NO176884B - DNA-sekvens kodende for human Mangansuperoksyddismutase (hMn-SOD), vektorer inneholdende dette genet og rekombinant framstilling av hMn-SOD - Google Patents

Description

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er en geneteknisk fremgangsmåte for fremstilling av human Mn-superoksyddismutase (hMn-SOD), DNA-sekvensene som koder for dette enzymet, replikerende vektorer som inneholder disse DNA-sekvensene, og plasmider. Det beskrives dessuten forslag for anvendelse av dette enzymet.

Som følge av forskjellige biokjemiske prosesser i biologiske systemer (f.eks. Redoxprosesser i åndedrettskjeden, oksydasjoner

i cytoplasma) dannes som kjent stadig 02-radikaler, som er meget cytotoksiske og kan føre til vevsforstyrrelser. Ved patologiske situasjoner, f.eks. i løpet av reumatisk betingede sykdommer, omtales degraderinger av kollagen og synovialvæske gjennom slike radikaler (Pasquier, C. et al., Inflammation 8, 27-32, 1984). Eukaryotiske celler inneholder to former av superoksyd-dismutaser, hvorav den ene særlig foreligger i cytosol (Cu/Zn-SOD), og den andre hovedsakelig i mitokondriene (Mn-SOD) . I levermitokondrier ble det funnet at Mn-enzymet i matrisen er lokalisert innesluttet i den innvendige membranen, selv om Mn-SOD også ble påvist i levercellenes cytosol (Mc Cord J.M. et al., In: Superoxide and Superoxide Dismutases (A.M. Michelson, J.M. Mc Cord, I.Fridovich, eds.) Academic Press, N.Y., 129-138, 1977).

I prokaryoter foreligger ved siden av et Mn-SOD også et Fe-SOD. Sistnevnte ble også påvist i alger og protozoer samt

i noen plantearter (Bridges, S.M., Salin, M.L., Plant Physiol. 68, 275-278, 1981). Disse meget aktive enzymer katalyserer disproporsjoneringen 02+02+2H+

H202+02 og forhindrer gjennom denne dismutasjonen av superoksyd-radikalene deres anrikelse og dermed deres celleskade-lige virkning. Ved siden av leverens endoplasmatiske reti-kulum kan de mitokondriale membranene anses som ett av de viktigste

stedene for 02 dannelse i dyreceller, slik at det ikke er forunderlig at mitokondrier har sine egne, spesielle SOD(Mn-

SOD) .

Strukturgenet til en prokaryotisk Mn-SOD (E.coli) ble klonet og det kromosomale sodA-genet lokalisert (Touati, D., J. Bact. 155, 1078-1087, 1983).

Den 699 bp lange nukleotidsekvensen til et mitokondrisk gjær-Mn-SOD ble oppklart og primærstrukturen til både forstadiet og det fullstendige protein derav avledet - med molekylvekter på 26123 Da for forstadiet og 23059 Da for det ferdige protein (Marres, C.A.M. et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161 (1985) Således adskiller Mn - og Cu/Zn-SOD (MG=14893, EP-A 138111) seg tydelige i sine molekylvekter.

Den fullstendige aminosyresekvensen til Mn-SOD fra menneskelever ble publisert av Barra, D., ifølge hvilken hMn-SOD skal være sammensattt av 196 aminosyrer (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984). De humane Cu/Zn-SOD fra erytrocytter består derimot av 153 aminosyrer (Jabusch, J. R., et al., Biochemistry 19, 2310-2316, 1980) og viser ingen sekvenshomologier med hMn-SOD) (Barra D. et al., se ovenfor).

Generelt tillegges superoksydismutasene en beskyttelses-funksjon mot bestemte betennelsesprosesser. Spesielt skal en mangel på Mn-SOD ved utviklingen av reumatoid arthritis beskrives en betydning (Pasquier, C. et al., se ovenfor). En beskyttende virkning av SOD mot alkoholinduserte leverskader antas likeledes (Del Villano B.C. et al., Science 207, 991-993, 1980).

Kloningen og ekspresjonen av et Human-SOD er bare kjent for Human-Cu/Zn-SOD fra menneskelever (EP-A-138111).

På grunn av de forannevnte vesentlige egenskapene til superoksyddismutaser, spesielt til hMn-SOD, forventes et behov for den terapeutiske og/eller diagnostiske anvendelse. Herunder er det fordelaktig å ha for dette formål artsegne, dvs. humane Mn-SOD i homogen form og i en tilstrekkelig mengde til rådighet. Målforestillingen som kan avledes fra dette/ er å minimalisere eller forhindre immunologiske reaksjoner som f.eks. kan ventes etter terapi.

Først utviklingen av teknologier for rekombinasjon av fremmed-DNA med vektor-DNA med den mulighet å etablere og eksprimere også førstnevnte i mikroorganismer, gjør det mulig å fremstille homogene proteiner av animalsk eller human opprinnelse i store mengder. Herunder skal også et annet mål nåes, nemlig at det dermed fremstilte enzym - hMn-SOD - viser et karakteristisk biologisk aktivitetsspektrum i forhold til det autentisk ekte hMn-SOD.

En oppgave for foreliggende oppfinnelse besto derfor i, ved hjelp av geneteknologiske metoder, for første gang å finne, henholdsvis vise, DNA-sekvensen som koder for dette enzymet, og for første gang å utvikle fremgangsmåter for fremstilling av denne sekvensen.

Ifølge oppfinnelsen ble denne oppgaven løst ved at en cDNA-genebank, med syntetisk fremstilte DNA-probemolekyler fra menneskeceller av placentaopprinnelse ble undersøkt og ved at genet som kodet for hMn-SOD kunne isoleres. For å oppnå genet for hMn-SOD, kan også mRNA'et fra slike celler isoleres etter kjente metoder, som kan produsere det ønskede enzymet. Som utgangsmateriale er forskjellige, f.eks. metabolisk aktive kjertelvev så som f.eks. lever eller placenta egnet. Etter fremstilling av cDNA, som også kan oppnås etter kjente metoder ved primet syntese med revers transkriptase ved hjelp av det isolerte mRNA, etterfølgende innbygning i en egnet vektor og utbygning til en fullstendig cDNA-genebank, kan disse under-søkes med en definert, radioaktiv merket DNA-probe, eller en blanding av forskjellige slike prober. For å ta hensyn til degenereringen av den genetiske koden anvendes fortrinnsvis definerte DNA-probeblandinger, som alle representerer mulige nukleotidvariasjoner for en og samme aminosyre, hhv. er slik utplukket at antallet av DNA-probene i en blanding som skal syntetiseres er minst mulig, og homologien til den søkte hMn-SOD DNA-sekvens så høy som mulig. Et videre utvalgskriterium for syntesen av DNA-prober kan bestå i at dette er komple-mentært med minst to uavhengige områder, f.eks. nær 3'- og 5'-enden av den putative genesekvens. Derved kan, ved hjelp av minst to adskilte hybridiseringer, de kloner identifiseres som viser positive signaler mot f.eks. begge uavhengige DNA-prober. Disse klonene kan da fortrinnsvis benyttes for isoleringen av hMn-SOD-genet, da man av dem kan vente at de enten inneholder en vesentlig del av, eller det komplette genet for hMn-SOD.

De spesielle DNA-sekvensene, som ble anvendt for DNA-probene ble avledet fra aminosyresekvensen til humant Mn-SOD fra levervev, publisert av Barra, D. et al., Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339-1983). Spesielt kan fortrinnsvis to områder av den putative hMn-SOD DNA-sekvensen anvendes, som koder for minst 5 aminosyre-rester, fortrinnsvis for 8 aminosyrerester, hvorunder en DNA-probelengde på minst 14, fortrinnsvis 23 baser er fordelaktig. Særlig fordelaktig er det når en DNA-probe er komplementær med den avledede hMn-SOD DNA-sekvens, dens genetiske informasjon er kolineær med aminosyreresten 39 til 46, og en andre DNA-probe er komplementær med det tilsvarende DNA-området som koder for aminosyre-restene 200 til 2 07 av den kjente aminosyresekvens. Likeledes kan naturligvis DNA-sekvensene anvendes som prober, som kan avledes ved hjelp av andre Mn-superoksyddismutaser.

Ved hjelp av en slik DNA-probe kan man få positive kloner, hvorfra en cDNA-sekvens med følgende formel Ia kan isoleres, som inneholder et stor andel av et område som koder for hMn-SOD:

Overraskende ble det funnet at det funnede cDNA koder for en aminosyresekvens som adskiller seg fra den publiserte aminosyresekvensen (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984) i noen rester og i sin lengde- fra hverandre. De funnede forskjeller av denne sekvensen med "Barra-sekvensen11 vedrører aminosyreposisjonene 42, 88, 109 og 131 (Glu istedet for Gin) samt to ytterligere aminosyrer Gly og Trp mellom posisjon 123 og 124, slik at DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen tilsvarer en hMn-SOD på 198 aminosyrer.

Fullstendig uventet var det også at på den annen side kunne et cDNA som koder for hMn-SOD isoleres, som betyr en aminosubstitusjon på posisjon 29 (kodon for Gin istedet for Lys) og dermed i dette punkt har en ytterligere forskjell "til Barra-sekvens" og med formel Ia, som tilsvarer formel Ib:

Går man ut fra at Barra-sekvensen er blitt riktig analysert, kan man ved hjelp av nukleotid- hhv. aminosyre-sekvensen i oppfinnelsen få den mulighet at dermed opptegnes for første gang og overraskende den mulige eksistens av forskjellige gener eller deres allele uttrykksformer eller isoenzymer for hMn-SOD.

Da klonene som inneholder cDNA kan erholdes, som mangler den nødvendige enden for det fullstendige hMn-SOD-genet, var en videre oppgave for foreliggende oppfinnelse å frembringe det fullstendige genet for hMn-SOD.

Løsningen av denne oppgaven kan skje etter forskjellige kjente strategier. For eksempel kan den oppnådde sekvens selv anvendes som DNA-probe, og dermed kan cDNA-banken undersøkes igjen for å finne et fullstendig gen, hhv. et cDNA, med enden som mangler, eller den oppnådde cDNA-sekvens kan anvendes som hybridiseringsprobe mot en genomisk bank for å isolere det fullstendige hMn-SOD-genet etter identifisering.

Eller man benytter den mulighet å syntetisere oligonukleotider hvis nukleotidsekvens tilsvarer den manglende ende av hMn-SOD og ved hjelp av denne etter passende linker-legering å oppnå det fullstendige cDNA for hMn-SOD. Denne metoden har den fordel at man f.eks. kan få et DNA som koder for hMn-SOD, hvis 5'-ende begynner direkte med startkodonet

(ATG).

Særlig egnet for å løse denne oppgave fant man komplett-eringen av de f.eks. fra aminosyre 22 eller 26 kodende cDNA'er ifølge oppfinnelsen DNA-sekvensen med formel II, som begynner med 5'-startkodonet ATG og ender med kodonet for aminosyre 31 (His, hvorunder AAG [Lys] =1) på basis av de kjente kodon-preferanser, slik som den f.eks. har gyldighet for gjær (Sharp, P.M. et al., Nucl. Acids. Res. 14 (13), 5125-5143, 1986)

Likeledes kan andre kjente synonyme kodoner for komplet-teringen av hMn-SOD-genet eller for in vitro syntese av det totale genet anvendes, f.eks. slike som letter en optimal kodon- antikodon-vekselvirkning i bakterier, f.eks. e.coli, og der øker effektiviteten av translasjonen (Grosjean, H. Fiers, W., Gene 18, 199-209, 1982; Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151, 389-4 09, 1981) eller slike kodoner, som tilsvarer de virkelige forhold i pattedyrceller (Grantham, R., et al., Nucleic Acid Research 9, 43-47, 1981).

Sistnevnte kan fortrinnsvis anvendes for transformasjon og deretter for ekspresjon i pattedyrceller.

Det er prinsipielt mulig å avspalte methioninresten som kodes for gjennom startkodonet ATG og står foran det ferdige hMn-SOD, som begynner den første aminosyren Lysin, etter i og for seg kjente fremgangsmåter, f.eks. med CNBr eller CNC1. Da det imidlertid kan forekomme ytterligere innvendige methionin-rester i det ferdige enzym hMn-SOD, f.eks. i posisjonene 23 eller 192, kan en slik fremgangsmåte være ugjennomførbar, slik at i dette tilfellet forblir den ytterligere N-terminale methioninrest uten innflytelse på den biologiske aktiviteten til hMn-SOD.

Det kan imidlertid også foretas enzymatiske spaltninger, hvorunder som kjent egnede syntetiske linkere anvendes, da det er å vente at kodoner for tilsvarende spesifikke aminosyrer befinner seg i de ønskede posisjoner på vektoren som inneholder hMn-SOD cDNA. For eksempel er Arg- eller Lys-rester å nevne for en tryptisk spaltning, hhv. man benytter seg generelt av kodoner som koder for protease-ømfintlige aminosyrer. Disse kan være plassert foran eller bak startkodonet eller inne i det kodende området.

En ytterligere oppgave for foreliggende oppfinnelse var, med hjelp av geneteknologiske metoder, å bringe sekvensen som koder for hMn-SOD for første gang til ekspresjon i egnede vertsceller, og for første gang fremstille og isolere det homogene enzym hMn-SOD etter slike fremgangsmåter, og bringe det i ren form og for første gang beskrive den nødvendige fremgangsmåte for dette.

Ifølge oppfinnelsen ble denne oppgaven løst ved DNA-sekvensene som koder for den fullstendige eller partielle genetiske informasjon for menneskets mangan-superoksyddismutase (hMn-SOD) med en pl-verdi 8,15 ±0,2, og bestående av sekvensen

hvori AAG i kodon 30 kan erstattes med CAG og CAC i kodon 32 kan erstattes med CAT, og som koder for et fullstendig hMn-SOD- enzym, idet de koder for et uferdig hMn-SOD-enzym som kan innføres i mitokondrium, og deri kan omdannes korrekt til det aktive ferdige enzym som har de enzymatiske, biokjemiske og immunologiske egenskapene til hMn-SOD,

at den eventuelt har en aminoterminal leder- eller signalsekvens, translasjonsstartsignal (ATG) og minst ett stopp-kodon.

Denne kan utstyres med tilsvarende signal- eller kontroll-sekvenser, innsettes i egnede vektorer og egnede vertsceller transformeres dermed. Etter dyrking av de transformerte vertsceller, isoleres de dannede polypeptider etter i og for seg kjente fremgangsmåter og renses. De erholdte polypeptider tilsvarer de etterfølgende formler IVa og IVb.

DNA-sekvensen med formelene forut egner seg spesielt for fremstilling av ikke-glykosylerte hMn-SOD med formelene IVa og IVb i mikroorganismer, spesielt i E.coli eller S. cerevisiae. Problemet med glykosylering, f.eks. i gjær, kan omgås ved at man benytter seg av mutanter som er defisiente i glykosyler-ingen av proteiner (alg mutanter) (f.eks. Huffaker, T.C., Robbins P.W. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 7466-7470, 1983)

Hvis det synes nødvendig eller hensiktsmessig, kan det foran det fullstendige hMn-SOD-gen med formelen forut settes en leder- hhv. signal-sekvens direkte før det første kodonet av den første N-terminale aminosyren til det ferdige hMn-SOD hhv. foran startkodonet ATG. Dermed kan det oppnås at hMn-SOD transporteres fra vertscellen og lett kan isoleres fra dyrkningsmediet.

Slike signalsekvenser er beskrevet, som koder for en hovedsakelig hydrofob proteinandel, som avspaltes med post-translasjonelle modifikasjonsprosesser i vertscellen (Davis, D. B., Tai. P.-C, Nature 283, 433-438, 1980; Perlman, D., Halvorson, H.O., J. Mol. Biol. 167, 391-409, 1983). Når et ATG-kodon er konstruert foran den første aminosyren av hMn-SOD, kan et genprodukt oppnås som inneholder et N-terminalt methionin foran lysinet. At signalsekvenser fra prokaryoter anvendes for å utskille proteiner i periplasmaet og behandle dem korrekt, er kjent. (f. eks. Davis, B.D., Tai, P.-C, 1980).

Selvfølgelig er det etter isolering og kloning av hMn-SOD DNA-sekvensen mulig å modifisere enzymet som kodes med denne sekvensen spesifikt. Enzymmodifikasjoner kan likeledes f.eks. skje gjennom målrettede in vitro mutasjoner med syntetiske oligonukleotider, hvorigjennom de katalytiske egenskapene til hMn-SOD påvirkes og nye typer enzymatiske aktiviteter kan fremskaffes. De grunnleggende metodiske trinn for gjennom-føring av slike proteinmanipulasjoner er kjente (f.eks. Winter, G. et al., Nature 299, 756-758, 1982; Dalbadie - Mc Farland, G. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79, 6409-6413, 1982).

For kloningen, dvs. forøkning og fremstilling av hMn-SOD genet kan E.coli anvendes, fortrinnsvis E.coli C600 (Nelson et al. Virology 108, 338-350, 1981) eller JM 101, f.eks. E. coli-stamme med minst en av de kjente sup-genotyper. Kloningen kan imidlertid også skje i Gram-positive bakterier så som f.eks. B. subtilis. Slike systemer er beskrevet mange ganger.

Som egnede verter for ekspresjonen av hMn-SOD-genet ifølge oppfinnelsen, kommer eukaryoter på tale. Blant eukary-otene er ascomycetene, spesielt gjær, f.eks. Saccharomyces cerevisiae, foretrukne verter.

For encellede mikroorganismer står en rekke utgangs-vektorer til rådighet, som kan være både av plasmidisk og også viral opprinnelse. Disse vektorer kan foreligge i enkelt kopitall eller som multikopi-vektorer. Slike vektorer, som er egnet for kloning og ekspresjonen av hMn-SOD ifølge oppfinnelsen, samt generelt for eukaryotiske DNA-sekvenser, beskrives i mange publikasjoner og håndbøker, f.eks. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Glover D.M. (ed.) DNA Cloning Vol. I, II, 1985) og kan kjøpes.

Generelt kan plasmidvektorer, hvilke som regel inneholder en replikasjonsopprinnelse og kontrollsekvenser for transkripsjon, translasjon og ekspresjon, anvendes i forbindelse med disse verter. Disse sekvenser bør stamme fra arter som er forenelige med vertscellene. Vektoren inneholder normalt, ved siden av et replikasjonssete, i tillegg gjenkjennelses-sekvenser som gjør det mulig å seleksjonere fenotypisk i transformerte celler. Seleksjonen kan enten skje ved komple-mentas jon, undertrykkelse eller ved inaktivering av en markør. Med hensyn til de to førstnevnte metoder er det kjent auxotrofe mutanter av bakterier og gjær, som mangler et essensielt stoffvekselprodukt, eller nonsense-mutanter, hvori det kommer til kjedeavbrudd ved translasjonen av det aktuelle gen. Forskjellige suppressor-gener, f.eks. supD, E, F (supprimerer UAG), supC, G (supprimerer UAG eller UAA) er kjente. Ved den tredje fremgangsmåte bærer vektoren et resistensgen mot ett eller flere cytotoksiske reagenser, så som f.eks. antibiotika, tungmetaller. Ved innskudd av et fremmed DNA i et slikt markørgen, inaktiveres dette, slik at den nye oppståtte fenotype kan skilles fra den opprinnelige fenotype.

For eksempel kan E.coli transformeres med pBR322, et

plasmid som stammer fra E.coli arter (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetra-cyklin-resistens og gir dermed enkle midler til å identifisere transformerte celler, idet fenotypen Ap<r>, Tc<r> til Ap<s>, Tcr f.eks. konverteres i Pstl-setet i /?-lactamase-genet. Andre fremgangsmåter er likeledes anvendelige, for hvilke f.eks. lacZ-geninaktiveringen ved X- og M 13-vektorene samt ved

forskjellige plasmider (f.eks. pUC, pUR) er viktige. Disse svært mangfoldige seleksjonssystemene har vært kjent lenge og er tilsvarende omfattende omtalt i literaturen.

Ved siden av slike seleksjonsmarkører må slike vektorer, spesielt ekspresjonsvektorer, ha signalsekvenser som gir den riktige start og avslutning av transkripsjonen. For den korrekte transkripsjon av hMn-SOD-genet kan derfor disse vektorer inneholde en bakteriell eller en eukaryotisk transkripsjonsenhet bestående av en promotor, det kodende området med hMn-SOD-genet og den dertil sluttende terminator. Tilsvarende typen av transkripsjonsenheter kan disse konsver-verte prototyp-sekvenser så som f.eks. Pribnow-Box eller TTG-sekvens, eller også CAAT-Box, TATA-Box, de kjente avslutnings-signaler (f.eks. AATAAA, TATGT) samt minst et stoppkodon foreligge, hvorunder det fortrinnsvis med hensyn til verten anvendes homologe promotorer og terminatorer. Det dannede mRNA inneholder normalt en 3' poly (A)-sekvens og/eller en 5' cap-struktur. For translasjonen av hMn-SOD-genet kreves det et ribosomalt bindingssete (RBS), bestående av Shine/Dalgarno (S/D)-sekvens og en dertil, i definert avstand på generelt 3 til 12 nukleotider, stående startkodon, samt minst et stopp-kodon. Alternativet kan RBS'er fremstilles syntetisk, hvorigjennom homologien med 3'-enden til 16S rRNA kan økes (Jay, E. et al. Nucleic Acids Res. 10, 6319-6329, 1982).

Spesielt ved eukaryotiske ekspresjonssystemer (f.eks. S. cerevisiae) bør fortrinnsvis reguleringssystemer for translasjon av vertsegen opprinnelse anvendes, da det i gjær ikke foreligger analoge forhold med prokaryotene (homologi av S/D-sekvens med 3'-enden til 16S rRNA) og signalene, hhv. RBS er definert for start av translasjon på en noe annen måte enn hos prokaryoter (f.eks. Kozak, M., Nucleic Acids Res. 9, 5233-5252, 1981; Kozak, M. J. Mol., Biol. 156. 807-820, 1982).

Fortrinnsvis har klonings- eller ekspresjonsvektoren bare et restriksjonsendonuklease-gjenkjennelsessete, som enten på forhånd foreligger i utgangsvektoren eller kan innføres etter-skuddsvis gjennom tilsvarende linker. Linkere kan enten lett syntetiseres kjemisk eller foreligger i handelen.

Ofte benyttede gjær-promotorer ved fremstillingen av tilsvarende ekspresjonsplasmider. De inneholder slike promotorer som styrer ekspresjonen spesielt effektivt i gjær-systemet, så som f.eks. PGK-promotor (Tuite, M.F. et al., The EMBO Journal 1, 603-608, 1982; Hitzeman, R.A. et al., Science 219, 620-625, 1983), PH05 promotor (Hinnen, A., & Meyhack, B., Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 101, 117, 1982; Kramer, R.A., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 367-370, 1984), GAPDH promotor (Urdea, M.S. et al. Proe Nati Acad. Sei. USA 80, 7461-7465, 1983), GAL10 promotor (Broach et al. Experimental Manipulation of Gene Expression 83-117, 1983), Enolase (ENO)-promotor (Holland, M.J. et al, J. Biol. Chem. 256. 1385-1395, 1981), a-faktor promotor (Bitter, G.-A. et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 5330-5334; Yakota, T. et al. Miami Winter Symp. 17. Meet. Adv. Gene Technol 2., 49-52, 1985)) eller ADHI promotor (Ammerer, G., Methods in Enzymology 101, 192-201, 1983; Hitzeman, R.A. et al. Nature 293. 717-722, 1981) .

Også promotorer for andre glykolytiske enzymer (Kawasaki und Fraenkel, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108, 1107-1112, 1982) er egnet, så som heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glykose-6-fosfat isomerase, fosfoglukose-isomerase og glukokinase. Ved konstruksjonen av egnede ekspresjonsplasmider kan avslutningssekvensen i.f.m. disse genene likeledes anvendes i ekspresjonsvektoren på 3'-enden av sekvensen som skal eksprimeres for å gi polyadenylering og avslutning av mRNA. Andre promotorer som dertil også har fordelen av kontrollert transkripsjon gjennom vekstbeting-elser, er promotorområdene til alkohol-dehydrogenase-2, iso-cytokrom C, de nedbrytende enzymer som henger sammen med nitrogenmetabolismen, den ovenfor nevnte glycerolaldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (GAPDH) og en enzymene som er ansvarlige for metaboliseringen av maltose og galaktose. Promotorer som reguleres gjennom gjærmodningstype-vekststed, f.eks. promotorer for genene BARI. MECI, STE2, STE3, STE5 kan anvendes ved temperaturregulerte systemer ved anvendelsen av temperatur-avhengige sir mutasjoner. (Rhine, Ph. D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209,

(1981), Cold Spring Harbor Laboratory).

Disse mutasjoner påvirker ekspresjonen til hvilende mod-ningstype kasetter fra gjær og derigjennom indirekte modnings-type avhengige promotorer. Generelt er imidlertid enhver plasmidvektor, som inneholder en gjær-forenelig promotor, opprinnelig replikasjons- og avslutnings-sekvenser egnet.

For kloning eller ekspresjon av hMn-SOD i gjær, f.eks. i S. cerevisiae, står godt kjente vektorer til rådighet.

Egnede ekspresjonsvektorer i gjær er integrerende (YIp), replikerende (YRp) og episomale (YEp) vektorer (Struhl, K. et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 7_6, 1035-1039, 1979; Sinchcomb, D.T. et al., Nature 282, 39-43, 1979; Hollenberg, C.P., Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 119-144, 1982), fortrinnsvis YEpl3 (Broach, J.R. et al. Gene 8, 121-133, 1979), YIp5 (Struhl, K. et al., 1979 s.o., ATCC 37061) samt pJDB207 (DSM 3181) eller pEAS102. Vektoren pEAS102 kan fremstilles idet YIp5 delvis spaltes med Pstl og fullstendig med BamHI og det isolerte 4,3 kb fragment (inneholder URA3-genet), ligeres med 4,4 kb BamHI/PstI-fragmentet fra pJDB207.

I tillegg til mikroorganismer er kulturer av flercellede organismer likeledes egnede verter for ekspresjonen av hMn-SOD. I prinsippet er enhver av disse kulturer anvendelige, enten det er virveldyr- eller virvelløse dyrecelle-kulturer. Størst interesse består likevel for virveldyrceller, slik at formeringen av virveldyrceller i kultur (vevskultur) i de siste år er blitt en rutinemetode. (Tissue, Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors, 197 3) . Eksempler på slike nyttige vertscelle-linjer er VERO- og HeLa-celler, gullhamster-eggstokk (CHO)-celler og W138, BHK, COS-7 og MDCK-cellelinjer. Ekspresjons-vektorer for disse cellene inneholder normalt en replikasjonsopprinnelse, en promotor, som er lokalisert foran hMn-SOD som skal eksprimeres, et nødvendig ribosombindingssted, et RNA-spleisingssted, polyadenyler-ingssted og transkripsjonene avslutningssekvenser.

Ved anvendelsen av pattedyrceller anordnes ofte kontroll-funksjonene på ekspresjonsvektorene av virusmateriale. For eksempel stammer de normalt anvendte promotorer fra papova-virus så som polyoma-, papilloma-virus, simian virus 4 0 (SV 40) og fra retrovirus, adenovirus type 2. De tidlige og sene promotorer av SV 4 0 og deres anvendelser er beskrevet mange ganger. Dertil er det mulig og ofte anbefalelsesverdig å anvende promotor- eller kontroll-sekvenser eller spleisesignaler som er knyttet sammen med de ønskede gensekvenser opprinnelig, forutsatt at disse kontrollsekvenser er forenelige med vertscellesystemene. Således er SV 4 0-vektorer kjent hvori et eksogent eukaryotisk DNA med sine egne promotor-sekvenser og spleisesignaler ved siden av den sene SV 40-promotor gir et stabilt transkripsjonsprodukt.

Et replikasjonsorigo kan enten oppnås gjennom en tilsvarende vektorkonstruksjon, slik at dette inneholder et eksogent startpunkt, f.eks. fra SV 40 eller andre viruskilder (f.eks. polyoma, adeno, VSV, PBV, etc.) eller dette kan gis til vertscellen gjennom de kromosomale replikasjonsmekanis-mene. Integreres faktoren i vertscellekromosomet, er det sistnevnte tiltak som regel tilstrekkelig.

Transformasjonene av cellene med bærerne kan oppnås med en rekke fremgangsmåter. For eksempel kan den skje med kalsium, hvorunder cellene enten vaskes i magnesium og DNA'et settes til cellene som er oppslemmet til kalsium, eller cellene utsettes for et kopresipitat av DNA og kalsiumfosfat. Ved etterfølgende genekspresjon overføres cellene på medier som selekterer for transformerte celler.

Ved intracellulær produksjon av hMn-SOD kan enzymet isoleres ved at cellene etter å ha nådd en tilsvarende høy celledensitet, frasentrifugeres og deretter oppsluttes enzymatisk eller mekanisk. Rensingen av hMn-SOD ifølge oppfinnelsen kan skje gjennom kjente biokjemiske metoder for protein- hhv. enzym-rensing så som f.eks. dialyse, elektroforese, utfelling, kromatografi eller kombinasjoner derav. Når enzymet utskilles fra cellen, utføres analoge fremgangsmåter for proteinrensning for å oppnå hMn-SOD i ren form fra dyrkningsmediet.

hMn-SOD fremstilt ifølge oppfinnelsen og renset ved disse fremgangsmåter viser et identisk biologisk aktivitetsspektrum in vivo og in vitro med det genuine enzym. Med disse aktiviteter forstås både immunologiske egenskaper (f.eks. kryssreaksjoner med antistoffer for genuint hMn-SOD mot hMn-SOD fremstilt ifølge oppfinnelsen) samt biokjemiske og enzymatiske aktiviteter. For biokjemisk og enzymatisk karakterisering av hMn-SOD'et kan f.eks. forskriftene til Marklund, S.

(Marklund, S. & Marklund, G., Eur J. Biochem. 47, 469-474, 1974) følges, hvoretter også en nøyaktig adskillelse mellom de Cu/Zn og Mn-holdige enzymer foreligger, spesielt ved tilsetning av KCN (inhiberer Cu/Zn-SOD, men ikke Mn-SOD) eller ved hjelp av den forskjellige pH-avhengigheten til deres aktiviteter (se spesielt: Ysebaert-Vanneste, M., Vanneste, W.H., Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980).

Ved polypeptidet dreier det seg ikke utelukkende om det ferdige hMn-SOD som er beskrevet i detalj, men likeledes om enhver modifikasjon av dette enzymet. Disse modifikasjoner innbefatter f.eks. forkortelse av molekylet på den N- eller C-terminale ende, utskifting av aminosyrer med andre rester, hvorigjennom enzymaktiviteten ikke forandres vesentlig. Gjenstand for oppfinnelsen er ikke bare gensekvenser, som spesifikt koder for det beskrevne og som eksempel fremlagte hMn-SOD, men likeledes modifikasjoner, som lett og rutine-messig kan fremstilles gjennom mutasjon, nedbygging, trans-posisjon eller addisjon. Enhver sekvens som koder for hMn-SOD fremstilt ifølge oppfinnelsen, (dvs. har det tilsvarende og kjente biologiske aktivitetsspektrum) og i sammenligning med det viste er degenerert, er likeledes innbefattet; fagfolk på dette området er i stand til å degenerere DNA-sekvenser, spesielt de kodende områder. Likeledes er enhver sekvens som koder for et polypeptid med aktivitetspekteret til det autentiske hMn-SOD, og som hybridiserer med de viste sekvenser (eller deler derav) under stringente betingelser innbefattet.

Det tilhører teknikkens stand under hvilke definerte betingelser en hybridisering (innbefattet forvasking, for-hybridisering, hybridisering, vasking) skal utføres for å oppnå stringente betingelser. Forhybridiseringen av oligonukleotider mot en genbank ("gene bank screening") går man fortrinnsvis frem etter betingelsene til Wood, I.M. et al (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82., 1582-1588, 1985). For å prøve om en bestemt DNA-sekvens hybridiserer med en av DNA-sekvensene som koder for hMn-SOD - enten gjennom in situ hybridisering mot plaquer eller bakteriekolonier eller gjennom Southern-Blotting - er metodene som er beskrevet av Maniatis, T. et al. i detalj og betingelsene å følge (Maniatis. T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, spesielt s. 326-328 og s. 387-389). Alle signaler som tydelig adskiller seg fra bakgrunnen viser følgelig et positivt hybridiseringssignal.

Spesifikt løses de ovenfor nærmere angitte oppgaver ved at RNA'et fremstilles fra menneskevev, fortrinnsvis fra vev av placenta hos mennesker. Mens oppslutningen av vevskultur-celler kan skje direkte med varm fenol, må vev findeles (f.eks. Starmix) for denne type ekstraksjon. Først i dypfryst tilstand, fortrinnsvis i nærvær av pulverisert eller kornet tørris eller i flytende nitrogen. Aggregater dannet med fenol mellom mRNA og andre RNA'er kan igjen oppløses med formamid eller med oppvarming (f.eks. 65°C) . En foretrukket fremgangsmåte for RNA-isolering er følgelig Chirgwins (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry 18, 5294-5299, 1979). Poly(A)<+> RNA kan isoleres fra det for protein og DNA rensete preparat, hensiktsmessig ved affinitetskromatografi, f.eks. poly(U)-sefarose eller Oligo(dT)-cellulose, da eukaryotiske mRNA-populasjoner som regel har en poly(A)-hale på sin 3'-ende (Aviv, H., Leder, P., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69, 1409-1412, 1972; Lindnerg, U., Persson, T., Europ. J. Biochem. 31, 246-254, 1972). For isolering av poly(A)<+->RNA arbeider man fortrinnsvis etter Auffray (Auffray, C., Rougeon, F. , Eur. J. Biochem. 107, 303-314, 1980).

En anrikning av det rensede mRNA kan skje ved at alle mRNA-fraksjonene oppdeles etter sin størrelse - f.eks. ved sentrifugering i en sakkarosegradient. Det ønskede mRNA kan f.eks. påvises gjennom kjente in vitro-proteinbiosyntese-

systemer (Retikulocyter, Oozyter av Xenopus laevis).

Det rensede mRNA eller den anrikede fraksjonen tjener som mal for syntesen av den første kjeden av cDNA, som skjer ved hjelp av den reverse transkriptase og en primer. Som primer er enten oligo (dT) eller syntetisk primer anvendelig, sistnevnte kan avledes ved hjelp av den kjente aminosyre-sekvensen til hMn-SOD og tillater gjentatt priming.av den reverse transkripsjon (Uhlen, M. et al. EMBO Journal 1, 249-254-1982).

Ved den foreliggende oppfinnelse ble syntesen av den første kjeden til cDNA med oligo(dT)12-18 som primer startet i nærvær av dNTP'er.

For syntesen av den andre kjeden av cDNA kan forskjellige kjente metoder anvendes, hvorav f.eks. primingen med en komplementær primer (Rougeon, F., Mach, B., J. Biol. Chem. 252. 2209-2217, 1977) selvpriming ved hjelp av en på 3'-enden av cDNA liggende "hairpin-struktur (Efstratiadis, A., et al. Cell 7, 279, 1976) eller med en Okazaki fragment-lignende primer dannet med RNaseH (Gubler, U., Hoffmann, B.J., Gene 25, 263, 1982) skal nevnes. I den foreliggende oppfinnelse ble denne metoden foretrukket slik den er beskrevet av Huynh, T.V.

(Huynh, T.V. et al., i DNA Cloning Vol I, (D.M. Glover ed.), kapittel 2, s. 49-78, 1985). Det derved oppnådde dobbeltkjedede cDNA kan klones hhv. pakkes direkte i en egnet vektor, f.eks. i et kosmid, innskudds- eller substitusjons-vektor, spesielt i en lambdavektor, fortrinnsvis i XgtlO (Huynh T.V. et al., 1985). Flere kjente metoder står til rådighet for kloningen i lambda, hvorav f.eks. "homopolymeriserings-haledannelse gjennom dA-dT hhv. dC-dG eller linkermetoden med syntetiske linkere skal nevnes (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Huynh, T.V. et al. DNA cloning Vol I (D.M., Glover ed.) 1985, 1980; Watson, C. J., Jackson, F. dto, 1985, kapittel 3). I tilfelle kloning av cDNA ifølge oppfinnelsen ble dette innsatt i EcoRI-setet av XgtlO. In vitro pakningen og kloningen av cDNA'et ifølge oppfinnelsen hhv. konstruksjonen av cDNA-genbanken skjedde ifølge Huynh, T.V. et al., 1985, s. 49-78.

Med den erholdte fagpopulasjon som representerer en cDNA-genbank fra placentavev ble formeringen og plaque-rensingen utført gjennom infeksjon av en egnet vert, spesielt av E.coli, fortrinnsvis av E.coli C 600, hhv. under sikring av den lytiske formeringssyklusen til lambda.

cDNA-genbanken ble undersøkt med radioaktivt merkede syntetiske oligonukleotider, som var avledet ved hjelp av den publiserte aminosyresekvensen (Barra, D. et al., Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1983) under stringente hybridiseringsbetingelser. Ved den foreliggende oppfinnelse ble in situ hybridiseringsprosessen ifølge Benton og Davis (Benton, W.D., Davis, R.W., Science 196, 180 - 182, 1977) anvendt. Foretrukket ble to blandinger på hver åtte syntetiske 23-mer oligonukleotider med formel Va og Vb, som er kolineare med aminosyrene 39 til 46, hhv. 200 - 207 av den Barra, D. et al., (s.o.) publiserte aminosyresekvens og som tar hensyn til den genetiske kodens degenerering. Den siste basen på 5'-enden til disse DNA-prober mangler Wobble-basen for det fullstendige kodon for Gin (aminosyre 46) hhv. Glu (aminosyre 207).

A, G, C og T står for de tilsvarende nukleotider, I for inosin.

Oligonukleotidsonene kan fremstilles etter i og for seg kjente kjemiske syntesemetoder. For den foreliggende oppfinnelse anvendtes en DNA-syntetisator-modell 381A (Applied Biosystems).

Syntesen av alle mulige kombinasjoner av disse to DNA-prober sikrer at minst en av de tilstedeværende oligonukleotider parrer med det for proben komplementære enkeltkjedede DNA-området av det søkte hMn-SOD. Anvendelsen av to uavhengige sammenslåinger av 23-mer oligonukleotider reduserer muligheten for at de "falske" positiver utvelges.

Etter isoleringen av i seg selv homogene plaquer, som ble identifisert av positive signaler etter hybridisering med de to 23-mer DNA-prober, kunne syv rekombinante fager isoleres, og fra deres DNA 500 til 1000 bp lange EcoRI-fragment sekvens-bestemmes. Etter sekvensbestemmelsen av disse EcoRI-fragmenter etter fremgangsmåten til Sanger (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467, 1977; Sanger F. Et al., FEBS Letters 87., 107-111, 1978) og etter subkloning i EcoRI-setet av Ml3-vektoren (Bluescribe, Vektor Cloning Systems) og transformasjon i E.coli, f.eks. E.coli JM101, kunne man finne at EcoRI-fragmentene inneholder cDNA-innskudd som koder for hMn-SOD fra aminosyre 22 (kloner BS5, BS8, BS9, BS13, BSXIII) hhv. fra aminosyre 26 (kloner BS3, BS12).

Det ble likevel overraskende funnet at det fantes noen avvik fra aminosyresekvensen til Barra, D. et al (1984, s.o.) i noen av de målte DNA-sekvenser:

DNA-sekvensen av et 617 bp blant EcoRI-fragment, som kunne isoleres fra ett av de erholdte kloner, f.eks. BS8, er vist i fig. 1. EcoRI-fragmentet inneholder en 532 bp lang sekvens som koder for hMn-SOD samt et 51 bp langt ikke-translatert område innbefattet en poly(A)30 hale. Deler av linker-sekvensene er likeledes vist frem til de (fullstendige) EcoRI-seter.

Posisjonene 30 til 3 3 viser et Thal-skjæringssted, på posisjonene 367 til 372 finner man et BamHI-sted. Overraskende finnes det kodoner på posisjonene 53 til 61, 155 til 163, 176 til 184 samt 500 til 508, som er kolineære for potensielle N-glykosyleringssteder av tilsvarende aminosyrer ifølge Asn-X-Thr hhv. Asn-X-Ser, som er karakteristiske for generell aminosyre-anordninger, hvorunder X f.eks. betyr valin, histidin eller leucin, mens derimot Cu/Zn-SOD av cytosolet bare har en slik aminosyrekombinasjon.

Man har allerede tidligere vært inne på aminosyrefor-skjellene i forhold til aminosyresekvensen til Barra, D. Et al. (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595 - 12601, 1984) som ble avledet fra det erholdt EcoRI-fragment.

For å oppnå de manglende baser på 3'- og/eller 5'-endene av hMn-SOD DNA-delsekvensen fra cDNA-genbanken for fremstilling av et fullstendig hMn-SOD gen, kan forskjellige strategier følges. For eksempel kan det erholdte cDNA anvendes som hybridiserings-probe mot en genomisk genbank for å oppnå sekvensen som koder for hele enzymet, eller man går frem f.eks. etter Kakidani, H. under anvendelse av syntetiske oligonukleotider komplementære til mRNA som spesifikk primer for den reverse transkripsjon (Kakidani, H. et al. Nature 298, 245-249, 1982). Det er imidlertid også mulig å syntetisere den manglende enden av cDNA-sekvensen ved hjelp av den kjente aminosyresekvens (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259,

12595 - 12601, 1984) og forbinde med det funnede cDNA, hvorunder en definert ende oppnås.

For den sistnevnte vei ble 5'-enden for fremstillingen av den fullstendige DNA-sekvens for hMn-SOD ifølge oppfinnelsen komplementert med to oligonukleotider med formlene Via og VIb, som med fordel har Xhol/Xbal - hhv. Xbal/Ncol - overhengende ender. Ifølge oppfinnelsen har man på 5'-enden av kjeden som koder tatt hensyn til 3'-enden av ADHI-promotoren (formel Via)

Etter kombinasjon av begge syntetiske oligonukleotider med formlene Via og VIb, kloning i en egnet vektor, f.eks. i et tilsvarende endret pUC18-derivat og tilføyelse av Thal/EcoRI-framgentet av cDNA ifølge oppfinnelsen oppvist av de erholdte kloner, hvis 5•-ende har minst et Thai-sete, kan man få et plasmid, som inneholder et fullstendig cDNA av hMn-SOD genet i riktig leseramme tilsvarende formelen Vila og Vllb uten Thal-setene.

Sekvensbestemmelsen av klonene BS5, BS9, BS13, BSXIII samt av klonene BS3 og BS12 viste at sekvensen til klonene BS5, BS9, BS13 og BSXIII er identiske med klon BS8. Klonene BS3 og BS12 viser, som allerede angitt, i forhold til klonet BS8, en forskjell i aminosyre 29 (CAG i stedet for AAG hhv. Gin i stedet for Lys, formelene Ib, Illb og IVb). Forøvrig består 100 % homologi med klone BS8 frem til basen 573 av det i fig. 1 viste EcoRI-fragment (... TA*A ACC ACG ATC GTT ATG CTG573) . Fra denne basen er begge klonene BS3 og BS12 identiske med de i formel VIII angitte 5'-ut (ikke-translaterte)-områder. Videre ble flere cDNA-kloner fra cDNA-genebank (placenta) isolert over Xgtll. Fremstillingen av denne cDNA-genebanken fant sted på samme måte som fremstillingen beskrevet i eksemplene av cDNA-genebanken fra placenta-DNA i XgtlO. Et av disse klonene isolert fra Xgtll, klon 4, ble likeledes som beskrevet, subklonet i Bluescribe M13+. Sekvensbestemmelsen skjedde gjentatt priming med de syntetiske 17mer oligonukleo-tidene ;Klon 4 er frem til aminosyre 29 (AAG hhv. Lys) og en ;...TCTA ...-sekvens identisk på 3'-enden i tilslutning til multikloningssete med klonene BS3 og BS12 fra XgtlO. Selvom den analyserte DNA-sekvensen av de gjenværende 61 baser av 5'-enden (foran formel Ia, klon BS8, tilsvarende kodonene +1 til +21 tilsvarende Lys til Glu) har noen baseforandringer i forhold til den avledede DNA-sekvens (formel II, som inne- ;holdes av formel Illb), gir translasjonen av dette DNA-avsnittet ingen forskjeller i forhold til Barra et al., 1984. En leder-sekvens foran ATG'et kunne likeledes analyseres. Formelen IX viser den funnende sekvens for klonet 4. ;* Andre gjennomsekvensbestemte kloner viser på posisjon -9 alanin (GCT)

Andre kloner har forskjellige lange 5' ut-områder.

DNA-sekvensen ifølge oppfinnelsen kan innbygges i forskjellige ekspresjonsvektorer og eksprimeres ved hjelp av de beskrevne kontrollelementer, fortrinnsvis i pES103 med ADHI-promotoren (DSM 4013). Derved får man pES103, som innsettes i pUC18-derivat pES102, som inneholder en Xho-linker i HincII-skjæringsstedet, det 1500 bp lange BamHI/Xhol-fragment av ADHI-promotoren (f.eks. Ammerer, G., Methods in Enzymology 101. 192-201, 1983).

I stedet for denne ADHI-promotor-sekvensen på opprinnelig 1500 bp kan også en ADHI-promotor forkortet til ca. 4 00 bp lengde anvendes som BamHI/Xhol-framgent. Den forkortede ADHI-promotor (ADHIk) får man ved at plasmidet pWS323E (DSM 4016) spaltes med BamHI/XhoI og ADHIk-promotoren isoleres.

For riktig avslutning ligeres en egnet avslutningssekvens, hensiktsmessig en ADH-terminator, fortrinnsvis ADHII-terminatoren bak hMn-SOD. ADHII-terminatoren (BEier, D.R., Young, E.T., Nature 300. 724-728, 1982) kan oppnås gjennom en Sphl-spaltning av pMW5-ADHII (Washington Research Fundation) som 1530 bp langt fragment og etterfølgende HincII-spaltning som endelig ADHII-terminator (329 bp), eller fra plasmidet pGD2 (DSM 4014) som 336 bp langt HindIII/XbaI-fragment.

For ekspresjon i gjær står forskjellige gjærvektorer til rådighet, som ekspresjonskassettene med hMn-SOD-genet ifølge oppfinnelsen kan innbygges i, fortrinnsvis YEpl3 (Broach, J.R. et al., Gene 8, 121 - 133, 1979; ATCC 37115), pJDB 207 (DSM 3181, deponert 28.12.1984), YIp5 (Struhl, K. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 1035 - 1039, 1979; ATCC 37061), pEASl02 kan fremstilles ved at YIp5 spaltes delvis med Pstl og fullstendig med BamHI, og det URA3-genholdige, isolerte 4,3 kb fragment ligeres med 4,4 kb BamHI/Pstl-fragmentet fra pJDB2 07).

Med disse gjærvektorer som inneholder en ekspresjonskassett med hMn-SOD-genet ifølge oppfinnelsen, kan egnede gjærceller transformeres etter kjente metoder. Som egnede gjærceller for ekspresjonen kan fortrinnsvis alle de anses som er defisiente for sine egne, gjærspesifikke hMn-SOD, og som inneholder et selekterbart gjærgen, så som f.eks. HIS3, URA3, LEU3, SUP for bare å nevne noen. Slike mutanter, de f.eks. gjennom in vitro eller in vivo konstruerte muterte gener og inneholder disse gjennom en "transplacement", er oppnåelige gjennom integrativ transformasjon (f.eks. Winston, F. et al., Methods in Enzymology 101. 211-228, 1983). hMn-SOD fra gjær som skal muteres inneholdes f.eks. i plasmidet pL4l som BamHI-fragment (van Loon et al., Gene 26, 261-272, 1983). Da den fullstendige sekvensen til dette BamHI-fragmentet er kjent (Marres, C.A.M. et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161, 1985) er hMn-SOD-genet av gjær også tilgjengelig uten pL41.

hMn-SOD som er produsert gjennom slike transformanter, kan oppnås etter kjente metoder for proteinisolering og protein-rensing. Celleoppslutningen kan foretas f.eks. ifølge van Loon et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83., 3820-3824, 1986).

Påvisningen av det eksprimerte hMn-SOD-genet kan også oppnås gjennom markering av proteinene i maksiceller. Plasmidkodede proteiner kan markeres selektivt in vivo ved anvendelse av maksicelleteknikken (Sancar, A. et al., J. Bacteriol, 137. 692-693, 1979). E.coli stammen CSR603 (CGSC 5830) har ingen DNA-reparasjons-mekanisme. Med en egnet UV-stråledose øde-legges det bakterielle kromosomet, men noen av de vesentlig kortere plasmid-DNA'er som er tilstede i flere kopier pr. celle, forblir derimot funksjonelle. Etter at alle ikke-skadede celler som formerer seg er drept med antibiotikumet D-Cycloserin og det endogene mRNA er oppbrukt, transkriberes og translateres i de gjenværende celler bare fortsatt plasmidkodede gener. De dannede proteiner kan merkes radioaktivt ved innbygging av <35>S-methionin og påvises. E.coli CSR603 transformeres etter vanlig metoder med ekspresjonsplasmidene og selekteres på ampicillin-holdige agarplater etter transformerte bakterier. Prepareringen av maksicellene og merkingen av proteinene foretas etter skriften til A. Sancar (1979, s.o.). Som molekylvektsstandard anvendes en "c-metylert proteinblanding (Amersham). Som kontroll anvendes plasmidet som bare inneholder promotoren uten hMn-SOD-genet.

Etter avsluttet transformasjon av verten, ekspresjon av genet og fermentering eller celledyrking under betingelser ved hvilke proteinene kan eksprimeres ifølge oppfinnelsen, kan produktet normalt eksprimeres gjennom kjente kromatografiske separasjonsmetoder for således å oppnå et materiale som inneholder proteinene med eller uten leder og tailing-sekvenser. hMn-SOD fremstilt ifølge oppfinnelsen kan eksprimeres med en leder-sekvens på N-enden, som kan fjernes fra noen vertsceller som allerede beskrevet. Hvis ikke, er en avspaltning av leder-polypeptidet som allerede beskrevet (hvis det foreligger) nødvendig for å oppnå et ferdig hMn-SOD. Alternativt kan sekvensen modifiseres slik at det ferdige enzym produseres direkte i mikroorganismen. For dette tilfelle kan forstadie-sekvensen til gjær-mating-feromonet MF-alfa-1 anvendes for å få en korrekt "modning" av det fusjonerte proteinet og utskillelse av produktene i vekstmediet eller det periplas-miske rom. "Oppsnittingen" av hMn-SOD i gjærmitokondrier kan finne sted idet leder sekvensen for gjær-hMn-SOD-genet stilles direkte foran hMn-SOD-genet.

Egnede ledersekvenser, f.eks. de som er beskrevet av Marres C.A.M., et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161 (1985) eller derivater derav, kan enten være av naturlig opprinnelse eller isoleres fra de tilsvarende eukaryotiske celler (f.eks. S. cerevisiae) eller fremstilles syntetisk. For eksempel kan en gjærspesifikk DNA-forsekvens, som er nødvendig for innføringen av hMn-SOD i gjærmitokondriet, oppnås ved ligering av enkelt-vise syntetiske oligonukleotider. Ifølge oppfinnelsen kan den fullstendige forsekvens mellom startkodonet ATG og det første kodon for den første aminosyre i det ferdige hMn-SOD (Lys, hhv. AAG) eller enhver del av en N-terminal ende derav, innføres f.eks. i formelene II, Illa, Illb, Via, Vila, Vllb, VIII eller XI. Likeledes kan en slik forsekvens innbygges direkte ATG-startkodonet og direkte foran det første kodonet til en i forhold til den genuine DNA-sekvens av hMn-SOD mutert gjennom sekvensforandringer og for et DNA som koder for protein med hMn-SOD-aktivitet innbygges.

En ledersekvens som kan anvendes for innføringen av et hMn-SOD i gjær-mitokondrium, viser etterfølgende formel X, hvori den kjente sekvens GCA GCT (Marres, C.A.M. et al., 1985, s.o.) til GCT GCA ble utbyttet (begge tripletter koder for alanin) og et PvuII-gjenkjenningssted fremskaffet.

Fortrinnsvis kan leder-sekvensen, f.eks. med formel X, foreligge i Xhol/Xbal fragmentet med formel Via. Dermed oppnås at denne 128 bp linker forbindes med lederen gjennom Xhol- og Xbal-setene slik med det resterende hMn-SOD-gen at ledersekvensen ligger direkte etter starten ATG og direkte foran den første aminosyren (lysin) av hMn-SOD (formel XI).

Rensingen av hMn-SOD fra celler kan skje etter kjente fremgangsmåter.

hMn-SOD fremstilt geneteknisk ifølge oppfinnelsen er på grunn av det biologisk-enzymatiske virkningsspekteret på den ene side og på grunn av den nå tilgjengelige mengde meget rent enzym med høyest mulig immunologisk definitet i forhold til det genuine hMn-SOD på den annen side egnet for enhver type forebygning, behandling og/eller diagnostikk på området betennelses-, degenerative, neoplastiske eller reumatiske sykdommer for sårheling, ved autoimmunsykdommer og ved transplantasjoner - hhv. for forebygning og terapi av sykdommer som henger sammen med en defisiens i hMn-SOD eller kan være kausalt forbundet dermed. Eksempler omfatter de kliniske anvendelsesmuligheter, slik som dem som fremgår fra Bannister W.H. og Bannister J.V. (Biological and Clinical Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase, Vol. 11B, Elsevier/North-Holland, 1980) og fra Michelson, A.M., McCord, J.M., Fridovich (Superoxide and Superoxiddismutases, Academic Press, 1977). Videre kommer følgende kliniske anvendelsesmuligheter i betraktning: Ved perfusjonssår, slaganfall, alkoholskadet lever, for tidlig fødsel, evt. pankreatitis, akutte ånde-dretts-sykdommer (ARDs), emfysem, dialyseskadede nyrer, osteoartritt, reumatisk artritt, stråleinduserte skader, sikkelcelleanemi.

Likeledes er hMn-SOD fremstilt ifølge oppfinnelsen egnet for å øke holdbarheten til faste eller flytende næringsmidler.

hMn-SOD fremstilt ifølge oppfinnelsen kan enten gi systemisk eller topisk, hvorunder de parenterale aplikasjonsveier (f.eks. i.v., i.m. s.c, i.a.) er egnet i det første tilfelle og i det andre tilfelle de tilsvarende kjente administrerings-former (f.eks. pasta, salve, geler, suge- eller tygge-tabletter, pulvere og andre galeniske formuleringer som muliggjør resorpsjon av hMn-SOD-preparatet og farmasøytiske akseptable bærerstoffer).

Som terapeutisk virksomt doseringsområde kan man, avhengig av individuelle kriterier (f.eks. pasienter, sykdomsgrad osv.) anvende ca. 4 mg daglig.

Forklaring på figurene:

Fig. 1:EcoRi-fragment fra klon BS8 med det 532 bp lange kodende området fra aminosyre 22 av det fullstendige hMn-SOD, det 51 bp 3' ut-området og sekvensandelene av linkeren. De potensielle N-glykosyleringssetene (overstreket), de enkelte Thal-seter og BamHI-setene (understreket) er angitt. Fig. 2:Skjematisk strategi for konstrusjon av plasmid HS0D4,

som inneholder den syntetiske 5'-enden av hMn-SOD-genet som XhoI/NcoI-fragment.

Fig. 3:Restriksjonskart av plasmidene HSOD2 og HS0D3, samt av

plasmidet HS0D4 som er konstruert derut av.

Fig. 4:Konstruksjon av et plasmid (HS0D6) med det fullstendige

cDNA for hMn-SOD som Xhol/EcoRI-fragment.

Fig. 5:Fremstilling av Thal/EcoRI-fragmenter av hMn-SOD cDNA

fra klon BS8.

Fig. 6:Konstruksjon av plasmidet pl54/2, som inneholder

ADHI-promotoren som 1500 bp BamHI/Xhol-fragment.

Fig. 7:Konstruksjon av plasmid pl50/2 med de nødvendige enheter ADHI-promotor og ADHII-terminator (336 bp XbaI/HindIII-fragment) for ekspresjon av hMn-SOD. Fig. 8:Komplettering av de endelige plasmider (pKHl og pKH2) med ADHI-promotoren hhv. ADHIk-promotoren og ADHII-terminatoren for videre innsetning av hMn-SOD cDNA gjennom XhoI/EcoRI-setet. Plasmidet pKH2 tilsvarer pKHl, bortsett fra at pKH2 inneholder ADHIk-promotoren istedet for ADHI-promotoren. Fig. 9:Konstruksjon av ekspresjonskassetten HS0D7 med den forkortede ca. 4 00 bp lange ADHI-promotor (ADHIk). Konstruksjonen med ADHI-promotoren med den opprinnelige lengde skjer ut fra pKHl på analog måte. Fig. 10: Konstruksjon av plasmider med URA3-genet som ligger innenfor gjær hMn-SOD-genet som markør i forskjellige orienteringer for hMn-SOD-genet (S0DY7, S0DY8), for fremstilling av en egnet gjær hMn-SOD-mutant for ekspresjonen. Gen-transplasseringen i tilsvarende gjær-stamme (DBY747) ble utført med SODY7 og SODY8. Fig. 11:Gelelektroforetisk påvisning av ekspresjon av hMn-SOD gjennom plasmidene pWS490A og pWS491A i gjærstammen WS30-5g. Bane 1: WS3 0-5g/pWS490Al, Bane 2: WS30-5g/ PWS490A2, Bane 3: WS30-5g/pWS49lAl, Bane 4: WS30-5g/ pWS491A2, Bane 5: WS21-1(SODI), inneholder gjær-MnSOD, Bane 5: WS20-5g, Bane 7 til 10: hMn-SOD fra lever (0,3 fig bane 8, 1,2 ug bane 9, 3,0 /xg bane 10). Med sifrene 1 hhv. 2 bak plasmidbetegnelsene menes forskjellige transformanter med de samme plasmider. Fig. 12: Analyse av hMn-SOD-aktiviteten i gjærekstrakter som inneholder ekspresjonsplasmidene pE024-AB, pE025-AC hhv. pEO 26-AC gjennom separering av proteinene i polyakrylamidgel og etterfølgende aktivitetsfarging med o-dianisidin etter kjent metode: a=WS30-5g, b=WS30-5g/pEO24-AB, c=WS30-5g/pE025-AC, d=WS3 0-5g/pEO26-AD, e=markør (0,15 /xg human-lever MnSOD).

Fig. 13:Analyse av aktiviteten til rekombinant humant MnSOD

i mitokondriene hhv. i cytoplasma fra 6 forskjellige gjærtransformanter gjennom gelelektroforetisk separa-sjon av proteinet og etterfølgende aktivitetsfarging med o-dianisidin etter kjent metode (CP-Extr. = cytoplasma ekstrakt, MC-Extr. = mitokondrier ekstrakt):

a=markør, 0,15 ug human lever MnSOD

o= markør, 0,075 ug human lever MnSOD

Fig. 14:Elueringsdiagram (eksempel 15, trinn 5) av kromatografi av hMn-SOD fremstilt ifølge oppfinnelsen etter (NHJ 2SOA-f elling (eksempel 15, trinn 4) med en Mono S kationbyttersøyle (Pharmacia). Fig. 15: SDS-polyakrylamidgel (15 %, sølvfarging) av hMn-SOD-prober etter forskjellige rensetrinn.

1= 4ul markør (LMW-Pharmacia) 1:50

2= 10ug råekstrakt

3= 10ug etter ammoniumsulfatfelling

4= 9ug etter kromatografi på Mono S

5= 2,5ug etter kromatografi

6= 5ug på hydroksylapatit

De følgende eksempler som skal anskueliggjøre oppfinnelsen i detalj, men ikke begrense den.

Anvendte materialer:

Når det i de følgende eksempler ikke er angitt noe spesielt, ble de følgende materialer, løsninger, plasmider, vektorer og mikroorganismer benyttet: ADHI-promotor: DSM 4013 (pES103), deponert (I500bp

BamHI/XhoI 27.2.87

ADHI-promotor, forkortet: DSM 4 016

(pWS323E), deponert (400bp BamHI/XhoI)" 27.2.87 ADHII-terminator: DSM 4014 (pGD2), deponert

(336 bp Xbal/Hindlll) 27.2.87

BamHI-buffer: 150mM NaCl, 6mM tris-HCl pH 7,9, 6mM MgCl2,

lOOug/ml BSA

Core-buffer: 50mM tris-HCl pH 8,0, lOmM MgCl2,

50 mM NaCl

Eksempel 1. Konstruksjon av en cDNA- qenbank

Fra en fersk menneske-placenta ble terningstore vevsstykker sjokkfrosset i flytende nitrogen og vevet pulverisert ved under -80°C. ' Fra det pulveriserte vevsmateriale ble deretter RNA ekstrahert etter forskriften som er beskrevet av Chirgwin, J.M. et al (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry 18., 5294-5299, 1979).

Fra det derav erholdte RNA ble poly(A)<+>RNA preparert ifølge

Aviv, H. og Leder, P. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69, 1409 - 1412, 1972). Syntesen av cDNA ble utført med "cDNA synthesis system" (Amersham RPN 1256). Pakkingen skjedde med Gigapack (Vektor cloning systems). Alle videre metodiske trinn for kloning i EcoRI-setet av XgtlO ble utført etter forskriften til Huynh T.V. et al., (DNA Cloning Vol 1, D.M. Glover ed., IRL Press, Chapter 2, 1985), untatt at E.coli C 600 ble anvendt som "plating bacteria". Styrken til XgtlO-fagene som representerer cDNA-genbanken var 1,2xl0<10>pfu/ml, tallet på uavhengige kloner lxlO<6>.

Eksempel 2. Forøkninq av XqtlO- qenbanken

En egnet E.coli vertsstamme (C600, Genotype F-, supE44, thil, thrl, leuB6 lacYl tonA21 lambda- (M.A. Hoyt et al., 1982, Cell 31, 5656) ble fordyrket natten over i LB-medium tilsatt 0,2 % maltose ved 37°C.

Deretter ble kulturen sentrifugert ved 3000 opm og oppslemmet i iskald 10 mM MgSOA-løsning, slik at OD600nm var 4,0. De således fremstilte Mg-celler ble lagret ved 4°C og kunne anvendes en uke.

12x200 ul Mg-celler ble blandet i sterile rør med en fas-suspensjon (hver 50.000 pfu av cDNA-genbank/plate) og inkubert 20 minutter ved 37°C.

Deretter pippetertes til hvert rør 6 - 7 ml smeltet topp-agarose temperert til 42°C (inneholder 10 mM MgSG\, sluttkonsentrasjon), blandet og heldt ut på 12 LB-agarplater (13 cm tverrsnitt) forvarmet ved 37°C med 10 mM MgSOA og inkubert 6-12 timer ved 37°C.

Eksempel 3. Primærundersøkelse for identifikasjon av rekombinante X- fager

a. Preparering av nitrocellulosefilter

De således fremstilte plater ble etter avsluttet inkubasjon avkjølt til 4°C. Nitrocellulose-filtre nummerert med blyant ble lagt på plateoverflaten og posisjonene på platene markert med nålestikk. Ca. 1 min. etter at de var fullstendig gjennomfuktet ble filtrene igjen forsiktig trukket av, lagt i denatureringsløsning og inkubert 1 min. ved romtemperatur (RT). Så skjedde nøytraliseringen i nøytraliseringsløsning i 5 min ved RT og en inkubasjon i 30 sek. i 2xSSPE likeledes ved

RT.

Opptil 3 ytterligere avtrykk ble foretatt fra hver plate, hvorunder filtrene hver gang fikk ligge 30 sek. lenger på platen. Nålestikkenes posisjoner ble nøyaktig overført til de følgende filtrene.

Filtrene ble tørket på filterpapir liggende mot luft, og DNA'et fiksert etter to timers varming ved 80°C. Platene oppbevarte man inntil resultatet av den etterfølgende hybridisering.

b. Preparering av <32>P-markerte DNA-prober.

De syntetiske oligonukleotidblandinger ble fremstilt på 381A DNA-syntetisator (Applied Biosystems), renset ved polyakryl-amidgelelektroforese (20 % i 8 M urea, T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, pl73ff), og avsaltet gjennom Sephadex G50 (Pharmacia). De derved syntetiserte DNA-prober er komplementære med RNA-basesekvenser som a) koder for aminosyrene 39-46 hhv. b) 200-207 (D. Barra et al., Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 3 36-339, 1983) og har følgende basesekvenser:

hvorunder A, G, C og T står for de tilsvarende nukleotider, I for inosin.

De kjemiske syntetiserte DNA-probeblandinger ble oppløst hver i en konsentrasjon på 20 pM/ul i vann.

Reaksj onssats:

20-100 pM gamma<32->PATP (>3000Ci/mmol. Amersham) , frysetørket fra etanolisk løsning, 20-100 pmol oligonukleotid, 1 ul lOxkinasebuffer (0,7 M tris-HCl pH 7,6, 0,1 m MgCl2, 50 mM dithiothreit, 10 enheter T4 polynukleotidkinase (BRL), vann ad 10 ul.

Reaksjonen fant sted ved 3 7°C i 60 minutter og ble stoppet ved tilsetning av 25 mM EDTA. Ikke innbygget radioaktivitet fjernet vann ved eksklusjonskromatografi gjennom 1 ml biogel P6-DG (Biorad) søyle, fremstilt i en 1 ml enveissprøyte. Som elueringsmiddel anvendtes TE-buffer.

c. In situ hybridisering

For å fjerne rester av agarose og bakterier fra nitro-cellulosen, som fører til sterk bakgrunnstråling med hybridiseringen, ble filteret inkubert i et ikke for lite volum for-vaskløsning i noen timer, og deretter rystet natten over ved 65°C. For å avmette uspesifikke bindingsseter for DNA på nitrocellulose-filtrene, ble disse inkubert 1 til 12 timer ved 37°C i forhybridiseringsløsning som var avgasset forut i våkum.

De radioaktivt markerte DNA'er (ca. 1 x 10<9> cpm//xg) som ble anvendt for hybridisering, ble satt til den nødvendige mengde av hybridiseringsløsning avgasset og forvarmet til 37°C.

For å holde konsentrasjonen av den enkelte DNA-probe i hybridiseringsløsningen høyest mulig, ble det bare anvendt så meget hybridiseringsløsning at filteret akkurat var dekket av væske. Hybridiseringen fant sted 12 - 18 timer ved 3 7°C.

Nitrocellulosefiltrene ble deretter spylt tilsvarende fremgangsmåten til Wood et al., (Proe. Nati. Acad. Sei. Vol 82, 1585-1588, 1985) 3 ganger i 6xSSC og 0,05 % SDS (4°C) og 2x30 min likeledes vasket ved 4°C. Deretter ble filtrene spylt i en frisk fremstilt løsning som inneholder 3 M tetrametyl-ammoniumklorid (Me4NCl), 50 mM tris-HCl pH8, 2 mM EDTA og 0,05 % SDS, 3 ganger ved romtemperatur (RT), vasket 2 x 30 min (RT) og til slutt vasket 3 x 30 min ved 49°C (oligonukleotidblanding

a)) hhv. ved 52°C (oligonukleotidblanding b)), tørket mot luft (oligonukleotidblanding b) og klebet på papir. Røntgenfilmer

ble eksponert 2-8 dager ved -70°C under anvendelse av en "intensiverings-sikt".

Eksempel 4. Plaque- rensinq

Da ingen enkelte plaquer kunne isoleres ved den høye anvendte densitet av plaquer i første leteoperasjon, ble de rekombinante lambda-fager renset ved flere påfølgende lete-operasjoner ved samtidig redusert plaque-tetthet. Etter utvikling av autoradiogrammene ble områder isolert fra platene, (fra tre utførte primærundersøkelser var av 28 områder 2, av 35 områder 1 og av 15 områder 5 positive), som på begge i duplikat hybridiserte nitrocellulosefiltre ga et positivt hybridiserings-signal. Dertil ble det ønskede sted stukket ut fra agaren med den trange enden av en steril Pasteurpipette og overprøvet i 0,3 - 0,6 ml lambda-buffer (100 mM tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 og ImM EDTA). Det kan imidlertid også tas SM-buffer (Maniatis T., Molecular-Cloning, 1982, S. 70). Etter tilsetning av en dråpe kloroform lot man fagene diffundere ut fra agaren natten over ved 4°C og pletterte hver enkelt fagsuspensjon på nytt ut i flere fortynninger. Fra plater som hadde 300 - 1000 plaquer ble det på nytt laget et nitrocellulosefilteravtrykk, og igjen hybridisert mot begge DNA-probene. Denne operasjonen ble gjentatt, hvorunder enkeltplaquer ble viderefulgt inntil alle plaquer av en plate ga et positivt hybridiseringssignal.

Eksempel 5. Analyse av de oppnådde faqkloner

a. Titrering av X-fager.

Fagsuspensjonene ble fortynnet i fortynningstrinn på 1:10 med lambda-buffer, blandet ved flere gangers omdreining og utplettert. Etter inkubasjon ved 37°C kunne plaquene som var dannet på bakterieteppet telles og styrken (plaque forming units (pfu)) bestemmes. Styrken var for de rensede fagsuspen-sjoner 2,2-8,6 x 1010 pfu/ml.

b. Preparering av lambdafag-DNA

Etter isolering og titrering av de i seg selv homogene fagkloner ble disse plettert i en tetthet på 2 x 10<6> pfu/ 13,5 cm petriskål (med dyrkningsmediet med sammensetning: 1,5 % agarose, 10 g/l trypton, 5 g/l gjærekstrakt, 5 g/l NaCl, 10 mM MgS04 og 0,2 % glukose med 200 ul C600 Mg-celler (4 OD600) , inkubert 5 timer ved 37°C, deretter avkjølt til 4°C. Eluer-ingen av fagene fant sted ved overskikting av platene med 8 ml lambda-buffer hver og noen dråper kloroform og lett rysting ved 4°C natten over. Supernatanten som var renset ved sentrifugering (15.000 opm, 15 min, 4°C) ble til slutt tatt vekk og fagene sammenklumpet ved sentrifugering ved 50.000 opm (Beckman Ti50 Rotor) i 30 min. med RT. Etter tilsetning av 500 /il lambdabuffer hver og inkubering med ribonuklease A (RNase A,10 ug/ml) og desoksiribonuklease (DNase, 1 ug/ml), 30 min ved 37°C, ble saltkonsentrasjonene øket ved tilsetning av 25 /il 0,5 M EDTA, 12 /il 1 M tris-HCl pH 8,0 og 6,5 /il 20 % SDS og de tilstedeværende enzymer inaktivert ved inkubering ved 70°C i 15 min. Etter en ekstraksjon med fenol og to ganger ekstraksjon med kloroform/isomylalkohol (24:1) til hver gang samme volumer, ble DNA utfelt ved tilsetning av 0,1 vol. 3 M natriumacetat pH 5,2 og 2 vol. alkohol, sentrifugert fra, vasket med 70 % alkohol, tørket og opptatt i 50 ul TE-buffer.

c. Restriksjonsanalyse

Hver 2 /il DNA-løsning ble inkuberty med 5 enheter EcoRI i HIGH-buffer i 2 timer ved 37°C, de oppnådde fragmenter separert på en 1 % agarosegel (T. Maniatis et al., 1982, pl49ff) under en spenning på fra 1-5 volt/cm, fragmentene med lengder mellom 500 og 1000 basepar eluseres fra gelen (G.M. Dretzen et al., Anal. Biochem. 112, 295-298, 1981) og underkastes til slutt en sekvensanalyse.

d. Sekvensanalyse

Subkloningen av restriksjonsfragmentene i en egnet vektor (Bluescribe M13+ hhv. M13-, Vektor Cloning Systems (C. Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119, 1985)) for sekvensbestemmelsen ifølge Sanger (F. Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 74, 5463-5467, 1977; F. Sanger et al. FEBS-Letters 87, 107-111, 1978) ble utført etter de vanlige metoder for gjennomføring av restriksjon og ligering av DNA-fragmenter og transformasjon av E.coli vertsceller (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, pl04, I46ff, 396; DNA-Cloning, IRL-Press 1985, Vol. 1, kapittel 6). Således ble' 100 ng isolerte EcoRI-cDNA-fragmenter innsatt gjennom EcoRI-setene i den tilsvarende forberedte dsDNA-form (replikativ form, 50 ng) av vektoren (gjennom inkubering i 10 /ul ligeringsløsning på 2-12 timer ved 14°C) og transformert med denne rekombinerte konstruksjonen (med betegnelsene BS3, BS5, BS8, BS9, BS12, BS13, BSXIII) i kompetente E.coli (stamme JM 101) celler.

Enkeltkjedet-DNA av de rekombinante fager ble isolert og sekvensbestemt etter Sanger. De avleste sekvenser ble bearbeidet ved hjelp av egnede computer-programmer (R. Staden, Nucl. Acid. Res. 10, 4731-4751, 1988).

Det isolerte klon 8 (BS8) inneholder den kodende sekvens fra aminosyre 2 2 av det fullstendige enzym (fig. 1).

Eksempel 6. Konstruksjon av en ekspresionskassett

For ekspresjon av hMn-SOD i gjær er komplettering av de isolerte cDNA samt konstruksjon av en ekspresjonskassett nødvendig, hvorunder ADHI-promotoren kommer til anvendelse i sin opprinnelige lengde (ca. 1500 bp, Methods in Enzymology, Vol. 101, Part C, 192-201, 1983) den samme i forkortet form (ADHIK ca. 400 bp) og ADHII-terminatoren (Dr. R. Beier og E.T. Young, Nature 300, 724-728, 1982).

a. Komplettering av genet.

Da baseantallet som tilsvarer de 21 aminosyrer (AS) mangler i det isolerte cDAN-klon 8 på N-enden, konstruertes for komplettering av genet tilsvarende den korrigerte aminosyresekvens (D. Barra et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984) under hensyntagen til gjær-kodon-utvalget (P.M. Sharp et al., Nucl. Acids. Res. 14, 5125-5143, 1986) 2 nukleotidpar som XhoI-Xbal-fragment (OPI, tilsv, formel Via) hhv. Xbal-Ncol-fragment (0P2 tilsv, formel VIb) og syntetisertes 381A DNA-Synthesizer, Applied Biosystems). OPI ble gjennom Xhol/Xbal innsatt i plasmid V 17 (oppstått fra pUC18 (J. Vieira og J. Messing, Gene 19, 259, 1982) etter HincII restriksjon og innsetting av Xhol-linkere (New England Biolabs, d(CCTCGAGG) og Smal-restriksjon av det dannede plasmid pES102 med etter-følgende innsetting av Ncol-linkere (New England Biolabs, d(CCCATGGG)) (Fig. 2), 0P2 gjennom Xbal/Ncol: Dertil ble hver 4 /ug V 17-DNA spaltet med 10 enheter Xbal og Ncol hhv. Xhol og Xbal i 40 /il CORE-buffer i 2 timer ved 37°C og renset gjennom gelelektroforese (0,7 % agarose, s.o.). 5 ul av de syntetiserte enkeltkjeder av OPI, hhv. av OP2 (hver enkelt 10 pM/ul) ble blandet, inkubert 10 min. ved 65°C og langsomt avkjølt til romtemperatur. Hver gang 1/10 derav ble ligert med hver gang 50 ng dobbeltkappet vektor (Xhol/Xbal for OPI og Xbal/Ncol for OP2) under ovenfor beskrevne betingelser (plasmider HSOD2 og HS0D3, fig. 2). Til slutt ble HS0D2 og HS0D3 gjennom Scal/Xbal (altså etter dobbeltspaltning med Seal og Xbal i CORE-buffer i 2 timer ved 37°C) etter rensing og isolering av de kappede vektorer ved gelelektroforese og ligering under ovenfor beskrevne betingelser (kloning av oligoparene OPI og OP2) kombinert med plasmid HS0D4 (fig. 2, 3), dette forberedt ved Ncol-restriksjon, etterfølgende Klenow-innfylling og EcoRI-restriksjon for opptak av Thal/EcoRI-cDNA-fragmentet: 5 /ug DNA ble inkubert i 50 ul High-buffer med 18 enheter Ncol ved 37°C i flere timer, det kappede DNA renset ved gel-elektrof orese, isolert og halvparten derav inkubert i 30 /il Klenow-reaksjonsløsning 1 time med RT.

Etter avslutning av reaksjonen ved tilsetning av 2 ul 0,5 M EDTA og inkubering av reaksjonsløsningen ved 70°C (10 min.) ble DNA'et renset med gelelektroforese, isolert og etterkappet med 7,5 enheter EcoRI i 20 ul HIGH-buffer, renset igjen og isolert (fig. 5).

Thal/EcoRI-cDNA-fragmentet ble preparert som følger:

Med plasmidet BS8, som inneholder det isolerte cDNA-klon8 (s.o.), ble kompetente E.coli (stamme JM 101) vertsceller transformert, og plasmidet preparert under egnede betingelser (T. Maniatis et al., 1982, p368).

Etter restriksjon med Thai (10 ug plasmid ble spaltet i 40 ul Thal-buffer med 25 enheter Thai 8 timer ved 60°C) , etterkappet av 759 bp Thai fragmentet med EcoRI (s.o.), med hver gang påfølgende gelelektroforetisk rensing og isolering av det tilsvarende fragment, ble det således oppnådde Thal/EcoRI-fragment (fig. 4) kombinert med det tilsvarende forberedte plasmid HS0D4 (ca. 100 ng fragment ble ligert med 50 ng kappet vektor i 10 /il ligeringsløsning (s.o.)) til HS0D6 (fig. 5). Plasmidet HS0D6 inneholder dermed det fullstendige c-DNA for hMn-SOD innbefattet Met. Leserammen forblir derunder opprett-holdt.

b. Konstruksjon av ekspresjonskassetten

Plasmid HS0D6 ble dobbeltspaltet med Xhol og EcoRI (hver 5 enheter/ug DNA) i CORE-buffer, Xhol-fragmentet (gen) isolert og innsatt i plasmidet PKHl hhv. PKH2 gjennom XhoI/EcoRI. Plasmidene PKHl hhv. PKH2 ble preparert som følger (fig. 6, 7, 8): I plasmidet PES 103, som inneholder ADHI-promotoren som 1500 bp BamHI-Xhol-fragment i PES 102 (PES 102 er et pUC18 derivat, som i HincII-skjæringsstedet inneholder en Xhol-linker, konstruksjonen av BamHI-Xhol-fragmentet er beskrevet i Methods in Enzymology 101, 192-201, ble etter Smal-restriksjon (lug plasmid ble spaltet med 5 enheter Smal i Smal-buffer i 2 timer ved 37°C) , rensing og isolering Bglll-linker innsatt (T. Maniatis et al., 1982, p 396). Det derved dannede plasmid (P154/1, fig. 6) ble etter EcoRI-restriksjon (s.o.), Klenow-oppfylling (s.o.) og religering (1 ug DNA ble inkubert natten over i 40 /il ligeringsløsning (s.o.) ved 14°C.) forandret til plasmid 154/2 (fig. 6.).

Likeledes ut fra plasmid pES103 ble etter dobbeltspaltning med Xhol og Hindlll i CORE-buffer linker- Xhol.EcoRI.-Xbal.Hindlll-(fig. 7, syntetisert på 381A DNA-syntetisator) insatt. Denne linkeren inneholder sekvensen

TCGAGGAATTCTCTAGAA

CCTTAAGAGATCTTTCGA

I det således erholdte plasmid 150/1 ble gjennom Xbal/Hindlll (dobbelt spaltning i CORE-buffer) ADHII-terminatoren innsatt (plasmid 150/2 (fig. 7)). ADHII-terminatoren fremstiltes som følger: Plasmid pMW5 ADHII (Washington Research Fundation) ble spaltet med Hindlll (Core-buffer), deretter med SphI (i Sphl-buffer) og det isolerte 605 bp fragment klonet i vektoren V18 og i HincII-skjæringsstedet ble det innbygget en Xbal-linker (Biolabs, CTCTAGAG) (ligering s.o.)' Et 335 bp langt Xbal/SphI-fragment ble innligert i pUCl8 (Xbal/SphI) (pGD2).

Vektoren V18 fikk man ved at en Hindlll-linker ble innbygget i pUCl8 i Smal-setet og Hindlll-setet mangler på det opprinnelige sted, slik at multikloningssetet i V18 lyder EcoRI.Sstl.Kpnl.Hindlll.BamHI.Xbal.Sali.Pstl.SphI.

ADHII-terminatoren ble tilslutt isolert etter dobbelt spaltning med Xbal/Hindlll i CORE-bufer etter de vanlige metoder (s.o.). Plasmid 150/2 inneholder dermed bortsett fra genet som skal innsettes gjennom XhoI/EcoRI, de nødvendige enheter for en genekspresjon på ca. 1500 bp (promotor), 7 bp (Xhol-linker), 6 bp (EcoRI-linker), 7 bp (Xbal-linker), 329 bp (terminator). Disse enheter ble innsatt nå gjennom BamHI/Hindlll (dobbeltspaltning i CORE-buffer) i vektoren 154/2 (fig. 8). I den således erholdte plasmid PKHl (fig. 8) ble ADHI-promotoren erstattet på analog måte med den forkortede vektor ADHIk som BamHI/XhoI-fragment (412 bp)

(pKH2, fig. 9).

I begge plasmider ble tilslutt det utskårede fullstendige cDNA-gen (s.o.) fra HSOD6 innsatt gjennom XhoI/EcoRI. De derved oppnådde plasmider HSOD7/1 hhv. HSOD7/2 (fig. 9 viser bare HSOD7/2) adskiller seg fra hverandre bare ved de forskjellige promotorer ADHI og ADHIk (s.o.). De derved av-sluttede ekspresjonskassetter ble innsatt gjennom Bglll/Hindlll (etter dobbelt spaltning av plasmidene i CORE-buffer og isolering av de utskårede ekspresjonskassetter) i de tilsvarende forberedte og offentlig tilgjengelige gjærtrans-formasjons-vektorer YEpl3 (J.R. Borach et al., gene 8, 121-133, 1979, ATCC 37115), pJDB207 (DSM 3181, deponert 28.12.84), pEAS102 (s.o.), YIp5 (K. Struhl et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 7_6, 1035-1039, 1979, ATCC 37061) gjennom skjæringsstedene BamHI og Hindlll.

Eksempel 7. Fremstilling av en egnet gjær Mn- SOD- mutant for ekspresjonen.

Genet for gjær-Mn-SOD (A.P.G.M. van Loon et al., Gene 26, 261-272, 1983) sitter som BamHI-fragment i vektoren PL 41 (fig. 10) og sekvensen er fullstendig publisert (C.A.M. Marres et al. Eur. J. Biochem. 147, 153-161, 1985). Etter restriksjon med BamHI (2 fiq plasmid ble spaltet med 5 enheter i 150 mM NaCl, 6 mM tris-HCl pH 7,9, 6 mM MgCl2, 100 Mg/Ml storfe-serumalbumin i 2 timer ved 36°C) ble det 2 045 bp lange BamHI-fragment, som inneholder genet, som vanlig renset ved gel-elektrof orese og isolert og subklonet gjennom BamHI i vektoren VO (pUCl8, men uten Hindlll-spaltningssted).

Vektoren VO fikk man idet 1 ug pUC18 ble spaltet med Hindlll (CORE-buffer), det lineæriserte fragment isolert fra gelen ved kjente metoder, de overhengende ender utfyllt med 2 U Klenow-polymerase (ligasebuffer + 0,2 mM dNTP) og religert i 30 min. ved RT ved tilsetning av 2 U T4-DNA-ligase natten over ved 14°C.

Det dannede plasmid S0DY1 (fig. 10) ble renset gjennom Nrul-restriksjon (1 jug plasmid ble spaltet med 5 enheter Nrul i Nrul-buffer i 2 timer ved 36°C) ved gelelektroforese og forandret til SODY3 (fig. 10) ved innskudd av en Hindlll-linker (CAAGCTTG). Til slutt ble URA3-genet (erholdt fra pURA3) innsatt i Hindlll-spaltningsstedet: 4 ug SODY3 ble spaltet med 20 enheter Hindlll i 2 timer ved 37°C i CORE-buffer og defosforylert:

Til 40 /il spaltningssats ble 40 ul H20, 10 ul 1 mM EDTA,

5 jul IM tris-HCl pH 9,5, 1 jul 100 mM spermidin 1 m1 kalvetarm-alkalifosfatase (CIAP, 1 mg/ml H20) tilsatt og inkubert ved 36°C. Etter 15 min. ble igjen 1 m1 CIAP tilsatt og inkubert ytterligere i 15 minutter. Den defosforylerte vektoren ble likeledes renset ved agarosegel-elektroforese. 2 \ iq plasmid pURA3 ble spaltet med Hindlll (s.o.) og et 1,2 kb fragment, som inneholder gjærgenet URA3, ble likeledes isolert og innsatt i den forberedte vektor (s.o.).

De således dannede plasmider S0DY7 og SODY8 inneholder URA3-genet innenfor gjær-Mn-SOD-genet og adskiller seg i orienteringen av URA-genet i forhold til Mn-SOD-genet (fig. 10).

Orienteringen av URA3-genet i forhold til Mn-SOD-genet kan fastslås, da URA3-genet inneholder et asymetrisk Pstl-sete.

Med plasmidet S0DY7 og S0DY8 ble et "gene/transplasement"

(Methods in Enzymology 101, 202-211 og 211-228) utført i stammen DBY 747 (Genotyp a, leu2, his3, trpl, ura3, Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley). Stammen DBY 747 ble transformert med BamHI-fragmentet fra SODY7 og S0DY8 (J.D. Beggs, Nature 275, 104, 1978). Dertil ble 20 /zg S0DY7 hhv. S0DY8 spaltet med 50 U BamHI i 200 /il BamHI-buffer (150 mM NaCl, 6 mM tris-HCl pH 7,9, 6 mM MgCl2, 1 mM DTT) og hele spaltningsblandingen (uten å skille fra pUC-andelen) ekstrahert med fenol (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, 1982, s. 458f) og konsentrert gjennom etanolfelling (tilsetning av 20 /il 3 M natriumacetat pH 5,5, 500 /il etanol) . DNA'et ble opptatt i 10 /il vann og anvendt direkte for transformasjon av gjær.

Transformantene ble seleksjonert etter uracilprototrofi.

Enkelte transformanter ble dyrket natten over i 5 ml SC-URA-medium ved 28°C. Cellene ble høstet med sentrifugering, oppsluttet etter van Loon et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 3820-3824, 1986) og undersøkt etter sitt innhold av Mn-SOD. For gelelektroforetisk registrering av Mn-SOD på den ene siden og Cu/Zn-SOD på den andre siden, kom allerede eksisterende arbeidsforskrifter til anvendelse. (Ch. Beuchamp og I. Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276-287, 1971; H.P. Misra og I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys. 183. 511-515, 1977; B.J. Davis, Annals of the NY Academy of Sciences Vol. 121, 404-427, 1964). Best virket derunder separasjonen av proteinene med etterfølgende negativ farging med nitroblå tetrazolium (B.J. Davis, 1964; Ch. Beauchamp og I. Fridovich, 1971). En økning av ømfintligheten er mulig gjennom farging med dianisidin. (H. P. Misra og I. Fridovich, 1977). For videre karakterisering anvendtes en spektrofotometrisk måling (Hyland, K. et al., Anal. Biochem. 135, 280-287, 1983) med alkalisk dimetylsul-foksyd som 0"<2->dannende system og med cytokrom C som "oppfanger".

Undersøkelsen mellom Mn-SOD på den ene side og Cu/Zn-SOD på den annen side skjer ved tilsetning av KCN (s.o. og M. Ysebaert-Vanneste og W.H. Vanneste, Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980). Stammene SODY7/2, SODY/6, SODY7/8 og SODY7/10 inneholdt ingen Mn-SOD-aktivitet.

Eksempel 8. Fremstilling av ekspresjonsvektorene

Ekspresjonskassetten som er beskrevet under eksempel 6 ble skåret ut som BglII/HindIII-fragmenter fra plasmidene HS0D7/1 hhv. HSOD7/2 (hver gang 2 ug plasmid-DNA i CORE-buffer, 2 timer ved 37°C med 10 U enzym hver) . Likeledes ble 1 ug hver av YEpl3, pJDB207 og pEAS102 kappet med Hindlll-BamHI (spaltnings-betingelser som beskrevet ovenfor).

Hver 50 ug vektor-DNA og 200 ixg innskudd ble ligert i ligasebuffer (som beskrevet) med 1 U ligase natten over ved 14°C og anvendt for transformasjon av E.coli-stamme HB101. I den følgende tabell er betegnelsen for de tilsvarende plasmider oppført.

Tabell 1: Betegnelse på ekspresjonsvektorene.

Eksempel 9: Fremstilling av en egnet gjærstamme ( WS30- 5q) for transformasj on

Det ble fremstilt en gjærstamme som ved siden av de beskrevne genetiske markører for gjærstammen SODY7/2 i tillegg inneholder en mutasjon i en av de lysosomale hovedproteaser (som kan aktivere andre lysosomale proteaser gjennom sin aktivitet) , og dermed frigjør mindre proteaser ved oppbryting av gjærcellene. (Mutasjon pep4)(E.W. Jones et al., Genetics 102. 665-677, 1982).

For dette ble den Mn-SOD-manglende stamme SODY7/2 krysset med den proteasemanglende stamme WS20-25 (a, leu2 his3 trpl ura3 pep4) og de derav resulterende haploider undersøkt med hensyn til sin genetiske markør (F. Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y. 1972).

Den erholdte stamme WS30-5g (leu2 his3 trpl pep4 sodi) er meget godt transformerbar og oppfyller de ønskede betingelser.

Slike krysninger kan også utføres med andre godt kjente og tilgjengelige gjærstammer, f.eks. med 20 B-12 (Yeast Genetic Stock Center, Berkeley) med lignende gode resultater.

Eksempel 10. Giærtransformasion og ekspresjon i gjær

Gjærstammen SODY7/2 ble transformert med plasmidene pWS371A, pWS372A hhv. pWS373A (J.D. Beggs, Nature 275, 104-109, 1978) og transformantene undersøkt med hensyn til sin ekspresjon.

For dette ble en forkultur av transformantene fremstilt i SC-leu-væskemedium (analogt med det beskrevne SC-URA-medium, men inneholder i tillegg 2,4 g uracil, men uten leucin)

(rysting ved 300 opm, 28°C, natten over). Derav ble 100 ul inokulert i 4 ml YP5%D (1 % Bacto Yeast Extract, 2 % Bacto Pepton, 5 % glukose) og dyrket natten over (som forkulturen). Cellene ble høstet og oppsluttet som allerede beskrevet i eksempel 7. Aktivitetsdelen ble påført den mengde celleråsaft som tilsvarer 1 ml kultur. Aktivitetsforsøket ble utført som beskrevet under eksempel 7.

Gjærstammen WS30-5g (leu2 his3 trpl pep4 sodi) ble transformert med plasmidene pWS550A, pWS490A, pWS 491A. Fremstillingen av forkulturen, kulturen og målingen av hMn-SOD-aktiviteten fant sted som ovenfor beskrevet.

Ekspresjonen av plasmidene pWS490A, pWS491A i gjærstammen WS30-5g er dokumentert i fig. 11.

Den målte MnSOD-mengde i gjæren under disse betingelsene tilsvarte ca. 0,5 mg/liter kultur.

Eksempel 11. Syntese av en linker som inneholder gjær- leder-DNA- sekvens

Det ble fremstilt seks forskjellige oligonukleotider EBI 656, EBI 636, EBI 643, EBI 646, EBI 660 og EBI 638 med følgende sekvenser og lengder

EBI 656:

gjennom en 381A DNA-syntetisator (Applied Biosystems), som beskrevet under 3b. 01igonukleotidene EBI 636, EBI 643, EBI 646 og EBI 660 ble fosforylert for den etterfølgende ligasereaksjonen på sine 5'-ender under følgende betingelser:

Reaksjonen fant sted 30 min. ved 3 7°C. Deretter ble T4 poly nukleotid-kinasen inaktivert ved oppvarming til 100°C.

01igonukleotidene EBI 656 og EBI 638 som skal danne 5'-endene til det ferdige 128 bp lange DNA-innskudd (formel XI) ble ikke fosforylert for å unngå dannelsen av multimere DNA-innskudd i den etterfølgende ligasereaksjonen.

For å oppnå en sammensetning av den ønskede linker ut fra de enkelte oligonukleotider etter det følgende skjema

ble 2 /Ltl (=100pMol) EBI656 satt til reaksjonssats nr. 1 og 2 ul EBI 638 (=l00pMol) til reaksjonssats nr. 2 for annealing-reaksjon (hybridisering av de komplementære oligonukleotider med hverandre). I reaksjonssats nr. 3 foreligger allerede 2 komplementære oligonukleotider (EBI 643, EBI 646). Alle tre reaksjonssatser ble oppvarmet i 2 minutter ved 100°C, og langsomt avkjølt i vannbad.

De korte dobbeltkjedede DNA-fragmenter som oppsto i reaksjonene nr. 1 til 3, ble ligert med hverandre som følger:

3 ul 10 mM ATP

1 /il DNA ligase, Boehringer Mannheim, 7 enheter//il Reaksjonen fant sted i 15 timer ved 4°C.

DNA'et ble separert etter størrelse på en l-%ig agarosegel og det ønskede 128 bp lange DNA-fragment med formel XI eluert fra gelen (G.M. Dretzen et al., Anal. Biochem. 112, 295-298, 1981).

Eksempel 12. Konstruksjon av ekspresjonsvektorene som inneholder leder- DNA- sekvensen

Plasmid HS0D6 ble dobbeltspaltet med Xhol og Xbal (hver 5 enheter//xg DNA) i CORE-buffer og den 128bp lange linker (Xhol -mitokondrisk leder - Xbal) innsatt deri etter kjente metoder (pE022-A). hMn-SOD-genet som nå var utstyret med med den mitokondriske gjærleder DNA-sekvens ble dobbeltspaltet med Xhol - EcoRI (hver 5 enheter//xg DNA) i CORE-buffer og gjennom Xhol -EcoRI innsatt i pKHl (eksempel 6b, fig. 8) (pE023-A).

Den således ferdiggjorte ekspresjonskassetten ble analogt eksempel 8 innsatt gjennom Bglll/Hindlll (etter dobbelt-spalting av plasmidene i CORE-buffer og isolering av den utskårede ekspresjonskassett) i de tilsvarende forberedte gjærtransformasjonsvektorer YEpl3, pJDB207 og pEAS102 gjennom spaltnings-stedene BamHI og Hindlll. Den følgende tabell 2 angir de tilsvarende oppnådde plasmider.

Eksempel 13. Gjærtransformasjon og ekspresjon i gjær

Gjærstammen WS30-5g (eksempel 9) ble transformert med plasmidene som er oppført i tabell 2 og transformantene undersøkt med hensyn til ekspresjon (eksempel 10).

For fermenteringen av den transformerte gjærstammen WS30-5g ble en forkultur med sammensetningen: 6,7 g/l gjærnitrogen-base w/o aminosyrer (Difco), 10 g/l glukose, 0,16 g/l arginin, 0,25 g/l lysin, 0,Og g/l tryptofan, 0,08 g/l methionin, 0,03 g/l cystein, 0,10 g/l histidin, 0,16 g/l tyrosin, 0,17 g/l fenylalanin, 0,16 g/l threonin, 0,18 g/l isoleucin, 0,21 g/l valin, 0,40 g/l glutaminsyre, 0,21 g/l blycin, 0,02 g/l cystin, 0,15 g/l alanin, 0,20 g/l asparagin-syre, 0,20 g/l prolin, 0,15 g/l serin, 0,10 g/l aspargin, 0,20 g/l glutamin, 2 5 mg/l adenin, 50 mg/l uracil fordyrket med magnetrørestav og under beluftning inntil optisk tetthet OD546 = 0,01.

Den etterfølgende hovedkultur med sammensetningen:

8,0 g/l (NHJ2S0A, 2,56 g/l (NHA)2HP0A, 1,16 g/l KC1, 0,60 g/l MgS04 . 7 H20, 0,56 g/l CaCl2 . 2H20, 0,04 mg/l biotin, 80 mg/l m-inosit, 40 mg/l Ca-pantothenat, 8 mg/l thiamin, 2 mg/l pyridoksin, 3,1 mg/l CuSOA . 5 H20, 19 mg/l FeCl3.6 H20, 12 mg/l ZnSOA.7 H20, 14 mg/l MnS04.H20, 5 mg/l H3B03, 1 mg/l KJ, 2 mg/l Na2 M0O4.2 H20, lg/l gjærekstrakt, 0,2 g/l uracil, 0,1 g/l adenin, 0,5 g/l sitronsyre, 15 g/l glutaminsyre, 0,2 g/l histidin, 0,5 g/l tryptofan, 100 g/l glukose fant sted i 20 liter fermenter (CHEMAP). For dette formål ble 5 % av mengden forkultur anvendt som inoculum og man dyrket under røring (1000 opm), beluftning (0,5 wm) og konstant pH (5,0) ved 28°C i 20 1 fermentor.

Etter at glukoseinnholdet var sunket til 50 g/l ble 50 g/l glukose igjen tilsatt og videre fermentert inntil glukoseinnholdet var 10 g/l (hvilket var tilfelle ved 45 timer). Fermenterings-væsken ble deretter avkjølt, sentrifugert og biomassen frosset inn. Utbyttet av biomassen var 18 g/l cellevåtvekt.

Ekspresjonen av plasmid pE024-AB, pE025-AC og pE026-AD i gjærstammen WS30-5g dokumenteres i fig. 12.

Eksempel 14. Gj ær- mitokondrie- preparering

For å fastslå om innføringen av den gjær-mitokondriske ledersekvens foran hMn-SOD-genet fører til at proteinet importeres i mitokondriene, ble gjærmitokondrier preparert og Mn-SOD-aktiviteten i mitokondriene og i cytaplasmaet analysert.

Gjær-mitokondrier ble preparert etter en forandret form av fremgangsmåten til G. Daum et al., The Journal of Biol. Chem., 257, 13028-13033, 1982.

En forkultur av transformanter i SC-leu-væskemedium (eksempel 10) ble dyrket ved rysting (300 opm) ved 2 8°C natten over. Derav ble 2 5 ml inokulert i 2 25 ml YPD-medium og dyrket liksom forkulturen natten over. Cellene ble i alminnelighet høstet ved en målt optisk tetthet 5-7, ved 600 nm, ved sentrifugering (Sorval, 6500 opm, 5 min.)' Cellene ble vasket en gang med 100 ml vann. Celleklumpen ble oppslemmet i IM mannitol, 20 mM KPi (KH2PO<,/K2HPOJ pH 7,4 (1 ml pr. 300 mg cellevekt) og 1 mg/ml zymolase (Miles, MG.500) tilføyet. Sferoplaster ble dyrket ved to timers langsom rysting (50 opm) ved 28°C. Sferoplastene ble høstet ved sentrifugering (3 000 opm, 5 min, Hereaus Christ bordsentrifuge) og vasket en gang med 1 M mannitol, 20 mM KP± pH 7,4 mM PMSF (fenylmetylsulfonyl-fluorid). Supernatanten ble kastet og 1 - 2 klumpvolumer glassperler (tverrsnitt 0,1 mm) tilført.

Cellene ble brutt opp ved 1 minutts røring og oppslemmet i 2,5 ml 0,65 M mannitol, 1 mM EDTA, 1 MM PMSF. Helle celler og celleavfall ble sentrifugert fra ved 2000 opm, i 5- minutter (Hereaus Christ bordsentrifuge). Mitokondriene ble så tatt ut fra supernatanten ved sentrifugering (Sorval, J-21, 12000 opm, 10 min.). Supernatanten inneholder cytoplasmaer og ble opp-bevart for senere å kunne undersøkes med hensyn til hMn-SOD-aktivitet. Den rødbrune mitokondrie-klumpen ble vasket med den ovenfor nevnte buffer (hvite cytoplasmatiske bestanddeler ble spylt vekk) og mitokondriene oppslemmet i 2,5 ml av den samme buffer. Forurensninger ble igjen fjernet ved sentrifugering (Hereaus Christ bordsentrifuge, 4000 opm, 5 min.) og mitokondriene pelletert fra supernatanten i en andre sentrifugering (Sorval, J-21, 12000 opm, 10 min.). Mitokondriene ble brutt opp med glassperler analogt fremgangsmåten for å bryte opp gjærceller (van Loon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 3820-3824, 1986), og undersøkt etter Mn-SOD-innhold i aktivitets-gelen (fig. 13).

Eksempel 15. Rensin<g> av hMn- SOD ifølge oppfinnelsen

Isoleringen av det rekombinante hMn-SOD ble utført fra stammen WS30-5g/pEO24-AB (gjærvektor PJDB207) gjennom flere trinn.

Trinn 1: Celleoppslutning

Cellemassen (eksempel 13) ble vasket i 10 ml destillert vann pr. gram våtvekt og sentrifugert ved 16000 x g i 15 min. Fellingen ble gjenoppslemmet i Na, K-fosfatbuffer (50 mM, pH 7,0) i forholdet 1:3 (vekt/volum). Cellene ble så oppsluttet i en kontinuerlig arbeidende cellemølle (Dynomil KDL; Bachofer, Basel, Sveits; 0,6 1-målebeholder, vannkjøling) ved hjelp av glasskuler (0,1 mm tverrsnitt) ved en strømnings-hastighet på 6 l/time. Celle-ekstraktet ble sentrifugert i 15 minutter (16 000 x g, 4°C) og fellingen kastet.

Trinn 2: Polyetylenimin-felling

Til supernatanten fra trinn 1 ble en 5 %-ig (vekt/volum) vandig polyetylenimin-løsning (pH 8,0) tilsatt under røring inntil en sluttkonsentrasjon på 0,5 % (polyetylenimin, Serva, Heidelberg). Deretter rørte man 30 minutter videre og frasentrifugerte så fellingen ved 16.000 x g (30 min.).

Trinn 3: Varmefelling

Supernatanten fra trinn 2 ble oppvarmet til 60°C i stålbegre under røring i et 80°C varmt vannbad og igjen avkjølt i isbad til romtemperatur. Utfellt protein ble fjernet ved sentrifugering (10.000 x g, 10 min. 4°C) .

Trinn 4: Ammoniumsulfat-felling

Supernatanten fra trinn 3 ble bragt til 20 % metning med fast ammoniumsulfat og felling fjernet ved sentrifugering (10.000 x g, 15 min. 4°C). "Ammoniumsulfatkonsentrasjonen ble så øket til 90 % og fellingen utvunnet ved sentrifugering (10.000 x g, 15 min., 4°C). Sedimentet ble opptatt i litt MES-buffer (morfolinoetansulfonatbuffer, 50 mM, pH 6,0; 2-morfo-lino-etanolsulfonsyre fra Sigma, Deisenhofen) og dialysert natten over mot den samme buffer.

Trinn 5: Kationbytter-kromatografi

En mono S søyle (Mono S HR 5/5, Pharmacia, Sverige) ble ekvilibrert med 5 søylevolumer MES-buffer. Etter at søylen

var påfyllt ekstraktet fra trinn 4, ble ikke-bundede proteiner vasket ut med 5 syrevolumer MES-buffer. hMn-SOD ble så eluert i en lineær gradient av 0 - 50 mM NaCl i MES-buffer (20 søyle-volumer) . Fraksjoner som inneholdt Mn-SOD-aktiviteten ble

slått sammen og dialysert mot Na, K-fosfatbuffer (5mM, pH 7,0) .

De gjæregne SOD-enzymer (Mn-SOD, CuZn-SOD) kan separeres i dette rensetrinnet. Et elueringsdiagram er vist på fig. 14. Trinn 6: Adsorpsjonskromatografi på hydroksylapatit

En hydroksylapatitsøyle (HA-Ultrogel, IBF, Villeneuve-la-Garenne, Frankrike) ekvilibrert med fosfatbuffer (5 mM, pH 7,0) ble påfyllt dialysatet fra trinn 5 og hMn-SOD med en lineær gradient (20 søylevolumer) av 5 - 300 mM Na, K-fosfat pH 7,0).

Den oppnådde renhetsgrad i de enkelte rensetrinn av hMn-SOD ble fulgt ved reduserende SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (fig. 15).

Eksempel 16. Karakteriserin<g> av hMn- SOD ifølge oppfinnelsen

Det ifølge eksempel 15 rensede hMn-SOD ble analysert ved gelgjennomtrengnings-HPLC, reversfase HPLC, N-terminalt sekvensbestemmelse, SDS-gelelektroforese, naturlig gelelektroforese og isoelektrisk fokusering og sammenlignet med et naturlige hMn-SOD.

a. Gelgjennomtrengnings-HPLC:

Søyle: Waters Protein Pak I 125, 2 x (7,8 x 300 mm)

10 um partikkeltverrsnitt.

Elueringsmiddel: 0,5 M Na2S0A, 0,02 M NaH2P04, pH 7,0,

0,04 % Tween 20, 25 % propylenglykol

Gjennomløp: 0,5 ml/min

Påvisning: UV-absorpsjon, 214 nm

Naturlig hMn-SOD hhv. fremstilt ifølge oppfinnelsen viste hovedtoppen av SOD-tetrameren med en molekylvekt på 70.000 hhv. 76.000, hvorunder justeringen skjedde gjennom fire standard-proteiner. Innenfor denne metodens eksperimentelle feil er disse verdier å anse som identiske.

b. Reversfase-HPLC

Søyle: Bakerbond WP C18, 4,6 x 250 mm, 5 um partikkeltverrsnitt, 3 0 nm poretverrsnitt Elueringsmiddel A: 0,1 % trifluoreddiksyre i vann Elueringsmiddel B: 0,1 % trifluoreddiksyre i acetonitril Gradient: 20 % B i 2 min, 20 - 60 % B i 24 min., 68 %

B i 10 min., 68 - 20 % B i 1 min.

Naturlig hMn-SOD og fremstilt ifølge oppfinnelsen viste en retensjonstid på knapt 21 min (20,7 hhv. 20,9 min.).

c. N-terminal sekvensbestemmelse

En avsaltet topp gjennom reversfase HPLC av hMn-SOD fremstilt ifølge oppfinnelsen ble sekvensbestemt. Sekvens-bestemmelsene fant sted med en gassfasesekvenator fra firma

Applied Biosystems (Modell 470 A) med programmet 02RPTH. Med en utgangsmengde på 0,8 nM kunne man sekvensbestemme frem til aminosyre 20. Det ble funnet 100 %ig overenstemmelse med den ventede sekvens (av naturlig protein og cDNA). Leder-sekvensen for transport i mitokondriene var fullstendig avspaltet.

d. SDS-gelelektroforese

SDS-gelelektroforesen ble i stor grad utført etter original-forskriften til U.K. Låmmli (Nature 227, 680-685, 1970). Ved probeforberedningen for hMn-SOD ble probene blandet med DTT som reduksjonsmiddel og kokt opp. På SDS-gelen foreligger hMn-SOD hovedsakelig som monomer med M ca. 25.000. Avhengig av reduksjonens fullstendighet er også tetrameren med M ca. 90.000 påviselig. Fig. 15 viser en 15 %-ig SDS-polyakrylamidgel etter sølvfarging.

e. Naturlig gelelektroforese

hMn-SOD fremstilt ifølge oppfinnelsen erholdt etter hydroksylapatit-kromatografien viste etter elektroforesen farging både med Coomassie-blått (påført mengde av hMn-SOD: 0,3 /xg) og etter aktivitetsfarging med o-dianisidin (påført mengde hMn-SOD: 57, 30 hhv. 15 ng) et enhetlig bånd som lå i samme posisjon,

f. Isoelektrisk fokussering

pH-område: 3,5-9,5

Gelplater: LKB, PAGplate (1 mm x (9 x 10 cm) Elektrodeløsninger: 1 M fosforsyre (anode)

1 M natronlut (katode) Kjøletemperatur: 7 °C

Probemengde: 4,0 hhv. 6,5 (ig

Løpsbetingelser: Forfokussering 500 Vh

fokussering 3000 Vh tilsammen

Farging: Coomassie-blått, aktivitetsfarging med o-dianisidin

Som isoelektrisk punkt måltes pl= 8,15.

Claims (12)

1. DNA-sekvens, karakterisert veda) at den koder for den fullstendige eller partielle genetiske informasjon for menneskets mangan-superoksyddismutase (hMn-SOD) med en pl-verdi 8,15 ±0,2, og bestående av sekvensen hvori AAG i kodon 30 kan erstattes med CAG og CAC i kodon 32 kan erstattes med CAT, og som koder for et fullstendig hMn-SOD- enzym, idet de koder for et uferdig hMn-SOD-enzym som kan innføres i mitokondrium, og deri kan omdannes korrekt til det aktive ferdige enzym som har de enzymatiske, biokjemiske og immunologiske egenskapene til hMn-SOD, b) at den eventuelt har en aminoterminal leder- eller signalsekvens, translasjonsstartsignal (ATG) og minst ett stopp-kodon.

2. DNA-sekvenser ifølge krav 1, karakterisert ved at den genetiske informasjon for hMn-SOD har en DNA-sekvens direkte foran seg som er en mitokondrisk leder- eller signalsekvens.

3. DNA-sekvenser ifølge krav 2, karakterisert ved at den mitokondriske leder- eller signalsekvens stammer fra gjær.

4. DNA-sekvenser ifølge ett av kravene 1 til 4, karakterisert ved en sammensetning med rekkefølgen translasjons-startsignal (ATG), mitokondrisk leder- eller signalsekvens, DNA-sekvens for hMn-SOD.

5. Replikerende vektorer med minst en seleksjonsmarkør og/eller med ett gjenkjennelsessted for minst ett restrik-sjons-enzym utenfor replikasjonsopprinnelsen og utenfor andre essensielle geneområder, eventuelt innenfor en seleksjons-markør , karakterisert ved at disse inneholder en av DNA-sekvensene ifølge ett av kravene 1 til 4, som koder for hMn-SOD og kan uttrykke dette genet.

6. Replikerende vektorer ifølge krav 5, karakterisert ved at de er av virusopp-rinnelse, fortrinnsvis lambda-fager, spesielt XgtlO eller M13-fager.

7. Replikerende vektorer ifølge krav 5, karakterisert ved at de er av plasmid-opprinnelse.

8. Plasmider, karakterisert ved at de inneholder en av DNA-sekvensene ifølge ett av kravene 1 til 4, som koder for hMn-SOD og er istand til å uttrykke dette genet, idet de bærer en ekspresjonskassett som sitter i en av disse nevnte sekvenser, kan transformere prokaryotiske og eukaryotiske vertsceller stabilt, er replikerbare i en av disse vertsceller og den genetiske informasjon som foreligger deri transkriberes og translateres korrekt for hMn-SOD.

9. Plasmider ifølge krav 8, karakterisert ved at ekspresjonskassetten befinner seg deri med elementpromotor, begynnelseskodon, mitokondrisk leder- eller signalsekvens, hMn-SOD strukturgen, stoppkodon, terminator, alle i korrekt orientering for lese-retning.

10. Plasmider ifølge krav 9, karakterisert ved at promotoren for ekspresjonskassetten i disse plasmidene er den fullstendige ca. 1500 bp lange ADHI-promotor, eller den forkortede ca. 400 bp lange ADHIk-promotor og terminator i nevnte ekspresjonskassett er ADHII-terminatoren.

11. Plasmider karakterisert ved at de er pWS490A, pWS491A, pWS550A, pWS371A, pWS372A, pWS373A, pE024-AB, pE025-AC, pE026-AD.

12. Fremgangsmåte ved fremstilling av hMn-SOD med aminosyresekvens ifølge formlene IVa og IVb, karakterisert ved at a. mRNA fra menneskevev, fortrinnsvis placentavev, isoleres og poly(A)<+>RNA prepareres, b. det dobbeltkjedete cDNA syntetiseres fra dette poly(A)<+>RNA, og derav konstrueres en cDNA-genbank, c. et DNA med fullstendig eller partiell sekvens som definert i krav 1, som koder for hMn-SOD fra nevnte cDNA-bank identifiseres og isoleres ved hjelp av aminosyresekvensen til DNA-prober avledet av hMn-SOD, fortrinnsvis slike som tilsvarer formelene Va og Vb, d. denne DNA-sekvens kompletteres eventuelt frem til start- eller stopp-kodonet, e. en mitokondrisk leder- eller signal-DNA-sekvens, for trinnsvis tilsvarende formel X, plasseres direkte etter startkodonet (ATG) av hMn-SOD-genet og foran det første kodon (lys) som koder for hMn-SOD, f. med denne komplette DNA-sekvens som koder for hMn-SOD utstyrt med et leder- eller signal-peptid konstrueres en, avhengig av vertscellen, egnet ekspresjons-kassett bestående av promotor, begynnel-ses-signal, hMn-SOD-gen med leder- eller signal sekvens, stoppkodon, terminator, g. denne ekspresjonskassetten innbygges i et egnet ekspresjonsplasmid som definert i kravene 7-15 egnet for eukaryotiske celler, fortrinnsvis en gjærvektor, h. med dette ekspresjonsplasmid som inneholder hMn-SOD-genet utstyrt med en leder- eller signalsekvens transformeres fortrinnsvis eukaryotiske vertsceller, spesielt gjærceller, i. det syntetiserte og korrekt behandlete hMn-SOD fra denne transformerte vert ekstraheres fra mitokondriene og renses deretter, og har de kjente enzymatiske, biologiske og immunokjemiske egenskapene til autentisk hMn-SOD.