NO176480B

NO176480B - Analogifremgangsmåte ved fremstilling av målrettede former av metyltritio-anti-tumormidler

Info

Publication number: NO176480B
Application number: NO884833A
Authority: NO
Inventors: William James Mcgahren; Martin Leon Sassiver; George A Ellestad; Phillip R Hamann; Lois M Hinman; Janis Upeslacis
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 1995-01-02
Also published as: NO884833D0; DK602488A; PT88881B; DK602488D0; ATE104309T1; FI95204B; JPH0296599A; AU618763B2; FI884984A7; EP0313874A2; NZ226726A; NO884834D0; DE3889063T2; FI884984A0; DE3851682D1; JPH01193282A; PT88882B; ZA888123B; HK131997A; FI91262C

Description

Denne oppfinnelsen vedrører en analogifremgangsmåte for å fremstille de terapeutisk aktive målrettede derivatene

av forbindelser med formelen CH3SSS-W, hvori CH3SSS-W er et antitumor antibiotikum LL-E33288a1 , a-^, a2Br, a2<J>, a3 , a3<J>,

<* 4Br, Pj<*>, PX<J>, P2 , P2<J>, 7i , 7i<J>, SX<J>, BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD 114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E eller CL-1724.

Beskrivelse av tegningene

Figur I: Ultrafiolett spekter av det antitumor antibiotikum

som er betegnet som LL-E33288'Y1<J->

Figur II: Protonmagnetiske resonans-spekteret for det antitumor antibiotikum som er betegnet som LL-E33288'Y1<J.>

Figur III:Infrarød spekteret av det antitumor antibiotikum

som er betegnet LL-E3 3288'Y1J.

Familien av antibakterielle og antitumor midler, kollek-tivt kjent som LL-E33 288 komplekset, er beskrevet og krevet i en parallell U.S. patentsøknad, serie nummer 009.321, innlevert 30. januar 1987, og blir brukt til å fremstille de disvovel antitumormidlene som er utgangsmaterialer for målrettede former av antitumor-midlene ifølge vår oppfinnelse.

Søknaden med serienummer 009.321 beskriver LL-E33288 komplekset, komponentene i dette, nemlig LL-E33288a1 , LL-E33288aL<J>, LL-E33288a2 , LL-E33288a2<J>, LL-E33288a3 , LL-E33288a3<J>, LL-E33288a4 , LL-E33288/31 , LL-E33288/31<J>, LL-E33288/32 , LL-E33288/32<J>, LL-E3 3 288-Y]81", LL-E3 3288"i1J og LL-E3328861<J>, og fremgangsmåter for deres fremstilling ved aerob fermentering ved bruk av en ny stamme av Micromonospora echinospora ssp calichensis eller naturlige eller avledete mutanter derav. Serie nr. 009.3 21 åpenbarer også foreslåtte strukturer for noen av de ovenfor navngitte komponenter.

Disse foreslåtte strukturene er gjengitt i tabell 1.

Visse andre antibiotika er nyttige i vår oppfinnelse, nemlig: 1) Esperamicin BBM-1675, en ny klasse av potente antitumor antibiotika. I. Physico-chemical data and partial structure. M. Konishi, et al.. J. Antibiotics, 38, 1605

(1985). A new antitumor antibiotic complex, M. Konishi, et al., U.K. patentsøknad, GB 2.141.425A, 15. mai, 1984. 2) New antitumor antibiotics, FR-900405 og FR-900406.I. Taxonomy of the producing strain. M. Iwami, et al., J.. Antibiotics 38, 835 (1985). New antitumor antibiotics FR-900405 og FR-900406.il. Production, isolation, characterization and antitumor activity. S. Kiyoto, et al., J. Antibiotics, 38, 340 (1985). 3) PD 114759 and PD 115028, novel antitumor antibiotics with phenomenal potency. I. Isolation and characterization. R.H. Bunge, et al., J. Antibiotics, 37, 1566 (1984). Biological and biochemical activities of the novel antitumor antibiotic PD 114759 and related derivativs. D.W. Fry et al., Investigational New Drugs, 4, 3 (1986). 4) New antibiotic complex CL-1577A, CL-1577B produced by Streptomyces sp ATCC 39363. Europeisk patentsøknad 0.132.081, A2 . 5) CL-1577D og CL-1577E Antibiotic antitumor compounds, their production and use. U.S. patent 4.539.203. 6) CL-1724 Antibiotic compounds, their production and use. U.S. patent 4.554.162.

De fullstendige strukturene av esperamicinene Alf A2 og Alb (BBM-1675 komplekset) er blitt rapportert og disse er tatt med i tabell 1. De fysikalske karakteristika for de ovenfor nevnte antitumor antibiotika indikerer at de alle er identiske eller svært like i struktur med esperamicinene, og alle inneholder en metyltritio funksjonell gruppe.

Som det kan sees av strukturene som er åpenbart ovenfor inneholder hvert av de antibiotiske stoffene alf a2, a3, a4, Æl' @2' °9 ^ komponentene av LL-E33288 komplekset, såvel som BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD 114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E og CL-1724 en metyltritio-gruppe i sin struktur. Metyltritiogruppen i de ovenfor nevnte antibiotika er gjenstand for utbytning med flere forskjellige tiol-holdige organiske molekyler, hvilket resulterer i dannelsen av en ny klasse midler mot kreft og mot bakterier.

De følgende fremgangsmåtealternativer karakteriserer oppfinnelsen.

Det er nå blitt oppdaget at utbytningen av metyltritiogruppen i de forbindelsene som er oppført i tabell 1 og som er beskrevet i skjema I, kan anvendes til å introdusere en spacer (Sp) som ved et skjønsomt valg av denne gjør det mulig å innføre målrettende enheter i forbindelsene i de ovenfor nevnte patentene og anvendelsene.

Skjema I

hvori Sp er en toverdig (C1-C10) alkylengruppe med rett eller forgrenet kjede, toverdig aryl eller heteroarylradikal, og Q

er H

i acetonitril i nærvær av en ekvivalent av trietylamin og/eller en ekvivalent eddiksyre ved -10 til -30°C i 1 til 48 timer, å isolere mellomproduktet med formelen Q-Sp-SS-W, hvori Q, Sp og W er som tidligere definert heri, deretter å omsette forbindelsen med formelen Q-Sp-SS-W hvori Sp, Q og W er som tidligere definert heri, med et molekyl med formelen Tu-Y hvori Tu-Y er et mono- eller polyklonalt antistoff, dets fragmenter, dets kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker, eller vekstfaktorer; Y er en side-kjede amino eller karboksyfunksjon av antistoffet; n er 1-100, i vandig buffer ved en pH på mellom 6,5 og 9, ved 4 til 40°C enten direkte eller i nærvær av et vannløselig karbodiimid, for å frembringe forbindelsen hvori Tu, Sp, W, n og Y er som tidligere definert heri, m er 1-15 og Z er dannet ved kovalent reaksjon av gruppene Q og Y og er -CONH-, -NH-,

-N=CH-, eller -C02-

eller

å omsette forbindelsen med formelen Q-Sp-SS-W, hvori Sp og W er som tidligere definert heri, og Q er

med et molekyl med formelen Tu-(Y)n,

hvor Tu og n er som tidligere definert heri, og Y er en sidekjede aminogruppe, i en vandig bufret løsning med en pH mellom 6,5 og 9, ved en temperatur på mellom 4 og 4 0°C, innbefattet, for å frembringe forbindelser med formelen :

hvori Tu, Sp, Y og n er som tidligere definert heri, m er 1-15, og Z er dannet ved kovalent reaksjon mellom Q og Y og er definert som -CONH-

eller

å omsette en forbindelse med formelen Q-Sp-SS-W, hvori Sp og W er som tidligere definert heri, og Q er -CONHNH2 med salpeter-syrling i vandig acetonitril for å frembringe en forbindelse med formelen Q-Sp-SS-W, hvori Sp og W er som tidligere definert heri og Q er -CON3 med en forbindelse med formelen Tu-(Y)n,, hvori Tu, Y og n er som tidligere definert heri for å frembringe en forbindelse med formelen

hvori Tu, Z, Sp, W, m, Y og n er som heri definert ovenfor;

eller

å omsette en forbindelse med formelen Q-Sp-SS-W hvori Sp og W er som tidligere definert heri og Q er -CONHNH2, med et molekyl med formelen Tu-(Y)n hvori Tu er som tidligere definert heri, Y er et aldehyd frembragt fra karbohydratresiduer på Tu ved oksydasjon i nærvær av et periodat av et alkalisk jordmetall i en vandig buffer med pH mellom 4,0 og 6,5, ved 4 til og med 4 0°C, og n er 1 til 20 for å frembringe en forbindelse med formelen:

hvori Tu, Sp, W, Y og n er som tidligere definert heri, og Z er laget ved kovalent reaksjon av Q og Y og er -CONHN=CH-, og m er 0,1 til 15; eller å behandle forbindelse umiddelbart ovenfor med formelen: hvori Tu, Z, Sp, W, Y, n og m er som umiddelbart ovenfor definert med acetylhydrazin i en vandig buffer ved pH mellom 4,0 og 6,5, ved 4 til og med 4 0°C, for å frembringe en forbindelse med formelen:

hvori Tu, Z, Sp, W, n og m er som umiddelbart ovenfor definert, og Y er -CH=NNHCOCH3,

og

å omsette denne forbindelsen med natriumcyanborhydrid i en vandig buffer ved pH på 4,0 til 6,5, ved en temperatur på 4 til og med 40°C, for å frembringe en forbindelse med formelen:

hvori Tu, Sp, W, m og n er som tidligere definert heri, Z er

-C0NHNHCH2-, og Y er -CH2NHNHCOCH3.

Som et eksempel kan 3-merkaptopropionsyre-derivatet av E-33288-Y!11 (Q=C02H, Sp=-CH2CH2-) , når det er omdannet til sin aktiverte form hydroksy-ravsyreimid (Q=C02Su, Sp=-CH2-CH2-) brukes til å reagere med noen av e-aminogruppene i lysinrestene (f.eks. Tu=monoklonalt antistoff, Y=-NH2 hvori n=50-100 fra tilgjengelige lysinrester), ved en pH mellom 7,0 og 9,5 i vandige bufrede løsninger ved temperaturer mellom 4 og 40°C for å frembringe målrettede former av de antibiotika som er bundet til vilkårlige seter langs protein-ryggraden (Tu=monoklonalt antistoff, Z=-NHCO-, Sp=-CH2CH2-, irt-1-10) .

Bare en del av de tilgjengelige lysinrestene blir substituert på denne måten, da et høyt innhold vanligvis ikke blir betraktet som forlikelig med å befare antistoffimmuno-reaktiviteten. De samme vilkårlig substituerte immunokonjugatene kan også fremstilles fra 3-merkaptopropionsyre-derivatet ved bruk av andre karboksylgruppe-aktiverende midler, så som flere forskjellige karbodiimider, eller det tilsvarende acylazidet. Alternativt, et 3-merkaptopropionylhydrazid-derivat av E-33288-Y!<17> (Q=H2NNHCO-, Sp=-CH2CH2-) , når det reageres med et periodatoksydert antistoff (Tu=monoklonalt antistoff, Y=-CHO, n=l-15) som beskrevet i U.S. patent nr. 4.671.958 ved en pH mellom 4 og 7, i en bufret vandig løsning ved en temperatur på mellom 4 og 4 0°C, reagerer bare ved aldehyd-funksjonen (avledet ved spaltning av vic-dioler av karbohydratrester plassert på Fc-delen av antistoffene) for å frembringe monoklonale antistoff-konjugater som inneholder medikamentet substituert på spesifikke seter langs ryggraden av proteinet (Tu=mono-klonalt antistoff, Z=-CH=NNHCO-, SP=-CH2CH-, m=0,5-10). For å blokkere ureagerte aldehyd-grupper på antistoffet, og således unngå tverrbinding, såvel som for å stabilisere de hydrlytisk labile Schiffs base bindingene, foretrekkes det (selvom det ikke er nødvendig) å reagere det sistnevnte konjugatet først med en forbindelse så som acetylhydrazid eller tyrosin-hydrazid, deretter redusere med natrium-cyanborhydrid eller natriumborhydrid for å fremstille de stabiliserte konstruksjonene ifølge denne oppfinnelsen (Tu=monoklonalt antistoff, Z=-CH2NHNHCO-, Sp=-CH2CH2-, m=0,5-10). Andre aldehydreaktive grupper som del av medikament-konstruksjonen er innenfor vår oppfinnelse for å frembringe produktene ifølge skjema II. Slike funksjonelle grupper er fortrinnsvis, skjønt ikke begrenset til, de som reagerer med aldehyder under sure vandige betingelser. Reaktiviteten av proteinlysiner under basiske betingelser er tilstrekkelig stor, slik at deres aminer konkurrerer med produktene ifølge skjema II om tilgjengelige aldehyder i det monoklonale antistoffet. Alternative aldehydreaktive grupper er f.eks. semikarbazidet, tiosemikarbazidet, og de oksygen-

substituerte hydroksy1amin-funksjonene.

Som et annet eksempel kan et monoklonalt antistoff reageres med 3-(2-ditiopyridyl)-propionsyre-hydroksyravsyreimidester for å modifisere proteinet med lysinrester (Tu=monoklonalt antistoff, Y=NH2, n=50-l00, Q=-C02Su, Sp=-CH2-CH2-, P=2-pyridyltio). Etter reduksjon med f.eks. ditiotreitol dannes et mellomprodukt (Tu=monoklonalt antistoff, Z=-NHCO-, Sp=-CH2CH2-, m=l til 15) som kan reageres med forbindelsene i tabell 1 for å frembringe de aktuelle immunokonjugatene. På samme måten kan 2-iminotiolan reageres med et monoklonalt antistoff for å innføre tiolgrupper direkte på overflaten av proteinet, uten at det er nødvendig med et reduksjonstrinn (Tu=monoklonalt antistoff, Z=-NHCO-, SP-(CH2) 3-m=l til 15), og dette mellomproduktet kan reageres med forbindelsene i tabell 1 som tidligere. Alternativt kan sulfhydryl-grupper opp-rinnelig tilstede i strukturen av monoklonale antistoffer i dimer form som cystinrester godt brukes til å delta i reaksjonen ifølge skjema III direkte. Slike sulfhydryler blir tradisjonelt eksponert ved en kombinasjon av enzymatisk spalting og reduksjon av naturlige monoklonale antistoffer Tu=Fab' fragment, Z-Sp=binding, Y=SH), men bruken av genetisk forandrede konstruksjoner av monoklonale antistoffer som inneholder uparrede cystinrester blir også vurdert.

Flere forskjellige monoklonale antistoffer (MoAs'er) blir brukt som eksempler på målretting av metyltritio-forbindelsene mot kreft. MoAs'ene Lym 1 og Lym 2 kan skille mellom forskjellige antigener på modne B-lymfocytter og deres produkt lymfomas. Fremstillingen og karakteristikken av disse MoAs'ene er beskrevet av A.L. Epstein, et al., "Cancer Research" 47, 830 (1987). Man har også bemerket MoAs B72,3 mål først og fremst for karcinom i brystene og kolon, ved reaktivitet med pankreas-ovarie- og lunge-karcinom. Antistoffet er beskrevet av T.L. Klug et al., "Int. J. Cancer" 38, 661, (1986). MoAs CT-M-01, som gjenkjenner først og fremst brysttumorer, er beskrevet i EPO søknad 86 401482.4 innlevert 3. juli 1986, og MAC-68 blir fremstilt ved en sub-klon av hybridoma som frembringer CT-M-01, og gjenkjenner både bryst- og kolon-karcinom. Mellomprodukter for de aktuelle forbindelsene som er nyttige for, og konjugerer med disse antistoffene, er beskrevet i den eksperimentelle delen. Det skal allikevel ikke forstås et dette patentet er begrenset til eller avgrenset ved de foran nevnte antistoffene. I stedet er metodologien tilstrekkelig generell til at det kan anvendes på alle antistoffer, uansett klasse eller isotype, deres enzymatisk avledede fragmenter, deres kjemisk manipulerte og stabiliserte fragmenter, såvel som deres respektive chimere og humaniserte motstykker. Heller ikke er de målrettende enhetene begrenset bare til monoklonale antistoffer. Andre proteiner såvel som små molekyler for hvilket det finnes reseptorer i målvev, er innenfor rammen av vår oppfinnelse som målrettende enheter.

Fremgangsmåtene ifølge denne oppfinnelsen som brukes til å frembringe monoklonale antistoff-konjugater fra forbindelsene i tabell 1, gir konstruksjoner som opprettholder god immunoreaktivitet med målcellelinjer, som bestemt ved de følgende in vitro undersøkelsene:

Målceller

Alle målcellene ble holdt i RPMI 1640 media tilsatt 5 % fetalt kalveserum (FCS), ITS (Collaborative Research, Cat# 40351), streptomycin (50 ug/ ml), penicillin (50 enheter/ml), gentamycinsulfat (50 /-tg/ml) og glutamin (0,03 %) . Cellene ble oppbevart i en fuktig 5 % C02 inkubator ved 37°C.

I. Immunoreaktivitets- undersøkelser

Prosedyre I - Elisa

Egnede målceller ble høstet, tellet og suspendert i Dulbecco's fosfatbufret saltløsning (DPBS) ved optimal konsentrasjon for testing av monoklonalt antistoff (MoAs). 0,1 ml celler ble alkvotert i hver av brønnene med steril vevskultur i en polystyrenplate med 96 brønner. Platene ble sentrifugert i 5 minutter ved 1.000 RPM og supernatanten ble slått vekk. Platene ble lufttørket over natten og kan lagres ved 4°C for opptil 3 måneder.

Ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert ved å tilsette 200 Ml av en 1% gelatin i DPBS pr. brønn, og inkubere platen i 1 time ved 37°C i en fuktig inkubator. (Alle påfølgende inkubasjoner blir utført under lignende betingelser). Platene ble vasket en gang med 250 jxl av 0,05 % TWEEN-20 i DPBS (vaske-løsning) ved å bruke det automatiserte ELISA vaske-systemet fra Dynatech (Ultrawash II). Prøvene som skulle undersøkes ble fortynnet til en endelig konsentrasjon på 3 Mg/ml MoAs ekvivalenter i 0,1 % gelatin-DPBS. Seks ytterligere tre-ganger serie fortynninger ble laget fra hver 3 /xg/ml prøve, og 100 ul ble tilsatt til angjeldende brønner i triplikat. Bare bunnrekken av brønnene fikk 100 /ul av 0,1 % gelatin som bakgrunn. Platene ble inkubert i 45 minutter og deretter vasket tre ganger. Alkalisk fosfatase-konjugerte affinitetsrensede geit anti-mus immunoglobuliner (Cappel Cat# 8611-0231) ble fortynnet 1:125 i 0,1 % gelatin, og 100 ul ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i 45 minutter og deretter vasket tre ganger. 200 fil av p_-nitrofenylfosfat-substratløsning (se nedenfor) ble tilsatt til hver brønn. Etter 45 minutter ved romtemperatur ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 50 fj. 1 3M NaOH. Absorbansen av innholdet av hver brønn ble avlest ved 4 05 nm i det automatiserte spektrofoto-meter fra Dynatech (EIA Autoreader # EL-310).

Substrat dietanolamin- buffer ( 10 %\

97 ml dietanolamin

800 ml vann

0,2 g NaN3

100 mg MgCl2'6H20

Reagensene ble oppløst ved kontinuerlig omrøring og IM HCl ble tilsatt inntil pH var 9,8. Samlet volum ble gjort opp til 1 liter med vann og filter-sterilisert med et 0,2 nm filter. Bufferen ble lagret i mørke ved 4°C. Umiddelbart før bruk ble p-nitrofenylfosfat (Sigma, Cat# 104-40) løst i den 10 %-ige dietanolamin-bufferen (må være ved romtemperatur) for å gi en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml.

Beregning av O. D. verdier

Bindingsprosenten i hver prøve ble beregnet ved følgende

ligning:

A = Gjennomsnittlig O.D. av testprøven

B = Gjennomsnittlig O.D. for bakgrunnen

C = Gjennomsnittlig O.D. av 3 ^g/ml ikke-manipulert MoAs-kontroll

Bindingsprosenten ble avsatt på ikke-log skalaen i et semi-log diagram, og MoAs konsentrasjonen ble avsatt på log-skalaen. BD50 (dvs. den dosen av antistoff som er nødvendig for å gi 50 % binding) av hver testprøve ble tatt ut av diagrammet, og retensjonsmengden av immunoreaktivitet ble beregnet ved følgende ligning:

Prosedyre 2 - indirekte RIA

Høvelige mengder av målceller i 0,2 ml av 10 % FCS media ble alikvotert i 4 ml polystyrenrør. Prøvene som skulle testet ble fortynnet til en konsentrasjon på 2 /xg/ml MoAs ekvivalenter i 10 % FCS media. Fem tre-ganger seriefortynninger ble fremstilt fra hver 2 / iq/ ml prøve og 0,2 ml ble tilsatt til hvert rør i duplikat. Bakgrunnsprøver fikk bare celler og media. Cellene ble inkubert ved 4°C i 1 time, deretter vasket to ganger (alle RIA vaskingene ble utført med et volum på 3 ml) med 2 % FCS media. 0,05 ml av sau F(ab')2 anti-mus IgG [125 J] (DuPont, Cat # NEX 162.0142) som inneholdt om lag 500.000 CPM ble tilsatt til hvert rør; cellene ble inkubert i ytterligere 1 time ved 4°C, vasket en gang med 2 % FCS og 2 ganger med PBS. 0,5 ml PBS ble tilsatt til hvert rør, cellene ble vortex-behandlet, overført til rene rør og tellet i 1 minutt i en Packard Gamma 500.

Bindingsprosenten for hver verdi ble bestemt og grafisk fremstilt som den foregående ELISA ligningen, untatt at CPM ble substituert for O.D. enheter og C = gjennomsnittlig CPM for 1 /ug/ml ikke-manipulert MoAs kontroll. Prosent retensjon av immunoreaktiviteten for hver prove ble beregnet som tidligere diskutert.

Prosedyre 3 - Direkte RIA

Høvelige mengder av målceller i 1 ml 10 % FCS media ble alikvotert i 4 ml polystyren prøverør, sentrifugert og supernatanten kastet. Prøver som skulle testes ble fortynnet til en konsentrasjon på 2 00 jig/ml MoAs ekvivalenter i 10 % FCS media. 5 ytterligere fem-ganger seriefortynninger ble fremstilt fra hver 200 /xg/ml prøve, og 0,05 ml ble tilsatt til hvert rør i duplikat. 0,05 ml av 125J-MoAs ble tilsatt til hvert rør (optimal mengde bestemmes individuelt for hvert MoAs og porsjon). Prøver for positiv kontroll inneholdt celler, media og <125>J-MoAs. Bakgrunnsprøver inneholdt ikke-spesifikke celler, media og <125>J-MoAs. Cellene ble inkubert i 1 time ved 4°C, vasket en gang med 2 % FCS media, to ganger med PBS, overført og tellet som tidligere nevnt.

%125j-MoAs bindingshemmingen for hver prøve ble beregnet ved følgende formel:

A = Gjennomsnittlig CPM for prøven

B = Gjennomsnittlig CPM for bakgrunn

C = Gjennomsnittlig CPM for positiv kontroll

Diagrammet og % retensjon av immunoreaktivitet for hver prøve ble beregnet som tidligere diskutert, untatt at BD50 i virkeligheten er BID50 (dose av MoAs som er nødvendig for å gi 50 % hemming av bindingen av 125J-MoAs) .

Bemerkninger:

1) Rørene ble alltid kraftig vortex-behandlet umiddelbart etter tilsetning av hvert reagens i RIA. 2) En indre kontrollprøve som var lik 50 % av den ikke-manipulerte MoAs kontrollen ble innbefattet i hvert sett undersøkelser for å bekrefte hvorvidt den enkelte prosedyre hva kvantitativt kunne forutsi konjugatets retensjon av immunoreaktivitet.

Resultatene av disse undersøkelsene er opplistet nedenfor i tabell 2.

De monoklonale antistoff-konjugatene fremstilt ifølge denne oppfinnelsen er aktive som midler mot kreft. Undersøkelsen som er beskrevet nedenfor for å bestemme cytotoksisiteten in vitro, viser hvordan konstruksjonene dramatisk foretrekker målcelle-linjene i motsetning til ikke-målcellene, og gir et mål for brukbarheten av målrettede former av forbindelsene sammenlignet med deres ikke-målrettede motstykker.

Undersøkelser av cytotoksisitet In vitro

Prøver som skal undersøkes ble fortynnet til en konsentrasjon på 0,2 eller 0,02 /Ltg/ml av LL-E33288'Y1<J> ekvivalenter (utgangs-konsentrasjonen er avhengig av den cellelinjen som skal testes). Tre ytterligere fem-ganger fortynninger ble fremstilt fra hver opprinnelige prøvefortynning, og 0,2 ml ble tilsatt til sterile 15 ml polystyrenrør. Minst ett lignende konjugat bestående av LL33288'Y1<J> og et irrelevant MoAs ble innbefattet i hver undersøkelse for å bestemme spesifisiteten av det relevante konjugatet. IO<5> høvelige målceller i 0,2 ml av 10 % FCS media ble alikvotert i rørene og vortex-behandlet. I tillegg ble en identisk test utført ved å anvende de irrelevante celler som mål for ytterligere å bekrefte spesifisiteten av relevant konjugat. MoAs kontroller fikk bare ekvivalente mengder av MoAs, og positive kontrollprøver fikk bare 10 % FCS media.

Cellene ble inkubert ved 37°C i 7 minutter, deretter vasket 4 ganger med 8 ml av 2 % FCS media. 0,1 ml av 10 % FCS ble tilsatt til hvert rør, cellene ble vortex-behandlet og 0,2 ml ble alikvotert til hver av brønnene i en steril 96-brønners polystyrenplate med vevskultur.

Platene ble inkubert i to døgn i en fuktig 37°C inkubator med 5 % C02. Halvpartene av mediene ble fjernet og erstattet med friske media inneholdende 2 /LtCi/ml <3>H thymidin (DuPont, NEN, Cat# NET-027). Inkubasjonen ble fortsatt i 24 timer, cellene ble flosset, tint og høstet med en PHD cellehøster (Cambridge Technology, Inc.). Hver prøve ble tellet i 1 minutt i en Beckman LS 5800 scintilasjonsteller på kanal 1.

% veksthemming ble beregnet som følger:

Hemmingsprosenten ble avsatt på ikke-log skalaen i et semi-log diagram og LL-E33288'y1<j> konsentrasjonen ble avsatt på log skalaen. I<C>50 (konsentrasjonen av LL-E33288i1J som er nødvendig for å gi 50 % hemming) av hver testprøve ble tatt ut fra diagrammet, og mengden retensjon av cytotoksisitet ble beregnet ved følgende ligning:

Resultatene av cytotoksisitets-undersøkelsen in vitro er listet opp nedenfor i tabell 3.

Følgende undersøkelses-system ble brukt for å måle in vivo aktiviteten av konjugatene fremstilt ifølge denne oppfinnelsen.

In vivo tester for antitumor aktivitet på medikament-monoklonale antistoff-konjugater ble utført ved å bruke humane tumor xenografer på atymiske (nakne) mus.

Burkitt lymphoma (Raji) og myeloma (HS Sultan) celler ble høstet fra kulturflasker og inokulert subkutant (> 80 x IO<6 >Raji celler eller 40 x IO<6> HS Sultan celler) i forsøksmus. Faste tumorer, ovarie-karcinom (CA73, Ovcar-3) og bryst-karcinom (MX-1) ble frembragt i atymiske mus, fjernet, skåret i 2 mm<3> fragmenter og implantert subkutant i forsøksmus (5-8 fragmenter pr. mus).

Medikamenter, monoklonale antistoffer og medikament-monoklonalt antistoff-konjugater ble administrert intra-peritonealt en gang hver tredje dag med tilsammen 3 eller 5 injeksjoner, begynnende på dag 2, 3, 4, 6, 7 eller 8 dager etter tumor-implanteringen. Målinger av tumor (lengden og bredden av tumoren) ble utført ved hjelp av en Fowler ultra CAL II elektronisk caliper hver 7. dag i 4 eller 5 uker etter tumor-implanteringen. Tumormasse i mg ble anslått fra formelen:

Hemmingen av tumorveksten ble beregnet for hver forsøks-gruppe som en prosent av kontrollen (midlere mg av behandlet (T) dividert med midlere mg av kontroll (C) x 100). En T/C verdi < 42 % i grupper med > 65 % overlevede dyr ansees som nødvendig for å demonstrere aktivitet.

Resultatene fra denne undersøkelsen vises i tabell 4.

Oppfinnelsen vil bli ytterligere beskrevet i forbindelse med følgende ikke-begrensende eksempler som omfatter både fremstilling av mellomprodukter og sluttprodukter.

Eksempel 1

3- Merkaptopropionsyre disulfid analog av LL- E33288- Y1J

Til en løsning av 90 mg av LL-E33288'Y;LJ i 90 ml av acetonitril ble tilsatt 10,6 mg av 3-merkaptopropionsyre i 1 ml acetonitril. Løsningen ble vortex-behandlet og deretter lagret ved -2 0°C i 6 døgn. Løsningsmiddelet ble fjernet in vacuo og residuet kromatografert over 10 ml silicagel i metylenklorid. Kolonnen ble utviklet med 50 ml metylenklorid, 50 ml 4 % metanol i metylenklorid og til slutt med 100 ml 8 % metanol i metylenklorid. Inndamping av denne siste fraksjonen ga et residum som ble tatt opp i etylacetat ved hjelp av litt aceton og tilsatt dråpevis til et overskudd av heksan. Bunn-fallet ble oppsamlet og tørket, og ga 39 mg av det ønskede produktet (FABMS, M+H 1394). Retensjonstiden på C18 reversfase HPLC: 18 minutter med 50 % acetonitril/0,1 M vandig ammoniumklorid. (LL-E3 3 2 88'Y1J: 8,0 minutter, esterhydrolyseprodukt: 1,5

minutter).

Eksempel 2

Reaksjon av LL- E33288' Y1 J med p- nitrofenylesteren

av 3- merkaptopropionsyre

(A) Fremstilling av p_-nitrofenylester av 3-merkaptopropionsyre

Kommersiell 3-merkaptopropionsyre i metylenklorid inneholdende en katalytisk mengde av konsentrert svovelsyre ble behandlet med isobutylen i 2 0 minutter. Løsningen ble deretter ekstrahert med IN natriumbikarbonat-løsning, hvoretter metylen-kloridløsningen ble tørket ved bruk av vannfritt magnesiumsulfat. Løsningen ble deretter inndampet til en fargeløs mobil væske, hvis NMR og masse-spektroskopiske data indikerte at det var S-t-butylmerkaptopropionsyren, t-butylesteren.

En alikvot av denne esteren ble oppvarmet med tilbakeløp med 6N saltsyre i dioksan i 2,5 timer. Løsningsmiddelet ble fordampet, etylacetat ble tilsatt og denne løsningen ble ekstrahert med natriumkarbonat. Natriumkarbonat-ekstraktet ble behandlet med 6N saltsyre inntil pH av suspensjonen var 2,0. Suspensjonen ble deretter ekstrahert med etylacetat, ekstraktet tørket over vannfritt magnesiumsulfat og løsnings-middelet inndampet til en fargeløs væske hvis %-NMR og masse-spektroskopiske data indikerte at den var S-t-butyl-merkaptopropionsyre.

Denne forbindelsen ble omdannet til p-nitrofenylesteren ved behandling med ekvimolare mengder av p-nitrofenol og dicykloheksylkarbodiimid i tetrahydrofuran i 4 timer. Dicyklo-heksylure bi-produktet ble fjernet ved filtrering og filtratet ble inndampet til en olje som ble renset ved å passere den over nøytral silicagel ved bruk av løsningsmiddelsystemet heksan: metylenklorid (50:50). Det rene p-nitrofenylester-derivatet var en svakt gul, mobil olje.

Den frie merkaptanen ble demaskert ved følgende fremgangsmåte. S-t-butylmerkaptopropionsyre p-nitrofenylesteren ble løst i trifluoreddiksyre, og et svakt molart overskudd (10 %) av kvikksølv (II) acetat ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 30 minutter, deretter ble trifluoreddiksyren fordampet, og residuet tatt opp i dimetylformamid. Denne løsningen ble behandlet med hydrogensulfidgass i 15 minutter, deretter ble det sorte kvikksølv (II) sulfidet filtrert av, og filtratet inndampet under redusert trykk for å eliminere opptil 99 % av dimetylformamidet. Den resulterende svakt brunaktige mobile væsken ble renset over nøytral silicagel ved å bruke heksan: metylenklorid (50:50). Hovedkomponenten ble vist ved -"-H NMR å inneholde en liten mengde av t-butylmerkapto-derivatet. Analytisk HPLC over to Perkin-Elmer Pecosphere C18 kolonner i tandem (4,6 x 33 mm og 4,6 x 83 mm) og bruk av et gradient-system med 37,5/62,5 til 47,5/52,5 acetonitril og 0,1 M ammoniumacetat buffer ved pH 6,5 (eddiksyre) over en 12 minutters periode indikerte at produktet var 88 % av p-nitrofenylesteren av 3-merkaptopropionsyre og 10 % av den mindre polare S-t-butylmerkaptopropionsyre p-nitrofenylesteren. Det var også en mindre mengde fri p-nitrofenol tilstede.

(B) Reaksjon av p-nitrofenylester av 3-merkaptopropionsyre med LL- E33288- Y1J

En 100 mg porsjon av LL-E33288'Y1<J> ble løst i 50 ml acetonitril. Til denne ble tilsatt en løsning av 25,7 mg p-nitrofenylester av 3-merkaptopropionsyre i en 1 ml acetonitril. Reaksjonen fikk stå ved -20°C i 48 timer. HPLC indikerte at reaksjonen var fullstendig. Løsningen ble inndampet til tørrhet og residuet tatt opp i 4-5 ml etylacetat ved bruk av ultralyd for å bringe dette i løsning. Blandingen ble filtrert og filtratet dryppet inn i 45 ml omrørt heksan. Det resulterende svakt gule faste stoffet ble oppsamlet og tørket under redusert trykk, og ga 93 mg av p-nitrofenylesteren av propionsyre-derivatet av LL-E33288'y1<j> som påvist ved <L>H NMR. Ved FABMS kom [M+H]-ionet tilsyne ved M/Z=1515.

Eksempel 3

N- hvdroksyravsyreimidvl 3- merkaptopropionat disulfid analog av LL- E33288' Y1J

Til en løsning av 5 mg av 3-merkaptopropionsyredisulfid analogen av LL-E33288'Y1<J> fra eksempel 1 i 0,5 ml tetrahydrofuran ble tilsatt 0,45 mg N-hydroksyravsyreimid i 0,1 ml tetrahydrofuran og deretter 1,8 mg av dicykloheksylkarbodiimid i 0,2 ml tetrahydrofuran. Reaksjonen ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer og ble deretter stoppet med et stort overskudd av heksaner. Det faste stoffet ble isolert ved filtrering og løst i etylacetat. Den resulterende løsningen ble vasket 3 ganger med saltløsning, tørket med magnesium-sulf at, og inndampet til 5 mg av det ønskede produktet som et brunfarget pulver som ble anvendt uten videre rensning. Retensjonstiden ved revers fase C18 HPLC: 15 minutter med 40 % acetonitril/0,1 M vandig ammoniumklorid (utgangsmateriale: 6,0 minutter).

Eksempel 4

3- merkaptopropionvlhydrazid- disulfid analog LL- E33288- Y1J

Til 5,4 ml (3 ekv.) vannfritt hydrazin i 100 ml tilbake-løpende tetrahydrofuran under argon ble tilsatt dråpevis 9,2 ml (83 mmol) metyl 3-merkaptopropionat i 50 ml tetrohydrofuran i løpet av 2 timer. Løsningen ble oppvarmet med tilbakeløp i ytterligere 2 timer, inndampet, og deretter fortynnet og inndampet 2 ganger fra 300 ml toluen. Produktet ble tilført til en plugg av silicagel med 5 % etylacetat/kloroform og eluert fra pluggen med 20 % metanol/kloroform. Det resulterende 3-merkaptopropionylhydrazidet var en svakt rosa olje som størknet ved avkjøling, men smeltet ved romtemperatur.

Til 50 mg LL-E33288'Y1<J> i 50 ml acetonitril ved -15°C ble tilsatt 6,6 mg 3-merkaptopropionylhydrazid i 1 ml tetrahydrofuran. En ekvivalent trietylamin og/eller en ekvivalent eddiksyre ble tilsatt som katalysator. Reaksjonen ble omrørt ved 0°C i 1 time og løsningsmiddelet ble deretter fordampet. Residuet ble kromatografert på silicagel med en gradient på 10-15 % metanol i kloroform for å gi 2 6 mg av det ønskede produktet. Retensjonstiden ved revers fase C18 HPLC: 5,0 minutter i 41 % acetonitril/0,1 M vandig ammoniumklorid.

Eksempel 5

N- r r( 4- metyl- coumarin- 7- vl) amino1 acetyl] cysteinhydrazid disulfid analog LL- E33288" Y1J

En blanding av 1,0 g (5,7 mmol) av 4-metyl-7-amino-coumarin, 3,0 ml etylbromacetat (5 ekv.), 90 mg (0,1 ekv.) natriumjodid, og 3 0 ml dimetylformamid ble oppvarmet under argon ved 80°C i 5 timer. Blandingen ble avkjølt, fortynnet med etyleter, vakset tre ganger med 50 % saltløsning, tørket med magnesium-sulf at, og inndampet til tørrhet. Det rå produktet ble løst i kloroform som inneholdt 1 % etylacetat, og filtrert gjennom en plugg av silicagel. Omkrystallisering fra dietyleter som inneholdt spor av kloroform, ga ren etyl N-[(4-metyl-coumarin-7-yl)amino]acetat.

Til 1,96 g (7,5 mmol) av esteren ovenfor i 15 ml metanol og 15 ml tetrahydrofuran ble tilsatt 10 ml IN vandig natrium-hydroksyd. Etter 3 0 minutter ble tilsatt 4 ml 10 % vandig saltsyre. De organiske løsningsmidlene ble fordampet, og det resulterende krystalline produktet ble filtrert og vasket med kald etanol og deretter eter. Dette stoffet ble løst i 20 ml tetrahydrofuran og 4 ml dimetylformamid. Dicykloheksyl-karbonyl-diimidazol (1,3 g, 2,2 ekv.) ble tilsatt og reaksjonen omrørt i 15 minutter. Cysteinetylesterhydroklorid (1,6 g, 2,5 ekv.) og trietylamin (1,2 ml) ble deretter tilsatt. Etter ytterligere 3 timer, ble reaksjonen fortynnet med etyleter inneholdende 5 % metylenklorid og vasket en gang med 10 % vandig saltsyre og 2 ganger med saltløsning. Etter tørking med magnesiumsulfat og fordampning av løsningsmidlene, ble det rå produktet krystallisert ved oppløsning i kloroform inneholdende en minimal mengde etanol og deretter tilsetning av et overskudd av eter. Krystallene ble filtrert og tørket for å gi ren N-[[(4-metyl-coumarin-7-yl)amino]acetyl]-cysteinetylester.

En blanding av 5 ml kloroform, 20 ml metanol, og 0,4 ml hydrazinhydrat ble oppvarmet til tilbakeløp under argon. Til dette ble tilsatt 550 mg N-[[(4-metyl-coumarin-7-yl)amino]-acetyl]-cysteinetylester. Etter 9 timers tilbakeløp ble blandingen avkjølt, og det faste produktet ble filtrert og vasket med kloroform og deretter etyleter. Det rå produktet (som inneholdt thiol og disulfid) ble løst i dimetylformamid inneholdende ditiotreitol og trietylamin. Etter 30 minutter ble produktet utfeldt med overskudd av etyleter og oppsamlet ved filtrering. Dette stoffet ble renset videre ved omkrystallisering fra avgasset acetonitril som inneholdt ditiotreitol og spor av trietylamin for å gi rent N-[[(4-metyl-coumarin-7-yl)amino]-acetyl]cysteinhydrazid.

Til 12 mg 70 % rent LL-E33288-Y1<J> i 12 ml acetonitril ved 0°C ble tilsatt 4 mg N-[[(4-metyl-coumarin-7-yl)amino]acetyl]-cysteinhydrazid i 1,2 ml dimetylformamid. Etter omrøring over natten ble tilsatt ytterligere 2 mg N-[[(4-metyl-coumarin-7-yl)amino]acetyl]cysteinhydrazid i 0,6 ml dimetylformamid. Reaksjonen ble omrørt i 3 døgn ved 0°C og filtrert. Aceton-itrilet ble inndampet, og den resulterende dimetylformamid-løsningen ble fortynnet med overskudd av 1:1 heksaner/eter. Produktet ble isolert ved filtrering og ytterligere renset ved kromatografi på silicagel med en 15-20 % gradient av metanol i kloroform for å gi 3 mg av det ønskede produktet. Retensjonstiden ved revers fase CL8 HPLC: 3,5 minutter ved bruk av 45 %

acetonitril/0,1 M vandig ammoniumklorid.

Eksempel

3- merkaptopropionylhvdrazid disulfid analog LL- E33288a3J

Til 10 mg LL-E33288a3<J> i 9 ml acetonitril ved -15°C ble tilsatt 6,6 mg av 3-merkaptopropionylhydrazid i 1 ml acetonitril. En ekvivalent trietylamin og/eller en ekvivalent eddiksyre ble tilsatt som katalysator. Reaksjonen ble omrørt ved 0°C i 1 time, og løsningsmiddelet ble deretter fordampet. Residuet ble kromatografert på silicagel med en gradient på 10-15 % metanol i kloroform for å gi det ønskede produktet. Retensjonstiden ved revers fase C18 HPLC: 3,5 minutter i systemet 45 % acetonitril/0,1 M vandig ammoniumklorid.

Eksempel 7

Ikke- spesifikk konjugasjon med proteiner Hydroksyravsyreimidesteren beskrevet i eksempel 3 ble kovalent bundet til antistoffer under svakt alkaliske betingelser. Det følgende er en generell fremgangsmåte som brukes for å lage de antistoffkonjugatene som er oppført i tabell 5. Antistoff ved en konsentrasjon på 3-5 mg/ml i fosfatbuffer inneholdende 0,1M natriumklorid, pH 7,5, ble omsatt med et 5-20 ganger molart overskudd av produktet fra eksempel 3 med omrøring, ved romtemperatur i fra 1-4 timer. Det konjugerte proteinet ble avsaltet kromatografisk, og aggregert protein ble separert fra monomert materiale ved gelfiltrering HPLC. Monomere fraksjoner ble oppsamlet og konsentrert.

Eksempel 8

Fremstilling av sete- spesifikt konjugat

Den generelle fremgangsmåten for å binde hydrazid-derivater av medikamenter til oksyderte antistoffer er beskrevet i T.J. McKearn, et al., i U.S. patent Nr. 4.671.958. Fremgangsmåten er blitt anvendt for å fremstille antistoff-konjugater fra produktene i eksemplene 4 og 5 med spesielle modifikasjoner som beskrevet nedenfor. Produktene fra disse reaksjonene og deres karakteristika er sammensatt i tabell 6.

(A) Oksydasjon av antistoff. Antistoff ved en konsentrasjon på 5 til 10 mg/ml ble dialysert over natten mot et 200 gangers

volum av 50 mM natriumacetatbuffer, pH 5,5, inneholdende 0,1 M natriumklorid (buffer A). Etter dialyse ble MoAs oksydert ved 15 mM til 2 00 mM perjodsyre i 0,2 M natriumacetat. Oksyda-

sjonen fikk foregå i mørke under omrøring, ved 4°C i 45 minutter, hvoretter det oksyderte MoAs ble avsaltet på en kolonne med >5 bed volum Sephadex G-25. Oksydasjonsgraden for antistoffet ble bestemt ved å omsette med p-nitrofenylhydrazin og sammenligne absorbansen av proteinet ved 280 nm mot p_-nitrofenylhydrazin ved 395 nm. (B) Medikamenthvdraz id- koniugasi on. Det oksyderte MoAs ble omsatt med 25 til 200 ganger molart overskudd av medikamenthydrazid. Hydrazidene ble løst i dimetylformamid og tilsatt til den vandige løsningen av MoAs. For å unngå utfelling av MoAs overskred ikke det totale tilsatte volumet av dimetylformamid 10 % av det totale reaksjonsvolumet. Reaksjonen fikk foregå i 3 timer ved romtemperatur under røring. For å forhindre tverrbinding av ikke-omsatte aldehyder og påfølgende aggregering, ble tilsatt et blokkeringsmiddel, acetylhydrazid i 100-ganger molart overskudd 3 timer etter tilsetning av medikamenthydrazidet. For å stabilisere Schiffs base-bindingen mellom aldehyd og medikamenthydrazid (et hydrazon), ble produktet vanligvis redusert til et alkylhydrazin ved tilsetning av 10 mM natriumcyanborhydrid, og reaksjonen fikk fortsette i ytterliger en time (samlet konjugeringstid - 4 timer). Konjugatet ble kromatografisk avsaltet og fullstendig dialysert (minimum tid 48 timer) over i pH 6,5 fosfatbuffer for lagring og utprøving.

Konjugatene ble analysert på tilstedeværelse av aggregater ved gelfiltrering HPLC og på fritt medikament ved revers fase HPLC. Medikamentinnholdet ble bestemt spektroskopisk ved bruk av ekstinksjons-koeffisienter for både antistoffet og medikamentet for å bestemme molare konsentrasjoner av medikament i konjugatene.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for å fremstille de terapeutisk aktive målrettede derivatene av forbindelser med formelen CH3SSS-W, hvori CH3SSS-W er et antitumor antibiotikum LL-E33288a1 , a ± J , a2 , a2<J>, a3 , a3<J>, a4 , P^ r, PX<J>, ( 32Br, ( 32J, nfiB<r>, "Yi<J>, 6^, BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD 114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E eller CL-1724, karakterisert ved at den omfatter å omsette CH3SSS-W med en forbindelse med formelen Q-Sp-SH, hvori Sp er en toverdig Ci~ C10 alkylengruppe med rett eller forgrenet kjede, og Q er H i acetonitril i nærvær av en ekvivalent av trietylamin og/eller en ekvivalent eddiksyre ved -10 til -30°C i 1 til 48 timer, å isolere mellomproduktet med formelen Q-Sp-SS-W, hvori Q, Sp og W er som tidligere definert heri, deretter å omsette forbindelsen med formelen Q-Sp-SS-W hvori Sp, Q og W er som tidligere definert heri, med et molekyl med formelen Tu-Y hvori Tu-Y er et mono- eller polyklonalt antistoff, dets fragmenter, dets kjemisk eller genetisk manipulerte motstykker, eller vekstfaktorer; Y er en side-kjede amino eller karboksyfunksjon av antistoffet; n er 1-100, i vandig buffer ved en pH på mellom 6,5 og 9, ved 4 til 40°C enten direkte eller i nærvær av et vannløselig karbodiimid, for å frembringe forbindelsen hvori Tu, Sp, W, n og Y er som tidligere definert heri, m er 1-15 og Z er dannet ved kovalent reaksjon av gruppene Q og Y og er -CONH-, -NH-, -N=CH-, eller -C02-eller å omsette forbindelsen med formelen Q-Sp-SS-W, hvori Sp og W er som tidligere definert heri, og Q er med et molekyl med formelen Tu-(Y)n. hvor Tu og n er som tidligere definert heri, og Y er en sidekjede aminogruppe, i en vandig bufret løsning med en pH mellom 6,5 og 9, ved en temperatur på mellom 4 og 40°C, innbefattet, for å frembringe forbindelser med formelen : hvori Tu, Sp, Y og n er som tidligere definert heri, m er 1-15, og Z er dannet ved kovalent reaksjon mellom Q og Y og er definert som -CONH- eller å omsette en forbindelse med formelen Q-Sp—SS-W, hvori Sp og W er som tidligere definert heri, og Q er -CONHNH2 med salpeter-syrling i vandig acetonitril for å frembringe en forbindelse med formelen Q-Sp-SS-W, hvori Sp og W er som tidligere definert heri og Q er -CON3 med en forbindelse med formelen Tu-(Y)n,, hvori Tu, Y og n er som tidligere definert heri for å frembringe en forbindelse med formelen hvori Tu, Z, Sp, W, m, Y og n er som heri definert ovenfor; eller å omsette en forbindelse med formelen Q-Sp-SS-W hvori Sp og W er som tidligere definert heri og Q er -CONHNH2, med et molekyl med formelen Tu-(Y)n hvori Tu er som tidligere definert heri, Y er et aldehyd frembragt fra karbohydratresiduer på Tu ved oksydasjon i nærvær av et periodat av et alkalisk jordmetall i en vandig buffer med pH mellom 4,0 og 6,5, ved 4 til og med 40°C, og n er 1 til 20 for å frembringe en forbindelse med formelen: hvori Tu, Sp, W, Y og n er som tidligere definert heri, og Z er laget ved kovalent reaksjon av Q og Y og er -C0NHN=CH-, og m er 0,1 til 15; eller å behandle forbindelse umiddelbart ovenfor med formelen: hvori Tu, Z, Sp, W, Y, n og m er som umiddelbart ovenfor definert med acetylhydrazin i en vandig buffer ved pH mellom 4,0 og 6,5, ved 4 til og med 40°C, for å frembringe en forbindelse med formelen: hvori Tu, Z, Sp, W, n og m er som umiddelbart ovenfor definert, og Y er -CH=NNHCOCH3, og å omsette denne forbindelsen med natriumcyanborhydrid i en vandig buffer ved pH på 4,0 til 6,5, ved en temperatur på 4 til og med 40°C, for å frembringe en forbindelse med formelen: hvori Tu, Sp, W, m og n er som tidligere definert heri, Z er -CONHNHCH2-, og Y er -CH2NHNHCOCH3.

2. Fremgangsmåte ved fremstilling av derivatene ifølge krav 1, hvori CH3SSSW er LL-E33288'y1<j>, Q er 4-nitrofenylesteren av en karboksylgruppe, Sp er -CH2CH2-, Tu er det monoklonale antistoffet CT-M-01, Y er -NH2, Z er -CONH-, og m er 0,5 til 15, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte ved fremstilling av derivatene ifølge krav 1, hvori CH3SSSW er LL-E33288'Y1<J>, Q er hydroksyravsyreimidesteren av en karboksylgruppe, Sp er -CH2CH2-, Tu er det monoklonale antistoffet MAC-68, Y er -NH2, Z er -CONH-, og m er 0,5 til 15, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

4. Fremgangsmåte ved fremstilling av derivatene ifølge krav 1, hvori CH3SSSW er LL-E33288'y1<J>, Q er -CONHNH2, Sp er - CH2CH2-, Tu er det monoklonale antistoffet Lym 1, Y er -CHO, Z er -CONHNHCH2, og m er 0,1 til 10, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

5. Fremgangsmåte ved fremstilling av derivatene ifølge krav 1, hvori CH3SSSW er LL-E33288'Y1<J>, SpQ er Tu er det monoklonale antistoffet B72,3, Y er -CHO, Z er -C0NHNHCH2-, og m er 0,1 til 10, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

6. Fremgangsmåte ved fremstilling av derivatene ifølge krav 1, hvori CH3SSSW er LL-E3 3 288'Y1J, SpQ er Tu er det monoklonale antistoff Lym 2, Y er -CHO, Z er -CONHNHCH2-, og m er 0,1 til 10, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.