NO169180B - Fremgangsmaate til fremstilling av l-tert-leucin og l-fosfinotricin ved transaminering - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av L-tert-leucin og L-fosfinotricin.

Optisk aktive, ikke-protelnogene aminosyrer har stor betyd-ning på grunn av deres kjente eller potensielle biologiske aktivitet. Noen anvendes med resultat av det farmasøytiske området, som L-dihydroksyfenylalanin (L-dopa) eller a—metyl-dopa, eller finner anvendelse i plantebeskyttelse, som fosfinotricin. Andre er forstadier for farmasøytika, som D-fenylglycin eller g<->p-hydroksyfenylglycin ved fremstillingen av de semisyntetiske penicilliner Ampicillin og Amoxycillin. De kan også være verdifulle forstadier for "fremstillingen av finkjemikalier. I den asymmetriske syntese av aminosyrederivater har spesielt også tertiær-leucin funnet inngang [U. Schollkopf, "Pure and Appl. Chem.", 55 1799-1806,

(1983)].

De ikke-proteinogene optisk aktive aminosyrer fremstilles fortrinnsvis bare på kjemisk måte. Derved er det uheldig at det ikke kan arbeides stereoselektivt og man har fått racematet som sluttprodukt. Enzymatiske fremgangsmåter har derimot meget ofte den fordel at fra enkelte fremstillbare forstadier kan det selektivt syntetiseres ved hjelp av et enzymtrinn en chiral forbindelse. Dette er spesielt fordelaktig når bare en av de to stereomere forbindelser er biologisk aktive.

Syntesen av naturlige, såkalte proteinogene aminosyrer ved biotransformasjon med transaminaser er i og for seg kjent. I EP 152 275 omtales en fremgangsmåte til fremstilling av fenylalanin ved transaminering med hjelp av en genetisk modifisert mikroorganisme, som utmerker seg ved overproduk-sjon av aminotransferase. Ifølge EP 135 846 foregår fremstillingen av naturlige L-aminosyrer således at cx-ketosyrer omsettes med L-asparaginsyrer som aminogruppedonatorer i nærvær av en transaminase, som isoleres fra E. coli. Det oppstår de til a-ketosyren svarende L-aminosyrer samt oksalacetatet av asparaginsyren.

Seleksjonen og mutasjonen av mikroorganismer fra rekken E. coli, Paracoccus denitrificans, Torula, Rhodotorula og Streptomyces til fremstilling av L-fenylalanin fra fenylpyrodruesyre med forbedret utbytte vises i DE 3 423 936.

Ikke naturlig forekommende, såkalte ikke-proteinogene, aminosyrer ble hittil Ikke fremstilt ved enzymatisk biotransformasjon.

Det er nu funnet at syntesen av de ikke-proteinogene aminosyrer L-tert-leucin og L-fosfinotricin kan gjennomføres ved meget gode utbytter ved hjelp av transaminering. Dette er for så vidt overraskende da det riktignok var kjent at det med transaminaser kunne syntetiseres forskjellige naturlige proteinogene aminosyrer på grunn av enzymenes spesifitet, men at det Imidlertid ikke kunne ventes at ikke-proteinogene aminosyrer kunne fremstilles med ikke-naturlig forekommende a-ketosyrer som forstadier på denne måte. Derfor er det overraskende at de tilsvarende forstadier, på tross av deres hydrofobe rester som ikke forekommer i forstadiene til naturlige aminosyrer, tolereres av transaminasens aktive sentrum og omsettes.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av L-tert-leucin og L-fosfinotricin og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at 3,3-dimetyl-2-okso-butansyre og (3-karboksy-3-okso-propyl )-metylfosfinsyre henholdsvis saltene av disse forbindelser, transamineres ved hjelp av mikroorganismer, med celleekstrakter, isolerte samlede proteiner eller med rensede transaminaser, i nærvær av aminosyrer som aminogruppedonatorer, idet det anvendes aminogruppedonatorer og a-ketosyrer i forholdet 1:1 til 5:1, hvorved transamineringen gjennomføres ved en pH-verdi innen området 5 til 9.

Oppfinnelsen skal i det følgende beskrives nærmere.

Enzymer av tallrike organismer, for eksempel fra mikroorganismer, planter og dyriske organer, som svinehjerte, er i stand til å omdanne a-ketosyrer ved transaminering til naturlige L-aminosyrer. Disse organismer henholdsvis deres enzymer kan anvendes ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis arbeider man imidlertid med mikroorganismer som har en transaminase som for eksempel mikroorganismer av slektene Paracoccus, Alkaligenes, Rhizobium, Pseudomonas, Serratia, Agrobacterium, Streptomyces samt enterobakterier. Spesielt fordelaktig er mikroorganismer som for eksempel Alicaligenes faecalis DSM 4115, Alcaligenes denitrificans DSM 4114, Pseudomonas paucimobilis DSM 4120, Pseudomonas spee. DSM 4119, Serratia plymuthica DSM 4116, Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli DH1, Escherichia coli ATCC 11303, Enterobacter agglomerans DSM 4122, Enterobacter spee. DSM 4121, Paracoccus denitrificans DSM 65, Streptomyces hygro-scopicus og Streptomyces viridochromogenes samt 3 jordisolater DSM 4113, DSM 4117 og DSM 4118. Disse mikroorganismer ble, hvis de var fritt oppnåelige eller var beskrevet slik at de kunne reproduseres, deponert ved Deutschen Sammlung fur Mikroorganismen (DSM).

Man kan få høyere enzymaktiviteter når man seleksjonerer stammer som er resistente ovenfor fosfinotricin eller nytter fosfinotricin som eneste nitrogenkilde, for eksempel Alcaligenes faecalis DSM 4115, Agrobacterium tumefaciens samt jordisolatet DSM 4113. Dette er fordelaktig, imidlertid ikke ubetinget nødvendig. Likeledes kan det, ved seleksjon og mutasjon på i og for seg kjent måte, mot økende mengder av 3,3-dimetyl-2-okso-butansyre, fenylpyrodruesyre henholdsvis (3-karboksy-3-okso-propyl)-metylfosfinosyrer eller deres salter i dyrkningsmediet, for de videre arbeider utvelges mikroorganismer som på grunn av deres adaptasjon til a—ketosyren gjennomfører transaminerIngen i bedre utbytter. 3,3-dimetyl-2-okso-butansyre henholdsvis deres salter er lett tilgjengelige ved forsåpning av trimetyleddiksyre i nærvær av tionylklorid og KCN efter klassiske metoder. Fremstillingen av (3-karboksy-3-okso-propyl)-metylfosfinsyre henholdsvis deres salter foregår likeledes efter kjente metoder (Hans Beyer, "Lehrbuch der organischen Chemie", S. Hirzel Verlag, Stuttgart).

Gode utbytter oppnås også når det anvendes genteknisk manipulerte mikroorganismer i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Spesielt foretrekkes at det arbeides med E. coli ATCC 11303, som ble transformert med et tyrB-gen henholdsvis ilvE-genholdig plasmid, idet tyrB-genet koder for den aromatiske transaminase og ilvE for den alifatiske transaminase i E.coli. Slike manipulerte stammer kan for eksempel fremstilles efter de tyske søknader P 36 31 829.9 og P 36 36 722.2.

Transamineringen kan foregå samtidig med kultiveringen, idet det da fortrinnsvis arbeides med mikroorganismer som er resistente mot fosfinotricin, for eksempel Alcaligenes faecalis DSM 4115 og Agrobacterium tumefaciens. Mikroorganismene dyrkes imidlertid fordelaktig i et for deres vekst optimalt næringsmedium under tilsvarende gunstige temperatur-og luftningsbetingelser inntil en tørrvekt på ca. 4 til 60 g/l næringsoppløsning. De for den respektive mikroorganisme gunstige betingelser er enten kjent for fagfolk eller kan fastslås I enkle forforsøk. Cellene anvendes derefter i næringsoppløsningen eller adskilt fra næringsoppløsningen til aminering av a-ketosyren. TransaminerIngen kan gjennomføres med hele eller også med oppsluttede celler, idet de vanlige oppslutningsmetoder anvendes. Det er likeledes mulig å gjennomføre transamineringen med celleekstrakter, isolerte samlede proteiner samt rensede transaminaser. Av praktiske grunner, for eksempel økonomiske grunner, arbeides det imidlertid fortrinnsvis med intakte celler. Imidlertid kan isoleringen av transaminasene på grunn av en lengere levetid av enzymet samt en bedre regulerbarhet av reaksjonen likeledes være fordelaktig. Det er videre mulig å anvende mikroorganismene eller enzymene i fiksert form. For fikse-ringen kommer de kjente fremgangsmåter i betraktning, fortrinnsvis fremgangsmåtene ifølge DE-OS 32 37 341 og 32 43 591.

Mikroorganismene henholdsvis det isolerte enzymsystem suspenderes i den foretrukne utførelsesform i en fysiologisk buffer, således at deres transaminaseaktivitet ikke påvirkes nevneverdig negativt under tilsetning av cx-ketosyren og aminogruppedonatoren. Alt efter mengden av mikroorganismene kan den til blandingen satte enzymatiske aktivitet i form av mikroorganismer eller av det isolerte enzymsystem svinge innen vide områder. Hensiktsmessig ligger den mellom 10 til 20.000 jjmol/mln.l. Fortrinnsvis inneholder blandingen cellemengder med en enzymaktivitet på 1500-2000 pmol/min.l.

Som aminogruppedonatorer anvendes aminosyrer. Hvilke aminosyrer som fordelaktig anvendes er sterkt avhengig av mikroorganismen henholdsvis det isolerte enzymsystem, hvilket imidlertid kan fastslås I korte forforsøk. Egnet er for eksempel valin, leucin, isoleucin, metionin, tyrosin og fenylalanin, spesielt asparagin, asparaginsyre, glutamin, glutaminsyre og glycin. Disse aminosyrer anvendes i L-formen, da bare denne utnyttes ifølge oppfinnelsen som frie syrer eller egnede salter (tilsvarende det anvendte medium). Til fremstilling av L-tert-leucin anvendes det 3,3-dimetyl-2-okso-butansyre, mens det for fremstillingen av L-fosfinotricin anvendes (3-karboksy-3-okso-propyl)-metylfosfinsyre som a-ketosyre. Også deres salter kan anvendes, idet det selvsagt velges ioner som ikke nevneverdig påvirker trans-aminaseaktiviteten negativt. Foretrukket er natrium-, kalium-og ammoniumsalter. Aminogruppedonatoren tilsettes I ekvi-molare mengder henholdsvis i overskudd til cx-ketosyren. Forhold på 1:1 til 5:1, fordelaktig 1:1 til 2:1, har vist seg egnet.

Tilsetningen av reaksjonskomponentene til reaksjonsblandingen kan foregå som oppløsning i vann eller ved tilsetning av de faste stoffer samtidig. Foretrukket er imidlertid en trinnvis henholdsvis kontinuerlig tilsetning i mengder på 0,1-4,596, spesielt 0, 2- 2%, beregnet på vekten av reaksjonsblandingen over et tidsrom på 1-90 timer, fortrinnsvis 2-40 timer.

Det arbeides fordelaktig ved en pH-verdi mellom 5 og 9, spesielt mellom 7 og 8,5. Det er dessuten hensiktsmessig å gjennomføre transamineringen i et temperaturområde på 10-65°C, spesielt 20-50°C. Ved lavere temperaturer forløper enzymreaksjonen stadig langsommere, mens enzymet desaktiveres ved høyere temperaturer.

Den gunstigste fremgangsmåte avhenger av den respektive mikroorganisme og kan lett fastslås i enkle forforsøk.

Det har spesielt vist seg gunstig å permeabilisere mikroorganismene før henholdsvis under transamineringsreaksjonen. Dette kan foregå ved tilsetning av egnede stoffer som toluen, cetyltrimetylammoniumbromid, dimetylsulfoksyd og så videre, til inkubasjonsmediet.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler. Prosentangivelsene er på vektbasis, hvis intet annet er angitt.

Eksempel 1

Dyrking og opparbeidelse av mikroorganismene.

De nevnte deponerte og fritt tilgjengelige bakterier ble dyrket i 400 ml væskekulturer i LB-medium [Luria-Bertani-Medium: 10 g Bacto-Trypton/5 g Bacto-gjær-ekstrakt/10 g NaCl pr. liter, (pH 7,5)] eller M9-minimalmedium [6 g Na2HP04/3 g KH4/0,5NaCl/l g NH4/Cl/2 ml 1 M MgS04 + 10 ml 20* glukose + 0,1 ml 1 M CaCl2 + 1 ml 1% vitamin Bl (tiamin) pr. liter (pH 7,4)] ved 30°C (alle bakterier foruten E. coli) henholdsvis 37"C (E. coli, DH1) natten over.

Derefter ble bakteriene frasentrifugert og cellepelletene vasket flere ganger i 10 nM Na2HP04, 10 mM NaCl (pH = 7,0)

(vaskebuffer) og til slutt suspendert i 5 ml vaskebuffer pr. 3 g cellepellet. Cellene ble oppsluttet ved 5x1 min. ultralydbehandling, og cellefragmentet derefter frasentrifugert. Det således fremstilte lysat-supernatant kunne oppbevares flere måneder ved -20°C.

Eksempel 2

Proteinisolering.

Til proteinisolering ble hver gang 5 ml av lysat-supernatant oppfylt med vaskebuffer til 50 ml og proteinene utfelt med tilsetning av ammoniumsulfat til 65*. Efter frasentrifuge-ringen over 15 minutter ved 10.000 g ble proteinpelletene resuspendert i hver gang 5 ml mM Na2HP04 (pH 7,0) 1 mM EDTA, 2* glycerol, 1 mM ditiotreitol (DTT). Denne suspensjon kan likeledes oppbevares ved -20°C. For å oppnå en bedre renseeffekt ble proteinene delvis utfelt to ganger med ammoniumsulfat.

Proteinbestemmelser ble utført efter biuret-metoden. Proteininnholdet i de efter ovennevnte protokoll gjennomførte prepareringer lå for det meste mellom 5 og 10 mg/ml. Til partiell rensing av transaminasen fra Alcalaigenes faecalis DSM 4115 og fra DSM 4113 ble proteinene felt ut fraksjonert med 25* til 75* ammoniumsulfat, henholdsvis tilsatt i 10* trinn, og enkeltfraksjonene undersøkt på transaminaseaktivitet (se nedenfor). Proteinfraksjonene med den største spesifikke aktivitet ble bragt på en Sephadex G 100-gel-filtreringssøyle og eluert med 10 mM Na2HP04 (pH 7,0). Eluat-fraksjonene med den høyeste spesifikke transaminaseaktivitet ble konsentrert ved fornyet ammoniumsulfatutfelling og tatt opp i 5 mg/ml i 10 mM Na2HP024 (pH 7,0), 1 mM EDTA, 2* glycerol, 1 mM DTT. Molekylvekten av ("Sephadex G 100) polydekstransøylefraksjonene ble bestemt ved sammenligning med molekylvekt-standard-proteiner. Renheten av de isolerte transaminasefraksjoner kunne undersøkes ved elektroforese av proteinprøver i 10*-ig SDS/polyakrylamid-geler.

Eksempel 3

Fosfinotricin-syntese-prøver i væskekulturer.

Det ble dyrket 5 ml kulturer av bakteriestammene I LB-medium med 3 g/l (20 mM) L-glutaminsyre som eneste N-kilde og 2 g/l (10 mM) natrium-(3-karboksy-3-okso-propyl)-metylfosfinat ved 30° C. Efter 1 og 2 dager ble det uttatt 1 ml prøver og bakteriecellene utryddet ved oppvarming til 95°C i 20 minutter. Efter sentrifugering ble det supernatanten fjernet og undersøkt på fosfinotricin-dannelse i aminosyreanalysator (AS-analysator). Alcalaigenes faecalis DSM 4115 omsetter substratet efter 24 timer til 0,3 g/l L-fosfinotricin (15* omsetning, beregnet på a-ketosyre). Efter 48 timer får man 5 g/l L-fosfinotricin (25* omsetning).

Eksempel 4

Transaminase-prøver med celleekstrakter og proteinisolater.

Lysat-supernatant og isolerte samlede proteiner av bakteriene, samt anrikede transaminase-fraksjoner av Alcaligenes faecalis DSM 4115 og av DSM 4113 ble innstilt med 10 mM Na2HP04, 10 mM NaCl (pH 7,0) til et proteininnhold mellom 20 og 60 mg/ml og inkubert i standardblanding med 80 mM L—glutaminsyre som NH2-donator og 20 mM natrium-(3-karboksy-3-okso-propyl)-metylfosfinat ved 30<*>C. Alt efter forsøks-betingelser ble det mellom 0 og 24 timer inkubasjonstid tatt ut 100 jjl-prøver, proteinene denaturert 10 minutter ved 94°C, frasentrifugert og reaksjonssupernatanten undersøkt i AS-analysator på fosfinotricin.

Kontrollreaksjoner inneholdt ingen donor-aminosyre henholdsvis ikke natrium-(3-karboksy-3-okso-propyl)-metyl-fosfinat eller ble gjennomført med varmeaktiverte proteiner (10 minutter ved 95"C).

Ved tilsetning av 10 mM hydroksylamin som spesifikt transaminase-inhibitor ble fosfinotricin-dannelsen fullstendig undertrykt.

De spesifikke fosfInotrlcin-transaminase-aktiviteter ble angitt i nmol dannet fosfinotricin pr. mg protein og time. Transaminoreaktivitetene ble angitt i jjmol fosf inotricin pr. minutt og mg protein henholdsvis liter (U/mg protein, U/l). 1 enhet (U) tilsvarer omsetningen til 1 pmol L-fosfinotricin/- mln.

a) L- fosfinotricin ( PTC)- svntese med lysat- supernatant

( urenset)

b) L- PTC- svntese med Isolerte samlede proteiner ( renset med ( NH^ SO4). c) L- PTC- svntese med renset transamlnase- enzvm

Eksempel 5

Prøver på stereoselektivitet av fosfinotricin-syntesen.

StereospesifIteten av fosfinotricln-dannelsen ved trans-amlnerlng ble undersøkt ved hjelp av N-acetyltransferase-reaksjonen. Dette enzym ble påvist i noen jordbakterier (for eksempel DE P 36 28 747.4) og kan isoleres efter kjente metoder. Det reageres stereospesifikt bare med L-fosfinotricin, som i en acetyl CoA-avhengig reaksjon overføres kvantitativt til det tilsvarende N-acetylderivat.

I prøven ble reaksjonssupernatanten fra eksempel 4, hvori det var blitt dannet fosfinotricin ved transaminering, inkubert med protein fra Alcaligenes faecalis DSM 4115 (på 1 mg/ml) og 10 mM acetyl CoA over 5 timer ved 30°C. Reaksjonssupernatanten ble derefter igjen målt på ikke omsatt fosfinotricin i AS-analysator.

Det ved transaminering enzymatisk dannede fosfinotricin kunne fullstendig avbygges ved hjelp av N-acetyltransferase-reaksjonen. Dette beviser transamineringens stereoselektivitet. Det dannes rent L-fosfinotricin.

Eksempel 6

Seleksjon av Escherichia coli ATCC 11303

Escherichia coli ATCC 11303 ble dyrket efter vanlige metoder og mutagenisert med N-metyl-N-nitro-N-nitroguanidin (MNG) ifølge E. Adelberg et. al., "Biochem. Biophys. Res. Comm." 18, 788 (1965). De med MNG behandlede celler ble utstrøket på en autoklavert agar med følgende sammensetning:

En sterilfUtrert oppløsning av fenylpyruvat ble helt inn i den enda varme agar slik at det ble oppnådd en sluttkonsen-trasjon på 24 g/l fenylpyruvat. Platene ble inkubert ved 37° C i 4 dager. Kolonier med en diameter på >1 mm ble isolert. 20* av den voksende stamme hadde en øket transaminaseaktivitet sammenlignet til utgangsstammen. Transaminaseaktivitetsbestemelsen ble gjennomført med Sigma prøvesett G 0390.

Eksempel 7

a) Isolering og fordøying av kosmidet pIMS 6026 fra E. coli.

Kosmidet pIMS 6026 stammer fra kosmidet pLAFRl (ATCC

37167) ved at noen EcoRI snittsteder i dette ble klonet med det handelsvanlige EcoRI fragment, hvorpå kanamycin-resistentgenet av Transposons Tn 903 ligger (Pharmacia, Upsala, Sverige). Ved fermentering med BamHI og efter-følgende religasjon kan den største del av det handelsvanlige EcoRi fragment deleteres, således at det bare blir tilbake et kort stykke DNA som innskudd, hvori et BamHI-snittsted flankeres av 2 EcoRI-snittsteder.

For isolering av kosmidet pIMS 6026 fra E. coli HB101 ble det enten arbeidet ifølge Humphreys et al. ["Biochem. Biophys. Acta" 383, 457-63 (1975)] eller gjennomført en alkalisk lyse ifølge Birnboim og Doly ["Nucleic Acids Res." 7, 1513 (1979)] i 10 ganger større målestokk. I ethvert tilfelle ble plasmid-DNA i det minste en gang renset ved CsCl/EtBr-densitetsgradientsentrifugering.

Kosmidet pIMS 6026 ble fermentert fullstendig med restriksjonsenzymet BamHI, idet det ble gått frem efter angivel-ser fra produsent, New England Biolabs. Til undersøkelse av fullstendigheten av denne fermentering ble en aliquot av restriksjonsblandingen påført på en 0,8*-ig agarosegel og underkastet elektroforese. Fremtreden av bare et bånd efter farving med etidiumbromid og bestråling med kort-bølget TJV-lys (254 nm) tjente som henvisning til en fullstendig fermentering. Fra det fordøyde kosmid-DNA ble restriksjonsenzymet fjernet ved fenolisering, DNA utfelt ved hjelp av etanol, vasket med 70*-ig etanol og efter tørking under vakuum I et egnet volum opptatt på TE-buffer (10 mM tris, 1 nM EDTA, pH 8,0)). Valgvis ble det dessuten gjennomført en behandling med alkalisk fosfatase efter angivelsene av produsenten, Boehringer Mannheim. Efter tilsetning av 1 yl av alkalisk fosfatase (CIP) ble det inkubert 30 minutter ved 37°C, enzymet fjernet ved fenolisering av reaksjonsblandingen, og DNA, som omtalt ovenfor, renset. Endelig ble det resuspendert i TE-buffer. b) Partiell fordøying av DNA fra E. coli ATCC 11303.

Isoleringen av det samlede DNA fra E.coli ATCC 11303 ble

gjennomført efter metoden av Marmur i "J. Mol. Biol." 53, 155-162, (1961). Det isolerte samlede DNA ble partielt fermentert med restriksjonsenzymet Sau3A, således at det hovedsaklig oppstod fragmenter i et størrelsesområde på 20-30 kb. Dertil ble det I forforsøk fastslått det hertil optimale forhold av DNA og enzym samt enzymets optimale innvirkningsvarighet på DNA. Den tilsvarende fremgangsmåte er omtalt i det av firmaet BRL utgitte hefte "focus", vol. 7, nr. 2 (1985) på side 3. Efter utløp av den som optimalt bestemte reaksjonstid ble enzymet ødelagt ved oppvarming til 65°C over et tidsrom på 10 minutter, og dannelsen av DNA-fragmenter i det ønskede størrelsesom-rådet undersøkt ved agarose-gelelektroforese med egnede DNA-markører, for eksempel med EcoRI-fordøyd DNA av fagen

X.

c) Ligasjon av restriksjonsblandingene.

Med Sau3A partielt fermentert samlet DNA fra E. coil ATCC

11303 ble pIMS 6026 kosmid-DNA, som var spaltet fullstendig med BamHI og var behandlet med alkalisk fosfatase, blandet i et molart forhold på ca. 1:5. Den resulterende blanding ble blandet med en flere ganger konsentrert buffer efter angivelsen av New England Biolabs, således at det fremkom en for enzymet T4-DNA-ligase optimal ione-konsentrasjon og inkubert med 1 pl av enzymet i minst 14

timer ved 16°C. Det samlede volum av blandingen utgjorde derved 50 pl med en samlet DNA-konsentrasjon på 20 pg/ml.

d) Forpakning i X-fagen.

Efter foretatt ligase-reaksjon ble ifølge eksempel 3

dannet DNA in vitro forpakket i hodene av X-fagen. De dertil nødvendige ekstrakter av to forskjellige bakterie-stammer kunne utvinnes ifølge Hohn, B., i Wu, R., utgiver: "Recombinant DNA, Methods in Enzymology", vol. 68, "Academic Press", New York, s. 299-309 (1979) eller referert av Boehringer Mannheim eller Amersham Buchler, Braunschweig. 3 pl av den ifølge eksempel 3 dannede blanding ble grundig blandet med umiddelbart på forhånd opptinte bakterieekstrakter fra firmaet Amersham under isavkjøling. Blandingen ble inkubert 30-60 minutter ved 20°C og derefter tilsatt 200 pl SM-buffer (100 mM NaCl, 10 mM MgS04, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,01* gelatin). Denne blandingen ble enten direkte anvendt i en transduksjons-reaksjon eller efter tilsetning av 10 pl kloroform oppbevart inntil senere anvendelse ved 4°C.

e) Transduksjon av E. coli DG 30.

5 ml L-Broth, bestående av 1* Bacto-trypton, 0,5* gjær-ekstrakt og 0,5* NaCl, ble tilsatt 0,4* maltose og podet med 50 pl av en væskekultur av E. coli DG 30 i den stasjonære vekstfase. Det ble inkubert 12 timer ved 37° C inntil det var oppnådd den tidlige stasjonære fase. Bakteriene ble frasentrifugert og forsiktig resuspendert i 2,5 ml av en vandig oppløsning, som var 10 mmolar på MgCl2- 10 pl av blandingen ifølge eksempel 4 ble blandet med 20 pl av den konsentrerte bakteriesuspensjon og inkubert 50 minutter ved værelsestemperatur.

Derefter ble det tilsatt 200 pl L-Broth og inkubert 1 time ved 37°C, idet blandingen av og til ble rystet. 50 pl-andeler av blandingen ble utplattert på L-Broth-agar, som inneholdt 20 pl tetracyklin. Platene ble dyrket minst 12 timer ved 37° C. Ved den omtalte måte kunne det av en blanding gjennomsnittlig fåes 1000 kolonier. f) Seleksjonering av E. coli DG 30 med et aspC- eller ilvE-eller tyrB-gen.

Rundt 800 kolonier, som efter transduksjon av E. coli DG 30 efter den omtalte fremgangsmåte på L-Broth-agar,

inneholdt 20 pg/ml tetracyklin, var blitt dannet og ble "gepickkt" på minimalagar. Minimalagaren bestod av M9-medium med glukose (Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Earbor, 1972), som var blitt supplert ved aminosyrene, isoleucin, leucin, valin, asparaginsyre og fenylalanin. Aminosyren tyrosin, som stammen DG 30 likeledes ikke kan syntetisere, ble imidlertid ikke tilsatt mediet. Av de 800 "gepickten" kolonier kunne 7 vokse på minimalmediet.

For å skille de tre mulige gener aspC, ilvE og tyrB i E. coli DG 30 ble disse 7 kolonier igjen "gepickt" på ovennevnte minimalmedium, som var supplert med de oppførte aminosyrer bortsett fra én i hvert tilfelle, for hvilken en av transaminasene, som kodes fra et av genene, viser substratspesifitet.

Resultatene er oppført i følgende tabell:

g) Lokalisering av tyrB-genet.

Ved minilyse ifølge Maniatis et al., Cold Spring Harbor,

side 366-370, (1982) ble kosmid-DNA av klonene 1 til 7, som var blitt dannet ifølge eksempel 6, utvunnet. Derefter ble dette kosmid-DNA innsluset i E. coli DH1 (ATCC 33849), hvorav den i gode utbytter igjen kunne reisoliseres. Det ble fullstendig fermentert plasmid-DNA, som opprinnelig var blitt utvunnet av klon 7 av E. coli DG 30 (se eksempel 6), hvorav den med denne DNA transformerte stamme E. coli

DH 1 ble isolert og fullstendig fermentert med restrik-sjons enzymene Sali og Smal, idet man fulgte angivelsene fra produsenten New England Biolabs. Likeledes fullstendig fermentert med Clal ble vektoren pAT 153, som derefter dessuten ble underkastet en behandling med alkalisk fosfatase. De to DNAer ble blandet, ligert med hverandre på den i eksempel 4 allerede omtalte måte og kompetente celler av stammen E. coli ATCC 11303 transformert med en aliquot av ligaseblandingen, for eksempel 10 pl. Resistente kolonier ble selektert på L-Broth-plater som inneholdt 50 pg/ml ampicillin, og undersøkt ved hjelp av "repllca plating" på L-Broth-plater med 20 pg/ml tetracyklin på markeringaktivering og dermed innbygging. Fra kolonier som har fentotypen AprTcs ble ved hjelp av minilyse plasmid-DNA isolert og ved fullstendig fordøying med restriksjonsenzymet Clal undersøkt på nærvær av Clal-fragmenter i vektoren pAT153.

h) Undersøkelse av transaminase-aktiviteten.

De ifølge eksempel 7 dannede kloner ble undersøkt ved

hjelp av APPAT-prøven (Aspartat-fenylpyruvat-aminotrans-feranse Assay, Sigma analysesett G0390, idet p-ketogluta-rat ble erstattet med fenylpyruvat) på aktiviteten av den aromatiske transaminase, altså genproduktet av tyrB. Som sammenligning tjente den ikke transformerte utgangsstamme E. coli ATCC 11303. Derved kunne det i et tilfelle måles en tydelig økning av tyrB-aktiviteten, nemlig rundt en faktor 5 til 10, i forhold til utgangsstammen E.coli ATCC 11303.

Ved agarose-gelelektroforese under anvendelse av egnede markører kunne det vises at i stammen som har øket tyrB-genaktivitet, var det inneholdt en pAT 153-vektor, som inneholdt innbygget et rundt 2,7 MD stort Clal-fragment. Ble den plasmidløse stamme E. coli ATCC 11303 transformert igjen med det isolerte plasmid-DNA, så kunne det i hvert tilfelle iakttas en økning av tyrB-aktiviteten rundt faktoren 5-10.

Transformeringen av E. coli ATCC 11303 med ilvE-genet foregår på analog måte.

Eksempel 8

Fremstilling av L-tertiær-leucin.

a) En ifølge eksempel 6 seleksjonert stamme av Escherichia coli ATCC 11303 ble dyrket i følgende næringsoppløsning:

Efter 48 timers vekst ved 37°C ble cellene frasentrifugert. I det overstående ble det ved hjelp av HPLC på en RPC-8 søyle (mobil fase: gradient av 100 mM Na-acetat (pH 7,2) og metanol) bestemt 0,9 g/l L-2-amino-3,3-dimetyl-butansyre (tertiær-leucin). b) Cellematerialet ble dyrket som i eksempel 8 og inkubert i en oppløsning av 10 g/l asparaginsyre, 4 g/l 3,3-dimetyl-2-okso-butansyre i 10 mmol/1 tris-HCl-buffer (pH 7,4) under rysting. Efter 24 timer ved 37<*>C kunne det ved hjelp av HPLC måles 1,9 g L-2-amino-3,3-dimetyl-butansyre.

Eksempel 9

Fremstilling av L-fosfinotricin.

Cellematerialet ble dyrket som i eksempel 8 imidlertid med 4 g/l dimetylpyruvat i stedet for 3,3-dimetyl-2-okso-butansyre. Efter 48 timer ble cellene frasentrifugert, vasket med buffer og Inkubert i en vandig oppløsning av 4 g/l natrium-(3-karboksy-3-okso-propyl)-metylfosfinat og 8 g/l asparaginsyre-natriumsalt i 10 mmol/1 tris/HCL (pH 7,4) i 24 timer ved 37°C. Derefter ble cellene frasentrifugert og den dannede mengde av L-fosfinotricin i supernatanten bestemte ved hjelp av HPLC-analyse. Det kunne påvises 3,2 g/l fosfinotricin.

Eksempel 10

Fremstilling av L-fosfinotricin med rekombinante bakterier.

En E. coli stamme fra eksempel 7 med plasmidkodet ilvE-transaminase-aktivitet ble fermentert i følgende nærings-oppløsning:

Efter 4 timers vekst ble det begynt med en eksponensiell glukosetilforing mellom 0,5 og 20 g/l/t. Efter 16 timers vekst hadde cellene en tørrvekt på 20 g/l og en transaminaseaktivitet på 15000 pmol/min/1. Cellene ble efter fermentering anvendt direkte uten videre vasketrinn i en 100 ml reaksjonsblanding. Reaksjonsblåndingen inneholdt i en 10 mmol/1 tris/HCl-buffer (pH 7,4), 1500 pmol/min/1 transaminaseaktivitet, 0,1 ml polyoksyetylen-sorbitan-monooleat ("Tween 80"), 90 mmol/1 natrium-(3-karboksy-3-okso-propyl)-metylfosfinat og 200 mmol/1 glutaminsyre og ble lett rystet ved 37°C. Efter 24 timer ble cellene frasentrifugert og L—fosfinotricin bestemt i supernatanten ved HPLC-analyse. Det ble påvist 70 mmol/1 L-fosfinotricin.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av L-tert-leucin og L—fosfino-tricin, karakterisert ved at 3,3-dimetyl-2-okso-butansyre og (3-karboksy-3-okso-propyl)-metylfosfin-syre henholdsvis saltene av disse forbindelser, transamineres ved hjelp av mikroorganismer, med celleekstrakter, isolerte samlede proteiner eller med rensede transaminaser, i nærvær av aminosyrer som aminogruppedonatorer, idet det anvendes aminogruppedonatorer og a-ketosyrer i forholdet 1:1 til 5:1, hvorved transamineringen gjennomføres ved en pH-verdi innen området 5 til 9.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det transamineres ved hjelp av Alcaligenes faecalis DSM 4115, Alcaligenes denitrificans DSM 4114, Pseudomonas paucimobilis DSM 4120, Pseudomonas spee. 4119, Serratia plymuthica DSM 4116, Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli DH1, Escherichia coli ATCC 11303, Enterobacter agglomerans DSM 4112, Enterobacter spee. DSM 4121, Paracoccus denitrificans DSM 65, Streptomyces hydroscopicus og Streptomyces viridochromogenes samt 3 jordisolater DSM 4113, DSM 4117 og DSM 4118.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det transamineres ved hjelp av E. coli ATCC 11303, som er transformert med et plasmid som inneholder et tyrB-gen.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes aminogruppedonator og a-ketosyre i forhold 1:1 til 2:1.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at transamineringen gjennomføres ved en pH i området på 7 til 8,5.