NO175900B - Fremgangsmåte for isolering av amblyommin - Google Patents
Fremgangsmåte for isolering av amblyommin Download PDFInfo
- Publication number
- NO175900B NO175900B NO892266A NO892266A NO175900B NO 175900 B NO175900 B NO 175900B NO 892266 A NO892266 A NO 892266A NO 892266 A NO892266 A NO 892266A NO 175900 B NO175900 B NO 175900B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- ile
- leu
- glu
- ser
- protein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 10
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 10
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 6
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241001480736 Amblyomma hebraeum Species 0.000 claims description 3
- MXNRLFUSFKVQSK-QMMMGPOBSA-O N(6),N(6),N(6)-trimethyl-L-lysine Chemical compound C[N+](C)(C)CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O MXNRLFUSFKVQSK-QMMMGPOBSA-O 0.000 claims description 3
- 241000864202 Rhipicephalus evertsi Species 0.000 claims description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 abstract description 7
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 241000238889 Ixodidae Species 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 241000282458 Ursus sp. Species 0.000 description 28
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000005996 Blood meal Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 2
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 2
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 2
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 206010038563 Reocclusion Diseases 0.000 description 1
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001455 anti-clotting effect Effects 0.000 description 1
- LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N benzenecarboximidamide;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NC(=[NH2+])C1=CC=CC=C1 LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 244000078703 ectoparasite Species 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 235000015816 nutrient absorption Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Substances [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007395 thrombosis prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43527—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from ticks
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/63—Arthropods
- A61K35/646—Arachnids, e.g. spiders, scorpions, ticks or mites
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for isolering av det nye virkemidlet amblyommin for antikoagulasjonsterapi.
Antikoagulasjonsmidler er av stor betydning i medisinen. Eksempel på sentrale, medisinske problemer omfatter f.eks. tromboseprofylakse, arteriell reokklusjonsprofylakse, behandling av tromboser, forbrukskoagulopati og ekstrakor-poral sirkulasjon.
Midler som for tiden kan anvendes innen antikoagulasjonsterapi utviser vanligvis en del uønskede ulemper så som f.eks. blødningsrisiko, trombozyttreduksjon, virkning på ZNS, uegnethet eller indirekte virkning så som f.eks. blir oppdaget på heparinvirkningsskjemaet.
Walsmann og Markwardt (Die Pharmazie Bd. 36 (1981) S. 653) beskriver den farmasøytiske betydningen til hybridiner isolert fra Hirudo medicinalis. Dette er et polypeptid med en lengde på 64-65 aminosyrer (Chan. FEBS Bd. 164 (1983) S. 307; United States Patent 4.668.662). Peptidet er en høyspesifikk trombinhemmer som dessuten ser ut til å være farmakologisk inert. Ulemper med forbindelsen omfatter den relativt korte halveringstiden til forbindelsen og i den parenterale applikas j onsformen.
En antitrombinvirksom forbindelse som ikke utviser noen av de nevnte ulempene er ønskelig. Det er også viktig å lete etter ytterligere antikoagulasjonsmidler som avdekker den ovenfor nevnte medisinske problematikken.
Skogbjørn, familie Ixodidae er i alle utviklingsstadiene temporære, blodsugende ektoparasitter på reptiler, fugler, pattedyr og mennesker. Voksne hunn-skogbjørner forblir vanligvis flere dager på verten og suger blod til hundre ganger av hennes egen vekt. Skogbjørnene har stikkende-sugende munnleddanordninger bestående av de parvis oppstilte cheliserne og hypostomet. Med skjæremekanismen til cheli-cerne, dvs. digitene, skjærer skogbjørnen et sår i Epidermis, og cheliceren og hypostomet blir innført heri, og sugekanalen blir dermed dannet. Spyttkjertlene til de fleste skogbjørnarter produserer et protein, det såkalte sement, som blir avgitt til såret og hvori tennene til hypostomene blir forankret slik at skogbjørnene festes til verten for næringsopptak.
Videre avgir skogbjørnene et sekret fra spyttkjertlene som inneholder antikoagulasjonsmidler.
For blodsuging trenger munnredskapene til skogbjørnene ikke direkte inn 1 blodkapillærer, men inn i vevet. Ved hjelp av spyttkjertelenzymer lyserer de vevet, og skader de fineste kapillærene slik at blodet renner ut. Ved den levringshem-mende virkningen til spyttkjertelsekretene, blør de skadede karene en stund og oppnår dermed en vevsvakuole som skogbjør-nene tar opp næring fra.
For tilveiebringing av stoffer med blodlevringshemmende egenskaper ble dermed spyttkjertler fra skogbjørner under-søkt .
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for isolering av et protein med trombininhibitorisk virkning eller et farmasøytisk anvendbart salt derav, som har en molekylvekt på 20.000 til 30.000 dalton, et isoelektrisk punkt mellom 5,05 og 5,65 og har aminosyredelsekvensen
- Ile-l£u-Phe-Tnr-GLn-&^
- Iys-Ile-Leu-Phe-X-Glii-Gly- og
- Åla^r-Iyr-Ile-Val-X-Ssr-Glu-Ser-Ile-Gln-Ile-Im-X-Læ^r-au-Gly-Ile
hvori hver rest X kan være lik eller forskjellig og betyr en naturlig forekommende aminosyre eller en hvilken som helst etter translasjon modifisert aminosyre, som trimetyllysin eller karboksyglutaminsyre, kjennetegnet ved at proteinet blir ekstrahert fra skogbjørner med aceton, utfelt med
eddiksyre eller trikloreddiksyre ved pH 1,8, fraksjonert ved gelfiltrering og tromblnsepharose-affinitetskromatografi.
Proteinet eller det farmasøytisk anvendbare saltet derav blir isolert fra spyttkjertler og hemmer blodlevringen via trombininhibering.
Selv om dette proteinet og hirudin virker på samme substrat, er begge proteinene overraskende tydelig forskjellig fra hverandre. Proteinet som blir isolert ifølge oppfinnelsen-betegnet amblyommin - har en medisinsk innstillingsverdi forskjellig fra hirudin. Amblyommin er et nytt protein. Det er det første isolerte virkemidlet fra spyttkjertlene til sydafrikanske skogbjørner.
Amblyommin er kjennetegnet ved følgende fysikalske egenskaper. Det har forholdsmessig lav affinitet overfor Coomassie Brillant Blue E250 Bio-Rad. Etter lyofilisering er det vanskelig oppløsbart i vann. Proteinet er uforanderlig i alle anvendte buffre. Fryser man eluatet etter HPLC-rensing ved -80"C, oppnås ingen bestembar aktivitetsreduksjon. Forbindelsen er videre stabil ved 40°C. Den er fellbar med aceton ved pE 1,8 (eddiksyre eller trikloreddiksyre). Dermed oppnås også fullstendig aktivitet i oppløsningen til fellingen også etter minst 12 dager. Hvis man anvender for HPLC-analyse et Water 600 Multisolvent Delivery System og en Biorad RP304 adskillelses-kolonne, og påfører en gradient på 80* A - 20* B (med A = 0,1* TFA og B = 0,1* TFA i 80* acetonitril i EPLC-vann), idet 50* B blir oppnådd etter en løpetid på 40 minutter, blir en reaksjonstid på 27 minutter målt for amblyommin. Med gelfiltrering over G75 superfint materiale har proteinet en molekylvekt på 20.000-30.000 dalton. I en SDS-polyakrylamidgel blir en molekylvekt på 2000 dt ± 2000 dt bestemt. Ved bestemming av det isoelektriske punktet oppnås en verdi på ca. 5,35 ± 0,3. Til slutt blir følgende delaminosyresekvens oppnådd:
-Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Gln-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu-, -Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gly- og -Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Gln-Ile-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ile-,
idet hver rest X kan være lik eller forskjellig og til tross for dette kan bety en naturlig forekommende aminosyre så som f. eks. Tyr, Ser, Thr, Glu, Asp, Asn eller en hvilken som helst modifisert aminosyre som oppstår etter translasjon, så som trimetyllysin eller -Y-karboksyglutaminsyre.
Den spesifikke hemmingen av trombin er den fremragende biologiske egenskapen. Proteinet isolert ifølge oppfinnelsen anvendes i medisinen som et antitrombotikum.
EKSEMPEL 1
Isolering av skogbjørner
Spyttkjertelen til skogbjørnen er et parvis organ og sitter i sagittalretningen på høyre og venstre side av den fremre kroppshalvdelen. Alt etter funksjonstilstand er spyttkjertlene i sultende eksemplarer små eller veldig store i sugende skogbjørner. De anvendte skogbjørnene hørte til Syd-afrikansk Bunt-skogbjørn, Amblyomma hebraeum og Rhipicephalus evertsi, avlet i kolonier i laboratorium i to år ifølge kjente fremgangsmåter.
Delsugde hunner i vektområdet 150-400 mg ble tatt fra vertsddyret og umiddelbart deretter dissikert under et stereomikroskop, idet skogbjørnene ble fiksert i en Petriskål med ryggsiden på dobbeltsidig klebrig limbånd og spylt med PBS-buffer pH 7,2. Etter et snitt ved hjelp av en fin skapell langs periferien til skogbjørnen, ble over- og undersiden oppsprettet og spyttkjertlene ble forsiktig tatt ut og dypfryst i nitrogen.
EKSEMPEL 2
Ekstraks. ion av virkemidlene ut 1 fra sp<y>ttkjertlene til skogbjørnene
Spyttkjertler fra skogbjørn av arten Amblyomma hebraeum ble isolert og deretter knust under nitrogen til et fint pulver. Homogenisatet ble løst og lyofilisert. Den tørkede resten ble oppslemmet i 40* azeton og rystet kraftig ved 40° C i 30 minutter. Til slutt ble det sentrifugert i 10 minutter ved 15000 g. Sedimentet ble, som beskrevet, på ny ekstrahert og resten ble slått sammen med den første ekstraksjonen og sakte omsatt med 1 M eddiksyre til en pH på 5 ble oppnådd. Fellingen ble sentrifugert av og den klare supernatanten isolert. Supernatanten ble omsatt med 10* trikloreddiksyre i azeton til en pE på 1,81 ble oppnådd. Deretter ble iskaldt azeton i 10 ganger volumet tilsatt og felt i 3,5 timer ved-20° C. Fellingen blir sentrifugert ut i 10 minutter ved 6000 rpm i Sorvall-kjølesentrifuge. Sedimentet ble vasket med iskald aceton og eter, og tilslutt suspendert i vann. Suspensjonen ble frosset ved -80°C og til slutt lyofilisert i rotasjonsvakuum-avdamper. Den tørkede resten ble tatt opp i buffer (0,05 M trietanolamin-ECl 0,4 M NaCl pE 7,8).
EKSEMPEL 3
Gelfiltrering
Proteinblandingen i eksempel 2 ble renset ved gelfiltrering. Til dette ble en kolonne med diameter på 1,6 cm og 78,3 cm høyde fylt med G 75 superfine Material fra firmaet Pharmacia. Elueringshastigheten var på 10 ml/time. Søylen ble kalibrert med et gelfiltreringskalibrerings-kit fra firmaet Pharmacia (art. nr. 17-0442-01). Trombinhemmende aktivitet ble registrert i fraksjoner med molekylvektsområde 20.000-30.000.
EKSEMPEL 4
Hemming av levring i plasma
Ut i fra de enkelte G 75-fraksjonene ble aliquoter på 50 jjI blandet med 50 jil H2O og 100 jjI citratbehandlet hundeplasma, som inneholder 3 U trombin pr. ml og trombintiden ble bestemt. Dette ble utført så som i Markwardt et al.
(Pharmazie 43 (1988) 202; Fol. Haematol. 115 (1988) 70).
EKSEMPEL 5
Hemming av trombinkatalysert spalting fra kromozvm TH
Bestemmingen foregikk ifølge publikasjonen til Griesbach et al. (Thromb. Res. 37 (1985), 347-50), men metoden ble forandret på en slik måte at reaksjonen ble gjennomført i "Mikrotiter Platten"-brønner med sluttvolum på 0,2 ml. Vurderingen foregikk ved 405 nM med et "Elisa"-avlesningsap-paratur.
EKSEMPEL 6
Rensing ved hjelp av trombinkolonne- affinitets-kromatograf i
Trombin-sepharose ble fremstilt ifølge metoden til Walsmann, P. (Pharmazie 36 (1981) 860-861). G 75-fraksjonene som viser aktivitet blir slått sammen, lyofylisert og lysatet tatt opp i 0,1 M eddiksyre. Proben blir avsaltet på en avkjølt G 25-kolonne og eluatet ifølge eksempel 5 blir undersøkt for aktivitet. Den tørkede resten blir tatt opp i 0,05 M Tris-HCl (pH 8) og applisert på en forbehandlet trombin-kolonne. Alle trinnene ble utført ved 4°C. Kolonnen ble vasket 2 ganger med 0,05 M Tris-buffer pH 8 før den ble eluert med 5 M ben-zamidiniumklorid i 0,05 M Tris-HCl (pH 8). Fraksjonene ble samlet og aliquoter av disse ble tatt ut og slått sammen og dialysert mot HgO og testet på trombinhemming. Fraksjonene som utviste høyeste aktivitet ble dialysert og lyofilisert. Lyofylisatet ble analysert ved SDS-polyakrylamidgelelektro-forese med påfølgende sølvfarving ved anvendelse av et "farve-kit" fra firmaet Bio-Rad. Et proteinbånd ble oppdaget ved MW-området på ca. 25000 dalton som ikke tidligere ble oppdaget ved eluering av kolonnen uten tidligere pålegging av skogbj ørn-probe.
EKSEMPEL 7
Avling av skogbjørn
Avling av trevert-skogbjørn fra arten Rhipicephalus evertsi foregår ifølge Th. Hiepe (Lehrbuch der Parasitologie, Bd. 4, Gustav Fischer Verlag Stuttgart 1982, s. 46 ff.). Varigheten er ca. 3-4 måneder. Hunn-skogbjørner blir for egglegging oppbevart ved 20°C og ved en luftfuktighet som er høyere enn 90*. Etter at larvene er kommet ut, blir disse satt på for det første blodmåltidet. Etter måltidet foregår hudskifting til nymfer. Disse blir satt på kaninene for det andre blodmåltidet. De fullsugde nymfene går nå over i differen-sieringsstadiumet til voksne hanner og hunner.
Etter avsluttende differensiering anvendes de voksne dyrene.
EKSEMPEL 8
Isolering av amblyommin fra voksne skogbjørner
Voksne skogbjørner ble opphakket i ItøO i en Ultra-Turrax-anordning fra fa. Janke und Kunkel. Skogbjørnhomogenisåtet ble til slutt inkubert i 40 minutter ved 40°C, og deretter sentrifugert i 30 minutter ved 10.000 rpm og 5°C i en Sorvall-sentrifuge. Sedimentet blir resuspendert i HgO og påny inkubert ved 40° C i 30 minutter og til slutt sentrifugert. Supernatantene fra begge sentrifugeringstrinnene ble slått sammen og filtrert gjennom et blåbåndsfilter. Den klare supernatanten ble lyofilisert og resten tatt opp i 20 ril Tris-HCl (pH 7,5) og til slutt renset over Q-sepharose Fast Flow-kromatograf i (gradient 0-1 NaCl i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). De amblyomminhoIdige fraksjonene ble identifisert ifølge eksempel 5, lyofylisert og sendt igjennom en G 75 superfin kolonne i eksempel 3. De antitrombotisk virksomme fraksjonene eluerte i molekylvektsområdet på 20-30000 dalton. De ble slått sammen, og ved hjelp av "reversfase" HPLC renset over en Bio-Rad RP 304-kolonne. Som anordning ble Waters 600 Multisolvent Delivery-system anvendt. Følgende gradient ble kjørt: Start 80* A - 20* B (med A = 0,1* TFA og B = 0,1* TFA i 80* acetonitril) til 100* B i en løpetid på 60 minutter. De antitrombotisk aktive fraksjonene ble slått sammen, lyofylisert og på ny renset over "reversfase" HPLC. Følgende gradient ble kjørt: Start 80* A : 20* B (A = 0,1* TFA; B = 0,1 * TFA i 80* acetonitril). Etter en elueringstid på 40 minutter ble 50* B oppnådd.
Under disse betingelsene ble en retensjonstid for amblyommin-fraksjonen oppnådd på 27 minutter.
EKSEMPEL 9
Bestemming av molekylvekten til amblyommin
EPLC-fraksjonen med retensjonstid på 27 minutter ble analysert på en 17,5#-ig SDS-polyakrylamidgel. Som "molekylvekt smarkører" ble "elektroforesekalibrerings-kitet" til fa. Pharmacia (Art. nr. 17-0446-01) anvendt. Amblyommin vandrer i dette systemet noe under "karbon-anhydrasen", som er beskrevet å ha en molekylvekt på 30.000 dt. For Amblyommin ble en molekylvekt på 26.000 ± 2.000 dt.
EKSEMPEL 10
Bestemming av det isoelektriske punktet
Amblyommin isolert ifølge eksempel 8 ble underkastet ultra-tynnsjiktsfokusering som foreslått av dr. Schulte et al. fra fa. LKB Instrument GmBE. Et isoelektrisk punkt på 5,35 ±0,3 ble oppnådd.
EKSEMPEL 11
Proteinsekvensanalyse av amblyommin
Autentisk isolert protein fra voksne skogbjørner kunne ikke bli N-terminalt sekvensert. Materialet ble deretter underkastet en trypsinspaltning. For å muliggjøre en kvantitativ trypsinspaltning ble proteinet først derivatisert i en karboksymetyleringsreaksjon. Det ble dermed løst i 24 pl buffer (8 M guanidinium-ECl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA) og 51 pg DTE i 4 pl buffer samt 4,52 pg 2-merkaptoetanol i 5 pl ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble inkubert i en time ved 37°C og deretter omsatt med 8,3 pl av en jodacetamidoppløsning (0,25 M jodacetamid pH 8,0 innstilt med KOH) og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble 59 pl HgO tilsatt for å fortynne oppløsningen og etter tilsetting av 400 pl CgHgOH etter kraftig rysting utfelt og ved 12000 rpm sentrifugert.
Sedimentet ble deretter ristet med 100 pl CHCI3 og omsatt med 300 pl H2O og påny sentrifugert. Den øvre fasen ble blandet med 300 pl C2H5OH. Blandingen ble sentrifugert og sedimentet for trypsinspaltning ble løst i 66 pl 0,2 M n-metylmorfolin (pH 8,5 innstilt med eddiksyre). Deretter ble 5 pl tryp-sinoppløsning (3,3 pg trypsin i N-metylmorfolinbuffer) tilsatt og blandingen ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur .
Fragmentblandingen ble deretter adskilt over et mikro-bor-reversert fase HPLC-skritt. (Mikro-bor-kolonne: 1 mm x 25 cm, Herst. firma Braun-Lee).
En lineær gradient på 10* A - 60* B ble påført (A = 10* acetonitril i HPLC-vann + 0,1* TFA; B = 10* H20 i acetonitril +0,1* TFA).
Det var mulig å isolere tre topp-fraksjoner. De ble enkeltvis tørket på glassfiberfUtrene til gassfasesekvenatoren og sekvensanalyse ble utført. Ved en 470 A gassfase-protein-sekvenator fra fa. Applied Biosystems ble anvendt med online PTE-identifikasjonssystem.
Følgende delaminosyresekvenser ble identifisert, og X står for en naturlig forekommende aminosyre: a) Ile-Leu-Phe-Thr-Gln-Gly-Asn-X-Gly-Gln-Leu-Glu-Asn-X-Phe-Glu
b) Lys-Ile-Leu-Phe-X-Glu-Gly
c) Ala-Ser-Tyr-Ile-Val-X-Ser-Glu-Ser-Ile-Gln-Ile-Leu-X-Leu-Ser-Glu-Gly-Ile.
Claims (3)
1.
Fremgangsmåte for isolering av et protein med trombininhibitorisk virkning eller et farmasøytisk anvendbart salt derav, som har en molekylvekt på 20.000 til 30.000 dalton, et isoelektrisk punkt mellom 5,05 og 5,65 og har aminosyredelsekvensen - Ile-Leu-rcfe-Thr-Gln^ - Lys-Ile-Leu-Phe-X-Gln-Gly- og - Ma-Ser-Tyr-He-Val-X-Ser-GLu-Se^ hvori hver rest X kan være lik eller forskjellig og betyr en naturlig forekommende aminosyre eller en hvilken som helst etter translasjon modifisert aminosyre, som trimetyllysin eller karboksyglutaminsyre, karakterisert ved at proteinet blir ekstrahert fra skogbjørner med aceton, utfelt med eddiksyre eller trikloreddiksyre ved pH 1,8, fraksjonert ved gelfiltrering og trombinsepharose-affinitetskromatograf i.
2.
Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1 til 5, karakterisert ved at det nevnte proteinet blir isolert fra Rhipicephalus evertsi.
3.
Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 5, karakterisert ved at det nevnte proteinet blir isolert fra Amblyomma hebraeum.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3819078A DE3819078A1 (de) | 1988-06-04 | 1988-06-04 | Amblyommin, ein neuer wirkstoff fuer die antikoagulationstherapie |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO892266D0 NO892266D0 (no) | 1989-06-02 |
| NO892266L NO892266L (no) | 1989-12-05 |
| NO175900B true NO175900B (no) | 1994-09-19 |
| NO175900C NO175900C (no) | 1994-12-28 |
Family
ID=6355878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO892266A NO175900C (no) | 1988-06-04 | 1989-06-02 | Fremgangsmåte for isolering av amblyommin |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5093322A (no) |
| EP (1) | EP0345614B1 (no) |
| JP (1) | JP2703993B2 (no) |
| KR (1) | KR0138531B1 (no) |
| AT (1) | ATE107666T1 (no) |
| AU (1) | AU618364B2 (no) |
| CA (1) | CA1339189C (no) |
| DE (2) | DE3819078A1 (no) |
| DK (1) | DK270489A (no) |
| ES (1) | ES2056149T3 (no) |
| FI (1) | FI93697C (no) |
| HU (2) | HU205148B (no) |
| IE (1) | IE64674B1 (no) |
| IL (1) | IL90508A (no) |
| NO (1) | NO175900C (no) |
| NZ (1) | NZ229401A (no) |
| PT (1) | PT90739B (no) |
| ZA (1) | ZA894181B (no) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5385885A (en) * | 1988-01-15 | 1995-01-31 | Gasic; Gregory P. | Inhibition of smooth muscle cell proliferation by antistasin and tick anticoagulant peptide |
| DE3931839A1 (de) * | 1989-09-23 | 1991-04-04 | Basf Ag | Neue proteine und ihre herstellung |
| DE4136513A1 (de) * | 1991-11-06 | 1993-05-13 | Basf Ag | Neues thrombininhibitorisches protein aus raubwanzen |
| US5321010A (en) * | 1991-12-10 | 1994-06-14 | Merck & Co., Inc. | Proteins for inhibiting adhesion of platelets to collagen |
| ES2107790T3 (es) * | 1992-12-04 | 1997-12-01 | Schering Ag | Inhibidor de trombina procedente de la saliva de protostomias. |
| GB2304048A (en) * | 1995-08-12 | 1997-03-12 | John William Carson | Medicament containing saliva extract |
| US20050033022A1 (en) * | 1997-09-26 | 2005-02-10 | Smithkline Beecham Biologicals Sa | Fusion proteins comprising HIV-1 Tat and/or Nef proteins |
| BRPI0406057B1 (pt) * | 2004-09-15 | 2021-10-26 | União Química Farmacêutica Nacional S/A | Sequência nucleotídica de um inibidor de proteases do tipo kunitz obtida a partir de uma biblioteca de cdna de glândulas salivarares de carrapatos amblyomma cajennese uso da proteína recombinante |
| US10702606B2 (en) | 2015-12-10 | 2020-07-07 | Menicon Co., Ltd. | Peptide composition |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| IL83912A (en) * | 1986-09-18 | 1993-05-13 | Pennsylvania Hospital | Protein having anticoagulant and antimetastatic properties |
| US4832849A (en) * | 1988-06-16 | 1989-05-23 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Extraction and purification of an anticoagulant principle from the south american leech, haementeria ghilianii |
| CA2024697A1 (en) * | 1989-09-07 | 1991-03-08 | George P. Vlasuk | Protein having anticoagulant properties |
-
1988
- 1988-06-04 DE DE3819078A patent/DE3819078A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-05-30 ES ES89109770T patent/ES2056149T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-30 EP EP89109770A patent/EP0345614B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-30 DE DE58907930T patent/DE58907930D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-30 AT AT89109770T patent/ATE107666T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-06-01 FI FI892690A patent/FI93697C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-06-01 AU AU35954/89A patent/AU618364B2/en not_active Ceased
- 1989-06-02 NZ NZ229401A patent/NZ229401A/xx unknown
- 1989-06-02 ZA ZA894181A patent/ZA894181B/xx unknown
- 1989-06-02 IL IL9050889A patent/IL90508A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-06-02 JP JP1139377A patent/JP2703993B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-02 CA CA000601594A patent/CA1339189C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-02 NO NO892266A patent/NO175900C/no unknown
- 1989-06-02 HU HU892820A patent/HU205148B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-06-02 US US07/360,573 patent/US5093322A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-02 DK DK270489A patent/DK270489A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-06-02 KR KR1019890007559A patent/KR0138531B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-02 PT PT90739A patent/PT90739B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-06-12 IE IE181489A patent/IE64674B1/en not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-11-09 HU HU94P/P00042P patent/HU210528A9/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE107666T1 (de) | 1994-07-15 |
| NO892266D0 (no) | 1989-06-02 |
| NO175900C (no) | 1994-12-28 |
| DK270489D0 (da) | 1989-06-02 |
| FI93697B (fi) | 1995-02-15 |
| HU210528A9 (en) | 1995-04-28 |
| EP0345614B1 (de) | 1994-06-22 |
| NO892266L (no) | 1989-12-05 |
| CA1339189C (en) | 1997-07-29 |
| AU3595489A (en) | 1989-12-07 |
| JP2703993B2 (ja) | 1998-01-26 |
| FI892690L (fi) | 1989-12-05 |
| IL90508A (en) | 1994-12-29 |
| IE891814L (en) | 1989-12-04 |
| NZ229401A (en) | 1991-10-25 |
| US5093322A (en) | 1992-03-03 |
| PT90739A (pt) | 1989-12-29 |
| HUT52117A (en) | 1990-06-28 |
| EP0345614A3 (en) | 1990-10-10 |
| IE64674B1 (en) | 1995-08-23 |
| IL90508A0 (en) | 1990-01-18 |
| JPH0232100A (ja) | 1990-02-01 |
| DK270489A (da) | 1989-12-05 |
| PT90739B (pt) | 1994-10-31 |
| HU205148B (en) | 1992-03-30 |
| DE3819078A1 (de) | 1989-12-07 |
| ZA894181B (en) | 1990-02-28 |
| EP0345614A2 (de) | 1989-12-13 |
| AU618364B2 (en) | 1991-12-19 |
| FI892690A0 (fi) | 1989-06-01 |
| FI93697C (fi) | 1995-05-26 |
| KR0138531B1 (ko) | 1998-04-30 |
| ES2056149T3 (es) | 1994-10-01 |
| DE58907930D1 (de) | 1994-07-28 |
| KR910001040A (ko) | 1991-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xu et al. | Toward an understanding of the molecular mechanism for successful blood feeding by coupling proteomics analysis with pharmacological testing of horsefly salivary glands | |
| US20060094079A1 (en) | Protein for blocking platelet adhesion | |
| DK173077B1 (da) | Polypeptid, der specifikt inhiberer thrombin, dets anvendelse til fremstilling af et lægemiddel samt farmaceutisk præparat | |
| US5246715A (en) | Platelet-aggregating inhibitory agents from leech saliva and pharmaceutical preparations containing the same | |
| NO175900B (no) | Fremgangsmåte for isolering av amblyommin | |
| Matsui et al. | Purification and characterization of two Ca2+-dependent lectins from coelomic plasma of sea cucumber, Stichopus japonicus | |
| JP3537437B2 (ja) | トロンビンインヒビター | |
| KR0185973B1 (ko) | 남미의 거머리인 헤멘테리아 길리아니로부터의 항전이 물질 길란텐 | |
| US6036958A (en) | Tsetse thrombin inhibitor | |
| EP0875564A1 (en) | Biologically active extract from the leech 'Limnatis nilotica' | |
| Douglas et al. | Characterization of Gaddum's substance R | |
| Reck Junior et al. | Pharmacological action of tick saliva upon haemostasis and the neutralization ability of sera from repeatedly infested hosts |