NO178464B - Monoklonalt antiidiotypeantistoff og fremgangsmåte for in vitro overvåkning av antiidiotypeantistoffer i en pröve fra en pasient som er under behandling - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår

metoder som anvender anti-idiotypiske

antistoffer, eller fragmenter derav,

for tumor-immunoterapi eller immuno-profylakse. Monoklonale anti-idiotypiske antistoffer som gjenkjenner

en idiotype tilstedeværende på et

andre antistoff eller på en T-lymfocytt

eller på en immun suppressorfaktor som

er rettet mot et definert tumorantigen,

kan anvendes for immunisering mot en

tumor, for immun anti-tumor-aktivering eller inhibering av undertrykkelse, eller for in vitro-aktivering av lymfocytter for anvendelse i adoptiv immunoterapi. De anti-idiotypiske antistoffer, eller frag-

menter derav, kan også anvendes for å overvåke anti-antistoff-fremkallelse i pasienter som gjennomgår passiv immunisering overfor et tumorantigen ved administrering av anti-tumor-antistoff. I en annen utførelsesform kan administrering av T-lymfocytter som uttrykker en idiotype rettet mot et definert tumorantigen, anvendes for å overføre hypersensibilitet av forsinket type til tumoren. I en annen metode ifølge oppfinnelsen kan fremkallelse av anti-idiotypiske antistoffer in vivo ved administrering av anti-tumor-antistoff eller immune celler eller faktorer som utviser en anti-tumor-idiotype, være terapeutisk verdifull.

1. Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår et monoklonalt anti-idiotypeantistof f for ikke-terapeutisk bruk, og en fremgangsmåte for in vitro-overvåkning av nivåene av et antiidiotypeantistoff i en prøve fra en pasient som er under behandling med et antitumor-antistoff som uttrykker en idiotype rettet mot et definert tumorantigen.

De monoklonale antiidiotypeantistoffer ifølge oppfinnelsen er verdifulle som reagenser i immunoanalyser slik

som ELISA-tester og radioimmunoanalyser som er anvendbare som diagnoseredskaper til påvisning av antitumorantistoffer eller tumorantigener, og i immunoabsorpsjonsanalyser som er anvendbare ved isolering og identifisering av antitumorantistoffer. Disse reagenser vil enn videre være verdifulle redskaper til

forståelse av utviklingen og veksten av neoplasi.

2. Bakgrunn for oppfinnelsen 2.1. Antiidiotypeantistoffer

Antiidiotypeantistoffer eller antiidiotyper er antistoffer som er rettet mot det antigen-kombinerende område eller det variable område (kalt idiotypen) av et annet antistoffmolekyl. Basert på Jernes nettverkmodell av idiotype-relasjoner (N.K. Jerne, 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125c:373, N.K. Jerne et al., 1982, EMBO 1:234) skulle immunisering med et antistoffmolekyl som uttrykker en paratop (antigen-kombinerende sted) for et gitt antigen, frembringe en gruppe av anti-antistoffer, hvorav enkelte har en komplementær struktur til paratopen felles med antigenet. Immunisering med en subpopulasjon av antiidiotypeantistoffene skulle igjen frembringe en subpopulasjon av antistoffer eller immunocelle-delmengder som er reaktive med begynnelsesantigenet.

Som forklaring på immunoreguleringen er det blitt påkalt et nettverk av idiotoper og antiidiotoper med felles eller beslektede idiotoper av antistoffer, B-lymfocytter og forskjellige delmengder av T-lymfocytter og deres oppløselige produkter som vekselvirker med antiidiotoper (N.K. Jerne, 1974, supra, J. Urbain et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:5126, R. Rajewski og T. Takemori, 1983, Ann. Rev. Immunol. 1:569). Undersøkelser som er blitt utført med hensyn til immunitet overfor både haptener og virale antigener, indikerer at B-celle-avledede antiidiotypeantistoffer kan fremkalle T-celleresponser (R. Rajewski og T. Takemori, supra, J. Urbain et al., supra, H. Binz og H. Wigzell, 1978, J. Exp. Med. 147:63). Eksempelvis immuniserte Erti et al. mus med

en Sendai virusspesifikk T-celleklon og frembrakte et anti-idiotype-mAb som regulerte DTH-responsen overfor Sendai-virus (H.C.J. Erti et al., 1982, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 79:7479). Som bevis for at et B-celleantistoff oppsto som respons på en T-celleidiotop, iakttok Kennedy et al. tumoravvisning, men ingen antitumorantistoffer i mus som var blitt behandlet med antiidiotop-antistoffer med relasjon til SV40 T-antigenet (R.C. Kennedy et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1432). Administrering av exogent antiidiotypeantistoff kari ha en fremmende eller undertrykkende innflytelse avhengig av - i tillegg til andre variabler - doseringen av antistoffet (M. Reth et al., 1981, Nature (London) 290:257).

2.2. Tumor- assosierte antigener

Det er blitt beskrevet mange forskjellige tumor-assosierte antigener (TAA). En klasse av TAA er den tumorspesifikke transplantasjonstype av celleoverflateantigen (TSTA) som er blitt erkjent ved fremkallelse av immunresponser

i tumortransplantasjonsforsøk.

En annen klasse av TAA er det oncoføtale antigen eller differensieringsantigenet. Oncoføtale antigener er hovedsakelig embryoniske eller føtale celleprodukter som uttrykkes av maligne celler på grunn av depresjon av de embryoniske gener. Et eksempel på humane oncoføtale antigener er de carcinoembryoniske antigener (CEA) i colon. Dette sett av antigener forekommer i vev erholdt fra det føtale gastrointestinale system, samt på tumorer i det gastrointestinale system. a-føtoprotein er et annet kjent oncoføtalt antigen som utskilles av hepatocarcinomaceller, samt av maligne celler fra plommesekk og føtal lever, og den del av lever-celler hos voksne som er under formering.

En tredje klasse av TAA omfatter viralt fremkalte tumorantigener. Disse antigener omfatter det av DNA-tumor-virus fremkalte T-antigen og omhyllingsantigenene av RNA-tumorvirus.

Mange forskjellige humane celleoverflate-TAA er blitt påvist i humant neoplasma ved hjelp av monoklonale museantistoffer (K.E. Hellstrom et al., 1982, Human Tumor-Associated Antigens Identified by Monoclonal Antibodies i Springer Seminars in Immunopathology: Mechanism of Host Resistance in Cancer, Springer, New York, s. 127-146,

M. Herlyn et al., 1984 i Contributions to Oncology, Karger, Basel, Sveits, bind 19, s. 160-170, R.A. Reisfeld og S. Seil, red., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, bind 27, Alan R. Liss, Inc., New York). Mange av disse antigener betegnes som oncoføtale da de uttrykkes sterkt av tumorer og visse embryoniske celler, og meget svakere av normale celler fra en voksen vert. Andre tumor-assosierte antigener er blitt påvist ved deres evne til å stimulere vertcelle-formidlet immunitet (CMI) i human cancer (K.E. Hellstrom og I. Hellstrom, 1969, Adv. Cancer Res. 12:167-223, W.J. Halliday og A.E. Maluish, 1982, i Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York, s. 1-26, R.B. Herberman, 1974, Adv. Cancer Res. 19:207-263, D.M.P. Thomson, 1980, Cancer Res. 29:627-629, W.J. Halliday et al., 1975, Int. J. Cancer 16:645-654) og i tumor-bærende dyr (L.A. Taranger et al., 1972, Science 176: 1337-1340, W.J. Halliday et al., 1974, Cell Immunol. 10:467-475, G. Steele et al., 1975, J. Nati. Cancer Inst. 54:959-967). Enkelte av disse antigener er også oncoføtale, men deres molekylære beskaffenhet og deres slektskap med de av monoklonale museantistoffer definerte antigener er ikke klarlagt. Det er nylig blitt oppnådd monoklonale rotteanti-stoffer mot antigener som er felles for muse-blærecarcinomer (I. Hellstrom et al., 1982, Int. J. Cancer 29:175-180, I. Hellstrom et al., 1985, Cancer Res. 45:2210-2218). Et av antistoffene, 6,10, viste seg å være spesifikt for et onco-føtalt blæretumorantigen (I. Hellstrom et al., 1985, Cancer Res. 45:2210-2188).

Umodifisert tumorantigen (H.C. Hoover et al., 1985, Cancer 55:1236-1243, M.B. Mclllmurray et al., 1978, Br. Med. J. 1:579-580) og levende rekombinante virus (P.L. Earl et al., 1986, Science 23:728-731, R. Lathe et al., 1987, Nature 236:878-880) er blitt anvendt i forsøk på å fremkalle terapeutisk nyttige antitumor-immunresponser.

2.3. Idiotypemanipulasjoner av tumorimmunitet

Adskillige idiotypemanipulasjoner av tumorimmunitet er blitt rapportert. Nepom et al. (1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:2864-2867) beskriver fremkallelse av tumorimmunitet hvor et oncoføtalt antigen er blitt innført i en xenogenisk vert. Det ble fremstilt polyklonale antiidio-typeantistof f er som gjenkjente idiotypedeterminanter på et museantistoff til p97<c->epitopen av humant melanomaantigen p97. De polyklonale antisera var i stand til å fremkalle både CMI og en Ab3-respons på p97 i mus. Forstrom et al. (1983, Nature (London) 303:627-629) anvendte et antiidiotypeantistoff til fremkallelse av CMI i mus overfor en syngenisk, kjemisk fremkalt sarcoma. I denne undersøkelse var anti-idiotypeantistof f et et auto-antistoff frembrakt ved hyper-immunisering overfor tumoren, og tumorantigenet var ikke et definert molekyl. Undersøkelsen av Flood et al. (1980, Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A., 77:2209-2213) og Binz et al. (1982, Int. J. Cancer 29:417-423) påviste idiotypemanipulasjoner av tumorimmunitet i syngeniske systemer med udefinerte antigen-molekyler. Flood et al. påviste at muse-antiidiotype-T-lymfocytter var i stand til å delta i en autoimmunreaksjon overfor fibrosarcoma-spesifitøce T-lymfocytter, og på denne måte innvirket negativt på et individs immunrespons på en tumor. Binz et al. anvendte antiidiotypeantistoffer til fremkallelse av in vitro-formering av T-lymfocytter som er spesifikt cytotoksiske overfor rotte-sarcomaceller.

Ytterligere undersøkelser har beskjeftiget seg med virkningen av antiidiotypeantistoffer på tumorvekst.

Tilkin et al. (1981, Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A. 78:1809-1812) viste at immunisering av mus med lymfeknuteceller som var blitt sensibilisert overfor et uidentifisert sarcoma-antigen, resulterte i tumoravvisning og vekstinhibering. Kennedy et al. (1985, J. Exp. Med. 161:1432-1449) beskrev undertrykkelse av tumordannelse i mus som var blitt utsatt for SV40-transformerte celler, etter injeksjon med polyklonale antiidiotypeantistoffer relatert til SV40-antigenet.

Koprowski et al. (1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:216-219) viste tilstedeværelsen av antiidiotypeantistoffer i pasienter med carcinomaremisjon etter administrering av et monoklonalt antistoff rettet mot human gastrointestinal cancer.

2.4. Suppressorceller og suppressorfaktorer

Suppressorcelle/faktor-kaskaden ble erkjent i tumor og modellsystemer (G.T. Nepom et al., 1983, Experientia 39:235, G.L. Asherson et al., 1984, Immunology 53:491, M.E. Dorf og B. Benacerraf, 1984, Ann. Rev. Immunol. 2:127). Suppressorceller spiller en viktig rolle ved reguleringen av tumorimmunitet (M.I. Greene et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:5118, K.E. Hellstrom et al., 1978, J. Exp. Med. 148:799, G.T. Nepom et al., 1983, Experientia 39:235,

R.J. North, 1982, J. Exp. Med. 155:1063, K. Yamauchi et al., 1979, J. Immunol. 123:1653). Enkelte av disse celler produserer suppressorfaktorer (SF) (K. Nelson et al., 1975, Int. J. Cancer 16:539, M.I. Greene et al., 1977, J. Immunol. 119:759, T.A. Koppi og W.J. Halliday, 1983, Cell. Immunol. 76:29), som kan påvises i sera fra tumor-bærende dyr og humane pasienter gjennom inhibering ("blokkering") av in vitro-manifestasjoner av celle-formidlet immunitet (CMI) (K.E. Hellstrom et al., 1978, J. Exp. Med. 148-799, I. Hellstrom et al., 1969, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 62:362, R.W. Baldwin,

1973, Adv. Cancer Res. 18:1, W.J. Halliday et al., 1974, Cell. Immunol. 10:467, G. Steele et al., 1975, J. Nati. Cancer Inst. 54:959, K.E. Hellstrom et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 473:121, W.J. Halliday et al., 1980, J. Nati. Cancer Inst. 65:327, T.A. Koppi og W.J. Halliday, 1981, J. Nati. Cancer Inst. 66:1089. V.K. Kuchroo et al., 1983, Cancer Res. 43:1325, T.A. Koppi et al., 1981, J. Nati. Cancer Inst. 66:1097). Enkelte SF har en tumorspesifisitet og kan fjernes fra serum ved absorpsjon med den respektive tumor eller det respektive tumor-beslektede antigen, men ikke med tumorer som uttrykker forskjellige antigener (V.K. Kuchroo et al., 1983, Cancer Res. 43:1325), R.W. Baldwin, 1973, Adv. Cancer Res. 18:1,

K.E. Hellstrom et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 473:121, T.A. Koppi-Reynolds og W.J. Halliday, 1984, Immunol. Lett. 8:219). Dette gir formodning om at det finnes et bindingssted eller en idiotop på SF-molekyler som er komplementær til tumorantigendeterminantene (G.T. Nepom et al., 1983, Experientia 39:235, K.E. Hellstrom et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 473:121). Det er blitt rapportert at sirkuler-ende SF binder til antistoffer fra mus som ble nyperimmunisert med tumorceller, hvilket gir formodning om at antistoffene er komplementære til idiotypedeterminanter på SF (K.E. Hellstrom et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 473-121, G.T. Nepom et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 74:4605). I disse undersøkelser gikk man ut fra at både antistoff og suppressor-celleresponsene var polyklonale. Visse immunsera erholdt etter fjerning av tumoren eller regresjon, opphever den antigenspesifikke, undertrykkende ("blokkerende") aktivitet av tumor-bærersera som målt in vitro (W.J. Halliday et al., 1974, Cell. Immunol. 10:467, I. Hellstrom og K.E. Hellstrom, 1970, Int. J. Cancer 5:195). Det er blitt oppstilt teorier om at denne "opphevende" virkning ble formidlet av antiidiotype-antistoffer (K.E. Hellstrom et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 473:121). Det er blitt rapportert at "opphevende" antistoffer hadde en terapeutisk virkning på rotter med primære eller transplanterte polyomavirus-fremkalte tumorer (S.C. Bansal og H.O. Sjogren, 1972, Int. J. Cancer 9:490,

H.O. Sjogren og S.C. Bansal, 1971, i Progress in Immunology, B. Amos, red., Academic Press, New York, s. 921, S.C. Bansal og H.O. Sjogren, 1971, Nature (New Biol.) 233:76).

3. Oppfinnelsens formål

Foreliggende oppfinnelse angår et monoklonalt anti-idiotypeantistof f for ikke-terapeutisk bruk, hvilket antistoff er kjennetegnet ved at det omfatter monoklonalt antistoff 2C1 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9484, hvilket antistoff 2C1 spesifikt gjenkjenner en idiotype som er til stede på et annet antistoff som definerer det humane melanoma-assosierte GD3-antigen. Oppfinnelsen angår også monoklonale antistoffer for ikke-terapeutisk bruk, hvilke antistoffer er kjennetegnet ved at det omfatter monoklonalt antistoff nr. 3 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9498, eller monoklonalt antistoff nr. 7 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9497, hvilket monoklonalt antistoff spesifikt gjenkjenner en idiotype som er til stede på et annet antistoff som definerer det humane melanoma-assosierte p97-antigen, og det omfatter monoklonalt antistoff L6 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 8677, monoklonalt antistoff nr. 11 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9544, det monoklonale antistoff nr. 12 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9681, eller det monoklonale antistoff nr. 14 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9680, hvilket antistoff spesifikt gjenkjenner en idiotype som er til stede på et annet antistoff som definerer et humant lungecarcinoma-antigen.

I spesielle utførelsesformer identifiseres monoklonale antiidiotype-antistoffer eller fragmenter derav, som (a) frembringes mot idiotypen av et antistoff som definerer et tumorantigen, slik som et oncoføtalt antigen eller et differensieringsantigen, og (b) utviser tumorspesifikke egenskaper slik som fremkallelse av tumorspesifikk, celle-formidlet immunitet (som målt ved forskjellige analyser, eksempelvis leukocyttadherensinhiberingsanalyse eller analyse av hypersensibilitet av forsinket type), inhibering av anti-tumor-antistoffbinding, etc.

I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for in vitro-overvåkning av nivåene av et antiidio-typeantistof f i en prøve fra en pasient som er under behandling med et antitumor-antistoff som uttrykker en idiotype rettet mot et definert tumorantigen, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at man måler nivået av antiidiotypeantistoffet i en prøve av pasientens sera ved en konkurrerende immunoanalyse under anvendelse av et monoklonalt antiidiotypeanti-stof f som spesifikt gjenkjenner idiotypen av antitumor-antistof fet .

Oppfinnelsen angår de monoklonale antiidiotype-antistof fmolekyler , antistoffragmenter eller kjemisk modifiserte antistoffer eller fragmenter som gjenkjenner en idiotype rettet mot et definert tumorantigen. Molekylene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved en hvilken som helst kjent teknikk, inklusive hybridomateknikken opprinnelig beskrevet av Kohler og Milstein (1975, Nature 256:495-497), human B-celle hybridomateknikken (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) og EBV-transformasjonsteknikken

(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan. R. Liss, Inc., s. 77-96).

Oppfinnelsen belyses ved eksempler i hvilke sero-terapi av mus ved injeksjon med antiidiotypeantistoffer beslektet med en murin fibrosarcoma forsinket tilsynekomst og forårsaket regresjon av transplantert sarcoma. Det ble etablert en T-cellelinje som uttrykte en idiotop rettet mot en fibrosarcoma, og som kunne overføre hypersensibilitet av

forsinket type til fibrosarcomaen.

I et annet eksempel beskrives et

monoklonalt museantiidiotypeantistoff som er spesifikt for en idiotype som gjenkjenner et humant melanoma-assosiert GD3-gangliosidantigen. Det ble påvist at antiidiotypeantistoffet forhindret binding av anti-GD3-antistoffet til dets antigen og inhiberte både komplement- og antistoffavhengig cytotoksisitet av anti-GD3-antistoffet. Ved å anvende antiidiotypeantistoffet som probe ble det utviklet en analyse-metode til overvåkning av humane antistoffer mot anti-GD3-antistoffet i pasienter som mottok anti-GD3-antistoffet i terapeutisk eller diagnostisk øyemed. I ytterligere et eksempel beskrives monoklonale muse-antiidiotypeantistoffer som gjenkjenner en idiotype rettet mot et humant melanoma-assosiert p97-antigen. Det ble oppnådd monoklonale antiidio-typeantistof f er som var i stand til konkurrerende å inhibere bindingen av p97 til anti-p97-antistoff.

I et annet eksempel beskrives murine, monoklonale antiidiotypeantistoffer som gjenkjenner en idiotype på monoklonalt antistoff L6 som definerer et carbohydratantigen i humane carcinomer. Det ble erholdt antiidiotypeantistoffer som var i stand til å fremkalle antistoffer in vivo som var reaktive med det av antistoff L6 definerte carcinomaantigen.

Antistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen, fragmenter av antistoffmolekylene som inneholder idiotypen av molekylene, eller kjemiske modifikasjoner av disse molekyler, kan anvendes til påvisning av tilstedeværelsen av antitumor-antistof f er, konkurrerende analyser til påvisning av tumorantigen.

3.1. Definisjoner

Som anvendt i det foreliggende, har forkortelsene følgende betydninger: Abl = antistoff 1, det innledende antistoff i

en antiidiotypeantistoffkaskade

Ab2 = antistoff 2, antiidiotypeantistoff rettet

mot en idiotype av Abl

Ab3 = antistoff 3, anti-antiidiotypeantistoff

rettet mot en idiotype av Ab2 ADCC = antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet anti-Id = antiidiotypeantistoff(er)

BTCC = blæreovergangscellecarcinoma

CDC = komplementavhengig cytotoksisitet CMI = celle-formidlet immunitet

DTH = hypersensibilitet av forsinket type FACS = fluorescensaktivert cellesorterer FCS = kalvefosterserum

FITC = fluoresceinisothiocyanat

HRP = pepperrotperoxydase

Id = idiotop

lg = immunoglobulin

i.p. = intraperitoneal

i.v. = intravenøs

kDa = kilodalton

KLH = albuskjell-hemocyanin

LAI = leukocyttadherensinhibering

mAb = monoklonalt antistoff eller monoklonale

antistoffer

MCA = 3-methylcholanthren

OPD = 0-fenylendiamin

par = parenteral (p97-negativ) C3H/HeN-musemelanomalinje K-1735-M2

PBS = fosfatbufret saltvann

PC = peritoneale celler

SC = miltceller

4. Beskrivelse av figurene

Figur 1. Skjematisk diagram av fire typer av idiotype- og antiidiotyperesponsen fremkalt ved antigen-stimuli. TH (fig. IB, ID) eller Tg (fig. 1C), som erstatter Abl ved stimulering av antiidiotypeantistoffproduksjon, er vist. Figur 2. Skjematisk diagram av tre veier gjennom hvilke Ab2 kan fremkalle antitumorimmunitet. Figur 2A viser fremkallelse av antigenspesifikk Tfl. ved immunisering med Ab2. Det er vist fremkallelse av generelt "tause" Abl-spesifisiteter (fig. 2B) sammen med utløsning av Id<+> Tg (figur 2C). Figur 3. Skjematisk diagram over immunisering med indre avbildnings-antiidiotypeantistoff til frembringelse av anti-antigenrespons.

Figur 4. Inhibering av mAb MG-21-binding til

M-2669 klon 13 celler ved dyrkningssupernatant av anti-idiotypeantistof f-produserende hybridom 2C1. Figur 5. Direkte binding av monoklonal antiidiotype-antistof f 2C1 til mAb MG-21. Forskjellige konsentrasjoner av mAb 2C1 (utfylte sirkler) eller kontrollimmunoglobulin Pl.17 (utfylte trekanter) ble tilsatt til polyvinylkloridbrønner som på forhånd var belagt med mAb MG-21. Figur 6. Spesifisitet av antiidiotype-mAb 2C1 overfor MG-21 sammenlignet med forskjellige mAb-er. Figur 7. Cellesorteringsprofiler av FITC-konjugert MG-21 overfor M-2669-celler i nærvær eller fravær av mAb 2C1. Tumorceller ble farget med FITC-konjugert MG-21 alene

(40 pg/ml, diagram a) eller forble ufarget under dannelse av bakgrunnsnivået (diagram b). Diagrammene c til f viser inhibering av farging med FITC-konjugert MG-21 i nærvær av mAb 2C1 ved forskjellige konsentrasjoner (diagram c, 160 yg/ml), diagram d, 80 ug/ml, diagram e, 40 yg'/ml, diagram f, 20 yg/ml).

Diagrammene g og h viser farging av FITC-konjugert MG-21 i nærvær av mAb 26,8 (160 yg/ml) og Pl.17 (160 yg/ml). Figur 8. Binding av renset antiidiotypeantistoff (Ab2) til Fab-fragmenter av anti-p97 mAb 96,5. Fab-antistoffragmenter av mAb 96,5 ble anbrakt på plater og ble blokkert, forskjellige fortynninger av Ab2 ble tilsatt, og bindingen av Ab2 ble påvist ved tilsetning av HRP-merket geite-antimuse-IgG som beskrevet i avsnitt 8.1.5. Figur 9. Ab2 kan inhibere bindingen av mAb 9 6,5 til SK MEL-28-celler. Anti-p97 mAb 96,5 (0,33 yg/ml) ble blandet med renset antiidiotypeantistoff (Ab2) (10 yg/ml) og ble tilsatt til SK MEL-28-celler som uttrykker ca. 400.000 molekyler av p9 7 pr. celle, og som var blitt anbrakt i brønner på "Immunolon"-plater. Bindingen av mAb 9 6,5 til cellene ble påvist ved en ELISA-test, og inhiberingen av denne binding med Ab2 ble beregnet. Figur 10. Konkurrerende inhibering med antiidiotype-125 antistoff (Ab2) av bindingen av I-merket p97 antigen til Fab-fragmenter av anti-p97 mAb 96,5. Forskjellige fortynninger av hvert Ab2 ble blandet med radiojodert p97, og bindingen av p9 7 til Fab-fragmenter av mAb 9 6,5 ble bestemt ved fast fase-analyse. Figur 11. Antiidiotypeantistoff (Ab2) kan inhibere bindingen av Fab-fragmenter av anti-p9 7 mAb 9 6,5 til radiomerket p97. Fab-fragmenter av mAb 96,5 ble anbrakt i brønner på "Immunolon"-plater, og Ab2 (10 yg/ml) ble tilsatt. Ab2 ble testet for deres evne til å redusere bindingen av radiomerket p97 til de Fab-belagte brønner ved å blokkere p97-bindings-stedene på Fab-fragmentene. Figur 12. Analyser av evnen av mAb som gjenkjenner forskjellige epitoper av p97-antigenet til inhibering av bindingen Ab2 til Fab-fragmenter av anti-p97 mAb 96,5. Hver anti-p97 mAb ble blandet med det Ab2 som skulle testes, og ble tilsatt til plater som var belagt med Fab-fragmenter av mAb 96,5, etterfulgt av tilsetning av geite-antimuse-IgGl-HRP til påvisning av bindingen av det respektive Ab2 til Fab-fragmentene. Bindingen av et gitt Ab2 ble testet alene (utfylte sirkler) eller i nærvær av Pl.17 kontrollimmunoglobulin (X—X) og ble sammenlignet med den binding som ble iakttatt etter tilsetning av forskjellige mAb-er som var spesifikke for p97 (åpne sirkler). Figur 13. Binding av antiidiotypeantistoff (Ab2) anbrakt på plater til forskjellige anti-p97 mAb-er, og virkningen derav på anti-p97 mAb'ets evne til etterfølgende å binde p97. Hvert Ab2 ble anbrakt på plater, forskjellige konsentrasjoner av anti-p97 mAb 8,2, 4,1 eller 96,5 ble tilsatt, og bindingen av hvert bundet anti-p97 mAb til radiojodert p97 ble målt. Figur 14. Binding av antiidiotypeantistoff (Ab2) anbrakt på plater til forskjellige anti-p97 mAb-er, og virkningen derav på anti-p97 mAb'ets evne til etterfølgende å binde p97. Hvert Ab2 ble anbrakt på plater, forskjellige konsentrasjoner av anti-p97 mAb 96,5 (diagram A, helopp-trukket linje), mAb 133,1 (diagram A, stiplet linje) eller mAb 133,3 (diagram B) ble tilsatt, og bindingen av ethvert bundet anti-p97 mAb til radiojodert p97 ble målt. Figur 15. Diagram A: Binding av musesera inneholdende Ab3 til p97 anbrakt på plater. Sera ble erholdt fra BALB/c-mus som var blitt immunisert med antiidiotypeanti-stof f er konjugert til KLH. Diagram B: Binding av mAb 96,5 og av sera samlet fra mus immunisert mot p97, til p97 anbrakt på plater. Figur 16. Inhibering av bindingen av p97 til Ab3 med p97-positive celler, men ikke med p97-negative celler. p97-positive 2A (p97 gentransfisert musemelanoma K-1735-M2-linje) celler, men ikke p97-negative (parental K-1735-M2) celler, var i stand til å inhibere bindingen av Ab3 fra immuniserte BALB/c-mus til p97 anbrakt på plater. Diagram A viser data fra mus immunisert med Ab2 nr. 3, og diagrammene B, C og D viser data fra mus immunisert med hhv. Ab2 nr. 7, nr. 4 og nr. 5. Figur 17. Antistoff som binder til p97 anbrakt på plater, ble testet etter absorpsjon av antistoffet med p97-

positive 2A-celler (2a), p97-negative parentale K-1735-M2-celler (par) eller antistoff alene. Diagram A: Absorpsjon av mAb 96,5 med 2A-celler inhiberer bindingen av mAb 96,5 til p97 anbrakt på plater. Diagram B: Absorpsjon av serumantistoffer (a-p97) fra mus immunisert med p97 med 2A-celler inhiberer bindingen av serumantistoffene til p97 anbrakt på plater. Diagram C: Serumantistoffer (a pl.17) fra mus immunisert med pl.17, binder ikke p9 7. Diagram D: Normalt museserum (NMS) binder ikke p97.

Figur 18. Binding til p97 anbrakt på plater av Ab3

i serum fra immuniserte mus. C3H/HeN-mus ble immunisert med antiidiotypeantistoffer (Ab2) konjugert til KLH. Binding av Ab3 i serum fra de immuniserte mus til p97-antigen ble påvist ved en fast fase-ELISA-test.

Figur 19. Binding av mAb 96,5 til p9 7 anbrakt på plater. Binding av anti-p97-mAb 96,5 til p97 anbrakt på plater, ble påvist ved en fast fase-ELISA-test. Figur 20. Inhibering av bindingen av mAb L6 til H-3347 carcinomaceller med renset Ab2. Ab2-konsentrasjoner var som følger: 0 50 Mg/ml, S 5,0 fig/ml, S3 0,5/ig/ml, ■ 0,05 fig/ml. mAb L6 ble anvendt i en konsentrasjon på 1,0 ug/ml. Figur 21. Binding av FITC-merket Ab2 til Fab L6-mettede H-3347-celler. Del A: Resultater er vist for følgende Ab2: -*- i, — o— 3, 9- 7, -£r 9, —•— 11,-B- 13,- År 15.

Del B: Resultater er vist for følgende Ab2:

-fr- 2, -A-4,-*-6, - Ar 8,-B- 10, 12,—*- 14.

LFE- (lineær fluorescensekvivalent) forhold er lik forholdet mellom prøvefluorescens og bakgrunnsfluorescens. Figur 22. Binding av FITC-merket Ab2 til PE-merkede L6-mettede H-3347-celler. Det testede Ab2 er vist under hver kurve. FITC-merket Ab2 , fycoerythrin-merket mAb L6 ved 1:25 fortynning av ca. 1 mg/ml oppløsning. RFL LFE-forhold: rød fluorescens lineær fluorescensekvivalent (forhold mellom prøvefluorescens og bakgrunnsfluorescens av fycoerythrin), GRFL LFE-forhold: grønn fluorescens lineær fluorescensekvivalent (forhold mellom prøvefluorescens og bakgrunnsfluorescens av FITC). Figur 23. Inhibering av binding av mAb F26 til H-3347-celler med L6 Ab2. Ab2-konsentrasjoner var som følger: 0 200 /ig/ml, H 20 Ag/ml, S 2,0 /ig/ml . mAb F26 ble anvendt 1 en konsentrasjon på 1,0 ug/ml.

Figur 24. Ab2-epitopspesifisitet. Konkurrerende analyser for L6 antiidiotype variabel områdespesifisitet ble utført som beskrevet i avsnitt 9.1.9. nedenfor. Konkurrenter ble tilsatt til en konsentrasjon på 6 yg/ml i 0,5 time før tilsetning av biotinylert kimærisk L6-antistoff, hvilket resulterte i en sluttkonsentrasjon på 4 yg/ml for sistnevnte. Konkurrentene var som følger: ■ kimærisk L6 mAb, fg den variable tunge kjede av kimærisk L6 mAb pluss J558L lambda I

lett kjede, □ variabel lett kjede av kimærisk L6 mAb,

£3 irrelevant humant IgGl (PW P3281B8). Den irrelevante humane IgGl viste ingen gjenkjennelse av noe V-kappe Ab2 for den tunge kimæriske L6-kjede og omvendt.

Figur 25. Inhibering av binding av Ab2 til Abl i nærvær av BALB/c- (del A) eller C3H/HeN- (del B) sera inneholdende Ab3. Fortynninger av Ab3-holdige sera var som følger:0 1:20, M 1:200,

1:2000, ■ 1:20.000 . Ab2 ble anvendt i en konsentrasjon på 1,0 yg/ml.

Figur 26. Binding av affinitetsrensede sera fra C3H/HeN-mus immunisert med Ab2 til H-3347 carcinomaceller.

Sera ble tatt ut 6 til 20 uker etter den første immunisering. Antisera var som følger: anti- Pl-17, H anti-Ab2 nr. 3,

-B- anti-Ab2 nr. ll,-#— anti-Ab2 nr. 12,-G- anti-Ab2 nr. 13,

- Ar anti-Ab2 nr. 14, - Ar anti-Ab2 nr. 15. Bindingen av mAb L6

ved en konsentrasjon på 0,016 yg/ml ( ) er også vist.

LFE- (lineær fluorescensekvivalent) forholdet er lik for-

holdet mellom prøvefluorescens og bakgrunnsfluorescens.

Figur 27. Binding av affinitetsrensede sera fra BALB/c-mus immunisert med Ab2 til H-3347 carcinomaceller.

Sera ble tatt ut 6 til 24 uker etter den første immunisering. Antisera var som følger: anti-Pl-17, —*—anti-Ab2 nr. 3,

—•—anti-Ab2 nr. 11, —e anti-Ab2 nr. 12, /\ anti-

Ab2 nr. 13, B anti-Ab2 nr. 14,—B—anti-Ab2 nr. 15. Bindingen av mAb L6 ved en konsentrasjon på 0,08 yg/ml ( ) er også vist.

LFE- (lineær fluorescensekvivalent) forholdet er lik forholdet mellom prøvefluorescens og bakgrunnsfluorescens.

5. Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår antiidiotype-antistoffer eller fragmenter derav som kan anvendes til overvåkning av anti-antistoffremkallelse i prøver fra pasienter som gjennomgår passiv immunisering med et tumorantigen ved administrering av antitumorantistoff.

Foreliggende oppfinnelse angår også antiidiotype-mAb-molekyler, eller fragmenter av antiidiotype-mAb-molekylene, eller modifikasjoner derav, som gjenkjenner en idiotype rettet mot et definert antigen som er spesifikt for en tumor. Slike tumorantigener omfatter antigener av fibrosarcoma, selv-differensieringsantigener slik som oncoføtal eller differensieringsantigener som uttrykkes av ondartede celler, innbefattet, men ikke begrenset til, oncoføtale antigener slik som carcinoembryoniske antigener (CEA) av colon, ct-føto-protein, den humane antigeniske motpart eller funksjonelle" ekvivalent til det murine 175 kDa antigen av blæreovergangs-cellecarcinomer, det melanoma-assosierte antigen p97 eller

GD3 og differensieringsantigener av humane lungecarcinomer slik som L6 og L20, beskrevet mer detaljert nedenfor.

mAb-molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter hele monoklonale antistoffmolekyler og fragmenter eller eventuelle kjemiske modifikasjoner av disse molekyler som inneholder antigenkombinasjonsstedet som binder til idiotypen av ett eller flere andre antistoffmolekyler med spesifisitet for et definert tumorantigen. Monoklonale antistoff-fragmenter inneholdende idiotypen av mAb-molekylet, kan dannes ved forskjellige teknikker. Disse omfatter, men er ikke begrenset til: F(ab')ragmentet som kan dannes ved behandling av antistoffmolekylet med pepsin, Fab'-fragmentene som kan dannes ved reduksjon av disulfidbroene i F(ab')ragmentet, samt 2Fab- eller Fab-fragmentene som kan dannes ved behandling av antistoffmolekylet med papain og et reduksjonsmiddel for reduksjon av disulfidbroene.

Avhengig av deres påtenkte anvendelse kan molekylene ifølge oppfinnelsen modifiseres kjemisk ved binding av en hvilken som helst av et utall forbindelser under anvendelse av kjente bindingsteknikker. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, enzymatiske metoder, oxydativ substitusjon, chelatering, etc, som f.eks. anvendes for binding av en radioisotop til immunoanalyseformål.

Den kjemiske binding eller kobling av en forbindelse til molekylet kan rettes mot et sted som ikke deltar i idio-typebindingen, f.eks. molekylets Fc~domene. Dette kan til-veiebringes ved en beskyttelse av molekylets bindingssted før utførelse av bindingsreaksjonen. Molekylet kan eksempelvis før bindingsreaksjonen bindes til den idiotype som det gjenkjenner. Etter avsluttet binding kan komplekset brytes under dannelse av et modifisert molekyl med minimal påvirkning av molekylets bindingssted.

I beskrivelsesøyemed kan fremgangsmåten oppdeles i følgende trinn: (a) dannelse av antiidiotype-mAb(er) (som kan være auto-antiidiotypiske) rettet mot en idiotype som binder et definert tumorantigen, (b) evaluering og påvisning av tumoridiotypespesifisitet av antiidiotype-mAb-molekylene eller deres derivatfragmenter, eksempelvis ved påvisning av immunostyrke ved fremkallelse av spesifikk CMI, av binding til spesifikke suppressor-T-celler eller suppressorfaktorer, av binding til spesifikke hjelper-T-celler, av inhibering av binding av antistoff rettet mot tumorantigenet, av inhibering av cytotoksisitetsegenskapene av antistoffet rettet mot tumorantigenet, etc, og (c) formulering av immunodiagnostiske for-skrifter.

I et modellsystem som beskrives i et spesifikt eksempel, ble det vist at behandling av mus med auto-antiidiotypeantistoffer relatert til et fibrosarcomaantigen, spesifikt reduserer veksten av etablerte sarcomaer. I et annet eksempel beskrives et murint monoklonalt antiidiotypeantistoff som gjenkjenner en idiotype rettet mot et GD3 gangliosidanti-gen av human melanoma. Dette antistoff var i stand til å blokkere bindingen av cytotoksisitetsegenskapene av antistoffet inneholdende den idiotype som det gjenkjenner. I et tredje eksempel beskrives murine monoklonale antiidiotype-antistoffer relatert til det humane melanoma-assosierte p97-antigen, hvilke antistoffer er i stand til konkurrerende å inhibere bindingen av p97 til anti-p97-antistoffet, og som kan fremkalle antistoffer til p97 in vivo. I ytterligere et eksempel beskrives dannelse og karakterisering av murine monoklonale antiidiotypeantistoffer som gjenkjenner en idiotype på monoklonalt antistoff L6 som definerer et carbohydratantigen av humane carcinomer. Det ble vist at flere av antistoffene er i stand til å fremkalle antistoffer in vivo til carcinomaanti-genet definert av antistoff L6. De beskrevne fremgangsmåter er imidlertid ikke begrenset til melanoma- eller fibrosarcoma-eller carcinomaantigener, men kan anvendes til frembringelse og anvendelse av antiidiotype-mAb-er relatert til et hvilket som helst spesifikt tumorantigen.

Anvendelse av antiidiotypeantistoffer til fremkallelse av immunresponser mot tumorer kan anses som to adskilte anliggender. For det første kan slike antistoffer anvendes til utvelgelse eller forsterkning av et allerede eksisterende antitumorrepertoar, dvs. til rekruttering via idiotype-utvelgelse av T- og/eller B-celler med spesifisitet overfor tumorantigen. For det annet kan antiidiotypeantistoffer anvendes som "interne bilder" av antigener til fremkallelse av en primær immunrespons som er anti-antiidiotypisk, og hvorav en del er rettet mot det nominelle tumorantigen. I sistnevnte tilfelle vil immunspesifisiteten være overfor antiidiotop snarere enn overfor antigen.

Ved anvendelse av antiidiotypeantistoffer til fremkallelse av immunitet kan det utvelges T- og B-celler som er forskjellige fra de som deltar i en naturlig forekommende antitumorrespons, enten som et resultat av oppregulering av en immunrespons som vanligvis undertrykkes, eller ved de novo-fremkallelse av en respons. Potensialet til å fremkalle effektiv antitumorreaktivitet i verter som ellers ikke er i stand til å oppnå en slik reaktivitet, har signifikant terapeutisk betydning.

5.1. Idiotypeinteraksioner fremkalt av antiqeniske

stimuli

For tilveiebringelse av manipulasjoner av tumoranti-geners idiotypegjenkjennelse må beskaffenheten av den naturlig forekommende idiotyperespons overfor en voksende syngenisk tumor tas i betraktning. Således skal arten av idiotyperepertoaret som respons på stimulering med et vilkårlig antigen, diskuteres.

Fire mulige idiotype- og antiidiotyperesponser som kan fremkalles med antigener, er belyst i fig. 1. Fig. IA viser en sekvensvis progresjon av fremkalte komplementære spesifisiteter. I denne type av idiotypekaskade fører immunisering med antigen til en populasjon av immunoglobuliner som bærer bestemte idiotyper hvis sum er kjent som idiotype-eller Abl-respons. Tilstedeværelsen av Abl fremkaller deretter en antiidiotyperespons som er karakterisert ved en heterogen populasjon av antistoffer, kjent som Ab2, som har spesifisitet for de forskjellige idiotoper i Abl-popula-sjonen. Retningen av den antigenfremkalte respons er vist ved pilene i fig. 1. Fremkallelse av Ab2 med Abl er uavhengig av antigen (J. Urbain et al., 1982, Ann. Immunol. 133D:179-189, L.S. Rodkey, 1974, J. Exp. Med. 139:712,

G. Kelsoe og J. Cerny, 1979, Nature 279:333). Det er støtte for denne modell (fig. IA) i tumorimmunitet (V.K. Lee et al., 1986, Biochim. Biophys. Acta 865:127-139, se eksemplene nedenfor).

En idiotypekaskade kan også føre til dannelse av Ab2

i henhold til den vei som er vist i fig. IB. Tumorantigengjenkjennelse fremkaller antigenspesifikke Tn-celler som bærer spesielle idiotoper, antagelig på deres antigenreseptor-molekyler. Disse T-celler stimulerer deretter dannelse av en antiidiotypeimmunoglobulinrespons i form av en populasjon av Ab2.

Hva innebærer en modell i hvilken idiotypekaskaden forløper skiftevis via antistoff og T-cellekomponenter? I

en analyse av idiotoper som er assosiert med responsen til MCA-fremkalte musesarcomaer eller carcinomer (V.K. Lee et al., 1986, Biochim. Biophys. Acta 865:127-139, se eksempel 6, 7

og 8, nedenfor), dannet immunisering med monoklonalt Ab2 ikke

Ab3 med Abl-lignende spesifisitet, mens antitumor T„ nlett

ble fremkalt. Denne iakttagelse, sammen med oppdagelsen av idiotype-positiv TR i den naturlig forekommende antitumorrespons, støtter en modell i hvilken det kan opptre en direkte regulatorisk vekselvirkning mellom Id+ T-celler og antiidiotype B-celler (og Ab2) K. Nelson og G.T. Nepom, 1986, i Paradoxes in Immunology, G. Hoffman et al., red., CRC Press, Boca Raton, Florida, s. 177-185, G. Bismuth et al., 1984, Eur. J. Immunol. 14:503, W.R. Thomas et al., 1983, J. Immunol. 130:2079). In vivo kan Id+ T-cellene tilveiebringe stimulus fra produksjonen av antiidiotype.

Fravær av Id+ B-cellegjenkjennelse i visse tilfeller kan avspeile en defekt i den genetiske evne med hensyn til dannelsen av antitumoridiotoper på immunoglobulinmolekyler. Alternativt kan den tumorbærende verts regulatoriske tilstand effektivt undertrykke Id+ Abl. Som angitt nedenfor, (se avsnitt 5.2.1.), kan denne tilsynelatende defekt omgås terapeutisk i en vert som vanligvis ikke utvikler Id+ antistoffresponser.

Utover idiotypevekselvirkninger som resulterer i en T ri-respons som fører til tumoravvisning, kan utsettelse for tumorantigen (eller antigenantistoffkomplekser) føre til dannelse av antigenspesifikke suppressor-T-celler (Tg)

(fig. 1C). I flere tumorsystemer har suppressor-T-celler vist seg å fungere som induksjonsceller som utløser og forsterker tumorantigenspesifikk undertrykkelse (G.T. Nepom et al., 1983, Experientia 39:235-242). Hvis Id+ Tg er direkte fremkalt ved antigenstimulering, som den modell som er vist

i figur 1C, er det mulig at disse celler slik som Tfl i figur IB, kan tjene som stimuli for dannelse av antiidiotype-Ab2.

I en modell hvor idiotype-Tg dannes etter stimulering med antigen, kan en alternativ vei også komme i betraktning. Som vist i diagramform i figur ID, kan Id+ Tg oppstå som en konsekvens av antiidiotypestimulering. I en nylig utført analyse av IgH-begrensede T-celleresponser på haptenazo-benzenarsonatet viste beskaffenheten av immunoglobulinidio-typer seg å bestemme utviklingen av Tg-idiotoper (K. Hayglass et al., 1986, J. Exp. Med. 164:36-49, K. Hayglass et al., 1986, Immunol. Today 7:179-183). T-celler som ble utviklet i IgH-kongeniske mus, antok vertens idiotyperepertoar, og behandling av nyfødte dyr med antistoffer til y-immunoglo-bulinkjeden opphevet etableringen av et normalt repertoar av funksjonelle T-celleidiotyper. Immunoglobulindelen kunne således bestemme utviklingen av komplementære T-celle-gjenkjennelseselementer.

Som belyst i eksemplene nedenfor, eksisterer den i fig. ID avbildede idiotypevei tilsynelatende også i forbindelse med tumorantigengjenkjennelse. I foreliggende under-søkelser på mus som enten led av sarcomaer eller blærecarcinomer fremkalt med MCA, viste det seg at en enkelt dominant T-celle-idiotop var fremherskende i den suppressor-respons formidlet både av Tg og oppløselige faktorer (se V.K. Kuchroo et al., 1987, Cellular Immunol. 104:105-114, og eksemplene i avsnitt 6 nedenfor). Dette betyr at det istedenfor en heterogen blanding av idiotyper er enkelte felles "offentlige" idiotoper som er fremtredende. Dette dokumen-teres ved å fjerne suppressorfaktorer under anvendelse av affinitetsabsorbenter fremstilt enten av monoklonale eller polyklonale antiidiotypeantistoffer. Foreliggende resultater viser at størstedelen av de synlige idiotypespesifisiteter i suppressorresponsen på et gitt tumorantigen er felles.

I modellsystemer er tilstedeværelsen av "offentlige" idiotoper blitt tilskrevet regulatoriske idiotoper som er viktige for nettverksvekselvirkninger (C. Bona et al., 1982, J. Exp. Med. 156:986). Tilstedeværelsen av slike formodede regulatoriske idiotoper i antitumorimmunitet kan enten avspeile en genetisk utvelgelse ved dannelsen av idiotype-T , eller en innflytelse av immunoglobulinutvelgelse på dannelsen av Tg-repertoaret. Hvis sistnevnte er tilfelle, kan frem-kallelsen av idiotype-Tg innbefatte den i figur ID viste vei, hvor Ab2-responsen har innflytelse på beskaffenheten av Tg.

5.2. Manipulering av idiotopekspresjon med

antiidiotypeantistoffer

Det finnes hovedsakelig to måter å anvende antiidio-typeantistof f er på til manipulering av immunresponsen overfor tumorantigener. Den ene er basert på utvelgelse og forsterkning av allerede eksisterende antitumoridiotoper innenfor T-og B-cellerepertoaret, og den andre innebærer priming av en de novo respons under anvendelse av en antiidiotype som fungerer som et internt bilde av tumorantigenet.

5.2.1. Utvelgelse og forsterkning av allerede

eksisterende antitumoridiotoper

Ved fremstilling av antiidiotypeantistoffer basert på en endring av en allerede eksisterende antitumoridiotoppresen-tasjon, er bestrebelsene basert på en reversering av de i figur 1 viste veier, hvor Ab2-delen anvendes som initiatoren for idiotypevekselvirkninger.

I figur 2 belyses tre veier via hvilke Ab2 kan fremkalle tumorantigenspesifikk immunitet. Figur 2A viser at immunisering med Ab2 kan føre til utvikling av antigenspesifikk T„H. Dette resultat ble oppnådd overfor infektiøse midler og har vist seg å gi beskyttelse mot sykdom (D. Sacks et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1108, A. Sharp et al., 1984,

J. Exp. Med. 160:1195, 1205, G. Fons et al., 1985, J. Immunol. 134:1225-1229). Analoge resultater er oppnådd for flere kjemisk og viralt fremkalte tumorer (R.C. Kennedy et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1432, N. Binz et al., 1982, Int. J. Cancer 19:417-423, A.F. Tilken et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 78:1809, P. Flood et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 77:2209-2213). Det anvendte Ab2 kan oppstå som et resultat av en antigenfremkalt idiotypekaskade eller kan fremkalles ved immunisering med antigenspesifikke T-celler (se avsnitt 5.3. i det etterfølgende).

Antiidiotypeantistoffer kan også stimulere "tause" kloner, dvs. kloner som vanligvis er undertrykt selv i genetisk kompetente individer (CA. Bona et al., 1981,

J. Exp. Med. 153:951). Antiidiotypeantistoffene er således tilsynelatende i stand til å "omprogrammere" immunsystemet til å danne antistoffer som ellers ikke ville bli fremstilt (fig. 2B). Således frembringer immunisering med antiidiotype-antistoffer som er relatert til kapselformige polysaccharider av E. coli, en beskyttende immunitet i nyfødte mus som ikke normalt utvikler antistoffer mot kapselpolysaccharidene

(K. Stein et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1001).

For at Ab2 skal kunne utvelge og stimulere både id+ fj-og T-cellekloner er det sannsynlig at det må eksistere felles idiotoper mellom B- og T-cellereseptorer (K. Rajewski og T. Takemori, 1983, Ann. Rev. Immunol. 1:569-607, H.C.J. Erti et al., 1982, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 79:7479,

P.I. Nadler et al., 19 82, Eur. J. Immunol. 12:113), svarende til antigenspesifikke reseptorer som tildeler både B- og T-celler samme antigenspesifisitet. En teknikk til utvelgelse av passende Ab2 som kan anvendes, er å frembringe Ab2 eksperimentelt ved immunisering med antigenspesifikke T-celler (A.J. Infante et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1100). I denne spesielle utførelsesform anvendes T-cellereseptoren som den stimulatoriske idiotype, slik at Ab2-populasjonen spesifikt vil bli målrettet mot de valgte T-celler. Immunisering med et slikt Ab2 vil deretter utvelge og stimulere T-cellekloner som har reseptoridiotoper felles med de immuniserende celler.

Adskillige forskere har rapportert om en vel-lykket kloning av tumorinfUtrerende T-lymfocytter utvunnet fra tumorbiopsier eller kirurgiske prøver. Etter dyrkning in vitro med IL-2 er disse lymfocytter virksomme til fremkallelse av antitumorresponser når de reinfuseres i verten (S.A. Rosenberg et al., 1986, Science 233:1318). I en utførelsesform skulle slike celler være ideelle immunogener til frembringelse av Ab2 rettet mot de bestemte idiotoper som er assosiert med slike antitumorkloner. Disse Ab2-er ville deretter tjene som antiidiotyper som potensielt vil utvelge og forsterke T-celler med lignende antitumorspesifisitet.

Som beskrevet ovenfor, synes antiidiotypespesifisi-teter i tumorimmuniserte mus å være komplementære ikke bare til TH, men også til Tg og oppløselige suppressorfaktorer (K.E. Hellstrom et al., 1977, Biophys. Biochim. Acta Reviews on Cancer 473:121-148, se avsnitt 8 nedenfor, H. Binz et al., 1982, Int. J. Cancer 19:417-423, A.F. Tilken et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 78:1809, P. Flood et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:2209-2213). Det forhold at antiidiotypeantistoffer gjenkjenner en dominant offentlig idiotop på Tg-avledede faktorer, antyder at det finnes en regulatorisk relasjon mellom den id+ cellulære del og Ab2-delen (se avsnitt 6 nedenfor, V.K. Kuchroo et al., 1987, Cellular Immunol. 104:105-114, K. Nelson og G.T. Nepom, 1986, i Paradoxes in Immunology, G. Hoffman et al., red., CRC Press, Boca Raton, Florida, s. 177-185). For å unngå den prefer-ensielle aktivering av Tg-delen ved administrering av antiidiotypeantistoffer (som vist i fig. 2C), og for å oppnå et virksomt resultat bør det ved antiidiotypeterapi mot cancer således anvendes en passende manipulasjon av idiotypenett-verket. En passende manipulasjon innbefatter hensyntagen til tre faktorer: den genetiske restriksjon mellom antiidiotype og T-celledelen, administreringsmåten for antiidiotypen og valget av idiotopspesifisitet.

5.2.1.1. Genetisk restriksjon

To typer av genetisk restriksjon kan potensielt

skape hindringer for cellerekruttering med injiserte antiidiotyper: MHC-restriksjon og IgH-restriksjon. MHC-restriksjon medfører et element av genetisk kontroll av C-celleaktivering ved en antigenspesifikk respons. I den utstrekning en antiidiotype etterligner antigen i gjenkjenn-elsesprosessen, er det logisk å overveie mulige krav til histoforenlighet. Det er faktisk beskrevet eksempler på at de antigen-primede T-celler er MHC-begrenset, ikke bare med hensyn til deres spesifikke antigengjenkjennelse, men også med hensyn til deres evne til å gjenkjenne cellebundet anti-idiotype in vitro (H. Erti et al., 1986, Int. Rev. Immunol. 1:61-66).

Hva innebærer disse resultater for in vivo administrering av antiidiotype? I en undersøkelse hvor det ble anvendt antiidiotype-priming for dannelse av antiviral immunitet, ble det iakttatt en genetisk respons uten restriksjon (id.). Dette kan muligens skyldes den direkte rekruttering av T„ risom deretter aktiverte andre T-celledeler. Selv om MHC-restriksjonselementet for anti-Id-presentasjon således er forskjellig fra elementet for nominell antigen-presentasjon, kan T-cellerekruttering stadig forekomme. Med en passende administreringsvei (se nedenfor) kan antiidiotype-antistoffer innføres i immunsystemet med antigen-frembydende celler på en slik måte at de kan "ses" i forbindelse med de riktige restriksjonselementer. En vert som ikke utviser genetisk respons på det nominelle antigen, kan tenkes å utvise respons når den utsettes for antiidiotype, avhengig av den mekanisme som opprettholder ikke-responsiteten. Således synes MHC-restriksjon å ha mindre betydning, med unntak av de tilfeller hvor det anvendes cellebundet antiidiotype.

I en utførelsesform bør problemet med IgH-restriksjon, dvs. nødvendigheten av genetisk motsvarighet av allo-typemarkører som er forbundet med immunoglobuliner, tas i betraktning. Da variabelt områdeantistoffgener er bundet til konstant områdegener, er det genetiske potensiale for spesifikke idiotypedeterminanter forbundet med Ig-allotypemarkører. IgH-restriksjon synes å styre mange trinn i idiotypekaskaden (B.A. Bach et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1084, P.I. Nadler et al., 1982, Eur. J. Immunol. 12:113, H. Yamamoto et al. 1983, J. Exp. Med. 158:635-640, J.W. Forstrom et al., 1983, Nature, 303:627-629). Hovedsakelig fungerer den som en "tillatende" barriere som krever tilstedeværelse av passende V-gener og bundne allotypemarkører for idiotype-anti-idiotypegjenkjennelse.

En streng IgH-restriksjon av immunresponsen overfor Ab2 gjenspeiler sannsynligvis krav til direkte gjenkjennelse av nettverk-V-gener. Dette er blitt betegnet som en "sann idiotype"-vekselvirkning (A. Nisonoff og E. Lamoyi, 1981, Clin. Immunol. Immunopathol. 21:397). Dette krav begrenser typen av antistoff som kan anvendes som antiidiotypeimmunogen, til en type som kan fremkalle komplementære V-gener i verten. I en spesiell utførelsesform bør eksperimentelt oppnådde anti-idiotypeantistof fer således ha IgH-motsvarighet til verten.

Når er IgH-motsvarighet ikke.nødvendig for anti-idiotypeadministrering? Antiidiotypeantistoffer som fungerer som interne bilder av det nominelle antigen, kan substituere denne immunisering med antigen. Da en slik de novo immunisering ikke er basert på en spesifikk utvelgelse av nettverks-V-gener, er internt bilde-immunogener vanligvis ikke IgH-begrenset (id.) og behøver således ikke å være verts-IgH-tilsvarende.

5.2.1.2. Immuniseringsvei

Immuniseringsveien med antiidiotype kan også ha innflytelse på immunresponsens beskaffenhet. Avhengig av administreringsveien har det vist seg at antiidiotypeantistoffer enten forsterker eller undertrykker immunresponser

(K. Rajewski og T. Takemori, 1983, Ann. Rev. Immunol. 1:569,

J. Urbain et al., 1982, Ann. Immunol. 1330:179). I et viralt system kunne reovirus-spesifikk immunitet eksempelvis etableres etter immunisering mot idiotype.determinanter, og det ble iaktatt DTH, cytolytiske T-celler og antigen-bindende antistoffer. Hvis oppløselig Ab2 ble anvendt som immunogen, ble DTH-responsen bare iakttatt, mens immunisering med celle-assosiert antiidiotype, i form av et hybridom-produserende Ab2, også fremkalte cytolytiske T-celler (H. Erti et al., 1986,

Int. Rev. Immunol. 1:61-66). Når Ab2 anvendes som et internt bilde-immunogen (som i reovirussystemet), erstatter det hovedsakelig antigen i den innledningsvise priming. Mange av de immunmanipulasjoner som letter antigenresponsitet, øker også immunitet mot Ab2 og kan anvendes i forskjellige utfør-elsesformer. (Se avsnitt 5.3.2. nedenfor).

I tilfelle av nominell antigenimmunisering har administrering av et haptenert protein s.c. med adjuvans vist seg å gi en kraftig T n-respons, mens samme antigen administrert intravenøst (i.v.) fortrinnsvis fremkalte Tg

(M. Greene et al., 1982, Adv. Immunol. 32:253). Når monoklonale antitumorantistoffer imidlertid ble anvendt terapeutisk, ble den motsatte situasjon rapportert av Koprowski et al. (H. Koprowski et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:216-219), som beskrev en antiidiotyperespons på systemisk injiserte museantistoffer til human gastrointestinal cancer, hvilken respons tilsynelatende ble ledsaget av en terapeutisk virkning på pasienten.

Det finnes også bevis på at Ab2 effektivt kan inhibere Abl's evne til å formidle antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet, eller drepe tumorceller i nærvær av komplement (se avsnitt 7.2.4. nedenfor).

Da såvel administreringsveien for Ab2 som den anvendte dosering, tilsynelatende har stor innflytelse på arten av den fremkalte respons, bør det i et foretrukket aspekt utføres foreløpige undersøkelser med hensyn til virkningen av dosering og administrering. Disse undersøkelser kan utføres på en dyre-modell slik som på mus, rotter, primater, etc. I en særlig utførelsesform kan forskjellige administreringsveier for anti-idiotypeantistof f relatert til melanomaantigenet p97, testes med hensyn til hvilke in vitro responser de fremkaller når de utsettes for en musemelanomalinje som uttrykker p97-antigenet (erholdt etter transfeksjon med det klonede p97-gen, Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546).

5.2.1.3. Idiotop spesifisitet

Komplekse antigener, innbefattende tumorantigener, inneholder multiple epitoper. Derfor inneholder den immungjenkjennelse som de fremkaller, mange idiotoper som ikke bare bestemmes ved epitopenes heterogenisitet, men også ved heterogenisiteten av V-genene valgt blant lg- og T-celle-reseptorgener i verten. Disse idiotoper er i stor utstrekning definert ved de antiidiotoper som de fremkaller. Således fremkaller private idiotoper Ab2-responser som er enestående for et gitt Abl, offentlige idiotoper fremkaller Ab2 til en spesifisitet som er felles for mange Abl-er, og Ab2 av internt bilde-typen fremkalles mot antigen-bindende struk-turer på Abl som er komplementære til antigenet (J. Urbain et al., 1982, Ann. Immunol. 125C:373-389, A. Augustin et al., 1983, Surv. Immunol. Res. 2:78, D. Mosier og A. Feeney, 1984,

i The Biology of Idiotypes, M. Greene og A. Nisonoff, red., Plenum Press, New York, s. 403-416).

I bestemte utførelsesformer kan sannsynligvis skift-ninger i idiotyperepertoaret manipuleres i et forsøk på å oppnå den ønskede idiotyperespons. Idiotoputvelgelse er f.eks. i vid utstrekning avhengig av det Ab2 som anvendes som immunogen. I et system med en dominant offentlig idiotop på både TH-og Ts-celler kan antiidiotypeantistoffer eksempelvis prime for TH hvis de administreres s.c. med adjuvans, eller de kan vekselvirke med oppløselige Ts-faktorer. Som illustrasjon fremkalte i undersøkelser på mus som var immune overfor haptener, og i hvilke offentlige idiotoper ble gjenkjent, en dominant Abl-respons med en felles offentlig idiotop, en sterk anti-Id-respons i mus av IgH-forenlige stammer. Hvis anti-Id ble gitt i.v. til nyfødte, eller hvis anti-Id Ts ble overført, ble den offentlige Abl-idiotop undertrykt, og dette viste seg å for-årsake ekspresjon av skiftende idiotoper på antigenspesifikk Abl (G. Kekoe et al., 1980, Immunol. Rev. 52:75). Når immunisering med anti-Id anvendes med henblikk på tumorterapi, kan en lignende skiftning i idiotyperepertoaret forekomme.

I et system som mangler en dominant offentlig idiotop, eller når det ikke identifiseres Abl, tilbyr idiotoputvelg-elsesprosessen oppmuntrende alternativer. Da administrering av Ab2 kan utvelge for skiftende idiotyperesponser, kan det i en særlig utførelsesform for styring av en antitumorrespons velges antistoffer mot idiotoper som ikke forekommer naturlig i den tumorbærende vert. Med andre ord kan det immuniseres med et Ab2 som utvelger et TH-repertoar som ikke kan utvelges ved utsettelse for tumorantigen. Eksempelvis kan det immuniseres med et monoklonalt, internt bilde Ab2 frembrakt mot et xenogenisk antitumorantistoff. Mange av de eksisterende monoklonale antitumorantistoffer er faktisk spesifikke for antigener som kanskje ikke en gang er immunogene i den tumor-bærende vert (K.E. Hellstrom og I. Hellstrom, 1985, i Monoclonal Antibodies for Tumor Detection and Drug Targeting, R.W. Baldwin og V.S. Byers, red., Academic Press, London, s. 17-51), og kan anvendes i denne utførelsesform.

5.2.2. Internt bilde- antistoffer

Ab2-immunisering kan føre til Ab3-fremkallelse, men ikke bare gjennom spesifikk V-gen nettverksvekselvirkninger, men også i kraft av internt bilde-etterligning (J. Urbain et al., 1982, Ann. Immunol. 133D:179-189, A. Augustin et al., 1983, Surv. Immunol. Res. 2:78). Det vil si at når antiidiotypen representerer det konformasjonsmessige speilbilde av antigenet, kan det substituere for nominelt antigen og fremkalle en Abl-lignende respons (A. Nisonoff og E. Lamoyi, 1981, Clin. Immunol. Immunopathol. 21:397) (fig. 3).

I en utførelsesform hvor det anvendes monoklonale antiidiotyper, bør det passende Ad2 utvelges omhyggelig. Den eksperimentelle bekreftelse av at et gitt Ab2 er et internt bilde-type av antiidiotype, avhenger av dets evne til å etterligne de konformasjonsmessige karakteristika som definerer gjenkjennelse av antigenet. Internt bilde-antiidiotyper konkurrerer in vitro med antigen om binding til idiotype-positivt Abl og primer in vivo for Ab3, som etterligner Abl, og denne priming foregår på en IgH ikke-restriktiv måte (Nisonoff og Lamoyi, ovenfor).

Utover inhiberingen av id+-binding til antigen kan intert bilde Ab2 substituere for antigen med hensyn til immungjenkjennelse. Ab2 kan eksempelvis stimulere antigen-spesif ikke kloner in vitro i fravær av antigen, eller Ab2+-celler kan tjene som et mål for antigenspesifikk CTL (H.C.J. Erti et al., 1982, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 79:7479). Da Ab2 substituerer for antigenkonformasjon, kan Ab2 "tilbys" til T-celler i disse analyser i en MHC-molekyl-sammenheng, og derfor kan responsen synes å ha MHC-restriksjon slik det er tilfelle for antigenspesifikk respons (id.).

I en utførelsesform hvor det ønskes internt bilde-immunogener, kan det anvendes xenogeniske antiidiotypeanti-stof f er. Det er mulig at internt bilde-immunogener ikke stimulerer suppressorceller selv om de samtidig fremkaller TH. Denne antagelse er basert på den i fig. ID og 2C skisserte forestil-ling at regulatoriske idiotoper som representeres ved uttryk-kelsen av dominante V-gener, bestemmer kommunikasjonen mellom Ab2 og Ts, og at det kan utvelges enkelte antiidiotypeanti-stof f er som mangler denne bestemte idiotop, men allikevel bibeholder de internt bilde-karakteristika som primer for TH.

Evnen av internt bilde Ab2 til å konkurrere med antigen om binding til Abl (og omvendt) er en integrert del av deres oppførsel. Ab2 som ikke fungerer som interne bilder, kan imidlertid på grunn av sterisk hindring (og kanskje også andre mekanismer) stadig konkurrere. »

Da forskjellen mellom internt bilde anti-Id og "sant" anti-Id leilighetsvis blir uklar, kan antiidiotypeantistoffer som ikke har internt bilde-spesifisitet, stadig utvise internt bilde-assosierte egenskaper som kan være av terapeutisk verdi. I foreliggende undersøkelse av monoklonale antiidiotyper dannet mot et murint blærecarcinomaantigen-assosiert, monoklonalt antistoff, fremkalte immunisering med antiidiotypene eksempelvis en kraftig Ab3-respons som manglet enhver påvise-lig antigenbinding (V.K. Lee et al., Biochim. Biophys. Acta 865:127-139). Ab3 dannet mot et gitt anti-Id, ble tilsynelatende rettet mot "private" spesifisiteter assosiert med denne antiidiotype. Selv om antiidiotypeantistoffene viste seg å inhibere antigenbinding med Abl, ble det antatt at dette skyldtes sterisk inhibering, og man har for-

søksvis fortolket betydningen av disse data slik at Ab2 ikke var internt bilde-antistoffer. De samme monoklonale Ab2-er var imidlertid overraskende i stand til å prime mus for antitumorresponser og likeledes til å binde til tumorspesifikke T-cellesuppressorfaktorer (V.K. Lee et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:6286-6290, V.K. Kuchroo et al., 1987, Cellular Immunol. 104:105-114). Da de monoklonale antiidio-typeantistof f er i disse forsøk ble dannet i mus og var rettet mot xenogeniske monoklonale antitumorantistoffer dannet i rotter, ville man ikke forvente at den antitumorrespons som ble fremkalt i mus ved Ab2-immunisering, var basert på spesifikk V-genutvelgelse, og kunne i stedet tilskrives internt bilde Ab2.

Et annet eksempel stammer fra forsøk i hvilke det

ble analysert idiotyperesponser på TMV-assosierte antigener hvor mus ble immunisert med kaninantiidiotypeantistoffer som var spesifikke for "private" kaninidiotoper (M. Francotte og J. Urbain, 1984, J. Exp. Med. 160:1485). Overraskende dannet disse mus anti-TMV-antistoffer som var idiotypisk kryss-reaktive med kaninidiotopene. Selv om den stimulatoriske antiidiotype således ikke var en "internt bilde"-spesifisitet, fremkalte den likevel antigenspesifikk informasjon på tross av synlig V-genuforenlighet.

5.3. Fremstilling av monoklonale antiidiotype-antistoffer som er spesifikke for en idiotype som gjenkjenner et definert tumorantigen

5.3.1. Fremstilling av monoklonale antiidiotype-antistoffer ved immunisering med et antistoff ( Abl) som gjenkjenner et definert tumorantigen

I en spesiell utførelsesform krever

dannelse av monoklonale antiidiotypeantistoffer som er spesifikke for en idiotype som gjenkjenner et definert tumoranti-

gen, immunisering av en vert med antistoffer som gjenkjenner det definerte tumorantigen. Som tidligere forklart, omfatter slike tumorantigener oncoføtal eller differensieringsantigener slik som CEA, a-føtoprotein, den humane antigeniske funksjonelle ekvivalent av det murine 175 kDa antigen av over-gangscelleblærecarcinom, melanoma-assosiert antigen p97 (se Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546), differensieringsantigener av humant lungecarcinom slik som L6 og L20 (se Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46:3917-3923), og differensieringsantigenet assosiert med human melanoma, GD3-gangliosidantigen, antigener av fibrosarcoma, o.l.

De mulige vertsarter omfatter forsøksdyr slik som mus, kaniner og sjimpanser, samt mennesker. Forskjellige adjuvanser kan anvendes for å øke den immunologiske respons på antistoffene, alt etter vertsarten, og innbefatter mineral-geler, f.eks. aluminiumhydroxyd, overflateaktive substanser slik som lysolecithin, plurone polyoler, polyanioner, peptider, oljeemulsjoner og potensielt anvendelige humane adjuvanser slik som BCG (bacillus Calmette-Guerin) og coryne-bacterium parvum.

Ab2 kan også kobles til en immunogen bærer, innbefattende LPS, eller kan tverrbindes med glutaraldehyd (CD. Primi et al., 1982, J. Immunol. 129:1124-1129). Immunogenet kan også inkorporeres i liposomer eller konjugeres til polysaccharider og/eller andre polymerer, eller på annen måte modifiseres kjemisk med henblikk på anvendelse. Allotypedeterminanter på selve Ab2-molekylet kan også anvendes for å øke immunogenisitet. I reovirussystemet ble det iakttatt en kraftig Ab3-respons når immuniseringen med Ab2 krysset allotypebarrierer, dvs. når verten var IgH-umake (H. Erti et al., 1986, ovenfor). Dette resultat antyder at Ig-allotypedeterminanter på antiidiotypen fungerte som hjelpedeterminanter med henblikk på økning av immunresponsen. I en særlig utførelsesform kan IgH-umake anvendes for å øke immunogenisitet.

Det monoklonale antistoff kan fremstilles ved anvendelse av en hvilken som helst teknikk som sørger for dannelse av antistoffmolekyler med kontinuerlige cellelinjer i kultur. Disse teknikker omfatter, men er ikke begrenset til, den 'hybridomateknikk som opprinnelig er beskrevet av Kohler og Milstein (1975, Nature 256:495-497), og den nyere humane B-celle-hybridomateknikk (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) samt EBV-transformasjonsteknikken (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., s. 77-96). Utvelgelse av hybridomet kan utføres ved en hvilken som helst blant tallrike analyser, f.eks. for binding til Abl, eller for inhibering av Abl-binding til tumorceller (G.T. Nepom et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:2864-2867, S.L. Holbeck og G.T. Nepom, 1983, J. Immunol. Methods 60:47-52, se avsnitt 7.1.7. nedenfor).

5.3.2. Fremstilling av monoklonale antiidiotype-antistoffer som er rettet mot en idiotop på T- celler som gjenkjenner et definert tumorantigen

I en annen utførelsesform dannes et antiidiotypeanti-stof f som er relatert til et tumorantigen, og som er rettet mot en idiotop assosiert med T-celler som gjenkjenner tumorantigenet. Idiotopen kan også være assosiert med suppressorfaktorer som utviser den idiotop som er rettet mot tumorantigenet. Slike tumorantigener omfatter de i avsnitt 5.3.1. ovenfor angitte tumorantigener. I en utførelsesform (se avsnitt 6 nedenfor) kan antiidiotypeantistoffet frembringes ved immunisering med tumorantigen, dannelse av hybridomer og screening med hensyn til monoklonale auto-antiidiotypeantistoffer ved fremgangsmåter som omfatter analyser av tumorspesifikk DTH, tumorspesifikk LAI, binding til monoklonalt antistoff rettet mot tumorantigenet, etc. I spesielle utførelsesformer kan det for dannelse av autoantiidiotypeantistoff anvendte tumorantigen, være spesifikt for fibrosarcoma, overgangscelleblærecarcinoma, det kan være melanomaantigen p97 eller GD3, eller humant lungecarcinomaantigen L6 eller L20. Alternativt kan T-celler (TH eller Ts) eller suppressorfaktorer som binder tumorantigen, anvendes til immunisering av en vert for dannelse av antiidiotypeantistoffet. I spesielle utførelseformer kan T-celler som uttrykker en idiotop definert av et antistoff som er spesifikt for fibrosarcoma, overgangscelleblærecarcinoma, p97 melanomaantigen, GD3-melanomaantigen, L6- eller L20-lunge-carsinomaantigen, anvendes til immunisering. Da injeksjon av

Ts-celler kan være ufordelaktig, foretrekkes immunisering

med Tg-celler. T-cellene anvendt til immunisering, kan eksempelvis oppnås fra selve den tumorbærende pasient eller fra en passende (fortrinnsvis histoforenlig) donor hvis immun-system er blitt utsatt for tumorantigenet. T-cellene kan deretter isoleres for injeksjon ved forskjellige kjente teknikker innen faget, eksempelvis fluorescens-merket monoklonalt antitumorantistoffbinding og FACS (se avsnitt 6.4. nedenfor). Suppressorfaktorer for immunisering kan isoleres ved mange kjente teknikker innen området, innbefattende immunoaffini-tetskromatografi (til en tumorantigen-belagt kolonne), dannelse av T-T-hybridomer ved fusjonering av T-celler fra tumorbærende verter (K.A. Nelson et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:2866) etterfulgt av screening, eksempelvis med hensyn til undertrykkelse av DTH til tumorantigen, spesifikk binding til tumorantigen, etc. (se avsnitt 6.5. nedenfor).

5.4. Evaluering og påvisning av immunostyrke ved

fremkallelse av tumorspesifikk CMI

Enhver fremgangsmåte som kan påvise antiidiotype-molekylets immunostyrke ved å vise fremkallelse av tumorspesifikk CMI ved immunisering med antiidiotypeantistoffet eller ett eller flere derivatfragmenter derav, faller innenfor rammen til evaluering av antiidiotype-mAb's immunostyrke. Slike analyser omfatter DTH (for en beskrivelse av DTH-analyseprosedyren se Forstrom et al., 1983, Nature (London) 303:627-629) og/eller LAI (W.J. Halliday og

A.E. Maluish, 1982, i Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York,

s. 1-26, T.A. Koppi og W.J. Halliday, 1982, Cell. Immunol. 66:394-406, T.A. Koppi og W.J. Halliday, 1981, J. Nati. Cancer Inst. 66:1089-1096). Ytterligere spesifisitets-testing kan omfatte immunoabsorpsjonsanalyser og behandling av peritoneale celler med antistoffer og komplement.

5.5. Ytterligere karakterisering av antiidiotype-antistof f

For ytterligere bestemmelse av antiidiotypeantistoff-spesifisitet kan det utføres Abl-bindingsanalyser og/eller analyser av inhiberingen av Abl-tumorbinding. Slike analyser kan utføres ved en hvilken som helst kjent metode innen området, f.eks. de som er beskrevet i avsnitt 7 nedenfor. To ytterligere analyser som kan utføres, omfatter tester ved-rørende inhibering av komplementavhengige cytotoksisitets-eller antistoffavhengige cellulære cytotoksisitetsegenskaper av Abl (se avsnitt 7.1.1.3. og 7.1.1.4. nedenfor).

5.6. Anvendelser innenfor immunoanalyse

Formålet med denne utførelsesform av oppfinnelsen er

å beskrive anvendelser av antiidiotypeantistoffmolekylene ifølge oppfinnelsen eller fragmenter av antistoffmolekylene som kan eller ikke kan være modifisert kjemisk, innenfor det medisinske område.

5.6.1. Immunoaffinitetsanvendelser

Antiidiotypeantistoffene eller beslektede molekyler ifølge oppfinnelsen kan anvendes til isolering av antistoffer som er rettet mot et definert tumorantigen. Kjente teknikker innen området ved hvilke dette kan utføres, omfatter immuno-af f initetskolonner og immunoabsorpsjonsreaksjoner. Antitumor-antistoff isolert ved anvendelse av antiidiotypeantistoffet eller beslektede molekyler, kan være et verdifullt redskap innenfor tumorimmunoterapi.

5.6.2. Immunoanalyser

I en alternativ utførelsesform av oppfinnelsen kan antiidiotypeantistoffene eller beslektede molekyler ifølge oppfinnelsen anvendes som antigener i immunoanalyser. Disse immunoanalyser vil gjøre det mulig å påvise antitumoranti-stof f er i dyr eller pasienter. Molekylene ifølge oppfinnelsen vil også kunne anvendes til konkurrerende immunoanalyser for testing med hensyn til tilstedeværelsen av tumorantigener.

Molekylene ifølge oppfinnelsen kan anvendes i et hvilket som helst immunoanalysesystem kjent innen faget, innbefattende radioimmunoanalyser, ELISA-tester, "sandwich"-analyser, utfellingsreaksjoner, geldiffusjonsutfellingsreak-sjoner, immunodiffusjonsanalyser, agglutineringsanalyser, komplementfikseringsanalyser, protein-A-immunoanalyser, fluorescensimmunoanalyser og immunoradiometriske analyser.

I en spesifikk utførelsesform kan antiidiotypeanti-stof f ene ifølge oppfinnelsen, som er rettet mot en idiotype av "antistoff 1" som definerer et tumorantigen, anvendes til konkurrerende immunoanalyser for overvåkning av tilstedeværelsen av antistoffer i pasienter til hvilke det administreres antistoff 1, til terapeutiske eller diagnostiske formål (se avsnitt 7.1.1.5. og 7.2.5. nedenfor). I en annen utførelsesform kan antiidiotypeantistoffer anvendes for identifisering av antitumorantistoffer under renseprosedyrer.

6. Monoklonale autoantiidiotypeantistoffer som binder til tumorspesifikke T- celler

Ifølge nettverksteorien (N.K. Jerne, 1974, Ann. Immunol. 125C:373, K. Rajewski og T. Takemori, 1983, Ann. Rev. Immunol. 1:569, J. Urbain et al., 1982, Ann. Immunol. 133D:179) bør mus som danner en immunrespons på syngeniske sarcomaer, ha antistoffer mot idiotypene av lymfocytter som utviser respons. Som beskrevet i de etterfølgende eksempler, ble BALB/c-mus på grunnlag av denne forutsigelse immunisert overfor en av de syngeniske, transplanterte fibrosarcomaer, og det ble dannet hybridomaer som frembrakte monoklonale antistoffer som primet syngeniske mus for tumorspesifikk DTH. Det ble påvist at et av disse monoklonale anti-antiidiotype-antistoffer definerer en idiotop som både foreligger på T-celler som utviser antitumoraktivitet, og på produkter av T-suppressorceller som inhiberer denne aktivitet. Det ble også påvist at behandling av mus med et av de to monoklonale antiidiotypeantistoffer reduserte veksten av etablerte sarcomaer signifikant, en virkning som var spesifikk for den passende mAb-tumorkombinasjon.

6.1. Materialer og fremgangsmåter

6.1.1. Mus

BALB/c-mus ble oppdrettet i The Division of Animal Health Resources, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC), Seattle, Wash., og ble utvalgt under hensyntagen til alder og kjønn i hvert forsøk. Det ble valgt hunndyr med en alder på over 10 uker, da disse i for-tester hadde gitt optimale responser. CB-20-mus ble oppdrettet på FHCRC fra avlspar oppnådd fra dr. Michael Potter, National Institute of Health.

6.1.2. Tumorer

Fibrosarcomaene MCA-1490, MCA-1510 og MCA-1511 ble fremkalt i BALB/c-mus ved intramuskulær injeksjon av 3-methylcholanthren i trioctanoin og ble opprettholdt ved syngenisk serietransplantasjon av vev nedfryst i annen generasjon.

Det viste seg at sarcomaene var frie for LDH-, Sendai- og ectro-meliavirus samt for mycoplasma, og som andre kjemisk fremkalte musesarcomaer uttrykte individuelt enestående tumorspesifikke transplantasjonsantigener. BW5147.G.1.4.oua<r>.1 er et lege-middelmerket AKR-thymoma som ble erholdt fra The Cell Distri-bution Center of the Salt Institute. NSl-celler kom fra dr. Ingegard Hellstroms laboratorium. Både BM5147- og NSl-celler viste seg å være frie for mycoplasma.

6.1.3. Analyse av hypersensibilitet av forsinket

type

En analyse som målte hypersensibilitet av forsinket type (DTH) som formidlet av Thy 1<+>, Lyt 1<+> lymfocytter, ble anvendt og karakterisert ved de typiske morfologiske mani-festasjoner av en DTH-reaksjon (J.W. Forstrom et al., 1983, Nature 303:627, J. Cory et al., 1981, i Monoclonal Antibodies and T. Cell Hybridomas, G.J. Hammerling et al., red., Elsevier/North-Holland Biomedical Press, s. 503). Mus ble immunisert ved subkutan injeksjon av enten i alt 1 x 10^ bestrålte (15.000 rad) tumorceller på to steder, et på hver side, eller ved injeksjon av 3-10 yg mAb (fortynnet i fosfatbufret saltvann, PBS) på fire subkutane steder. Når materiale ble analysert med hensyn til undertrykkelse av DTH, ble det alltid analysert med hensyn til undertrykkelse av dets fremkallende fase. I disse forsøk ble det formodentlige undertrykkende materiale fortynnet til 100 yl i PBS og ble injisert i en halevene umiddelbart etter immunisering.

I hver test med hensyn til DTH besto en behandlings-eller kontrollgruppe av 5 mus, og disse ble alltid kodet.

Fem dager etter immunisering ble DTH fremkalt ved injeksjon

av 5 x 10^ tumorceller i en av de to bakpote-tråputer. Etter 24 timer ble tykkelsen av både de injiserte og uinjiserte motsatte tråputer målt under anvendelse av et mikrometer.

For hver behandlingsgruppe er dataene angitt som den midlere økning i tykkelse (dvs. hevelsen) av de injiserte tråputer. Signifikansen av forskjellene mellom behandlede grupper og tilsvarende kontrollgrupper ble bestemt under anvendelse av en tosidig Students t-test.

6.1.4. Dannelse av monoklonale auto- antiidiotype-antistoffer

BALB/c-mus ble immunisert ved subkutan injeksjon av

1 x 10<7> trypanblå, ubeisede, dyrkede MCA-1490- eller MCA-1511-celler, etterfulgt av utskjæring av de resulterende tumor-noduler tre uker senere. Etter to ytterligere uker ble musene injisert med 2 x IO<6> bestrålte (15.000 rad) celler fra de respektive tumorer, og to uker senere ble musene injisert en gang til med samme dose. Miltceller ble erholdt 7 dager etter den siste injeksjon og ble fusjonert med NS-1 myelomaceller under anvendelse av tidligere beskrevne teknikker (M.Y. Yeh et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:2927).

Hybridomer ble først screenet med hensyn til produk-sjon av IgG-antistoffer under anvendelse av en konkurrerende radioimmunoanalyse (J.P. Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:4980), og de hybridomer som frembrakte mer enn 4 yg IgG pr. ml, ble ekspandert. Kultursupernatanter ble sammenblandet, idet hver blanding besto av supernatanter fra 5 hybridomer. Antistoffer ble renset fra hver samling ved affinitetskromatografi på S. aureus protein A som var kovalent bundet til Sepharose<®> CL-4B (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)

(J.P. Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:4980). Anti-

stoffløsningenes pH ble innstilt til 8,5 før kromatografi for å lette isolering av IgG^. BALB/c-mus ble immunisert ved injeksjon med de sammenblandede antistoffer og ble 5 dager senere utsatt for de passende tumorceller (MCA-1490-eller MCA-1511-celler) for fremkallelse av DTH. De indivi-duelle supernatanter av en blanding som var positiv ved testing, ble analysert med hensyn til priming av DTH til MCA-

1490 og MCA-1511, idet den ene av de to tumorer tjente som kontroll. 2 til 4% av brønnene fra hver fusjon viste seg å inneholde antistoffer med den ønskede aktivitet. Hybridoma-produserende antistoffer som primet for tumorspesifikk DTH, ble klonet to ganger ved grensefortynning, hvoretter positive kloner ble ekspandert og tilpasset vekst som ascitestumorer i pristan-primede BALB/c-mus (M.Y. Yeh et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76:2927). Monoklonale antistoffer ble renset fra ascitesvæsken ved affinitetskromatografi på

protein A Sepharose<®>. mAb 4,72 (svarende til MCA-1490) og mAb 5,96 (svarende til MCA-1511) ble anvendt i foreliggende undersøkelse. De var begge av IgGl-isotypen, slik som mAb 8,2 som ble anvendt som en kontroll i enkelte forsøk.

6.1.5. T- cellehybridomer

Flere hybridomalinjer ble oppnådd ved fusjon av BW5147-celler med thymocytter av MCA-1490-tumorbærende mus

som tidligere beskrevet (K.A. Nelson et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:2866, K. Nelson et al., 1985, i T-Cell Hybridomas, M.J. Taussig, red., CRC Press, s. 129). De fire anvendte hybridomer i denne undersøkelse frembrakte faktorer som undertrykte lyse av MCA-1940-celler med spesifikt immune

51

T-celler testet ved en Cr-frigjørelsesanalyse (K. Nelson et al., 1985, ovenfor). Kulturer av disse hybridomer og av BW5147-fusjonspartneren ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y.) som var supplert med 150 yl/ml kalvefosterserum, 100 enheter/ml penicillin, 100 yg/ml streptomycin og 290 yg/ml L-glutamin,

og ble bufret med natriumbicarbonat. Brukt medium ble fjernet fra celler i log-fasevekst når det var ca. 2 x 10 celler pr. ml. Mediet ble filtrert (0,4 ym, Millipore) og ble oppbevart ved -70°C inntil analyse fant sted.

6.1.6. Isolering av suppressorfaktorer ved

affinitetskromatografi med mAb

mAb 4,72 eller 5,96 ble anvendt sammen med et kontroll-mAb, 8,2, som også er av IgGl-isotypen og er spesifikk for et humant melanomaantigen, p97 (J.P. Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539). mAb ble fortynnet med PBS til 2 mg pr. ml og ble deretter koblet til et like stort volum "Affi-Gel" 10 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) ved inkubering over natten ved 4°C. Gelene ble vasket, ble inkubert med 0,1 M ethanolamin og ble anvendt til fremstilling av kolonner. Kolonnene ble vasket grundig med PBS og pre-eluert med 3 M NaSCH før anvendelse. Brukte dyrkningsmedier fra T-cellehybridomer (som en kilde for suppressorfaktor) eller BW5147-celler (som en kontroll) ble fortynnet 1:10 i PBS, hvoretter 0,2 ml av de fortynnede medier ble ført gjennom kolonner med 0,2 ml gel. Kolonnene ble vasket med PBS inntil 2 ml av avgangsvæske var blitt oppsamlet, hvoretter eluatene ble fortynnet 1:10 i PBS og analysert med hensyn til undertrykkelse av den induktive fase av DTH.

Det ble også utført forsøk med sera fra BALB/c-mus

som var blitt transplantert med enten MCA-1490- eller MCA-1511-tumorer, eller som var ubehandlede kullsøsken. Sera ble fortynnet 1:10 i PBS, hvoretter 0,5 ml av de fortynnede sera ble ført gjennom kolonner med 0,5 ml gel. Kolonnene ble vasket med PBS. De første 1,5 ml ble oppsamlet som eluat,

og ytterligere 5 ml ble kassert. Deretter ble bundne proteiner eluert fra kolonnen ved tilsetning av 0,5 ml 3 M NaSCN, og eluatene ble avsaltet ved passasje gjennom kolonner med Sephadex<®> G-25 ekvilibrert med PBS. Eluater og avgangsvæsker ble fortynnet i PBS under dannelse av en 1:100 fortynning i forhold til de opprinnelige sera. Disse ble deretter testet med hensyn til undertrykkelse av den induktive fase av DTH.

6.1.7. Binding av suppressorfaktor K54SF til MCA-1490- celler

Adherent dyrkede MCA-1490-celler ble inkubert i ethylendiamintetraeddiksyre (5 mM), ble vasket med PBS og inkubert i en 0,1% løsning av glutaraldehyd i 10 minutter ved 4°C. Cellene ble deretter inkubert i PBS med 0,5% kalveserum-albumin, etterfulgt av vasking med PBS. Brukte kulturmedier fra T-hybridoma I-K54 eller kontroll-BW5147-celler ble fortynnet 1:100 i PBS inneholdende 10 yg av enten mAb 4,72 eller mAb 8,2 (som en kontroll) og ble inkubert på is i 30 minutter. Deretter ble de tilsatt til 100 yl pakkede tumorceller som ble suspendert og inkubert ved romtemperatur i 10 minutter og på is i ytterligere 30 minutter. I et forsøk ble tumorcellene forbehandlet ved inkubering med antistoff og ble vasket tre ganger med PBS før tilsetning av fortynnede, brukte medier fra I-K54- eller BW5147-celler. Etter inkubering på

is ble tumorcellene vasket 5 ganger med 15 ml PBS og ble suspendert i 0,5 ml glycin-HCl-buffer (pH 3,0). Etter ytterligere inkubering på is i 10 minutter ble cellene pellettert ved sentrifugering ved 200 x g. Supernatantens pH-verdi ble umiddelbart innstilt ved passasje gjennom Sephadex<®> G-25 ekvilibert med PBS. Eluatene ble fortynnet 1:10 i PBS og ble analysert med hensyn til undertrykkelse av den induktive fase av DTH.

6.1.8. Isolering og dyrkning av T- cellelinjer

T-celler som reagerte med mAb 4,72, ble oppnådd fra lymfekjertler ved å drenere stedet for en progressivt voksende, transplantert MCA-1490-sarcoma. Cellene ble isolert ved sentrifugering på en Percoll-gradient (Pharmacia) og ble blandet med mAb 4,72 eller mAb 8,2 koblet med biotin. Cellene ble deretter vasket, behandlet med avidin-fluoresceinisothiocyanat (FITC), ble vasket ytterligere en gang og analysert på en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS-II, Becton-Dickinson). Sterkt fargede celler som bare ble iakttatt i den med mAb 4,72 behandlede prøve, og som representerte mindre enn 1% av prøven, ble oppsamlet. Disse celler, betegnet som 90,3, ble dyrket i Clicks medium supplert med 25% medium fra en kultur av rottemilteelier som var blitt stimulert med concanavalin A i 24 timer. Det ble iakttatt en kraftig vekst etter 25 dager, og denne ble opprettholdt ved ekspandering av kulturen i friskt medium med 7 2 timers mellomrom. En annen cellelinje,- 11,2, ble etablert ut fra Lyt-1 positive lymfocytter som var blitt oppnådd fra knuter ved å drenere stedet for en MCA-1511-tumor. Cellelinjen ble opprettholdt på lignende måte som linje 90,3. Cellene ble analysert mellom 6 og 18 uker etter etableringen av 90,3-eller 11,2-linjene. Normale T-celler fra lymfekjertler fra tumorfrie mus ble dyrket i 48 timer før de ble anvendt som kontrollprøver ved enkelte analysene.

7. Antiidiotypeantistoff som er spesifikt for en idiotype som gjenkjenner et humant melanoma- assosiert GD3-gangliosidantigen

Monoklonalt museantistoff (mAb) MG-21 (Hellstrom et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:1499-1502) gjenkjenner et GD3-gangliosidantigen uttrykt på overflaten av celler fra de fleste humane melanomaer og i spormengder på normale celler (W.G. Dippold et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77:6114-6118, E. Nudelman et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:12752-12756, M.Y. Yeh et al., 1982, Int. J. Cancer 29:269-275). mAb MG-21 påviser komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) overfor GD3-positive celler med humant serum som komplementkilde, og antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) overfor GD3-positive celler med humane lymfocytter (Hellstrom et al., 1985, ovenfor). GD3-antigenet hvortil MG-21 binder, er blitt anvendt med et visst hell som et mål for et passivt administrert muse-mAb, R24 (A.N. Houghton et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:1242-1246), hvis spesifisitet og biologiske aktivitet ligner MG-21's.

Som beskrevet i de nedenfor angitte eksempler, ble MG-21

(Abl) anvendt som et immunogen til frembrignelse av et monoklonalt muse-antiidiotypeantistoff (Ab2) som ble betegnet som 2C1. Dette mAb, som er et IgG2a, ble utvalgt på grunn av sin evne til å inhibere bindingen av MG-21 til en GD3-positiv melanomacellelinje. Det ble funnet at mAb 2C1 er meget til-bøyelig til å binde til Mg-21, men ikke til noen av seks andre muse-mAb-er. Det kunne fullstendig oppheve bindingen av MG-21 til GD3-positive melanomaceller, samt til renset GD5, og det inhiberte CDC- og ADCC-egenskapene av MG-21 på en doseavhengig måte. Ved anvendelse av mAb 2C1 som en probe ble det utviklet en analyse til overvåkning av humane antistoffer overfor mAb MG-21 i pasienter som mottok mAb MG-21 til terapeutiske eller

diagnostiske formål. En detaljert beskrivelse av hvert trinn i denne utførelsesform av oppfinnelsen følger i de etterfølg-ende underavsnitt.

7.1. Materialer og metoder

7.1.1. Mus

8 til 12 uker gamle BALB/c-hunnmus ble kjøpt fra Animal Facilities, Fred Hutchinson Cancer Research Center (Seattle, WA).

7.1.2. Målceller

Det ble anvendt human melanomacellelinje M-2669

klon 13. For enkelhets skyld betegnes den her som M-2669. Den var blitt etablert fra en metastatisk melanoma og klonet (P.L. Beaumier et al., 1986, J. Nucl. Med. 27:824-828). Celler fra denne klon uttrykker sterkt det av mAb MG-21 definerte GD3-antigen som vurdert ved en bindingsanalyse (id.). Melanomacellene ble dyrket i 6% C02 i luft i RPMI 1640 dyrkningsmedium (Gibco, Grand Island, New York) inneholdende 15% varmeinaktivert kalvefosterserum (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) og supplert med 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin og 290 mg/liter L-glutamin.

7.1.3. Glycolipid

GD3-gangliosidantigen ble renset fra M-2669 klon 13 melanomaceller som beskrevet av (E. Nudelman et al., 1982,

J. Biol. Chem. 257:12752-12756), og ble levert fra

dr. Sen-itirch Hakomori, Fred Hutchinson Cancer Research Center (Seattle, WA).

7.1.4. Monoklonale antistoffer

MG-21 (I. Hellstrom et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:1499-1502) er et IgG3-antistoff som binder til et GD3-gangliosidantigen som uttrykkes sterkt på ca. 80-90% av humane melanomaer (E. Nudelman et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:12752-12756, M.Y. Yeh, 1982, Int. J. Cancer 29:269-275). MG-21 kan formidle CDC i nærvær av humant serum og ADCC i nærvær av humane perifere blodlymfocytter (PBL), og det kan inhibere fremveksten av humane melanomaxenotransplantater i nakne mus (I. Hellstrom et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:1499-1502).

mAb 2A-14 er et IgG3 som også binder til GD3-ganglio-sidantigenet, men til en epitop som ved kryssblokkerings-forsøk synes å være forskjellig fra den av MG-21 gjenkjente epitop.

mAb 96,5 er et IgG2a som binder til p97, et melanoma-assosiert celleoverflateglycoprotein (J.P. Brown et al., 1981, J. Immunol.. 127:539-546).

mAb L6 er et IgG2a som binder til et carbohydratantigen som uttrykkes sterkt på celler fra de fleste humane carcinomaer, men ikke fra melanomaer (I. Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46:3917-3923).

mAb L20 er et IgGl som identifiserer et 110 kd protein som uttrykkes på overflaten av celler fra de fleste humane carcinomaer, men ikke fra melanomaer (id.)r

mAb 7T1.1 er et IgG3 immunoglobulin som er spesifikt for blodgruppe A antigen som uttrykkes sterkt på mange humane carcinomaer.

mAb 1G3.10 er et IgG3 antistoff som er spesifikt for blodgruppeA-lignende antigen, som også uttrykkes på mange humane carcinomaer.

mAb 26,8 som ble anvendt som en Ab2-kontroll, er et IgGl som binder til en idiotop på mAb 96,5 som er spesifikk for p97-melanomaantigenet. mAb 26,8 kan inhibere bindingen av mAb 96,5 til p97.

Pl.17 er et IgG2a-musemyelomaprotein som ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC-løpenr. TIB 10).

Antistoffer ble renset enten fra brukt dyrkningsmedium eller ascitesvæske ved affinitetskromatografi på protein A-Sepharose<®> CL-4B som beskrevet av Ey et al. (1978, Immuno-chemistry 15:429-436).

7.1.5. Kobling av antistoff med albuskjell- hemocyanin Antistoff MG-21 ble koblet med albuskjell-hemocyanin (KLH) ved kjemisk tverrbinding i nærvær av glutaraldehyd i henhold til de av Bona et al. (1979, J. Exp. Med. 149:815-823) beskrevne prosedyrer. I korte trekk ble 1 ml mAb MG-21-

løsning (3,6 mg/ml) blandet med 1 ml KLH-løsning (3 mg/ml)

i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,5. Koblingen ble startet ved tilsetning av 1 ml av en 0,25% oppløsning av glutaraldehyd

(Sigma Chemical, St. Louis, MO). Blandingen ble rystet ved romtemperatur i 1 time. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 250 ul 1 M glycin. Antistoff-KLH-konjugat ble lagret i fryst tilstand ved -20°C før anvendelse.

7.1.6. Fremstilling av monoklonale antiidiotypeantistoffer ( Ab2) som er spesifikke for MG- 21 ( Abl) To 8 uker gamle BALB/c-hunnmus ble immunisert intraperitonealt (i.p.) med 100 ug MG-21-KLH-konjugat i Freunds komplette adjuvans. To uker senere ble samme mengde konjugat gitt i.p. i Freunds ufullstendige adjuvans. Ytterligere 8 uker senere ble musene igjen injisert med konjugat i saltvann. Fire dager etter siste immunisering ble milten fjernet og de erholdte celler fusjonert med NS-1 musemyelomaceller under anvendelse av polyethylenglycol. Hybridomer som utskilte antiidiotypeantistoffer som er spesifikke for MG-21, ble utvalgt, dyrket i HAT-medium og klonet under anvendelse av velkjente prosedyrer (M.Y. Yeh et al., 1979, Proe. Nati.

Acad. Sei. U.S.A. 76:2927-2931).

7.1.7. mAb-( Abl) bindingsinhiberingsanalyse

Enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISA-tester)

for antistoffbinding ble anvendt til den innledende screening av hybridomer som utskilte antiidiotypeantistoffer. I denne analyse ble hybridomdyrkningssupernatanter analysert med hensyn til inhibering av binding av MG-21 ("Abl") til M-2669-celler som tegn på tilstedeværelse av antiidiotypeantistoffer ("Ab2"): M-2669-melanomaceller podet i polyvinylkloridplater (10 5 celler/brønn) og fiksert med 0,5% glutaraldehyd, ble anvendt som mål. 100 ul mAb MG-21 (5 ug/ml) ble blandet med like store volumer av hybridomsupernatanter, ble inkubert ved 4°C

i 2-4 timer og ble deretter tilsatt til målcellene. Etter en ytterligere inkubering i 1 time ved 37°C ble platene vasket tre ganger med 0,05% Tween<®->20 i PBS (PBS-Tween<®> buffer). Cellene ble deretter inkubert med 100 ul geite-antimuse-IgG antistoff-peroxydasekonjugat (Boehringer Mannheim Biochemicals,

Indianapolis, IN) fortynnet 1/10.000 i PBS-Tween<®> buffer ved 37°C i 30 minutter, og ble deretter på nytt vasket. 100 ul o-fenylendiamin (OPD) inneholdende 0,015% H202 i citrat-'fosfat, pH 5,0, ble fordelt i hver brønn som substrat for peroxydase. Ca. 3-5 minutter senere ble 100 ul 1/3 N H2S04 tilsatt for blokkering av enzymsubstratreaksjonen. Absorbans ble målt ved 492 nm/630 nm dobbelt bølgelengde for hver brønn i et GSC-mikroplateavlesningsapparat (Genetic System Corp., Seattle, WA).

Til undersøkelse av doseavhengigheten av den inhibi-toriske virkning av antiidiotypeantistoff (Ab2) på bindingen av MG-21 (Abl) til celler og GD3-antigen, ble 100 ul av en fast konsentrasjon (5 ug/ml) av MG-21 blandet med 100 ul av forskjellige konsentrasjoner av passende antiidiotype- eller kontrollantistoffer, ble inkubert ved 37°C i 1 time og ble deretter tilsatt til brønner som på forhånd var belagt med M-2669-celler (10 5/brønn) eller renset GD3-antigen

(200 ng/50 ul/brønn). De øvrige prosedyrer var de samme som angitt ovenfor.

7.1.8. Bestemmelse av immunoglobulinisotype Det ble anvendt geité-antisera mot den spesifikke klasse av muse-immunoglobulin (Southern Biotechnology Assoc, Birmingham, AL). 50 ul av hvert slikt antiserum ble fortynnet i PBS (1 ul/ml), ble anbrakt i plater med 9 6 brønner (Dynatech, Alexandria, VA) og ble inkubert over natten ved 4°C. Platene ble vasket en gang med PBS-Tween<®> buffer og ble deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur med 100 ul RPMI 1640 medium pr. brønn, inneholdende 15% kalvefosterserum (FCS). Etter vasking ble 50 ul brukt hybridomdyrknings-medium tilsatt, etterfulgt av inkubering av platene ved romtemperatur i 1 time og en vaskning med PBS-Tween<®> buffer. 50 ul geite-anti-muse IgG-antistoffkonjugat fortynnet 1/10.000 i PBS-Tween<®> buffer ble deretter tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i 30 minutter ved 37°C og ble vasket fem ganger med PBS-Tween<®> buffer, hvoretter det ble tilsatt 100 ul OPD-substrat til hver brønn. Fem minutter senere ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 100 ul 1,3 N H2S0^, og absorbansen ble målt i et GSC-mikroplateavlesningsapparat.

7.1.9. Antiidiotypeantistoff-( Ab2) bindingsanalyse

Det ble anvendt en bindingsanalyse til bestemmelse

av om Ab2<1>s evne til å inhibere binding av MG-21 (Abl) var spesifikk. 0,5 ug/100 ul renset MG-21 ble tilsatt som belegg til hver brønn i polyvinylkloridplater med 96 brønner (Costar, Cambridge, MA), hvoretter det ble tilsatt 200 ul RPMI 1640-medium pr. brønn inneholdende 15% FCS som en "blokkerer" for å hindre antistoffbinding til plastmateriale. Etter vasking ble det tilsatt 100 ul renset Ab2 eller kontroll-immunoglobulin Pl.17 ved forskjellige konsentrasjoner. Platene ble inkubert ved 37°C i 30 minutter og ble deretter vasket tre ganger med PBS-Tween<®> buffer. 100 ul perodoxydase-konjugert kanin-anti-muse-IgG som hadde samme isotype som Ab2, ble deretter tilsatt etter fortynning i PBS-Tween<®> buffer. Etter inkubering i 30 minutter ved 3 7°C, etterfulgt av grundig vasking, ble det tilsatt 100 ul OPD-substrat, og platene ble inkubert i 3-5 minutter i mørke. Til slutt ble det tilsatt 100 Ul 1,3 N H2S04- Platene ble avlest med et GSC-mikroplateavlesningsapparat.

7.1.10. Radiojodering av antistoff og direkte

125

I- Ab2 bindingsanalyse

100 ul renset mAb ble inkubert med 500 uCi Na<1>25I (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) og 40 ug klor-amin-T i 500 ul PBS ved 4°C i 3 minutter. Merket mAb ble separert fra fritt <125>I ved gelfiltrering på en Sephadex<®> G-25 kolonne. Den spesifikke aktivitet var ca. 4 x 10 g cpm/ug. Det merkede mAb ble fortynnet i 15% FCS i PBS før anvendelse.

125

For en direkte I-Ab2 bindingsanalyse ble 100 ul av forskjellige rensede mAb-er (50 ug/ml) i 15 mM NaHCO^ ved pH 9 anbrakt i plater med 96 brønner (Dynatech, Alexandria, VA) ved 4°C over natten. Etter vasking ble brønnene blokkert ved inkubering over natten ved 4°C med 200 ul RPMI 1640 medium inneholdende 15% FCS. Platene ble vasket tre ganger med PBS-Tween<®> buffer, og 2,5 x IO<5> cpm merket Ab2 i 100 ul 30% FCS ble tilsatt til hver brønn og ble inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter grundig vasking ble den bundne radio-aktivitet oppløst i 100 ul 2 M NaOH, ble overført til testrør og ble tellet i en gammateller (Beckman, Irvine, CA).

7.1.11. Antistoff- FITC- konjugering

Fluoresceinisothiocyanat (FITC) ble konjugert til

mAb MG-21 som beskrevet av Goding (J.W. Goding, 1976, J. Immunol. Methods 13:215-226). I korte trekk ble 2 mg renset MG-21 dialysert over natten over i 0,2 M carbonat/bicarbonat-buffer, pH 9,5. FITC (Molecular Probes Inc., Junction City, OR) oppløst i dimethylsulfoxyd (1 mg/ml) ble tilsatt i et forhold på 40 ug FITC/mg antistoff. Blandingen ble inkubert ved 37°C i 45 minutter, hvoretter konjugert mAb ble separert fra fritt FITC ved passasje gjennom en G-25 Sephadex<®->kolonne ekvilibrert med PBS inneholdende 0,1% NaN^. Fluorescein/antistoff-konjugeringsforholdet var ca. 3,5 til 4,0. Det konju-gerte mAb ble lagret ved -20°C i PBS inneholdende 1% kveg-serumalbumin (BSA).

7.1.12. Fluorescensaktivert cellesorteringsanalyse

Til bindingsinhiberingsanalyse under anvendelse av

et fluorescens-aktivert cellesorteringsapparat (FACS) ble 100 ul FITC-konjugert MG-21 inkubert i 30 minutter ved 37°C med 100 ul renset Ab2 eller kontrollantistoffer i forskjellige konsentrasjoner i 10% normalt museserum. Antistoffblandingene ble deretter tilsatt til testrør inneholdende 1 x 10 para-formaldehyd-fikserte M-2669 celler i 100 ul PBS. Etter 30 minutters inkubering ble cellene vasket to ganger med PBS og ble deretter analysert med et Coulter Epics C fluorescens-aktivert cellesorteringsapparat (Coulter Corporation, Hialeah, FL). Dataene ble uttrykt som lineær fluorescensekvivalent (LFE) som representerer relativ fluorescensintensitet.

7.1.13. Komplementavhengig cytotoksisitetsanalyse

Til testing av om Ab2, som er spesifikk for MG-21, kan inhibere komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) av mAb

51

MG-21, ble en fire timers Cr-frigjørelsesanalyse anvendt

(I. Hellstrom et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:1499-1502). I korte trekk ble 10 4 målceller merket med

51 o

100 yCi Cr i 2 timer ved 37 C. Etter merking ble cellene vasket tre ganger, ble resuspendert i RPMI 1640 medium inneholdende 15% FCS, og 20.000 merkede celler ble suspendert i 45 ul RPMI 1640 medium og ble podet i hver brønn på mikro-

titerplater med V-formet bunn (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA). Forskjellige konsentrasjoner av renset MG-21 ble kombinert med forskjellige konsentrasjoner av renset Ab2 (eller kontroll-mAb) for å teste inhiberingen av CDC. De ble tilsatt i 90 ul pr. brønn, etterfulgt av 65 ul ufortynnet, uoppvarmet, humant serum pr. brønn. Etter inkubering i 4 timer ved 37°C ble platene sentrifugert ved 400 x g, 100 ul supernatanter ble fjernet fra hver brønn, og radioaktivitets-nivået ble bestemt med en gammateller (Beckman, Irvine, CA). Spontan frigjørelse ble definert som cpm som ble frigjort i mediet fra målceller som ikke var blitt utsatt for antistoff eller komplement, og den samlede frigjørelse ble vurdert som cpm frigjort fra målceller som var blitt osmotisk lysert.

Den prosentvise cytotoksisitet ble beregnet med følgende formel:

7.1.14. Antistoffavhengig, cellulær cytotoksisitetsanalyse

Til testing av om Ab2 kan inhibere den antistoffavhengige, cellulære cytotoksisitet (ADCC) av mAb MG-21, ble det anvendt en fire timers frigjørelsesanalyse. PBL fra friske mennesker ble anvendt som effektorceller. De ble separert på Ficoll-Hypaque og ble på forhånd screenet med hensyn til lav naturlig dreper-(NK) celleaktivitet. Det ble bare anvendt lymfocytter med lav NK-aktivitet (mindre enn 10% ~* Cr-frigjørelse over fire timer) . Etter merking av målcellene ble de anbrakt pa mikrotiterplater (2 x 10 4 celler/50 ul) som ved CDC-analysen. 50 ul renset MG-21 og 50 ul renset Ab2 (eller kontroll) mAb ble tilsatt i forskjellige konsentrasjoner, etterfulgt av 2 x 10 g lymfocytter pr. brønn i 50 ul medium. Forholdet mellom lymfocytter og målceller var 100:1. Blandingene ble inkubert i 4 timer ved 37°C i 6% C02 i luft-atmosfære. Platene ble deretter sentrifugert, og 100 ul supernatant ble overført fra hver brønn til radioaktivitetsmåling. Den prosentvise cytotoksisitet ble beregnet som ved CDC-analysen.

7.1.15. Konkurrerende analyse til påvisning av

anti- MG- 21- antistoffer i pasientsera

En konkurrerende analyse som anvendte monoklonalt antiidiotypeantistoff (Ab2) som probe, ble utviklet til påvisning av anti-MG-21-antistoffer i sera fra pasienter som var blitt behandlet med mAb MG-21. I korte trekk ble 100 yl Ab2 (5 yg/ml) i 15 mM NaHC03 buffer, pH 9, tilsatt til hver brønn på Falcon pro-bindingsanalyseplater (Becton Dickinson, Oxnard, CA), ble inkubert ved romtemperatur i 1 time og ble deretter vasket med PBS-Tween<®> buffer. 75 yl mAb MG-21

(1 yg/ml) ble på forhånd inkubert i 45 minutter med like volumer av sera fra pasienter, eller med blandet, normalt, humant serum. Disse sera ble fortynnet 1:2,5, 1:5 og 1:10 i PBS. 100 yl av blandingene ble deretter tilsatt til de på forhånd Ab2-belagte plater. Etter ytterligere inkubering i 30 minutter ved romtemperatur ble platene vasket to ganger med PBS-Tween<®> buffer. 100 yl kanin-antimuse-IgG3 antistoff-peroxydasekonjugat (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA), fortynnet 1:1.000 i PBS-Tween<®> buffer, ble tilsatt og ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Etter tre vaskinger med PBS-Tween<®> buffer ble brønnene fylt med 100 yl OPD-substrat inneholdende 0,015% ^ 2°2 i c^- trat~ fosfat, pH 5,0. 5 minutter senere ble det tilsatt 100 yl 1,3 N H2S04, og platene ble avlest med et GSC-mikroplate-leseapparat. Den prosentvise inhibering av MG-21-binding til mAb 2C1 ble beregnet med følgende formel:

Serumprøver fra 3 av 8 pasienter med fremskreden melanoma som deltok i en fase 1 avprøvning av mAb MG-21, ble testet ved denne analyse. I korte trekk var MG-21 i 5% humant serumalbumin blitt administrert disse pasienter ved infusjon over et tidsrom på 4-6 timer, idet infusjonene ble gjentatt daglig i 7 dager. Serumprøvene ble tatt ut før behandling og heretter med forskjellige intervaller, og ble oppbevart ved 80°C inntil de ble analysert.

7.2. Resultater

7.2.1. Utvelgelse av hybridomer

Miltceller fra mus immunisert med MC-21, ble fusjonert med NS-l-celler under dannelse av hybridomer som var i stand til å brembringe mAb overfor idiotypedeterminanter på MG-21. Sistnevnte mAb betegnes som Ab2. To uker etter fusjonen ble hybridomsupernatanter testet med hensyn til antistoffer som inhiberer bindingen av MG-21 til M-2669-celler. Et hybridom, 2C1, som utviste en slik aktivitet, ble klonet og ekspandert. Som vist i fig. 4, virket supernatant av 2Cl-hybridomet sterkt inhiberende på bindingen av MG-21 til M-2669-celler, men ble ikke selv bundet til M-2669-celler. Supernatant fra NS-l-myelomaen ble anvendt som en kontroll og inhiberte ikke bindingen av MG-21.

Hybridom 2C1 vokser som en ascitestumor når den inokuleres intraperitonealt i pristan-primede BALB/c-mus. Fast fase-enzymimmunoanalyse med geite-antimuse-Ig-spesifikk klasse antisera viste at mAb 2C1 er et IgG2a.

Som vist i fig. 5, ga mAb 2C1 en sterk binding til MG-21 når det ble testet i en ELISA-test ved konsentrasjoner mellom 0,08 yg/ml og 2 yg/ml, idet signifikant binding stadig ble iakttatt ved 6,4 ng/ml. Det ble ikke iakttatt noen binding til Pl.17, et IgG2a-myelomaprotein (fig. 5).

7.2.2. mAb 2C1 er spesifikk for MG- 21

For bestemmelse av spesifisitetsgraden av 2C1 for MG-21 ble det utført en bindingsanalyse under anvendelse av 125 2C1. Seks som var blitt dannet mot

I-merket 2C1. Seks muse-mAb-er som var blitt dannet mot

et antall forskjellige humane tumorer, ble innbefattet som kontroll. Som vist i fig. 6, bandt mAb 2C1 sterkt til MG-21, men ikke til noen av de seks kontroll-mAb-er, hvorav de to (2A-14 og 96,5) var spesifikke for melanoma-assosierte antigener som var forskjellige fra den av MG-21 gjenkjente epitop. Blant disse to mAb-er reagerer 2A-14 med en epitop av GD3-antigénet som er forskjellig fra den som gjenkjennes av MG-21.

7.2.3. mAb 2C1 ( Ab2) inhiberer bindingen av MG- 21

( Abl) til M- 2669- celler og GD3- antigen på

en doseavhengig måte

En bindingsanalyse ble anvendt til titrering av hvor meget mAb 2C1 som krevdes som Ab2 for å inhibere bindingen av MG-21 (Abl) til M-2669-celler. Som vist i tabell IX, inhiberte mAb 2C1 fullstendig bindingen av MG-21 til M-2669-celler når det var til stede i en konsentrasjon som var lik eller større enn konsentrasjonen av MG-21. To kontrollimmuno-globuliner, mAb 26,8 og Pl.17, ga ingen signifikant inhibering.

I en parallell undersøkelse ble det anvendt renset GD3 som er det av MG-21 gjenkjente antigen, istedenfor M-2669-celler. mAb 2C1 inhiberte bindingen av MG-21 til det rensede GD3-gangliosid på doseavhengig måte (tabell X).

Den inhiberende virkning av mAb 2C1 på bindingen av MG-21 til M-2669-celler ble bekreftet ved FACS-analyse under anvendelse av FITC-konjugert MG-21. Ved å starte med 40 yg/ml FITC-konjugert MG-21 som tilnærmet svarer til met-ningskonsentrasjonen, ble mAb 2C1 eller kontrollantistoffer tilsatt i overskudd til M-2669-celler. Fig. 7 viser at 2C1 fullstendig inhiberte bindingen av FITC-konjugert MG-21 til tumorcellene, mens kontrollantistoffer ikke hadde noen virkning.

7.2.4. Antistoff 2C1 inhiberer CDC- og ADCC-aktiviteten av MG- 21 mot M- 2669- celler Tidligere forsøk har vist at MG-21 gir sterk CDC og ADCC med GD3-positive melanomaceller (I. Hellstrom et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:1499-1502). Det ble nå testet om 2C1 hadde noen virkning på disse aktiviteter.

Som vist i tabell XI, ble CDC av MG-21 fullstendig opphevet ved tilsetning av mAb 2C1 i en konsentrasjon som var større enn konsentrasjonen av MG-21, men ikke ved tilsetning av et av de to kontrollantistoffer, mAb 26,8 eller Pl.17.

Cytotoksisitet ble bestemt ved en fire timers <51>Cr-fngjør-elsesanalyse under anvendelse av normalt, humant serum som komplementkilde. Det ble ikke iakttatt cytotoksisitet med humant serum alene. Antistoffer alene ga ingen cytotoksisitet. Signifikansen ble bestemt ved Students t-test og er vist med <*>, P mindre enn 0,01.

Antistoff 2C1 inhiberte også fullstendig ADCC-aktivi-teten av MG-21 mot M-2669-celler når dets konsentrasjon var større enn konsentrasjonen av MG-21, mens det ikke ble iakttatt noen signifikant inhibering med de to kontrollantistoffer (tabell XII).

Cytotoksisitet ble bestemt ved en fire timers ^Cr-frigjør-elsesanalyse under anvendelse av normale, humane, perifere blodlymfocytter som effektorer. Forholdet mellom effektorceller og målceller var 100:1. Antistoffer alene ga ingen cytotoksisitet, og lymfocytter alene ga 6,9% cytotoksisitet. Signifikante forskjeller i sammenligning med kontrollprøver uten Ab2 ble beregnet ved Students t-test og er vist med <*>,

P mindre enn 0,01.

7.2.5. Påvisning av anti- MG- 21- antistoffer i pasientsera under anvendelse av mAb 2C1

som probe

Da mAb 2C1 er spesifikt for MG-21, kan det anvendes som et reagens til påvisning av humane anti-MG-21-antistoffer i sera fra pasienter som var blitt behandlet med MG-21. Det ble utviklet en konkurrerende analyse (se avsnitt 7.1.15. ovenfor) , ved hvilken det ble testet om sera fra noen av tre pasienter som var blitt injisert med MG-21, inhiberte bindingen av MG-21 til mAb 2C1. Som vist i tabell XIII, inhiberte sera erholdt fra alle tre pasienter, hhv. 17, 18 eller 21 dager (eller senere) etter administrering av MG-21, sterkt bindingen av MG-21 til mAb 2C1 med 20-83%. De forbehandlede sera ga mindre enn 13% inhibering i sammenligning med blandet, normalt, humant serum.

Anti-idiotype-mAb-antistoffet 2C1 som beskrevet i

det foreliggende, gjenkjenner en idiotype som er spesifikk for et humant melanoma-assosiert GD3-gangliosidantigen. Det ble vist at mAb 2C1 binder til mAb MG-21 selv i en lav konsentrasjon (0,08 ug/ml), men ikke til andre mAb-er av samme eller annen isotype. Det inhiberte på doseavhengig måte bindingen av MG-21 til GD3-gangliosidantigenet, samt til GD3-positive M-2669-melanomaceller. mAb 2C1 opphevet dessuten fullstendig CDC- og ADCC-aktivitetene av mAb MG-21 så lenge dets konsentrasjon var større enn konsentrasjonen av MG-21.

Ved å anvende 2C1 som probe ble det utviklet en analyse for humane anti-MG-21-antistoffer i sera fra pasienter behandlet med MG-21. Analoge analyser kan utvikles for andre typer av antitumorantistoffer. Da humane antistoffer som binder til MG-21, var til stede kort tid (14-21 dager) etter behandling av pasienter med MG-21, med mindre slike antistoffer utviser en høy effektivitet med hensyn til fremkallelse av en immunrespons som fører til tumoravvisning, kan prosedyrer som minimerer en slik antistoffutvikling, tenkes anvendt når det ønskes en langvarig behandling av pasienter ved administrering av antitumorantistoffer. 8. Monoklonale antiidiotypeantistoffer som er beslektet med p97- melanomaantigenet

Det ble fremstilt monoklonale antiidiotypeantistoffer (Ab2) som er beslektet med p97-antigenet av. humant melamona. Dette ble tilveiebrakt ved immunisering av BALB/c-mus med 96,5, et monoklonalt antistoff (mAb) som er spesifikt for epitop p97 , hybridisering av musemiltceller med NS-1 myelomaceller og utvelgelse av hybridomer som fremstilte antistoffer som ble bundet til Fab-fragmenter fremstilt ut fra mAb 96,5 (Fab 96,5). Ab2 ble testet med hensyn til binding til mAb 96,6 og mAb som definerer andre epitoper av p97-antigenet, samt med hensyn til deres evne til å inhibere bindingen mellom mAb 96,5 og p97. Det ble identifisert tre monoklonale Ab2-ere som konkurrerende inhiberte bindingen mellom p9 7 og mAb 96,5. Når de ble injisert i enten BALB/c- eller C3H/HeN-mus, fremkalte to av disse Ab3 som uttrykte samme idiotype som mAb 96,5 og som var spesifikke for p97. Disse to Ab2-ere oppførte seg således som "interne bilder" av p97.

8.1. Materialer og fremgangsmåter

8.1.1. Dyr

I hele undersøkelsen ble det anvendt ca. 6-8 uker gamle BALB/c- og C3H/HeN-hunnmus.

8.1.2. Humane melanomaceller

Linjs SK MEL-28 ble anvendt som kilde for p97 antigen-positive målceller. Hver SK MEL-28 uttrykker ved sin over-flate ca. 400.000 molekyler av p9 7.

8.1.3. Musemelanomaceller

Celler fra den B16 (C57BL) musemelanoma som var blitt transfisert med p97-genet (G.D. Powlman, 1986, Characterization and Expression of the Melanotransferrin (p97) Gen, doktordis-putas, University of Washington), ble anvendt til dannelse av oppløselig p97-antigen. Det ble også anvendt en cellelinje (2A) fra C3H/HeN-musemelanomalinjen K-1735-M2 (I.J. Fidler og I.R. Hart, 1981, Cancer Res. 41:3266-3267) som etter transfeksjon med genet for p97 uttrykker ca. 10 p97-molekyler pr. celle. K-1735-M2-cellene som fullstendig mangler p97, betegnes som parentale (par) celler, da 2A-linjen ble avledet derfra.

8.1.4. Antistoffer

Syv mAb-er overfor det humane melanoma-assosierte antigen p97 (J.P. Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546) ble anvendt i undersøkelsen. Tre epitoper av p97 er blitt definert ved anvendelse av disse mAb-er i konkurrerende bindingsinhiberingsanalyser, nemlig p97 (med mAb 96,5 og 4,1), p97<b> (med mAb 118,1, 133,1 og 133,3) og p97<c> (med mAb 8,2 og 133,2). Hybridom 96,5 som danner et mAb overfor epitop p97<a>, ble erholdt ved fusjonering av miltceller fra en immunisert BALB/c-mus med NS-1 myelomaceller (id.). Fab-fragmenter ble fremstilt fra mAb 96,5 ved papainoppslutning og betegnes som Fab 96,5 (id.). mAb F6 er et IgG2a som er spesifikt for et proteoglycanantigen på humane melanomaceller. Det ble anvendt for fremstilling av Fab-fragmenter (betegnet som Fab F6) som ble anvendt som kontroll.

For dannelse av anti-Id ble BALB/c-mus injisert subkutant med 100 yg renset mAb 96,5 som var blitt konjugert med albuskjell-hemocyanin (KLM) og deretter blandet med Freunds fullstendige adjuvans (Bacto H37Ra, Difco Labs., Detroit, MI). En måned senere ble musene injisert intraperitonealt med samme mengde KLH-konjugert mAb 96,5 i Freunds ufullstendige adjuvans (Difco). Musene ble deretter injisert med 2 ukers mellomrom ytterligere 1 eller 2 ganger med mAb 96,5 i saltvann. Tre dager etter siste injeksjon ble musene av-livet, og en miltcellesuspensjon ble fremstilt og fusjonert med NS-1 musemyelomaceller under anvendelse av standard-teknikker (G. Kohler og C. Milstein, 1975, Nature 256:495-497).

8.1.5. Screening av hybridomer

Primær screening ble utført ved en ELISA-test

(G. Kohler og C. Milstein, 1975, Nature 256:495-497).

Fab 96,5 i en konsentrasjon på 4 yg/ml i fosfatbufret saltvann (PBS) ble anbrakt på Immunolonplater (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA). Neste dag ble platene vasket med PBS inneholdende 0,05% Tween<®> 20 og ble "blokkert" ved inkubering i 1 time med PBS inneholdende 0,05% Tween<®> og 1% kalvefosterserum (FCS). Supernatanter (50 yl) fra hver brønn med voksende hybridomceller ble tilsatt. En time senere ble det tilsatt en blanding inneholdende geite-antimuse-IgGl (Zymed, San Francisco, CA) som var blitt koblet med pepperrotperoxydase (HRP), 0,05% Tween<®> 20 og 1% FCS i PBS. Etter 1 times inkubering ble antistoff som var blitt bundet til det på plater anbrakte Fab 96,5, påvist ved tilsetning av 0-fenylendiamin (OPD) i henhold til produsentens (Zymed) anvisninger. Platene ble avlest i et automatisk mikroplateavlesningsapparat (Genetic Systems Corporation, Seattle, WA) ved en absorbans på 492 nm/630 nm. Fab-fragmenter fra mAb F6 ble anvendt som kontroll-prøver, og bare slike hybridomer som frembrakte mAb som ble bundet til Fab 96,5, men ikke til Fab F6, ble anvendt til ytterligere testing. De anvendte screeningsprosedyrer påviste bare hybridomer som frembrakte IgGl-antistoffer.

Til ytterligere testing av supernatanter med hensyn til aktivitet ble det anvendt en analyse hvori supernatantene ble fortynnet to ganger, ble kombinert med en del mAb 96,5

og ble tilsatt til Immunolonbrønner i hvilke det var blitt anbrakt Fab 96,5. Etter tilsetning av geite-antimuse-IgG

og OPD ble evnen til det tilsatte mAb 96,5 til å forhindre binding av supernatantene til det på platene anbrakte Fab, vurdert. Denne analyse ble også anvendt til testing av anti-Id for binding til mAb som definerer p97-epitoper som er forskjellige fra p97<a>.

Hybridomer som fremkalte antistoffer som ble bundet til Fab 96,5, men ikke til Fab F6, ble klonet to ganger ved grensefortynning, hvoretter de ble ekspandert og injisert i pristan-primede BALB/c-mus til ascitesproduksjon.

8.1.6. Undersøkelser av rensede antiidiotypeanti-stof f er

Ab2 ble renset ved utfelling med mettet ammonium-sulfat (B. Mishell og S. Shilgi, 1979, i Select Methods in Cellular Immunology, W.H. Freemen & Co., s. 278-281). For identifisering av anti-Id som var i stand til å interferere med bindingen av mAb 96,5 til p97, ble SK MEL-28 melanomaceller anbrakt på plater med 10 4 celler/brønn. Renset Ab2 ble blandet med mAb 96,5 (1 yg/ml). Inhibering av bindingen av mAb 96,5 til melanomaceller ble påvist ved tilsetning av geite-antimuse-HRP-konjugat som ovenfor. Noen få tester av denne type ble utført også på hybridomsupernatanter.

Til undersøkelse av om det rensede Ab2 var i stand til å blokkere antigenbindingsstedet av Fab 96,5, ble forskjellige konsentrasjoner av Ab2 tilsatt til brønner på Immunolonplater på hvilke det også befant seg Fab 9 6,5. p97-antigen, isolert fra transfiserte Bl6-musemelanomaceller,

ble radiojodert (T.M. Rose et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:1261-1265), 2 x 10<5> cpm merket p97 ble tilsatt,

og antallet av tellinger bundet pr. brønn, ble bestemt.

8.1.7. Konkurranse med radiomerket p97 om binding til

Fab- fragmenter av mAb 96, 5

Forskjellige konsentrasjoner av renset Ab2 ble blandet 125

med en konstant mengde av I-merket p97-antigen, og blandingene ble tilsatt til plater som var blitt overtrukket med Fab 96,5. Etter 1 time ble platene vasket, 2N NaOH ble tilsatt, og brønnenes innhold ble tellet i en gammateller.

8.1.8. Søkning etter Ab3 in vivo

6 til 8 uker gamle BALB/c- og C3H/HeN-hunnmus ble injisert intraperitonealt (i.p.) med 50 ug/Ab2 som var konjugert til KLH og blandet med komplett adjuvans. Fem dager senere ble musene igjen injisert med Ab2 i ufullstendig adjuvans, og deretter med Ab2 i saltvann med 5 dagers mellomrom. Etter i alt hhv. 4 og 6 immuniseringer ble musene tappet for blod. De ble fortsatt injisert med 2 ukers mellomrom i flere uker. I enkelte tilfeller ble immuniseringsproto-kollen startet med 2 ukers mellomrom og 4 til 5 oppfølgnings-injeksjoner.

Sera fra de immuniserte mus ble titrert med hensyn til tilstedeværelse av antistoffer som binder til Ab2, som ble kalt for Ab3. Dette ble utført ved blanding av fortynnede sera med Ab2, og anbringelse av blandingen på Immunolonplater som var blitt overtrukket med Fab 96,5 (Abl), hvoretter det ble tilsatt geite-antimuse-IgGl-HRP og OPD. Data ble uttrykt som prosent inhibering av bindingen av Ab2 til Abl. De ble beregnet ved bestemmelse av O.D.-verdien (optisk densitet)

for (Ab3 + Ab2), divisjon med O.D.-verdien for Ab2 alene og subtraksjon av kvotienten fra 100.

Sera ble også testet for Ab3-binding til p97-antigenet. Renset p97 ble anbrakt på Immunolonplater med 5 yg/ml i PBS og fikk stå over natten. Etter blokkering ble fortynnede sera tilsatt, etterfulgt av et geite-antiserum mot muse-immunoglobulin som reagerte med IgG, IgM og IgA, og ble koblet til HRP.

Det ble også anvendt en fast fase-inhiberingsanalyse hvor musesera ble blandet med 2A musemelanomaceller som uttrykker p9 7 ved celleoverflaten, eller med par-musemelanomaceller som ikke uttrykker det. Blandingen ble først inkubert i 1 time og ble deretter tilsatt til Immunolonplater som var blitt belagt med p97-antigenet. Som ovenfor, ble binding påvist ved tilsetning av OPD i nærvær av anti-muse-HRP-konjugater.

8.2. Resultater

8.2.1. Frembringelse av Ab2- binding til idiotypedeterminanter på mAb 96, 5

BALB/c-mus ble immunisert med mAb 96,5, deres miltceller ble fusjonert, og hybridomsupernatanter ble screenet med hensyn til IgGl-antistoffer overfor mAb 96,5 som beskrevet ovenfor. Ca. 3.000 hybridomer ble erholdt fra åtte forskjellige fusjoner. Det viste seg at supernatanter fra 70 av disse hybridomer binder til Fab 96,5 og ikke til kontroll Fab F6. Det antas derfor at de fleste hybridomer, fra hvilke de ble erholdt, frembringer Ab2. Syv av disse hybridomer ble klonet, og mAb dannet fra disse, ble renset og testet med hensyn til binding til Fab 9 6,5. Som vist i fig. 8, . bandt mAb som frembrakte alle syv hybridomer, til Fab 96,5, selv om det var forskjell mellom Ab2 i de ved høye antistoffkonsentra-sjoner, iakttatte bindingsverdier. Ingen av mAb-ene bandt til Fab F6.

8.2.2. Tester med hensyn til Ab2- spesifisitet av

antigenbindingsstedet for mAb 96, 5

Det ble undersøkt om enkelte av de syv Ab2-ere, for hvilke data er vist i fig. 8, identifiserte antigenbindingsstedet for mAb 9 6,5. For det første ble mAb's evne til å inhibere bindingen av mAb 96,5 til p97-antigenet som ble uttrykt av SK MEL-28 celler, målt. Denne undersøkelse ble utført som beskrevet i avsnitt 8.1.6. Tre av de syv Ab2-ere, nr. 3, nr. 5 og nr. 7, inhiberte sterkt denne binding, mens to Ab2-ere

(nr. 4 og nr. 6) ga en svak inhibering, og to Ab2-ere (nr. 1 og nr. 2) ga ingen inhibering (fig. 9).

For det annet ble evnen av de syv Ab2-ere til å konkurrere med oppløselig p9 7 om binding til mAb 96,5, undersøkt. Forskjellige fortynninger av hvert Ab2 ble blandet med radiojodert p97, og bindingen av p97 til Fab 96,5 ble bestemt ved en fast fase-analyse (fig. 10). Anti-Id nr. 3, nr. 5 og nr. 7 konkurrerte med radiojodert p97, mens de fire andre anti-Id (nr. 1, nr. 2, nr. 4, nr. 6) ikke konkurrerte. Resultatene lignet således de resultater som er vist i fig. 9.

For det tredje ble det påvist at de samme tre Ab2-ere som var i stand til å konkurrere med p97, nemlig nr. 3, nr. 5 og nr. 7, kan blokkere antigenbindingsstedene av Fab 96,5 på en slik måte at de reduserer bindingen av radiojodert p97

til Fab 96,5 med 50-60% (fig. 11). Et Ab2, nr. 2, ga 25% inhibering av denne binding, og de resterende tre Ab2-ere (nr. 1, nr. 4, nr. 6) hadde 0-10% inhibering.

Disse data antydet således at tre Ab2-ere, nr. 3, nr.5 og nr. 7, var i stand til å etterligne p9 7a-epitopen som et "internt bilde". Det forelå imidlertid stadig mulighet for at sterisk hindring var ansvarlig for de iakttatte virkninger. Derfor ble evnen til Ab2 til å fremkalle en Ab3-respons in vivo testet som beskrevet i avsnitt 8.2.4. nedenfor.

8.2.3. Analyse av bindingen av Ab2 til en rekke

av mAb- er som spesifiserer andre p97- epitoper enn p97<a>

Syv mAb-er overfor p97 ble utvalgt til undersøkelse.

I henhold til analyser som målte konkurrerende inhibering av mAb-binding til p97-positive celler, identifiserer de syv mAb-er tre forskjellige epitoper på p97-antigenet (J.P. Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:53-546), nemlig p97<a> (mAb 4,1

og mAb 96,5), p97<b> (mAb 118,1, mAb 133,1, mAb 133,3 og mAb 8,2) og p97<C> (mAb 133,2). mAb 133,3 er et IgG2b, mAb 4,1 og 8,2

er et IgGl, og de andre mAb-er er IgG2a.

I det i fig. 12 viste forsøk ble hvert av de 5 IgG2a mAb-er blandet med det Ab2 som skulle testes, og ble tilsatt til plater belagt med Fab 96,5, etterfulgt av tilsetning av geite-antimuse-IgGl-HRP til påvisning av bindingen av det respektive Ab2 til Fab 96,5. -Som vist i fig. 12, inhiberte mAb 133,3 bindingen av seks av de testede Ab2-ere (nr. 1,

nr. 3, nr. 4, nr. 5, nr. 6 og nr. 7) til Fab 96,5 (fig. 10). Denne inhibering var omtrent av samme grad som den som ble iakttatt i forbindelse med mAb 96,5. Bindingen av nr. 2,

som i likhet med de andre Ab2-ere var blitt utvalgt for binding til mAb 96,5, ble ikke inhibert. mAb 118,1, 133,1 og 133,2 inhiberte ikke bindingen av noen av de testede Ab2-ere.

En annen analyse ble anvendt til analysering av graden av binding mellom Ab2 og forskjellige anti-p97-mAb-er av IgGl-isotypen, og virkningen av en slik binding på den etter-følgende binding av radiomerket p97 med anti-p97 mAb. De to IgGl-anti-p97-mAb-er, 4,1 og 8,2, såvel som mAb 96,5, ble testet. Hvert Ab2 ble anbrakt på plater, forskjellige konsentrasjoner av mAb 8,2, mAb 4,1 eller mAb 96,5 ble tilsatt, og bindingen av anti-p97 mAb til radiojodert p97 ble målt (fig. 13). Tre Ab2-ere, nr. 3, nr. 5 og nr. 7, interfererte med bindingen av mAb 96,5 til p97 (i overensstemmelse med resultatene beskrevet i avsnitt 8.2.2. ovenfor), mens fire andre Ab2-ere, nr. 1, nr. 2, nr. 4 og nr. 6, ikke interfererte. Ingen av Ab2-ene bandt til mAb 8,2 eller mAb 4,1. Forsøket ble gjentatt idet mAb 133,1 og mAb 133,3 ble testet parallelt med mAb 96,5, da de i fig. 15 viste data viste at mAb 133,3 (men ikke 133,1) var i stand til å binde til Ab2. Fig. 14 viser at alle syv testede Ab2-ere bandt til både mAb 96,5 og 133,3. Derimot bandt ingen av Ab2-ene til mAb 133,1.

Det ble utført en analyse som påviste at seks av Ab2-ene (med unntak av nr. 2) hindret mAb 133,3 i å binde

til SK MEL-28 melanomaceller. Dessuten var ingen av Ab2-ene i stand til å inhibere mAb 4,1 eller 8,2 i å binde til SK MEL-28 celler. Ingen av de syv Ab2-ere bandt til Pl.17, et IgG2a-myelomaprotein, eller til de to mAb-er som ble anvendt som kontroll, L6 (et IgG2a-anticarcinomaantistoff)

eller MPG24 (et IgG2a-antistoff mot et melanoma-assosiert proteoglycan) eller til et geite-antiserum mot muse-IgG2b (tabell XIV).

<*> Som påvist ved en ELISA-test ved hvilken forskjellige inhibitorer ved 80 yg/ml ble blandet med Ab2 (0,4 yg/ml) og ble tilsatt til plater belagt med Fab 96,5. HRP-konjugert geite-antimuse-IgGl ble tilsatt til platene og inkubert i 1 time, etterfulgt av tilsetning av OPD.

OD ble målt ved 492 nm.

Det samlede resultat av foreliggende undersøkelser indikerer at de syv testede Ab2-ere var i stand til å binde til mAb 133,3, sannsynligvis ved dets antigenbindingssted, med unntak av nr. 2 som ikke binder til mAb 13 3,3 ved dets antigenbindingssted (nr. 2 binder imidlertid til mAb 133,3, tilsynelatende på et annet sted enn dets antigenbindingssted, se figur 14).

8.2.4. Fremkallelse av en Ab3- respons

De syv Ab2-ere ble testet med hensyn til deres evne til å fremkalle en Ab3-antistoffrespons i mus. I den første forsøksrekke ble syngeniske (BALB/c)-mus immunisert med Ab2. Til de fleste av disse forsøk ble Ab2 konjugert med KLH.

Etter immuniseringen med Ab2 ble sera fra musene testet med hensyn til tilstedeværelse av Ab3 som kunne påvises ved dets evne til å binde til Ab2. Flere fortynninger av musesera ble blandet med de respektive Ab2-ere og ble tilsatt til Immunolonplater som var belagt med Fab 96,5 (se Abl). Deretter ble geite-antimuse-IgGl-HRP anvendt til påvisning av bindingen av Ab2 til Fab 96,5 (tabell XV).

Som vist i tabell XV, inhiberte serum som utelukkende var oppnådd fra den første blodtapning, bindingen av Ab2 til Fab 96,5. Størrelsen av den inhiberende virkning ble øket etter den andre injisering.

Deretter ble det testet om sera fra de immuniserte mus var i stand til å binde p97 (slik som et Abl). Oppløselig p9 7-antigen ble anbrakt på plater, og fortynnet museserum ble tilsatt (etter blokkering), etterfulgt av geite-antimuse-IgG-HRP. Sera fra mus som var immunisert med det ene av de to Ab2-ere nr. 3 eller nr. 7, bandt til p9 7, mens sera fra mus immunisert med et av de fem andre Ab2-ere, innbefattet nr. 5, ikke bandt til p97 (fig. 15). Som en positiv kontroll ble bindingen til p97 av enten mAb 96,5 eller et muse-anti-p97-serum titrert, og den iakttatte binding ble sammenlignet med bindingen som ble iakttatt når det ble anvendt sera fra mus immunisert med enten Ab2 nr. 3 eller nr. 5. Disse data viste at de sistnevnte sera inneholdt p97-spesifikt Ab2 i en konsentrasjon på 1-5 yg/ml. Evnen til Ab2 nr. 3 eller nr. 7 til å fremkalle en Abl-lignende Ab3-respons, viste således at disse Ab2-ere var internt bilde-antistoffer.

For ytterligere testing av spesifisiteten av Ab3 for p9 7 ble sera fra Ab2-immuniserte mus absorbert med 1 x 10g

celler fra enten den p97-positive musemelanomalinje 2A eller fra dens p97-negative parentale (foreldre) linje (som en kontroll) før sera ble tilsatt til p97 anbrakt på plater. Bindingen av Ab3 til p97 ble deretter påvist ved anvendelse av et geite-antimuse-IgG-HRP-konjugat. Som vist i fig. 16 (diagram A og B), inneholdt sera fra mus immunisert med enten Ab2 nr. 3 eller nr. 7, Ab3 som bandt til p97, og denne Ab3-aktivitet ble fjernet ved absorpsjon med 2A-celler, men ikke ved absorpsjon med par-celler. Det forekom et mindre omfang av binding til p97 med sera fra mus immunisert med enten Ab2 nr. 4 eller nr. 5, og denne binding ble inhibert også ved absorpsjon med 2A-celler (fig. 16, diagram C og D). Hverken normalt museserum eller serum fra mus immunisert med Pl.17 (som en kontroll) inneholdt antistoffer som bandt til p97. Mens bindingen av renset mAb 96,5 til p97 kunne oppheves

fullstendig ved absorpsjon med 2A-celler (fig. 17), ble bindingen av serumantistoffer fra mus immunisert med p97, inhibert bare delvis, slik som Ab3-aktiviteten av sera fra mus immunisert med enten Ab2 nr. 3 eller nr. 7.

Det ble også påvist en Ab3-respons i C3H/HeN-mus

etter immunisering med Ab2 konjugert til KLH. Serum fra de immuniserte C3H/HeN-mus bandt til oppløselig p97-antigen ved en fast fase-ELISA-test (figurene 18, 19). Absorpsjon av musesera med enten 2A- eller par-celler før testing for binding til oppløselig p97, bekreftet at bindingen var til p97.

Det ble også utført forsøk i hvilke BALB/c- og C3H/HeN-mus ble immunisert med et Ab2 som ikke var blitt konjugert til KLH. Sera fra disse mus viste seg å inneholde antistoffer som bandt til Fab 96,5. Til bestemmelse av om disse antistoffer var Ab2 som stadig forble i kretsløpet, eller om noe Ab4 var blitt fremkalt, ble det utført en ELISA-test med HRP-konjugater som ikke bare var i stand til å identifisere IgGl (isotypen av Ab2), men også IgG2b og IgG3. Resultatene antydet at museseraene inneholdt Ab4 som var i stand til å binde til Abl og tilhørte IgG2b- og IgG3-klassene.

8.3. Diskusjon

Det ble fremstilt en rekke muse mAb-er til idiotypedeterminanter på mAb 96,5 som definerer p97 , en epitop av p97-melanoma-antigenet, og de ble analysert med henblikk på spesifisitet og evne til å fremkalle en Ab3-respons i mus.

Syv Ab2-ere ble undersøkt mer detaljert. Fire av disse Ab2-ere syntes ikke å identifisere det område av mAb 96,5 som er involvert i binding av p97, da disse Ab2-ere hverken inhiberte bindingen mellom mAb 96,5 og p97 merkbart, og heller ikke ble deres binding til mAb 96,5 inhibert av oppløselig p97. Tre av disse Ab2-ere, hhv. betegnet som nr. 3, nr. 5 og nr. 7,• hindret imidlertid bindingen mellom oppløselig p97-antigen og mAb 96,5, og oppløselig p97 hindret bindingen mellom Fab 96,5 og disse Ab2-ere.

mAb 133,3 oppførte seg på lignende måte som mAb 96,5

når det ble testet i bindingsanalyser med de syv Ab2-ere,

mens mAb 4,1 ikke oppførte seg på denne måte. Dette var uventet da det var blitt rapportert at mAb 133,3 identifiserer en annen epitop (p97 ) enn mAb 96,5, mens det var blitt rapportert at mAb 4,1 er spesifikk for samme epitop (p97<a>)

(J.P. Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546) som

mAb 96,5. Grunnen til avviket mellom de resultater som ble oppnådd under anvendelse av en analyse med hensyn til konkurrerende inhibering av mAb-binding til målceller (id.), og de her beskrevne resultater som ble oppnådd med en analyse til måling av bindingen mellom Abl og Ab2, er ukjent.

Antigenbindingsinhiberingsdataene var i overensstemmelse med det syn at tre av de her beskrevne Ab2-ere, nr. 3,

nr. 5 og nr. 7, var av "internt bilde"-typen. Dataene ute-lukket imidlertid ikke alternative forklaringer slik som sterisk hindring. Det ble derfor undersøkt om noen av disse tre Ab2-ere var i stand til å fremkalle en immunrespons i mus. Da humorale antistoffresponser generelt kan undersøkes lettere og mer nøyaktig enn celle-formidlede responser, ble det lett etter Ab3 som var i stand til å binde til p97.

To Ab2-ere, nr. 3 og nr. 7, fremkalte en Abl-lignende Ab3-respons i både BALB/c- og C3H/HeN-mus, hvilket indikerte

at de er internt bilde-antistoffer. Et tredje Ab2, nr. 5,

hvis oppførsel lignet nr. 3 og nr. 7's 'når de ble testet in vitro, fremkalte ikke noen Abl-lignende Ab3-respons. Bindingen av Ab3 til p97 ble konkurrerende inhibert ved absorpsjon med 2A-celler som uttrykker p97, men ikke med celler fra den p97-negative par-linje. Den kjensgjerning at en respons også ble iakttatt i den allogeniske C3H/HeN-stamme, indikerer at responsen ikke ble kontrollert av Th-gener, men mer sannsynlig ble fremkalt av Ab2-et som fungerte som et "internt bilde" av p97-antigenet (V.K. Lee et al., 1986, Biochim. Biophys.

Acta 865:127-139).

For utelukkende å oppnå en Abl-lignende respons in

vivo var det nødvendig å konjugere et Ab2 til KLH. Når det ikke ble anvendt KLH, inneholdt sera fra de immuniserte mus både antistoffer av IgGl-isotypen av Ab2 og antistoffer av

andre isotyper (IgG2b, IgG3), og som kan ha vært Ab4. Hvis det virkelig ble dannet Ab4, har det muligens på et tidspunkt opptrådt en Ab3-respons.

9. Antiidiotypeantistoffer som er spesifikke for anti-carcinoma- antistoff L6

Murint, monoklonalt antistoff (mAb) L6 (Abl) er et IgG2a som er spesifikt for et tumor-assosiert carbohydratantigen som forekommer på overflaten av celler fra mange forskjellige humane carcinomaer (I. Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 3917-3933). Antiidiotype-mAb (Ab2) overfor L6 er blitt fremstilt. Det ble oppnådd 24 Ab2-ere som bandt til Fab-fragmenter fremstilt fra L6, men ikke til Fab fremstilt fra et kontroll-IgG2a. Åtte av disse 24 mAb-er var i stand til å binde i høye konsentrasjoner til et av to mAb-er som ble oppnådd uavhengig, men som har samme spesifisitet som L6. 14 av de 24 Ab2-ere var i stand til å inhibere bindingen av L6 til antigen på celler. Seks av disse 14 Ab2-ere var ikke i stand til å binde til Fab-fragmenter fremstilt fra L6 og allerede bundet til L6 antigen-positive celler. Ved anvendelse av klonede, variabelt område-gensegmenter viste det seg at to av disse seks Ab2-ere var i stand til spesifikt å gjenkjenne det L6 tungkjede-variable område som er assosiert med en irrelevant'lettkjede, mens de resterende 4 Ab2-ere gjenkjenner en kombinatorisk determinant som krever L6 tung-og lett-kjede-variable områder for å bli assosiert. Derimot var alle 8 testede Ab2-ere som bandt til L6 Fab bundet til celler, også i stand til å binde til det isolerte lettkjede-variable. område . De 6 Ab2-ere som ikke bandt til L6 Fab-fragmenter bundet til celler, ble injisert i BALB/c- og C3H/HeN-mus. To av disse (muligens flere) fremkalte polyklonale antistoffer (Ab3) som uttrykte samme idiotype som L6, bandt til L6-positive tumorceller, og konkurrerte med L6 om dets antigenbindingssted.

9.1. Materialer og fremgangsmåter

9.1.1. Dyr

Seks til åtte uker gamle BALB/c- og C3H/HeN-hunnmus ble erholdt fra Animal Facilities ved Fred Hutchinsons Cancer Research Center. De ble anvendt gjennom hele undersøkelsen med mindre annet er angitt.

9.1.2. Cellelinjer

Human coloncarcinomalinje H-3347 (I. Hellstrom et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:7059-7063) uttrykker høye nivåer av det av L6 definerte antigen. CEM human T-cellelinjen som ikke binder L6, ble innbefattet som en negativ kontroll.

9.1.3. Antitumorantistoffer (" Abl")

Monoklonalt antistoff L6 (IgG2a) ble anvendt som antitumor-mAb (Abl) i denne undersøkelse. Dets utvikling og karakterisering er beskrevet (I. Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46:3917-3928, I. Hellstrom et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 83:7059-7063). mAb F26 (IgGl) og 012/28-24 (IgG2a) fremstilles av hybridomer som var erholdt ved fusjon av miltceller fra BALB/c-mus som var blitt immunisert med carcinomavev. Hybridisering og utvelgelse lignet de som resulterte i L6. De sistnevnte to mAb-er konkurrerer med L6 om binding til carcinomaceller. mAb 96,5 (J.P. Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546) og myelomaprotein Pl.17 (American Type Culture Collection deponeringsnr. TIB 10), som begge er IgG2a, ble anvendt som kontroll. Fab-fragmenter ble fremstilt ut fra L6 og 96,5 ved papainoppslutning (id.)

og ble betegnet hhv. Fab l6 og Fab 9 6,5.

9.1.4. Dannelse av antiidiotypeantistoffer ( Ab2)

Det ble anvendt en protokoll som var blitt anvendt

med hell for dannelse av Ab2 som er beslektet med et annet tumorantigen, p97 (se avsnitt 8 ovenfor). BALB/c-mus ble immunisert med 100 yg L6 som var blitt koblet til albuskjell-hemocyanin (KLH) som beskrevet (H.Z. Streicher et al., 1986,

J. Immunol. 136:1007-1014). Den første immunisering ble gitt subkutant i fullstendig H37Ra-adjuvans (Difco, Detroit, MI), og en annen dose ble gitt intraperitonealt (i.p.) i Freunds ufullstendige adjuvans 4 uker senere. To til fire etterfølg-ende immuniseringer ble utført i.p. i saltvann med to ukers mellomrom.

Miltene ble fjernet 3 dager etter siste injeksjon, og miltcellene ble fusjonert med NS-1 myelomaceller ved sentri-fuger ing med polyethylenglycol. Etter 10 dager ble hybridomene screenet ved en ELTSA-test overfor Fab-fragmenter som var blitt fremstilt ut fra 16 (betegnet som L6 Fab) og ble anbrakt på 96-brønns Immunolon-II-plater (Dynatech, Chantilly, VA). Bindingen til L6 Fab ble påvist ved separat anvendelse av tre forskjellige reagenser: et kaninantiserum overfor muse-IgGl som var blitt koblet til pepperrotperoxydase (HRP) (betegnet som IgGl-HRP), et HRP-konjugert kaninantiserum overfor muse-IgG3 (betegnet som antimuse-IgG3-HRP) eller protein A koblet til HRP ("protein A-HRP"). Disse reagenser ble erholdt fra Zymed (South San Francisco, CA). Antistoffer som binder til Fab L6, ble testet med hensyn til binding til Fab 96,5 for å utelukke ikke-spesifikke bindinger. Hybridomer som syntes å fremkalle mAb overfor idiotypen av L6, ble klonet to ganger ved grensefortynning, etterfulgt av testing av alle subkloner.

9.1.5. Ab2- rensing

Fire til seks uker gamle BALB/c-hannmus ble primet med pristan. 10 dager senere ble musene injisert med 5 x 10 Ab2-fremkallende hybridomceller, og ascites ble oppsamlet 3 til 8 uker deretter. Ascites inneholdende IgG2a- og IgG2b-antistoffer, ble renset over protein A-kolonner (J.P. Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546), og IgGl-holdig ascites ble renset ved ammoniumsulfatutfelling, etterfulgt av DEAE-"Sephacel"-kromatografi (Pharmacia, Uppsala, Sverige). Renset Ab2 ble testet med hensyn til binding til Fab L6, samt med hensyn til inhibering av bindingen av L6 til H-3347-celler (som beskrevet nedenfor).

9.1.6. Inhiberinqsanalyse til påvisning av Ab2 som

binder til paratopområdet av L6

Det ble anvendt en analyse som lignet den som tidligere ble anvendt i p97-systemet (se avsnitt 8 ovenfor). Supernatanter inneholdende Ab2, eller renset Ab2, ble blandet med mAb L6 til en sluttkonsentrasjon på 0,1-0,4 <y>g/L6 pr. ml. Blandingen ble inkubert i en 96-brønns vevkulturplate (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA) i 30 minutter ved romtemperatur, hvoretter den ble tilsatt til glutaraldehyd-fikserte H-3347 carcinomaceller som var blitt fastgjort til brønnene i en 96-brønns plate. Binding av L6 til H-3347-cellene ble påvist ved en ELISA-test under anvendelse av et geite-antiserum overfor muse-IgG som var koblet til HRP, eller protein A som var koblet til HRP. Data ble uttrykt som prosent inhibering av bindingen av L6 til cellene i nærvær av Ab2.

9.1.7. Blokkeringsanalyse til påvisning av konkurranse

mellom Ab2 og antigen om L6- bindingssteder 30 yg/ml Fab L6 ble tilsatt til 5 x IO<5> H-3347 carcinomaceller i et propylenrør. Etter 30 minutters inkubering ved 4°C ble cellene vasket for fjerning av eventuelt ubundet Fab. Renset Ab2 ble merket med fluoresceinisothiocyanat (FITC). Forskjellige konsentrasjoner av det merkede Ab2 ble tilsatt til propylenrøret, etterfulgt av inkubering ved 4°C i 30 minutter og vasking. Ab2-binding ble påvist under anvendelse av et EPIC-C-modell fluorescein-aktivert cellesorteringsapparat (FACS) som tidligere beskrevet (I. Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46:3917-3923). Dette forsøk ble også utført med fycberythrin (PE)-merket L6 istedenfor umerkede L6 Fab-fragmenter.

9.1.8. Kloning av L6 tung- og lett- kjede- variabelt

område- qensegmenter

DNA ble isolert som prinsipielt beskrevet av Blin og Stafford (1976, Nucl. Acids Res. 3:2303-2308) og mere detaljert av Ledbetter et al., (1987, Mol. Immunol. 24:1255-1261). Det ble nedbrutt enten med EcoRI eller Hindlll og fraksjonert etter størrelse på saccharosegradienter (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Gradientfraksjoner inneholdende spesifikke, variable (V) områder, ble identifisert ved Southern blot-analyse (E.M. Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503-507). De uttrykte alleler ble identifisert i kraft av deres manglende påvisning ved Southern blot-analyse av ikke-produserende L6 sublinjer. EcoRI-nedbrutt DNA inneholdende det uttrykte L6 tungkjede V-område-gensegment, ble klonet i EMBL3 lambda fag-vektoren (Promega Biotech, Madison, WI) med "Gigapack" pakningsekstrakter (Stratagene, La Jolla, CA), ble anbrakt på plater og screenet under anvendelse av Xbal/EcoRI-fragment inneholdende den murine tungkjedeforsterker.

Et 2,3 kb HindiII-fragment som strekker seg over den murine tungkjedeforsterker, ble klonet i en pSV2-gpt vektor (R.C. Mulligan og P. Berg, 1980, Science 209:1422-1427) inneholdende de humane C exoner som et 10,5 kb BamHI-fragment som stammet fra HG3A fag-klonen (J.W. Ellison et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10:4071-4079). Det uttrykte variable tung-kjede-gensegment ble deretter overført til vektoren som et 10,5 kb EcoRI-fragment.

Gradientfraksjoner inneholdende HindiII-nedbrutt DNA med den uttrykte L6 lette kjede, ble klonet i Xbal-stedet av Lambda Zap (Stratogene) ved å utfylle HindllI-fremspringene med dinucleotid-AG og Xbal-fremspringene med CT, som etterlot forenlige fremspring for kloning. Det resulterende bibliotek ble screenet med et 1 kb Psti/ HindiII-fragment fra intronet som adskilte JK og CK i pBR322-klonen inneholdende 9,5 kg BamHI-fragmentet med det uttrykte K-gen fra MPC11 (D.E. Kelley et al., 1982, Cell 29:681-689). For den kimæriske lett-kjede-ekspresjonskonstruksjon ble et 1 kb Hindlll/ Xmnl-fragment som inneholdt den murine K-forsterker (fra MPC11) oppstrøms for et 2,7 kg EcoRI-fragment som kodet for det humane CK-exon (P.A. Heiter et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-1522), klonet i en pUC-gpt vektor. Det uttrykte 6 VK gensegment ble deretter overført til denne vektor som

et EcoRI-NotRI-fragment innkoblet på det unike Pstl-sted.

De kimæriske lettkjede- og tungkjede-genkonstruksjoner ble transfisert i musemyelomacellelinjen Ag 8,653 under anvendelse av en elektroporator i henhold til produsentens anvisninger, med etterfølgende utvelgelse på 0,5 ug/ml myco-fenolsyre. Lignende transfeksjoner ble utført under anvendelse av den kimæriske lettkjede-genkonstruksjon og SP2/0-musemyelomacellelinjen alene, eller med den kimæriske tung-kjedekonstruksjon og J588L murin-myelomaen som uttrykker en murin lambda I lettkjede. Cellelinjer som uttrykker de kimæriske proteiner, ble identifisert ved en ELISA-test. Kimærisk L6 antistoff ble renset over protein A-Sepharose<®> og ble biotinylert som tidligere beskrevet (H.M. Pohlit et al., 1979, i Immunological Methods, I. Lefkovits og B. Pernis, red., Academic Press, New York, s. 181-194).

9.1.9. Analyser for L6 antiidiotype variabel- t

område- spesifisitet

Det ble utført konkurrerende analyser ved å belegge Immunolon II plater med 100 yl mAb 187,1 (erholdt fra

dr. Dale Yelton), etterfulgt av tre vaskninger, og deretter med supernatanter fra kulturer av L6 antiidiotype-mAb. Platene ble igjen vasket, og 100 yl umerket, konkurrerende materiale ble tilsatt i en konsentrasjon på 6 yg/ml. De umerkede, konkurrerende materialer var enten kultursupernatanter fra transfektanter som uttrykker den kimæriske variable tunge L6-kjede, assosiert med de lette J558L-kjeder, eller bare den kimæriske variable lette L6-kjede, eller medier spiddet med renset kimærisk L6 mAb eller PW P2281B8 (et irrelevant humant kontroll-IgGl-antistoff). Etter 30 minutter ved 30°C ble 50 yl av en 1 yg/ml oppløsning av renset biotinylert kimærisk L6 antistoff tilsatt til det 100 yl volum som allerede var til stede i brønnen. Denne blanding ble inkubert i ytterligere 1 time ved 37°C, hvoretter platen ble vasket, inkubert med Avidin<®->HRP (Tago, Burlingame, CA)

(1:1000 fortynning i 30 minutter ved romtemperatur), ble igjen vasket og fremkalt med et TMB-kromogen i bufret substrat

(Genetics Systems, Seattle, WA). Dataene ble uttrykt som % inhibering, idet intet konkurrerende materiale (bare medium) ble regnet som 100% med bakgrunnsverdien (intet Ab2) fra-trukket .

9.1.10. Fremkallelse av en Ab3- respons

6 til 8 uker gamle BALB/c- og C3H/HeN hunnmus ble immunisert med 50 yg Ab2 som var blitt konjugert med KLH

(H.Z. Streicher et al., 1986, J. Immunol. 136:1007-1014). En lignende annen immunisering ble utført 1 uke etter den første, etterfulgt av en tredje og fjerde immunisering utført med 1 ukes mellomrom, idet Ab2 ble gitt i fosfatbufret saltvann (PBS), og etterfølgende immuniseringer ble utført med 2 ukers mellomrom med Ab2 i PBS. Alle immuniseringer ble utført i.p. Etter 4 uker ble musene tappet for blod periodisk, og deres sera ble testet med hensyn til tilstedeværelse av (polyklonalt) Ab3.

9.1.11. Rensing av polyklonalt Ab3

Sera fra mus immunisert med Ab2, ble oppsamlet mellom

6 og 20 uker etter den første immunisering og ble blandet.

10 mg av de respektive Ab2-ere ble konjugert til 1 ml cyanogen-bromid-aktivert Sepharose<®> 4B (Pharmacia, Piscataway, NJ),

og kromatografi ble utført i henhold til produsentens anvisninger, for derved å oppnå en anrikning av Ab3 som kunne binde til de respektive Ab2-ere.

9.1.12. Måling av Ab3' s evne til å inhibere bindingen av Ab2 til L6 Fab

Det ble anvendt en tidligere beskrevet analyse (se avsnitt 8 ovenfor). Sera eller renset Ab3 som skulle testes med hensyn til Ab3, ble blandet med en bestemt konsentrasjon (2,0 yg/ml) av renset Ab2 og ble tilsatt til en Immunolon II plate hvis brønner var blitt belagt med Fab L6. mAb L6 og PBS ble anvendt som hhv. positiv og negativ kontroll. Etter 30 minutters inkubering ble bindingen av Ab2 til Fab L6 påvist ved en ELISA-test under anvendelse av en kanin-antimuse-

IgGl-HRP/protein A-HRP cocktail. Data ble uttrykt som

prosent inhibering av bindingen av Ab2 til Fab L6 med Ab3-serum.

9.1.13. Analyse med hensyn til binding av Ab3 til

celler

Forskjellige fortynninger av museserum som skulle testes med hensyn til Ab3 eller renset polyklonalt Ab3 (i 50 yl mengder), ble inkubert ved 4°C med 5 x IO<5> H-3347-celler i 30 minutter i polypropylenrør. Dyrkningsmedium, serum fra mus immunisert med mAb 96,5 eller med Pl.17, og normalt museserum ble anvendt som negativ kontroll. Celler ble vasket to ganger i medium. Binding av Ab3 til målceller.ble påvist med et geite-antimuse-IgG merket med FITC (Tago, Burlingame, CA). 50 yl ble tilsatt til blandingen av museserum og tumorceller og ble inkubert i 30 minutter. Etter vasking to ganger i medium ble cellene analysert under anvendelse av FACS. CEM-celler som ikke uttrykker det av L6 definerte antigen, ble anvendt som negativ målcellekontroll.

9.2. Resultater

9.2.1. Dannelse av antiidiotype- mAb ( Ab2) overfor

L6 ( Abl)

Hybridom-produserende antiidiotype-mAb ble erholdt

ved immunisering av BALB/c-mus med L6 og fusjonering av deres miltceller med myeloma NS-1, etterfulgt av screening av hybridomsupernatantene med hensyn til binding til Fab L6. Celler fra brønner med supernatanter som bandt til Fab L6,

ble klonet to ganger, og klonene ble testet med hensyn til deres evne til å fremkalle mAb som bandt til Fab L6 og ikke til Fab 96,5 (anvendt som en negativ kontroll). Ut fra 8 fusjoneringer ble det isolert 24 hybridomer som fremkalte mAb overfor Fab L6,<v>og disse ble stabilisert og anvendt til ascitesproduksjon. De representerte flere forskjellige isotyper (tabell XVI).

Ab2 renset fra ascites, ble anvendt til ytterligere testing (se nedenfor).

9.2.2. Karakterisering av Ab2- bindinq til idiotoper

på L6

En innledende screening identifiserte 14 av 24 testede hybridomer som frembrakte Ab2 til å inhibere 90-100% av bindingen av L6 (testet ved 0,2-0,4 ug/ml) til carcinomaceller, og ble ytterligere testet med hensyn til deres evne til å inhibere bindingen av L6 til sitt målantigen på celler. Det forventes at en slik inhibering opptrer hvis Ab2 reagerer med idiotopeområdet av L6. Til dette formål ble det benyttet en ELISA-test, hvorved det ble anvendt glutaraldehyd-fikserte H-3347-celler som en antigenkilde. Som vist i fig. 20, ble bindingen av L6 (0,2 yg/ml) til carcinomaceller inhibert når Ab2 ble tilsatt ved en konsentrasjon på 0,5 <y>g/ml og 5 yg/ml. To av de inhiberende Ab2-ere var IgG2a, 3 var IgG2b, og de resterende 9 var IgGl, mens ingen av de 7 IgG3- eller 2 IgM-antistoffer var inhiberende.

De 14 Ab2-ere som var i stand til å inhibere bindingen av L6 i den ovenfor beskrevne fast fase-analyse, ble merket med FITC for analyse. Hvert konjugat ble analysert ved en ELISA-test med hensyn til sin evne til å binde til Fab L6, samt sin evne til å hindre L6 i å binde til antigen-positive carcinomaceller. Dette ble gjort for å sikre at de merkede antistoffer oppførte seg nøyaktig som umerkede antistoffer. Når FITC-merket Ab2 ble tilsatt til Fab L6, som i en metningsdose var blitt tilsatt til H-3347-carcinomaceller, viste det seg at 8 av de 14 Ab2-ere stadig var i stand til å binde til Fab L6, mens bindingen av 6 Ab2-ere ble fullstendig inhibert (fig. 21). Når det ved denne analyse ble anvendt PE-merket L6 istedenfor Fab L6, viste det seg at L6 forble bundet til cellene og ikke ble fortrengt i nærvær av de 6 ikke-bindende Ab2-ere (fig. 22).

De 6 Ab2-ere som inhiberte bindingen av L6 til dets målantigen og som ikke var i stand til å binde til tidligere bundet Fab L6 eller deiler, ble utvalgt for ytterligere testing. De i de følgende avsnitt angitte undersøkelser ble utført på prøver av disse 6 Ab2-ere, og var primært rettet mot å identifisere Ab2 som er i stand til å fungere som "interne bilder" av det L6-definerte antigen.

9.2.3. Spesifisitet av det av L6 dannede Ab2

Det finnes to mAb-er, F2-6 og 012/28-24, som har

samme spesifisitet som L6 når de testes på FACS ved konkurrerende bindingsinhiberingsanalyser. Prøver av disse to mAb-er ble blandet med forskjellige konsentrasjoner av Ab2 til testing av om sistnevnte var i stand til å inhibere bindingen av de to ("L6-lignende") mAb-er overfor carcinomaceller. Ingen av de 14 testede Ab2-ere inhiberte bindingen av 012/28-24 til det L6-definerte antigen når de ble analysert på lignende måte som vist for L6 i fig. 23. 8 av de 14 testede Ab2-ere var i stand til å inhibere bindingen av F26 ved høye konsentrasjoner, idet 20 til 200 ug/ml inhiberte 1 ug/ml F26. Dette antyder at 012/28-24 har en annen idiotype enn L6, og at F26 og L6 kan ha overlappende idiotoper.

9.2.4. Ab2- epitopspesifisitet

Epitopspesifisiteten av L6 antiidiotype monoklonale antistoffer ble påvist i konkurrerende forsøk, ved hvilke enten L6, den kimæriske L6 tunge kjede assosiert med den J558L murine lambda 1 lette kjede, den fri kimæriske L6 lette kjede eller et irrelevant, humant IgGl, ble testet med hensyn til deres evne til å konkurrere om hvert antiidiotypeanti-stoffs binding til biotinylert kimærisk L6 (fig. 24). Det ble vist at hvert av de 14 Ab2-ere spesifikt gjenkjenner de klonede L6 V-områder i kraft av deres evne til å binde det biotinylerte kimæriske L6-molekyl. Det ble vist at bindingen kan inhiberes med umerket kimærisk L6, men ikke med irrelevant humant IgGl. 8 Ab-ere kunne bli inhibert i merkbart omfang med den fri kimæriske L6 lette kjede (nr. 1, nr. 2, nr. 4, nr. 6, nr. 7, nr. 8, nr. 9 og nr. 15), men ikke med den kimæriske tunge kjede som er assosiert med muse lambda 1, og derfor gjenkjenner de 8 Ab-ere en variabel L6 tungkjede-assosiert determinant. Disse 8 er de Ab2-ere som er i stand til å binde L6 Fab bundet til celler. To av Ab2-ene (nr. 12 og nr. 13) kunne inhiberes med den med J558L lettkjede-assosierte kimæriske L6 tunge kjede, men ikke med den fri kimæriske.lette kjede, og de gjenkjenner således en L6 V-assosiert determinant. De resterende Ab2-ere (nr. 3, nr. 10, nr. 11 og nr. 14) kunne ikke inhiberes med noen av de klonede V-områder tatt hver for seg og må derfor være spesifikke

for en kombinatorisk determinant som bare dannes ved samling av passende V-regioner. Disse resultater ble også bekreftet ved direkte bindingsundersøkelser.

9.2.5. Fremkallelse av Ab3

5 og de 6 Ab2-ere som syntes å være bindingssted-relaterte, ble konjugert til KLH og ble anvendt til immunisering av BALB/c- og C3H/HeN-mus som beskrevet i avsnitt 9.1.4. Musene ble periodisk tappet for blod og fikk booster-injeksjoner, og deres sera ble analysert.

Først ble det utført en bindingsinhiberingsanalyse til bestemmelse av om de immuniserte mus syntes å fremkalle noe Ab3 som kunne identifiseres ved dets evne til å binde spesifikt til Ab2. Forskjellige fortynninger av sera fra musene ble blandet med Ab2 (1,0 yg/ml), blandingene ble anbrakt på plater som var belagt med Fab L6, og bindingen av Ab2 til Fab L6 ble bestemt ved en ELISA-test. Resultater ble uttrykt i prosent inhibering av bindingen av Ab2 til Fab L6 i nærvær av det gitte museserum. Som vist i fig. 25, ble bindingen av Ab2 (1,0 yg/ml) til Fab L6 inhibert med over 90% ved en 1:200 fortynning av flere av seraene fra immune mus. Det viste seg at de affinitetsrensede antisera inhiberer bindingen av Ab2 ved samme analyse. Dette ble iakttatt for alle testede Ab2-ere og indikerer at Ab3 ble fremkalt overfor Ab2-paratopområdet. Fremkallelse av Ab3 antiidiotype overfor Ab2 i BALB/c- og C3H/HeN-mus var på lignende måte.

9.2.6. Ab3' s evne til å binde til det av L6

definerte antigen

Hvis et Ab2 fungerer som et "internt bilde" av L6-antigenet, skulle det være i stand til å fremkalle et Ab3 som binder spesifikt til det av L6 (Abl) definerte antigen. Til testing av antigenspesifisiteten av det Ab3 som dannes i mus som er blitt immunisert med Ab2, ble forskjellige fortynninger av de affinitetsrensede sera fra immune mus testet med hensyn til binding til celler fra de L6-positive carcinoma-linjer H-3347. Som negativ kontroll ble det anvendt CEM-celler til hvilke L6 ikke binder. Sera fra C3H/HeN-mus (fig. 26) som var blitt immunisert med Ab2 nr. 11 og nr. 12, og sera fra BALB/c-mus (fig. 27) som var blitt immunisert med Ab2 nr. 14, ble bundet til carcinomacellene.

9.3. Diskusjon

Det ble fremkalt monoklonale antiidiotypeantistoffer (Ab2) overfor et muse-mAb, L6, som binder til et carbohydratantigen som uttrykkes på mange humane carcinomaer. Ab2-ene ble først screenet med hensyn til binding til Fab L6-fragmenter, etterfulgt av screening med hensyn til deres evne til å inhibere bindingen av L6 til dets målantigen på carcinomaceller. Ut fra en samlet mengde på 24 Ab2-ere, som innled-ningsvis ble utvalgt for binding til Fab L6, inhiberte 14 Ab2-ere bindingen av L6 til antigen-positive carcinomaceller. 6 av de sistnevnte Ab2-ere var ikke i stand til å binde til L6 Fab-fragmenter som tidligere var blitt bundet til antigen på celler, noe som antyder at de identifiserer et område av L6 som er assosiert med dets antigenbindingssted. Når disse 6 Ab2-ere ble testet med hensyn til binding til klonede L6 lett- og tung-kjede variable områder, bandt 4 Ab2-ere bare til en kombinasjon av de passende V-områder, mens 2 Ab2-ere gjenkjente det variable tungkjedeområde som er assosiert med en irrelevant variabel lettkjede, og ingen var i stand til å binde lette kjeder. Derimot kunne alle 8 testede Ab2-ere som bandt til fri kimærisk Fab L6 bundet til celler, binde til kimæriske lette L6-kjeder.

En Abl-lignende respons in vivo ble bare oppnådd

når det ble anvendt slike Ab2-ere som ikke bandt til Fab L6 som var bundet til celler, og som bandt til enten en kombinatorisk eller en variabel tungkjede-assosiert determinant. Derimot fremkalte ingen av de Ab2-ere som bandt til Fab L6 som var bundet til carcinomaceller og til isolerte kimæriske lette L6-kjeder, en Abl-lignende Ab3-respons i mus.

Ab2 nr. 11, nr. 12 og nr. 14 oppførte seg som "internt bilde" Ab2 i flere forskjellige analysetyper.

To Ab2-ere (nr. 11, nr. 12) var i stand til å fremkalle en Abl-lignende Ab3-respons i mus. Sera fra mus immunisert med et hvilket som helst av disse Ab2-ere, var i stand til å binde med samme spesifisitet som L6 til carcinomaceller. Da en Ab3-respons ble fremkalt i allogeniske C3H/HeN-mus, var det ikke allotype-begrenset som det ville ha vært forventet hvis Ab2 hadde tjent som immunregulator (V.K. Lee et al., 1986, Biochim. Biophys. Acta 865:127-139). Ab2 oppførte seg snarere som et "internt bilde" (J. Urbain et al., 1982,

Ann. Immunol. 1330:179-189, V.K. Lee et al., 1986, Biochim. Biophys. Acta 865:127-139) av det L6-definerte antigen. Det ble også funnet at et Ab2 (nr. 14) var i stand til å fremkalle en Abl-lignende respons i det syngeniske system.

10. Deponering av mikroorganismer

Følgende hybridomcellelinjer som fremkaller det viste monoklonale antistoff, er blitt deponert hos American Type Culture Collection, Rockville, MD, og har fått følgende depon-eringsnumre:

Claims (13)

1. Monoklonalt antiidiotypeantistoff for ikke-terapeutisk bruk, karakterisert ved at det omfatter monoklonalt antistoff 2C1 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9484, hvilket antistoff 2C1 spesifikt gjenkjenner en idiotype som er til stede på et annet antistoff som definerer det humane melanoma-assosierte GD3-antigen.

2. Monoklonalt antiidiotypeantistoff for ikke-terapeutisk bruk, karakterisert ved at det omfatter monoklonalt antistoff nr. 3 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9498, eller monoklonalt antistoff nr. 7 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9497, hvilket monoklonalt antistoff spesifikt gjenkjenner en idiotype som er til stede på et annet antistoff som definerer det humane melanoma-assosierte p97-antigen.

3. Monoklonalt antiidiotypeantistoff for ikke-terapeutisk bruk, karakterisert ved at det omfatter monoklonalt antistoff L6 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 8677, monoklonalt antistoff nr. 11 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9544, det monoklonale antistoff nr. 12 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9681, eller det monoklonale antistoff nr. 14 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnummer HB 9680, hvilket antistoff spesifikt gjenkjenner en idiotype som er til stede på et annet antistoff som definerer et humant lungecarcinoma-antigen.

4. Monoklonalt antistoff ifølge de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter den reaktive del i form av Fv-, Fab-, Fab'- eller F(ab' )2-fragmenter.

5. Fremgangsmåte for ln vitro-overvåkning av nivåene av et antiidiotypeantistoff i en prøve fra en pasient som er under behandling med et antitumor-antistoff som uttrykker en idiotype rettet mot et definert tumorantigen, karakterisert ved at man måler nivået av antiidiotypeantistoffet i en prøve av pasientens sera ved en konkurrerende immunoanalyse under anvendelse av et monoklonalt antiidiotypeantistoff som spesifikt gjenkjenner idiotypen av antitumorantistoffet.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at tumorantigenet omfatter et melanoma-antigen.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at melanoma-antigenet omfatter p97.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at auto-antiidiotypeantistoffet omfatter det monoklonale antistoff nr. 3 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnr. HB 9498, eller det monoklonale antistoff nr. 7 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnr. HB 9497.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at melanoma-antigenet omfatter GD3.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det monoklonale anti-idiotypeantistof f omfatter det monoklonale antistoff 2C1 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnr. HB 9484.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at tumorantigenet omfatter et lungecarcinoma-antigen.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at lungecarcinoma-antigenet er et glycolipidantigen som er karakterisert ved å kunne reagere med det monoklonale antistoff L6 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnr. HB 8677.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at det monoklonale anti-idiotypeantistof f omfatter det monoklonale antistoff nr. 11 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnr. HB 9544, det monoklonale antistoff nr. 12 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnr. HB 9681, eller det monoklonale antistoff nr. 14 som fremstilt av cellelinjen deponert hos ATCC under deponeringsnr. HB 9680.