JP2709060B2 - アミノ交換反応によるｌ−ホスフイノスリシンの製法 - Google Patents
アミノ交換反応によるｌ−ホスフイノスリシンの製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
光学活性な、非タンパク性アミノ酸は知られたかまた
はありうる生物学的活性ゆえに大変重要である。Ｌ−ジ
ヒドロキシフエニルアラニン（Ｌ−ドーパ）またはα−
メチルドーパのような幾種かのものは医薬分野に効果的
に使用されるし、またはホスフイノスリシン（phosphin
othricine）のように植物保護に使用される。その他の
ものには医薬の前駆物質、例えば半合成ペニシリンであ
るアンピシリンおよびアモキシシリン製造におけるＤ−
フエニルグリシンまたはβ−ｐ−ヒドロキシフエニルグ
リシンがあげられる。これらはまた精製化学薬品合成の
ための価値ある前駆物質でもありうる。アミノ酸誘導体
の不斉合成においては特に第三ロイシンも採用されてき
た（U.Schllkopf氏の「Pure and Appl.Chem.」55,179
9〜1806（1983））。 非タンパク性の光学活性アミノ酸は化学的経路でのみ
製造されるのが好ましい。その場合立体選択的に操作で
きず、最終生成物としてラセミ化合物が得られるという
欠点がある。これに対し酵素による方法は簡単に調製で
きる中間体から酵素工程を用いることによりキラール化
合物が選択的に合成されうるという利点を非常にしばし
ば有する。このことは２つの立体異性化合物のうちの一
方のみが生物学的に活性である場合に特に好都合であ
る。 トランスアミナーゼを用いる生物学的変換による天然
の、いわゆるタンパク性アミノ酸の合成それ自体は知ら
れている。ヨーロツパ特許出願第152,275号にはアミノ
トランスフエラーゼの過剰生産により特徴づけられる遺
伝子工学的に修飾された微生物を用いるアミノ交換反応
によるフエニルアラニンの製法が記載されている。ヨー
ロツパ特許出願第1,35,846号ではα−ケト酸をエシエリ
ヒア・コリ（Escherichia coli）から単離されるトラン
スアミラーゼの存在下でアミノ基供与体としてのＬ−ア
スパラギン酸と反応させることにより天然のＬ−アミノ
酸を製造している。それによりα−ケト酸に相当するＬ
−アミノ酸、ならびにアスパラギン酸から生成するオキ
サロアセテートが形成される。 フェニルピルビン酸からより高収率にＬ−フエニルア
ラニンを製造するためのエシエリヒア・コリ（E.col
i）、パラコツカス・デニトリフイカンス（Paracoccus
denitrificans）、トルラ（Torula）、ロドトルラ（Rho
dotorula）およびストレプトミセス（Streptomyces）の
系列の微生物の選択および突然変異は西ドイル特許出願
第3,423,936号に報告されている。 天然には存在しない、いわゆる非タンパク性アミノ酸
はこれまで酵素による生物学的変換法によつては製造さ
れなかつた。 今、非タンパク性アミノ酸であるＬ−ホスフイノスリ
シンがアミノ変換反応により非常に良好な収率で合成さ
れうることが見出された。種々の天然のタンパク性アミ
ノ酸がトランスアミナーゼを用いて合成されうることは
知られていたとしても、酵素の特異性ゆえに非タンパク
性アミノ酸が天然に存在しないα−ケト酸を前駆物質と
して用いてこの方法により同様に製造されうることは驚
くべきことである。それゆえ相当する前駆物質が、天然
のアミノ酸の前駆物質においてはこの形態で存在しない
疎水性残基を有するにも拘らずトランスアミナーゼの活
性中心によつて受容されそして変換されることは驚くべ
きことである。 従って本発明は（３−カルボキシ−３−オキソ−プロ
ピル）−メチルホスフィン酸またはその塩をアミノ基供
与体としてのアミノ酸の存在下に、アルカリゲネス（Al
caligenes）、リゾビウム（Rhizobium）、シュードモナ
ス（Pseudomonas）、セラチア（Serratia）、ロドコッ
カス（Rhodococcus）、エンテロバクター（Enterobacte
r）またはエシェリヒア（Esherichia）属の微生物を用
いてアミノ交換反応することからなるＬ−ホスフィノス
リシンの製法に関する。 以下に本発明について詳細に説明する。 多数の生物体例えば微生物、植物および豚の心臓のよ
うな動物器官から得られる酵素はα−ケト酸をアミノ交
換反応により天然のＬ−アミノ酸に変換させうる。これ
ら生物体またはそれらの酵素は本発明に使用されうる。
しかしながら、トランスアミナーゼを有する微生物、例
えばパラコツカス（Paracoccus）、アルカリゲネス（Al
caligenes）、リゾビウム（Rhizobium）、シユードモナ
ス（Pseudomonas）、セラシア（Serratia）、アグロバ
クテリウム（Agrobacterium）およびストレプトミセス
（Streptomyces）属の微生物または腸内菌科の細菌を用
いて操作するのが好ましい。特に好ましい微生物はアル
カリゲネス・フエカリス（Alcaligenes faecalis）DSM
4115、アルカリゲネス・デニトリフイカンス（Alcalige
nes denitrificans）DSM 4114、シユードモナス・パウ
シモビリス（Pseudomonas paucimobilis）DSM 4120、シ
ユードモナス種（Pseudomonas spec.）DSM 4119、セラ
シア・プリムシカ（Serratia plymuthica）DSM 4116、
アグロバクテリウム、ツメフアシエンス（Agrobacteriu
m tumefaciens）、エシエリヒア・コリ DH1、エシエリ
ヒア・コリ ATCC 11303、エンテロバクター・アグロメ
ランス（Enterobacter agglomerans）DSM 4122、エンテ
ロバクター種（Enterobacter spec.）DSM 4121、ならび
に３種の土壌単離物のロドコッカス種DSM 4113、DSM 41
17およびエンテロバクター・インターメジウム（Entero
bacter inttermedium）DSM 4118である。 これらの微生物はそれらが自由に入手できないかまた
は当業者が本発明を実施できる程度に記載されていない
場合は「ドイツ微生物寄託機関（Deutsche Sammlung f
r Mikro organism（DSMと略記））」に寄託されてい
る。 ホスフイノスリシン抵抗性であるかまたは唯一の窒素
源としてホスフイノスリシンを利用する菌株、例えばア
ルカリゲネス・フエカリスDSM 4115、アグロバクテリウ
ム・ツメフアシエンスならびにロドコッカス種DSM 4113
が選択される場合は比較的高い酵素活性が得られうる。
これは好都合であるが、絶対に必要なわけではない。同
様にそれ自体知られた方法で選択および突然変異させる
ことにより、培地中のより多量の3,3−ジメチル−２−
オキソブタン酸、フエニルピルビン酸または（３−カル
ボキシ−３−オキソプロピル）−メチルホスフイン酸ま
たはそれらの塩に対し、α−ケト酸に対する適合性ゆえ
にアミノ交換反応をより高収率に進行せしめる微生物を
以後の操作用に選択することができる。（３−カルボキ
シ−３−オキソ−プロピル）−メチルホスフイン酸また
はその塩も同様に知られた方法により製造される（Hans
Beyer氏の「Lehrbuch der organischen Chemie（Texbo
ok of Organic Chemistry）」、S.Hirzel出版、Stuttga
rt）。 遺伝子工学的に操作された微生物を本発明方法に使用
する場合も良好な収量が得られる。tyrB遺伝子またはil
vE遺伝子を含有するプラスミド形質転換されたエシエリ
ヒア・コリATCC 11303を用いるのが特に好ましく、ここ
でtyrB遺伝子は芳香族トランスアミナーゼをそしてilvE
遺伝子は脂肪族トランスアミナーゼをそれぞれコードす
る。かくの如く操作された菌株は例えば西ドイツ特許出
願P 36 31 829.9号またはP 36 36 722.2号の記載により
調製されうる。 アミノ交換反応は培養と同時に行われうる。その場合
ホスフイノスリシンに対して抵抗性を有する微生物例え
ばアルカリゲネス・フエカリスDSM 4115およびアグロバ
クテリウム・ツメフアシエンスを用いて操作するのが好
ましい。しかしながら微生物はその生育に最適の培養基
中で適当な好ましい温度条件および通気条件下に栄養溶
液１当り乾燥重量約４〜60gとなるまで培養するのが
好ましい。それぞれの微生物に最も好都合な条件は当業
者に知られているかまたは簡単な予備実験により判定さ
れうる。次に細胞を栄養溶液中に、または栄養溶液から
分離してα−ケト酸のアミノ化に使用する。アミノ交換
反応は細胞全体を用いてあるいは破壊した細胞を用いて
も実施でき、慣用の破壊法が用いられる。アミノ交換反
応は細胞抽出物、単離された総タンパク質または精製ト
ランスアミナーゼを用いても同様に実施できる。しかし
ながら例えば価格などの実際的理由から、完全な細胞全
体を用いて操作するのが好ましい。しかしながらその寿
命が比較的長いことおよび反応をより良好に調節しうる
ことのゆえにトランスアミナーゼを単離使用することも
同様に好都合でありうる。さらに、微生物または酵素を
固定した形態で使用することも可能である。固定には知
られた方法、好都合には西ドイツ特許出願公開第3,237,
341号および同第3,243,591号記載の方法が用いられる。 微生物または単離された酵素系は好ましい実施形態に
おいては、α−ケト酸およびアミノ基供与体の添加の下
においてそのトランスアミナーゼ活性が著しくマイナス
の影響を受けることがないように生理的緩衝液中に懸濁
する。微生物の量に応じ、微生物の形態でかまたは単離
された酵素系の形態で反応混合物に添加される酵素活性
は広範囲に変動しうる。好都合には活性は10〜20000μ
モル／分・である。反応混合物は酵素活性1500〜2000
μモル／分・に相当する細胞量を含有するのが好まし
い。 アミノ基供与体としてはアミノ酸が使用される。どの
アミノ酸が用いられるのが好ましいかは実質上微生物ま
たは単離された酵素系の如何によるものであるが、これ
は簡単な予備試験により判定されうる。例えばバリン、
ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシンおよび
フエニルアラニン、特にアスパラギン、アスパラギン
酸、グルタミン、グルタミン酸およびグリシンが適当で
ある。これらのアミノ酸は、Ｌ−形のみが本発明に利用
されるのでＬ−形における遊離の酸または適当な塩（用
いられる培地に相当して）として使用される。Ｌ−ホス
フイノスリシンの製造には（３−カルボキシ−３−オキ
ソ−プロピル）−メチルホスフイン酸が使用される。そ
れらの塩も使用でき、その場合当然トランスアミナーゼ
活性に著明にマイナスに影響しないイオンが選択され
る。ナトリウム、カリウムおよびアンモニウム塩が好ま
しい。アミノ基供与体はα−ケト酸に対し等モル量また
は過剰に添加される。1:1〜5:1好ましくは1:1〜2:1なる
割合が適当であることが判明した。 反応混合物への反応体の添加は、水中における溶液と
してまたは固形物質を添加することにより同時に行われ
うる。しかしながら反応混合物の重量に基づき0.1〜4.5
％特に0.2〜２％の量で１〜90時間好ましくは２〜40時
間にわたり段階的にまたは継続的に添加するのが好まし
い。 pH5〜９、特にpH7〜8.5で操作するのが好ましい。そ
の他アミノ変換反応は10℃〜65℃、特に20〜50℃の温度
範囲で実施するのが好都合である。これより温度が低い
と酵素反応が遅くなつてゆき、一方これより温度が高い
と酵素が不活化されてゆく。 最も好都合な操作法はそれぞれの微生物の如何に応じ
たものであり、そして簡単な予備試験により容易に決定
されうる。 微生物をアミノ交換反応期間前または期間中は浸透性
となすことが特に好都合であると判明した。これはトル
エン、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ジメ
チルスルホキシド等のような適当な薬剤をインキユベー
シヨン培地に添加することによりなされうる。 以下の例により本発明をより詳細に説明する。％記載
は別に断わりなければ重量によるものとする。 例 １ 微生物の培養と後処理 寄託されるかまたは自由に入手しうる前記細胞をLB−
培地〔Luria−Bertani−培地:1当り10gバクト（Bact
o）−トリプトン/5gパクト酵母抽出物/10g NaCl（pH7.
5）〕またはM9−最少培地〔１当り6g Na2HPO4/3g KH2
PO4/0.5g NaCl/1g NH4Cl/2ml 1M MgSO4＋10ml 20％グル
コース＋0.1ml 1M CaCl2＋1ml 1％ビタミンB1（サイア
ミン）（pH7.4）〕中の液体培養液400ml中で30℃（エシ
エリヒア・コリ以外の全ての細菌）または37℃（エシエ
リヒア・コリDH1）で一夜培養した。 次に細菌を遠心分離しそして細胞ペレツトをpH7.0の
洗浄緩衝液（10mM Na2HPO4、10mM NaCl）中で数回洗い
そして終りに細胞ペレツト3gにつき洗浄緩衝液5ml中に
懸濁した。この細胞を１分間の超音波処理を５回行うこ
とにより崩壊させそして細胞断片を遠心分離した。かく
して得られた溶解物上澄み液は−20℃で数ケ月間保存さ
れうる。 例 ２ タンパク質の単離 タンパク質を単離するには、溶解物上澄み液5mlずつ
に洗浄緩衝液を加えてそれぞれ50mlとなしそして硫酸ア
ンモニウムを65％まで添加することによりタンパク質を
沈澱させた。10000gで15分間遠心分離したのちタンパク
質ペレツトを10mM Na2HPO4（pH7.0）、1mM EDTA、２％
グリセリンおよび1mMジチオトレイトール（DTT）を含有
する溶液5ml中にそれぞれ再懸濁させた。これらの懸濁
液も同じく−20℃で保存されうる。精製効果をより良く
するためにタンパク質の一部は硫酸アンモニウムで２回
沈澱させた。 タンパク質測定はビウレツト法で行われた。前記した
教示に従つて行われた調製物中のタンパク質含量は大抵
の場合５〜10mg/mlであつた。アルカリゲネス・フエカ
リスDSM 4115およびロドコッカス種 DSM 4113から得ら
れるトランスアミナーゼの部分精製を行うには、硫酸ア
ンモニウムをそれぞれ10％刻みで25％から75％添加して
タンパク質を分別沈澱させそして個々のフラクシヨンの
トランスアミナーゼ活性について検査（下記参照）し
た。最大の比活性を有するタンパク質フラクシヨンをセ
フアデツクスG100を含有するゲル過カラムに適用しそ
して10mMのNa2HPO4（pH7.0）を用いて溶離した。トラン
スアミナーゼ比活性が最大である溶出液フラクシヨンを
硫酸アンモニウムで反復沈澱させることにより濃縮しそ
して10mM Na2HPO4（pH7.0）、1mM EDTA、２％グリセリ
ンおよび1mM DTTを含有する溶液中に5mg/mlとなるよう
にとつた。 （セフアデツクス（Sephadex） G 100）ポリデキス
トランカラムフラクシヨンの分子量は標準分子量タンパ
ク質との比較により測定した。単離されたトランスアミ
ナーゼフラクシヨンの純度はタンパク質試料を10％SDS/
ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動することにより検
査した。 例 ３ 液体培養におけるホスフイノスリシン合成試験 唯一のＮ源として3g/（20mM）のＬ−グルタミン酸
および2g/（10mM）のナトリウム−（３−カルボキシ
−３−オキソ−プロピル）−メチルホスフイネートを含
有するLB培地中の各細菌菌株の5ml培養物を30℃で調製
した。１日および２日後に1mlの試料を採取しそして細
菌細胞を95℃に20分間加熱することにより殺した。遠心
分離したのち上澄み液をとり出しそしてアミノ酸分析器
（AA−分析器）中でホスフイノスリシン形成について検
べた。アルカリゲネス・フエカリスDSM 4115は24時間後
に基質を0.3g/のＬ−ホスフイノスリシン（α−ケト
酸に基づき15％の変換率）に変換した。48時間後には5g
/のＬ−ホスフイノスリシン（25％の変換率）が得ら
れた。 例 ４ 細胞抽出物およびタンパク質単離物を用いるトランスア
ミナーゼ試験 細菌の溶解物上澄み液および単離された総タンパク
質、ならびにアルカリゲネス・フエカリスDSM 4115およ
びDSM 4113から得られた富化されたトランスアミナーゼ
フラクシヨンを10mM Na2HPO4および10mM NaCl（pH7.0）
を含有する溶液を用いてタンパク質含量20〜60mg/mlに
調整しそしてNH2−供与体としての80mM L−グルタミン
酸および20mMナトリウム−（３−カルボキシ−３−オキ
ソ−プロピル）−メチルホスフイネートを含有する標準
バツチ中30℃でインキユベーシヨンした。実験条件の如
何に応じインキユベーシヨン時間０〜24時間で100μ
の試料を採取し、タンパク質を95℃で10分間変性させ、
遠心分離しそして反応上澄み液をAA−分析器中でホスフ
イノスリシンについて検査した。 対照反応は何ら供与体アミノ酸またはナトリウム−
（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチルホ
スフイネートを含有しないか、または熱不活性化したタ
ンパク質（95℃、10分間）を用いて行われた。 特異的なトランスアミナーゼ阻害剤として10mMのヒド
ロキシルアミンを添加することによりホスフイノスリシ
ン形成が完全に抑制された。 ホスフイノスリシン−トランスアミナーゼ比活性はタ
ンパク質1mgにつき１時間につき形成されたホスフイノ
スリシンのｎモルで示され、アミノ交換の反応性はタン
パク質1mg当りまたは１当り１分間で生成されるホス
フイノスリシンのμモル（U/タンパク質mgまたはU/）
で示される。１単位（Ｕ）はＬ−ホスフイノスリシンへ
の変換毎分１μモルに相当する。 ａ） 溶解物上澄み液（未精製）を用いるＬ−ホスホノ
スリシン（PTC）合成 ｂ） 単離された全タンパク質（（NH4）2SO4で精製）
を用いるＬ−PTC合成 ｃ） 精製トランスアミナーゼ酵素を用いるＬ−PTC合
成 ｄ） ロドコッカス種（DSM 4113）、アルカリゲネス・
フェカリス（DSM 4115）およびエシェルヒア・コリDH1
の粗抽出物を用いる、アミノ交換反応によるＬ−PTC合
成のために有効なアミノ酸供与体 試験は、前述のグルタミン酸の代わりに上記表中のア
ミノ酸を用いて同様に実施された。トランスアミナーゼ
比活性はmU/タンパク質mgで示されている（1mU＝1nmol
L−ホスフィノスリシン／分）。 ｅ） NH2−供与体としてグルタミン酸を用いた場合
の、土壌単離物の粗抽出物におけるＬ−ホスフィノスリ
シン−トランスアミナーゼ比活性 〔酵素活性はmU/タンパク質mgで表示されている（1mU＝
1nmol L−ホスフィノスリシン／分）。〕 例 ５ ホスフイノスリシン合成の立体選択性に関する試験 アミノ変換反応によるホスフイノスリシン生成に関す
る立体特異性をＮ−アセチルトランスフエラーゼ反応に
より検査した。この酵素は２〜３の土壌細菌で検出（例
えば西ドイツ特許出願P 36 28 74.74）されそして知ら
れた方法で単離されうる。このものはＬ−ホスフイノス
リシンとのみ立体特異的に反応してそれがアセチル−Co
A−依存性反応により定量的に対応するＮ−アセチル誘
導体に変換される。 試験においては、アミノ交換反応によりホスフイノス
リシンが形成されている例４で得られた反応上澄み液を
アルカリゲネス・フエカリスDSM 4115から得られたタン
パク質（1mg/ml）および10mMのアセチルCoAと30℃で５
時間インキユベーシヨンした。反応上澄み液を次に再び
未反応ホスフイノスリシンについてAA−分析器で検査し
た。 アミノ交換反応により酵素的に形成されたホスフイノ
スリシンはそれぞれＮ−アセチルトランスフエラーゼ反
応により完全に崩壊された。これはアミノ変換反応の立
体選択性を証明している。純粋なＬ−ホスフイノスリシ
ンが形成されている。 例 ６ エシエリヒア・コリATCC 11303の選択 エシエリヒア・コリATCC 11303を常法により培養しそ
してE.Adelberg氏他の「Biocchem.Biophys.Res.Comm.」
18,788（1965）の記載によりＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアジン（NMG）を用いて突然変異させ
た。NMGで処理した細胞を下記組成を有する圧熱滅菌さ
れた寒天上に画線した。 フマル酸 ５ g/ 肉エキス 20 g/ アスパラギン酸 20 g/ KH2PO4 ２ g/ MgSO4・7H2O 0.5g/ CaCl2・2H2O 0.1g/ 寒天 20 g/ 水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.2に調整 フエニルピルベートの滅菌過された溶液をまだ熱い
寒天溶液にフエニルピルベートの最終濃度が24g/とな
るように注いだ。このプレートを37℃で４日間インキユ
ベーシヨンした。直径1mm以上のコロニーを単離した。
生育する菌株の20％が出発菌株に比較して高いトランス
アミナーゼ活性を有していた。 トランスアミナーゼ活性はSigmaテストキツトG 0390
を用いて測定された。 例 ７ a.エシエリヒア・コリからのコスミドpIMS 6026の単離
および消化 トランスポゾンTn903のカナマイシン抵抗性が存在す
る商業的に入手しうるEcoR I断片（Pharmacia社製、Upp
sala、スウエーデン）を、コスミドpLAFRI（ATCC 3716
7）の独特のEcoR I切断部位中にクローニングすること
によりコスミドpIMS 6026を誘導する。BamH Iでの消化
そして続く再連結により商業に入手しうるEcoR I断片の
大部分が欠失されて、１個のBamH I切断部位が２個のEc
oR I切断部位により両側をはさまれた短いDNA片のみが
挿入物として残存する。 エシエリヒア・コリHB101からコスミドpIMS 6026を単
離するにはHumphreys氏他の方法〔Biochim.Biophys.Act
a 383,457〜63（1975）〕またたはBirnboim氏他による
アルカリ分解〔Nucleic Acids Res.７,1513（1979）〕
のいずれかに従い10倍の規模で実施した。いずれの場合
もプラスミドDNAはCsCl/EtBr密度勾配遠心分離により少
くとも１回は精製した。 このコスミドpIMS 6026を製造者New England Biolabs
の教示に従い操作して制限酵素のBamH Iで完全に消化し
た。この消化が完結したかどうか検査するには制限調製
物の一部分を0.8％アガロースゲルに適用した電気泳動
にかけた。エチジウムブロマイドで着色しそして短波長
UV光線（254nm）で照射して１本のバンドのみが見られ
る場合は完全な消化を示すものとされた。消化されたコ
スミドDNAからフエノール処理により制限酵素を除去
し、DNAをエタノールで沈澱させ、70％エタノールで洗
いそして真空下に乾燥したのち適当量のTE緩衝液（10mM
のトリスおよび1mMのEDTA、pH8.0）中にとつた。選択に
より、製造者Boehringer Mannheimの教示に従いアルカ
リホスフアターゼでさらに処理した。１μのアルカリ
ホスフアターゼ（CIP）を添加したのち37℃で30分間イ
ンキユベーシヨンし、フエノール処理により反応混合物
から酵素を除去し、そしてDNAを前記したようにして精
製した。これを終りにTE緩衝中に再懸濁した。 b.エシエリヒア・コリATCC 11303からのDNAの部分消化 Marmur氏の「I.Mol.Biol.」53,155〜162（1961）記載
の方法に従いエシエリヒア・コリATCC 11303から全DNA
を単離した。この単離された全DNAを制限酵素Sau3Aを用
いて部分消化すると主に20〜30kbの寸法の断片が生成し
た。この目的には予備実験においてこの反応に最適のDN
A:酵素比ならびにDNAに及ぼす酵素の最適作用時間が判
定された。適当な操作法はBRL社から出されたパンフレ
ツト「Focus」７（２）,3（1985）に記載されている。
最適と定められた反応時間経過後、酵素を65℃に10分間
加熱することにより破壊しそして所望の寸法範囲内のDN
A断片が形成されたかどうかをアガロースゲル電気泳動
により適当なDNA−マーカー例えばフアージλのEcoR I
消化されたDNAを用いて検査した。 c.制限部位の連結 エシエリヒア・コリATCC 11303から得られる総DNAをS
au3Aで部分消化したものをBamH Iで完全に切断しそして
アルカリフオスフアターゼ処理したpIMS 6026コスミドD
NAと約1:5なるモル比で混合した。生成した混合物を、N
ew England Biolabsの教示に従い酵素T4−DNAリガーゼ
にとつて最適のイオン濃度を生ずるように数倍濃度の緩
衝液で処理し、そして酵素１μと一緒に16℃で少くと
も14時間インキユベーシヨンした。反応混合物の総量は
50μであり、総DNA濃度は20μg/mlであつた。 d.λ−フアージ中へのパツケージング リガーゼ反応が行われた後、例３で得られたDNAをin
vitroでλ−フアージの頭部にパツケージングした。こ
の目的に必要な抽出物はB.Hohn氏の「Recombinant DNA,
Methods in Enzymology」68,Academic Press,New York,
299〜309頁（1979）記載の方法により２種の異なる細菌
菌株から得ることができるしまたはBoshringer Mannhei
m社またはAmersham Buchler,Brunswick社から得られう
る。 例３で得られた混合物３μを直前に解凍されたAmer
sham社の細菌抽出物と氷冷下に充分によく混合した。こ
の混合物を20℃で30〜60分間インキユベーシヨンしそし
て次にSM−緩衝液（100mM NaCl、10mM MgSO4、50mMトリ
ス−HCl（pH7.5）および0.01％ゼラチン）200μを加
えた。この混合物を直接形質導入反応にかけるかまたは
10μのクロロホルムを添加したのち後程の使用時まで
４℃で保存した。 e.エシエリヒア・コリDG 30の形質導入 １％Bacto−トリプトン、0.5％酵母エキスおよび0.5
％NaClからなるＬ−ブイヨン5mlに0.4％のマルトースを
加えそして定常生長期にあるエシエリヒア・コリDG 30
の液体培養物50μを接種した。早期定常期に達するま
でこの混合物を37℃で12時間インキユベーシヨンした。
細菌を遠心分離しそして10ミリモルMgCl2水溶液2.5ml中
に注意深く再懸濁した。例４記載の混合物10μに濃細
菌懸濁液20μを加えそして室温で50分間インキユベー
シヨンした。 次にＬ−ブイヨン200μをこれに加え、この混合物
を時々振盪しながら37℃で１時間インキユベーシヨンし
た。 この調製物50μずつを20μg/mlのテトラサイクリン
を含有するＬ−ブイヨン−寒天上に塗布した。このプレ
ートを37℃で少くとも12時間インキユベーシヨンした。
前記した操作法により、１つの調製物から平均1000個の
コロニーを得ることができた。 f.aspC、ilvEまたはtyrB遺伝子を有するエシエリヒア・
コリDG 30の選択 20μg/mlのテトラサイクリンを含有するＬ−ブイヨン
−寒天上で前記した方法に従いエシエリヒア・コリDG 3
0の形質導入により得られた約800個のコロニーを最少寒
天上に「拾い移し」た。最少寒天はアミノ酸イソロイシ
ン、ロイシン、バリン、アスパラギン酸およびフエニル
アラニンを補充された、グルコース含有M9培地（Mille
r,「Experiments in Molecular Genetics」,Cold Sprin
g Harbor,1972）からなる。しかしながら菌株DG 30が同
じく最早や合成できないアミノ酸チロシンは培地に添加
されなかつた。800個の「拾い移し」たコロニーのうち
７個が最少培地上で生育できた。 エシエリヒア・コリDG 30中の３種のありうる遺伝子a
spC、ilvEおよびtyrBを区別するためにこれら７種のコ
ロニーを、遺伝子の１つによりコードされるトランスア
ミナーゼの１つに対して基質特異性を示す１アミノ酸を
それぞれ除外して前記したアミノ酸を補充した前記最少
培地上に再び「拾い移し」た。 その結果を以下の表に示す。 g.tyrB遺伝子の位置測定 Maniatis氏他、Cold Spring Harbor、366〜370（198
2）によるミニ分析を行うことにより、例６で得られた
クローン１〜７からコスミドDNAが得られた。次にこの
コスミドDNAをエシエリヒア・コリDH1（ATCC 33849）中
に導入し、そこからこれらは良好な収率で再び単離でき
た。 本来エシエリヒア・コリDG 30（例６参照）のクロー
ン３から得られたプラスミドDNAを、このDNAで形質転換
された菌株エシエリヒア・コリDH1から単離しそして制
限酵素Sal IおよびSma Iを用い製造者New England Bicl
aboの教示に従い完全に消化した。ベクターpAT153もCla
Iを用いて完全に消化し、これを次にアルカリホスフア
ターゼでさらに処理した。２種のDNAを一緒にし、例４
記載の方法に従い相互に連結しそして菌株エシエリヒア
・コリATCC 11303のコンピテントな細胞をリガーゼ調製
物の一部分、例えば10μを用いて形質転換した。50μ
g/mlのアンピシリンを含有するＬ−ブイヨンプレート上
の抵抗性のコロニーを選択し、そして20μg/mlのテトラ
サイクリンを含有するＬ−ブイヨンプレート上の「レプ
リカ培養」によりマーカー不活化および従つてとり込み
について検査した。表現型AprTcsを示すコロニーから、
ミニ分析法によりプラスミドDNAを単離しそして制限酵
素Cla Iを用いて完全に消化することによりベクターpAT
153中におけるCla I断片の存在について検査した。 h.トランスアミナーゼ活性の検査 例７で得られたクローンをAPPAT試験（フエニルピル
ベート−アミノトランスフエラーゼ分析装置、Sigma−
テストキツトG0390、α−ケトグルタレートをフエニル
ピルベートにより置換）を用いた芳香族トランスアミナ
ーゼ活性、すなわちtyrBの遺伝子産物について検査し
た。形質転換されていない出発菌株エシエリヒア・コリ
ATCC 11303を比較用に用いた。ここで１例においては出
発菌株エシエリヒア・コリATCC 11303に比較してtyrB活
性の著明な増加、すなわち５〜10倍の増加が測定され
た。 適当なマーカーを使用するアガロースゲル電気泳動に
より、約2.7MDの寸法のCla I断片がとり込まれて含有さ
れるnAT 153ベクターがtyrB遺伝子活性の増大を示す菌
株中に含有されることを示すことができた。単離された
プラスミドDNAを用いて新たにプラスミド不含菌株エシ
エリヒア・コリATCC 11303を形質転換した場合、あらゆ
る場合にtyrB遺伝子活性が約５〜10倍増加することが観
察された。 ilvE遺伝子を用いるエシエリヒア・コリATCC 11303の
形質転換も同様な方法で行われる。 参考例 Ｌ−第三ロイシンの調製 a.エシエリヒア・コリATCC 11303の例６により選択され
た菌株を下記栄養溶液中で培養した。 フマル酸 10 g/ 肉エキス 20 g/ アスパラギン酸 ８ g/ KH2PO4 ２ g/ MgSO4・7H2O 0.5g/ CaCl2・2H2O 0.1g/ 3,3−ジメチル−２−オキソ−ブタン酸 ４ g/
水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.4に調整 37℃で48時間生育させた後、細胞を遠心分離した。RP
C−８カラム上のHPLC（移動相、100mMのNa−アセテート
（pH7.2）およびメタノールからなるグラジエント）に
より上澄み液中に0.9g/のＬ−２−アミノ−3,3−ジメ
チル−ブタン酸（第三ロイシン）が測定された。 b.細胞物質を実施例8aと同様にして培養しそして10ミリ
モル／のトリス−HCl緩衝液（pH7.4）中の10g/のア
スパラギン酸および4g/の3,3−ジメチル−２−オキソ
−ブタン酸からなる溶液中で振盪しながらインキユベー
シヨンした。37℃で24時間後、HPLCにより1.9g/のＬ
−２−アミノ−3,3−ジメチル−ブタン酸が測定され
た。 例 ８ Ｌ−ホスフイノスリシンの調製 細胞物質を例８と同様にするが3,3−ジメチル−２−
オキソ−ブタン酸の代りに4g/のジメチルピルベート
を用いて培養した。48時間後細胞を遠心分離し、緩衝液
で洗いそして10ミリモル／のトリス/HCl（pH7.4）中
の4g/のナトリウム−（３−カルボキシ−３−オキソ
−プロピル）−メチルホスフイネートおよび8g/のア
スパラギン酸ナトリウムからなる水溶液中37℃で24時間
インキユベーシヨンした。次に細胞を遠心分離しそして
上澄み液中に形成されたＬ−ホスフイノスリシン量をHP
LC分析により測定した。3.2g/のホスフイノスリシン
が測定された。 例 ９ 組換え型細菌を用いるＬ−ホスフイノスリシンの調製 プラスミドによりコードされたilvEトランスアミナー
ゼ活性を有する例７で得られるエシエリヒア・コリ菌株
を下記栄養溶液中で発酵させた。 グルコース ５ g/ Na2HPO4 3.5g/ KH2PO4 1.8g/ （KH4）2HPO4 12 g/ （NH4）2SO4 ６ g/ MgSO4 0.2g/ 酵母エキス １ g/ NaOHを用いてpH7.4に調整 ４時間生育させたのち毎時0.5〜20g/のグルコース
指数補給を開始した。16時間生育させたあとで細胞は乾
燥重量20g/そしてトランスアミナーゼ活性15000μモ
ル／分／を有していた。発酵後細胞をそれ以上洗浄す
ることなく直接100mlの反応バツチ中に使用した。反応
混合物は10ミリモル／のトリス/HCl緩衝液（pH7.4）
中に1500μモル／分／のトランスアミナーゼ活性、0.
1mlのポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート
（ツイーン（Tween）R80）、90ミリモル／のナトリウ
ム−（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチ
ルホスフイネートおよび200ミリモル／のグルタミン
酸を含有しそして37℃で穏やかに振盪した。24時間後細
胞を遠心分離しそして上澄み液中のＬ−ホスフイノスリ
シンをHPLC分析により測定した。70ミリモル／のＬ−
ホスフイノスリシンが測定された。
はありうる生物学的活性ゆえに大変重要である。Ｌ−ジ
ヒドロキシフエニルアラニン（Ｌ−ドーパ）またはα−
メチルドーパのような幾種かのものは医薬分野に効果的
に使用されるし、またはホスフイノスリシン（phosphin
othricine）のように植物保護に使用される。その他の
ものには医薬の前駆物質、例えば半合成ペニシリンであ
るアンピシリンおよびアモキシシリン製造におけるＤ−
フエニルグリシンまたはβ−ｐ−ヒドロキシフエニルグ
リシンがあげられる。これらはまた精製化学薬品合成の
ための価値ある前駆物質でもありうる。アミノ酸誘導体
の不斉合成においては特に第三ロイシンも採用されてき
た（U.Schllkopf氏の「Pure and Appl.Chem.」55,179
9〜1806（1983））。 非タンパク性の光学活性アミノ酸は化学的経路でのみ
製造されるのが好ましい。その場合立体選択的に操作で
きず、最終生成物としてラセミ化合物が得られるという
欠点がある。これに対し酵素による方法は簡単に調製で
きる中間体から酵素工程を用いることによりキラール化
合物が選択的に合成されうるという利点を非常にしばし
ば有する。このことは２つの立体異性化合物のうちの一
方のみが生物学的に活性である場合に特に好都合であ
る。 トランスアミナーゼを用いる生物学的変換による天然
の、いわゆるタンパク性アミノ酸の合成それ自体は知ら
れている。ヨーロツパ特許出願第152,275号にはアミノ
トランスフエラーゼの過剰生産により特徴づけられる遺
伝子工学的に修飾された微生物を用いるアミノ交換反応
によるフエニルアラニンの製法が記載されている。ヨー
ロツパ特許出願第1,35,846号ではα−ケト酸をエシエリ
ヒア・コリ（Escherichia coli）から単離されるトラン
スアミラーゼの存在下でアミノ基供与体としてのＬ−ア
スパラギン酸と反応させることにより天然のＬ−アミノ
酸を製造している。それによりα−ケト酸に相当するＬ
−アミノ酸、ならびにアスパラギン酸から生成するオキ
サロアセテートが形成される。 フェニルピルビン酸からより高収率にＬ−フエニルア
ラニンを製造するためのエシエリヒア・コリ（E.col
i）、パラコツカス・デニトリフイカンス（Paracoccus
denitrificans）、トルラ（Torula）、ロドトルラ（Rho
dotorula）およびストレプトミセス（Streptomyces）の
系列の微生物の選択および突然変異は西ドイル特許出願
第3,423,936号に報告されている。 天然には存在しない、いわゆる非タンパク性アミノ酸
はこれまで酵素による生物学的変換法によつては製造さ
れなかつた。 今、非タンパク性アミノ酸であるＬ−ホスフイノスリ
シンがアミノ変換反応により非常に良好な収率で合成さ
れうることが見出された。種々の天然のタンパク性アミ
ノ酸がトランスアミナーゼを用いて合成されうることは
知られていたとしても、酵素の特異性ゆえに非タンパク
性アミノ酸が天然に存在しないα−ケト酸を前駆物質と
して用いてこの方法により同様に製造されうることは驚
くべきことである。それゆえ相当する前駆物質が、天然
のアミノ酸の前駆物質においてはこの形態で存在しない
疎水性残基を有するにも拘らずトランスアミナーゼの活
性中心によつて受容されそして変換されることは驚くべ
きことである。 従って本発明は（３−カルボキシ−３−オキソ−プロ
ピル）−メチルホスフィン酸またはその塩をアミノ基供
与体としてのアミノ酸の存在下に、アルカリゲネス（Al
caligenes）、リゾビウム（Rhizobium）、シュードモナ
ス（Pseudomonas）、セラチア（Serratia）、ロドコッ
カス（Rhodococcus）、エンテロバクター（Enterobacte
r）またはエシェリヒア（Esherichia）属の微生物を用
いてアミノ交換反応することからなるＬ−ホスフィノス
リシンの製法に関する。 以下に本発明について詳細に説明する。 多数の生物体例えば微生物、植物および豚の心臓のよ
うな動物器官から得られる酵素はα−ケト酸をアミノ交
換反応により天然のＬ−アミノ酸に変換させうる。これ
ら生物体またはそれらの酵素は本発明に使用されうる。
しかしながら、トランスアミナーゼを有する微生物、例
えばパラコツカス（Paracoccus）、アルカリゲネス（Al
caligenes）、リゾビウム（Rhizobium）、シユードモナ
ス（Pseudomonas）、セラシア（Serratia）、アグロバ
クテリウム（Agrobacterium）およびストレプトミセス
（Streptomyces）属の微生物または腸内菌科の細菌を用
いて操作するのが好ましい。特に好ましい微生物はアル
カリゲネス・フエカリス（Alcaligenes faecalis）DSM
4115、アルカリゲネス・デニトリフイカンス（Alcalige
nes denitrificans）DSM 4114、シユードモナス・パウ
シモビリス（Pseudomonas paucimobilis）DSM 4120、シ
ユードモナス種（Pseudomonas spec.）DSM 4119、セラ
シア・プリムシカ（Serratia plymuthica）DSM 4116、
アグロバクテリウム、ツメフアシエンス（Agrobacteriu
m tumefaciens）、エシエリヒア・コリ DH1、エシエリ
ヒア・コリ ATCC 11303、エンテロバクター・アグロメ
ランス（Enterobacter agglomerans）DSM 4122、エンテ
ロバクター種（Enterobacter spec.）DSM 4121、ならび
に３種の土壌単離物のロドコッカス種DSM 4113、DSM 41
17およびエンテロバクター・インターメジウム（Entero
bacter inttermedium）DSM 4118である。 これらの微生物はそれらが自由に入手できないかまた
は当業者が本発明を実施できる程度に記載されていない
場合は「ドイツ微生物寄託機関（Deutsche Sammlung f
r Mikro organism（DSMと略記））」に寄託されてい
る。 ホスフイノスリシン抵抗性であるかまたは唯一の窒素
源としてホスフイノスリシンを利用する菌株、例えばア
ルカリゲネス・フエカリスDSM 4115、アグロバクテリウ
ム・ツメフアシエンスならびにロドコッカス種DSM 4113
が選択される場合は比較的高い酵素活性が得られうる。
これは好都合であるが、絶対に必要なわけではない。同
様にそれ自体知られた方法で選択および突然変異させる
ことにより、培地中のより多量の3,3−ジメチル−２−
オキソブタン酸、フエニルピルビン酸または（３−カル
ボキシ−３−オキソプロピル）−メチルホスフイン酸ま
たはそれらの塩に対し、α−ケト酸に対する適合性ゆえ
にアミノ交換反応をより高収率に進行せしめる微生物を
以後の操作用に選択することができる。（３−カルボキ
シ−３−オキソ−プロピル）−メチルホスフイン酸また
はその塩も同様に知られた方法により製造される（Hans
Beyer氏の「Lehrbuch der organischen Chemie（Texbo
ok of Organic Chemistry）」、S.Hirzel出版、Stuttga
rt）。 遺伝子工学的に操作された微生物を本発明方法に使用
する場合も良好な収量が得られる。tyrB遺伝子またはil
vE遺伝子を含有するプラスミド形質転換されたエシエリ
ヒア・コリATCC 11303を用いるのが特に好ましく、ここ
でtyrB遺伝子は芳香族トランスアミナーゼをそしてilvE
遺伝子は脂肪族トランスアミナーゼをそれぞれコードす
る。かくの如く操作された菌株は例えば西ドイツ特許出
願P 36 31 829.9号またはP 36 36 722.2号の記載により
調製されうる。 アミノ交換反応は培養と同時に行われうる。その場合
ホスフイノスリシンに対して抵抗性を有する微生物例え
ばアルカリゲネス・フエカリスDSM 4115およびアグロバ
クテリウム・ツメフアシエンスを用いて操作するのが好
ましい。しかしながら微生物はその生育に最適の培養基
中で適当な好ましい温度条件および通気条件下に栄養溶
液１当り乾燥重量約４〜60gとなるまで培養するのが
好ましい。それぞれの微生物に最も好都合な条件は当業
者に知られているかまたは簡単な予備実験により判定さ
れうる。次に細胞を栄養溶液中に、または栄養溶液から
分離してα−ケト酸のアミノ化に使用する。アミノ交換
反応は細胞全体を用いてあるいは破壊した細胞を用いて
も実施でき、慣用の破壊法が用いられる。アミノ交換反
応は細胞抽出物、単離された総タンパク質または精製ト
ランスアミナーゼを用いても同様に実施できる。しかし
ながら例えば価格などの実際的理由から、完全な細胞全
体を用いて操作するのが好ましい。しかしながらその寿
命が比較的長いことおよび反応をより良好に調節しうる
ことのゆえにトランスアミナーゼを単離使用することも
同様に好都合でありうる。さらに、微生物または酵素を
固定した形態で使用することも可能である。固定には知
られた方法、好都合には西ドイツ特許出願公開第3,237,
341号および同第3,243,591号記載の方法が用いられる。 微生物または単離された酵素系は好ましい実施形態に
おいては、α−ケト酸およびアミノ基供与体の添加の下
においてそのトランスアミナーゼ活性が著しくマイナス
の影響を受けることがないように生理的緩衝液中に懸濁
する。微生物の量に応じ、微生物の形態でかまたは単離
された酵素系の形態で反応混合物に添加される酵素活性
は広範囲に変動しうる。好都合には活性は10〜20000μ
モル／分・である。反応混合物は酵素活性1500〜2000
μモル／分・に相当する細胞量を含有するのが好まし
い。 アミノ基供与体としてはアミノ酸が使用される。どの
アミノ酸が用いられるのが好ましいかは実質上微生物ま
たは単離された酵素系の如何によるものであるが、これ
は簡単な予備試験により判定されうる。例えばバリン、
ロイシン、イソロイシン、メチオニン、チロシンおよび
フエニルアラニン、特にアスパラギン、アスパラギン
酸、グルタミン、グルタミン酸およびグリシンが適当で
ある。これらのアミノ酸は、Ｌ−形のみが本発明に利用
されるのでＬ−形における遊離の酸または適当な塩（用
いられる培地に相当して）として使用される。Ｌ−ホス
フイノスリシンの製造には（３−カルボキシ−３−オキ
ソ−プロピル）−メチルホスフイン酸が使用される。そ
れらの塩も使用でき、その場合当然トランスアミナーゼ
活性に著明にマイナスに影響しないイオンが選択され
る。ナトリウム、カリウムおよびアンモニウム塩が好ま
しい。アミノ基供与体はα−ケト酸に対し等モル量また
は過剰に添加される。1:1〜5:1好ましくは1:1〜2:1なる
割合が適当であることが判明した。 反応混合物への反応体の添加は、水中における溶液と
してまたは固形物質を添加することにより同時に行われ
うる。しかしながら反応混合物の重量に基づき0.1〜4.5
％特に0.2〜２％の量で１〜90時間好ましくは２〜40時
間にわたり段階的にまたは継続的に添加するのが好まし
い。 pH5〜９、特にpH7〜8.5で操作するのが好ましい。そ
の他アミノ変換反応は10℃〜65℃、特に20〜50℃の温度
範囲で実施するのが好都合である。これより温度が低い
と酵素反応が遅くなつてゆき、一方これより温度が高い
と酵素が不活化されてゆく。 最も好都合な操作法はそれぞれの微生物の如何に応じ
たものであり、そして簡単な予備試験により容易に決定
されうる。 微生物をアミノ交換反応期間前または期間中は浸透性
となすことが特に好都合であると判明した。これはトル
エン、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ジメ
チルスルホキシド等のような適当な薬剤をインキユベー
シヨン培地に添加することによりなされうる。 以下の例により本発明をより詳細に説明する。％記載
は別に断わりなければ重量によるものとする。 例 １ 微生物の培養と後処理 寄託されるかまたは自由に入手しうる前記細胞をLB−
培地〔Luria−Bertani−培地:1当り10gバクト（Bact
o）−トリプトン/5gパクト酵母抽出物/10g NaCl（pH7.
5）〕またはM9−最少培地〔１当り6g Na2HPO4/3g KH2
PO4/0.5g NaCl/1g NH4Cl/2ml 1M MgSO4＋10ml 20％グル
コース＋0.1ml 1M CaCl2＋1ml 1％ビタミンB1（サイア
ミン）（pH7.4）〕中の液体培養液400ml中で30℃（エシ
エリヒア・コリ以外の全ての細菌）または37℃（エシエ
リヒア・コリDH1）で一夜培養した。 次に細菌を遠心分離しそして細胞ペレツトをpH7.0の
洗浄緩衝液（10mM Na2HPO4、10mM NaCl）中で数回洗い
そして終りに細胞ペレツト3gにつき洗浄緩衝液5ml中に
懸濁した。この細胞を１分間の超音波処理を５回行うこ
とにより崩壊させそして細胞断片を遠心分離した。かく
して得られた溶解物上澄み液は−20℃で数ケ月間保存さ
れうる。 例 ２ タンパク質の単離 タンパク質を単離するには、溶解物上澄み液5mlずつ
に洗浄緩衝液を加えてそれぞれ50mlとなしそして硫酸ア
ンモニウムを65％まで添加することによりタンパク質を
沈澱させた。10000gで15分間遠心分離したのちタンパク
質ペレツトを10mM Na2HPO4（pH7.0）、1mM EDTA、２％
グリセリンおよび1mMジチオトレイトール（DTT）を含有
する溶液5ml中にそれぞれ再懸濁させた。これらの懸濁
液も同じく−20℃で保存されうる。精製効果をより良く
するためにタンパク質の一部は硫酸アンモニウムで２回
沈澱させた。 タンパク質測定はビウレツト法で行われた。前記した
教示に従つて行われた調製物中のタンパク質含量は大抵
の場合５〜10mg/mlであつた。アルカリゲネス・フエカ
リスDSM 4115およびロドコッカス種 DSM 4113から得ら
れるトランスアミナーゼの部分精製を行うには、硫酸ア
ンモニウムをそれぞれ10％刻みで25％から75％添加して
タンパク質を分別沈澱させそして個々のフラクシヨンの
トランスアミナーゼ活性について検査（下記参照）し
た。最大の比活性を有するタンパク質フラクシヨンをセ
フアデツクスG100を含有するゲル過カラムに適用しそ
して10mMのNa2HPO4（pH7.0）を用いて溶離した。トラン
スアミナーゼ比活性が最大である溶出液フラクシヨンを
硫酸アンモニウムで反復沈澱させることにより濃縮しそ
して10mM Na2HPO4（pH7.0）、1mM EDTA、２％グリセリ
ンおよび1mM DTTを含有する溶液中に5mg/mlとなるよう
にとつた。 （セフアデツクス（Sephadex） G 100）ポリデキス
トランカラムフラクシヨンの分子量は標準分子量タンパ
ク質との比較により測定した。単離されたトランスアミ
ナーゼフラクシヨンの純度はタンパク質試料を10％SDS/
ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動することにより検
査した。 例 ３ 液体培養におけるホスフイノスリシン合成試験 唯一のＮ源として3g/（20mM）のＬ−グルタミン酸
および2g/（10mM）のナトリウム−（３−カルボキシ
−３−オキソ−プロピル）−メチルホスフイネートを含
有するLB培地中の各細菌菌株の5ml培養物を30℃で調製
した。１日および２日後に1mlの試料を採取しそして細
菌細胞を95℃に20分間加熱することにより殺した。遠心
分離したのち上澄み液をとり出しそしてアミノ酸分析器
（AA−分析器）中でホスフイノスリシン形成について検
べた。アルカリゲネス・フエカリスDSM 4115は24時間後
に基質を0.3g/のＬ−ホスフイノスリシン（α−ケト
酸に基づき15％の変換率）に変換した。48時間後には5g
/のＬ−ホスフイノスリシン（25％の変換率）が得ら
れた。 例 ４ 細胞抽出物およびタンパク質単離物を用いるトランスア
ミナーゼ試験 細菌の溶解物上澄み液および単離された総タンパク
質、ならびにアルカリゲネス・フエカリスDSM 4115およ
びDSM 4113から得られた富化されたトランスアミナーゼ
フラクシヨンを10mM Na2HPO4および10mM NaCl（pH7.0）
を含有する溶液を用いてタンパク質含量20〜60mg/mlに
調整しそしてNH2−供与体としての80mM L−グルタミン
酸および20mMナトリウム−（３−カルボキシ−３−オキ
ソ−プロピル）−メチルホスフイネートを含有する標準
バツチ中30℃でインキユベーシヨンした。実験条件の如
何に応じインキユベーシヨン時間０〜24時間で100μ
の試料を採取し、タンパク質を95℃で10分間変性させ、
遠心分離しそして反応上澄み液をAA−分析器中でホスフ
イノスリシンについて検査した。 対照反応は何ら供与体アミノ酸またはナトリウム−
（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチルホ
スフイネートを含有しないか、または熱不活性化したタ
ンパク質（95℃、10分間）を用いて行われた。 特異的なトランスアミナーゼ阻害剤として10mMのヒド
ロキシルアミンを添加することによりホスフイノスリシ
ン形成が完全に抑制された。 ホスフイノスリシン−トランスアミナーゼ比活性はタ
ンパク質1mgにつき１時間につき形成されたホスフイノ
スリシンのｎモルで示され、アミノ交換の反応性はタン
パク質1mg当りまたは１当り１分間で生成されるホス
フイノスリシンのμモル（U/タンパク質mgまたはU/）
で示される。１単位（Ｕ）はＬ−ホスフイノスリシンへ
の変換毎分１μモルに相当する。 ａ） 溶解物上澄み液（未精製）を用いるＬ−ホスホノ
スリシン（PTC）合成 ｂ） 単離された全タンパク質（（NH4）2SO4で精製）
を用いるＬ−PTC合成 ｃ） 精製トランスアミナーゼ酵素を用いるＬ−PTC合
成 ｄ） ロドコッカス種（DSM 4113）、アルカリゲネス・
フェカリス（DSM 4115）およびエシェルヒア・コリDH1
の粗抽出物を用いる、アミノ交換反応によるＬ−PTC合
成のために有効なアミノ酸供与体 試験は、前述のグルタミン酸の代わりに上記表中のア
ミノ酸を用いて同様に実施された。トランスアミナーゼ
比活性はmU/タンパク質mgで示されている（1mU＝1nmol
L−ホスフィノスリシン／分）。 ｅ） NH2−供与体としてグルタミン酸を用いた場合
の、土壌単離物の粗抽出物におけるＬ−ホスフィノスリ
シン−トランスアミナーゼ比活性 〔酵素活性はmU/タンパク質mgで表示されている（1mU＝
1nmol L−ホスフィノスリシン／分）。〕 例 ５ ホスフイノスリシン合成の立体選択性に関する試験 アミノ変換反応によるホスフイノスリシン生成に関す
る立体特異性をＮ−アセチルトランスフエラーゼ反応に
より検査した。この酵素は２〜３の土壌細菌で検出（例
えば西ドイツ特許出願P 36 28 74.74）されそして知ら
れた方法で単離されうる。このものはＬ−ホスフイノス
リシンとのみ立体特異的に反応してそれがアセチル−Co
A−依存性反応により定量的に対応するＮ−アセチル誘
導体に変換される。 試験においては、アミノ交換反応によりホスフイノス
リシンが形成されている例４で得られた反応上澄み液を
アルカリゲネス・フエカリスDSM 4115から得られたタン
パク質（1mg/ml）および10mMのアセチルCoAと30℃で５
時間インキユベーシヨンした。反応上澄み液を次に再び
未反応ホスフイノスリシンについてAA−分析器で検査し
た。 アミノ交換反応により酵素的に形成されたホスフイノ
スリシンはそれぞれＮ−アセチルトランスフエラーゼ反
応により完全に崩壊された。これはアミノ変換反応の立
体選択性を証明している。純粋なＬ−ホスフイノスリシ
ンが形成されている。 例 ６ エシエリヒア・コリATCC 11303の選択 エシエリヒア・コリATCC 11303を常法により培養しそ
してE.Adelberg氏他の「Biocchem.Biophys.Res.Comm.」
18,788（1965）の記載によりＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアジン（NMG）を用いて突然変異させ
た。NMGで処理した細胞を下記組成を有する圧熱滅菌さ
れた寒天上に画線した。 フマル酸 ５ g/ 肉エキス 20 g/ アスパラギン酸 20 g/ KH2PO4 ２ g/ MgSO4・7H2O 0.5g/ CaCl2・2H2O 0.1g/ 寒天 20 g/ 水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.2に調整 フエニルピルベートの滅菌過された溶液をまだ熱い
寒天溶液にフエニルピルベートの最終濃度が24g/とな
るように注いだ。このプレートを37℃で４日間インキユ
ベーシヨンした。直径1mm以上のコロニーを単離した。
生育する菌株の20％が出発菌株に比較して高いトランス
アミナーゼ活性を有していた。 トランスアミナーゼ活性はSigmaテストキツトG 0390
を用いて測定された。 例 ７ a.エシエリヒア・コリからのコスミドpIMS 6026の単離
および消化 トランスポゾンTn903のカナマイシン抵抗性が存在す
る商業的に入手しうるEcoR I断片（Pharmacia社製、Upp
sala、スウエーデン）を、コスミドpLAFRI（ATCC 3716
7）の独特のEcoR I切断部位中にクローニングすること
によりコスミドpIMS 6026を誘導する。BamH Iでの消化
そして続く再連結により商業に入手しうるEcoR I断片の
大部分が欠失されて、１個のBamH I切断部位が２個のEc
oR I切断部位により両側をはさまれた短いDNA片のみが
挿入物として残存する。 エシエリヒア・コリHB101からコスミドpIMS 6026を単
離するにはHumphreys氏他の方法〔Biochim.Biophys.Act
a 383,457〜63（1975）〕またたはBirnboim氏他による
アルカリ分解〔Nucleic Acids Res.７,1513（1979）〕
のいずれかに従い10倍の規模で実施した。いずれの場合
もプラスミドDNAはCsCl/EtBr密度勾配遠心分離により少
くとも１回は精製した。 このコスミドpIMS 6026を製造者New England Biolabs
の教示に従い操作して制限酵素のBamH Iで完全に消化し
た。この消化が完結したかどうか検査するには制限調製
物の一部分を0.8％アガロースゲルに適用した電気泳動
にかけた。エチジウムブロマイドで着色しそして短波長
UV光線（254nm）で照射して１本のバンドのみが見られ
る場合は完全な消化を示すものとされた。消化されたコ
スミドDNAからフエノール処理により制限酵素を除去
し、DNAをエタノールで沈澱させ、70％エタノールで洗
いそして真空下に乾燥したのち適当量のTE緩衝液（10mM
のトリスおよび1mMのEDTA、pH8.0）中にとつた。選択に
より、製造者Boehringer Mannheimの教示に従いアルカ
リホスフアターゼでさらに処理した。１μのアルカリ
ホスフアターゼ（CIP）を添加したのち37℃で30分間イ
ンキユベーシヨンし、フエノール処理により反応混合物
から酵素を除去し、そしてDNAを前記したようにして精
製した。これを終りにTE緩衝中に再懸濁した。 b.エシエリヒア・コリATCC 11303からのDNAの部分消化 Marmur氏の「I.Mol.Biol.」53,155〜162（1961）記載
の方法に従いエシエリヒア・コリATCC 11303から全DNA
を単離した。この単離された全DNAを制限酵素Sau3Aを用
いて部分消化すると主に20〜30kbの寸法の断片が生成し
た。この目的には予備実験においてこの反応に最適のDN
A:酵素比ならびにDNAに及ぼす酵素の最適作用時間が判
定された。適当な操作法はBRL社から出されたパンフレ
ツト「Focus」７（２）,3（1985）に記載されている。
最適と定められた反応時間経過後、酵素を65℃に10分間
加熱することにより破壊しそして所望の寸法範囲内のDN
A断片が形成されたかどうかをアガロースゲル電気泳動
により適当なDNA−マーカー例えばフアージλのEcoR I
消化されたDNAを用いて検査した。 c.制限部位の連結 エシエリヒア・コリATCC 11303から得られる総DNAをS
au3Aで部分消化したものをBamH Iで完全に切断しそして
アルカリフオスフアターゼ処理したpIMS 6026コスミドD
NAと約1:5なるモル比で混合した。生成した混合物を、N
ew England Biolabsの教示に従い酵素T4−DNAリガーゼ
にとつて最適のイオン濃度を生ずるように数倍濃度の緩
衝液で処理し、そして酵素１μと一緒に16℃で少くと
も14時間インキユベーシヨンした。反応混合物の総量は
50μであり、総DNA濃度は20μg/mlであつた。 d.λ−フアージ中へのパツケージング リガーゼ反応が行われた後、例３で得られたDNAをin
vitroでλ−フアージの頭部にパツケージングした。こ
の目的に必要な抽出物はB.Hohn氏の「Recombinant DNA,
Methods in Enzymology」68,Academic Press,New York,
299〜309頁（1979）記載の方法により２種の異なる細菌
菌株から得ることができるしまたはBoshringer Mannhei
m社またはAmersham Buchler,Brunswick社から得られう
る。 例３で得られた混合物３μを直前に解凍されたAmer
sham社の細菌抽出物と氷冷下に充分によく混合した。こ
の混合物を20℃で30〜60分間インキユベーシヨンしそし
て次にSM−緩衝液（100mM NaCl、10mM MgSO4、50mMトリ
ス−HCl（pH7.5）および0.01％ゼラチン）200μを加
えた。この混合物を直接形質導入反応にかけるかまたは
10μのクロロホルムを添加したのち後程の使用時まで
４℃で保存した。 e.エシエリヒア・コリDG 30の形質導入 １％Bacto−トリプトン、0.5％酵母エキスおよび0.5
％NaClからなるＬ−ブイヨン5mlに0.4％のマルトースを
加えそして定常生長期にあるエシエリヒア・コリDG 30
の液体培養物50μを接種した。早期定常期に達するま
でこの混合物を37℃で12時間インキユベーシヨンした。
細菌を遠心分離しそして10ミリモルMgCl2水溶液2.5ml中
に注意深く再懸濁した。例４記載の混合物10μに濃細
菌懸濁液20μを加えそして室温で50分間インキユベー
シヨンした。 次にＬ−ブイヨン200μをこれに加え、この混合物
を時々振盪しながら37℃で１時間インキユベーシヨンし
た。 この調製物50μずつを20μg/mlのテトラサイクリン
を含有するＬ−ブイヨン−寒天上に塗布した。このプレ
ートを37℃で少くとも12時間インキユベーシヨンした。
前記した操作法により、１つの調製物から平均1000個の
コロニーを得ることができた。 f.aspC、ilvEまたはtyrB遺伝子を有するエシエリヒア・
コリDG 30の選択 20μg/mlのテトラサイクリンを含有するＬ−ブイヨン
−寒天上で前記した方法に従いエシエリヒア・コリDG 3
0の形質導入により得られた約800個のコロニーを最少寒
天上に「拾い移し」た。最少寒天はアミノ酸イソロイシ
ン、ロイシン、バリン、アスパラギン酸およびフエニル
アラニンを補充された、グルコース含有M9培地（Mille
r,「Experiments in Molecular Genetics」,Cold Sprin
g Harbor,1972）からなる。しかしながら菌株DG 30が同
じく最早や合成できないアミノ酸チロシンは培地に添加
されなかつた。800個の「拾い移し」たコロニーのうち
７個が最少培地上で生育できた。 エシエリヒア・コリDG 30中の３種のありうる遺伝子a
spC、ilvEおよびtyrBを区別するためにこれら７種のコ
ロニーを、遺伝子の１つによりコードされるトランスア
ミナーゼの１つに対して基質特異性を示す１アミノ酸を
それぞれ除外して前記したアミノ酸を補充した前記最少
培地上に再び「拾い移し」た。 その結果を以下の表に示す。 g.tyrB遺伝子の位置測定 Maniatis氏他、Cold Spring Harbor、366〜370（198
2）によるミニ分析を行うことにより、例６で得られた
クローン１〜７からコスミドDNAが得られた。次にこの
コスミドDNAをエシエリヒア・コリDH1（ATCC 33849）中
に導入し、そこからこれらは良好な収率で再び単離でき
た。 本来エシエリヒア・コリDG 30（例６参照）のクロー
ン３から得られたプラスミドDNAを、このDNAで形質転換
された菌株エシエリヒア・コリDH1から単離しそして制
限酵素Sal IおよびSma Iを用い製造者New England Bicl
aboの教示に従い完全に消化した。ベクターpAT153もCla
Iを用いて完全に消化し、これを次にアルカリホスフア
ターゼでさらに処理した。２種のDNAを一緒にし、例４
記載の方法に従い相互に連結しそして菌株エシエリヒア
・コリATCC 11303のコンピテントな細胞をリガーゼ調製
物の一部分、例えば10μを用いて形質転換した。50μ
g/mlのアンピシリンを含有するＬ−ブイヨンプレート上
の抵抗性のコロニーを選択し、そして20μg/mlのテトラ
サイクリンを含有するＬ−ブイヨンプレート上の「レプ
リカ培養」によりマーカー不活化および従つてとり込み
について検査した。表現型AprTcsを示すコロニーから、
ミニ分析法によりプラスミドDNAを単離しそして制限酵
素Cla Iを用いて完全に消化することによりベクターpAT
153中におけるCla I断片の存在について検査した。 h.トランスアミナーゼ活性の検査 例７で得られたクローンをAPPAT試験（フエニルピル
ベート−アミノトランスフエラーゼ分析装置、Sigma−
テストキツトG0390、α−ケトグルタレートをフエニル
ピルベートにより置換）を用いた芳香族トランスアミナ
ーゼ活性、すなわちtyrBの遺伝子産物について検査し
た。形質転換されていない出発菌株エシエリヒア・コリ
ATCC 11303を比較用に用いた。ここで１例においては出
発菌株エシエリヒア・コリATCC 11303に比較してtyrB活
性の著明な増加、すなわち５〜10倍の増加が測定され
た。 適当なマーカーを使用するアガロースゲル電気泳動に
より、約2.7MDの寸法のCla I断片がとり込まれて含有さ
れるnAT 153ベクターがtyrB遺伝子活性の増大を示す菌
株中に含有されることを示すことができた。単離された
プラスミドDNAを用いて新たにプラスミド不含菌株エシ
エリヒア・コリATCC 11303を形質転換した場合、あらゆ
る場合にtyrB遺伝子活性が約５〜10倍増加することが観
察された。 ilvE遺伝子を用いるエシエリヒア・コリATCC 11303の
形質転換も同様な方法で行われる。 参考例 Ｌ−第三ロイシンの調製 a.エシエリヒア・コリATCC 11303の例６により選択され
た菌株を下記栄養溶液中で培養した。 フマル酸 10 g/ 肉エキス 20 g/ アスパラギン酸 ８ g/ KH2PO4 ２ g/ MgSO4・7H2O 0.5g/ CaCl2・2H2O 0.1g/ 3,3−ジメチル−２−オキソ−ブタン酸 ４ g/
水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.4に調整 37℃で48時間生育させた後、細胞を遠心分離した。RP
C−８カラム上のHPLC（移動相、100mMのNa−アセテート
（pH7.2）およびメタノールからなるグラジエント）に
より上澄み液中に0.9g/のＬ−２−アミノ−3,3−ジメ
チル−ブタン酸（第三ロイシン）が測定された。 b.細胞物質を実施例8aと同様にして培養しそして10ミリ
モル／のトリス−HCl緩衝液（pH7.4）中の10g/のア
スパラギン酸および4g/の3,3−ジメチル−２−オキソ
−ブタン酸からなる溶液中で振盪しながらインキユベー
シヨンした。37℃で24時間後、HPLCにより1.9g/のＬ
−２−アミノ−3,3−ジメチル−ブタン酸が測定され
た。 例 ８ Ｌ−ホスフイノスリシンの調製 細胞物質を例８と同様にするが3,3−ジメチル−２−
オキソ−ブタン酸の代りに4g/のジメチルピルベート
を用いて培養した。48時間後細胞を遠心分離し、緩衝液
で洗いそして10ミリモル／のトリス/HCl（pH7.4）中
の4g/のナトリウム−（３−カルボキシ−３−オキソ
−プロピル）−メチルホスフイネートおよび8g/のア
スパラギン酸ナトリウムからなる水溶液中37℃で24時間
インキユベーシヨンした。次に細胞を遠心分離しそして
上澄み液中に形成されたＬ−ホスフイノスリシン量をHP
LC分析により測定した。3.2g/のホスフイノスリシン
が測定された。 例 ９ 組換え型細菌を用いるＬ−ホスフイノスリシンの調製 プラスミドによりコードされたilvEトランスアミナー
ゼ活性を有する例７で得られるエシエリヒア・コリ菌株
を下記栄養溶液中で発酵させた。 グルコース ５ g/ Na2HPO4 3.5g/ KH2PO4 1.8g/ （KH4）2HPO4 12 g/ （NH4）2SO4 ６ g/ MgSO4 0.2g/ 酵母エキス １ g/ NaOHを用いてpH7.4に調整 ４時間生育させたのち毎時0.5〜20g/のグルコース
指数補給を開始した。16時間生育させたあとで細胞は乾
燥重量20g/そしてトランスアミナーゼ活性15000μモ
ル／分／を有していた。発酵後細胞をそれ以上洗浄す
ることなく直接100mlの反応バツチ中に使用した。反応
混合物は10ミリモル／のトリス/HCl緩衝液（pH7.4）
中に1500μモル／分／のトランスアミナーゼ活性、0.
1mlのポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート
（ツイーン（Tween）R80）、90ミリモル／のナトリウ
ム−（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチ
ルホスフイネートおよび200ミリモル／のグルタミン
酸を含有しそして37℃で穏やかに振盪した。24時間後細
胞を遠心分離しそして上澄み液中のＬ−ホスフイノスリ
シンをHPLC分析により測定した。70ミリモル／のＬ−
ホスフイノスリシンが測定された。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｒ 1:05）
(Ｃ１２Ｐ 13/04
Ｃ１２Ｒ 1:185）
微生物の受託番号 ＤＳＭ ４１２１
微生物の受託番号 ＤＳＭ ４１２２
前置審査
(72)発明者 ハンス−マテイーアス・デガー
ドイツ連邦共和国デー−6238 ホフハイ
ム・アム・タウヌス．アム・ラインガウ
アーヴエーク ８
(72)発明者 ズザネ・グラープライ
ドイツ連邦共和国デー−6240 ケーニヒ
シユタイン／タウヌス．ヘルダーリーン
シユトラーセ ７
(72)発明者 リユーデイガー・マルクヴアルト
ドイツ連邦共和国デー−6000 フランク
フルト・アム・マイン．ギユンタースブ
ルクアレー 69
(56)参考文献 特開 昭64−27485（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．（３−カルボキシ−３−オキソ−プロピル）−メチ
ルホスフィン酸またはその塩をアミノ基供与体としての
アミノ酸の存在下に、アルカリゲネス（Alcaligene
s）、エンテロバクター（Enterobacter）またはエシェ
リヒア（Escherichia）属の微生物を用いてアミノ交換
反応することからなるＬ−ホスフィノスリシンの製法。 ２．アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecal
is）DSM 4115、アルカリゲネス・デニトリフィカンス
（Alcaligenes denitrificans）DSM 4114、エシェリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）DH1 ATCC 33849、エシェ
リヒア・コリ ATCC 11303の突然変異体、エンテロバク
ター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）DS
M 4122、エンテロバクター種（Enterobacter sp.）DSM
4121およびエンテロバクター・インターメジウム（Ente
robacter intermedium）DSM 4118を用いてアミノ交換反
応を行うことからなる特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ３．tyrB遺伝子またはilvE遺伝子を含有するプラスミド
で形質転換されたエシェリヒア・コリ ATCC 11303を用
いてアミノ交換反応を行うことからなる特許請求の範囲
第１または２項記載の方法。 ４．微生物の細胞抽出物、単離された総タンパク質また
は精製トランスアミナーゼを用いてアミノ交換反応を行
うことからなる特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１
項に記載の方法。 ５．アミノ基供与体と（３−カルボキシ−３−オキソ−
プロピル）−メチルホスフィン酸とが1:1〜5:1の比率で
用いられることからなる特許請求の範囲第１〜４項のい
ずれか１項に記載の方法。 ６．アミノ基供与体と（３−カルボキシ−３−オキソ−
プロピル）−メチルホスフィン酸とが1:1〜2:1の比率で
用いられることからなる特許請求の範囲第５項記載の方
法。 ７．アミノ交換反応がpH5〜９で実施されることからな
る特許請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方
法。 ８．アミノ交換反応がpH7〜8.5で実施されることからな
る特許請求の範囲第７項記載の方法。
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