PT86955B - Processo para a preparacao do enzima superoxidismutase - manganes humano (hmn-sod) - Google Patents

Processo para a preparacao do enzima superoxidismutase - manganes humano (hmn-sod) Download PDF

Info

Publication number
PT86955B
PT86955B PT86955A PT8695588A PT86955B PT 86955 B PT86955 B PT 86955B PT 86955 A PT86955 A PT 86955A PT 8695588 A PT8695588 A PT 8695588A PT 86955 B PT86955 B PT 86955B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
sod
hmn
process according
prepared
dna
Prior art date
Application number
PT86955A
Other languages
English (en)
Other versions
PT86955A (pt
Inventor
Rudolf Hauptmann
Konrad Heckl
Walter Spevak
Elinborg Ostermann
Andreas Zoephel
Edeltraud Krystek
Ingrid Maurer-Fogy
Maria Josefa Wiche-Castanon
Christian Stratowa
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19873708306 external-priority patent/DE3708306A1/de
Priority claimed from DE19873717695 external-priority patent/DE3717695A1/de
Priority claimed from DE19873722884 external-priority patent/DE3722884A1/de
Priority claimed from DE19873744038 external-priority patent/DE3744038A1/de
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of PT86955A publication Critical patent/PT86955A/pt
Publication of PT86955B publication Critical patent/PT86955B/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/07—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a mitochondrial localisation signal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Inorganic Compounds Of Heavy Metals (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)

Description

enzima.
Em consequência de vãrios processos bioquímicos em sistemas biológicos (por exemplo processos redox na cadeia respiratória, oxidações no citoplasma) formam-se, de modo conhecido, radicais 02 móveis, de elevada toxicidade e que podem conduzir à destruição dos tecidos. Em situações patológicas, por exemplo no decurso de doenças de origem reumática, verij i ficam-se degradações de colagênio e do líquido sinovial devidas í a esses radicais (Pasquier, C. et al., Inflammation 8, 27-32, j 1984). As células eucariõticas possuem duas formas de superoxidismutases, uma das quais existe principalmente no citosol (Cu/Z_iji -SOD) e a outra principalmente nas mitocôndrias (Mn-SOD). Descobriu-se nas mitocôndrias do fígado que o enzima de Mn estã locaH zado também na matriz da membrana interna, embora o Mn-SOD se te nha encontrado também no citosol das células do fígado (Mc Cord J.M. et al., em Superoxide and Superoxide Dismutases (A.M. Michelson, J.M. Mc Cord, I. Fridocich, eds.) Academic Press, N.Y., 129-138, 1977).
Nas células procarióticas existe pa ra além de um Mn-SOD também um Fe-SOD. Este ultimo encontrou-se ainda em algas e protozoários bem como em algumas espécies vegetais (Bridges, S.M., Salin, M.L., Plant Physiol. 68, 275-278, 1981). Estes enzimas altamente reactivos catalisam a despropor~ + cionaçao 02 + 02 + 2H ---*· H2O2+O2 e impedem, através desta dismutação dos radicais superõxido, a sua acumulação e, como tal, as Tesões celulares que provocam. Para além do rectículo endoplasmãtico do fígado podem considerar-se as membranas mitocondri ais como um dos locais .mais importantes de produção de 02 em células animais, de maneira que não admira que as mitocôndrias dis ponham dos seus próprios SOD (Mn-SOD) especiais.
Clonou-se o gene estrutural de um Mn-SOD procariõtico (E. coli) e localizou-se o gene sodA cromossomal (Touati, D., J. Bact. 155, 1078-1087, 1983).
Conseguir esclarecer-se a sequência de nucleótidos com 699 bp (lares de bases) de um Mn-SOD mitocondrial de levedura e derivar-se a partir daí a estrutura priãria quer do precursor quer ainda da proteína madura, obtendo-se pe sos moleculares de 26123 Da para o precursor e de 23059 Da para a proteína madura (Marres, C.A.M. et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161 (1985). Deste modo os SOD de Mn e de Cu/Zn (PM=14893, EP-A 138111) distinguem-se claramente pelos seus pesos moleculares .
A sequência completa de aminoácidos do Mn-SOD de fígado humano foi publicada por Barra, D., após o que se identificou o hMn-SOD como composto por 196 aminoácidos (Barra, D. et al.,. J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984). O Cu/Zn-SOD humano de eritrõcitos ê constituído, pelo contrário, por 153 aminoácidos (Jabusch, J.R. et al., Biochemistry 19, 2310 -2316, 1980) e não apresenta qualquer homologia sequencial com o hMn-SOD (Barra, D. et al., vide acima).
Em geral, atribui-se às superoxidiss mutases umá função protectora contra determinados processos inflamatórios. Em particular, uma deficiência em Mn-SOD pode ter um papel importante no desenvolvimento da artrite reumatõide (Pasquier, C. et al., vide acima). Refere-se também um efeito protector do SOD contra lesões do fígado induzidas pelo álcool (Del Villano, B.C. et al., Science 207, 991-993, 1980).
A clonagem e expressão de um SOD hu mano conhece-se apenas para o Cu/Zn-SOD humano do fígado (EP-A 138111).
Devido ãs propriedades essenciais das superoxidismutases anteriormente mencionadas, em especial do hMn-SOD, e de esperar que tenham utilidade para aplicação terapêutica e/ou diagnóstica. Para tal fim ê vantajoso dispór de espécies apropriadas, isto ê, de Mn-SOD humano, numa forma homogénea e em quantidades suficientes. O objectivo daí resultante será o de minimizar ou impedir as reacções imunolõgicas esperadas, por exemplo após aplicação terapêutica.
Só o desenvolvimento de tecnologias para a recombinação de DNA estranho com DNA vector, com a possibilidade de se estabelecer e se exprimir pela primeira vez em mi croorganismos, permitiu preparar proteínas homogéneas de origem animal ou humana em grandes quantidades. Há ainda que atingir neste caso um outro objectivo, ou seja o de que o enzima assim produzido - o hMn-SOD - tenha um espectro de actividade biológica característico em relação ao do hMn-SOD autêntico e genuíno.
Um objectivo da presente invenção consiste pois, por meio de processos de engenharia genética, em descobrir ou preparar'pela primeira vez a sequência de DNA codificante para este enzima e mostrar, pela primeira vez, por que métodos esta sequência se pode obter.
De acordo com a invenção, conseguiu -se este objectivo, tendo-se investigado um banco de genes de cDNA obtido a partir de células de placenta humana com moléculas sonda de DNA obtidas por via sintética, conseguindo-se assim iso lar o gene codificante para o hMn-SOD. Para se obter o gene para o hMn-SOD pode isolar-se o mRNA das células que produzem esse en zima, de acordo com métodos conhecidos. Como material de partida são adequados vários tecidos glandulares metabolicamente activos. como por exemplo tecidos do fígado ou da placenta. Após a preparação do cDNA, que se pode obter de acordo com métodos conhecidos por síntese com primers com transcriptase reversa a partir do mRNA isolado, seguida de introdução num vector adequado e de amplificação até se obter um banco de genes de cDNA completo, po de pesquisar-se este com uma sonda de DNA definida, marcada ra dioactivamente, ou com uma mistura de várias dessas sondas. De modo a ter em conta a degeneração do código genético empregam-se de preferência misturas definidas de sondas de DNA que representem todas as variações de nucleótidos possíveis para um determinado aminoácido, escolhidas de modo que a quantidade das sondas de DNA de uma mistura a sintetizar seja tão pequena quanto possí vel e que a homologia com a sequência de DNA a pesquisar no hMn-SOD seja tão elevada quanto possível. Um outro critério de esco lha para a síntese de sondas de DNA pode consistir no facto de estas serem complementares a pelo menos duas regiões independentes , por exemplo na proximidade dos extremos 3' e 5’ da sequência genética. Podem assim identificar-se clonos a partir de pelo menos duas hibridações separadas, que tenham sinais positivos por exemplo em relação às duas sondas de DNA independentes. Estes clonos podem utilizar-se então de preferência para o isolamento do gene de hMn-SOD, uma vez que ê de esperar que eles con tenham uma parte ou a totalidade do gene para o hMn-SOD.
As sequências de DNA particulares, que foram utilizadas para as sondas de DNA de acordo com a inven ção, obtiveram-se a partir de tecidos do fígado de acordo com as sequências de aminoácidos do Mn-SOD humano publicadas por Barra, D. et al. (Barra, D. et al., Oxy Radicais and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1983).
Em particular, podem empregar-se de preferência duas regiões da sequência de DNA do hMN-SOD, que codificam para pelo menos cinco grupos aminoácidos, de preferência para 8 grupos aminoácido, sendo vantajoso um comprimento da sonda de DNA de pelo menos 14 bases, de preferência de 23 bases. Ê particularmente conveniente que uma sonda de DNA seja complementar a uma sequência de DNA derivada do hMn-SOD, cuja informação genética seja colinear com os grupos aminoácido 39 a 49 e que uma segunda sonda de DNA seja complementar ã região de DNA que codifica para os grupos aminoácido 200 a 207 da sequência de ami noacidos conhecida. Do mesmo modo, podem ainda empregar-se como sondas sequências de DNA derivadas de outras superoxidismutases de Mn.
Por meio de tais sondas de DNA podem obter-se clonos positivos, a partir dos quais se pode isolar uma sequência de cDNA, de acordo com a fórmula I a seguinte, que contém uma grande parte de uma região codificante para o hMn-SOD:
G ATC ATG CAG CTG CAC CAC AGC AAG CAC CAC GCG GCC TAC GTG AAC
AAC CTG AAC GTC ACC GAG GAG AAG TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG
GGA GAT GTT ACA GCC CAG ATA GCT CTT CAG CCT GCA CTG AAG TTC
AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT CAT AGC ATT TTC TGG ACA AAC CTC
AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC AAA GGG GAG TTG CTG GAA GCC
ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC TTT GAC AAG TTT AAG GAG AAG CTG
ACG GCT GCA TCT GTT GGT GTC CAA GGC TCA GGT TGG GGT TGG CTT
GGT TTC AAT AAG GAA CGG GGA CAC TTA CAA ATT GCT GCT TGT CCA
AAT CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA ACA GGC CTT ATT CCA CTG CTG
GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT TAC TAC CTT CAG TAT AAA AAT
GTC AGG CCT GAT TAT CTA AAA GCT ATT TGG AAT GTA ATC AAC TGG
GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAC ATG GCT TGC AAA AAG TAA
Fórmula Ia
Descobriu-se surpreendentemente que o cDNA descoberto codifica para uma sequência de aminoácidos que se distingue da sequência de aminoácidos publicada (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984) em alguns dos grupos e no seu comprimento. As diferenças encontradas entre esta sequência e a sequência de Barra dizem respeito às posições dos aminoácidos 42, 88, 109 e 133 (sempre Gin), bem como a dois aminoãcidos adicionais Gly e Trp entre as posições 123 e 124, de mo do que a sequência de DNA de acordo com a invenção corresponde a um hMn-SOD com 198 aminoácidos.
Não era também de esperar que, por outro lado, se pudesse isolar um cDNA codificante para o hMn-SOD com uma substituição de aminoácido na posição 29 (codão para Gin em vez de para Lys) apresentando assim neste ponto uma nova dife rença em relação à sequência de Barra e à fórmula Ia, correspondente à fórmula Ib:
CAC CAC AGC CAG CAC CAC GCG GCC TAC GTG AAC AAC CTG AAC GTC ACC
GAG GAG AAG TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG GGA GAT GTT ACA GCC CAG
ATA GCT CTT CAG CCT GCA CTG AAG TTC AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT
CAT AGC ATT TTC TGG ACA AAC CTC AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC
AAA GGG GAG TTG CTG GAA GCC ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC TTT GAC
AAG TTT AAG GAG AAG CTG ACG GCT GCA TCT GTT GGT GTC CAA GGC TCA
GGT TGG GGT TGG CTT GGT TTC AAT AAG GAA CGG GGA CAC TTA CAA ATT
GCT GCT TGT CCA AAT CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA ACA GGC CTT ATT
CCA CTG CTG GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT TAC TAC CTT CAG TAT
AAA AAT GTC AGG CCT GAT TAT CTA AAA GCT ATT TGG AAT GTA ATC AAC
TGG GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAC ATG GCT TGC AAA AAG TAA
Fórmula Ib
Partindo-se do princípio de que a sequência de Barra está correctamente analisada pode, com base na sequência de nucleotidos ou de aminoácidos de acordo com a in vençâo, admitir-se a possibilidade de que, deste modo e pela pri meira vez, se demonstrou a existência de genes diferentes ou das suas diferentes formas de expressão ou isoenzimas para o hMn-SOD
Uma vez que se podem obter clonos portadores de cDNA, aos quais falta o extremo necessário para o gene completo de hMn-SOD, um outro objectivo da presente invenção foi a preparação do gene completo para o hMn-SOD. A solução desta tarefa pode assentar em varias estratégias conhecidas. Por exemplo pode empregar-se a própria sequência obtida como sonda de DNA e pesquisar-se com ela de novo o banco de cDNA de modo a encontrar-se um gene completo ou um cDNA a que falta o extremo em causa ou pode utilizar-se a sequência de DNA obtida como sonda de hibridação em relação a um banco genómico de modo a isolar, após identificação, o gene completo do hMn-SOD.
Pode também lançar-se mão da possibilidade de sintetizar oligonucleõtidos cuja sequência de nucleó tidos corresponda ao extremo do hMn-SOD que falta e por meio des ses oligonucleõtidos, através de uma ligação por lincagem apropriada, obter-se o cDNA completo para o hMn-SOD. Este método tem a vantagem de se poder obter por exemplo um DNA codificante para o hMn-SOD, cujo extremo 5’ comece directamente com o codão de início (ATG) .
Para este fim, para completar os cDNA’s de acordo com a invenção, codificantes por exemplo a partir do amino.ãcido 22 ou 26, revelou-se particularmente apropriada a sequência de DNA da fórmula II, que começa com o codão de início 5' ATG e acaba com o codão para o aminoácido 31 (His, sen do AAG/Lys/ = 1), de acordo com as preferências de codão conheci das, como as que se verificam por exemplo no caso das leveduras (Sharp, P.M. et al., Nucl. Acids Res. 14 (13), 5125 - 5143, 1986).
5' ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG CCA TAC GAC TAC GGT GCT TAC
TTC GTG AGA AAC GGT CTG AAG GGT ATG CTG ATG CCA CGA
CTA GAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA TTG CAC CAC GAT
CTT GGT GTG TAG TTG CGA GTT TAG TAC GTT AAC GTG GTG
TCT AAG CAC CAT G
AGA TTC GTG GTA C
Formula II
Podem utilizar-se do mesmo modo outros codões sinónimos conhecidos para completar o gene do hMn-SOD ou para a síntese in vitro do gene total, por exemplo aqueles que facilitam uma permuta óptima codão-anticodão em bactérias, por exemplo E. coli, aumentando aí a eficiência da translacção (Grosjean, H. Fiers, W., Gene 18, 199 -209, 1982; Ikemura; T., J. Mol. Biol. 151, 389 - 409, 1981), ou aqueles codões que correspondem â composição genuína em células de mamíferos (Grantham, R. et al., Acid Research 9., 43 - 47, 1981).
Estes últimos podem empregar-se de preferência para a transformação e em seguida para a expressão em células de mamíferos.
Ê em princípio possível, de acordo com métodos por si conhecidos, por exemplo com CNBr ou CNC1, cin dir o grupo metionina, codificado pelo codão de início ATG e colocado antes do hMn-SOD maduro, que começa pelo primeiro aminoãcido lisina. Uma vez que no enzima hMn-SOD maduro podem existir outros grupos metionina internos, por exemplo nas posições 23 ou 192, não pode ser executível um tal processo, de modo a manter-se inalterado nesse caso o grupo metionina adicional N-terminal, sem influenciar a actividade biológica do hMn-SOD.
Podem contudo aplicar-se também outros métodos de cisão enzimãtica, em que se podem utilizar de um modo conhecido agentes de lingagem sintéticos apropriados, uma vez que ê de esperar que existam codões pará os aminoácidos correspondentes específicos nas posições desejadas do vector que contêm o cDNA do hMn-SOD. Referem-se por exemplo grupos Arg ou Lys para uma cisão tríptica ou utilizam-se em geral codões que codificam para aminoácidos sensíveis ã protease. Estas podem colocar-se antes ou depois do codão de início ou no interior da re gião codificante.
Um outro objectivo da presente invenção foi exprimir pela primeira vez, por meio de técnicas de engenharia genética, as sequências codificantes para o hMn-SOD em células hospedeiras apropriadas, preparar pela primeira vez o enzima homogéneo hMn-SOD de acordo com esses processos, isola-lo e obtê-lo numa forma pura, e descrever pela primeira vez os moR
dos de procedimento para tal necessários.
De acordo com a invenção conseguiu-
-se atingir este objectivo, inserido as sequências âe DNA codifi
cantes para o hMn-SOD, por exemplo de acordo com as fórmulas III
a ou Illb,
5' ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG CCA TAC GAC TAC GGT GCT CTA
GAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA TTG CAC CAC TCT AAG
CAC CAC GCG GCC TAC GTG AAC AAC CTG AAC GTC ACC GAG GAG AAG
TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG GGA GAT GTT ACA GCC CAG ATA GCT
CTT CAG CCT GCA CTG AAG TTC AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT CAT
AGC ATT TTC TGG ACA AAC CTC AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC
AAA GGG GAG TTG CTG GAA GCC ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC TTT
GAC AAG TTT AAG GAG AAG CTG ACG GCT GCA TCT GTT GGT GTC CAA
GGC TCA GGT. TGG GGT TGG CTT GGT TTC AAT AAG GAA CGG GGA CAC
TTA CAA ATT GCT GCT TGT CCA AAT CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA
ACA GGC CTT ATT CCA CTG CTG GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT
TAC TAC CTT CAG TAT AAA AAT GTC AGG CCT GAT TAT CTA AAA GCT
ATT TGG AAT GTA ATC AAC TGG GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAC ATG
GCT TGC AAA AAG TAA
Formula Illa
5' ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG CCA TAC GAC TAC GGT GCT CTA
GAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA TTG CAC CAC TCT CAG
CAC CAC GCG GCC TAC GTG AAC AAC CTG AAC GTC ACC GAG GAG AAG
TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG GGA GAT GTT ACA GCC CAG ATA GCT
CTT CAG CCT GCA CTG AAG TTC AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT CAT
AGC ATT TTC TGG ACA AAC CTC AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC
AAA GGG GAG TTG CTG GAA GCC ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC TTT
GAC AAG TTT AAG GAG AAG CTG ACG GCT GCA TCT GTT GGT GTC CAA
GGC TCA GGT TGG GGT TGG CTT GGT TTC AAT AAG GAA CGG GGA CAC
TTA CAA ATT GCT GCT TGT CCA AAT CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA
ACA GGC CTT ATT CCA CTG CTG GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT
TAC TAC CTT CAG TAT AAA AAT GTC AGG CCT GAT TAT CTA AAA GCT
ATT TGG AAT GTA ATC AAC TGG GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAC ATG
GCT TGC AAA AAG TAA
Formula Illb
Q conforme o caso providas das correspondentes sequências de sinal ou de controle, em vectores apropriados, transformando assim as células hospedeiras. Após cultura das células hospedeiras transformadas isolam-se e purificam-se os polipêptidos formados, de acordo com processos por si conhecidos. Os polipêptidos obtidos correspondem às férmulas IVa e IVb seguintes.
10 15
Lys His Ser Leu Pro 20 Asp Leu Pro Tyr Asp Tyr 25 Gly Ala Leu Glu 30
Pro His Ile Asn Ala Gin Ile Met Gin Leu His His Ser Lys His
35 40 45
His Ala Ala Tyr Vai Asn Asn Leu Asn Vai Thr Glu Glu Lys Tyr
50 55 60
Gin Glu Ala Leu Ala Lys Gly Asp Vai Thr Ala Gin Ile Ala Leu
65 70 75
Gin Pro Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser
80 85 90
Ile Phe Trp Thr Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu Pro Lys
95 100 105
Gly Glu Leu Leu Glu Ala Ile Lys Arg Asp Phe Gly Ser Phe Asp
110 115 120
Lys Phe Lys Glu Lys Leu Thr Ala Ala Ser Vai Gly Vai Gin Gly
125 130 135
Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Phe Asn Lys Glu Arg Gly His Leu
140 145 150
Gin Ile Ala Ala Cys Pro Asn Gin Asp Pro Leu Gin Gly Thr Thr
155 160 165
Gly Leu Ile Pro Leu Leu Gly Ile Asp Vai Trp Glu His Ala Tyr
170 175 180
Tyr Leu Gin Tyr Lys Asn Vai Arg Pro Asp Tyr Leu Lys Ala Ile
185 190 195
Trp Asn Vai Ile Asn Trp Glu Asn Vai Thr Glu Arg Tyr Met Ala
Cys Lys Lys
Formula IVa
1 5 5 10 15
Lys His Ser Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Leu Glu
20 25 30
Pro His Ile Asn Ala Gin Ile Met Gin Leu His His Ser Gin His
35 40 45
His Ala Ala Tyr Vai Asn Asn Leu Asn Vai Thr Glu Glu Lys Tyr
50 55 60
Gin Glu Ala Leu Ala Lys Gly Asp Vai Thr Ala Gin Ile Ala Leu
65 70 75
Gin Pro Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser
80 85 90
Ile Phe Trp Thr Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu Pro Lys
95 100 105
Gly Glu Leu Leu Glu Ala Ile Lys Arg Asp Phe Gly Ser Phe Asp
110 115 120
Lys Phe Lys Glu Lys Leu Thr Ala Ala Ser Vai Gly Vai Gin Gly
125 130 135
Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Phe Asn Lys Glu Arg Gly His Leu
140 145 150
Gin Ile Ala Ala Cys Pro Asn Gin Asp Pro Leu Gin Gly Thr Thr
155 160 165
Gly Leu Ile Pro Leu Leu Gly Ile Asp Vai Trp Glu His Ala Tyr
170 175 180
Tyr Leu Gin Tyr Lys Asn Vai Arg Pro Asp Tyr Leu Lys Ala Ile
185 190 195
Trp Asn Vai Ile Asn Trp Glu Asn Vai Thr Glu Arg Tyr Met Ala
Cys Lys Lys
Formula IVb
A sequência de acordo com as formulas Illa e Illb são particularmente apropriadas para a prepara ção do hMn-SOD não glicolisado de formula IVa e IVb em microorga
1 nismos, em particular em E. coli ou S. cerevisiae. 0 problema da glicosilação por exemplo em leveduras pode resolver-se lançando não a mutantes que sejam deficientes na glicosilação de proteínas (mutantes alg) (vide por exemplo, Huffaker, T.C., Robbins P. W. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 7466-7470, 1983).
Caso se revele necessário ou significativo pode colocar-se antes do gene completo de hMn-SOD, de acordo por exemplo com as fórmula IVa ou IVb, uma sequência Lea der ou de sinal, directamente antes do primeiro codão do primei ro aminoácido N-terminal do hMn-SOD maduro ou antes do codão de início ATG. Com isto pode conseguir-se transpor o hMn-SOD a partir da célula hospedeira e isolá-lo facilmente a partir do meio de cultura.
As sequências de sinal deste tipo encontram-se descritas; elas codificam para uma região proteica essencialmente hidrofõbica, que por meio de processos de pós-translacção se pode remover da célula hospedeira (Davis, D.B., Tai. P.-C., Nature 283, 433-438, 1980; Perlman, D., Halvorson, H.O., J. Mol. Biol. 167, 391-409, 1983). Quando antes do primeiro aminoácido do hMn-SOD se construiu um codão ATG, pode obter-se um produto genético que contêm uma metionina N-terminal antes da lisina. Ê conhecido o facto de se utilizarem sequências de sinal de células) procariõticas de modo a segregarem-se proteínas no periplasma e a se processarem correctamente (por exemplo em Davis, B.D., Tai, P.-C., 1980).
Ê evidentemente possível, após isolamento e clonagem da sequência de DNA do hMn-SOD, modificar especificamente o enzima codificado por esta sequência. As modificações de enzimas podem efectuar-se por exemplo através de mutações in vitro adequado com oligonucleõtidos sintéticos, por meio das quais se podem modificar as propriedades catalíticas do hMn-SOD obtendo-se novas actividades enzimáticas. São conhecidas as técnicas necessárias à execução destas manipulações das proteínas (por exemplo Winter, G. et al., Nature 299, 756 - 758, 1982; Dalbadie - Mc Farland, G. et al. Proc. Natl. Acad, Sei. USA, 79, 6409-6413, 1982).
Para a clonagem, isto ê para a am plificação e preparação do gene do hMn-SOD pode utilizar-se E. coli, de preferência E. coli C600 (Nelson et al. Virology 108, 338-350, 1981) ou JM 101, ou estirpes de E. colo com pelo menos um dos subgenótipos conhecidos. A clonagem pode também efectuar-se em bactérias gram-positivas como por exemplo B. subtilis. En contram-se numerosas descrições destes sistemas.
Como hospedeiras apropriados para a expressão do gene de hMn-SOD de acordo com a invenção referem-se tanto microórganismos como ainda culturas de organismos multicelulares. Como microorganismos entendem-se células procariõticas, isto é bactérias gram-negativas ou gram-positivas e células euca riõticas como protozoários, algas, fungos ou espécies superiores. Como hospedeiros preferidos referem-se de entre as bactérias gram-negativas em particular as Enterobacteriaceae, por exemplo E. coli, de entre as bactérias gram-positivas as Bacillaceae e Micrococcaceae apatogênicas, por exemplo B. subtilis e Staph. carnosus, de entre os eucariotes os Ascomyceten em particular as leveduras, por exemplo Saccharomyces cerevisiae.
Existem à disposição um grande nume ro de vectores de partida para microorganismos unicelulares, que podem ser tanto de origem plasmidica como de origem virai. Estes vectores podem existir como cópias simples ou como vectores multicõpia. Os vectores deste tipo, adequados à clonagem e expressãc do hMn-SOD de acordo com a invenção como em geral para sequências de DNA eucariótico, encontram-se descritos em numerosas publi cações e manuais (por exemplo Maniatis, T. et al. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Glover, D.M. (ed.) DNA Cloning Vol. I, II, 1985) e podem obter-se comercialmente.
Podem utilizar-se em geral vectores plasmídeos, que contêm geralmente uma origem de replicação e sequências de controlo para a transcrição, translacção e expressão, em ligação com estes hospedeiros. Estas sequências devem provir de espécies que sejam compatíveis com as células hospedeiras. O vector possui normalmente, para além de uma posição de replicação, sequências de reconhecimento adicionais que permitem uma se lecção fenotípica nas células transformadas. A selecção pode ocor rer quer por complementação, por supressão, quer por inactivação
de um marcador. Em relação aos dois primeiros processos menciona' dos referem-se mutantes auxotropicos de bactérias e leveduras, que são deficientes num produto metabólico essencial, ou mutanI tes nonsense nos quais ocorre uma quebra de cadeia por trans- i
Λ 9* >
lacçao do gene em causa. Conhecem-se vários genes supressores, ί por exemplo supD, E, F (suprimem UAG), supC, G (suprimem UAG ou ' UAA) .
_2, 95 (1977). 0 pBR322 contêm genes resisNo caso do terceiro processo o vec tor possui um gene resistente a um ou mais agentes citotóxicos, como por exemplo antibióticos e metais pesados. Por meio da inserção de um DNA estranho num tal gene marcador consegue-se a inactivação deste, de modo que o novo fenõtipo obtido se pode distinguir do fenõtipo original.
Por exemplo pode transformar-se E coli com pBR322, um plasmídeo resultante de espécies de E. coli (Bolivar et al., Gene tentes ã ampicilina e à tetraciclina fornecendo assim um meio pa ra a identificação de células transformadas em que, por clonagem por exemplo na posição PstI do gené da ^-lactamase, se converte * 3* 3S S 3?
o fenõtipo Ap , Tc em Ap , Tc . Podem utilizar-se igualmente ou tros processos em que é por exemplo significativa a inactivação do gene de lacZ em vectores JV e M 13 bem como em vários plasmídeos (por exemplo pUC, pUR). cetados são conhecidos desde de volume de literatura.
Estes sistemas de selecção multifahâ muito e sobre eles existe um grari marcadores de seos vectores de exPara além destes lecção, os vectores deste tipo, em particular pressão', devem possuir sequências de sinal que garantam uma iniciação e terminação correcta da transcrição. Para a transcrição correcta do gene de hMn-SOD estes vectores podem por isso conter uma unidade de transcrição bacteriana ou eucariõtica, constituí-! da por um promotor, pela região de codificação com o gene do hMní -SOD e pelo terminador que se lhe segue. Conforme a natureza unidades de transcrição podem utilizar-se estas sequências - pro tõtipo conservativas, como por exemplo Pribnow-Box ou sequências
TTG ou ainda CAAT-Box, TATA-Box, que contém sinais de terminação conhecidos (por exemplo AATAAA, TATGT), e ainda pelo menos um co dão de finalização, sendo de preferir em relação ao hospedeiro das
Ί A
promotores e terminadores homólogos. 0 mRNA formado contém habi-! tualmente uma sequência 3'-poli(A) e/ou uma estrutura 5’-cap. Pa) ra a translacção do gene do hMn-SOD ê necessário uma posição de i ligação ribossomal (RBS), constituída por uma sequência Shine/ /Dalgarno (S/D), e por um codão de iniciação colocado em relação a ela numa distância definida de cerca de 3 a 12 nucleõtidos, bem como pelo menos por um codão de paragem. Alternativamente, ( podem preparar-se RBS's sintéticos, aumentando-se assim a homolo! gia com o extremo 3’ do rRNA 16S (Jay> E. et al., Nucleic Acids j Res. 10, 6319-6329, 1982). I
Em particular em sistemas de expres| são eucarõticos (por exemplo S. cerevisiae) devem empregar-se de, preferência sistemas de regulação para a translacção da mesma ! origem, uma vez que nas leveduras não existem composições anãlo-i gas às dos procariotes (homologia da sequência S/D com o extremoj 3' do rRNA 16S) e os sinais ou o RBS para a iniciação da trans- ι lacçao se definem de um modo diferente do dos procariotes (por : exemplo Kozak, M., Nucleic Acids Res. 5233-5252, 1981; Kozak, M. J. Mol., Biol. 156, 807-820, 1982).
De preferência, o vector de clonagem ou de expressão possui apenas uma posição de reconhecimento J para a endonuclease de restrição, que ou já existe previamente no vector de partida ou pode ser introduzido posteriormente por | meio de agentes de lincagem apropriados. Os agentes de lincagem podem sintetizar-se facilmente por via química ou obtêm-se comer cialmente.
Os promotores de levedura frequente mente empregues na preparação dos plasmídeos de expressão corre£ pondentes contêm promotores particularmente eficazes na regula- í ção da expressão no sistema levedura, como por exemplo o promo- ) tor PGK (Tuite, M.F. et al., The EMBO Journal 1, 603-608, 1982; Hitzeman, R.A. et al., Science 219, 620-625, 1983), PH05 o promo tor (Hinnen, A., & Meyhack, B., Current Topics in Microbiology and Immunology 9(5, 101-117, 1982; Kramer, R.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 367-370, 1984), o promotor GAPDH (Urdea; M.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 7461-7465, 1983) o promotor GAL10 (Broach et al. Experimental Manipulation of Gene
Ί C
Expression 83-117, 1983), o promotor de enclase (ENO)(Holland, ί M.J. et al. J. Biol. Chem. 256, 1385-1395, 1981), o promotor de ί Factor o<. (Bitter, G.-A. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 5330-5334; Yakota, T. et al. Miami Winter Symp. 17. Meet, Adv. ί Gene Technol. 2, 49-52, 1985)) ou o promotor ADHI (Ammerer, G., j Methods in Enzymology 101, 192-201, 1983; Hitzeman, R.A. et al. : Nature 293, 717-722, 1981). ]
São também apropriados promotores de outros enzimas glicollticos ((Kawasaki e Fraenkel, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108, 1107-1112, 1982), como hexoquinase, des] ί carboxilase de piruvato, fosfofrutoquinase, isomerase de 6-fosfaí to de glucose, isomerase de fosfoglucose e glucoquinase. Na consj trução de plasmídeos de expressão apropriados podem utilizar-se | também as sequências de terminação associadas com estes genes no vector de expressão no extremo 3' da sequência a exprimir, de modo a possibilitar-se a poliadenilação e a terminação do nRNA. Outros promotores, que têm alêm disso a vantagem da transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras da 2-desidrogenase de álcool, do isocitocroma C, dos enzimas a degradar, que se encontram ligados ao metabolismo do azoto, da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato acima mencionada (GAPDH) e dos enzimas responsáveis pela metabolização da maltose e da galactose. Os promotores regulados pelo Locus do tipo Mating das leveduras, por exemplo os promotores dos genes BARI, MECI, STE2, STE3, STE5, podem empregar-se em sistemas regulados pela temperatura utilizàndo mutações sir dependentes da temperatura (Rhine, Ph. D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon! (1979), Herskowitz e Oshima, The Molecular Biology of the Yeast I Saccharomyces, parte I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Labo-| ratory). j
Estas mutações influenciam a express) são das cassetes do tipo Mating em repouso de leveduras e desse modo, indirectamente, os promotores do tipo Mating dependentes. Contudo, ê em geral apropriado qualquer vector plasmídeo que con tenha um promotor de levedura compatível e sequências de replica ção e de terminação originais.
Para o caso de a expressão do hMn-SOD se efectuar em bactérias, empregam-se de preferência promo-i tores que condicionam uma elevada percentagem de síntese de mRNA[ e que além disso se podem induzir. i
Os promotores utilizados conhecidos, contêm os sistemas promotores de beta-lactamase (Penicilinase) e^ de Lactose (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Itakura et al. Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979); incluindo o promotor UV-5 (Silverstone, A.E. et al., Proc. Natl< Acad. Sei. USA 66, 773-779, 1970) e o sistema promotor de tripto l· fano (trp)(Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); rei i gisto europeu, pedido n9. 0036 776). Desenvolveram-se ainda e í aplicaram-se outros promotores microbianos. A sequência genética para o hMn-SOD pode transcrever-se por exemplo sob controle do promotor Lambda-PL. Este promotor ê conhecido como um dos promotores particularmente fortes e controláveis. O controle ê possível por meio de um repressor cl termolãbil (por exemplo cl 857) do qual se conhecem as posições de corte por restrição vizinhas. Além disso pode ainda utilizar-se o promotor da fosfatase alcali na de E. coli (Ohsuye, K. et al., Nucleic Acids Res. 11, 1283-1294, 1983) e promotores híbridos, como por exemplo o promotor tac (Amann, E. et al. Gene 25, 167-178, 1983; De.Boer, H.A. et . al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 21-25, 1983). Sobre a utilização de tais promotores suportados (lacuv5, lacZ SD, tac) ou so bre vectores para a preparação de proteínas eucarióticas de fusão e de não fusão em E. coli, pode ainda encontrar-se referências bibliográficas em T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, em particular na pag. 412f. A expressão e translacção de uma sequência de hMn-SOD em baetê- I
I rias pode decorrer também sob o controle de outros sistemas de 1 regulação, que se podem considerar homólogos ao organismo na ι sua forma não transformada. Por exemplo, podem utilizar-se tam- I bêm sistemas de promotor operador como operador de arabinose, | operador de colicina El, operador de galactose, operador de fosfatase alcalina, operador trp, operador de xilose A, entre outros, ou partes destes.
Para a clonagem ou para a expressão • do hMn-SOD em bactérias, por exemplo em Ξ. coli, ou em leveduras.
por exemplo em S.
conhecidos, de entre os quais, para os sistemas hospedeiros men-| cionados em primeiro lugar, se podem empregar com vantagem o pBR, !
(Bolivar, F. et al.., Gene 2, 95-113, 1977), o pUC (Vieira, I.; !
Messing, I., Gene 19, 259-268, 1982), o pOP (Fuller, F., Gene 19, 43-54, 1982), o pAT (Windass, J.D. et al., Nucleic Acids Res. 10_, 6639-6657, 1982), o pHV-plasmídeo (Ehrlich, S.D., Proc. Natl. ;
Acad. Sei. USA 7J5, 1433-1436, 1977), vectores Lambda incluindo plasmídeos (Brenner, S. et al., Gene 17, 27-44, 1982), cosmídeos (Collins, J., Hohn. B., Proc. Natl, Acad. Sei. USA 75, 4242-4246, 1979) e outros vectores conhecidos da literatura (por exemplo Ma niatis, T. et al,, Molecular Cloning, Cold Spring Habor LaboratcH ry, 1982), em particular derivados de pBR e de pUC, por exemplo o pBR322.
Como vectores de expressão em leveduras encontram-se os vectores integrantes (YIp), replicantes (YRp) e epissomais (YEp) (Struhl, K. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 1035-1039, 1979; Stinchcomb, D.T. et al., Nature 282, 39-43, 1979; Hollenberg, C.P., Current Topics in Microbiolo gy and Immunology 96, 119-144, 1982), de preferência YEpl3 (Broach, J.R. et al., Gene 8_, 121-133, 1979), YIp5 (Struhl, K. et al. 1979, vide acima, ATCC 37061), bem como pJDB207 (DSM 3181) ou pEAS102. O vector pEAS102 pode obter-se digerindo YIp5 parcialmente com PstI e totalmente com BamHI e ligando o fragmento de 4.3 kb isolado (que contêm o gene URA3) com o fragmento BamHI/ /PstI de 4.4 kb de pJDB207.
Para alêm dos microorganismos, as culturas de organismos multicelulares são também hospedeiros ade quados para a expressão do hMN-SOD. Em princípio pode utilizar- ; -se qualquer destas culturas, quer se trate de culturas célula- i i res de vertebrados ou de invertebrados. Existe contudo um maior interesse em células de vertebrados, uma vez que a multiplicação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) se tor nou um processo de rotina nos últimos anos (Tissue, Culture, Aca demic Press, Kruse e Patterson, Editors, 1973). Exemplos destas linhas de células hospedeiras com utilidade são as células VERO e HeLa, células de ovos de hamster dourado (CHO) e W138, BHK e
- is _
linhas celulares COS-7 e MDCK. Os vectores de expressão para estas células contêm habitualmente uma origem de replicação, um promotor localizado antes do hMn-SOD a exprimir, uma posição necessária à ligação dos ribossomas, um sinal de junção de RNA, po sições de poliadenilação e sequências de terminação transcricionais.
I
Na utilização de. células de animais) mamíferos as funções de controle nos vectores de expressão são frequentemente exercidas por material virai. Por exemplo, os pro motores habitualmente utilizados provêm de virus de Papova como virus de Polyoma e de Papilloma, virus Simian 40 (SV 40) e retro virus e adenovirus do tipo 2. Os promotores iniciais e tardios ! do SV 40 e a sua aplicação encontram-se descritos em numerosas publicações. Além disso ê possível e muitas vezes aconselhável aj utilização de sequências promotoras ou de controle, originalmente ligadas com as sequências genéticas desejadas, desde que estas sequências ,de controle sejam compatível com o sistema de cêlulas hospedeiras. Conhecem-se assim vectores SV 40 nos quais um DNA eucariõtico exógeno, com as suas próprias sequências promoto ras e sinais de junção, na vizinhança do promotor SV 40 tardio, origina uma transcrição estável.
Uma origem de replicação pode obter -se por meio de uma construção de vector apropriada, de modo a conter um ponto de partida exógeno, por exemplo de SV 40 ou de outras fontes virais (por exemplo Polyoma, Adeno, VSV, PBV, etc.) ou pode ser fornecida pelos mecanismos de replicação cromossomais da célula hospedeira. No caso de se integrar o vector no cromossoma da célula hospedeira, ê normalmente suficiente a ulti ma condição mencionada.
A transformação das células com os veículos pode conseguir-se através de um grande número de proces sos. Por exemplo, pode efectuar-se por meio de cálcio, lavando-se as células em magnésio e adicionando-se o DNA às células em suspensão em cálcio, ou expondo-se as células a um coprecipitado de DNA e fosfato de cálcio. Na expressão subsequente dos genes transferem-se as células para meios selectivos para as células transformadas.
ί α
pode isolar-se o enzima separando por centrifugação as células | apôs atingirem uma densidade celular apreciavelmente elevada e abrindo-as em seguida por via enzimãtica ou mecânica. A purifica ção do hMn-SOD de acordo com a invenção pode efectuar-se por meio de processos bioquímicos conhecidos para a purificação de proteínas ou de enzimas, como por exemplo diãlise, electroforese, precipitação, cromatografia ou combinação destes métodos. Quando o enzima é segregado pela célula utilizam-se processos análogos para a purificação de proteínas, de modo a obter o hMn-SOD numa forma pura a partir do meio de cultura.
hMn-SOD, de acordo com a invenção purificado por estes métodos apresenta um espectro de actividades biológicas idêntico ao do enzima genuíno, in vivo e in vitro, De entre estas actividades contam-se tanto as propriedades imuno lógicas (por exemplo reacção cruzada com anticorpos de hMn-SOD genuíno em relação ao hMn-SOD de acordo com a invenção) como ain da as actividades bioquímicas e enzimãticas. Para a caracterização bioquímica e enzimãtica do hMn-SOD pode seguir-se por exemplo a técnica de Marklund, S. (Marklund, S. e Marklund, G., Eur J. Biochem. 47, 469-474, 1974), através da qual se pode distinguir estritamente também entre os enzimas que contêm Cu/Zn e Mn, por exemplo por adição de KCN (inibe o Cu/Zn-SOD mas não o Mn-SOD) ou por meio das diferentes dependências dó pH das suas actividades (vide em particular: Ysebaert-Vanneste, M., Vanneste, W.H., Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980).
polipêptido de acordo com a inven ção não se trata exclusivamente do hMn-SOD maduro, que se encontra descrito em pormenor, mas também de qualquer modificação des: te enzima. Estas modificações incluem por exemplo o encurtamento da molécula nos extremos N- ou C-terminais, substituição de aminoãcidos por outros grupos, através das quais não se modifica a actividade enzimãtica na sua essência.
objectivo da invenção são não ape nas sequências genéticas que codificam especificamente para o hMn-SOD descrito e apresentado como exemplo, mas também modifica ções que se podem obter por meio de métodos de rotina como mutação, degradação, transposição ou adição. Qualquer sequência que codifique para o hMn-SOD de acordo com a invenção (isto ê, que apresente o espectro de actividade biológica característico e co nhecido) e que seja degenerado em comparação com o apresentado, estã também incluída; os especialistas neste domínio são capazes de degenerar as sequências de DNA, em particular as das regiões codificantes. Inclui-se também qualquer sequência que codifique para um polipeptido com o espectro de actividades do hMn-SOD autêntico e que hibridize com as sequências indicadas (ou com partes destas) em condições bem definidas.
Ê conhecido da técnica em que condi ções definidas se deve conduzir uma hibridação (incluindo pré-laÍ vagem, pré-hibridação, hibridação, lavagem) de modo a obter con-í dições adequadas. Para a hibridação de oligonucleotidos num banco de genes (gene bank screening) deve proceder-se de preferên cia sob as condições de Wood, I.M. et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA j82, 1582-1588, 1985). Para se testar se uma determinada sequência de DNA hibridiza com uma das sequências de DNA de acordo com a invenção que codificam para o hMn-SOD quer via hibridação in situ em placas ou em colónias de bactérias, quer via Southern -Blotting - devem utilizar-se os métodos e as condições descritas detalhadamente por Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cóld Sping Harber Laboratory, 1982, em particular pãgs. 326-328 e 387-389). Todos os sinais que sobressaem claramente do substracto apresentam em consequência disso um sinal de hibridação positivo.
Os objectivos anteriormente mencionados resolvem-se mais especificamente preparando o RNA a partir de tecidos humanos, de preferência a partir de tecidos de placen ta humana. Enquanto que a abertura das culturas dos tecidos celu lares se pode efectuar directamente com fenol aquente, devem triturar-se os tecidos para este tipo de extracção no estado de liofilizados, com vantagem, na presença de gelo pulverizado ou moldo ou de azoto liquido (por exemplo num Starmix). Os agregados formados por acção do fenol, entre o mRNA’s, podem dissolver -se de novo em formamida ou por aquecimento (por exemplo a 659
C). Um processo preferido para o isolamento de RNA ê o de Chir- gwin (Chirgwin, J.M, et al., Biochemistry 18, 5294-5299, 1979). +
RNA poly(A) pode isolar-se a partir do preparado purificado de proteína e de DNA, por conveniência por meio de cromatografia de afinidade, por exemplo em poly(U)-Sepharose ou Oligo (dT)-Cellulose, uma vez que, em geral, as populações de mRNA eucariõtico apresentam uma cauda de poly(A) nos seus extremos 3' (Aviv, H., Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 68, 1409-1412, 1972; Lindberg, U., Persson. T., Europ. J. Biochen. 31, 246-254, 1972). Para o isolamento do poly(A)+-RNA pode proceder-se de preferência de acordo com o método de Auffray, C., Rougeon, F., Eur. 107] 303-314, 1980) .
Pode conseguir-se um enriquecimento do mRNA purificado separando a fracção de nRNA recolhida, de acordo com o seu tamanho, por exemplo por centrifugação num gradi ante de sacarose. O mRNA desejado pode identificar-se por exemplo por meio de sistemas conhecidos de biossíntese de proteínas in vitro (reticulõcitos, oêcitos de Xenopus laevis).
O mRNA purificado ou a fracção enri quecida servem como.templato para a síntese da primeira cadeia do cDNA, que se efectua por meio da transcriptase reversa e de um Primer.'Como Primer pode utilizar-se um oligo-primer (dT) ou um Primer sintético, podendo este último derivar-se da conhecida sequência de aminoácidos do hMn-SOD, permitindo a repeti ção do Primer na transcrição reversa (Uhlen, M. et al., EMBO Jdurnal 1, 249-254, 1982).
Na presente invenção iniciou-se a síntese da primeira cadeia do cDNA com oligo (dT)12-18 como Pri mer na presença de dNTPs.
Para a síntese da segunda cadeia do cDNA podem empregar-se vários métodos conhecidos., de entre os quais se referem por exemplo a iniciação com um Primer complementar (Rougeon, F., Mach, Β., J.Biol. Chem. 252, 2209-2217, 1977), a auto-iniciação com base numa estrutura de gancho de ca belo ligada ao extremo 3’ do cDNA (Efstratiadis, A. et al., Cell Ί_, 279, 1976) ou com um primer análogo ao fragmento de Okazaki formado por RNaseH (Gubler, U., Hoffmann, B.J., Gene 25, 263, 1982). Na presente invenção preferiu-se o método descrito
Rn»
por Huynh, T.V. et al., em DNA Cloning Vol. I, ed. D.M. Glover), cap. 2, pag. 49-78, 1985). 0 cDNA de cadeia dupla assim obtido pode clonar-se ou armazenar-se directamente num vector apropriado, por exemplo num cosmldeo, num vector de inverçao ou de substituição, em especial num vector Lambda, de preferência em ^gtlO (Huynh, T.V. et al., 1985). Para a clonagem em vectores Lambda pode dispôr-se de vários métodos conhecidos, de entre os quais se referem por exemplo o homopolymertailing por meio de dA-dT ou dC-dG ou o método de lincagem com agentes de lincagem sintêti cos (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Huynh, T.V. et al. DNA cloning Vol. I (D.M., Glover ed.) 1985, 1980; Watson, C.J., Jackson, F. idem, 1985, cap. 3). No caso da clonagem do cDNA de acordo com a invenção in seriu-se este na posição EcoRI de ^.gtlO. O armazenamento in' vitro e a clonagem do cDNA de acordo com a invenção ou a construção do banco de genes de cDNA efectuou-se de acordo com Huynh, T.V. et al. 1985, pag. 49-78.
Com a população de fogos obtida, re presentando um banco de genes de cDNA de tecidos da placenta, efectuou-se a amplificação e a purificação em placas através da infecção de um’hospedeiro adequado, em especial de E. coli, de preferência E. coli C 600 ou assegurando o ciclo de crescimento lítico do lambda.
banco de genes de cDNA pesquisou-se com oligonucleitidos sintéticos, marcados.radioactivamente, derivados das sequências de aminoácidos publicadas (Barra, D. et al., Oxy Radicais and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1983), em condições de hibridação estritas. Na presente invenção utilizou-se o processo de hibridação in situ de acordo com Benton e Davis (Benton, W.D., Davis, R.W., Science 196, 180-182, 1977). Preferiram-se duas misturas de oito oligonucleõtidos sintéticos cada, com 23 membros, de formulas Va e Vb, colineares com os aminoácidos·39 a 46 ou 200 a 207 das sequências de aminoâcidos publicadas por Barra, D. et al. (vide acima) e que obdecem ã degeneração do código genético. A cada uma das ultimas bases do extremo 5’ destas sondas de DNA falta a base Wobble para • o codão completo para Gin (aminoácido 46) ou Glu (aminoácido 207 .
dos correspondentes e I é inosina.
5' TGITA^TT^TC^TCIGTIACITT
Formula Va
5· tcigtiacXtccca^jtiat
Fórmula Vb
As sondas de oligonucleõtido podem preparar-se de acordo com processos de síntese química por si co nhecidos. Para a presente invenção utilizou-se um sintetizador dé DNA modelo 38IA (Applied Biosystems).
A síntese de todas as combinações possíveis destas duas sondas de DNA assegura que pelo menos um dos oligonuclèótidos presentes emparelha idealmente com a região de DNA de cadeia simples, complementar à da sonda, do gene de hMn-SOD procurado. A utilização de dois conjuntos independentes de oligonuclèótidos de 23 membros diminui a possibilidade de erros na pesquisa. .
Após o isolamento em placas homogéneas, que se identificaram pelos sinais positivos apos hibridação com as duas sondas de DNA de 23 membros, conseguiram isolar-se sete fogos recombinantes e a partir dos respectivos DNA sequenciaram-se fragmentos de EcoRI com 500 a 1000 bp de comprimen to. Após analise sequencial destes fragmentos de EcoRI, de acordo com o método de Sanger (Sanger et al., Proc., Natl., Acad. Sei. USA 74, 5463-5467, 1977; Sanger·, F. et al. FEBs Letters 87, 107-111, 1978) e após subclonagem na posição de EcoRI do vector M13 (Bluescribe, Vector Cloning Systems) e transformaçao em E. coli, por exemplo em E. coli JM101, descobriu-se que os fragmentos de EcoRT continham inversões de cDNA, que codificam para o hMn-SOD a partir do aminoácido 22 (Clono BS5, BS8, BS9, BS13, BSXIII) ου a partir do aminoácido 26 (Clono BS3, BS12).
Contudo, descobriu-se também surpreendentemente que se verificam alguns desvios ã sequência de aminoácidos de Barra, D.
as de DNA identificadas:
Clono Aminoâcido Codão Aminoãcido diferen te Aminoácido segunda Barra, D. et al., 1984
BS3, BS12, 29 CaG Gin Lys (29)
BS5, BS9, BS13
BSXIII 29 AAG Lys Lys (29)
BS3, BS12, BS13, 42 GAG Glu Gin (42)
BS5, BS9
BSXIII 88 GAG Glu Gin (88)
29 AAG Lys Lys (29)
42 GAG Glu Gin (42)
88 GAG Glu Gin (88)
BS8 109 GAG Glu Gin (109)
124 GGT Gly Δ
125 TGG Trp Δ
139 GAA Glu Gin (129)
A sequência de DNA de um fragmento de EcoRI com 617 bp de comprimento, que se pode isolar a partir de um clono obtido, por exemplo a partir de BS8, encontra-se representada na Fig. 1. 0 fragmento de EcoRI contêm uma sequência com 532 bp de comprimento codificante para hMn-SOD, bem como uma região não translaccionada com 51 bp de comprimento, incluindo uma cauda de poly(A)gg. Os componentes das sequências de lincagem encontram-se também representados até as posições (completas^ de EcoRI.
As posições 30 a 33 apresentam uma posição de corte Thal e nas posições 367 a 372 reconhece-se uma posição BamHI. Surpreendentemente, encontram-se codões nas posi' ções 53 a 61, 155 a 163, 176 a 184, bem como 500 a 508, que são . colineares para posições de N-glicosilação potenciais dos amino-
dos gerais, para tal caracteristicas, Asn-X-Thr ou Asn-X-Ser, em que X ê por exemplo valina, histidina ou leucina, apresentando apenas uma destas combinações de aminoácidos para o Cu/Zn-SOD.
Já se mencionaram anteriormente as I diferenças de aminoácidos, em relação ã sequência de aminoãcidosj de Barra, D. et al. (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595 -12601, 1984), existentes nos fragmentos de EcoRI obtidos.
Para se obterem as bases que faltam nos terminais 3’ e/ou 5’ da sequência parcial de DNA do hMn-SOD, a partir do banco de genes de cDNA para a preparação de um gene completo de hMn-SOD, podem seguir-se várias estratégias. Por exemplo, pode utilizar-se o cDNA obtido como sonda de hibridação num banco de genes genõmico, de modo a obter-se a sequência que codifica para o enzima completo, ou procede-se por exemplo de acordo com o método de Kakidani, H. utilizando-se oligonucleótidos sintéticos, complementares ao mRNA, como Primer específicos para a transcrição reversa (Kakidani, H. et al. Nature 298, 245-249, 1982). É contudo também possível sintetizar por via quí mica o extremo que falta à sequência de cDNA em relação à sequên cia de aminoácidos conhecida (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984) e ligã-lo ao cDNA encontrado, obtendo-se um extremo definido.
No processo mencionado em último lu gar, para a preparação da sequência de DNA completa, de acordo com a invenção, para o hMn-SOD, completou-se o extremo 5' por meio de dois oligonucleõtidos de fórmulas Via e VIb, que possuem por conveniência, extremos aguçados Xhol/Xbal ou Xbal/Ncol. De acordo com a invenção, no extremo 5’ da cadeia codificante, considerou-se o extremo 3' do promotor ADHI (fórmula Via).
5 TCGAG TATACA ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG
C ATATGT TAC TTC GTG AGA AAC GGT CTG AAG
Xhol
CCA TAC GAC TAC GGT GCT
GGT ATG CTG ATG CCA CGA GATC
Xbal
Fórmula VIa
CTAGAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA ί
I
TT GGT GTG TAG TTG CGA GTT TAG TAC GTT |
Xnal
TTG CAC CAC TCT AAG CAC
AAC GTG GTG AGA TTC GTG GTAC
Ncol
Formula VIb
Após combinação dos dois oligonucleótidos sintéticos de fórmulas Via e VIb, clonagem num vector adequado, por exemplo num derivado de pUC18 modificado conve nientemente, e introdução do fragmento Thal/EcoRI do cDNA, de acordo com a invenção, de um dos clonos obtidos, cujo extremo 5' apresenta pelo menos uma posição Thal, pode obter-se um plasmídeo que contém um cDNA completo do gene de hMn-SOD, na ordem de leitura correcta, de acordo com as fórmulas Vila e Vllb, sem a posição Thal.
5' ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG CCA TAC GAC TAC GGT GCT CTA
GAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA TTG CAC CAC TCT AAG
CAC CAT GCG GCC TAC GTG AAC AAC CTG AAC GTC ACC GAG GAG AAG
TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG GGA GAT GTT ACA GCC CAG ATA GCT
CTT CAG CCT GCA CTG AAG TTC AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT CAT
AGC ATT TTC TGG ACA AAC CTC AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC
AAA GGG GAG TTG CTG GAA GCC ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC TTT
GAC AAG TTT AAG GAG AAG CTG ACG GCT GCA TCT GTT GGT GTC CAA
GGC TCA GGT TGG GGT TGG CTT GGT TTC AAT AAG GAA CGG GGA CAC
TTA CAA ATT GCT GCT TGT CCA AAT CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA
ACA GGC CTT ATT CCA CTG CTG GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT
TAC TAC CTT CAG TAT AAA AAT GTC AGG CCT GAT TAT CTA AAA GCT
ATT TGG AAT GTA ATC AAC TGG GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAC ATG
GCT TGC AAA AAG TAA
Formula Vila
i
5' ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG CCA TAC GAC TAC GGT GCT CTA
GAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA TTG CAC CAC TCT CAG
CAC CAT GCG GCC TAC GTG AAC AAC CTG AAC GTC ACC GAG GAG AAG
TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG GGA GAT GTT ACA GCC CAG ATA GCT
CTT CAG CCT GCA CTG AAG TTC AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT CAT
AGC ATT TTC TGG ACA AAC CTC AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC
AAA GGG GAG TTG CTG GAA GCC ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC TTT
GAC AAG TTT AAG GAG AAG CTG ACG GCT GCA TCT GTT GGT GTC CAA
GGC TCA GGT TGG GGT TGG CTT GGT TTC AAT AAG GAA CGG GGA CAC
TTA CAA ATT GCT GCT TGT CCA AAT CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA
CAC GGC CTT ATT CCA CTG CTG GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT
TAC TAC CTT CAG TAT AAA AAT GTC AGG CCT GAT TAT CTA AAA GCT
ATT TGG AAT GTA ATC AAC TGG GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAC ATG
GCT TGC AAA AAG TAA
Formula Vllb
A sequenciação dos clonos BS5, BS9, BS13, BSXIII, bem como dos clonos BS3 e BS12 mostrou que as sequências dos clonos BS5, BS9, BS13 e BSXIII são idênticas à do clono BS8. Os clonos BS3 e BS12 mostram, como jà se referiu, uma diferença no aminoácido 29 em relação ao clono BS8 (CAG em vez de AAG ou Gin em vez de Lys, formulas Ib, Illb e IVb). Tirando isso existe uma homologia de 100% ao clono BS8 atê ã base 573 do fragmento de EcoRI representado na Fig. 1 (... TA*A ACC ACG 573
ATC GTT ATG CTG ). A partir desta base ambos os clonos BS3 e BS12 são idênticos no que respeita à região 5’-ut (não translaccionada) indicada na fórmula VIII.
5' AAG CAC TCT ... /Fórmula Illb/ ... AAA AAG TAA ACC ACG ATC GTT ATG CTG AGTAT GTTAA GCTCT TTATG ACTGT TTTTG TAGTG GTATA
GAGTA CTGCA GAATA CAGTA AGCTG CTCTA TTGTA GCATT TCTTG ATGTT
GCTTA GTCAC TTATT TCATA AACAA CTTAA TGTTC TGAAT AATTT CTTAC
TAAAC ATTTT GTTAT TGGGC AAGTG ATTGA AAATA GTAAA TGCTT TGTGT
GATTG AATCT GATTG GACAT TTTCT TCAGA GAGCT AAATT ACAAT TGTCA
TTTAT AAAAC CATCA AAAAT ATTCC ATCCA TATAC TTTGG GGACT TGTAG
GGATG CCTTT CTAGT CCTAT TCTAT TGCAG TTATA GAAAA GTAGT
CGACCATGCGGAATTC
Agente de lincagem
EcoRI
Fórmula VIII
nos de cDNA de um banco de genes de cDNA (Placenta) por meio de ί J(gtll. A preparação deste banco de genes de cDNA efectuou-se de!
i modo análogo ao da preparação do banco de genes de cDNA, a par- i tir de DNA de placenta em AgtlO, descrita nos exemplos. Um destes clonos isolados a partir de Agtll, o clono 4, subclonou-se, também como descrito, em Bluescribe M13+. A sequenciação efectuou-se por Priming repetido com os oligonucleótidos sintéticos de 17 membros: ί
EBI 760 : 5’ AGATACATGGCTTGCAA 3'
EBI 765 : 5' CTCTGAAGAAAATGTCC 3'
EBI 782 : 5' GGAGATGTTACAGCCCA 3’
EBI 785 : 5' AAGGAACGGGGACACTT 3'
0 clono 4 é idêntico , até ao amino-
ácido 29 (AAG ou Lys) e a uma sequência ... TCTA·... no extremo
3' a seguir à posição de multiclonagem, aos clonos BS3 e BS12 de gtlO. Embora a sequência de DNA avalisada das 61 bases restantes no extremo 5' (antes da fórmula Ia, clono BS8, correspondente aos codões +1 a +21 ou a Lys a Glu) apresente algumas mudan- I ças de bases em relação ã sequência de DNA derivada (fórmula II,| contida na fórmula Illb), da tradução deste troço de DNA não re-l ~ í sulta qualquer diferença em relaçao a sequencia de Barra et al.,J 1984. Consegui analisar-se também uma sequência de sinal antes i Λ i do ATG. A fórmula IX mostra a sequencia do clono 4 encontrada. ·
I
EcoRI j 1K (GGGCGAATTCCAGC)
M L S R A V C G T S R Q L P
ATG TTG AGC CGG GCA GTG TGC GGC ACC AGC AGG CAG CTG CCT
-10 5 1 +1
P V * L G Y L G S R Q K H . S L
CCG GTT TTG GGG TAT CTG GGC TCC AGG CAG AAG CAC AGC CTC
+5 +10 +15
P D L P Y D Y G A L E P H I
ccc GAC CTG CCC TAC GAC TAC GGC GCC CTG GAA CCT CAC ATC
+20 +21
N A Q I
AAC GCG CAG ATC ... /Formula Ia/ ... AAA AAG TAA ACC
I
ACG ATC GTT ATG CTG AGTAT GTTAA GCTCT TTATG ACTGT TTTTG TAGTG
GTATA GAGTA CTGCA GAATA CAGTA AGCTG CTCTA TTGTA GCATT TCTTG
ATGTT GCTTA GTCAC TTATT TCATA AACAA CTTAA TGTTC TGAAT AATTT ·
CTTAC TAAAC ATTTT GTTAT TGGGC AAGTG ATTGA ΑΆΑΤΑ GTAAA TGCTT
TGTGT GATTG AATCT GATTG GACAT TTTCT TCAGA GAGCT AAATT ACAAT i
TGTCA TTTAT AAAAC CATCA AAAAT ATTCC ATCCA TATAC TTTGG GGACT !
TGTAG GGATG CCTTT CTAGT CCTAT TCTAT TGCAG TTATA GAAAA tcta ;
GGAATTCGCCC,
Agente de lincagem - EcoRI
Formula IX * Outros clonos sequenciados apresentam alanina (GCT) na posição; -9.i
Outros clonos possuem regiões 5'ut (não translaccionadas) de comprimentos diferentes.!
As sequências de DNA de acordo com · a invenção podem introduzir-se em vários vectores de expressão e\ exprimir-se por meio dos elementos de controle descritos, de pre: ferência em pES103 com o promotor ADHI (DSM 4013). O pES103 ob- j têm-se introduzindo no derivado de pUC18, pES102, que contém na posição de corte HincII um agente de lincagem Xho, o fragmento BamHI/Xhol de 1500 bp de comprimento do promotor ADHI (por exem-j pio Ammerer, G., Methods in Enzymology 101, 192-201, 1983). j
Em vez desta .sequência de promotor i ADHI originalmente com 1500 bp de comprimento pode também utili-í zar-se um promotor ADHI, encurtado de cerca de 400 bp, como fracfi mento BamHI/Xhol. O promotor ADHI encurtado (ADHIk) obtêm-se di-i gerindo o plasmídeo pWS323E (DSM 4016) com BamHI/Xhol e isolando; o promotor ADHIk. í
Para a terminação correcta liga-se · uma sequência de terminador adequada, por conveniência um terminador ADH, de preferência o terminador ADHII, atrás do hMn-SOD. i O terminador ADHII (Beier, D.R., Young, E.T., Nature 300, 724-
-728, 1982) pode obter-se por meio de digestão de pMW5-ADHII i (Washington Research Fundation) com Sphl, na forma de um fragmeni to com 1530 bp de comprimento, seguido de digestão com HincII co' i mo terminador ADHII (329 bp), ou a partir do plasmídeo pGD2 (DSMl
4014) na forma de um fragmento HindIII/Xbal com 336 bp de comprij mento. I
I
Para a expressão em leveduras exis-l i tem vários vectores de levedura ã disposição, em que se podem inj ~ i troduzir as cassetes de expressão com o gene de hMn-SOD de acor-| do com a invenção, de preferência YEpl3 (Broach, J.R. et al., Gel ne 8, 121-133, 1979; ATCC 37115), pJDB 207 (DSM 3181, depositada! em 28.12.1984), YIp5 (Struhl, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. I f
USA 76, 1035-1039, 1979; ATCC 37061), pEAS102 (pEAS102 pode ob- I ter-se digerindo YIp5 parcialmente com PstI e totalmente com BamHI e ligando o fragmento isolado com 4.3 kb, contendo o gene URA3, com o fragmento BamHI/PstI com 4.4 kb de pJDB207).
Com estes vectores de levedura con-i tendo uma cassete de expressão com o gene de hMn-SOD de acordo cóm a invenção, puderam transformar-se células de levedura apro-! priadas, de acordo com processos conhecidos. Como células de le-| vedura apropriadas.para a expressão como considerar-se de prefe-1 rência aquelas que são deficientes para o seu próprio Mn-SOD específico e que contêm um gene de levedura seleccionãvel, como ;
I por exemplo HIS3, URA3, LEU2, SUP, para mencionar só algumas. Os| mutantes deste tipo, que contêm por exemplo genes mutados cons- ; truídos in vitro ou in vivo por meio de um Transplacement, ob-; têm-se por meio de uma transformação integrativa (por exemplo I Winston, F. et al., Methods in Enzymology 101, 211-228, 1983). θ| gene de Mn-SOD de levedura a mutar está contido por exemplo no I
I plasmídeo pL41 como fragmento BamHI (van Loon et al., Gene 26, I i 261-272, 1983). Uma vez que se conhece a sequência completa des-i te fragmento BamHI (Marres, C.A.M. et al., Eur. J. Biochem. 147,i 153-161, 1985), pode obter-se o gene de Mn-SOD das leveduras mesí mo sem o pL41. !
O hMn-SOD produzido por meio de tais transformantes pode obter-se apôs métodos conhecidos de isoi • lamento e de purificação de proteínas. A abertura das células po; •5 Ί de efectuar-se por exemplo de acordo com o método de van Loon et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 3820-3824, 1986).
Para a expressão do hMn-SOD em bactérias, de preferência em E. coli, por exemplo em E. coli HB101, C600, ou JM101, existem à disposição os sistemas de expressão jã mencionados e estabelecidos. As sequências de DNA de acordo com a invenção devem utilizar-se para este fim, sob controle de um forte promotor de E. coli (vide acima), mas não sob controle de um promotor eucariôtico. Exemplos de tais promotores conhecidos são lac, lacuv5, trp, tac, trp-lacuv5, PT, ompF., bla. A utiliza ção obrigatória de uma posição de ligação ribossomal, de modo a garantir uma translacção eficiente em E. coli, foi jã mencionada anteriormente.
Para a verificação da expressão da actividade do hMn-SOD por meio da E. coli, colocam-se as bactérias apôs a incubação, num meio de cultura habitual apropriado e testa-se a camada superior em relação à actividade do hMn-SOD, como descrito (por.exemplo em Marklund, S., Marklund, G., 1974; Beauchamp e I. Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276-287, 1971; H.P. Misra e I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys. 183, 511-515, 1977; B.J. Davis, Annals of the NY Academy of Sciences 121, 404-427, 1964; M. Ysebaert-Vanneste e W.H. Vanneste, Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980).
A identificação do gene de hMn-SOD expresso pode também efectuar-se por meio de marcação das protei nas em maxicélulas. As proteínas codificadas por plasmideos podem marcar-se selectivamente in vivo utilizando a técnica das ma xicélulas (Sanear, A. et al., J. Bacteriol, 137, 692-693, 1979). A estirpe de E. coli CSR603 (CGSC 5830) não possui quaisquer mecanismos de reparação de DNA. Por meio de uma dose de radiação ultravioleta adequada destrói-se o cromossoma bacteriana; pelo contrário, alguns dos DNA plasmideos apreciavelmente menores e presentes em várias cópias por célula continuam funcionalmente inalterados. Após matar todas as células não lesadas e em multiplicação, por meio do antibiótico D-cicloserina, e consumo do mRNA endógeno, nas células restantes efectua-se a transcrição e translacção apenas de genes codificados por plasmideos. As pro-
temas formadas podem marcar-se radioactivamente e identificar- , 35
-se por introdução de metionina S. A E. coli CSR603 transforma, -se com os plasmídeos de expressão, de acordo com processos usu-1 ais, e selecciona-se em placas de agar contendo ampicilina sobre bactérias transformadas. A preparação das maxicélulas e a marca-ι ção das proteínas efectua-se de acordo com o processo do A. Sancar (1979, vide acima). Como padrão de peso molecular utiliza-se!
uma mistura de proteínas C-metiladas. Como controle utiliza-se o plasmídeo que contém apenas o promotor sem o gene de hMn-SOD.
Após transformação bem sucedida do ; hospedeiro, expressão do gene e fermentação ou cultura celular i em condições que são adequadas ã expressão das proteínas de acor do com a invenção, pode extrair-se habitualmente o produto por
I meio de métodos de separação cromatograficos conhecidos, de modo! a obter-se um material que contêm a proteína com ou sem sequên- í cia de sinal ou de cauda. 0 hMn-SOD de acordo com a invenção po-i de exprimir-se com uma sequência de sinal no terminal azotado,
I que, como jã se descreveu, se pode separar de algumas células hospedeiras. Quando isso não acontece, ê necessário, como também! jã descrito, uma cisão do polipêptido de sinal (quando exista), ' de modo a obter-se o hMn-SOD maduro. Em alternativa, pode modifij car-se a sequência de modo a produzir-se directamente o enzima ! maduro no microorganismo. Neste caso pode utilizar-se a sequên- !
I cia de precursor da feromona Mating de levedura MF-alfa-1, de mo;
< do a garantir-se um amadurecimento” correcto da proteína de fu-| são e a expulsão dos produtos para o meio de crescimento ou parai o espaço periplasmãtico. A distribuição do hMn-SOD em mitocôn-i drias de levedura pode efectuar-se introduzindo directamente an-| í tes do gene de hMn-SOD a sequência de sinal para o gene do Mn- j -SOD de levedura. | i As sequências de sinal apropriadas,!
por exemplo as descritas por Marres C.A.M. et àl., Eur. J. Bio- j chem. 147, 153-161 (1985) ou os seus derivados, podem ser de ori! gem natural ou isolar-se a partir de células eucarióticas apro- i priadas (por exemplo S. cerevisiae) ou ainda preparar-se por viaj sintética. Por exemplo, pode obter-se uma pré-sequência de DNA j específica para leveduras, necessária para a importação do hMn- i
-SOD na mitocôndria da levedura, por meio de ligação de oligonucleótidos sintéticos individuais. De acordo com a invenção pode introduzir-se por exemplo a pré-sequência completa entre o codão de início ATG e o primeiro codão para o primeiro aminoácido do hMn-SOD madura (Lys, por exemplo AAG) ou de uma determinada porção de um dos seus extremos N-terminais, por exemplo nas formulas II, Illa, Illb, Via, Vila, Vllb, VIII ou XI. Pode também introduzir-se uma prê-sequênçia deste tipo, directamente após o co dão de início ATG e directamente antes do primeiro codão de um DNA mutacionado em relação ã sequência genuína de DNA do hMn-SOD por meio de alteração de sequência e que codifica para uma proteína com a actividade do hMn-SOD.
Uma sequência de sinal que se pode utilizar de acordo com a invenção com o objectivo de importar um hMn-SOD na mitocôndria da levedura, é a que apreáenta a fórmula X seguinte, na qual a conhecida sequência GCA GCT (Marres, C.A. M. et al, 1985, vide acima) se substituiu por GCT GCA (ambos os tripletos codificam para alanina) e se introduziu uma posição de reconhecimento
PvuII TTCGCGAAAACAGCTGCAGCTAATTTAACCAAGAAGGGTGGTTTGTCATTGCTCTCCACCACAG CAAGGAGAACC
Formula X
De preferência, a sequência de sinal, por exemplo de acordo com a fórmula X, pode estar contida no fragmento Xhol/Xbal da fórmula Via. Consegue-se assim que este agente de lincagem de 128 bp possa estar ligado com o sinal e com o restante gene de hMn-SOD, através das posições do tipo Xhol e Xbal, e que a sequência de sinal esteja colocada directamente apôs o codão de início ATG e directamente antes do primeiro aminoácido (Lisina) do hMn-SOD.
Xhol OvuII
Início
5' TCCAGTATACAATGTTCGCGAAAACAGCTGCAGCTAA
CATATGTTACAAGCGCTTTTGTCGACGTCGATT
TTTAACCAAGAAGGGTGGTTTGTCATTGCTC
AAATTGGTTCTTCCCACCAAACAGTAACGAG
Lisina
TCCACCACAGCAAGGAGAACCAAGCACTCTTT AGGTGGTGTCGTTCCTCTTGGTTCGTGAGAAA
GCCAGACTTGCCATACGACTACGGTGCT3' CGGTCTGAACGGTATGCTGATGCCACGAGATC
Xbal i
Formula XI ;
A purificação do hMn-SOD a partir das células pode efectuar-se de acordo com processos conhecidos.i
Os enzimas hMn-SOD de acordo com a I invenção, preparados por meio de engenharia genética, são adequai dos, por um lado, devido ao seu espectro de acção bio-enzimãticaj e, por outro lado, devido às quantidades agora disponíveis de en zima de alta pureza com a maior identidade imunológica possível em relação ao hMn-SOD genuíno, para todo o tipo de prevenção, tratamento e/ou diagnostico no âmbito das doenças inflamatórias, degenerativas, neoplãsicas ou reumáticas, para o tratamento de 1 feridas, em doenças autoimunes e em transplantações, e ainda pa-l ra a prevenção e terapia de doenças provocadas por uma deficiência em hMn-SOD ou com ela causalmente relacionadas. Por exemplo,] as possibilidades de aplicação clínica abrangem as referidas por Bannister W.H. e Bannister J.V. (biologieal and Clinicai Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase, vol. 11B, Elsevier/North -Holland, 1980) e por Michelson, A.M., McCord, J.M., Fridovich (Superoxide and Superoxiddismutases, Academic Press, 1977). Além] ι disso referem-se ainda as seguintes possibilidades de aplicação clínica: feridas de perfusão, ataques de apoplexia, fígado lesado por álcool, crianças prematuras, pancreatite (eventualmente), doenças agudas das vias respiratórias (ARDs), epfizema, distur- j bios de diãlise renal, osteoartrite, artrite reumatõide, lesões provocadas por radiação, anemia celular.
Os hMn-SOD's de acordo com a inven-j
ção são ainda adequados para aumentar o tempo de conservação de ! alimentos sólidos ou líquidos. |
Os hMn-SOD's de acordo com a inven-! ~ ' - - ! ção podem administrar-se por via sistémica ou tópica, sendo adequados no primeiro caso métodos de aplicação parenteral de rotina (por exemplo i.v., i.m., s.c., i.a.) e no segundo caso formas de administração conhecidas apropriadas (por exemplo pastas, pomadas, geles, comprimidos para chupar ou mastigar, pós e outras formulações galêmicas, em veículos farmaceuticamente aceitáveis, de preparados de hMn-SOD, que possibilitem a assimilação local). Como dose terapêutica activa pode aplicar-se por exemplo, dependendo de critérios individuais (por exemplo, tipo de paciente, * gravidade da doença, etc.), cerca de 4 mg diários.
Legendas das figuras:
Fig. 1: Fragmento EcoRI do clono BS8 com a região codificante de 532 bp de comprimento a partir do aminoácido 22 do hMn-SOD maduro, a região-ut 3’ de 51 bp e a componentes sequenciais do agente de lincagem. Indicam-se as posições de N-glicosilação potenciais (sublinhadas), a posição Thal individual e a posição BamHI (sublinhada).
Fig. 2: Estratégia esquemática para a construção do plasmídeo i HSOD4, que contêm o extremo 5' sintético do gene de hMn-j -SOD como fragmento Xhol/Ncol.
Fig. 3: Cartas de restrição dos plasmídeos HSOD2 e HSOD3, bem co mo do plasmídeo HSOD4 a partir deles construído.
Fig. 4: Construção de um plasmídeo (HSOD6) com o cDNA completo para o hMn-SOD, como fragmento Xhol/EcoRI.
Fig. 5: Preparação do fragmento Thal/EcoRI do cDNA de hMn-SOD a partir do clono BS8.
Fig. 6: Construção do plasmídeo pl54/2, que contêm o promotor ADHI como fragmento BamHI/Xhol com 1500 bp.
Fig. 7: Construção do plasmídeo pl50/2 com as unidades promotor ADHI e terminador ADHII, necessárias à expressão do hMn-SOD (fragmento Xbal/HindIII de 336 bp).
Fig. 8: Acabamento dos plasmídeos finais (pKHl e pKH2) com o pro motor ADHI ou com o promotor ADHIk, respectivamente, e o τα
Fig.
Fig.
►
Fig.
Fig.
Fig.
hMn-SOD na posição Xhol/EcoRI. 0 plasmídeo pKH2 corresponde a pKHl, excepto em que o pKH2 em vez do promotor ADHI contêm o promotor ADHIk.
: Construção da cassete de expressão HSOD7 com o promotor’ ADHI encurtado com cerca de 400 bp (ADHIk). A construção com o promotor ADHI com o comprimento original efec tua-se de modo análogo a partir de pKHl.
10: Construção de plasmídeos com o gene URA3, contido no ge ne Mn-SOD de levedura, como marcador em várias orientações em relação ao gene de Mn-SOD (SODY7, SODY8), para a preparação de um mutante de Mn-SOD de levedura apro- ; priado para a expressão. A transferência do gene na corj respondente estirpe de levedura (DBY747) efectuou-se ΐ com SODY7 e SODY8.
11: Identificação, por electroforese de gel, da expressão do hMn-SOD através dos plasmídeos pWS490A e pWS491A na estirpe de levedura WS30-5g. Coluna 1: WS30-5g/pWS490Al, coluna 2: WS30-5g/pWS490A2, coluna 3: WS30-5g/pWS491Al, coluna 4: WS30-59/pWS491A2, coluna 5: Ws21-1(SOD1), con tém Mn-SOD de levedura, coluna 6: WS30-5g, colunas 7 a 10: hMn-SOD do fígado (0,3 ug coluna 8, 1,2 ug coluna j 9, 3,0 ug coluna 10). Referem-se com os numeros 1 ou 2 atrás das designações dos plasmídeos os vários transfor mados com os mesmos plasmídeos. j
12: Análise da actividade do MnSOD em extractos de levedura^ i que contêm os plasmídeos de expressão pEO24-AB, pEO25- j -AC ou pEO26-AC, por meio da separação das proteínas emj gel de poliacrilamida seguida de coloração com o-diani-i
I sidina, de acordo com métodos conhecidos: a= WS30-5g, i b= WS30-5g/pEO24-AB, c= WS30-5g/pEO25-AC, d= WS30-5g/ /pEO26AD, e= marcador (0,15 ug de MnSOD de fígado humano) .
13: Análise da actividade de MnSOD recombinante humano nas mitocondrias ou no citoplasma de 6 transformados de levedura diferentes, por meio de separação da proteína por electroforese de gel seguida por coloração com oί
- ?7 -
(CP-Extrj mitocón· a=marcador, 0,15 pg de MnSOD de fígado humano
b=CP-Extr. WS30-5g pWS490A sem 'Leader MC
c=MC-Extr. I! II II
d=CP-Extr. fl pEO24-AB com Leader MC
e=MC-Extr. II II II
f=CP-Extr. II PWS491A sem Leader MC
g=MC-Extr. II II 11
h=CP-Extr. II pEO25-AC com Leader MC
i=MC-Extr. II II II
j=CP-Extr. II pWS550A sem Leader MC
k=MC-Extr. fl 11 II
l=CP-Extr. II pEO26-AD com Leader MC
m=MC-Extr. II II 11
n=banda livre
Fig.
Fig.
o=marcador, 0,075 pg de MnSOD de fígado humano
14: Diagrama de eluição (exemplo 15, passo 5) da cromatogra fia do hMn-SOD, de acordo com a invenção, após precipitação com (NH4)2SO4 (Exemplo 15, passo 4), numa coluna de permuta catiónica Mono S (Pharmacia).
15: Gel de poliacrilamida SDS (15% de coloração prata) de amostras de hMn-SOD após vários passos de purificação:
= 4 pl de marcador (LMW-Pharmacia) 1:50 = 10 pg de extracto bruto = 10 pg após precipitação com sulfato de amónio = 9 pg apos cromatografia em Mono S
- 2,5 pg l apgs cromatografia em hidroxilapatite = 5 pg J
Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar a invenção em detalhe sem a limitarem.
Materiais utilizados:
Salvo indicação em contrário nos exemplos seguintes, utilizaram-se os seguintes materiais, soluções, plasmídeos, vectores e microorganismos:
Promotor ADHI:
DSM 4013 (pES103), depositado em (BamHI/Xhol,
1500 bp) 27.2.87
Promotor ADHI, encurtado:
DSM 4016 (pWS323E), depositado (BamHI/ /Xhol, 400bp) em 27.2.87
Terminador ADHII: DSM 4014 (pGD2), depositado em (Xbal/HindIII, 336 bp) 27.2.87
Tampão BamHI: 150mM NaCl, 6mM Tris-HCl pH 7,9, 6mM MgCl2,
100pg/ml BSA
Tampão Core: 50mM Tris-HCl, pH 8,0, lOmM MgCl2, 50 mM NaCl
Solução de desnaturação: 0,5M NaOH, 1,5M NaCl
Solução de Denhardt (50x): Ig de polivinilpirrolidona de peso molecular 360.000, lg de Ficoll, lg de albumina de soro de vitela (BSA), ãgua até ao volume de lOOml
E. coli C600: F, supE44, thil, thil, leuB6, lacYl, tonA21,à (ATCC 23724)
E. coli JMlol: supE, thi, A(lac-pro AB) , /Ϊ1 , traD36, proAB, laciqZ,AM157
Tampão de High: lOOmM NaCl, 50mM Tris-HCl pH 7,5, lOmM MgCl2, lmM ditiotreitol (DTT)
Tampão HincII: lOmM Tris-HCl pH 7,5, 60mM NaCl, lOmM MgCl2, lmM 2-mercaptoetanol, 100 pg/ml BSA
Solução de hibridação: como a solução de pré-hibridação, sem
DNA de esperma de salmão
Solução para a reacção de Klenow: 22ul DNA/H^O, 2,5pl lOx
NTR-tampão (0,5M Tris-HCl, pH 7,2, O,1M MgSO4, ImM DTT, 500 pg/ml BSA( cada Ιμΐ, . 2mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 2,5 U de fragmento de Klenow (0,5 pl)
Tampão Lambda: lOOmM Tris-HCl, pH 7,5, lOmM MgCl2, ImM EDTA
Agar LB: meio liquido LB, 15g/l Bacto-agar (Difco)
Meio líquido LB: 10g/l Bacto-Trypton (Difco), 5g/l de extracto de levedura (Difco), 5g/l NaCl, 10M NaOH até pH 7,4
Solução de ligação: 66mM Tris-HCl pH 7,6, lOmM MgCl2, 5mM DTT,
ImM ATP, 1 U de ligase de DNA-T4
Solução de neutralização: 0,5M Tris-HCl, pH 7,5, 1,5M NaCl
Filtro de nitrocelulose: Schleicher & Schuell, filtro de membrana BA 85
TampãozNruI: 50mM KC1, 50mM Nacl, 50mM Tris-HCl pH 8,0, lOmM
MgCl2
Solução de pré-hibridação: 5 x SSC, 5 x solução de Denhardt,
50mM de tampão de fosfato de sodio, pH 6,8, ImM Na^O?, ΙΟΟμΜ ATP, 0,1% SD.S, 30 - 100 (50)pg/mlde DNA de esperma de salmão, desnaturado e tratado por ultra-sons puC18: Pharmacia pURA3: DSM 4015, depositado em 27.2.87
S. cerevisiae DBY747:
a, leu2, his3, trpl, ura3 (Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley)
Meio SC-URA: 0,67% BYNB (Difco), 2% Glukose, 2% 50x AS-Mix (por litro: lg Histidin, 6g Leucin,2,5g triptofano, 4g lisina, 1,2 g adenina, 2g arginina, lg metionina, 6g fenilalanina, 5g treonina, 6g isoleucina)
Tampão Smal: lOmM Tris-HCl pH 8,0 20mM KC1, lOmM MgCl2, lOmM
2-mercaptoetanol, lOOjug/ml BSA
Tampão Sphl: lOmM Tris-HCl pH 7,5, lOOmM NaCl, lOmM MgCl2, lOmM 2-mercaptoetanol, lOOpg/ml BSA
SSC (20x): 3,0M NaCl, 0,3M Na^-citrato tri-sõdico, pH 7,0
SSPE (20x): 3,6M NaCl, 0,2MNa2HPO, 20mM EDTA, com NaOH (10N) até pH 7,4
Tampão TE: lOmM Tris-HCl pH 8,0, lmM EDTA
Tampão Thal: 50mM Tris-HCl pH 8,0, lOmM MgCl2
Agarose Top: Meio liquido LB, 0,7% de agarose (agarose Seaken
FM)
Solução de pré-crescimento: 1 M NaCl, 50mM Tris-HCl pH 8,0, lmM EDTA, 0,1% SDS.
EXEMPLO 1
Construção de um banco de genes de cDNA j
Congelaram-se em azoto liquido peda ços de tecido de placenta humana fresca, cortados em cubos, e pulverizaram-se a uma temperatura inferior a -809C. A partir do material pulverizado extraiu-se e preparou-se em seguida o RNA de acordo com o processo descrito por Chirgwin, J.M. et al. (Chir
gwin, J.M. et al, Biochemistry 18., 5294 - 5299, 1979) .
A partir do RNA assim obtido prepa-, rou-se o poly(A)+RNA de acordo com o método de Aviv, H. e Leder, P. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 1409 - 1412, 1972). A síntese^ do cDNA efectuou-se pelo método cDNA synthesis system (Amersham RPN 1256).
O empacotamento processou-se com Gigapack (Vector cloning systems). Todos os restantes passos do processo para a clonagem na posição EcoRI do gtlO efectuaram-se de acordo com a técnica de Huynh T.V. et al. (DNA Cloning ! Vol 1, D.M. Glover ed., IRL Press, Chapter 2, 1985), exceptuandol ter-se utilizado como plating bactéria E.coli C 600. O título | dos fogos ^gtlO representando o banco de genes de cDNA foi de ! 1,2x10·*·° pfu/ml, o número dos clonos independentes de 1x10°. '
EXEMPLO 2
Amplificação do banco de genes de % gtlO
Suplementou-se uma estirpe hospedei ra de E.coli adequada (C600, Genotyp F-, supE44, thil, thrl leuB6 lacYl tonA21 lambda- (M.A. Hoyt et al., 1982, Cell 31, 5656) com maltose a 0,2%, durante a noite, num meio LB, e prê-desenvol veu-se a 379C.
Centrifugou-se esta cultura durante 5 minutos a 3000 upm e suspendeu-se numa solução lOmM de MgSO4~ gelada, de modo a obter um DO(densidade õptica) de 4,0 a 600nm. As célulasMg assim preparadas armazenaram-se a 49C e conservaram -se para utilização durante uma semana.
Misturaram-se 12x200 ul de cêlulas-Mg em tubos esterilizados com uma suspensão de fogos (cada um com 50000pfu do banco de genes de cDNA/placa) e incubaram-se durante 20 min. a 379C.
Em seguida, adicionou-se com uma pi peta a cada tubo, 6 - 7 ml de agarosé-Top fundida e temperada a
429C (contendo lOmM MgSO^, concentração final), misturou-se , e colocou-se a mistura sobre 12 placas de agar LB a 379C (diâmetro
13,5cm) com lOmM MgSO^ e incubou-se durante 6-12 horas a 379C.
Selecção ('screening) primária para a identificação de fagos λ ί recombinantes '
a. Preparação dos filtros de nitrocelulose
Apõs incubação bem sucedida, arrefej ι ceram-se a 49C as placas anteriormente preparadas. Colocaram-se | filtros de nitrocelulose numerados a lápis sobre a superfície das placas e marcaram-se as posições sobre as placas com orifí- ι
I cios de agulha. Cerca de um minuto depois de os filtros estarem ί completamente molhados, retiram-se estes cuidadosamente de novo, colocaram-se na solução de desnaturação e incubaram-se durante 1 min. à temperatura ambiente (TA). Efectuou-se em seguida a neutralização na solução de neutralização durante 5 min. ã TA e in-< cubou-se de novo durante 30 segundos em 2xSSPE também à TA. |
Efectuaram-se mais 3 colheitas de cada placa, deixando-se os filtros de cada vez durante mais 30 segundos sobre a placa. As posições marcadas pela agulha mantive ram-se exactamente nos filtros sucessivos.
Secaram-se os filtros sobre papel de filtro ao ar e fixou-se o DNA por aquecimento durante 2 horas a 809C. Guardaram-se as placas até se obterem resultados da hibridação subsequente.
~ 32
b. Preparaçao das sondas de DNA marcadas com P
As misturas de oligonucleõtidos sin têticos preparam-se -num DNA-Synthesizer 381A (Applied Biosystems), purificaram-se por meio de electroforese de gel de poliacrilamida (20% em ureia 8 Μ, T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, pag. 173 e seguintes) e dessalinizaram-se em Sephadex G50 (Pharmacia). As sondas de DNA assim sintetizadas são complementares às sequências de bases do RNA que codificam para a) os aminoácidos 39-46 ou b) os amino ácidos 200-207 (D. Barra et al., Oxy Radicais and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1983) e possuem as seguintes sequências de bases:
A,
a) 5'
TG ITA c
TT
T c
TC
T
C
TC
T
IGT IAC ITT
3'
b)
5'
TC
IGT
IAC
A
TT
G
C
TC
T
A
CCA TT IAT
G
3’ em que
G, sintetizadas quimicamente, em agua, cada uma com tras de DNA, uma concentração de 20 pM/ul
Mistura reaccional:
20-100 pM de 32PATP gama (73000CÍ/' /mmol, Amersham), liofilizado da solução etanõlica, 20-100 pmol j de oligonucleôtido, 1 ul lOx tampão de quinase (0,7 M Tris-HCl pH 7,6, 0,1 m MgClg, 50 mM de ditiotreite, 10 unidades de quinase de polinucleótido T4 (BRL), agua atê 10 ul.
A reacção decorreu durante 60 minutos a 379C e interrompeu-se por adição de EDTA 25 mM. A radioactividade não incorporada removeu-se por cromatografia de exclusão numa coluna de 1 ml de Biogel P6-DG (Biorad), preparada numa seringa de 1 ml. Como meio de eluição utilizou-se o tampão TE.
c. Hibridação in situ
Para remover os restos de agarose e bactérias da nitrocelulose, que durante a hibridação dão origem a uma acentuada radiação de fundõ, incubaram-se os filtros num volume razoável de solução de pré-lavagem, durante algumas horas (ou durante a noite), sob agitação, a 659C. De modo a saturar as posições de ligação não específicas para o DNA sobre os filtros de nitrocelulose, incubaram-se estes durante 1-12 horas a 379C, na solução de pré-hibridação previamente desgaseifiçada em vãcuo,
Os DNA1s marcados radioactivamente (cerca de lxlOg cpm/pg), utilizados para a hibridação, adicionaram-se à quantidade necessária da solução de hibridação, previamente aquecida a 379C e desgaseifiçada. De modo a manter a concentração de cada amostra de DNA na solução de hibridação tão elèvada quanto possível, utilizou-se apenas a quantidade de líquido de hibridação necessária para cobrir os filtros. A hibrida
AA
ção decorreu durante 12-18 horas a 379C. I
Lavaram-se os filtros de nitrocelu-| lose, em seguida, segundo o método de Wood et al. (Proc.Natl.Aca
d.Sei. Vol 82, 1585-1588, 1985), por 3 vezes, em 6xSSC e 0,05% SDS, a 49C, e de novo 2x30min, também a 49C. Lavaram-se em segui da os filtros numa solução preparada de fresco, contendo cloreto i de tetrametilamõnio (Me4NCl) 3 M, 50mM Tris-HCl, pH8, EDTA 2mM e| 0,05% SDS, por três vezes ã temperatura ambiente (TA), mais 2x30! min a TA e finalmente 3x30 min a 499C (mistura de oligonucleoti-; dos a)) ou a 529C (mistura de oligonuclèótidos b)), secaram-se ao ar (mistura de oligonuclèótidos b)) e colaram-se sobre papel. Expuseram-se a películas de Raios X durante 2-8 dias a -709C, utilizando um intensifying-screen.
EXEMPLO 4
Purificação de placas(áreas)
Uma vez que com a elevada densidade de áreas utilizada no primeiro passo da pesquisa, não se puderam isolar áreas individuais, purificaram-se os fagos lambda recombi. nantes através de vários passos de pesquisa consecutivos com uma redução simultânea da densidade das áreas. Após desenvolvimento dos autoradiogramas isolaram-se regiões das placas de agar (de três screenings primários efectuados, identificaram-se como po sitivos 2 regiões de 28,' 1 de 35 è 5 de 15) que deram sinal de hibridação positivo em filtros de nitrocelulose hibridizados em duplicado. Para tal removeu-se do agar a região desejada com as pontas de uma pipeta de Pasteur e transferiu-se para 0,3-0,6 ml de tampão lambda (100 mM Tris HC1, pH 7,5, lOmM MgCl2 θ lmM EDTA). Pode utilizar-se também tampão SM(Maniatis T., Molecular-Cloning, 1982, pag. 70). Após adição de uma gota de clorofórmio deixaram-se os fagos, durante a noite, a 49C, difundirem-se a partir do agar, e recolocaram-se de novos as suspensões de fagos individuais com várias diluições. A partir das placas que continham 300-1000 áreas efectuou-se de novo uma colheita com filtros de nitrocelulose e hibridizou-se com ambas as sondas de DNA. Repetiu-se este processo, obtendo-se novas áreas individuais, até que
A C
νο.
EXEMPLO 5
Análise dos clonos de fagos obtidos
a. Titulação dos fagosλ
Diluiram-se as suspensões de fagos em várias diluições sucessivas a 1:10 com tampão lambda, mistura ram-se com agitação repetida e colocaram-se em placas. Após incu bação a 379C, puderam contar-se as áreas formadas na camada de bactérias e calcularam-se os títulos (plaque forming units (pfu)) título das suspensões de fagos pu rifiçadas foi de 2,2-8,6 χ ΙΟ^θ pfu/ml.
b. Preparação do DNA dos fagos lambda
Após isolamento e titulação dos cio nos de fagos em si homogéneos, colocaram-se estes, com uma densi^ dade de 2 x 10 pfu/13,5 cm, numa caixa de Petri (com o meio de cultura de composição: 1,5% de agarose, 10 g/1 de Trypton, 5 g/1 de extracto de levedura, 5 g/1 de NaCl, lOmM de MgSO^ e 0,2% de glucose) com 200 ul de células Mg C600 (4 r incubaram-se durante 5 horas a 379C e arrefeceram-se em seguida a 49C. A elui ção dos fagos efectuou-se estratificando as placas com 8 ml de tampão lambda e algumas gotas de clorofórmio, sob agitação ligei ra a 49C. A camada superior purificada por centrifugação (15ooo upm, 15 min., 49C) retirou-se em seguida e peletizaram-se os fagos por centrifugação a 50000 upm (Beckman Ti50 Rotor), durante 30 minutos à TA. Após adição de 500 ul de tampão lambda e incuba ção com ribonuclease A (RNase A, 10 pg/ml), durante 30 min. a 379C, elevou-se a concentração de sal por adição de 25 ul de EDTA 0,5 M, 12 ul de Tris-HCl 1 M a pH 8,0, e 6,5 ul de SDS a 20% e inactivaram-se os enzimas presentes por incubação a 709C durante 15’ min. Após uma extracção com fenol e duas extracções com clorofõrmio/alcool isoamílico (24:1) com volumes iguais de
cada vez, precipitou-se o DNA por adição de 0,1 volumes de aceta
I to de sódio 3 M, a pH 5,2 e 2 volumes de álcool, centrifugou-se,j lavou-se com álcool a 70%, secou-se e tomou-se em 50 ul de tam- i pão TE. , i
c. Análise de restrição í I
Incubaram-se 2 ul de solução de DNA ~ 1 com 5 unidades de EcoRI em tampão HIGH, durante 2 horas a 379C, i ! separaram-se os fragmentos obtidos num gel de agarose a 1% (T, i Maniatis et al., 1982, pag. 149 e seguintes) sob uma tensão de I 1-5 Volt/cm, eluiram-se do gel os fragmentos çom comprimentos en' “j tre 500 e 1000 pares de bases (G.M. Dretzen et al., Anal. Bio- ! chem. 112, 295-298, 1981) e submeteram-se em seguida a uma análise sequencial.
d. Análise sequencial
A subclonagem dos fragmentos de res trição num vector adequado (Bluescribe M13+ ou M13-; Vector Cloning Systems (C. Yanisch-Perron et al., Gene 33_, 103-119, 1985)) para a determinação da sequência, de acordo com o processo de Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 74., 5463-5467, 1977; F. Sanger et al. FEBS-Letters, 82, 107-111, 1978) efectuou-se. segundo os métodos usuais para a execução da restrição e ligação de fraç[ mentos de DNA e transformação de células de E.coli hospedeiras (T.Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, pag. 104, 146 e seguintes, 396; DNA-Cloning, IRL-Press 1985, vol. 1, capítulo 6). Deste modo, inseriram-se 100 ng de fragmentos de cDNA de EcoRI, isolados pelas posições EcoRI, na forma dsDNA preparada correspondente (Forma replicativa, 50 ng) do vector (através de incubação durante 2-12 horas a 149C em 10 ul de solução de ligaçãó) e, dom esta construção recombinante (com as designações BS3, BS5, BS8, BS9, BS12, BS13, BSXIII) trans formaram-se as células de E.coli adequadas (estirpe JM 101).
Isolou-se o DNA de cadeia simples dos fagos recombinantes e sequenciou-se de acordo com o método de Sanger. As sequências identificadas trataram-se por meio de programas de computador adequados (R. Staden, Nucl.Acid.Res. 10, λ n
4731-4751, 1982).
clono 8 isolado (BS8) contêm a se quência codificante, a partir do aminoâcido 22, do enzima maduro (Fig.l).
EXEMPLO 6
Construção de uma cassete de expressão
Para a expressão do hMn-SOD em leve duras ê necessário completar os cDNA's isolados, bem como construir uma cassete de expressão, em que se empregue o promotor ADHI no seu comprimento original (cerca de 1500 bp, Methods in Enzymology, Vol. 101, parte C, 192-201, 1983), o mesmo promotor na forma encurtada (ADHIK, cerca de 400 bp) e o terminador ADHII (Dr. R. Beier e E.T. Young, Nature 300, 724-728, 1982).
a. Complementação do gene
Uma vez que ao clono 8 de cDNA isolado falta, no terminal azotado, o numero de bases correspondente a 21 aminoácidos (AS), para a complementação do gene correspondente à sequência de aminoácidos referida (D. Barra et al., J.Biol.Chem. 259, 12595-12601, 1982), constroem-se é sintetizam-se 381A DNA-Synthesizer, Applied Biosystems) dois pares de oligonucleótidos como fragmento Xhol-Xbal.(OP1, correspondente à fórmula Via) ou Xbal-Ncol (0P2, correspondente ã fórmula VIb), de acordo com a selecção de codões de leveduras (P.M. Sharp et al., Nucl.Acids.Res.14, 5125-5143, 1986).
OP1 inseriu-se por meio de Xhol/ /Xbal no plasmídeo V 17 (obtido a partir de pUC18(J. Vieira e J. Messing, Gene .19, 259, 1982) após restrição com HincII e inserção de agentes de lincagem Xhol (New England Biolabs, d(CCTCGAGGJ) e restrição com Smal de plasmídeo pES102 resultante, com inserção subsequente de agentes de lincagem Ncol (New England Biolabs, d(CCCATGGG)), (Fig.2), inserindo-se ο OP2 por meio de Xbal/Ncol. Para tal digeriram-se, em cada caso, 4 ug de DNA V 17 com 10 uni dades de Xbal e de Ncol ou de Xhol e de Xbal, em 40 ul de tampão
- ar -
CORE, durante 2 horas a 379C, e purificaram-se por electroforese i de gel (0,7% agarose, vide acima).
Misturaram-se 5 ul das cadeias simples sintetizadas de OP1 ou de 0P2 (em cada caso 10 pM/ul), incu baram-se durante 10 minutos a 659C e arrefecera-se lentamente até ã temperatura ambiente. Ligou-se 1/10 dessa quantidade com 50 ug de vector duplamente cortado (Xhol/Xbal para OP1 e Xbal/ /Ncol para OP2), nas condições acima descritas (plasmídeos HSOD2 e HSOD3, fig.2). Finalmente combinaram-se os plasmídeos HSOD2 e HSOD3 por meio de Scal/Xbal (isto é,· após digestão dupla com Scal e Xbal em tampão CORE, durante 2 horas, a 379C) , após purif_i cação e isolamento dos vectores cortados através de electroforese de gel e ligação, nas condições acima descritas (clonagem dos oligopares 0P1 e 0P2), de modo a obter-se o plasmídeo HSOD4 (Figs 2,3), e prepara-se este por restrição com Ncol, seguida de Fill -in de Klenow e de restrição por EcoRI, para a introdução do fragmento de cDNA de Thal/EcoRI: incubaram-se 5 ug de DNA em 50 ul de tampão High, com 18 unidades de Ncol, a 379C durante várias horas, purificou-se o DNA cortado por electroforese de gel, isolou-se, e incubou-se metade desta quantidade em 30 ul de solu ção reaccional de Klenow, durante uma hora ã TA.
Após interrupção da reacção por adi ção de 2 ul de EDTA 0,5 M e incubação da solução reaccional a 709C (10 minutos), purificou-se o DNA por electroforese de gel, isolou-se e córtou-se de novo com 7,5 unidades de EcoRI em 20 ul de tampão HIGH, purificou-se mais uma vez e' isolou-se (Fig.5). O fragmento de cDNA Thal/EcoRI preparou-se da seguinte maneira:
Com o plasmídeo BS8, que contêm o cloro 8 de cDNA isolado (vide acima), transformaram-se células de E.coli hospedeiras adequadas (estirpe JM101), e preparou-se o plasmídeo em condições apropriadas (T. Maniatis et al., 1982, pag. 368).
Após restrição com Thal (digeriram-se 10 ug de plasmídeo em 40 ul de tampão Thal com 25 unidades de
Thal, durante 8 horas a 609C), corte'do fragmento Thal de 759 bp com EcoRI (vide acima), seguido de purificação por electroforese de gel, e isolamento do fragmento obtido, combinou-se o fragmento Thal/EcoRI assim obtido (Fig.4) com o plasmídeo HSOD4 prepara;
do (ligaram-se cerca de 100 ug de fragmento com 50 ug de vector cortado, em 10 ul de solução de ligação (vide acima)) de modo a i i obter-se o HSOD6 (Fig.5). O plasmídeo HSOD6 contém assim o c-DNA completo para o hMn-SOD, incluindo a Met. O código de leitura fi ca assim inalterado.
b. Construção da cassete de expressão
Digeriu-se duplamente o plasmídeo HSOD6 com Xhol e EcoRI (5 unidades de cada/ug DNA) em tampão CORE, isolou-se o fragmento Xhol (gene) e insériu-se no plasmídeo PKH1 ou PKH2 através de Xhol/EcoRI. Os plasmídeos PKH1 ou PKH2 prepararam-se do seguinte modo (Figs.6,7,8):
No plasmídeo PES 103, que contêm o promotor ADHI como fragmento BamHI-Xhol de 1500 bp no PES 102 (o PES 102 ê um derivado de pUC18, que contém na posição de corte de HincII um agente de lincagem Xhol; a construção do fragmen to BamHI-Xhol encontra-se descrita em Methods in Enzymology 101, 192-201), inseriram-se, apos restrição com Smal (digeriu-se 1 ug de plasmídeo com 5 unidades de Smal em tampão Smal, durante 2 ho ras a 379C), purificação e isolamento, agentes de lincagem BglII (T. Maniatis et al., 1982, pag. 396). O plasmídeo assim obtido (P154/1, Fig.6) transformou-se por restrição com EcoRI (vide aci ma), Fill-in de Klenow (vide acima) e religação (incubou-se 1 ug de DNA em 40 ul de solução de ligação (vide acima), durante a noite a 149C) no plasmídeo 154/2 (Fig.6).
Do mesmo modo, partindo do plasmídeo pES103, após digestão dupla com Xhol e HindlII em tampão CORE inseriu-se o agente de lincagem -Xhol.EcoRI.Xbal.MindIII- (Fig.7, sintetizado no 381A DNA-Synthesizer). Este agente de lincagem contêm a sequência:
TCGAGGAATTCTCTAGAA
CCTTAAGAGATCTTTCGA..
No plasmídeo 150/1 assim obtido inseriu-se, por meio de Xbal/HindIII (digestão dupla em tampão CORE) o terminador ADHII (plasmídeo 150/2, Fig.7). O terminador ADHII obteve-se do seguinte modo. Digeriu-se o plasmídeo pMW5 ADHII
(Washington Research Fundation) com HindIII (tampão CORE), depois com SpHI (em tampão Sphl) e clonou-se o fragmento de 605 bp isolado no vector V 18 e introduziu-se na posição de corte HincH um agente de lincagem Xbal (Biolabs, CTCTAGAG)(ver acima detalhes sobre a ligação). Introduziu-se um fragmento Xbal/Sphl de 335 bp no pUC18(Xbal/Sphl), obtendo-se pGD2.
Obteve-se o vector V 18 introduzindo no pUC18, na posição Smal, um agente de lincagem HindIII, de modo que a posição HindIII não existe no sítio original, sendo a posição de multiclonagem em V 18 a posição EcoRI,Sall,ΚρηΙ.Hind III.BamHI.Xbal.Sall.PstI.Sphl.
Isolou-se finalmente o terminador ADHII apos digestão dupla com Xbal/HindIII em tampão CORE, de acordo com métodos usuais (vide acima). 0 plasmídeo 150/2 contém assim, até ao gene a inserir através de Xhol/EcoRI, as unidades necessárias para a expressão do gene, ou seja cerca de 1500 bp (promotor), 7 bp (agente de lincagem Xhol), 6 bp (agente de lincagem EcoRI), 7 bp (agente de lincagem Xbal), 32 g bp (terminador) . Estas unidades inseriram-se então por meio de BamHI/HindIII (digestão dupla em tampão CORE) no vector 154/2 (Fig.8). No pla£ mídeo PKH1 assim obtido (Fig.8) substituiu-se de modo análogo o promotor ADHI por meio do promotor encurtado ADHIK, como fragmen to BamHI/Xhol(412 bp)(pKH2, Fig.9).
Em ambos os plasmídeos inseriu-se em seguida, por meio de Xhol/EcoRI (vide acima) o cDNA do gene completo cortado a partir de HSOD6 (vide acima). Os plasmídeos assim obtidos HSOD7/1 ou HSOD7/2 (a fig. 9 mostra apenas o HSOD7/2) distinguem-se entre si apenas através dos diversos promotores ADHI e ADHIK (vide acima). As cassetes de expressão assim preparadas inseriram-se pelas posições de corte BamHI e HindIII, através de BglII e HindIII (após digestão dupla dos plasmídeos em tampão CORE e isolamento das cassetes de expressão a partir deles cortados), nos vectores de transformação de leveduras adequados preparados e disponíveis no mercado YEpl3 (J.R. Broach et al., Gene 8, 121-133, 1979, ATCC 3711S), pJDB207 (DSM 3181, depo sitado em 28.12.84), pEAS102 (vide acima), YIp5 (K. Struhl et al, Proc.Natl.,Acad.Sei. USA 76, 1035-1039, 1979, ATCC 37061).
— RI _
EXEMPLO 7
Preparação de um mutante de Mn-SOD de levedura adequado ã expres são gene para o Mn-SOD de levedura (A.P.G.M. van Loon et al., Gene 26, 261-272, 1983) estã contido como fragmento BamHI no vector PL41 )Fig.10) e a sequência encon tra-se completamente publicada (C.A.M. Marres et al. Eur.J.Biochem. 147, 153-161, 1985). Após restrição com BamHI (digeriram-se 2 ug de plasmídeo com 5 unidades em 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HC1 pH 7,9, 6 mM MgCl2, 100 ug/ul de albumina de soro de vaca, durante 2 horas a 369C) purificou-se o fragmento BamHI com 2045 bp de comprimento, contendo o gene, como habitualmente por electroforese de gel, isolou-se, e subclonou-se por meio de BamHI no vector VO (pUC18 mas sem posição de corte HindIII).
O vector VO obteve-se cortando 1 ug de pUC18 com HindIII (em tampão CORE), isolando o fragmento linearizado a partir do gel de acordo com métodos conhecidos, enchendo os extremos salientes com 2 U de polimerase de Klenow (em tampão de ligase + 0,2 mM dNTP) e religando-os após 30 minutos à TA por adição de 2 U de ligase T4-DNA, durante a noite a 149C.
O plasmídeo resultante SODY1 (Fig. 10), apõs restrição com NruI (digeriram-se 1 ug de plasmídeo com 5 unidades de NruI em tampão NruI, durante 2 horas a 369C), puri ficou-se por electroforese de gel, e transformou-se, por inserção de um agente de lincagem HindIII (CAAGCTTG), em SODY3 (Fig.10). Em seguida inseriu-se, na posição de corte HindIII, o gene URA-3 (obtido a partir de pURA3): digeriram-se 4 ug de SODY3 com vinte unidades de HindIII, durante 2 horas a 379C em tampão CORE e pro cedeu-se ã desfosforilação:
A 40 ul de mistura de digestão adicionaram-se 40 ul de H2O, 10 ul de EDTA 1 M, 5 ul de Tris-HCl 1 M a pH 9,5, 1 ul de espermidina 100 mM- 1 ul de fosfatase alcalina intestinal de vitela (CIAP, 1 mg/ml, H20) e incubou-se a 369C. Apôs 15 minutos adicionou-se mais 1 ul de CIAP e incubou-se durante mais 15 minutos. O vector desfosforilado purificou-se tam• bém por electroforese em gel de agarose. Cortaram-se 2 ug do plas^ mídeo pURA3 com HindIII (vide acima) e isolou-se também um frag- 69 mento de 1,2 kb, que contém o gene de levedura URA3, e inseriu-se no vector preparado (vide acima).
Os plasmídeos assim obtidos SODY7 e SODY8 contêm o gene URA3 dentro do gene de Mn-SOD de levedura e distinguem-se na orientação do gene URA em relação ao gene de Mn -SOD (Fig.10).
A orientação do gene URA3 em relação ao gene de Mn-SOD pode verificar-se uma vez que o gene URA3 contêm uma posição PstI assimétrica.
’ Com os plasmídeos SODY7 e SODY8 efec tuou-se na estirpe DBY 747 (genotipo a, Leu2, his3, trpl, ura3, Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley) um Gen-Transplacement (Methods in Enzymology 101, 202-211 e 211-228). Transformou-se a estirpe DBY 747 com o fragmento BamHI de SODY7 e SODY8 (J.D. Beç[ gs, Nature 275, 104, 1978). Para tal cortaram-se 20 ug de SODY7 ou de SODY8 com 50 U de BamHI em 200 ml de tampão BamHI (150 mM NaCl, 6 mM Tris HCl, a pH 7,9, 6 mM MgCl2, 1 mM DTT) e extraiu-se a mistura de digestão total (sem separar a parte pUC) com fe nol (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, 1982, pag. 458 e se guintes) e concentrou-se por precipitação com etanol (adição de 20 ul de acetato de sédio 3 M, a pH 5,5, e 500 ul de etanol). To mou-se o DNA em 10 ul de ãgua e utilizou-se directamente para a transformação da levedura.
Os transformantes seleccionaram por prototropia em relação ao uracilo.
Cultivaram-se transformantes indivi duais, durante a noite, em 5 ml de meio SC-URA, a 289C. Recolheram-se as células por centrifugação, abriram-se de acordo com o método de van Loon et al. (Proc.Natl.Acad.Sei. USA 83, 3820-3824, 1986) e determinou-se o seu conteúdo em Mn-SOD. Para a recolha por electroforese de gel do Mn-SOD por um lado e do Cu/Zn-SOd por outro, utilizaram-se técnicas experimentais jã publicadas (Ch. Beauchamp e I. Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276-287, 1971; H.P. Misra e I. Fridovich, Arch.Biochem.Biophys. 183, 511-515, 1977; B.J. Davis, Annals of the NY Academy of Sciences, Vol. 121, 404-427, 1964). Para este fim revelou-se como mais. conveniente a separação das proteínas segundo de coloração negativa com azul de nitrotetrazôlio (B.J. Davis, 1964; Ch. Beauchamp e I. Fridovich, 1971). Ê possivel melhorar a sensibilidade por coloração com dia nisidina (H.P. Misra e I. Fridovich, 1977).Para posterior caracterização utilizou-se um método espectrofotométrico (Hyland, K. et al., Annal.Biochem. 135, 280-287, 1983) com sulfõxido dimetíl:. co alcalino como sistema produtor de O2 e com citocroma c como scavenger (captor).
A distinção entre o Mn-SOD por um lado e o Cu/Zn-SOD por outro, efectuou-se por adição de KCN (vide acima e M. Ysebaert-Vanneste e W.H. Vanneste, Anal.Biochem. 107, 86-95, 1980). As estirpes SODY7/2, SODY7/6, SODY7/8 e SODY7/ /10 não possuiam qualquer actividade de Mn-SOD.
EXEMPLO 8
Preparação dos vectores de expressão
As cassetes de expressão descritas no exemplo 6b cortaram-se como fragmentos BglI/HindlJI a partir dos plasmídeos HSOD7/1 ou HSOD7/2 (em ambos os casos com 2 ug de DNA plasmídeo em tampão CORE, durante 2 horas a 379C com 10 U de emzima). Cortaram-se também YEpl3, pJDB207 e pEASlO (1 ug de cada) com HindIII-BamHI (condições de digestão como anteriormente).
Ligaram-se 50 ug de DNA vector e
200 ug do inserto em tampão de ligase (como descrito) com 1 U de ligase, durante a noite a 149C e utilizou-se para a transformação da estirpe de E.coli HB101. Na tabela seguinte indica-se a designação dos plasmídeos respectivos.
Tabela 1: Designação dos vectores de expressão
Vector Inserto: HSOD7/1 HSOD7/2
YEpl3 pWS550A pWS371A
pJDB207 pWS490A pWS372A
PEAS102 PWS491A pWS373A
EXEMPLO 9
Preparação de uma estirpe de levedura (WS30-5g) adequada ã trans formação
Preparou-se uma estirpe de levedura que, para alem dos marcadores genéticos descritos para a estirpe de levedura SODY7/2, contém ainda uma mutação numa das proteases lisossomais principais (que pode, pela sua actividade, activar outras proteases lisossomais) e que por isso liberta menos proteases por abertura das células de levedura (mutação pep4)(E.W. Jones et al., Genetics 102, 665-677, 1982).
Para tal, cruzou-se a estirpe SODY7/ /2 deficiente em MnSOD com a estirpe WS20-25 deficiente em protease (<X- leu2 his3 trpl ura3 pep4) e investigaram-se as células haploides daí resultantes em relação aos seus marcadores genéticos (F. Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y., 1972).
A estirpe WS30-59 obtida (leu2 his3 trpl pep4 sodl) transforma-se facilmente e preenche as condições pretendidas.
Os cruzamentos deste tipo podem tam bém efectuar-se com outras estirpes de levedura bem conhecidas e disponíveis no mercado, por exemplo com 20B-12 (Yeast Genetic Stock Center, Berkeley) com idênticos bons resultados.
EXEMPLO 10
Transformação de leveduras e expressão em leveduras
Transformou-se a estirpe de levedura SODY7/2 com os plasmídeos pWS371A, pWS372A ou pWS373A (J.D. Beggs, Nature 275, 104-109, 1978) e investigaram-se os transformantes em relação à sua expressão.
Para tal preparou-se uma pré-cultura dos transformantes em meio líquido SC-leu (análogo ao meio SC-URA descrito, mas contendo ainda 2,4 g de uracilo, embora sem leucina) , agitando a 300 rpm a 28<?C, durante a noite. Inocularam • -se 100 ul deste meio em 4 ml de YP5%D (1% de extracto de Bacto-levedura, 2% de bacto-peptona, 5% de glucose) e desenvolveu-se durante a noite (como a pré-cultura). Recolheram-se as células e abriram-se como jã se descreveu no exemplo 7. Colocou-se a quantidade celular bruta, correspondente a 1 ml de cultura, sobre o gel activo. Efectuou-se o teste de actividade como descrito no exemplo 7.
A estirpe de levedura WS30-5 g (leu 2 his3 trpl pop4 sodl) transformou-se com os plasmídeos pWS550A, pWS490A, pWS491Ã. A preparação da pré-cultura, da cultura e a me dição da actividade do hMn-SOD efectuaram-se como descrito anteriormente.
A expressão dos plasmídeos pWS490A, pWS491A na estirpe de levedura WS30-5 g encontra-se documentada na Fig.11. A quantidade de MnSOD medida nestas condições na leve dura correspondia a cerca dé 0,5 mg/litro de cultura.
EXEMPLO 11
Síntese de um agente de lincagem contendo a sequência de DNA de sinal de levedura
Prepararam-se seis oligonucleõtidos EBI 656, EBI 636, EBI 643, EBI 646, EBI 660 e EBI 638 com a seguintes sequências e comprimentos:
EBI 656:
5'TCGAGTATACAATGTTCGCGAAAACAGCTGCAGCTAATTTA3 4lbp
EBI 636:
5'TCTTGGTTAAATTAGCTGCAGCTGTTTTCGCGAACATTGTATAC 3 4 4bp
EBI 643:
5'ACCAAGAAGGGTGGTTTGTCATTGCTCTCCACCACAGCAAGGAGAACC 3 4 8bp
EBI 646:
5'AGTGCTTGGTTCTCCTTGCTGTGGTGGAGAGCAATGACAAACAACCCT3 4 8bp
EBI 660:
5'AAGCACTCTTTGCCAGACTTGCCATACGACTACGGTGCT3
39bp
ΕΒΙ 638:
5'CTAGAGCACCGTAGTCGTATGGCAAGTCTGGCAAAG1 * 3 3 6bp por meio de um sintetizador de DNA 381A (Applied Biosystems), co mo descrito em 3b.
Os oligonucleótidos EBI 636, EBI 643, EBT 646 e EBI 660 fosforilaram-se nos seus extremos 5', para a reacção com ligase subsequente, nas condições indicadas a seguir:
Mistura reaccional n9.1 2 ul EBI 636 (=100pMol)
i Pi 10 x tampão Linker Kinase
3 pl 10 mM ATP
1 pl Kinase T4 de polinucleõtido, Bio-
labs lOU/pl
3 pl água
Mistura reaccional n9.2 idêntica ã n9.1, mas com 2 pl (10 pMol)
de EBI 60
Mistura reaccional N9.3 2 pl oligonucleótido EBI 643 (=100 pMol!
2 pl oligonucleótido EBI 646 (=100 pMol)
pl 10 x tampão de Kinase de agente de lincagem pl ATP 10 mM pl Kmase de polinucleõtido T4 (10 unidades) pl água x tampão de Kinase de agente de lincagem: 0,7 M Tris.Cl pH 7,6 0,lM MgClg 0,05M DTT (ditiotreitol)
A reacção decorreu durante 30 minutos a 379C.
Por fim, inactivou-se a Kinase de polinucleõtido T4 por meio de aquecimento a 1009C.
Os oligonucleótidos EBI 656 e EBI
638, destinados a formar os extremos 5' da inserção de DNA com . 128 bp de comprimento pronta (fórmula XI), não se fosforilaram, de modo a evitar a formação de inserções de DNA múltiplas na reacçao de ligase subsequente.
Para se obter uma composição do agente de lincagem pretendido, a partir dos oligonucleõtidos indi viduais, de acordo com o esquema:
5' EBI656 Ρ EBI643 Ρ EBI660 3 * 3' EBI636 Ρ EBI646 Ρ . EBI638 5* adicionaram-se, para a reacção de annealing (hibridação dos oligonucleõtidos complementares entre si), 2 pl (=100pMol) de EBI656 à mistura reaccional n9.1 e 2pl de EBI 638 (=100pMol) ã mistura reaccional n9.2. A mistura reaccional n9.3 contém jã doié oligonucleõtidos complementares (EBI 643 e EBI 646). Aqueceram-se todas as 3 misturas reaccionais durante 2 minutos a 1009C e deixaram-se arrefecer lentamente em banho maria.
Os fragmentos de DNA de cadeia dupla curtos formados nas reacções n9.1 a n9:3, ligaram-se entre si do seguinte modo:
10 P1 de mistura reaccional n9.1 (EBI 636 + EBI 656)
10 P1 11 11 II n9.2 (EBI 660 + EBI 638)
10 pl 11 11 II n9.3 (EBI 643 + EBI 646)
pl de ATP lOmM pl de ligase de DNA, Boehringer Manheim, 7Unidades/pl
A reacção decorreu durante 15 horas a 49C.
DNA separou-se, segundo o seu tamanho, num gel de agarose a 1% e eluiu-se a partir do gel o fraç[ mento de DNA desejado com 128 bp de comprimento, de acordo com a formula XI (G.M. Dretzen et al., Anal.Biochem. 112, 295-298, 1981).
EXEMPLO 12
Construções dos vectores de expressão que contêm a sequência de
DNA de sinal
Procedeu-se a uma digestão dupla do plasmídeo HSOD6, como habitualmente, com Xhol e Xbal (5 unidades,'
Vector
PJDB207
PEAS102
/pg de DNA, cada) em tampão CORE, e inseriu-se nele o agente de ! lincagem de 128 bp de comprimento (Xhol- sinal mitocondrial-Xbal) de acordo com métodos conhecidos (pEO22-A). 0 gene de hMn-SOD, agora provido com a sequência de DNA de sinal mitocondrial de le vedura, digeriu-se duplamente com Xhol-EcoRI (5 unidades/pg de DNA, cada) em tampão CORE e inseriu-se, através de Xhol-EcoRI em pKHl (exemplo 6b, Fig.8)(pEO23-A).
A cassete de expressão assim preparada inseriu-se de modo análogo ao do exemplo 8, através de BglII /HindIII (após digestão dupla dos plasmídeos em tampão CORE e isolamento da cassete de expressão a partir deles cortada), nos j vectores de transformação de levedura adequados preparados YEpl3, pJDB207 e pEAS102, por meio das posiçoes de corte BamHI e HindIII A tabela 2 seguinte apresenta os respectivos plasmídeos obtidos. Tabela 2: Designação dos vectores de expressão
Designação do plasmídeo
PEO24-AB pEO25-AC pEO26-AD
EXEMPLO 13
Transformação de leveduras e expressão em leveduras
A estirpe de levedura WS30-5g (exem pio 9) transformou-se com os plasmídeos indicados na tabela 2 e testaram-se os transformantes em relação ã sua expressão (exemplo 10) .
Para a fermentação da estirpe de le vedura WS30-5g transformada efectuou-se uma pré-cultura com a se guinte composição: 6,7 g/1 de yeast nitrogen base w/o amino acids (Difco), 10 g/1 de glucose, 0,16 g/1 de arginina, 0,25 g/1 de lisina, 0,06 g/1 de triptofano, 0,08 g/1 de metionina, 0,03 g/1 de cisteína, 0,10 g/1 de histidina, 0,16 g/1 de tirosina, 0,17 g/1 de fenilalanina, 0,16 g/1 de treonina, 0,18 g/1 de isoleucina, 0,21 g/1 de valina, 0,40 g/1 de ãcido glutânico, 0,21 g/1 de glicina, 0,02 g/1 de cistina, 0,15 g/1 de alanina, 0,20
YEpl3
g/1 de ácido asparagínico, 0,20 g/1 de prolina, 0,15 g/1 de serij na, 0,10 g/1 de asparagina, 0,20 g/1 de glutamina, 25 mg/1 de adenina, 50 mg/1 de uracilo, sob agitação magnética e com areja-I mento até se atingir uma densidade õptica OD5^6 =0,01. ;
A cultura principal subsequente efec| tua-se com a seguinte composição; 8,0g/l de (NE^^SO^, 2,56g/l I de (NH^^HPO^, l,16g/l de KC1, 0,60g/l de MgSO^.7 H2O, 0,56g/l de CaCl2.2H2O, 0,04 mg/1 de biotina, 80 mg/1 de m-inositol, 40 mg/1 de pantotenato de cálcio, 8mg/l de tiamina, 2mg/l de pirido xina, 3,lmg/l de CuSO^.5 H^O, 19mg/l de FeCL^.ô H2O, 12mg/l de ZnSO4.7 H2)t 14mg/l de MnSO^.E^O, 5mg/l de H^BO^, 1 mg/1 de KJ, I 2mg/l de Na2 MoO^. 2 H2O, lg/1 de extracto de levedura, 0,2 g/1 de uracilo, 0,lg/l de adenina, 0,5g/l de ácido cítrico, 15g/l de ácido glutânico, 0,2 g/1 de histidina, 0,5g/l de triptofano, 100 g/1 de glucose, num fermentador de 201 (CHEMAP). Para este fim | utilizou-se como inoculo 5% da quantidade da pré-cultura e proce; deu-se ao desenvolvimento sob agitação (1000 rpm), arejamento | (0,5 wm) e pH constante (5,0), a 209C, num fermentador de 20 l.i
Após o teor de glucose ter diminuído até 50g/l adicionou-se de novo mais 50g/l de glucose e continuou-se a fermentação até ao teor de glucose ser de 10 g/1 (o que demorou cerca de 45 horas). Arrefeceu-se em seguida o caldo de cultura, centrifugou-se e congelou-se a biomassa. O rendimento da biomassa foi de 18g/l de peso de células molhadas.
A expressão dos plasmídeos pEO24-AB, pEO25-AC e pEO26-AD na estirpe de levedura WS30-5g encontra-se documentada na Fig.12.
EXEMPLO 14
Preparação de mitocôndrias de levedura
De modo a verificar se a introdução da sequência mitocondrial de sinal de leveduras antes do gene de hMn-SOD provoca a importação da proteína nas mitocôndrias, prepa ram-se mitocôndrias de levedura e analisou-se a actividade do
Mn-SOD nas mitocôndrias e no citoplasma.
Preparam-se mitocôndrias de levedu-
ra segundo uma forma modificada do método de G.Daum et al., The ' Journal of Biol.Chem., 257, 13028-13033, 1982.
Desenvolveu-se uma pré-cultura dos transformantes em meio líquido SC-leu (exemplo 10), com agitação (300 rpm), a 289C, durante a noite. Inocularam-se 25 ml desta pré-cultura em 225 ml de meio YPD e procedeu-se ao desenvolvimen to durante a noite como no caso da pré-cultura. As células apresentavam no seu conjunto uma densidade óptica de 5 a 7, medida a 600nm, e recolheram-se por centrifugação (Solval, 6500 rpm, 5 min.). Lavaram-se as células uma vez com 100 ml de água. Suspen-; deu-se a massa celular em manitol 1 M, KP^ (KE^PO^/l^HPO^) 20 mM! a pH 7,4 (1 ml por 300 mg de peso de células) e adicionou-se 1 !
mg/ml de zinolase (Miles, P.M. 500). Obtiveram-se esferoplastos ' por agitação lenta (.50 rpm) durante 2 horas, a 289C. Recolheram-! -se os esferoplastos por centrifugação (3000 rpm, 5 min., centrií fuga de mesa Hereaus.Christ) e levaram-se uma vez com manitol 1 Μ, KP. 20mM, a pH 7,4, PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) 1 i ι I mM. Rejeitou-se a camada sobrenadante e adicionaram-se esferas | de vidro (diâmetro 0,lmm) com 1-2 vezes o volume da massa. ,
Rebentaram-se as células por agitação durante 1 minuto e suspenderam-se em 2,5 ml de manitol 0,65M, EDTA lmM e DMSF lmM. Removeram-se as células inteiras e os destroços celulares por centrifugação a 2000 rpm, durante 5 minutos (centrífuga de mesa Hereaus Christ). Recolheram-se por fim as mi tocôndrias por centrifugação (Sorvai, J-21, 12000 rpm, 10 min.) a partir da camada sobrenadante. A camada sobrenadante contém o citoplasma e guardou-se para mais tarde se determinar a activida de do hMn-SOD. O peletizado castanho avermelhado de mitocôndrias lavou-se com o tampão acima mencionado (removeram-se os componen tes citoplasmãticos brancos) e suspenderam-se as mitocôndrias em 2,5 ml do mesmo tampão. Removeram-se as impurezas novamente por ! centrifugação (centrifuga de mesa Hereaus Christ, 4000 rpm, 5 !
min.) e peletizaram-se as mitocôndrias numa segunda centrifugação (Sorvai, J-21, 12000 rpm, 10 min.) a partir da camada sobrenadante. Quebraram-se as mitocôndrias com esferas de vidro, de i modo análogo ao método utilizado para abrir as células de levedu ra (ven Loon et al., Proc.Natl. Acad.Sei.USA 83, 3820-3824, 1986) i
e mediu-se o seu teor em Μη-SOD num gel activado (Fig.13).
I
EXEMPLO 15
Purificação do hMn-SOD de acordo com a invenção
I
O isolamento do hMn-SOD recombinan-í i te efectuou-se a partir da estirpe WS30-5g/pEO24-AB (vector de levedura PJDB207) por meio de um processo em vários passos. '
Passo 1: Abertura das células
Lavou-se a massa celular (exemplo ; 13) em 10 ml de ãgua destilada por grama de peso húmido e centrij fugou-se durante 15 minutos a 16000 x g. Ressuspendeu-se o precii pitado em tampão de fosfato de sôdio/potãssio (50 mM, pH7,0) na j ~ ~ i razão de 1:3 (peso/volume). Trituraram-se (para abrir) então as | células num moinho celular contínuo (Dynomill KDL; Bachofer, Ba-j í sileia, Suiça; 0,6 1 de recipiente, arrefecido com ãgua) a um caudal de 6 1/h. Centrifugou-se o extracto celular durante 15 mi nutos (16 000 x g, 49C) e rejeitou-se o precipitado.
Passo 2: Precipitação com polietilenimina
Λ camada sobrenadante do passo 1 adicionou-se uma solução aquosa de polietilenimina a 5% (peso/ /vol.), a pH 8,0, sob agitação até se atingir uma concentração final de 0,5% (polietilenimina, Serva, Heidelberg). Agitou-se em seguida durante mais 30 minutos e removeu-se depois o precipitado por centrifugação a 16000 x g (30 minutos).
Passo 3: Precipitação por calor
Aqueceu-se a 609C a camada sobrenadante do passo 2 em copos de aço, sob agitação, em banho maria a 809C, e arrefeceu-se de novo até à temperatura ambiente em banho de gelo. A proteína precipitada removeu-se por cromatografia (10000 x g, 10 min. 49C).
Passo 4: Precipitação com sulfato de amónio
Saturou-se a 20% a camada sobrenadante do passo 3 com sulfato de amónio solido e removeu-se o pre cipitado por centrifugação (10 000 x g, 15 min. 49C). Elevou-se então a concentração de sulfato de amónio a 90% de saturação e recolheu-se o precipitado por centrifugação (10 000 x g, 15 min. 49C). Tomou-se sedimento num pouco de tampão MES (tampão de morfolinoetanosulfonato, 50 mM, pH 6,0; ãcido 2-morfolinoetanosulfo nico da firma Sigma, Deisenhofen) e procedeu-se ã sua diãlise, durante a noite, no mesmo tampão.
Passo 5: Cromatografia de permuta catiónica
Equilibrou-se uma coluna Mono S (Mo no S HR 5/5, Pharmacia, Suécia) com 5 volumes de tampão MES. Após se ter carregado a coluna com o extracto do passo 4, removeram-se as proteínas não ligadas eluindo com 5 volumes de tampão MES. Eluiu-se então o hMn-SOD de acordo com a invenção com um gradian te linear de 0 - 50 mM NaCl em tampão MES (20 volumes de coluna). Reuniram-se as fracções que apresentavam actividade de Mn-SOD e procedeu-se à sua diãlise com tampão de fosfato de sõdio/potãssio (5mM, pH 7,0).
Os enzimas SOD próprios das leveduras (Mn-SOD, Cu/Zn-SOD) podem separar-se neste passo de purifica ção. Na Fig. 14 apresenta-se um diagrama de eluição.
Passo 6: Cromatografia de adsorpção em hidroxilapatite
Carregou-se uma coluna de hidroxilapatite (HA-Ultrogel, IBF, Villeneuve-la-Garenne, França), equilibrada com tampão de fosfato (5mM, pH 7,0), com o dialisado do passo 5 e eluiu-se o hMn-SOD de acordo com a invenção com um gra diante linear (20 volumes de coluna) de 5 - 300 mM de fosfato de sódio/potãssio, a pH 7,0.
O grau de pureza do hMn-SOD obtido em cada um dos passos de purificação seguiu-se por electroforese de gel de poliacrilamida SDS redutora (Fig. 15).
a o
EXEMPLO 16
Caracterização do hMn-SOD de acordo com a invenção
Analisou-se o hMn-SOD de acordo com a invenção, purificado de acordo com o exemplo 15, por HPLC de permeabilidade de gel, HPLC de fase reversa, sequênciação N-terminal, electroforese de gel SDS, electroforese de gel nativa e focagem isolectrica e comparou-se com o hMn-SOD natural.
a. HPLC de permeabilidade de gel:
Coluna: Wáters Protein Pak I 125, 2 x (7,8 x 300 mm), 10 um de diâmetro das partículas
Eluente: 0,5 M Na2SO4, 0,02 M NaH2PO4, pH 7,0, 0,04% de
Tween 20, 25% de propilenoglicol
Caudal: 0,5 ml/min
Detecção: Absorção no UV., 214 nm
Tanto o hMn-SOD natural como o preparado de acordo com a invenção apresentam o pico principal do tetrâmero de SOD a um peso molecular de 70.000 ou 76.000, tendo-se efectuado a calibração com 4 proteínas padrão. Estes valores podem considerar-se idênticos dentro do erro experimental deste | método.
b. HPLC de
Coluna:
Eluente A:
Eluente B: Gradiante:
Caudal:
Detecção:
fase reversa:
um de diâmetro
Bakerbond WP C^g, 4,6 x 250 mm, partículas, 30 nm de diâmetro de
0,1% de ãcido trifluoroacêtico em ãgua
0,1% de ãcido trifluoroacêtico em acetonitrilo
20% de B durante 2 minutos, 20 - 68% de B durante poros minutos, 68% de B durante 10 minutos, 68 - 20% de durante 1 minuto
1,0 ml/min Absorpção :
no UV, 214 nm e 280 nm de acordo com a invenção minutos (20,7 ou 20,9
O hMn-SOD natural e o preparado de apresenta um tempo de retenção de quase 21 minutos, respectivamente)
c. Sequenciação N-terminal
Sequenciou-se um pico de hMn-SOD de acordo com a invenção, dessalinizado por HPLC de fase reversa. A sequenciação efectuou-se num sequenciador de fase gasosa da firma Applied Biosystems (Modelo 470 A) com o programa 02RPTH. Com uma quantidade de partida de 0,8 nM conseguiu sequenciar-se até ao aminoácido 20. Obteve-se uma concordância a 100% com a sequên cia esperada (a partir de proteína natural e de cDNA). A sequência de sinal para o transporte para as mitocêndrias tinha sido totalmente eliminada.
d. Electroforese de gel SDS
Gel de separação: 15% de acrilamida
Gel de empacotamento: 4% de acrilamida Coloração: coloração com prata de acordo com o método de B.R. Oakley et al. (Analyt. Biochem. 105, 361-363, 1980).
Massa de gel: 0,75 mm (8 x lOcm)
Condições de eluição: 60 minutos, 150 V
A electroforese de gel SDS efectuou -se em contínuo de acordo com o processo original de U.K. Lammli (Nature 227, 680-685, 1970). Na preparação das amostras para o hMn-SOD trataram-se as amostras com DTT como agente redutor e aqueceram-se à ebulição. No gel SDS apareceu principalmente o hMn-SOD na forma de monõmero com um peso molecular de cerca de 25.000. Conforme o grau de completamento da redução pode ainda identificar-se o tetrâmero com um peso molecular de cerca de 90.000. A Fig. 15 mostra um gel de poliacrilamida SDS a 15% após coloração com prata.
e. Electroforese de gel nativa
Gel de separação: PAGE nativo a 7,5%, de acordo com o método de Davis, B.J. (Ann. NY Acad. Sei. 121,
404-427, 1964).
• Gel de empacotamento: 2% de acrilamida + sacarose
Massa de gel:
Condições de eluição: 75 minutos, 150 V (constante)
Coloração: Azul coomassie de acordo com métodos conhecidos coloração de actividade com θ-dia nisidade de acordo com o método de Misra, H.P., Fridovich, I.(Arch. Biochem. Biophys. 183, 511-515, 1977) | i
hMn-SOD de acordo com a invenção ; obtido após cromatografia em hidroxilapafite apresentava após a j electroforese, tanto por coloração com azul coomassie (quanti-i í dade de hMn-SOD identificada: 0,3 ug) como por coloração de acti vidade com o-dianisidina (quantidade de hMn-SOD identificada: 75f 30 ou 15 ng), uma banda unitária e colocada na mesma posição.
f. Focagem isoelectrica
Gama de pH:
Placas de gel:
Soluções dos electrodos:
3,5-9,5 placas LBK, PAG(lmm x (9 x 10 cm)) Ácido fosfórico 1 M )ânodo) Hidróxido de sódio 1 M (cátodo) Temperatura de arrefecimento: 79C
Quantidade de amostra:
Condições de eluição:
4,0 ou 6,5 ug
Pre-focagem: 600 Vh
Focagem; 3000 Vh (total)
Azul coomassie, coloração de actividade com o-dianisidina
Coloração:
Como ponto isolectrico determinou-se o valor pi = 8,15.

Claims (1)

  1. Processo de engenharia genética para a preparação do enzima superoxidismutase-manganês humano (hMn -SOD), caracterizado por
    a. se isolar o mRNA de tecidos humanos, de preferência de teci- +
    dos da placenta, e se preparar o poli(A) RNA.
    b. Se sintetizar o cDNA de cadeia dupla a partir deste poli (A)+RNA e, a partir dele, se construir um banco de genes de cDNA,
    c. se identificar e se isolar uma sequência total ou parcial de DNA que codifique para o hMn-SOD, a partir do banco de cDNA referido, por meio de sondas de DNA derivadas da sequência de aminoácidos do hMn-SOD, de preferência das correspondentes às fórmulas Va e Vb,
    d. se completar, conforme o caso, esta sequência de DNA até ao codão de início ou de fim,
    e. se posicionar uma sequência de DNA peptídica ou de sinal, de preferência correspondente à fórmula X, directamente após o codão de início (ATG) do gene do hMn-SOD e antes do primeiro codão (LYS) que codifica para o hMn-SOD.
    f. se construir uma cassete de expressão, adequada à célula hospedeira, constituída por promotor, sinal de iniciação, gene de hMn-SOD com sequência peptídica ou de sinal, codão de fim e terminador, a partir desta sequência de DNA completa codifi cante para o hMn-SOD contendo um sinal peptídico,
    £. se incorporar esta cassete de expressão num plasmídeo de expressão adequado para células eucarióticas, de preferência num vector de levedura,
    h. se transformarem, com este plasmídeo de expressão que contêm o gene de hMn-SOD com a sequência de sinal ou peptídica, de preferência células hospedeiras eucarióticas, em especial cêlulas de levedura,
    i. se extrair das mitocôndrias o hMn-SOD sintetizado por meio destes hospedeiros transformados e correctamente processados, e se proceder finalmente ã sua purificação.
    Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por se prepararem sequências de DNA que codificam a informação genética total ou parcial de um enzima, que possui as propriedades enzimãticas, bioquímicas e imunológicas da superoxidase-manganês humana (hMn-SOD).
    Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por se prepararem sequências de DNA que codificam um enzima primário hMn-SOD, que pode ser integrado na mi tocôndria e aí processado ao enzima maduro, que possui as propriedades enzimãticas, bioquímicas e imunológicas do hMn-SOD.
    Processo de acordo com a reivindica ção 3, caracterizado por se prepararem sequências de DNA compostas pela informação genética de um hMn-SOD e por uma sequência peptidica ou de sinal aminoterminal.
    Processo de acordo com a reivindica ção 4, caracterizado por se prepararem sequências de DNA, em que à informação genética do hMn-SOD se antepõe directamente uma sequência de DNA, constituída por uma sequência peptidica ou de si nal mitocondrial.
    ção 5, caracterizado por se a sequência peptidica ou de leveduras.
    Processo de acordo com a reivindica prepararem sequências de DNA em que sinal mitocondrial ê originaria de
    Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se prepararem sequências de DNA cuja composição compreende a série seguinte: sinal de ini ciaçao de translacção (ATG), sequência peptidica ou de sinal mitocondrial, sequência de DNA para o hMn-SOD e pelo menos um codão de fim.
    Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se prepararem sequências de DNA correspondentes às sequências de nucleõtidos de acordo com as fórmulas Ia, Ib, II, Illa, Illb, Va, Vb, Via, VIb, Vila, Vllb, VIII, IX, X e XI.
    Processo para a preparação de sequências de DNA, caracterizado por se hibridizarem, em condições definidas, com uma das sequências de DNA, preparadas de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, podendo estas sequências de DNA serem de origem sintética, semi-sintêtica ou natural, sen do por isso relacionadas com as sequências de DNA de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 bem como com as suas mutações de qualquer tipo, e que codificam um enzima com as propriedades enzimãticas, bioquímicas e imunológicas de hMn-SOD.
    - 10- Processo de acordo com a reivindica ção 1, para a preparação de vectores de replicação contendo pelo menos um marcador de selecção e/ou uma posição de reconhecimento para, pelo menos, um enzima de restrição para alêm da origem de replicação e para alêm de outras zonas genéticas essenciais, ever tualmente dentro de um marcador de selecção, caracterizado por estes vectores de replicação conterem uma das sequências de DNA de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 9.
    Processo de acordo com a reivindica ção 10, caracterizado por se prepararem vectores de replicação de origem virai, de preferência originários de Lambda-fagos, em particular de Àgt 10 ou de fagos M13.
    Processo de acordo com a reivindica ção 10, caracterizado por se prepararem vectores de replicação de origem plasmldica.
    Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por se prepararem plasmídeos que contêm uma das sequências de DNA de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 9, e por estes plasmídeos suportarem uma cassete de expressão contendo uma das sequências de DNA referidas, por poderem transformar de forma estável células procariõticas e eucariõticas, serem replicáveis numa destas células hospedeiras e se trans crever e translaccionar correctamente a informação genética nelas contida em hMn-SOD.
    Processo de acordo com a reivindica ção 13, caracterizado por se prepararem plasmídeos do tipo YEpl3, pJBD207, PEAS102 e YIp5.
    Processo de acordo com a reivindica ção 13, caracterizado por se prepararem plasmídeos do tipo pUC, de preferência pUC18.
    Processo de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 15, caracterizado por se prepararem plasmídeos com uma cassete de expressão com os elementos: promotor, co dão de iniciação, sequência peptídica ou de sinal mitocondrial, gene estrutural de hMn-SOD, codão de fim e terminador, todos na orientação e ordem de leitura correctas.
    Processo de acordo com a reivindica ção 16, caracterizado por se prepararem plasmídeos em que o promotor das cassetes de expressão neles contidas, ê o promotor com pleto ADHI com cerca de 1500 pares de bases (bp) ou o promotor encurtado ADHIK com cerca de 400 bp, e o terminador das referidas cassetes de expressão ê o terminador ADHII.
    - 18- Processo de acordo com as reivindicações 13 a 17, caracterizado por se prepararem os plasmídeos pWS490A, PWS491A, pWS550A, pWS371A, pWS372A, pEO24-AB, pEO25-AC e pEO26-AD.
    Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por se prepararem células hospedeiras trans formadas que contêm a informação genética codificante para o hMn
    -SOD.
    Processo de acordo com a reivindica ção 19, caracterizado por se prepararem células hospedeiras trans formadas contendo vectores de replicação de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 12, em particular plasmídeos de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 18, se replicarem e exprimi rem estes, se introduzirem os hMn-SOD sintetizados nas mitocôndrias hospedadas e se processarem e acumularem intracelularmente.
    Processo de acordo com a reivindica ção 20, caracterizado por se prepararem células hospedeiras trans formadas procarióticas, em particular células de Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Micrococcaceae apatogênica, em especial de E. coli C600 e E. coli JM 101.
    Processo de acordo com a reivindica ção 20, caracterizado por se prepararem células hospedeiras trans formadas eucariõticas, de preferência células de levedura.
    Processo de acordo com a reivindica •7^ ção 20, caracterizado por se prepararem células hospedeiras trans formadas de animais mamíferos.
    Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por as sequências de DNA a utilizar se defi nirem de acordo com as reivindicações 2 a 9.
    - 25- -
    Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por os vectores e plasmídeos a utilizar se definirem de acordo com as reivindicações 10 a 12 e 13 a 18, res. pectivamente.
    - 26- -
    Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por as células hospedeiras a utilizar se de finirem de acordo com as reivindicações 19 a 23.
    - 27- Processo de acordo com as reivindicações 1 e 24 a 26, caracterizado por se preparar em seguida, di rectamente, um hMn-SOD correctamente processado, que possui as propriedades enzimãticas, bioquímicas e imunolõgicas conhecidas do hMn-SOD autêntico.
    - 28- — Π /1 —
    Processo de acordo com as reivindicações 1 e 24 a 27, caracterizado por se preparar em seguida, di rectamente, um hMn-SOD correctamente processado, correspondente ãs sequências de aminoácidos de acordo com as fórmulas IVa ou IVh
    - 29- Processo de acordo com as reivindicações 1 e 24 a 28, caracterizado por se prepararem polipéptidos com as propriedades enzimãticas, bioquímicas e imunológicas do hMn-SOD, na forma livre, excepto um polipeptido que, em relação ãs fórmulas IVa e/ou IVb apresenta tanto o aminoácido Lys na posição 29 como o aminoácido Gin nas posições 42, 88, 109 e 129, mas não contêm os aminoácidos Gly e Trp nas posições 124 e 125.
    Processo de acordo com as reivindicações 1 e 24 a 29, caracterizado por se preparar um polipeptido com as propriedades enzimãticas, bioquímicas e imunológicas do hMn-SOD conhecidas, livre de glicosilação nativa ou na forma gli cosilada.
    Processo de acordo com as reivindicações 29 e 30, caracterizado por se preparar um polipeptido que apresenta o aminoácido metionina antes do primeiro aminoácido do terminal azotado.
    - 75 I *
    Processo de acordo com as reivindicações 29 a 31, caracterizado por se preparar um polipeptido que contêm também um sinal peptídico mitocondrial, posicionado antes do primeiro aminoãcido do hMn-SOD(Lys).
    Processo de acordo com as reivindicações 29 a 32, caracterizado por se preparar um polipeptido pro cessado na forma correcta.
    - 34- Processo de acordo com as reivindicações 29 a 33, caracterizado por se preparar um polipeptido que apresenta uma sequência de aminoácidos de acordo com as fórmulas IVa ou IVb.
    ção 34, caracterizado por se o aminoãcido metionina antes azotado do hMn-SOD maduro.
    Processo de acordo com a reivindica obter um polipeptido que apresenta do primeiro aminoãcido do terminal
    I 4
    Processo de acordo com as reivindicações 34 e 35, caracterizado por se preparar um polipeptido que contém um sinal peptídico mitocondrial posicionado entre a metio nina codificada pelo codão de início e o primeiro aminoãcido do hMn-SOD (Lisina).
    - 37- -
    Processo para a preparação de um po lipéptido, de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 24 a 28 ,
    - 38- -
    Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, destinada ao tratamento de seres humanos, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade efectiva de um polipêptido, quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 29 a 37, com veículos farmacêuticos inertes adequados.
    A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados na República Federal Alemã em 14 de Março de 1987, 26 de Maio de 1987, 10 de Julho de 1987 e em 24 de Dezembro de 1987, sob os n9s P 37 08 306.6. P 37 17 695.1, P 37 22 884.6 e P 37 44 038.1, respectivamente.
PT86955A 1987-03-14 1988-03-11 Processo para a preparacao do enzima superoxidismutase - manganes humano (hmn-sod) PT86955B (pt)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19873708306 DE3708306A1 (de) 1987-03-14 1987-03-14 Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod)
DE19873717695 DE3717695A1 (de) 1987-05-26 1987-05-26 Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod)
DE19873722884 DE3722884A1 (de) 1987-07-10 1987-07-10 Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod)
DE19873744038 DE3744038A1 (de) 1987-12-24 1987-12-24 Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT86955A PT86955A (pt) 1988-04-01
PT86955B true PT86955B (pt) 1992-06-30

Family

ID=27433860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT86955A PT86955B (pt) 1987-03-14 1988-03-11 Processo para a preparacao do enzima superoxidismutase - manganes humano (hmn-sod)

Country Status (18)

Country Link
US (3) US5240847A (pt)
EP (2) EP0282899B1 (pt)
JP (1) JP2860100B2 (pt)
KR (1) KR880011339A (pt)
AT (1) ATE132902T1 (pt)
AU (1) AU618526B2 (pt)
CA (1) CA1341387C (pt)
DE (1) DE3854872D1 (pt)
DK (1) DK133388A (pt)
ES (1) ES2083357T3 (pt)
FI (1) FI881185L (pt)
GR (1) GR3019091T3 (pt)
HU (1) HU212920B (pt)
IE (2) IE71940B1 (pt)
IL (1) IL85701A0 (pt)
MX (1) MX9203619A (pt)
NO (1) NO176884C (pt)
PT (1) PT86955B (pt)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5714362A (en) * 1983-04-29 1998-02-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Human superoxide dismutase cDNA
US6610520B1 (en) 1985-11-22 2003-08-26 Bio-Technology General Corp. Gene encoding human manganese superoxide dismutase and recombinant polypeptide encoded thereby
US6326003B1 (en) 1986-10-14 2001-12-04 Chiron Corporation Manganese superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms
ES2083357T3 (es) * 1987-03-14 1996-04-16 Boehringer Ingelheim Int Manganeso-superoxido-dismutasa humana (hmn-sod).
DE3854678T2 (de) * 1987-03-27 1996-06-13 Bio Technology General Corp Menschliches Mangansuperoxiddismutase und Behandlungsverfahren.
JP2500543B2 (ja) * 1991-05-24 1996-05-29 住友化学工業株式会社 キメラｐ４５０産生菌株
DE59310242D1 (de) * 1992-09-09 2002-01-17 Bio Technology General Corp Verwendung von Mangan-Superoxiddismutase (Mn-SOD) zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen in niedriger Dosierung
US5843641A (en) * 1993-02-26 1998-12-01 Massachusetts Institute Of Technology Methods for the daignosis, of familial amyotrophic lateral sclerosis
IL109112A0 (en) * 1993-03-24 1994-06-24 Boehringer Ingelheim Pharma Pharmaceutical compositions containing human manganese superoxide dismutase
US5747026A (en) * 1993-10-15 1998-05-05 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Antioxidants
US5994339A (en) * 1993-10-15 1999-11-30 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Oxidant scavengers
US6887856B1 (en) * 1993-10-15 2005-05-03 University Of Pittsburgh Protection from ionizing irradiation or chemotherapeutic drug damage by in vivo gene therapy
US6127356A (en) 1993-10-15 2000-10-03 Duke University Oxidant scavengers
US5506133A (en) * 1994-04-11 1996-04-09 Human Genome Sciences, Inc. Superoxide dismutase-4
JP2517894B2 (ja) * 1994-08-12 1996-07-24 住友化学工業株式会社 フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現させるキメラｐ４５０産生菌株
WO1996009053A1 (en) * 1994-09-20 1996-03-28 Duke University Oxidoreductase activity of manganic porphyrins
US5834248A (en) * 1995-02-10 1998-11-10 Millennium Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods using rchd534, a gene uregulated by shear stress
US6359194B1 (en) 1995-02-10 2002-03-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment and diagnosis of cardiovascular disease
US6099823A (en) * 1996-02-16 2000-08-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment and diagnosis of cardiovascular disease
AU725192B2 (en) 1996-02-16 2000-10-05 Brigham And Women's Hospital Compositions and methods for the treatment and diagnosis of cardiovascular disease
US6171856B1 (en) 1997-07-30 2001-01-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity
AU8671798A (en) * 1997-07-30 1999-02-22 Betagene, Inc. Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity
JP2001521939A (ja) 1997-11-03 2001-11-13 デューク・ユニバーシティー 置換されたポルフィリン類
US6737506B1 (en) * 1998-02-25 2004-05-18 Paul Anziano Manganese superoxide dismutase exon 3-deleted isoforms and nucleic acid molecules encoding the isoforms
WO1999043697A1 (en) * 1998-02-25 1999-09-02 The Board Of Regents Of The University And Community College System Of Nevada On Behalf Of The University Of Nevada-Reno Manganese superoxide dismutase exon 3-deleted isoforms and nucleic acid molecules encoding the isoforms
DE69928655T2 (de) 1998-04-24 2006-08-24 Duke University Substituierte porphyrine
US6190658B1 (en) 1998-05-08 2001-02-20 Webb-Waring Institute For Biomedical Research Genetically modified manganese superoxide dismutase for treating oxidative damage
US6221848B1 (en) 1998-05-11 2001-04-24 University Of Pittsburgh Protection of the esophagus from chemotherapeutic or irradiation damage by gene therapy
GB9824282D0 (en) * 1998-11-05 1998-12-30 Microbiological Research Agenc Delivery of superoxide dismutase to neuronal cells
EP1155019B1 (en) 1999-01-25 2005-12-07 National Jewish Medical and Research Center Substituted porphyrins and their therapeutic use
US6265172B1 (en) * 1999-02-08 2001-07-24 University Of Kentucky Diagnostic test and therapy for manganese superoxide dismutate (mNsod) associated diseases
FR2806911B1 (fr) * 2000-03-28 2003-01-10 Univ Rene Descartes Utilisation de mimetiques de la sod dans le traitement d'insuffisances hepatocellulaires
CN1322825A (zh) * 2000-05-09 2001-11-21 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——超氧化物歧化酶11和编码这种多肽的多核苷酸
JP2004520380A (ja) 2001-01-19 2004-07-08 ナショナル・ジュウィッシュ・メディカル・アンド・リサーチ・センター 癌治療本出願は、２００１年１月１９日に出願の仮出願番号第６０／２６２，３９０号の優先権を主張し、その全ての内容は、参照により本願明細書に援用したものとする。
JP2005508864A (ja) 2001-06-01 2005-04-07 ナショナル・ジュウィッシュ・メディカル・アンド・リサーチ・センター 糖尿病の治療、または移植術における使用、または免疫寛容の誘導のためのオキシダントスカベンジャー
US20030027745A1 (en) * 2001-06-13 2003-02-06 Repine John E. Diagnostic and prognostic method for evaluating ocular inflammation and oxidative stress and the treatment of the same
EP1513537A4 (en) 2002-06-07 2006-09-06 Univ Duke Substituted porphyrins
WO2005038013A1 (en) * 2003-10-07 2005-04-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Artisense oligonucleotides optimized for kidney targeting
US20050191653A1 (en) * 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
US7232808B2 (en) * 2004-08-02 2007-06-19 University Of Iowa Research Foundation Methods of inhibiting manganese-containing superoxide dismutase 2 (MnSOD)
US9546312B2 (en) * 2007-08-31 2017-01-17 Hayes & Associates Endotherm systems and methods utilizing carbohydrate in non-oxidizing environment
US11382895B2 (en) 2008-05-23 2022-07-12 National Jewish Health Methods for treating injury associated with exposure to an alkylating species

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2225443B1 (pt) * 1973-04-16 1976-11-12 Anvar
FR2240277B2 (pt) * 1973-08-10 1976-12-17 Anvar
US4029819A (en) * 1973-04-16 1977-06-14 Etablissement Public Det: Agence Nationale De Valorisation De La Recherche Anver Superoxide dismutase and its application as an oxidation inhibitor
BE813485A (fr) * 1973-04-16 1974-10-09 Superoxyde dismutases et leur application comme inhibiteurs d'oxydation
JPS5816685A (ja) * 1981-07-22 1983-01-31 Takeda Chem Ind Ltd 固定化酵素，その製造法および製剤
US5196335A (en) * 1983-04-29 1993-03-23 Yeda Research And Development Co., Ltd. Human superoxide dismutase cDNA
DE3486452T2 (de) * 1983-10-03 1997-11-06 Chiron Corp., Emeryville, Calif. Superoxiddismutase und deren Expression in Mikroorganismen
US5066591A (en) * 1983-10-03 1991-11-19 Chiron Corporation Polypeptides of human copper/zinc superoxide dimutase
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
DK402785D0 (da) * 1985-09-03 1985-09-03 Syn Tek Ab Fremgangsmaade til fremstilling af et enzym
US5270195A (en) * 1985-11-22 1993-12-14 Bio-Technology General Corp. Plasmids for expression and method of producing a human manganese superoxide dimutase analog
IE59498B1 (en) * 1985-11-22 1994-03-09 Bio Technology General Corp Human manganese superoxide dismutase analog, plasmid for its expression and method of recovering it in enzymatically active form
US5246847A (en) * 1985-11-22 1993-09-21 Bio-Technology General Corp. Polypeptide analogs of human manganese superoxide dismutase and compositions and complexes thereof
ES2083357T3 (es) * 1987-03-14 1996-04-16 Boehringer Ingelheim Int Manganeso-superoxido-dismutasa humana (hmn-sod).
US5260204A (en) * 1987-03-14 1993-11-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Human manganese superoxide dismutase (hMn-SOD)
DE3854678T2 (de) * 1987-03-27 1996-06-13 Bio Technology General Corp Menschliches Mangansuperoxiddismutase und Behandlungsverfahren.
US5223538A (en) * 1987-03-31 1993-06-29 Duke University Superoxide dismutase mimic
NZ225760A (en) * 1987-08-14 1991-02-26 Bio Technology General Corp Expression plasmids containing the deo promoter and bacterial hosts containing these plasmids
JPH0283398A (ja) * 1988-09-21 1990-03-23 Ube Ind Ltd 合成ペプチド、それを用いたヒトＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼの測定キットおよび測定法
EP0462836A3 (en) * 1990-06-20 1992-08-26 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Recombinant vector plasmid capable of expressing human manganese superoxide dismutase, and process of producing this enzyme

Also Published As

Publication number Publication date
IE880717L (en) 1988-09-14
US5436162A (en) 1995-07-25
DE3854872D1 (de) 1996-02-22
US5240847A (en) 1993-08-31
NO881089D0 (no) 1988-03-11
JP2860100B2 (ja) 1999-02-24
EP0282899B1 (de) 1996-01-10
AU1302788A (en) 1988-09-15
IE71940B1 (en) 1997-03-12
ES2083357T3 (es) 1996-04-16
DK133388A (da) 1988-09-15
AU618526B2 (en) 1992-01-02
JPS6463383A (en) 1989-03-09
MX9203619A (es) 1992-09-01
HUT46739A (en) 1988-11-28
CA1341387C (en) 2002-09-03
EP0282899A3 (en) 1989-11-15
FI881185A7 (fi) 1988-09-15
DK133388D0 (da) 1988-03-11
EP0676472A1 (de) 1995-10-11
GR3019091T3 (en) 1996-05-31
IL85701A0 (en) 1988-08-31
HU212920B (en) 1996-12-30
FI881185A0 (fi) 1988-03-14
IE960190L (en) 1988-09-14
ATE132902T1 (de) 1996-01-15
NO176884B (no) 1995-03-06
FI881185L (fi) 1988-09-15
NO176884C (no) 1995-06-14
US5589371A (en) 1996-12-31
EP0282899A2 (de) 1988-09-21
PT86955A (pt) 1988-04-01
KR880011339A (ko) 1988-10-27
NO881089L (no) 1988-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU618526B2 (en) Human manganese superoxide dismutase (hmn-sod)
EP0200590B1 (fr) Procédé de préparation microbiologique de la sérum-albumine humaine
ES2321948T3 (es) Tecnica de expresion genetica.
Duronio et al. Protein N-myristoylation in Escherichia coli: reconstitution of a eukaryotic protein modification in bacteria.
KR101298157B1 (ko) 2-미크론 패밀리 플라스미드 및 이의 용도
CA2632331C (en) Molecules with a beta-aggregating region and their use in inducing protein aggregation
FI103892B (fi) Rekombinantti-DNA-molekyyli, joka koodaa polypeptidiä/proteiinia, jolla on oleellisesti vaskulaaristen antikoaguloivien proteiinien biologiset ominaisuudet sekä niiden valmistus
HU207533B (en) Process for clowning superoxide dismutase, expressing them in microorganisma and improving enzyme-yeald of microorganismus cultures
JPH03500171A (ja) 合成酵母リーダーペプチド
Beck et al. Efficient production of active human manganese superoxide dismutase in Escherichia coli
US5618712A (en) Human lysozyme
JPS62289187A (ja) ヒトマンガンス−パ−オキシドジスムタ−ゼ↓ｃＤＮＡ、その細菌中での発現及び酵素活性ヒトマンガンス−パ−オキシドジスムタ−ゼの回収方法
US5260204A (en) Human manganese superoxide dismutase (hMn-SOD)
US5066591A (en) Polypeptides of human copper/zinc superoxide dimutase
FR2579223A1 (fr) Procede de preparation microbiologique de la serum-albumine humaine
Chen et al. Expression, purification, and characterization of a recombinant 5-lipoxygenase from potato tuber
Fujinaga et al. Cloning and expression in Escherichia coli of the gene encoding the [2Fe-2S] ferredoxin from Clostridium pasteurianum
US6331421B1 (en) DNA construct comprising a vector for expression of human cytoplasmic Cu/Zn superoxide dismutase in E. coli and method of use of same
NZ223869A (en) Genetically engineered production of human manganese superoxide dismutase
Dieryck et al. Purification and activity of a wheat 9-kDa lipid transfer protein expressed in Escherichia coli as a fusion with the maltose binding protein
US6830906B2 (en) Manganese superoxide dismutase cloning and expression in microoganisms
US5691139A (en) Genetic modification of superoxide dismutase to increase expression in microorganisms
CN113354738B (zh) 融合毒素VEGF165b/mGEL及其编码基因与应用
JPH02219570A (ja) ヒト５―リポキシゲナーゼの製造方法
JPH10309193A (ja) 哺乳類セレノシステイン含有タンパク質の大腸菌での製造法

Legal Events

Date Code Title Description
FG3A Patent granted, date of granting

Effective date: 19911206

PC3A Transfer or assignment

Free format text: 19990331 BIO-TECHNOLOGY GENERAL CORPORATION US

MM3A Annulment or lapse

Free format text: LAPSE DUE TO NON-PAYMENT OF FEES

Effective date: 20030630