne hver prøve til en passende konsentrasjon med f. eks NRS for å lette assaybestemmelsen og nedsette feilkilder til et minimum. I dette tilfelle bør ikke bare testprøven og sammenligningsprøven, men også en kontrollprøve omfattende bare løsningsmidlet fremstilles og assaybestemmes.

Assaybestemmelsen kan gjennomføres ved hjelp av vanlige metoder ved enzym-immunoassaybestemmelse. Således innføres hver av testprøvene, sammenlignings- og kontrollprøvene i en skål med et ATL-assosiert antigen og inkuberes deri. Et antistoff merket med et enzym, f. eks antihumant IgG fra geit/alkalifosfatasekonjugat tilsettes deretter og inkuberes deri. Et substrat, f. eks p-nitrofenylfosfat tilsettes og inkuberes deri og mengden av spaltet substrat bestemmes med et spektrofotometer.

Endelig beregnes represjonsforholdet (%) ved bruk av data A, B og C oppnådd fra henholdsvis testprøven, sammenlignings- og kontrollprøvene.

Represjonsforholdet (%) = (A - B)/(A - C) x 100.

Det er mulig a bestemme ATL-virusantistoffer i en testprøve ved å bestemme represjonsforholdet (%) med bruk av en prøve inneholdende en kjent mengde ATL-virusantistoffer og trekke en kalibreringskurve for represjonsforholdet (%).

Det er videre mulig nøyaktig og utvetydig å bestemme nærværet av ATL-virusantistoffer i en prøve (testserum) basert på et kriterium om at prøven er positiv med hensyn til ATL-virusantistoff når represjonsforholdet er 50 % eller mer, mens den er negativ når represjonsforholdet er mindre enn 50 %.

Ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er det mulig nøyaktig å skjelne mellom ATL-virusantistoff-positive og negative serum.

Ved den foreliggende oppfinnelse kan det fordelaktig anvendes et reagens som hovedsakelig omfatter et ATL-assosiert antigen og et ATL-virusantigen. Et slik reagens kan anvendes ved hvilken som helst av metodene enzym-immunoassaybestemmelse, radioimmunoassaybestemmelse og passiv hemagglutinasjon.

F. eks kan reagenset praktisk anvendes ved enzym-immunoassaybestemmelse på følgende måte. Reagenset anvendes i form av en kombinasjon av et ATL-assosiert antigen og et ATL-virusantigen som sådant eller et sette omfattende et til fire elementer vilkårlig valgt blant et ATL-assosiert antigen og et ATL-virusantigen, en fast fase, et antistoff som skal merkes, et enzym og et substrat. Når settet omfatter en fast fase kan denne faste fase belegges med det ATL-assosierte antigen. Når settet omfatter et antistoff som skal merkes og et enzym kan disse to materialer være i form av en konjugat, det vil si et merket antistoff. Det bemerkes også at settet ytterligere kan omfatte en passende buffer eller NRS for å lette assaybestemmelsen. For ytterligere illustrering av oppfinnelsen gis følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

En 0,15 M fosfatbuffer fysiologisk saltløsning (pH 7,2) ble tilsatt i 2,4 x IO<7> MT-2-celler og blandingen ble sentrifugert for å separere cellene som så ble samlet. 5 ml av en veronalbuffer-oppløsning (pH 7,5, u = 0,145) inneholdende 0,2% natriumdeoksycholat ble tilsatt dertil og den oppnådde blanding ble omrørt med et røreverk ved 4°C i fire timer og deretter sentrifugert ved 10.000 omdreininger pr minutt i 30 minutter. Supernatanten ble fylt i et dialyserør, dialysert mot en 0,15 M fosfatbuffer fysiologisk saltløsning ved 4°C i to døgn og deretter sentrifugert ved 10.000 omdreininger pr minutt i 30 minutter. Den således oppnådde supernatant ble beregnet som en supernatant inneholdende et ATL-assosiert antigen. OD28Q-verdien for den ovennevnte supernatant var 15/ml.

Det oppnådde serum inneholdende det ATL-assosierte antigen ble fortynnet med 0,15 M fosfatbuffer fysiologisk saltløsning til å gi en OD28Q-verdi på 0,4. 150 ul porsjoner av opp-løsningen ble innført i polystyrenenzym-immunoassaybestem-melsesskåler.

Hver skål fikk stå over natten ved 4°C og ble så tømt og vasket med avionisert vann. Den således preparerte skål ble kombinert med et antihuman IgG antistoff fra geil/alkalifos-fatasekonjugat, p-nitrofenylfosfat og et ATL-virusantigen ti å danne et sett. Dette sett var et reagens for enzym-immuno-assaybestemmelsen. For å lette assaybestemmelsen omfattet settet NRS, en 0,9 % natriumkloridoppløsning og 1 N NaOH.

ATL-virusantigenet ble fremstilt som følger.

3 1 av supernatanten av et medium hvori MT-2-celler var dyrket ble sentrifugert ved 10.000 omdreininger pr minutt i 30 minutter for å samle supernatanten som deretter ble konsentrert og sentrifugert under 10.000 g i 2 timer. ATL-virus ble samlet som et bunnfall. Bunnfallet ble så grundig suspendert i 4 ml av en 0,01 M tris-hydrokloridbufferopp-løsning (pH 7,5) inneholdende 0,15 M NaCl, 0,002 M EDTA og 0,1 NaN3 og den oppnådde suspensjon ble sentrifugert for samling av supernatanten som et rått viralt konsentrat. 45 ml av en sukrose-konsentrasjonsgradientoppløsning (15 - 60 vekt%) ble fremstilt i et nitrocelluloserør og 2 ml av det ovennevnte rå virale konsentrat ble laminert derpå ot ultrasentrifugert ved 22.000 omdreininger pr minutt i 15 timer med en RPS-25-2 rotor (Hitachi). Deretter ble 50 dråpers (ca 2 ml) porsjoner av eluenten samlet fra bunnen av røret. ATL-virus i hver fraksjon ble assaybestemt ved enzymimmunoassaybestemmelse hvori humane ATLA-viruspositive fraksjoner ble kombinert og dialysert mot en 0,1 M tris- hydrokloridbufferoppløsning (pH 7,5) inneholdende 0,15 M NaCl, 0,0002 M EDTA og 0,1 % NaN3 til å gi en 1,15 g/ml av en ATL-virusoppløsning. Etter fullført dialyse ble natriumdeoksycholat tilsatt dertil til å gi en konsentrasjon på 0,2 % og den oppnådde blanding vie omrørt ved 4°C i 30 minutter. Den ble deretter dialysert mot en 0,01 M tri-hydroklorid-bufferoppløsning (pH 7,5) inneholdende 0,15 M NaCl, 0,002 M EDTA og 0,1 % NaN3 for å fjerne natriumdeoksycholat og ga på denne måte et ATL-virusantigen. således ble det samlet 35 ml av ATL-virusantigenet inneholdende 1,23 protein ved ODo<on>

& o u nm

EKSEMPEL 2

Antihumant IgG antistoff fra geit eller antihumant IgG (Fc) antistoff fra mus ble oppløst i en 0,05 M fosfatbufferopp-løsning (pH 7,5) til å gi en proteinkonsentrasjon på 1 mg/ml. Til 10 ul av oppløsningen oppnådd på denne måte ble i rekkefølge tilsatt 10 ul av 125I_Na med med 1 mei og 10 ul av en oppløsning fremstilt ved å tilsette 1,5 mg/ml kloramin T til den foregående fosfatbufferoppløsning og den oppnådde blanding ble omrørt i 30 sekunder. Deretter ble 100 ul av en oppløsning fremstilt ved å oppløse 2 mg/ml natriumhydrogen-metasulfat i den ovennevnte fosfatbufferoppløsning tilsatt dertil for derved å stanse reaksjonen. 100 ul av en opp-løsning fremstilt ved å oppløse 10 mg/ml kaliumjodid i den nevnte bufferoppløsning ble tilsatt til reaksjonsblandingen og blandingen ble deretter underkastet gelfiltrering med

125

"Sephadex G-50" for å separere den I-merkede substans fra

■''^I. Den ^^I-merkede substans fremviste en spesifikk radioaktivitet på omtrent 5 til 20 uCi/ug.

Denne <125>I-merkede substans ble kombinert med en skål og et ATL-virusantigen begge fremstilt på samme måte som i eksempel 1 til å gi et sett som var tilgjengelig ved radioimmunobe-stemmelse.

EKSEMPEL 3

Saueblod ble sentrifugert ved 2.000 omdreininger pr minutt i 10 minutter fem ganger i et rør med bruk av en fysiologisk saltoppløsning for å vaske erytrocyttene deri. Til erytrocyttene ble tilsatt en 0,15 M fosfatbuffer-fysiologisk saltoppløsning (7,5) til å gi en konsentrasjon på 5 %. En glutaraldehydoppløsning inntilt til en konsentrasjon på 2,5 % med den nevnte fosfatbuffer-fysiologiske saltoppløsning ble tilsatt til den ovennevnte erytrocyttsuspensjon i en volummengde på 1 femtedel. En blanding fikk reagere ved romtemperatur under omrøring i omtrent 5 timer for derved å fiksere erytrocyttene. Deretter ble oppløsningen sentrifugert til å gi fikserte erytrocytter som så ble vasket med en fysiologisk saltoppløsning flere ganger med bruk av en sentrifuge. De fikserte erytrocytter ble deretter innstilt til 5 % suspensjon med den nevnte fosfatbufferoppløsning og den samme mengde av en garvesyreoppløsning innstilt til en konsentrasjon på 5 mg/dl med den nevnte fosfatbuffer-fysiologiske saltoppløsning tilsatt dertil etterfulgt av omrøring i 30 minutter. Den således oppnådde oppløsning ble sentrifugert til å gi fikserte erytrocytter behandlet med tannin som ble ytterligere sentrifugert flere ganger med bruk av en fysiologisk saltoppløsning. Den nevnte fosfatbufferopp-løsning ble tilsatt til de oppnådde fikserte erytrocytter behandlet med tannin til å gi en 5 % erytrocyttsuspensjon.

Den således oppnådde erytrocyttsuspensjon ble blandet med den samme mengde av en oppløsning fremstilt ved å oppløse supenatanten inneholdende et ATL-assosiert antigen som fremstilt i eksempel 1 med den nevnte fosfatbuffer-fysiologiske saltoppløsning til å gi en proteinkonsentrasjon på omtrent 5 mg/ml og blandingen ble sensitivert ved omrøring ved romtemperatur i 60 minutter. Den oppnådde oppløsning ble sentrifugert til å gi sensitiverte erytrocytter som så ble vasket med en fysiologisk saltoppløsning ved sentrifugering flere ganger. Til de sensitiverte erytrocytter oppnådd på denne måte ble det tilsatt en fosfatbuffer-fysiologisk saltoppløsning inneholdende 2 % NRS til å gi en 7 % suspensjon. De sensitiverte erytrocytter ble kombinert med ATL-virusantigenet som fremstilt i eksempel 1 til å gi et reagens for passiv hemagglutinasjon.

EKSEMPEL 4

En serumprøve ble bedømt som ATL-virusantistoffpositiv eller negativ med bruk av reagenset fremstilt i eksempel 1.

100 ul porsjoner av NRS og en ATL-virusantigenoppløsning som ble fremstilt ved 16 gangers fortynning av ATL-virusantigenet med NRS som vist i eksempel 1 ble hver for seg innført i testrør. 20 ml av serumprøven ble innført i hvert rør. Den førstnevnte ble referert til som testprøven mens den sistnevnte ble benevnt som en sammenligningsprøve. Separat ble NRS som sådant anvendt som en kontrollprøve.

Hver prøve ble grundig omrørt og fikk stå ved 37°C i 1 time eller ved 4°C over natten. Deretter ble 100 ul av hver prøve innført i en belagt skål som vist i eksempel 1 og inkubert ved 37°C i 60 minutter. Etter fullført inkubasjon ble en 0,9% natriumkloridoppløsning tilsatt dertil for å vaske ut ureagert substans og 100 ul av en antihumant IgG fra geit/- alkalifosfat-konjugatoppløsning ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Etter fornyet inkubasjon ved 37°C i 60 minutter ble en 0,9 % natriumkloridoppløsning tilsatt dertil for å vaske ut ureagert substans og 100 ul p-nitrofenylfosfatopp-løsning ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Blandingen ble omsatt ved 37°C i 30 minutter og deretter ble 100 ul 1 N NaOH tilsatt dertil for å stanse reaksjonen. Tilslutt ble den optiske densitet av hver prøve bestemt ved 405 nm. Den optiske densitet av hver testprøve ble omtalt som A, den optiske densitet av sammenligningsprøven som B mens den optiske densitet av kontrollprøven ble omtalt som C.

Represjonsforholdet (%) ble beregnet fra A, B og C i henhold til følgende ligning:

Represjonsforhold (%) = (A - B)/(A - C) x 100

Når represjonsforholdet er 50 % eller mer er serumprøven positiv med hensyn til ATL-virusantistoffer, mens serumprøven er negativ når represjonsforholdet er lavere enn 50 %.

(3) Virkning av oppfinnelsen

For ytterligere å illustrere virkningen av oppfinnelsen anføres følgende forsøkseksempler.

FORSØKSEKSEMPEL 1

Som vist i tabell 1 ble serumprøver nr 1 - 11 fremstilt. Det var blitt bekreftet at nr 1 - 5 og 9 - 11 var positive med hensyn til ATL-virusantistoffer ved immunofluoroscerende antistoff-assaybestemmelse. Blant disse serum var nr 6 - 8 normale humanserum (NHS) mens nr 9 - 11 var avledet fra systemiske lupuserythematodespasienter.

Hver serumprøve ble assaybestemt på den samme måte som beskrevet i eksempel 4 og represjonsforholdet (%) derav ble beregnet fra A, B og C for derved å bedømme om prøven var positiv eller negativ med hensyn til ATL-virusantistoffer i samsvar med prosedyren beskrevet i eksempel .4. Tabell 1 viser resultatene. Tabell 1 indikerer at assaybestemmelsesmetoden i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kan gi en utvetydig og nøyaktig bedømmelse av ATL-virusantistoffer. Det er spesielt bemerkelsesverdig at serumprøver nr 9 - 11, som faktisk er negative overfor ATL-virusantistoffer, misforstått ble ansett som positive på en konvensjonell basis hvor bedøm-melsen bare baseres på A mens fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse basert på represjonsforholdet gir korrekt bedømmelse og klart skjelner resultatene fra virkelig positive resultater som vist i tabell 1.

Dette er en karakteristisk fordel ved den foreliggende oppfinnelse.

FORSØKSEKSEMPEL 2

For å illustrere fremgangsmåten for å bestemme det optimale fortynningsforhold av et ATL-virusantigen gis følgende eksempel.

ATL-virusantigenet som oppnådd ved forsøkseksempel 1 ble fortynnet 2n<->ganger (det vil si 2 til 128 ganger) med 100 ul NRS. Separat NRS sådant ble fremstilt. Til hver prøve ble tilsatt 20 ul human ATL-virusantistoffpositivt serum og blandingen ble inkubert ved 37°C i en time eller ved 4°C over natten. Deretter ble 100 ul av reaksjonsblandingen innført i en belagt skål av reagenssettet som vist i eksempel 1 og OD-verdien av sammenligningsprøven, dvs B, ble bestemt i

Claims (1)

1. henhold til prosedyrene som ble beskrevet i eksempel 4. C-verdien for hver NRS anvendt ved fortynningen ble bestemt i henhold til prosedyrene som vist i eksempel 4. Tabell 2 viser resultatet. NRS i fortynningsforholdspalten i tabell 2 referer til normalt kaninserum anvendt som kontroll som er negativ med hensyn til ATL-virusantistoffer. Tabell 2 indikerer at represjonen som skyldes ATL-virusantigenet oppnår likevekt og gir konsistente data ved 16 gangers fortynning. PATENTKRAV Fremgangsmåte for eliminering av falske positive resultater fra systemiske lupuserythematodes-pasiehter ved bestemmelse av tilstedeværelsen av et ATL-virusantistoff i en testprøve under anvendelse av ATL-assosiert antigen som skriver seg fra MT-2-celler ved hjelp av en metode valgt fra gruppen bestående av enzym-immunoassaybestemmelse, radioimmunoassaybestemmelse og passiv hemagglutinasjon,karakterisert ved at en testprøve hvortil et ATL-virusantigen er blitt tilsatt, anvendes som en sammenligningsprøve sammen med testprøven og en kontroll-prøve.