PT88459B

PT88459B - Processo para a preparacao de anticorpos anti-idiotipicos e metodo para utilizacao destes em imunoterapia de tumores

Info

Publication number: PT88459B
Application number: PT88459A
Authority: PT
Inventors: Ingegerd Hellstrom; Karl Erik Hellstrom; Maria S Kahn; Donna Francine Beaton; Victor K Lee
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1987-09-10
Filing date: 1988-09-08
Publication date: 1993-01-29
Also published as: HU206394B; EP0759442A1; NO178464C; AU630592B2; FI884114A0; DK500888A; JPH02494A; NZ226129A; AU2207788A; FI884114A7; GR3023725T3; DE3855850D1; DK500888D0; IL87692A; OA08952A; DE3855850T2; HUT47973A; NO884024D0; EP0306995B1; EP0306995A3

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE

ANTICORPOS ANTI-IDIOTÍPICOS E MÉTODO PARA UTILIZAÇÃO DESTES EM IMUNOTERAPIA DE TUMORES

1. ÂMBITO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos que utilizam anticorpos anti-idiotípicos para imunoterapia e imunoprofiláxia de tumores. A presente invenção refere-se ã manipulação da rede idio típica do sistema imunológico para efeitos terapêuticos, por exem pio, por utilização de anticorpos anti-idiotípicos para imunização contra tumores, por inibição da supressão imunológica por in termédio das células supressoras T ou factores supressores por expressão de um idiotopo dirigido contra um antigenio de tumor, por activaçao de linfócitos utilizados na imunoterapia adoptiva, etc.. Num aspecto específico, anticorpos anti-idiotípicos monoclonais que excitaram o idiotipo de um anticorpo que define um antigenio de auto-diferenciação, tal como um antigenio, oncofetal ou de diferenciação, podem utilizar-se in vivo para induzir uma resposta imunológica contra tumores contendo antigenio oncof etal

Os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos da presente invenção são adequados para imunoterapia e imunoprofilaxia de tumo res, e de importância geral na medicina humana. As moléculas da presente invenção podem também utilizar-se como reagentes em imu no-ensaios tais como testes ELISa e em radio-imuno-ensaios, os quais são adequados como instrumentos de diagnóstico para a detec ção de anticorpos anti-tumor ou antigéniõs de tumor, e em ensaios de imuno-absorção, os quais são adequados para isolar e identifi car anticorpos anti-tumor. Em adição·, estes reagentes sao instru mentos importantes para a compreensão do desenvolvimento e crescimento de neoplasias.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

2.1 Anticorpos Anti-idiotípicos

Os anticorpos anti-idiotípicos ou anti-idiotipos são anticorpos dirigidos contra a região de combinação de antigénio ou região variãvel (chamada o idiotipo) de outra molécula de anticor po. Ra teoria, com base no modelo de rede de relações idiotípicas de Jerne (Jerne, R.K., 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125c:373; Jerne, N.K., et al., 1982, EMBO 1:234), a imunização com uma molécula de anticorpo expressando um paratopo (local de combinação de antigénio) para um dado antigénio deve produzir um grupo de anti-anticorpos, alguns dos quais compartilham com o antigénio uma estrutura complementar do paratopo. A imunização com uma sub -população dos anticorpos anti-idiotípicos proporciona, por seu turno, uma sub-população de anticorpos ou sub-séries de células imunes que são reactivas ao antigénio inicial.

Uma rede de idiotopos e anti-idiotopos tem sido invocada para explicar a regulação imunológica, com idiotopos comuns ou relacionados de anticorpos, linfócitos B, e várias sub-séries de linfócitos T e seus produtos solúveis que inter-reagem com anti-idiotopos (Jerne, W.K., 1974, supra; Urbain, J., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74:5126; Rajewski, R. and Takemori, T., 1983, Ann. Rev. Immunol. 1:569). Os estudos que se realizaram sobre a imunidade dos haptenos e antigénios virais indicam que a célula B derivada de anticorpos anti-idiotípicos pode induzir respostas da célula Ϊ (Rajewski, R. and Takemori, T., supra;

Urbain, J., et al., supra; Binz, H. and Wigzell, H., 1978, J.

Exp. Med. 147:63). Por exemplo, Ertl et al. imunizaram ratos com um clone de célula T específica de vírus Sendai e produziram um mAb anti-idiotípico que regulou a resposta DTH ao vírus Sendai (Ertl, H.C.J., et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 79:7479) Como uma prova para o aparecimento de um anticorpo de célula B em resposta a um idiotopo de célula T, Kennedy et al. observou a rejeição do tumor mas não anticorpos anti-tumor, em ratos tratados com anticorpos anti-idiotípicos relacionados com o antigénio de SV40T (Kennedy, R.C., et al., 1985, J. Exp, Med. 161:1432). A administração de anticorpos anti-idiotípicos exogenos pode exercer influências de aumento ou de supressão·, dependendo, entre outras variáveis, da dose de anticorpo (Reth, M., et al., 1981, Nature (London) 290:257).

2.2 Antigénios Associados a Tumores

Tem sido descrita uma variedade de antigénios associados com tumores (TAA). Uma classe de TAA é o tipo de transplantação

de antigenio de superfície celular específico do tumor (TSTA), o qual tem sido reconhecido pela indução das respostas imunológicas em experiências de transplantes de tumor.

Outra classe de TAA é o antigenio oncofetal ou de diferenciação. Os antigenios oncofetais são principalmente produtos de células embrionarias ou fetais que sao expressas pelas células malignas devido á nao repressão dos genes embrionários. Um exemplo de antigenios oncofetais humanos são os antigenios carcino-embrionários (CEA) do colon. Esta série de antigenios encontra-se nos tecidos derivados do tracto gastrintestinal fetal, e nos tumores do tracto gastro-intestinal. A alfa-fetoproteína é outro antigenio oncofetal conhecido, o qual é segregado pelas células do hepatocarcinoma, assim como por células de saco de gema malignas e células do fígado fetal, e a fracção proliferante de célu las de fígado de adulto.

Uma terceira classe de TAA inclui antigenios de tumor indu zido viralmente. Esta inclui o antigenio T induzido pelos vírus de tumor de DNA, e os antigenios de invólucro de vírus de tumor de RNA.

Tem sido detectada uma variedade de TAA de superfície celu lar humana em neoplasias humanas por anticorpos mono.clonais de ? rato (Hellstrom, K.E., et al., 1982, Human Tumor-Associãted Antigens Identified by Monoclonal Antibodies, in, Springer Seminars in Immunopathology: Mechanism of Host Resistance in Câncer. Springer, New Tork, pp. 127-146; Herlyn, M., et al,, 1984» in» Contributions to Oncology, Karger, Basel, Switzerland, Vol. 19

pp. 160-170; Reisfeld, R.A. and. Sell, S., eds., 1985, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, Vol. 27, Alan R. Liss, Inc., New York), Muitos destes antigenios denominam-se oncofetais, uma vez que eles são expressos fortemente por tumores e determinadas células embrionárias e, muito mais moderadamente por células normais de hospedeiros adultos. Tem sido detectados outros antigénios associados a tumores, pela sua capacidade para estimularem a imunidade induzida por células do hospedeiro (GMI) no cancro humano (Hellstrom, K.E., and Hellstrom, I., 1969, Adv. Câncer Res. 12:167-225; Halliday, W.J., and Maluish, A.E,, 1982 in, Assessment of Immune Status hy the Leukocyte Adherence Inhihition Test, Aca demic, New York pp. 1-26; Herherman, R.B., 1974, Adv. Câncer Res. 19:207-265; Thomson, D.M.P., 1980, Câncer Res. 29:627-629; Halli day, W.J., et al; 1975, Int. J. Câncer 16:645-654) and in tumor-hearing animais (Taranger, L.A., et al., 1972, Science 176:1557-1540; Halliday, W.J., et al., 1974, Cell Immunol. 10:467-475; .Steele, G., et al., 1975, J. Natl. Câncer Inst. 54:959-967). Alguns destes antigénios são também oncofetais, mas a sua natureza molecular e relação com· os antigénios definidos pelos anticorpos monoclonais murinos não são claras.

Obtiveram-se recentemente anticorpos monoclonais de murino a antigénios compartilhados carcinomas da bexiga do rato (Hellstrom, I., et al., 1982, Int. J. Câncer 29:175-180; Hellstrom,

I., et al., 1985, Câncer Res. 45:2210-2218). Nm dos anticorpos, 6.10, mostrou ser específico para um antigénio oncofetal de tumor da bexiga (Hellstrom, I., et al., 1985, Câncer Res. 45:2210-2188).

Antigénios de tumor não modificados (Hoover, H.C., et al., 1985, Câncer 55:1256-1243; Mclllmurray, M.B., et al., 1978, Br. Med. J. 1:579-580) e vírus recombinantes vivos (Earl, P.L., et al., 1986, Science 23:728-731; Lathe, R., et al., 1987, Nature 236:878-880) têm sido utilizados em tentativas para induzir respostas imunológicas anti-tumor terapeuticamente benéficas.

2·3 Manipulações Idiotípicas de Imunidade de Tumor

Tem sido referidas várias manipulações idiotípicas de imuni dade de tumor, Nepom et al. (1984, Proc. Bati. Acad. Sei. U.S.A. 81:2864-2867) descreveu a indução de imunidade de tumor em que se introduziu um antigénio oncofetal num hospedeiro xenogénico. Prepararam-se anticorpos anti-idiotípicos policlonais que reconheciam determinantes idiotípicos num anticorpo de rato para o epitope p97° de antigénio p97 de melanoma humano. Os anti-soros policlonais puderam induzir, em ratos, uma resposta de Ab3 e uma resposta de CMI para p97. Forstrom et al. (1983, Nature (London) 303:627-629) utilizaram um anticorpo anti-idiotípico para induzir CMI, em ratos, e um sarcoma singénico quimicamente induzido. Neste estudo, 0 anticorpo anti-idiotípico era um auto-anticorpo produzido por hiperimunização do tumor, e 0 antigénio de tumor não era uma molécula definida. Os estudos de Flood et al. (1980, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:2209-2213) and Binz et al.

(1982, Int. J. Câncer 29:417-423) demonstraram manipulações idio típicas de imunidade de tumor em sistemas singeneicos, com moléculas de antigénio não definidas. Flood et al. provaram que os linfécitos T anti-idiotípicos de murinos podiam participar numa

reacção auto-imunológiea aos linfócitos T específicos de fibrosarcoma, e assim, afectar de modo adverso uma resposta imunológi ca individual a um tumor. Binz et al. utilizaram anticorpos anti -idiotípicos para induzir in vitro a proliferação de linfócitos T especificamente citotoxicos em células de sarcoma de rato.

Estudos adicionais têm investigado o efeito de anticorpos anti-idiotípicos no crescimento de tumores. Tilkin et al. (1981, Proc. Natl. Acad. Sei., U.SíA. 78:1809-1812) mostraram que a imu nização de ratos com células de nodulos de linfa sensibilizadas para um antigénio de sarcoma não identificado originou a rejeição do tumor e inibição do crescimento. Kennedy et al. (1985, J. Exp. med. 161:1432-1449) descreveram a supressão da formação de tumor em ratos estimulados com células transformadas de SV40, depois de injecção com anticorpos anti-idiotípicos policlonais relacionados com o antigénio de SV40.

Koprowski et al. (1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:216-219) mostraram a presença de anticorpos anti-idiotípicos em pacientes que apresentavam uma remissão de carcionoma depois da administração de um anticorpo monoclonal dirigido contra can cro gastrointestinal humano.

2·4 células Supressoras e Eactores Supressores a cascata de factores/células supressores têm sido reconhe eidos em tumores e sistemas de experiência (Nepom, G.T., et al. 1983, Experientia 39:235; Asherson, G.L., et al., 1984, Immunolo gy 53:491; Dorf, m.E. and Benacerraf, B., 1984, Ann. Rev. Immunol. 2:127). as células supressoras têm um papel importante na regulação da imunidade de tumor (Greene, M.I., et al., 1977,

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74:5118; Hellstrom, K.E., et al., 1978, J. Exp. med. 148:799; Repom, G.T., et al., 1983, Experientia 39:235; Rorth, R.J., 1982, J. Exp. Med. 155:1063;Yamauchi, K., et al., 1979, J. Immunol. 123:1655)· Algumas destas células produ zem factores supressores (SE) (Relson, K., et al., 1975, Int. J. Câncer 16:539; Greene, M.I., et al., 1977, J. Immunol. 119:759;. Koppi, T.A. and Halliday, W.J., 1983, Cell. Immunol. 76:29) que se podem detectar nos soros de animais com tumores e pacientes humanos através da inibição (bloqueamento) de manifestações in vitro de imunidade induzida pela célula (CMI) (Hellstrom, K.E., et al., 1978, J. Exp. Med. 148:799; Hellstrom, I., et al., 1969, Proc. Ratl. Acad. Sei. U.S.A. 62:362; Baldwin, R.W., 1973, Adv. Câncer Res. 18:1; Halliday, W.J., et al., 1974, Cell. Immunol. 10:467; Steele, G., et al., 1975, J. Ratl. Câncer Inst. 54:959; Hellstrom, K.E<, et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 473:121; Halliday, R.J., et al., 1980, J. Ratl. Câncer Inst. 65:327; Koppi, T.A. and Halliday, VÍ.J», 1981,«T. Ratl. Câncer Inst. 66:1089; Kuchroo, V.K., et al., 1983, Câncer Res. 45:1525; Koppi, T.A., et al,, 1981, J. Natl. Câncer Inst. 66:1097). Alguns ES têm espe cificidade de tumor e podem remover-se do soro por absorção com o tumor respectivo ou antigénio relacionado com o tumor mas não com tumores expressando antigénios diferentes (Kuchroo, V.K., et al., 1985, Câncer Res. 45:1525·; Baldwin, R.R., 1975, Adv. Câncer Res. 18:1; Hellstrom, K.E., et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 475:121; Koppi-Reynolds, T.A. and Halliday, W.J., 1984, Immunol. Lett. 8:219). Isto sugere que há um sítio de ligaçao ou idiotopo

- 9 nas moléculas de FS complementar aos determinantes de antigénios de tumor (Nepom, G.T., et al., 1983, Experientia 39:235; Hellstrom, K.E., et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 473:121). Tem sido referido que FS circulantes se ligam a anticorpos de ratos hiperimunizados com células de tumor, sugerindo que os anticorpos sao complementares aos determinantes idiotípicos no FS, (Hellstrom, K.E., et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 473:121; Nepom,

G.T., et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74:4605); nestes estudos, considerou-se que as respostas dos anticorpos e as respostas das células supressoras eram policlonais. Determinados soros imunolégicos, obtidos depois da remoção ou regressão de tu mor, anulam (unhlock”) a actividade supressora específica de antigénio (blocking”) dos soros de tumor como medido in vitro (Halliday, W.J., et al., 1974, Cell. Immunol. 10:467; Hellstrom, I. and Hellstrom, K.E., 1970> Int. J. Câncer 5:195). Tem sido teorizado que este efeito desbloqueante” foi veiculado por anti corpos anti-idiotípicos (Hellstrom, K.E., et al., 1977, Biochim. Biophys. Acta 473:121). Foi referido que anticorpos desbloquean tes” têm um efeito terapêutico no rato com tumores induzidos por vírus de polioma primários ou transplantados (Bansal, S.C.^and Sjogren, H.O., 1972, Int. J. Câncer 9:490; Sjogren, H.O. and Ban sal, B.C., 1971, in Progress in Immunology, Amos, B., ed., Acade mie Press, New York, p. 921; Bansal, S.C. and Sjogren, H.O.,

1971, Nature (NewBiol.) 235:76).

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos que utilizam anticorpos anti-idiotípicos, ou seus fragmentos, para imunoterapia e imunoprofilaxia de tumores. Esta invenção refere-se ã manipulação da rede idiotípica do sistema imunologico para efeitos terapêuticos. Aspectos particulares incluem a utilização de anticorpos anti-idiotípicos para imunização contra tumores, para activa ção de linfocitos para utilização em imunoterapia adoptiva e para inibição da supressão imunológica veiculada por células supressoras T ou factores supressores expressando um idiotopo diri gido contra um antigénio tumoral. Em aspectos específicos, são identificados anticorpos anti-idiotípicos monoclonais, ou seus fragmentos, (a) que se desenvolvem contra o idiotipo de um anticorpo que define um antigénio de tumor, e (b) que apresentam pro priedades específicas do tumor, tais como indução de imunidade veiculada por células específicas de tumor (como medido por vários ensaios, por exemplo, o ensaio de inibição de aderência de leucócitos ou o ensaio de hiper-sensibilidade tipo retardada), inibição de ligação anticorpo anti-tumor, etc.. Os anticorpos anti-idiotípicos, ou seus fragmentos, que apresentam imunocompetência podem utilizar-se in vivo num paciente para induzir uma resposta imunologica dirigida contra células de tumor que contem o antigénio de tumor. Os anticorpos anti-idiotípicos, ou os seus fragmentos, podem também utilizar-se para controlar a indução de anti-anticorpos em pacientes submetidos a imunização passiva para um antigeno de tumor, por administração de anticorpo anti-tumor.

Num outro aspecto, de realização, a indução de anticorpos anti-idiotípicos in vivo por administraçao de anticorpos anti-tu

mor ou células imunes ou factores apresentando os idíotopos anti -tumor, podem ter valor terapeuticamente.

Esta invenção refere-se também a moléculas de anticorpos anti-idiotípicos monoclonais, fragmentos de anticorpo, ou anticorpos ou fragmentos quimicamente modificados, os quais reconhecem um idiotipo dirigido contra um antigénio de tumor definido.

As moléculas desta invenção podem produzir-se por qualquer técni ca conhecida na especialidade, incluindo a técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein (1975, Nature 256:495-497), the human B-cell hybridoma technique (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), and the EBV-transformation technique (Cole et al., 1985 Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

A presente invenção é ilustrada por intermédio de um exemplo no qual a seroterapia em ratos por injecção com anticorpos anti-idiotípicos relacionados com um fibrossarcoma murino atrasa o aparecimento e origina a regressão do sarcoma transplantado. Estabeleceu-se uma linha de células T que expressou um idiotopo dirigido contra um fibrossarcoma, e que pode transferir hipersen sibilidade tipo retardada, para o fibrossarcoma.

Num outro exemplo desta invenção, descreve-se um anticorpo anti-idiotípico monoclonal de rato o qual é específico para um idiotipo que reconhece um antigénio gangliosídico GQ3 associado com melanoma humano. Demonstrou-se que o anticorpo anti-idiotípi co evitava a ligação do anticorpo anti-GD3 ao seu antigénio, e inibia a citotoxicidade dependente do anticorpo e do complemento

do anticorpo anti-GDJ. Mediante utilização do anticorpo anti-idio típico como uma sonda, desenvolveu-se um ensaio para controlar anticorpos humanos para os anticorpos anti-GDJ em pacientes que receberam os anticorpos anti-GD3 para efeito terapêutico ou de diagnostico.

Num terceiro exemplo desta invenção, descrevem-se anticorpos anti-idiotipicos monoclonais murinos que reconhecem um idiotipo dirigido contra um antigénio p97 associado com melanoma humano. Obtiveram-se anticorpos anti-idiotípicos monoclonais que podiam inibir competitivamente a ligação de p97 a anticorpos anti -p97 e que podiam induzir anticorpos a p97 in vivo.

Num outro exemplo, descrevem-se anticorpos anti-idiotipicos monoclonais murinos que reconhecem um idiotipo num anticorpo 16 monoclonal o qual define um antigénio de hidratos de carbono de carcinomas humanos. Obtiveram-se anticorpos anti-idiotípicos sus ceptíveis de induzirem anticorpos, in vivo, reactivos com o anti génio de carcinoma definido pelo anticorpo 16.

As moléculas de anticorpo desta invenção, fragmentos de mo léculas de anticorpo contendo o idiotipo das moléculas, ou modificações químicas destas moléculas podem utilizar-se para testar a presença de anticorpos anti-tumor, de antigénio de tumor, por ensaios de competição e a indução de imunidade de tumor veiculada por células em aplicações imunoprofiláticas e imunoterapêuticas ς

- í

3.1 Definições

Como utilizado aqui, as abreviaturas seguintes têm os significados indicados:

Abl - anticorpo 1; o anticorpo inicial de uma cascata de anticorpos anti-idiotípicos.

Ab2 - anticorpo 2; anticorpo anti-idiotípico dirigido contra um idiotipo de Abl.

Ab3 - anticorpo 3; anticorpo anti-anti-idiotípico, diri gido contra um idiotipo de Ab2.

ADCC - Citotoxicidade celular dependente do anticorpo. anti-Id - anticorpo(s) anti-idiotípico (ies).

B1CC - carcinoma das células transicional da bexiga.

CDC - citotoxicidade dependente do complemento.

CMI - Imunidade veiculada por células,

DTH - Hipersensibilidade tipo retardada.

FACS - Separador de célula activado por fluorescência. FCS - Soro de feto de vitelo

FITC - Isotiocianato de fluoresceína.

HRP - peroxidase de rábano.

Id - idiotopo

Ig - imunoglobulina

i.p. - intraperitoneal

i.v. - intravenoso.

KDa - KiloDalton.

KLH - hemocianina de molusco (lapa).

LAI - Inibição de aderência de leucócito mAb - anticorpo monoclonal (ies)

- 14 MCA - 3-metil-colantrenoOPD - O-fenileno-di-amina par - parental (p97-negativo) C3H/linha K-1735-M2 de melanoma de rato HeN·.

PBS - solução de cloreto de.sódio tamponada com fosfato;

PC - células peritoneais ,

SC - célula de baço /

4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Pigura 1. Um diagrama esquemático de quatro tipos de respos tas idiotípicas e anti-idiotípicas iniciadas por estimulação anti génica. Está representada a substituição de (Eig. 1B, 1D) ou Tg (Eig. 1C) por Abl naQêstimulaçao de produção de anticorpos anti-idiotípicos.

Eigura 2. Um diagrama esquemático de três percursos pelos quais Ab2 pode induzir imunidade anti-tumor. A Eigura 2A mostra a indução de antigénio específico Tjj depois de imunização com Ab2. É ilustrada a activaçao de especificidades Abl normalmente silenciosas (Eig. 2B), tal como o início de Id⁺ T_g (Eig. 2C).

/ Aí

Eigura 3. Um diagrama esquemático de imunização com anticorpos anti-idiotípicos de imagem interna para provocar a resposta anti-antígena.

Eigura 4. células T de linha 90.3 (círculos fechados) inibem o crescimento de MCA-1490 (Painel A) mas não inibem MCA-1510 ou MCA-1511 (Painéis B e C). Utilizou-se o crescimento de tumor

misturado com células T de controlo (círculos abertos), para com paração.

Figura 5. Tratamento de ratos portadores de tumor com mAb auto-anti-idiotipicos inibe o crescimento do tumor. Os mAb foram administrados intraperitonealmente, nos dias 8, 13, 17 e 21. Representou-se o tamanho do tumor oomo a área média dos tumores de 10 ratos em cada grupo de tratamento. Trataram-se os ratos com mAb 4.72 (círculos fechados), mAb 5.96 (quadrados abertos), mAb 8.2 (círculos abertos) ou BBS (linha tracejada). Diferenças signi ficativas a ^p menor do que 0,05, menor do que 0,01, me nor do que 0,001.

Figura 6. 0 tratamento de ratos portadores de tumor com an ticorpos auto-anti-ibâípicos monoclonais induz a regressão do crescimento de sarcomas. 0 número de ratos com tumores maiores do que 0,2 cnr depois de tratamento com mAb 4.72 (círculos fechados) ou mAb 5.96 (círculos abertos) está representado para o tumor MCA-1490 (painel superior) ou MCA-1511 (painel inferior).

Figura 7. Inibição da ligação a células 13 mAb MG-21 do cio ne M-2669 por cultura do sobrenadante do hibridoma 2C1 produtor de anticorpos anti-idiotípicos.

Figura 8. Ligação directa de anticorpos anti-idiotípicos monoclonais 2C1 a mb MG-21. Adicionaram-se várias concentrações de mAb 2C1 (círculos fechados) ou imunoglobulina de controlo P1.17 (triângulos fechados) a cavidade de cloreto de polivinilo pré-revestidas com mAb MG-21.

Figura 9. Especificidade de mAb anti-ioditípicos 2C1 para

- Ιό’

MG-21 em comparaçao com vários mAbs.

Figura 10. Perfis de separaçao de células de MG-21 conjuga do com FITC contra células M-2669 na presença ou ausência da mAb 2C1. Coraram-se as células de tumor com MG-21 conjugado com FITC isolado (40ytg/ml, painel a) ou mantiveram-se sem coloração para se obter o nível de fundo (painel b). Os painéis c a f mostram a inibição da coloração com MG-21 conjugado com FITC na presença de mAb 2C1 a diferentes concentrações (painel c, lóOyAg/ml; painel d, 80ytóg/ml; painel e, 40yU,g/ml; painel f, 20yí-g/mlK Os pai neis g e h mostram a coloração de MG-21 conjugado com FITC na presença de mAb 26.8 (lóffiytlg/ml) e P1.17 (lóOyig/ml).

Figura 11. Ligação de anticorpos anti-idiotípicos (Ab2) pu rifiçados a fragmentos Fab de mAb 96.5 anti-p9Y. Colocaram-se em placas e bloquearam-se fragmentos de anticorpos Fab de mAb 96.5, adicionaram-se várias diluições de Ab2, e detectou-se a ligação de Ab2 por adição de IgG anti rato murina marcada com HRP, como descrito na secção 8,1,5.

Figura 12. Ab2 pode inibir a ligação de mAb 96.5 a células SK MEL-28. Misturou-se o mAb 96.5 anti-p97 (0,33^g/ml) com anti. corpo anti-idiotípico (Ab2) purificado (10^/íg/ml) e adicionou-se a células SK MEL-28, que expressaram aproximadamente 400.000 moléculas de p97 por célula e que se tinham colocado em cavidades de placas Immunolon, Detectou-se a ligação de mAb 96.5 ãs células por ELISA e calculou-se a inibição desta ligação por Ab2.

Figura 15. Inibição competitiva por anticorpos anti-idiotí picos (Ab2) da ligação de antigénio p97 marcado com ¹²^I a fra- 17 -

gmentos Fab de mAb 96.5 de anti-p97. Misturaram-se várias diluições de cada Ab2 com p97 rádio-iodado, e determinou-se a ligação de p97 a fragmentos Fab de mAb 96.5 num ensaio de fase sólida.

Figura 14. 0 anticorpo anti-idiotípico (Ab2) pode inibir a ligação de fragmentos de mAb anti-p97 96.5 a p97 marcado por rádio. Plaquearam-se fragmentos Fab de mAb 96.5 em cavidades de placas Immunolon, e adicionou-se Ab2 (10y<g/ml). Testou-se o Ab2 para a sua capacidade para diminuir a ligação de p97 rádio-marca do em cavidades revestidas de Fab, por bloqueamento dos sítios de ligação a p97 nos fragmentos Fab.

Figura 15. Ensaios da capacidade de mAb, que reconhece diferentes epitopes do antigénio p97, para inibir a ligação de Ab2 a fragmentos de mAb 96.5 de anti-p97. Misturou-se cada mAb anti-p97 com o Ab2 a ensaiar, e adicionou-se a placas revestidas com fragmentos Fab de mAb 96.5, seguida da adição de IgGl-HSP caprina anti-murina para detectar a ligação do Ab2 respectivo aos fra gmentos Fab. Testou-se a ligaçao de um dado Ab2 isolado (círculos fechados), ou na presença de imunoglobulina P1.17 de controlo (X—X), e comparou-se com a ligação verificada depois de se terem adicionado vários mAb específicos para p97 (círculos abertos).

Figura 16. Ligação de anticorpos anti-idiotípicos (Ab2) plaqueados para diferentes mAb anti-p97, e seu efeito na capacida de de mAb anti-p97 para se ligar subsequentemente a p97. Plaqueou -se cada Ab2, adicionaram-se várias concentrações de mAb anti-97 8, 2, 4, 1, ou 96,5 e mediu-se a ligação de qualquer mAb anti- 18

-p97 a ρ97 marcado com iodo radioactivo.

Figura 17. Ligação de anticorpos anti-idiotípicos (Ab2) co locados em placas a diferentes mAb anti-p97, e o seu efeito na ca pacidade do mAb anti-p97 se ligar, subsequentemente, a p97. Piaqueou-se cada Ab2, adicionaram-se varias concentrações de mAb, anti-p97, 96,5 (Painel A, linha a cheio), mAb 133,1 (Painel A, linha tracejada), ou mAb 133,3 (Painel B), e mediu-se a ligação de qualquer mAb anti-p97 a p97 marcado com iodo radiomarcado.

Figura 18. Painel A: Ligação, de p 97 plaqueado para soros de murino contendo Ab3» Os soros derivaram de ratos BALB/c que tinham sido imunizados com anticorpos anti-idiotípicos conjugados com KLH. Painel B: Ligação, a p97 plaqueado de mAb 96.5 e de soros recolhidos de ratos imunizados a p97.

Figura 19. Inibição da ligação de p 97 a Ab3, por células positivas-p97 mas não por células negativas-p97. As células posi tivas 2A-p97 (linha K-1735-K2 de melanoma de rato transfectada com o gene p97), mas as células negativas-p97 (originais K-1735-M2), não foram capazes de inibir a ligação, a p97 de Ab3 plaqueadas de Ab3 de ratos BALB/c imunizados. 0 painel A mostra os resultados de ratos imunizados com Ab2$3, θ os Painéis B, C e D mostram os resultados de ratos imunizados com Ab2 tM7, //4, e //5, respectivamente.

Figura 20. Testou-se a ligação de anticorpo a p97 plaqueado depois de absorção do anticorpo com células 2A positivas-p97 (2a), células K-1735-M2 originais negativas p97 (par), ou anticorpos isolados. Painel A: A absorção de mAb 96.5 com células 2A

inibe a ligação de mAb 96.5 a p97 plaqueado. Painel Β: A absorção, com células 2A, de anticorpos de soro (alfa-p97) de ratos imunizados com p97, inibe a ligação dos anticorpos de soro a p97 plaqueado. Painel C: Anticorpos de soro (alfa pl.17) de ratos imuni zados com pl.17 não se ligaram a p97. Painel D: Soro normal de rato (NMS) não se liga a p97.

Figura 21. Ligação a p97 plaqueado de Ab3 plaqueado em soro de ratos imunizados. Imunizaram-se ratos C3H/H e N com anticorpos anti-idiotípicos (Ab2) conjugados com KLH. Detectou-se a ligação de Ab3, no soro de ratos imunizados, para o antigénio p97, por ELISA de fase solida.

Figura 22. Ligação a p97 de mAb 96.5 plaqueado. Detectou-se a ligação de mAb 96.5 anti-p97 ao antigénio p97 plaqueado por ELISA de fase sólida.

Figura 23. Inibição da ligação de mAb L6 a células de carcinoma H-3347 por Ab2 purificado. As concentrações de Ab2 foram como se segue: VZ2 50ytg/ml; β 5.0_/Wg/ml; S£3 0.5yfg/ml; 0$

0.05yíg/ml. 0 mAb 16 utilizou-se a 1.0y«g/ml.

Figura 24. Ligação de Ab2 marcado com FITC a células H-3347 saturadas Fab L6. Parte A: Os resultados são apresentados para os seguintes Ab2: —1; —G— 3; -h’ 7; 9; —11;

-ΕΞ3— 13; -Ar- 15. Parte B: Os resultados são apresentados para os seguintes Ab2: Hi 2; -Ά- 4; —·—* 6; 8; 10;

—O— 12; —*— 14, LFE (fluorescência linear equivalente). A proporção é igual ã proporção entre a fluorescência da amostra e a fluorescência de base.

Figura 25. Ligação de Ab2 marcado com FITC a células H-3347 saturadas de L6 marcadas com PE. 0 Ab2 ensaiado é indicado em baixo de cada gráfico. ---Ab2 marcado com FITC;

---- mAb 16 marcado com ficoeritrina a uma diluição 1:25 de apro ximadamente 1 mg/ml de solução. Proporção RFL EFE: fluorescência linear vermelha, fluorescência linear equivalente (proporção entre a fluorescência da amostra e a fluorescência de base da fico eritrina); Proporção GRFL LFE: fluorescência linear verde, equivalente de fluorescência linear (proporção entre a fluorescência da amostra e a fluorescência de base de FITC).

Figura 26. Inibição da ligação de mAb F26 a células H-3547 por Ab2 L6. As concentrações de Ab2 foram as que se seguem: VHZà 200y«g/ml; 20y^g/ml; ESI 2,0^Ag/ml. 0 mAb F2ó utilizou-se a 1.0 yíg/ml.

Figura 27. Especificidade do epítope Ab2. Os ensaios de competição para a especificidade de regiões variáveis de anti-idiotipo L6 realizaram-se como descrito na secção 9.1.9, infra. Adicionaram-se os competidores a uma concentração de 6y«g/inl durante 0,5 horas antes da adição de anticorpo 16 quimérico biotinilado, originando uma concentração final de 4^wg/ml para o últi mo. Os competidores eram como se segue: W mAb L6 quimérico 823 a cadeia pesada -variável de mAb 16 quimérico mais a cadeia leve J5581 lambda I; C3 cadeia leve variável de mAb 16 quimérico ESSf IgGl humana irrelevante (PW P5281B8). A IgGl humana irrelevante não mostrou qualquer inibição para qualquer Ab2. Os estu dos de ligação directa não mostraram reconhecimento de quaisquer dos Ab2 V-Kapa para a cadeia pesada 16 quimérica e vice-versa.

Figura 28. Inibição da ligação de Ab2 a Abl na presença de soros BALB/c (Parte A) ou C3H/H e N, contendo Ab3. As diluições de soros contendo Ab3 foram como se segueis, izzzza 1:20; ® 1:200; SSí 1:2000; 1:20,000. 0 Ab2 utilizou-se 1.0^g/ml.

Figura 29. Ligação a células de carcinoma H-3347 de soros purificados por afinidade, de ratos C3H/H e W imunizados com Ab2. Os soros retiraram-se 6 a 20 semanas depois da primeira imunização. Os anti-soros eram como segue: —— anti-Pl-17; -Wl·- anti-

//13; anti-Ab2 //14; -tAt* anti-Ab2 //15. Apresenta-se também a ligação de mAb L6 a uma concentração de 0,016 y/g/ml (----).

A proporção LFE (fluorescência linear equivalente) é igual á pro porção entre a fluorescência da amostra e a fluorescência de base.

Figura 30. Ligação a células de carcinoma H-3347 de soros purificados por afinidade, de ratos BALB/c imunizados com Ab2.

Os soros retiraram-se 6 a 24 semanas depois da primeira imunização. Os anti-soros eram como se segue:--anti-Pl-17; —V anti

-Ab2 //3; —<·— anti-Ab2 //11; - o— anti-Ab2 //12; “âr anti-Ab2 //13; 1 anti-Áb2 //14; EZLl· anti-Ab2 //15. Apresenta-se também a ligação de mAb L6 a uma concentração de 0,08^Z/g/ml (----).

A proporção LFE (fluorescência linear equivalente) é igual ã pro porção entre a fluorescência da amostra e a fluorescência de base

- 22 - ,

5. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos que utilizam anticorpos anti-idiotípicos para imunoterapia e imunoprofilaxia de tumores. A invenção refere-se ã manipulação dá rede idiotípica do sistema imunitário para efeitos terapêuticos. A imunização com anticorpos anti-idiotípicos (Ab2) pode induzir a formação de imunoglobulinas anti-anti-idiotípicas, algumas das quais têm a mesma especificidade antigénica dos anticorpos (Abl) utilizados para derivar o anti-idiotipo. Isto cria um modelo poderoso para a manipulação de respostas imunologicas, proporcionando um mecanismo para geração e ampliação do reconhecimento específico do antigénio no sistema imunitário. Uma resposta imune para tumores parece envolver o reconhecimento específico do idiotipo do antigénio tumoral; a presente invenção refere-se a estratégias para manipular este reconhecimento por forma a obter-se benefício terapêutico. Formas de realização particulares desta invenção incluem a utilização de anticorpos anti-idiotípicos para imunização contra tumores, para activaçao de linfócitos utilizados em imuno terapia adoptiva e para inibição da supressão imune veiculada por células T supressoras ou factores supressores que exprimem um idiotopo dirigido contra um antigénio tumoral. Os anticorpos anti-idiotípicos, ou seus fragmentos, podem também utilizar-se para controlar a indução de anti-anticorpos em pacientes submeti, dos a imunização passiva para um antigénio de tumor por administração de anticorpo anti-tumor.

Numa forma de realização específica, a indução de anticorpos anti-iditípicos in vivo, por administração de anticorpos anti -tumor, células ou factores imunoles apresentando o idiotopo anti

-tumor, pode ter importância terapêutica.

Num outro aspecto da presente invenção, anticorpos anti-idiotípicos monoclonais, ou seus fragmentos, desenvolvidos contra o idiotipo de um anticorpo que define um antigénio de auto-diferenciação, tal como um antigénio oncofetal, ou de diferenciação, podem administrar-se in vivo para induzir uma resposta imune específica dirigida contra células de tumor que contêm o antigénio oncofetal. Os pacientes com tumores podem ser tratados por imunoterapia com os anticorpos anti-idiotípicos monoclonais da presente invenção enquanto pacientes identificados como tendo uma pre-disposiçao podem receber tratamento imunoprofilactico.

A presente invenção refere-se também a moléculas de mAb anti-idiotipicas, ou fragmentos das moléculas de mAb anti-idioti picas, ou suas modificações, que reconhecem um iodítipo que se dirige contra um antigénio definido específico para um tumor. Estes antigénios de tumor incluem antigénios de fibrossarcoma, antigénios de auto-diferenciação tais como antigénios oncofetais, ou de diferenciação que são expressos por células malignas, incluindo mas não se limitando aos antigénios oncofetais tais como antigénios carcino-emhrionários (CEA) do colon, alfa-fectoproteí na, o antigénio humano correspondente ou o equivalente funcional do antigénio murino de 175 KDa de células transitórias de carcinomas da bexiga, o antígeno p97 ou GD3 associado com melanoma, e antigénios de diferenciação de carcinomas do pulmão humano tais como L6 e L20, descritos com mais pormenor infra.

As moléculas de mAb da presente invenção incluem o conjun-

to de moléculas e fragmentos de anticorpo monoclonal ou quaisquer modificações químicas destas moléculas, que contêm o sítio de combinação de antigénio que se liga ao idiotipo de outra molécula (s) de anticorpo com especificidade para um antigénio de tumor definido. Os fragmentos de anticorpo monoclonal contendo o idiotipo da molécula de mAb podem gerar-se por várias técnicas. Estas incluem, mas não se limitam a: o fragmento F (ah’)^ l^ue pode gerar-se por tratamento da molécula de anticorpo com pepsina, os fragmentos Eab’ que se podem gerar por redução das pontes dissul fureto do fragmento F(ah’)₂, e os fragmentos 2Fab ou Fah que se podem gerar por tratamento da molécula do anticorpo com papama e com um agente de redução para reduzir as pontes dissulfureto»

Dependendo da utilização pretendida, as moléculas desta in venção podem modifiear-se quimicamente por ligação com qualquer um dos diversos compostos, utilizando as técnicas de ligação conhecidas. Estas incluem, mas não se limitam a, meios enzimáticos, substituição oxidativa, formação de complexos etc., como utiliza do, por exemplo, na ligação de um radio-isotopo para imuno-ensaios.

A ligação ou acoplamento químico de um composto á molécula pode ser dirigida a um sítio que não participa na ligação de idiotipo, por exemplo, o domínio F da molécula. Isto pode reali c zar-se por prolecção do sítio de ligação da molécula antes de se efectuar a reacção de ligação. Por exemplo, a molécula pode ligar-se ao idiotipo que recinhece, antes da reacção de acoplamento. Depois de se completar o acoplamento o complexo pode separar -se afim de gerar uma molécula modificada com efeito mínimo no

sítio de ligação da molécula.

Os anticorpos, ou fragmentos de moléculas de anticorpos desta invenção, podem utili&ar-se como imunogenos para induzir, modificar ou regular a imunidade de tumor veiculada por células específicas. Isto inclui, mas não se limita a, utilização destas moléculas na imunização contra tumores singenicos.

método desta invenção pode dividir-se, unicamente com o objectivo de descrição, nas duas fases seguintes:

(a) produção de mAb(s) anti-idiotípicos (os quais podem ser auto -anti-idiotípicos) dirigidos contra um idiotipo que se liga a um antigénio tumoral definido; (b) avaliação e demonstração de espe cificidade do idiotipo tumoral das moléculas de mAb anti-idiotípicas ou seus fragmentos derivados, por exemplo, por demonstração de imunopotência por indução de CMI específico, de ligação a células I supressoras específicas ou factores supressores, de li gação a células T de auxílio específicas, de inibição da ligação de anticorpo dirigido contra o antigénio de tumor, de inibição das propriedades de citotoxicidade do anticorpo dirigido contra o antigénio de tumor, etc.; e (c) formulação de regimes imunopro filáticos, imunoterapêuticos e de imunodiagnóstico.

Num sistema de experiência descrito num exemplo específico da presente invenção, o tratamento de ratos com anticorpos autoanti-idiotípicos relacionados com um antigénio de fibrossarcoma mostrou-se capaz de reduzir especificamente o crescimento·de sar comas existentes. Num outro exemplo, descreve-se um anticorpo anti-idiotípico monoclonal murino que reconhece um idiotipo diri

- 2^β -(

gido contra um antigénio gangliosídico GD 3 de melanoma humano. Este anticorpo é capaz de bloquear a ligação e as propriedades de citotoxicidade do anticorpo contendo o idiotipo que ele reconhece.

Num terceiro exemplo desta invenção, descreveram-se anticor pos anti-idiotípicos monoclonais murinos relacionados com os antigénios p97 associados a melanoma humano, cujos anticorpos po dem inibir competitivamente a ligação de p97 a anticorpos anti-p97, e que podem induzir anticorpos para p97 in vivo. Ainda nou tro exemplo desta invenção, descreve-se a geração e caracterização de anticorpos anti-idiotípicos monoclonais murinos que reconhecem um idiotipo num anticorpo monoclonal L6 o qual define um antigénio de hidratos de carbono de carcinomas humanos, vários dos anticorpos apresentam-se capazes de induzir anticorpos in vivo em antigénios de carcinoma definidos pêlo anticorpo L6. Contu do, os métodos descritos não se limitam a antigénios de melanoma, fibrossarcoma ou carcinoma, mas podem aplicar-se na produção e utilização de mAb(s) anti-idiotípicos relacionados com quaisquer antigénios de tumor específicos.

A utilização de anticorpos anti-idiotípicos para induzir respostas imunológicas para tumores pode ser vista como duas ques toes separadas. Primeiro, estes anticorpos podem utilizar-se para seleccionar ou amplificar um reportério anti-tumor pré-existente, isto é, para recrutar, por intermédio de selecção idiotípica, cé lulas T e/ou B com especificidade para antigénio tumoral. Segundo, anticorpos anti-idiotípicos podem utilizar-se como imagens

internas” de antigénios para induzir uma resposta imunológica primária a qual é anti-anti-idiotípica, e da qual uma parte é di rigida contra o antigénio de tumor nominal. No último caso, a especificidade imunológica é mais contra o anti-ioditipo do que contra o antigénio.

Por utilização de anticorpos anti-idiotípicos para induzir imunidade, podem seleccionar-se células T e B que são diferentes das que participam numa resposta anti-tumoral que ocorra natural mente, como um resultado da regulação superior de uma resposta imunológica que é normalmente suprimida ou pela indução, de novo, de uma resposta. De importância terapêutica significativa é o potencial para induzir reactividade anti-tumor eficaz nos hospedeiros que de outro modo são incapazes de manifestar tal reactividade.

5.1 Interacções idiotípicas iniciadas por estimulação antigéa nica.

A fim de efectuar manipulações terapêuticas do reconhecimento:⁼;ídiotípico de antigénios de tumor, tem que se considerar a natureza da resposta idiotípica, que ocorre naturalmente, ao ores cimento do tumor singeneico. Deve-se assim discutir a natureza do reportério idiotípico na resposta â estimulação com qualquer antigénio.

Na Figura 1 são ilustradas quatro possíveis respostas idio típicas e anti-idiotípicas que podem ser induzidas por antigénios. A Figura IA mostra uma progressão sequencial de especificidades complementares induzidas. Neste tipo de cascata idiotípica, a

imunização com antigénio conduz a uma população de imunoglobulinas que transportam idiotipos distintos, a soma dos quais é conhecida como o idiotipo ou resposta Abl. A presença de Abl induz então uma resposta anti-idiotípica, caracterizada por uma popula ção heterogénea de anticorpos, conhecidos como Ab2, os quais tem especificidade para os vários idiotopos na população Abl. A direç cionalidade da resposta provocada pelo antigénio é representada pelas setas na Figura 1. A indução de Ab2 por Abl é independente do antigénio (Urfoain, J., et al., 1982, Ann. Immunol. 133D:179-189; Rodkey, L.S., 1974, J. Exp. Med. 139:712; Kelsoe, G. and Cerny, J., 1979» Nature 279:333)· Ha suporte para este modelo (Fig. IA) na imunidade de tumor (Lee, V.K., et al., 1986, Biochim. Biophys. Acta 865:127-139; ver secções de exemplos infra).

Uma cascata idiotípica pode também levar á geração de Ab2 de acordo com o percurso apresentado na Figura 1B. 0 reconhecimento de antigénio de tumor induz células específicas de anti génio, que contêm idiotopos particulares, presumivelmente nas suas moléculas receptoras de antigénio. Estas células T estimulam então a geração de uma resposta de imunoglobulina anti-idiotípica sob a forma de uma população de Ab2.

Quais são as implicações de um modelo em que a cascata idiotípica se processa através de componentes alternados de anti corpo e de célula T? Numa análise de idiotopos associados com a resposta a sarcomas ou carcinomas de rato induzidos por MCA (Lee,

V.K., et al., 1986, Biochim. Biophys. Acta 865:127-139; ver secções de exemplos 6,7,8, infra), a imunização com Ab2 monoclonal

Λ

J falhou na geração de Ab3 com especificidade semelhante a Ahl, en quanto que T„ anti-tumor foram facilmente induzidas. Esta obsern vação, juntamente com a existência de positivo-idiotipo na resposta anti-tumor que ocorre naturalmente, suporta um modelo no qual pode haver uma interacção reguladora directa entre células Id T e células B anti-idiotípicas (e Ab2) (Nelson, K. and Nepom,

G.T., 1986, in Paradoxes in Immunology, Hoffman, G., et al., eds., CRG Press, Boca Raton, Florida, pp. 177-185; Bismuth, G., et al., 1984, Eur. Jf. Immunol. 14:503; Thomas, W.R., et al., 1983, J. Immunol. 130:2079). In vivo, as células Id⁺ T podem proporcio nar o estímulo para a produção de anti-idiotipo.

A falta de reconhecimento da célula Id⁺ B, em determinados casos, pode reflectir um defeito na capacidade genética para gerar idiotopos anti-tumor em moléculas de imunoglobulina; alterna tivamente, 0 estado regulador no hospedeiro que tem um tumor pode suprimir eficazmente Id⁺ Abl. Como descrito infra (ver secção 5.2.1), este aparente defeito pode ser terapeuticamente vantajoso num hospedeiro que normalmente não desenvolve respostas a anticorpos Id⁺.

Em adição ãs interacçoes idiotípicas que originam uma resposta Tg levando à rejeição do tumor, a exposição ao antigénio de tumor (ou complexos antigénio-anticorpo) pode conduzir â gera ção de células T suspressoras específicas de antigénio (Tg) (Fig. 1C). Em vários sistemas tumorais mostrou-se que as células supressoras T funcionam como células de indução, iniciando e amplificando a supressão específica de antigénio de tumor (Nepom,

G.T., et al., 1983, Experientia 39:235-242). Se Id⁺ T_s são direç tamente induzidas por estimulação de antigenio, como no modelo apresentado na Figura 1C, é possível que estas células, assim como a T„ na Figura 1B, possam servir como estímulo para a gera±1 ção de Ab2 anti-idiotípicos.

Num modelo em que os T<, idiotípicos são gerados subsequentemente ã estimulação por antigénio, pode considerar-se também um percurso alternativo. Como apresentado em diagrama na Figura 1L, Id⁺ T.g pode surgir como uma consequência de estimulação anti. -idiotípica. Numa análise recente de respostas de célula T restringida por IgH para o azobenzeno-arsonato de hapteno, verificou-se que a natureza dos idiotopos de imunoglobulina determinam o desenvolvimento de idiotopos (Hayglass, K., et al., 1986, J. Exp. Med. 164:36-49; Hayglass, K«, et al., 1986, Xmmunol. Today 7:179-183)· As células T desenvolvendo-se em ratos congénicos de IgH adquiriram o reportorio idiotípico do hospedeiro e o tratamen to de animais neonatais com anticorpos na cadeia de imunoglobuli na aboliu o estabelecimento de um reportorio normal de idiotipos de célula T funcionais. Assim, a divisão de imunoglobulina pode determinar o desenvolvimento de elementos complementares de reconhecimento da célula Ϊ.

Como ilustrado pelos exemplos das secções infra, o percurso idiotípico representado na Figura ID parece existir também no con texto de reconhecimento de antigénio de tumor. Nos nossos estudos em ratos que tinham sarcomas ou carcinomas da bexiga induzidos com MCA, verificou-se que um idiotopo simples, dominante de célu

la T era prevalecente na resposta supressora veiculada por T,g e factores solúveis (ver Kuchroo, V.K., et al., 1987, Cellular Immu nol. 104:105-114, e secção de exemplos 6, infra). Isto é, em vez de uma mistura heterogénea de idiotipos, predominam alguns idiotopos públicos compartilhados. Isto foi documentado pela remoção de factores supressores utilizando absorventes de afinidade feitos de anticorpos anti-idiotipicos monoclonais ou policlonais. Estas descobertas indicam que muitas das especificidades idiotípicas aparentes na resposta supressora a qualquer antigénio particular de tumor são compartilhadas.

Nos sistemas de experiência, a presença de idiotopos publi cos tem sido atribuída aos idiotopos reguladores, importantes para as interacções de rede (Bona, C., et al., 1982, J. Exp. Med. 156:986). A presença de tais supostos idiotopos reguladores da imunidade anti-tumoral pode reflectir ou uma selecção genética na geração de Tg idiotípico, ou uma influência da selecção de imunoglobulina na geração do reportério Tg. Se for o último caso, a indução de Tg idiotípico pode incluir o percurso apresentado na Figura 1D, no qual a resposta de Ah2 influência a natureza de ^Tg.

5·2 Manipulação da expressão de idiotopo por anticorpos anti-idiotípicos

Existem essencialmente dois processos de utilização de anti corpos anti-idiotípicos para manipular a resposta imunológica a antigénios de tumor para fins terapêuticos. Um baseia-se na selecção e amplificação de idiotopos anti-tumor pré-existentes den

f 9 tro dos reportorios das células T e B, e o outro requer a indução de uma resposta de novo utilizando um anti-idiotipo que actua como uma imagem interna de antigénio de tumor.

5.2.1 Selecção e amplificação de idiotopos de anti-tumor pré-existentes

Na produção terapêutica de anticorpos anti-idiotípicos baseada numa alteração da representação de idiotopo anti-tumoral pré-existente, os esforços terapêuticos baseiam-se numa inversão dos percursos, ilustrados na Figura 1, nos quais o compartimento de Ab2 se utiliza como o iniciador de interacções idiotipicas.

Os três percursos pelos quais Ab2 pode induzir imunidade específica de antigénia tumoral são ilustrados na Figura 2. A Figura 2A mostra que a imunização pode conduzir ao desenvolvimen to de T_H específico de antigénio. Este resultado utilizou-se con tra agentes infecciosos e verificou-se que originava protecção da doença (Sacks, D., et al., 1982, J. Exp. Med. 155:1108; Sharp, Â., et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1195-1205; Fons, G., et al,, 1985, J. Immunol. 134:1225-1229). Tem-se feito descobertas análogas para vários tumores induzidos química e viralmente (Kennedy, R.C., et al., 1985, J. Exp. Med. 161:1432; Binz, H., et al.,

1982, Int. J. Câncer 19:417-423? Tilken, A.F., et al., 1981,

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:1809; Flood, P., et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:2209-2213). 0 Âb2 que se utiliza pode desenvolver-se como um resultado de uma cascata idiotípica induzida de antigénio, ou pode ser induzido por imunização com células T específicas de antigénio (ver secção 5.3? infra).

Os anticorpos anti-idiotípicos podem também estimular clones silenciosos”, isto é, clones que são normalmente suprimidos mesmo em indivíduos geneticamente competentes (Bona, C.A., et al., 1981, J. Exp. Med. 153:951). Assim, os anticorpos anti-idiotípicos parecem ser capazes de reprogramar o sistema imunológico para gerar anticorpos que de outro modo não podiam ser feitos (Fig. 2B). Assim, a imunização com anticorpos anti-idiotípicos relacionados com polissacaridos capsulares de E. coli produz imu nidade protectora em ratos neonatais que não desenvolvem normalmente anticorpos contra os polissacaridos capsulares (Stein, K., et al., 1984, J. Exp» Med. 160:1001).

Para o Ab2 seleccionar e estimular os clones de células Id B e T, é provável que tenham de existir idiotopos compartilhados entre receptores das células B e T, (Rajewski, K. and Takemori, T., 1983, Ann. Rev. Immunol. 1:569-607; Ertl, H.C.J., et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 79:7479; Nadler, P.

I., et al., 1982, Eur. J. Immunol. 12:113), θ correspondam a receptores específicos de antigénios os quais conferem a mesma especificidade antigénica para ambas as células B e T. Numa forma de realização preferencial desta invenção, pode seleccionar-se para utilização na imunização os Ab2 que induzem imunidade de cé lulas T, na qual uma subsérie de células I é estimulada e veicula a resposta desejada. Uma técnica para seleccionar Ab2 apropriado para utilização é desenvolver o Ab2 experimentalmente por imunização com células T específicas de antigénio (infante, A.J., et al., 1982, J. Exp. Í4ed, 155:1100). Nesta forma de realização rv Λ particular desta invenção, o receptor de célula T utiliza-se

como idiotipo estimulador de modo que a população Ah2 seja especi ficamente alvejada por células T escolhidas» A imunização com um tal Ab2, selecciona, então, e estimula clones de célula T os quais compartilham os idiotipos receptores com as células imunizantes.

Vários investigadores têm referido a clonagem com êxito de linfócitos T infiltrados em tumores recuperados de biópsias de tumor ou de amostras cirúrgicas. Estes linfócitos, depois de cul tura in vitro com IL-2, são eficazes_gna elicitação de respostas, anti-tumorais quando re-introduzidos no hospedeiro (Rosenherg, S.A., et al., 1986, Science 233:1318). Numa forma de realização preferida desta invenção, tais células devem ser imunogenos ideais para desenvolverem Ah2 dirigidos contra idiotopos particu lares associados com tais clones anti-tumor. Estes Ab2 servem, então, como anti-idiotipos que potencialmente seleccionam' e ampli ficam células T com especificidade anti-tumoral semelhante.

Gomo descrito supra, as especificidades anti-idiotípicas em ratos imunizados com tumor parecem ser complementares não só de mas também de T_o e de factores supressores solúveis il L) (Hellstrom, K.E., et al., 1977, Biophys. Biochim. Acta Reviews on Câncer 473:121-148; ver secção 8, infra; Binz, H_e, et al., 1982, Int. J. Câncer 19:417-423; Tilken, A.E., et al., 1981,

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:1809; Elood, P., et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:2209-2213). A prova de que anti corpos anti-idiotípicos reconhecem um idiotopo público dominan te em factores derivados de sugere que há uma relação regula35 -

dora entre o compartimento celular de Id e o compartimento de Ab2 (ver secção 6, infra; Kuchroo, V.K., et al., 1987, Cellular Immunol. 104:105-114; Nelson, K. and Nepom, G.T., 1986, in Paradoxes in Immunology, Hoffman, G., et al., eds., CRC Bress, Boca Raton, Florida, pp. 177-185). Assim, a fim de evitar a activação preferencial do compartimento de depois da administração de anticorpos anti-idiotípicos (como ilustrado na Fig. 2C), e a fim de se obter um resultado terapeuticamente eficaz, a terapia anti -idiotipica para o cancro deve utilizar a manipulaçao adequada das redes idiotípicas. A manipulação adequada envolve a consideração de três questões: a restricção genética entre o anti-idiotipo e o compartimento das células T; a via de administração de anti-idiotipo; e a escolha da especificidade de idiotopo.

5.2.1.1 Restricção genética

Bois tipos de restricção genética podem potencialmente apresentar obstáculos ao reforço celular por anti-idiotipos injec tados: restricção MHC e restricção IgH. A restricção MHC confere um elemento de controlo genético da activação da célula T numa resposta específica a antigénio.

Extrapolando que um anti-idiotipo imita o antigénio no pro cesso de reconhecimento, é lógico considerar possíveis exigências de histocompatíbilidade. Na verdade, têm sido referidos exem pios em que células T munidas de antigénio são restringidas por MHC não sé no seu reconhecimento antigénico específico, mas também na sua capacidade para reconhecer anti-idiotipo ligados a cé lulas in vitro (Eartl, H., et al., 1986, Int. Rev. Immunol.

1:61-66)

Quais são as implicações destas descobertas para a adminis tração in vivo de anti-idiotipo? Num estudo utilizando anti-idio tipo-iniciador para gerar imunidade anti-viral, observou-se uma resposta geneticamente não restringida (id.), Isto pode ser devi do ao reforço directo de Tg que subsequentemente activou outros compartimentos de células T. Assim, mesmo se o elemento de restricção MHC para apresentação anti-IcE for diferente do de apresen tação do antigénio nominal, o reforço da célula T pode ainda ocorrer. Com uma via de administração apropriada (ver adiante), os anticorpos anti-idiotípicos podem introduzir-se no sistema imunolégico por células apresentando antigénios de um modo tal que podem ser vistos no contexto dos elementos de restricção certos. De facto, um hospedeiro que não responde geneticamente ao antigénio nominal pode responder de modo concebível ao estímu lo com anti-idiotipo, dependendo do mecanismo de manutenção de capacidade de não resposta. Assim, a restricção de MHC parece ser de menor importância excepto quando se utiliza anti-idiotipos ligados a células. Numa forma de realização preferencial desta invenção, a administração de anti-idiotipo deve procurar optimizar a introdução do imunogénio Ab2 no sistema imunolégico do hos pedeiro, mesmo quando incompatível com MHC.

Numa forma de realização preferencial desta invenção, deve considerar-se a questão da restricção de IgH, isto é, a necessidade de adaptação genética de marcadores alotípicos associados com genes de imunoglobulina. Uma vez que genes de anticorpos de

3t

I

região variável se ligam a genes de região constante, o potencial genético para determinantes idiotípicos específicos liga-se a marcadores alotípicos de Ig. A restricção de IgH parece governar várias fases na cascata idiotípica (Bach, B.A., et al., 1979, J. Exp. Med. 149:1084; Nadler, P.I., et al., 1982, Eur. J. Immunol. 12:115; Yamamoto, H·, et al., 1985, J. Exp. Med. 158:655-640; Porstrom, J.W., et al., 1985, Nature 505:627-629). Ha essência, actua como um obstáculo permissivo que necessita da presença de genes V apropriados, e marcadores alotípicos ligados, para o reconhecimento idiotipo-anti-idiotipo.

Uma restricção de IgH rigorosa da resposta imunológica a Ab2 reflecte, provavelmente, a necessidade de reconhecimento directo da rede de genes V; isto tem sido referido como uma intera cção idiotípica verdadeira (Nisonoff, A. and Lamoyi, E., 1981, Clin. Immunol. Immunopathol. 21:597). Esta necessidade limita o tipo de anticorpo que se pode utilizar como um imunogeno anti-idiotipo,-o qual pode elicitar genes V complementares no hospedeiro. Assim, numa forma de realização particularmente preferencial desta invenção, anticorpos anti-idiotípicos experimentalmen te derivados devem estar adaptados com IgH do hospedeiro.

Quando ê que não é necessária a adaptação de IgH para a administração anti-idiotípica? Os anticorpos anti-idiotípicos que actuam como imagens internas do antigénio nominal podem subs tituir-se para esta imunização por antigénios. Uma vez que a imu nização de novo não se baseia na selecção específica da rede de genes V, os imunogenos de imagem interna não são geralmente res- 38 -

tringidos por IgH (id.), e assim não necessitam que haja adaptação a IgH do hospedeiro.

5·2.1.2 Via de imunização

A via de imunização com anti-idiotipo pode também influenciar a natureza da resposta imune. Dependendo da via de administração, tem-se verificado que os anticorpos anti-idiotípicos aumentam ou suprimem as respostas imunologicas (Ralewski, K. and Takemori, T., 1983, Ann. Rev, Immunol. 1:569; IJrbain, J,, et al., 1982, Ann. Immunol. 133D:179)· Por exemplo, num sistema virai, pode estabelecer-se imunidade específica a reovírus seguida da imunização contra determinantes idiotipicos, e observaram-se DTH, células T citolíticas e anticorpos de ligação a antigénio. Se se utiliza Ab2 solúvel como imunogeno, sé se verifica a resposta DTH enquanto a imunização com anti-idiotipos associados a células, na forma de um Ab2 produtor de hibridoma, também induzia cé lulas I citolíticas (Ertl, H., et al., 1986, Int. Rev. Immunol. 1:61-66). Quando o Ab2 se utiliza como um imunogeno de imagem in terna (como no sistema de reovírus), ele essencialmente substitui o antigénio na indução inicial; muitas das manipulações imunológicas que facilitam a capacidade de resposta de antigénio também aumentam a imunidade para Ab2 e podem utilizar-se em vários aspe ctos desta invenção (ver secção 5.3.2, infra).

Podem utilizar-se vários métodos para introduzir as composições imunizantes; estes incluem, mas não se limitam a, vias in tradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, e intranasal. Em aspectos particulares, a indução de imu- 59

nidade com anticorpos anti-idiotípicos pode utilizar injecções subcutâneas (s.c.) ou intramusculares de anticorpos na presença de vários agentes adjuvantes.

Mo caso de imunização com antigénio nominal, a administração de uma proteína haptenada s.c. com agente adjuvante mostrou produzir uma resposta forte, enquanto o mesmo antigénio intra venosamente (i.v.) induziu preferencialmente Tg (Greene, M., et al., 1982, Adv. Immunol 52:255)· Contudo, quando se utilizaram anticorpos anti-tumor monoclonais para terapêutica, foi referida por Koprowski et al. a situação oposta, (Koprowski, H., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. S>ci. U.S.A. 82:216-219), o qual descreve uma resposta anti-idiotípica a anticorpos de rato injectados por via sistémica em cancros gastrintestinais humanos, que foi aparentemente acompanhada por um efeito terapêutico no paciente_o

Há também a prova de que o Ah2 pode inibir eficazmente a capacidade de um Abl para veicular a citotoxicidade celular depen dente do anticorpo ou matar células de tumor na presença de complemento (ver secção 7.2.4, infra).

Uma vez que a via de administração de Ab2, assim como as dosagens utilizadas, têm provavelmente um impacto importante no tipo de resposta induzida, num aspecto preferido desta invenção, devem-^se realizar estudos preliminares dos efeitos da dosagem e da administração. Estes estudos podem realizar-se num animal de experiência tais como murganhos, ratos, primatas, etc₀. Por exem pio, numa forma de realização particular, podem testar-se várias vias de administração de anticorpos anti-idiotípicos relaciona- 40

dos com antigénio p97 de melanoma, para as respostas in vivo e in vitro, que induzem depois de estímulo com uma linha de melano ma de rato que exprime o antigénio p97 (obtido a seguir ã transfecção com o gene de p97 clonado; Brown et al®, 1981, J. Immunol. 127:539-546).

5.2.1.3 Especificidade de idiotopo

Os antigénios complexos, incluindo antigénios de tumor, con têm epítopos múltiplos. 0 reconhecimento imunológico que eles despertam, contém, assim, muitos idiotopos que sao determinados nao só pela heterogeneidade dos epítopos, mas também pela hetero geneidade dos genes V seleccionados entre genes receptores de cé lulas T e Ig no hospedeiro. Estes idiotopos são largamente definidos pelos anti-idiotopos que eles induzem.’ Assim idiotopos pri vados elicitam respostas de Ab2 que são únicas para um Abl parti cular, idiotopos públicos elicitam Ab2 a uma especificidade compartilhada por vários Abl, e Ah2 do tipo imagem interna são indu zidos contra estruturas de ligação a antigénio no Abl as quais são complementares do antigénio (Urbain, J., et al., 1982, Ann. Immunol. 1250:373-389; Augustin, A., et al., 1983, Surv. Immunol. Res. 2:78; Mosier, D. and Feeney, A., 1984, in The Biology of Idiotypes, Greene, M. and Nisonoff, A., eds., Plenum Press, New York, pp. 403-416).

Sm formas de realização particulares desta invenção, podem manipular-se mudanças apropriadas no reportório idiotípico numa tentativa para se obter a resposta idiotípica desejada. Por exem pio, a selecção do idiotopo depende em grande parte do Ab2 utili

zado como imunogeno. Assim, numa forma de realização preferencial, um Ab2 utilizado como imunogeno é um determinado para ser apropriado para originar a expressão de idiotopos terapeuticamente desejáveis. Por exemplo, num sistema com um idiotopo publico dominante em ambas as células Tg e Tg, os anticorpos anti-idiotípi cos podem induzir para Tg, se administrados s.c. com um agente adjuvante, ou podem inter-agirem com factores Tg solúveis. Como uma ilustração, em estudos em ratos que foram imunizados para ha ptenos e nos quais se reconheceram idiotopos públicos, uma resposta de Abl dominante com um idiotopo público compartilhado eli citou uma resposta anti-Id forte em ratos de características com patíveis com IgH. Se anti-Id se administrasse i.v. em neonascidos, ou se anti-Id Tg fosse transferido, o idiotopo Abl público era suprimido, e isto mostrou originar a expressão de idiotopos alternados no Abl específico de antigénio. (Kekoe, G., et al., 1980, Immunol. Rev. 52:75). Quando a imunização com anti-Id se aplica á terapia de tumores, pode ocorrer uma mudança semelhante no reportério idiotípico.

Num sistema sem um idiotopo público dominante, ou em que nenhum Abl é identificado a adaptabilidade do processo de seleç ção do idiotopo oferece alternativas encorajantes. Numa forma de realização particular desta invenção, uma vez que a administração de Ab2 se pode seleccionar para respostas idiotípicas alternativas, os anticorpos para idiotopos que não ocorrem naturalmen te no hospedeiro com tumor, podem escolher-se para dirigirem uma resposta anti-tumoral. Por outras palavras, pode-se imunizar com um Ab2 que selecciona um reportorio Tg o qual nao pode ser seleç

cionado por exposição ao antigénio de tumor. Por exemplo, pode-se imunizar com um Ab2 de imagem interna, monoclonal desenvolvi do contra um anticorpo anti-·tumoral xenogeneico. Muitos dos anti corpos anti-tumor monoclonais existentes são, na realidade, espe cíficos para antigénios que podem não ser imunogénicos no hospedeiro com tumor (Hellstrom, K.E. and Hellstrom, I., 1985, in Monoclonal Antibodies for Tumour Detection and Drug Targeting, Bal dwin, R.W. and Byers, V.S., eds., Academic Press, London, pp. 17-51), e podem utilizar-se nesta forma de realização desta inven ção.

5.2.2 Anticorpos de imagem interna

A imunização Ab2 pode conduzir â elicitação Ab3 não só através de interacções da rede de genes V específica mas também devido ao mimetismo de imagem interna (Urbain, J., et al., 1982, Ann. Immunol. 133^:179-189; Augustin, A., et al., 1983, Surv. Immunol. Res. 2:78). Isto é, quando o anti-iditipo representa a conformação imagem-espelho do antigénio, pode substituir-se por antigénio nominal e elicitar uma resposta semelhante a Abl (Riso noff, A. and Lamoyi, E,, 1981, Clin. Immunol. Immunopathol. 21:397) (Fig. 3)· Assim, numa forma de realização preferencial, tais anticorpos anti-idiotípicos podem utilizar-se como imunogenos para terapia de tumor em hospedeiros com IgH mal combinado.

Ruma forma de realização desta invenção utilizando anti-idiotipos monoclonais, o Ab2 apropriado deve ser seleccionado cuidadosamente. A verificação experimental de que qualquer Ab2 particular é um tipo imagem interna de anti-idiotipos depende da

sua capacidade para imitar as características conformacionais que definem o reconhecimento do antigénio. Os anti-idiotipos de imagem interna competem in vit ro com antigénios para ligação ao Abl positivo de idiotipo, e induzem in vivo Ab3 que imita Abl, e esta indução ocorre numa forma não restringida de IgH (Nisonoff e lamoyi, supra).

Em adição ã inibição da ligação id ao antigénio, Ab2 de imagem interna pode substituir o antígeno em termos de reconheci mento imunolégico. Por exemplo, o Ab2 pode estimúlar clones espe cíficos de antigénio in vitro na ausência de antigénio, ou as cé lulas Ab2 podem servir como um alvo para CTL específico de anti génio (Ertl, H.C.J., et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 79:7479). Uma vez que o Ab2 é substituinte para a conformação an tigenica, o Ab2 pode introduzir-se” em células T, nestes ensaios, no contexto de moléculas MHC, e assim a resposta pode parecer ser restringida de MHC, assim como para a resposta específica de antigénio (id.).

Numa forma de realização preferencial desta invenção na qual são desejados imunogenos de imagem interna, podem utilizar-se anticorpos anti-idiotípicos xenogeneicos. É possível que os imunogenos de imagem interna falhem na estimulação de células su pressoras, enquanto ao mesmo tempo induzem Esta suposição ba seia-se na noção, apresentada nas Figuras ID e 2D, de que iodoto pos reguladores que se representam pela expressão de genes V dominantes determinam a comunicação entre Ab2 e Tg, e que podem se leccionar-se alguns anticorpos anti-idiotípicos sem este idioto- 44 *

po particular que retêm ainda as características de imagem inter na que induzem Tg,

Numa forma de realização específica desta invenção, anticorpos de imagem interna com actividade. antigénica de tumor podem utilizar-se como vacinas” tumorais dirigidas para a indução de imunidade específica de tumor. Por exemplo, estas vacinas podem ser terapeuticamente importantes para pacientes cujos neoplasias primários tenham sido eliminadas mas que estão em risco de desenvolverem metastases.

A capacidade do Ab2 de imagem interna competir com antigénio para a ligação a Abl (e vice-versa) é uma parte integrante do seu comportamento. Contudo, os Ab2 que não funcionam como imagens internas podem ainda competir, devido ao impedimento esterico (e talvez também a outros mecanismos). Num aspecto preferencial desta invenção, investiga-se a capacidade de um Ab2 induzir uma resposta imunológica em barreiras IgH (e MHC) em animais experimentais como parte da sua caracterização como imagens internas potenciais.

Ainda que, na ocasião, a distinção entre anti-Id de imagem interna e verdadeiros anti-Id se tornasse obscura, os anticorpos anti-idiotípicos que não têm especificidade de imagem interna podem ainda apresentar propriedades associadas a imagem inter na, o que pode ser terapeuticamente importante. Por exemplo, nes te estudo de anti-idiotipos monoclonais desenvolvidos contra um anticorpo monoclonal associado a antigénio de carcinoma da bexiga murino, a imunização com os anti-idiotipos provocou uma res- 45 -

posta de Ab3 forte sem qualquer ligação ao antigénio detectável (Lee, V.K,, et al., Biochim, Biophys. Acta 865:127-139). 0 Ab3 desenvolvido contra um anti-Id particular é dirigido, aparentemente, contra especificidades privadas” associadas com aquele anti-idiotipo. Embora os anticorpos anti-idiotípicos mostrassem inibir a ligação antigénica pel© Abl, presumiu-se que isto era devido ao impedimento estérico e intrepretou-se, por tentativas, estes dados como significando que os Áb2 não eram anticorpos de imagem interna. Surpreendentemente, contudo, estes mesmos Ab2 monoclonais foram capazes de sensibilizar ratos para respostas anti-tumor e também se ligarem a factores supressores de célula T específica de tumor (Lee, V.K., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:6286-6290; Kuchroo, V.K., et al., 1987 Cellular / Immunol. 104:105-114). Aindâ que os anticorpos anti-idiotípicos monoclonais, nestas experiências, tenham sido desenvolvidos no ra to, e dirigidos contra anticorpos monoclonais anti-tumor xenogénicos desenvolvidos no rato, não se pode esperar que a resposta anti-tumor provocada no rato por imunização de Ab2 seja baseada na selecção do gene V específico, e pode antes ser atribuída a algum Ab2 de imagem interna.

Um segundo exemplo vem de experiências que analisam respos tas idiotípicas a antigéniosassociados a TMV, em que se imunizaram ratos com anticorpos anti-idiotípicos de coelho específicos para idiotopos privados¹¹ de coelho (Erancotte, M. e Urbain, J. 1984, J. Exp. Med. 160:1485). Surpreendentemente, estes ratos produziram anticorpos anti-TMV que apresentavam reacção cruzada, idiotípica com idiotopos de coelho. Assim, embora o anti-idioti- 46 -

po estimulador não tivesse uma especificidade de imagem interna”, contudo, provocou informação específica de antigénio em face da aparente incompatibilidade do gene V.

5.3 Produção de Anticorpos Monoclonais Anti-idiotípicos Específicos Para Um Idiotipo Que Reconhece Um Antigénio de Tumor Definido

5.3.1 Produção de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos por imunização com um anticorpo (Abl) que reconhece um antigénio de tumor definido

Numa forma de realização específica desta invenção, a produçao de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos específicos para um idiotipo que reconhece um antigénio de tumor definido necessi ta da imunização de um hospedeiro com anticorpos que reconhecem o antigénio de tumor definido. Como previamente explicado, tais antigenios de tumor incluem mas não se limitam a, antigenios oncofetais, ou de diferenciação tais como CEA, alfa-fetoproteína, o equivalente funcional antigénico humano do antigénio 175 kDa murino de carcinoma de células transitórias da bexiga, antigénio p97 associado a melanoma (ver Brown et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546), antigénios de diferenciação de carcinoma de pulmão humano tais como L6 e L20 (ver Hellstrom et al., 1986, Câncer Res. 46:3917-3923), θ o antigénio de diferenciação associado com mela noma humano, antigénio gangliosido GD3, antigénios de fibrossarcoma, e análogos.

Os tipos de hospedeiros possíveis incluem mas não se limitam a, animais experimentais tais como ratos, coelhos, e chimpas

zés; e seres humanos. Podem utilizar-se vários adjuvantes para melhorar a resposta imunológica aos anticorpos, dependendo do ti po de hospedeiro e incluem mas não se limitam a, geles minerais, por exemplo, hidróxido de alumínio; substâncias tensio-activas tais como lisolecitina; polióis plurónicos; poli-aniões, peptidos; emulsões de óleos; e adjuvantes potencialmente adequados para se res humanos tais como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e coryneba cterium parvum. 0 Ab2 pode também acoplapse a tm veículo imunogénico, incluindo mas não se limitando a LPS, ou reticular-se com glutaraldeído (Primi, C.D., et al., J. Immunol. 129:1124-1129, 1982). 0 imunógeno pode também incorporar-se em lipossomas, ou conjugar-se com polissacáridos e/ou outros polímeros, ou modificar-se quimicamente de outro modo para utilização. Podem também utilizar-se determinantes alotípicos na própria molécula de Ab2 para aumentar a imunogenicidade. No sistema de reovírus, quando a imunização com Ab2 atravessou as barreiras alotípicas, isto é, quando o hospedeiro foi IgH desemparelhada, verificou-se uma res posta Ab3 vigorosa. (Ertl, H., et al., 1986, supra). Este resultado sugere que os determinantes alotípicos Ig no anti-idiotipo actuam como determinantes auxiliares para o aumento das respostas / A/ imunologicas. Assim, numa forma de realizaçao particular, pode utilizar-se IgH-. desemparelhada pâra aumentar a imunogeni cidade.

Os anticorpos anti-idiotípicos, ou fragmentos de anticorpos anti-idiotípicos, ou fragmentos modificados quimicamente ou anticorpos podem utilizar-se para imunização. Em adição pode uti lizar-se, um fragmento mAb contendo o idiotipo da molécula de mAb, incluindo mas não se limitando aos fragmentos P , Pab, Eab’,

ou P(ab')₂, os quais se podem gerar pelas técnicas conhecidas.

anticorpo monoclonal pode preparar-se utilizando-se qual quer técnica que proporcione a produção de moléculas anticorpo por intermédio de linhas de células contínuas em cultura. Estas inclui, mas não se limita á, técnica do hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein (Nature 256:495-497, 1975), e á técnica mais recente de hibridoma de células-B humanas (Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983) e ã técnica de transformação de EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. liss, Inc., pp. 77-96). A selecção da hibridoma pode realizar-se por qualquer de vários ensaios, por exemplo, por ligação a Abl, ou por inibição da ligação de Abl a células de tumor (Nepom, C.T., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:2864-2867; Holbeck, S.L. and Nepom, G.T. 1983, J· Immunol. Methods 60:47-52; ver secção 7.1.7, infra).

5.3·2 Produção de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos que são dirigidos contra um idiotopo em células T que recônhece um antigénio’de tumor definido

Numa outra forma de realização específica desta invenção, produz-se um anticorpo anti-idiotípico, o qual se relaciona com um antigénio de tumor, e que é dirigido contra um idiotopo, asso ciado com células T, que reconhece o antigénio de tumor. 0 idiotopo pode também associar-se com factores supressores que apresentam o idiotopo dirigido contra o antigénio de tumor. Estes an tigénios de tumor incluem, mas não se limitam aos apresentados na secção 5.3*1, supra. Numa forma de realização (ver secção 6,

- 49ν=.

infra), ο anticorpo anti-idiotípico pode produzir-se por imuniza ção com antigénio de tumor, por formação de hibridomas, e sondagem para anticorpos monoclonais auto-anti-idiotípicos por métodos que incluem, mas nao se limitam a, ensaio de DTH específico de tumor, LAI específico de tumor, ligação a anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio de tumor, etc.. Em formas de realização particulares, o antigénio de tumor utilizado para pro dução de anticorpos auto-anti-idiotípicos pode ser específico de fibrossarcoma, e de carcinoma de células transitórias na bexiga; pode ser o antigénio p97 ou GD3 de melanoma, ou antigénio L6 ou L20 de carcinoma de pulmão humano. Alternativamente, as células T {Tg ou Tg) ou factores supressores que se ligam ao antigénio de tumor, podem utilizar-se na imunização de um hospedeiro para a produção do anticorpo anti-idiotípico. Em formas de realização particulares, as células T que expressam um idiotopo definido por um anticorpo específico de fibrossarcoma, carcinoma de células de transicção na bexiga, antigénio p97 de melanoma, antigénio GD3 de melanoma, antigénio L6 ou L20 de carcinoma do pulmão, podem utilizar-se para imunização. Uma vez que a injecção de células Tg pode ser terapeuticamente prejudicial, a imunização com células Tg é preferencial. As células T utilizadas para imunização podem obter-se, por exemplo, dos próprios pacientes com tumor ou de um dador apropriado (de preferência histocompatível) cujo sistema imunolégico tenha estado exposto ao antigénio de tu mor. As células T podem então isolar-se para injecção, por várias técnicas conhecidas na especialidade, por exemplo, ligaçao de anticorpos anti-tumor monoclonais marcados por fluorescência

- 50(-

e FACS. (Ver secção 6.4, infra). Os factores supressores para imunização podem isolar-se por intermédio de várias técnicas conhecidas na especialidade, incluindo mas não se limitando a, cro matografia de imuno-afinidade (para uma coluna revestida de anti génio de tumor), geração de hihridomas T-T por fusão de células T de hospedeiros com tumor (Nelson, K.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:2866, 1980) seguida de sondagem, por exemplo, para a supressão de DTH do antigénio de tumor, ligação espe cífica ao antigénio de tumor, etc. (ver secção 6.5, infra).

5.4 Avaliação e Demonstração de Imunopotencia Por Indução de

CMI Específica de Tumor

Quando o anticorpo anti-idiotípico desta invenção for consi derado para utilização na imunização contra tumores (ver secção 5.6.1, infra). numa forma de realização preferencial, deve-se testar a imunopotencia do anticorpo. Qualquer método que possa demonstrar a imunopotencia da molécula anti-idiotípica, mostrando a indução de CMI específica de tumor depois de imunização com o anticorpo anti-idiotípico ou seus fragmento(s) derivado(s) está dentro do âmbito desta invenção, para avaliação da imunopotência do mAb anti-idiotípico; tais ensaios incluem, mas não se limitam a, DTH (para uma descrição do procedimento do ensaio DTH ver, Forstrom et al., 1983, Nature (London) 303:627-629) and/or LAI (Halliday, W.J. & Maluish, A.E., 1982, in Assessment of Immu ne Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, New York pp. 1-26; Koppi, T.A., and Halliday, W.J., 1982, Cell. Immunol. 66:394-406; Koppi, T.A., and Halliday, W.J., 1981, J.

Natl. Câncer Inst. 66:1089-1096). Testes adicionais de especificidade podem incluir, mas não se limitam a, ensaios de imuno-absorção e tratamento de células peritoneais còm anticorpos e complemento.

5.5 Caracterização Adicional de Anticorpos Anti-Idiotípicos

A fim de determinar ainda a especificidade de anticorpos anti-idiotípicos, podem executar-se ensaios de ligação de Abl e/ou ensaios de inibição de ligação de tumor a Abl» Tais ensaios podem realizar-se por qualquer método conhecido na especialidade, por exemplo, os descritos na secção 7, infra. Dois ensaios adicionais que se podem realizar incluem testes de inibição de cito toxicidade dependente do complemento ou propriedades de citoxici dade celular dependente de anticorpo de Abl (ver secções 7.1.1.3 e 7.1.1.4 infra).

5.6 Utilizações em Imunoprofilaxia, Imunoterapia, e Imuno-ensaio objectivo desta forma de realização desta invenção é des crever as utilizações das moléculas de anticorpos anti-idiotípicos desta invenção, ou fragmentos das moléculas de anticorpos, as quais podem ou nao ser modificadas quimicamente, no âmbito da medicina.

5.6.1 Imunização contra tumores

Us pacientes com tumores podem tratar-se terapeuticamente por imunização com os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos da presente invenção enquanto os pacientes com uma tendência para o

tumor podem tratar-se imunoprofilacticaraiente por esta imunização. Uma vantagem da utilização de mAb anti-idiotípico relativamente ao antigénio numa composição de vacina tumoral é que grandes quantidades de material idêntico se podem obter para utilização como imunogeno. Isto é especialmente válido quando o antigénio é um glicolípido ou um hidrato de carbono, os quais podem ser difí ceis de obter sob a forma pura e em quantidades suficientes. Em adição, se o antigénio é uma proteína, a disponibilidade de um anticorpo anti-idiotípico evita a necessidade de se ter o gene cionado para o antigénio, a fim de se obterem quantidades suficientes do antigénio para utilização em vacinas. Os anticorpos anti-idiotípicos, ou fragmentos dos anticorpos anti-idiotípicos, ou fragmentos ou anticorpos modificados quimicamente podem utilizar-se para a imunização contra tumores. Pode utilizar-se qual quer fragmento de mAb contendo o idiotipo da molécula de mAb, incluindo mas não se limitando a, fragmentos F , Fab, Fab’, ou F(ab’)₂, os quais se podem gerar pelas técnicas conhecidas. As moléculas de anticorpo anti-idiotípico ou seus fragmentos deriva dos podem formilar-se com um adjuvante adequado a fim de melhorar a resposta imunolégica. Estes adjuvantes podem incluir, mas não se limitam a, geles minerais, por exemplo, hidróxido de alumínio; substâncias tensio-activas tais como lisolecitina, poliois plurénicos; poli-aniões; péptidos; emulsões oleosas; e adjuvantes potencialmente adequados para seres humanos tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e corynebacterium parvum. Para utilização do imunogeno pode também incorporar-se em lipossomas, ou conjugar-se com polissacáridos e/ou outros polímeros, ou modificar-se

quimicamente de outro modo.

Podem utilizar-se vários métodos para introduzir as composições imunizántes; estes, incluem mas não se limitam a, vias in tradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcuta nea e intranasal*

Em formas particulares desta invenção, hospedeiros com fibrossarcoma podem injectar-se intraperitonealmente com um anticor po monoclonal anti-idiotípico específico de um idiotopo que reco nhece um antigénio de fibrossarcoma.

A imunização em animais de experiência pode ensaiar-se por injecção do anticorpo anti-idiotípico ou de uma molécula dele de rivada relacionada, seguida, de estimulação com um(s) agente(s) tumorogénico tal como células de tumor singenético ou agentes químicos cancerígenos e observação do desenvolvimento e progressão do tumor.

5.6.2 Imunoterapia adoptiva

Numa outra forma de realização desta invenção, células T (de preferência Tg) que expressam um idiotopo que recinhece um antigénio de tumor o qual pode ser, mas não se limita a, um anti génio descrito na secção 5.5.1, supra, podem introduzir-se num hospedeiro, para ímunoprofilaxia ou imunoterapia. Estas células podem obter-se do tumor em desenvolvimento do próprio hospedeiro expandirem-se in vitro, seleccionarem-se para a especificidade idiotípica adequada (antes ou depois da expansão), e re-introduzirem-se no hospedeiro (ver secção 6.4, infra). Alternativamente, as células T podem obter-se de um dador apropriado (de preferên·

cia histocompatível)

Num processo alternativo, é possível activar linfécitos es pecíficos de tumor in vitro e tratar o paciente com os leucócitos específicos de tumor activados. Recentemente, observou-se a regressão do cancro como resposta a um tratamento imunoterapêuti co adaptado envolvendo a administração de células assassinas activadas com linfocina (LAK) a hospedeiros com tumor (Rosenberg et al., New Engl. J. Medicine 313:1485-1492, 1985). Contudo, esta terapia originou vários efeitos secundários indesejáveis, incluin do toxicidade acentuada, edema pulmonar, e dificuldades respiratórias. Em contraste, o método desta forma de realização da presente invenção envolve a administração a um paciente de linfécitos estimulados, que são específicos para o antigénio associado ao tumor (o qual pode ser, mas não se limita a, um antigénio des crito na secção 5.3·1, supra), que pode resultar em uma terapia mais específica e efeitos secundários reduzidos. Por exemplo, os linfocitos periféricos podem retirar-se do paciente, ou de um da dor histocompatível que esteve exposto ao antigénio de tumor ou a um anticorpo anti-idiotípico monoclonal desenvolvido para o idiotipo de um anticorpo que define o antigénio do tumor, como descrito antes. Os linfécitos podem então estimular-se in vitro na presença dos anticorpos anti-idiotípicos específicos de'tumor da presente invenção. Esta estimulação específica pode realizar-se utilizando os anticorpos anti-idiotípicos monoclonais da pre sente invenção num método como o descrito por Binz et al. (Int.

J. Câncer 29:417-423, 1982). As células T activadas podem então desenvolver-se em cultura de células. Este desenvolvimento pode

realizar-se por estimulação repetida das células T com os anticor pos anti-idiotípicos desta invenção, com ou sem IL-2, ou por cres cimento num meio contendo apenas IL-2. Podem também utilizar-se outros métodos de cultura de células (por exemplo, com outras linfocinas, factores de crescimento, ou outras moléculas bio-acti vas). Os linfocitos activados podem então testar-se para a reacti vidade imunologica anti-tumor veículadada por células» Se se desejar, a confirmação de identidade dos linfocitos activados como células T pode fazer-se o exame das células relativamente ã expressão de superfície de célula de marcadores de célula B e Ϊ. Isto pode executar-se, por exemplo, por análise de imunofluorescência utilizando-se anticorpos monoclonais a antigénios de célu las Bei conjugados com fluoresceína. A expressão de marcadores de célula T conhecidos, tais como os antigénios CD4 θ CD8, confirma a identidade dos linfocitos activados como células T.

As células I actívadas são então testadas para a reactividade anti-tumoral. Isto pode fazer-se por intermédio de qualquer das várias técnicas conhecidas na especialidade para ensaio da imunidade veiculada por células específicas. Por exemplo, um ensaio de citotoxicidade, que mede a capacidade das células T esti muladas para matarem as células de tumor in vitro, pode realizar

-se por incubação dos linfocitos com células de tumor marcadas £“*1 com ^Cr, e células marcadas não infectadas, e medição da liber~ 51 taçao de Cr depois de lise. Tais ensaios tem sido descritos (ver, por exemplo, Zarling, J.M., et al., 1986, J. Immunol. 156:4669). Os linfocitos activados podem também testar-se para actividade das células auxiliares T por medição da sua capacida-

de para proliferarem, como mostrado pela incorporação de 3H-timi dina, seguida de estimulação, e/ou medição da sua capacidade para produzir linfocinas tais como 11-2 ou interferão, depois de estimulação, na ausência de IL-2 exógeno. Podem também utilizar-se outros ensaios de imunidade veiculada por células específicas conhecidos na especialidade, tais como ensaios de inibição da aderência de leucócito (Thomson, D.M.P. (ed.), 1982, Assessment of Immune .Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic Press, New York). Os linfócitos seleccionados podem então inocular-se no paciente. A inoculação das células T activadas faz-se, de preferência, através de administração sistémica, embora se possam utilizar outros métodos de administração (por exemplo, perfusão directa numa artéria). As células T podem admi nistrar-se intravenosamente através de um catéter venoso central ou numa veia grande periférica. Numa forma de realização preferencial, inicialmente introduzem-se aproximadamente lxl0^ células e as restantes introduzem-se durante as várias horas seguintes. Em alguns pacientes, pode utilizar-se IL-2 humano recombinante e pode perfundir-se intravenosamente t©,das as 8 horas com início na altura de perfusão da célula T. As injecções de IL-2 são de preferência em doses de 10.000 a 100.000 unidades/kg de peso do corpo, como anteriormente utilizado nos pacientes com cancro. (Rosenberg, S.A., et al., 1985, N. Engl. 3í. Med» 313:1485). A perfusão de IL-2 pode continuar-se durante vários dias depois da perfusão de células T activadas, se tolerada pelo paciente.

- 57y*

5.6.3 Inibição de supressão imunologica de reactividade anti-tumor

Numa outra forma de realização desta invenção, anticorpos anti-idiotípicos que reconhecem específicamente um idiotopo que é dirigido contra um antigénio de tumor e cujo idiotopo está pre sente nas células T supressoras e/ou factores supressores, podem administrar-se in vivo a fim de inibir a supressão de reactivida de anti-tumor. Em formas de realização particulares, um tal anti génio de tumor pode incluir, mas não se limitar a, os listados na secção 5·3·1, supra.

5«6.4 Aplicações, de imuno-afinidade

Os anticorpos anti-idiotípicos ou moléculas relacionadas desta invenção pode utilizar-se para isolar anticorpos dirigidos contra um antigéni'0 de tumor definido. As técnicas conhecidas na especialidade pelas quais isto se pode realizar incluem mas não se limitam a, colunas de imuno-afinidade e reacções de imuno-absorção. Os anticorpos anti-tumor isolados através da utilização do anticorpo anti-idiotípico ou moléculas relacionadas podem ser um instrumento importante na imunoterapia de tumores.

5.6.5 Imuno-ensaio s

Numa forma de realização alternativa da presente invenção, os anticorpos anti-idiotípicos ou moléculas relacionadas da presente invenção podem utilizar-se como antigéniõs em imuno-ensaios. Estes imuno-ensaios devem permitir a detecção do anticorpo anti“tumor em animais ou em pacientes. As moléculas da presente inven ção podem também utilizar-se em imuno-ensaios de competição para

testar a presença de antigénios de tumor.

As moléculas da presente invenção podem utilizar-se em qualquer sistema de imuno-ensaio conhecido na especialidade, incluindo, mas não se limitando a, radio-imuno-ensaios, ELISAs, ensaios sandwich”, reacções de precipitina, reacções de precipi tina de difusão em gel, ensaios de imuno-difusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixaçao de complemento, e ensaios imuno-radiométricos.

Numa forma de realização específica, os anticorpos anti-idiotípicos desta invenção, dirigidos contra um idiotipo de ^RAn ticorpo 1 que define um antigénio de tumor, podem utilizar-se em imuno-ensaios competitivos para controlar a presença de anticorpos em pacientes que estão a ser administrados com Anticorpo 1, para fins terapêuticos ou de diagnostico (ver secções 7.1.1.5, 7.2.5, infra). Numa outra forma de realização, os anticorpos anti -idiotípicos podem utilizar-se para identificar anticorpos anti-tumor durante procedimentos de purificação.

6. IMUNOTERAPIA DE SARCOMAS MURINOS COM ANTICORPOS MONOCLONAIS

AUTO-ANTI-IDIOTIPICOS QUE SE LIGAM A CÉLULAS Ϊ ESPECIFICAS DE

TUMOR

De acordo com a teoria de rede (Jerne, N.K., 1974, Ann. Immunol. 1250:373; Rajewski, K. and Takemori, T., 1983, Ann. Rev. Immunol. 1:569; Urhain, J., et al., 1982, Ann. Immunol. 133D:179), os ratos que formam uma resposta imunologica aos sarcomas singeneicos devem ter anticorpos dos idiotipos dos linfócitos de res- 59 -

posta. Como descrito nos exemplos infra, com base nesta previsão, imunizaram-se murganhos BALB/c para um de dois fibrossarcomas transplantados, singeneicos, e formaram-se hibridomas que produziram anticorpos monoclonais os quais sensibilizaram os murganhos singeneicos para DTH específico de tumor. Um destes anticorpos monoclonais auto-anti-idiotípicos mostrou definir um idiotopo presente nas células T que têm actividade anti-tumor e nos produ tos de células supressoras T, que inibem esta actividade. Bemons tra-se também que o tratamento de ratos com qualquer dos dois anticorpos anti-idiotípicos monoclonais reduzem significativamen te o crescimento de sarcomas estabelecidos, um efeito que era es pecífico para a combinação adequada de tumor-mAb.

6.1 Materiais e Métodos

6.1.1 Murganhos

Criaram-se murganhos BALB/c na Bivision of Animal Health Resources, Ered Hutchinson Câncer Research Center (EHCRC), Seattle, Wash., e separaram-se por idade e sexo para cada experiência. Escolheram-se as fêmeas com mais de dez semanas de idade uma vez que davam respostas óptimas em testes piloto. Besenvolveram-se murganhos CB-20 no EH CRC a partir da criação de pares obtidos do Dr. Michael Eotter, National Institute of Health.

6.1.2 Tumores

Induziram-se fibrossarcomas MCA-1490„ MCA-1510, e MCA-1511 em murganhos BALB/c por injecção intramuscular de 3-metil-colantreno em trioctanoina e mantiveram-se por transplantação singeneica em série de tecido congelado na segunda geração. Eles apre

sentavam-se isentos de LDH, vírus ectromelia e Sendai, è de mico plasma, e, de modo semelhante a outras sarcomas de rato induzidos quimicamente, expressaram individualmente antigénios de transplan tação específicos de tumor unicos_o A BW5147®G»1.4<>oua „1, e um ti morna AKR marcado com droga que se obteve do Cell Distribution Center of the 'Salk Institute. As células NS1 vieram do labora to rio do Br. Ingegerd Hellstrom. Tanto as células BW5147 como as NS1 apresentavam-se livres de micoplasma.

6.1.3 Ensaio de hipersensibilídade do tipo retardado

Utilizou-se um ensaio que mediu a hipersensibilídade do ti po retardada (DTH) como, veiculada por linfócitos Thyl , lytl , e caracterizou-se por manifestações morfológicas típicas de uma reacção DTH (Forstrom, J.W., et al., 1983, Nature 303:627; Cory, J., et al., 1981, in Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Hammerling, G.J., et al., eds., Elsevier/North-Holland Biomedical Press, p. 503). Imunizaram-se murganhos por injecção sub cutânea de um total de 1x10^ células de tumor irradiadas (15.000 rad) em dois sítios, uma em cada flanco, ou por injecção de

3-10 g de mAb (diluido em solução salina de fosfato tamponada, PBS) em quatro sítios subcutâneos. Quando se ensaiou o material para a supressão de DTH, ensaiou-se sempre para a supressão da sua fase indutiva. Nestas experiências, dilui-se o provável material supressivo a 100 1 em PBS e injeotou-se numa veia da cauda, imediatamente depois da imunização.

Em cada um dos testes para a DTH, os grupos de controlo ou de tratamento consistsam de 5 murganhos, e eram sempre codifica-

dos. Cinco dias depois da imunização, elicitou-se a DTH por injecção de 5x10^ células de tumor em uma das patas posteriores. Depois de 24 horas, mediu-se a espessura das patas contralaterais injectada e não injectada, utilizando um micrometro com mostrador. Para cada grupo de tratamento, os dados apresentaram-se como o aumento médio na espessura (i.é., a dilatação) das patas injectadas. A significância das diferenças entre grupos de tratamento e correspondentes grupos de controlo determinou-se utilizando um teste t de student de duas entradas.

6.1.4 Geração de anticorpos monoclonais auto-anti-idiotípicos

Imunizaram-se murganhos BALB/c por injecção subcutânea de 1x10' de azul tripano incolor, cultura de células MCA-1490 ou MCA-1511, seguindo-se três semanas mais tarde a extirpação dos nódulos de tumor resultantes. Depois de mais duas semanas, injectaram-se os murganhos com 2x10 células irradiadas (15.000 rads) dos tumores respectivos, e duas semanas mais tarde injectaram-se uma vez mais com a mesma dose. Obtiveram-se células esplénicas 7 dias depois da última injecção e fundiram-se a células de mieloma RS-1, utilizando técnicas que têm sido descritas (Keh, M.Y., et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:2927).

Os hibridomas foram primeiro sondados para a produção de anticorpos IgG utilizando um ensaio de radio-imuno-competição (Brown, J.P., et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:4980), e desenvol veram-se os que produziram mais do que 4 g de IgG por ml.

Recolheram-se os sobrenadantes da cultura, consistindo

cada colheita de sobrenadantes de cinco hibridomas. Purificaram-se os anticorpos de cada colheita por cromatografia de afinidade na proteína 3. aureus A ligada por covalencia a Sepharose CL-4B (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (Brown, J.P., et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:4980). Ajustou-se o pH das soluções de anticorpo a 8,5 antes da cromatografia para facilitar o isolamen to de IgGl. Imunizaram-se os murganhos BALB/c por injecção com os anticorpos recolhidos e cinco dias mais tarde estimularam-se com células de tumor apropriadas (células MCA-1490 ou MCA-1511) para elicitação de DTH. Os sobrenadantes individuais de uma colheita de teste positivo, ensaiaram-se para a sensibilidade de DTH a MCA-1490 e MCA-1511, servindo um dos dois tumores como con trolo. Verificou-se que dois a quatro por cento dos tubos de cada colheita continham anticorpos com a actividade desejada. Os hibridomas que produzem anticorpos que se sensibilizaram para DTH específico de tumor clonaram-se duas vezes por diluição limi tante, depois do que os clones positivos se desenvolveram e adaptaram para crescerem como tumores asoites em murganhos BALB/c sensibilizados em pristano (Yeh, M.Y., et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:2927). Purificaram-se os anticorpos monoclo nais do fluido de ascites por cromatografia de afinidade em Sepharose A-proteína. Utilizaram-se mAb 4.72 (relacionados com MCA-1490) e mAb 5.96 (relacionados com MCA-1511), para o presente estudo. Estes eram ambos do isotipo IgGl, assim como mAb 8.2, que se utilizaram como um controlo nas mesmas experiências.

6.1.5 Hibridomas de célula T

Obtiveram-se várias linhas de hibridoma por fusão de célu-

las ΒΪ5147 com timocitos de murgahhos transportando tumores MCA-1490, como previamente descrito (Nelson, K.A., et al,, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:2866; Nelson, K., et al., 1985, in T-Cell Hybridomas, Taussig£ M.J., ed., CRC Press, p. 129). Os quatro hibridomas utilizados neste estudo produziram factores que suprimiram 0 lise de cálulas MCA-1490 por células T especificamen te imunológicas como testado num ensaio de libertação de ^Cr (Nelson, K., et al., 1985, supra)» As culturas deste hibridomas e do parceiro de fusão BW5147 cresceram em meio de Eagle modifica do por Dulbeco (Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y.), os quais se complementaram com soro de fetal bovino (150 l/ml), penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 g/ml) e L-glu tamina (290 g/ml), e se tamponaram com carbonato de hidrogénio e sódio. 0 meio consumido foi retirado de células em fase logarí tmica de crescimento quando eram aproximadamente 2x10 células por ml. Filtrou-se 0 meio (0,4 micra, Millipore) e armazenou-se a -7O°C até se ensaiar.

6.1.6 Isolamento de factores supressores por cromatografia de afinidade com mAb

Utilizou-se mAb 4,72 ou 5,96 conjuntamente com um mAb de controlo, 8,2, que é também do isotipo IgGl e é específico para um antigénio de melanoma humano, p97 (Brown, J.P., et al„, 1981, J. Immunol. 127:539). Diluiram-se os mAb em PBS a 2 mg por ml e então acoplaram-se a um volume igual de Affi-Gel 10 (BioRad Laboratories, Richmond, CA) por incubação durante a noite ã temperatura de 4°G. Lavaram-se os geles, incubaram-se com etanolamina 0,lM e utilizaram-se para preparar colunas. Lavaram-se as colu-

nas extensivamente com PBS e pré-eluiram-se com tiocianeto de só dio 3M antes de se utilizarem. Os meios de cultura consumidos, de hibrídomas de célula T (como uma fonte de factor supressor) ou de células BW5147 (como um controlo) diluiram-se a 1:10 em PBS, depois do que se fizeram passar 0,2 ml do meio diluido atra vés de colunas de 0,2 ml de gel. Lavaram-se as colunas com PBS até se recolherem 2 ml de eluente, depois do que os eluentes se diluíram a 1:10 em PBS e se ensaiarampara a supressão da fase indutora de DTH.

Realizaram-se também experiências com soros de ratos BALB/c que tinham transplantes de tumores MCA-1490 ou de MCA-1511 ou que eram de ninhadas não tratadas. Diluiram-se os soros a 1:10 em PBS, depois do que se passaram 0,5 ml dos soros diluídos através de colunas de 0,5 ml de gel. Lavaram-se as colunas com PBS. Reco lheram-se os primeiros 1,5 ml do eluente e rejeitaram-se os restantes 5 ml. As proteínas ligadas, eluiram depois das colunas por adição de 0,5 ml de NaSCN 3M, e dessalinizaram-se os eluatos por passagem através de colunas de Sephadex G-25 equilibradas com PBS. Diluíram-se os eluatos e os eluentes com PBS para propor cionarem uma diluição a 1:100 relativamente aos soros originais. Subsequentemente testaram-se para a supressão da fase indutora de DTH.

6.1,7 Ligação de factor supressor K54SP a células MCA-1490

Incubaram-se células MCA-1490 de cultura aderentes com áci do etilenodiamina-tetraacético (5 mM), lavaram-se com PBS, e incubaram-se numa solução a 0,1$ de glutaraldeído durante 10 minu65 J

tos a 4°C. Subsequentemente incubaram-se as células em PBS com 0,5/ de albumina de soro bovino, seguida de lavagem com PBS. 0 meio de cultura consumido de hibridoma de células T-I-K54 ou de células BW5147 de controlo dilui-se a 1:100 em PBS contendo 10 g de mAb 4.72 ou mAb 8.2 (como um controlo), e incubou-se sobre gelo durante 30 minutos. Subsequentemente, adicionou-se a 10 1 de células de tumor acondicionadas, as quais se suspenderam e in cubaram à temperatura ambiente durante 10 minutos e sobre gelo durante mais 30 minutos. Numa experiência, pré-trataram-se células de tumor por incubação com anticorpos e lavaram-se três vezes com PBS antes da adição do meio consumido diluído de células de I-K54 ou BW5147. Depois de incubação sobre gelo, lavaram-se as células de tumor 5 vezes com 15 ml de PBS e suspenderam-se em 0,5 ml de tampão HCl-glicina (pH 3.0). Depois de incubação poste rior sobre gelo durante 10 minutos, aglomeraram-se as células por centrifugação a 200 x g. Ajustou-se imediatamente o pH do sobrenadante por passagem através de Sephadex G-25 equilibrada com PBS. Diluíram-se os eluatos a 1:10 em PBS e ensaiaram-se para a supressão da fase indutora de DTH.

6.1.8 Isolamento e cultura de linhas de célula T

Obtiveram-se células T que reagem com mAb 4,72 de nódulos linfáticos drenando-se o sítio de um sarcoma MCA-1490 transplantado, em crescimento progressivo. Isolaram-se as células por cen trifugação num gradiente Percoli (Pharmacia) e misturaram-se com mAb 4,72 ou mAb 8,2 acoplados com biotina» Subsequentemente, lavaram-se, trataram-se com isotiocianato de fluoresceína-avidina (FITC), lavaram-se de novo e analisaram-se num separador de célu

las activado por fluorescência (FACS-II, Becton-Dickinson). Reco lheram-se células com coloração brilhante, observadas apenas na amostra tratada com mAb 4,72 e que representavam menos do que 1% da amostra. Estas células, denominadas 90.3» cultivaram-se em meio de Glick complementado com 25% de um meio de uma cultura de células de baço de rato que tinham sido estimuladas com concanavalina A durante 24 horas. Observou-se crescimento vigoroso depois de 25 dias que se manteve por desenvolvimento das culturas em meios recentes em cada as 72 horas. Estabeleceu-se outra linha de célula, 11.2, a partir de linfécitos positivos Lyt-1 que se tinham obtido de nódulos drenando-se o sítio de um tumor MCA-1511; aquela, manteve-se de uma maneira semelhante ã linha 90.3. Ensaiaram-se as células entre 6 e 18 semanas depois do estabelecimento das linhas 90.3 ou 11.2. Cultivaram-se células T normais de nódulos linfáticos de ratos isentos de tumor durante 48 horas antes de se utilizarem como controlo para alguns dos ensaios.

6.1.9 Manipulação in vivo de crescimento de tumor

Obteve-se tecido de tumor de murganhos, 14 a 21 dias depois da injecção de células de tumor por passagem em série. Preparou-se uma suspensão por desagregação mecânica e breve tratamento com tripsina. Avaliou-se a viabilidade por exclusão de azul de tripano. Na experiência apresentada na Fig. 4, misturaram-se células de tumor com células T de cultura numa proporção de 1:10 e injectou-se a mistura por via subcutânea. Utilizaram-se dez murganhos por grupo de tratamento. Controlou-se o crescimento do tu mor em intervalos de 2 a 4 dias por duas medições perpendiculares ao nódulo de crescimento do tumor. Os tumores com uma área

ο superior a 0,2 enr raramente regrediram nos controlos não tratados e consideraram-se tumores estabelecidos.

Nas experiências que medem o efeito do tratamento de mAb, injectaram-se células de tumor subcutaneamente em um sítio por murganho. Diluíu-se o mAb em PBS e injectou-se intraperitonealmen te (i.p.), 10 g por injecção. Controlou-se o crescimento do tumor como descrito antes. Utilizou-se o teste t de Student de duas vias para determinar a significância da diferença entre os vários grupos de tratamento.

6.2 A Administração Subcutânea de mAb 4°72 ou mAb 5 »96 Induz DTH Específico de Tumor Em MCA-1490 e MCA-1511

Referiu-se anteriormente que o mAb 4·72 pode induzir DTH em MCA-1490, quando injectado subcutaneamente, e que reage com um idiotopo em células específicas de tumor, isto é, que é auto-anti-idiotípico (Forstrom, J.W., et al., 1983, Hature 303:627). Desenvolveu-se agora um mAb semelhante 5.96, utilizando linfécitos de murganho sensibilizados por um sarcoma antigenicamente diferen te, MCA-1511 (id.), o que permitiu avaliar a especificidade imunolégica do efeito de DTH por meio de teste dos mAb 4»72 e 5.96 em paralelo (Tabela i).

TABELA I

Estirpe de murganhos .mÁbs 4.72 e 5.96 induzem murganhos BALB/c para DTH que é específico de tumor e alotipo restringido^

Murganhos Dilatação média das patas injectados (_x io“⁵ em - SE) com em murganhos, estimulados com

MCA-1490 MCA-1511

BALB/c (H-2^d,	mAb 4.72 células de	15.3 - 1.2 18.4 * 1.6	5.0 ± 1.6
não	realizado
Igh-l^a)	MCA-1490
	mAb 5.96	8.0 i 1.2	13.7	i 0.3^
	células de	não realizado	18.7	i Ο.9Ϊ
	MCA-1511
	Dissolvente	8.3 - 1.2	5.0	Í 1.8
CB-20	mAb 4o 72	7.7 ±· 0.4	6.7	1 0.3
(H-2^d,	células de	18.3 ^£ 0.9	não	realizado
Igh-l^b)	MCA-1490
	mAb 5.96	8.2 í 0.6	6.7	t 1.2
	células de	não realizado	20.0	± 1.8?
	MCA-1511
	Dissolvente	8.0 i 1.2	5.3	i 0.6
Injectaram-se cinco murganhos de cada grupe	1, subcutânea-
mente com	6 5/g de mAb ou 10	células de tumor em	100/1	. Cinco

* dias mais tarde, injectaram-se todos os murganhos 5x10 células de tumor em 20y<l na almofada de uma pata posterior. 0 aumento na espessura (dilatacção) da almofada da pata injectada relativa mente à pata contralateral determinou-se 24 horas mais tarde e apresentou-se sob a forma da média (- SE) para cada grupo.

t A resposta destes murganhos foi significativamente superior à dos murganhos injectados com o dissolvente com P inferior a 0,01 pelo teste t de Student.

J____

Como apresentado na Tabela I, murganhos BALB/c sensibiliza dos com mAb 4.72 responderam com DTH a um estímulo subsequente com células MCA-1490 mas não ao estímulo com células MCA-1511. 0 mAb 5.96 comportou-se de um modo análogo quando se sensibilizaram murganhos BALB/c para DTH com MCA-1511 mas não MCA-1490. A especificidade de DTH indica que se envolveram diferentes idioto pos nas respostas imunolégicas a MCA-1490 e MCA-1511.

De acordo com os dados anteriores para mAb 4.72 (Eorstrom, J.W., et al., 1983, Nature 303:627), a sensibilização exige a identidade de genes ligados ao locus do alotipo de Igh-1 (Tabela i), uma vez que nenhum dos dois mAb sensibilizaram murganhos CB-20. A imunização com células de tumor não induziu DTH nos murga nhos CB-20. Quando testado com ensaios de ligação ao anticorpo, (Cory, J., et al., 1981, in Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Hammerling, G.J., et al., eds₀, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, p. 503), θ mAb 5.96 foi semelhante ao mAb 4.72 (Eorstrom, J.W., et al., 1983, Nature 303:627), não se ligando a

células de sarcoma

Conclui-se que o mAb 4.72 e o mAb 5.96 são funcionalmente anti-idiotópicos a respostas imunológicas a MCA-1490 e MCA-1511, respectivamente.

6.3 A Administração Intravenosa de mAb 4.72 Suprime B1H para

MCA-1490

Testou-se o efeito da administração intravenosa (i.v.) de mAb 4.72 sobre a reactividade de DTH de murganhos que tinham sido imunizados por injecçao subcutânea de mAb 4.72 ou de células de MCA-1490 ou com células MCA-1511, sendo as últimas utilizadas como controlo. Imediatamente a seguir ã imunização subcutânea, injectaram-se os murganhos na veia da cauda com aproximadamente 5y<g de mAb 4·72 ou de mAb 8.2 (como um controlo). Mediu-se a resposta de DTH 5 dias mais tarde (Tabela II).

TABELA II mAb 4.72 SUPRIME DTH EM MCA-1490 QUANDO INJECTADO INTRAVENOSAMENTE (I.V.) EM MURGANHOS IMEDIATAMENTE DEPOIS DE IMUNIZAÇÃO POR INJECÇÃO SUBCUTÂNEA DE mAb 4.72 OU DE CÉLULAS DE TUMOR MCA-1490*

Murganhos	Murganhos	Anticorpos	Dilatação
Imunizados	Estimulados	(ou fragmentos	Media da pata
com	com	Eab) Injectados	(x IO’³ em
		i.v.	£ SE)
mAb 4·72	MCA-1490	mAb 4.72	4.8 £ 0.8t
		mAb 8.2	12.2 ± 0.7
		nenhum dissol-	15.6 ¹ 0.5
		vente
MCA-1490	MCA-1490	mAb 4.72	6.8 £ 1.6^
		Eab 4.72	7.2 £ l.^t
		mAb 8.2	17.0 ± 1.5
		nenhum (dis-	19.8 ± 0.7
		solvente)
Nada	MCA-1490	nenhum	4.0 £ 0.9
MCA-1511	MCA-1511	mAb 4.72	15.0 £ 2.6
		Eab 4.72	15.6 ± 1,2
		mAb 8«,2	14.8 £ 2.1
		nenhum (dis-	16.4 £ 2.6
		solvente)
Nada	MCA-1511	nenhum	4.6 £ 1.5

- 72 - ( d/ Λ* A

Imunizaram-se murganhos por injeeção subcutânea, e mediu-se DTH como descrito para a Tabela I. Dilui-se o material ensaiado para a supressão de DTH, e injeçtaram-se 100ytL i.v. imediatamente a seguir â imunização. Cada murganho recebeu 5y<g de mAb ou 3,5yWg de fragmentos Fab.

t A resposta destes murganhos foi significativamente inferior à dos murganhos que receberam o dissolvente a P inferior a 0,001 de acordo com o teste t de Student.

J_______

Como mostrado na Tabela II, a injeeção de mAb 4.72 suprimiu a ca pacidade de mAb 4.72 ou de células MCA-1490 injectados subcutaneamente sensibilizarem murganhos para DTH a MCA-1490. Além disso, a injeeção i.v. de fragmentos Fab preparados de mAb suprimiu a imunização com células MCA-1490. A imunização com células MCA-1511 não foi suprimida, e a injeeção i.v. de um mAb de controlo, 8.2, não teve algum efeito.

Concluiu-se que a via de administração influenciava a reactividade de DTH em murganhos que receberam mAb 4.72, por injecção subcutânea induzindo DTH (ver secção 6.2, supra) e injeeção i.v. suprimindo este efeito.

6.4 Expressão de Um Idiotopo Definido Por mAb 4.72 Em Células

T Que Veiculam DTH a MCA-1490

Estudou-se se o mAb 4.72 que definia idiotopo estava presente em células T que veiculavam DTH a MCA-1490. Células mononu cleares de nódulos linfáticos drenadas de um tumor MCA-1490 em crescimento, analisaram-se num separador de célula activado por

fluorescência (FACS) utilizando mAb 4.72 aclopado a biotina e FITC-avidina. Observaram-se as células de coloração brilhante. Embora as células de coloração brilhante representassem menos do que um por cento da população total de células mononucleares, estas não foram observados em amostras analisadas com um anticor po monoclonal de controlo biotinilado, mAb 8.2, utilizado na mes ma dose. As células coradas isolaram-se e cultivaram-se na presença de interleucina-2(IIi-2), a partir das quais se estabeleceu uma linha de células, que se designou por 90.3. Quando as células 90.3 se analisaram para o fenotipo de superfície depois de seis semanas de cultura, elas estavam ligadas a mAb 4*72, embora a in tensidade de fluorescência fosse inferior à das células originais. Estas células eram Thy-1 positivas e expressavam o antigénio Lyt-1 mas não antigénio Lyt-2.

Investigou-se então o efeito das células 90.3 sobre a resposta de DTH a MCA-1490 (Tabela III).

74TABELA III

DTH ESPECIFICO BE TUMOR E TRANSFERIDO POR CÉLULAS T DE LINHAS 90.3 E 11.2*

Murganhos injectados com mistura de Dilatação média da pata

Células de Células _(x 10^ em ° SE)

Tumor Efectoras Experiência 1 Experiência 2

MCA-1490	90.3	19.2 í 1.61	15.0 í 2.2t
MCA-1490	Normal T	9.6 £ 1.1	4.8 ± 0.6
MCA-1490	Nenhum (dissolvente)	7.0 £ 0.7	4.0 ± 0.4
MCA-1511	90.3	9.4 £ 1.0	4.0 ± 0.4
MCA-1511	11 · 2	17.3 ~ 2.6	10.7 £ 1.2t
MCA-1511	Normal Ϊ	10.2 £ 2.3	3.0 £ 0.3
MCA-1511	Nehnum (dissolvente)	8.0 £ 0.7	3.0 ± 0.4
Nenhuma	(dissolvente) 90.3	0.4 £ 1.2	0.2 ± 0.4
Nenhuma	(dissolvente) 11.2	2.6 ± 0.6	1.2 £ 0.6
Nenhuma	(dissolvente) Normal I	4.8 £ 1.0	3.6 £ 1.2

As células T efectoras (2x10^) derivadas de linhas 90.3 ou de 11.2 ou de murganhos primitivos BALB/c misturaram-se com célu las MCA-1490 ou MCA-1511 (5x10^) e injectaram-se numa almofada da pata de um murganho primitivo BALB/c. Utilizaram-se grupos de cincò murganhos. Depois de 24 horas, mediu-se a DTH e calculou-se como descrito na Tahela I.

T A resposta destes murganhos foi significativamente superior ã dos murganhos que receberam dissolvente e células MCA-1490 a P

->

inferior a 0,02 pelo teste t de Student.

Gomo apresentado na Tabela III, existia DTH para MCA-1490 quando se injectaram misturas de células 90.3 θ células MCA-1490 nas patas de ratos primitivos BALB/c. Nao existiu qualquer DTH para MCA-1511, nem qualquer dilatação da pata nos murganhos que recebem apenas as células 90.3 mas não células MCA-1490. Estabeleceu-se uma segunda linha de células T, 11.2, a partir de nódulos linfáticos de murganhos drenados de sarcoma MCA-1511 antigenicamente diferente. Fez-se a cultura de células dos nódulos lin fáticos de murganhos primitivos em meio contendo IL-2 durante 48 horas antes do ensaio e utilizaram-se como outro controlo; estas não transferiram DTH para MCA-1490.

Testaram-se células 90.3, cultivadas durante nove semanas, para o seu efeito sobre o crescimento in vivo do tumor MCA-1490. Utilizaram-se células T de cultura de murganhos primitivos como controlo. As células T misturaram-se com células de tumor MCA-1490; MCA-1510 ou M'CA-1511; injectou-se cada mistura subcutânea mente em dez murganhos primitivos BALB/c. Controlou-se 0 tempo para 0 aparecimento de tumores, assim como a velocidade de crescimento dos tumores. Como mostrado na Figura 4, um de 10 murganhos que tinham recebido uma mistura de MCA-Í490 conjuntamente com células 90.3 desenvolveu tumores palpáveis, em comparação com nove de dez murganhos aos quais se juntou células T de controlo em vez de células 90.3. As células 90.3 não tiveram qualquer efeito nos dois sarcomas antigenicamente diferentes, MCA-1510 ou MCA-1511

Concluiu-se que o mAb 4.72 reagiu com uma pequena população de células T de murganhos com sarcoma MCA-1490, e que a linha de célula 90.3, que derivou de tais células, era especificamente reactiva para MCA-1490.

6.5 Expressão de Um Idiotopo Reconhecido Por mAb 4.72 Em Factores Derivados De Células T Supressoras

Descreveu-se anteriormente a geração de hibridomas T-T por fusão de células T de murganhos com sarcoma MCA-1490. (Nelson,

K.A., et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:2866). Os produtos monoclonais (factores supressores) feitos de quatro des tes hibridomas, I-K54, 11-15, 11-32, e 11-122, mostraram que suprimiam DTH para MCA-1490, mas não para MCA-1511, e que se ligavam especificamente a células MCA-1490, embora diferissem quanto ã cinética e â restricção genética dessa supressão (Nelson, K., et al., 1985, in T-Cell Hybridomas, Taussig, M.J., ed., CSC Press, p. 129).

Seleccionou-se um dos quatro factores supressores, K54SE, para testar se o idiotopo definido por mAb 4.72 estava associado com a porção daquele factor que se podia ligar a MCA-1490. 0 K54SF (obtido do sobrenadante de cultura de células I-K54) e célu las MCa-1490 inocularam-se em conjunto, depois do que se lavaram as células de tumor e se eluiu algum K54SF que se tivesse ligado a elas. Ensaiou-se a supressão por testes de DTH depois de injec ção i.v. dos eluídos em murganhos, imediatamente depois destes se terem imunizado subcutaneamente com células MCA-1490 ou MCA-1511. Recuperou-se a actividade supressora específica de tumor,

nos eluidos.

Investigou-se com mais pormenor a capacidade do mAb 4.72 para inibir a ligação de K54SF a HCA-149O. Bisturou-se um meio contendo K54BF com mAb 4.72 ou com máb 8.2 (controlo), antes de se adicionarem a células MCA-149O, θ testaram-se os eluidos das células para a supressão (Tabela IV),

TABELA IV

INCUBAÇÃO DE K54SF (UM FACTOR SUPRESSOR

FEITO DE HIBRIDOMA T-T, I-K54) COM mAb

4₀ 72 INIBE A SUA LIGAÇÃO A CÉLULAS MCA-1490^

Murganhos imunizados anti-MCA-1490 Dilatação média da pata injectados com

4» (x 10 em - SE) em raFonte de Factor supres Subsequente- tos estimulados com factor de sor primeiro mente incuba MCA-1490_ supressão misturado com do com um Experiência Experiência

(meio)			eluído de		1			2
I-K54	mAb	8.2	MCA-1490	6.4		o.eT	4.0	0.7 +
I-K54	mAb	4.72	MCA-1490	15.6	4-	1.1	15.2	- 0.9
BW5147	mAb	8.2	MCA-1490	17.4	4·	0.9	Não	realizado
(controlo)
BW5147	mAb	4.72	MCA-1490	17₀2	4· tea	1.6	Não	realizado
(controlo)
I-K54	Dissolvente	MCA-1490	Não realizado 6.6	Í 1.5+

I-K54

Dissolvente pré-incubado com mAb 8.2

MCA-1490 Não realizado 17_O6 í 1.2-f pré-incubado com mAb 4_O72

Os meios de células I-K54 ou de células BW5147 (controlo) misturaram-se primeiro com mAb 4.72 ou com mAb 8.2, depois do j A que se incubaram com células MCA-1490. Na Experiência 2, havia também grupos (linhas 5 θ 6 na Tabela) em que células MCA-1490 se incubaram com mAb 8.2 ou com mAb 4.72, antes de se incubarem com o meio de I-K54. Depois da incubação, lavaram-se as células de tumor, e eluíu-se o material ligado a estas e ensaiou-se para a supressão de DTH para MCA-1490. A dilatação média da pata nos murganhos não imunizados (controlo) foi de 5,0 £ 0»3 na Experiência 1 e 5,2 - 0,6 na Experiência 2, e a dilatação média da pata em murganhos imunizados anti-MCA-1490 estimulados com MCA-1490 foi de 15,8 - 1,4 na Experiência 1 e 17,6 £ 1,0 na Experiência 2.

f A resposta destes murganhos foi significativamente inferior â dos murganhos que receberam dissolvente a P menor do que 0,001 pelo teste t de Student.

Como mostrado na Tabela IV, os eluatos de células MCA-1490 que se tinham incubado com uma mistura de mAb 8.2 e de K54SE, su primiram DTH para MCA-1490. Em contraste, os eluatos de células MCA-1490 incubados com uma mistura de K54SE e mAb 4.72 nao foram supressivos. Este resultado indica que a capacidade de K54SE para se ligar a MCA-1490 foi inibida pela sua ligação a mAb 4.72. Os eluatos de células MCA-1490 que se tinham incubado com meio BW5147 (controlo) e com mAb 8.2 foram não supressivos; assim a supressão não se deve ã eluição de antigénio de tumor. 0 pré-tra tamento de células MCA-1490 com mAb 4.72 não evitou que elas se

ligassem a K54BF (ver linha 6 da Tabela XV)_f e assim a inibição verificada quando o K54SF se incubou com mAb 4.72 não se deveu ã competição entre mAb 4.72 e K54SF para a ligação ao antigénio nas células MCA-1490. 0 resultado sugere que o idiotopo reconhecido pelo mAb 4.72 se expressa no sítio de K54SF que se liga a MCA-1490 ou, pelo menos, muito próximo daquele sítio. Obtiveram-se resultados semelhantes para o factor supressor produzido por um hibridoma de células T, 11-32.

Uma vez que K54SF suprime DTH a MCA-1490, ensaiou-se o efeito de K54SF sobre o funcionamento de células 90.3? visto que estas células podiam transferir DTH específica para MCA-1490 (ver secção 6.4, supra). Injectaram-se murganhos, numa pata, com uma mistura de células da linha 90.3 e células de tumor MCA-1490. Uma hora mais tarde, injectou-se K54SF (como sobrenadante do hibridoma I-K54) na mesma pata; utilizou-se sobrenadante de BW5147 como controlo. Como apresentado na Tabela V, a injecção de K54SF suprimiu a capacidade das células 90.3 para veicularem DTH a MCA-1490.

TABELA V

A DTH PARA MCA-1490, COMO TRANSFERIDA POR CÉLULAS T DA LINHA 90.3 E SUPRIMIDA POR UM PACTOR PRODUZIDO POR HIBRIDOMA T-T I-K54*

Células transferindo DTH

Ponte de factor supressor (meio de cultura)

Dilatação média da pata (x 1Q-3 em * SE)

Experiência Experiência 1 2

90.3	Nenhuma I-K54 I-K54 BW5147 BW5147	(diluente)	19.2 - 1.6 8.2 i 0.8^* 9.4 - 0.9^f 20.3 i 1.4	15.0 ± 3.0 ±	2.2 0.4 1.2
1.0 0.1 1.0 0.1	1 1 1 1
13.3	i
19.6	* 1.6
Normal T	Nenhum	(diluente)	9.6	+	1.1	4.8	Jr-	0.6
Dissolvente	Nenhum	(diluente)	7.0		0.7	4.0	±	0.6

J-Misturaram-se células T linha 90.3 com células MCA-1490 e injectaram-se em patas de murganhos primitivos BALB/c para se en saiarem para a DTH como descrito na Tahela III. 0 meio de células I-K54 ou de células ΒΪ5147 (controlo) diluíu-se para 5y4l e injectou-se na mesma pata da mistura de célula de tumor-célula T. Utilizaram-se grupos de cinco murganhos.

T A resposta destes murganhos foi significativamente inferior á dos murganhos que receberam células 90.3, células de tumor e dissolvente, a P inferior a 0,01 pelo teste t de Student.

Uma vez que as células efectoras e as células supressoras K54 parecem transportar um idiotopo definido por mAb 4.72, deter minou-se se este idiotopo estava também presente nos factores su pressores produzidos pelos hibridomas de células T diferentes de K54. Os factores supressores derivados de quatro hibridomas diferentes de célula T ensaiaram-se para a actividade supressora depois de incubação com mAb 4.72 imobilizado. 0 meio consumido dos quatro hibridomas e das células BW5147 (controlo), passou através de colunas de mAb 4.72 ou mAb 8.2 (controlo), que se tinham ligado a agarose por covalência. Ensaiaram-se os eluentes para a supressão de DTH para MCA-149O, por injecção i.v. destes em murganhos BALB/c imediatamente depois de terem sido imunizados subcutaneamente para MCA-1490 (Tabela VI).

TABELA VI mAb 4.72 LIGA-SE A FACTORES QUE SÃO PRODUZIDOS POR HIBRIDOMAS DE CÉLULAS T Ξ QUE SUPRIMEM DTH PARA

MCA-1490*

Fonte de factores supressores (meio de cultura de)

Dilatação média de paía (x 10 em - SE) em murganhos injectados com meio absorvido com mAb 8.2 mAb 4.72

BW5147 (controle) Hibridoma I-K54	24.2 ± 1.8	23.4 ± 0.8 22.9 - 1.2 18.4 - 2.2
7.8 9.6	£ £	í.ot 2.8**
Hibridoma	11-15
Hibridoma	11-32	10.8		2.0**	24.8 £ 2.4
Hibridoma	11-122	11.0	£	1.2Ϊ	23.6 ± 2.0

meio de cultura consumido de hibridomas de células T, I-K54, 11-15, 11-32 e 11-122 ou de células BW5147 (controlo) passaram através de colunas de mAb 4.72 ou 8.2 ligados por covalência a agarose. Ensaiaram-se os eluentes para a supressão da fase indutora de DTH a MCA-1490 como descrito na Tabela II. Cal culou-se a significãncia estatística das diferenças na dilatação da pata, em comparação com murganhos de controlo que receberam dissolvente, pelo teste t de Student.

P menor do que 0,001 ** P menor do que 0,01

Gomo mostrado na Tabela IV, os meios derivados de cada um dos quatro hibridomas T e passados através de uma coluna de controlo (de mAb 8.2) suprimiram a indução de DTH para MCA-1490, em bora esta supressão fosse removida por passagem através de uma coluna de mAb 4.72. Todos os quatro factores supressores mostraram assim expressar o idiotopo definido por mAb 4·72.

Este resultado sugeriu que o idiotopo definido pelo mAb era dominante na regulação da resposta supressora para MCA-1490» Contudo, como se estudaram os factores produzidos apenas por qua tro hibridomas, analisou-se a seguir a presumível resposta supressora policlonal em murganhos com um sarcoma MCA-1490 em cres cimento. Esta experiência fez-se na base da demonstração de que soros de murganhos com sarcomas M'CA-1490 ou MCA-1511 podem supri mir a indução de DTH nos respectivos tumores (Tabela VII).

- 85 TABELA VII

SOROS DE MURGANHOS COM SARCOMA MCA-1490 OU MCA-1511 SUPRIMEM DTH AO TUMOR RESPECTIVO*

Dilatação média de pata (x 10-5 _em + gjg) _{em ra}tos imunizados e estimulados com

Dador de soro MCA-1490 MCA-1511

Murganhos portadores MCA-1490	de	tumor	6.7	+	1.3^	20.0	+	0.4
Murganhos portadores MCA-1511	de	tumor	15.9		2.6	10.4	£	2.3^
Murganhos simples			17.5	+	4.5	22.2		2.6
Nenhum (dissolvente)			15.0	+	1.4	21.0		1.4

Os soros de murganhos portadores de tumores MCA-1490 ou MCA-1511 em crescimento progressivo ou de murganhos de controlo diluiram-se e ínjectaram i»v» 100 1 em murganhos, imediatamente antes da imunização para MCA-1490 ou para MCA-1511. A dilatação média da pata em murganhos não imunizados foi de 5,3-1,2 depois de estimulados com MCA-1490 e 6,3 - 0,3 depois de estimulados com MCA-1511.

ΐ A resposta destes murganhos foi significativamente inferior ã dos murganhos que receberam dissolvente a P menor do que 0,01 para 0 teste t de Student» /

fez-se a cromatografia de soros de murganhos portadores de tumor em colunas com mAb 4.72 ou com mAb 8.2 (controlo), eluíu-se o ma terial ligado às colunas, e ensaiaram-se os eluentes e eluídos para a supressão de DTH (Tabela VIII).

	<:	ω
	ω	2
		Η
	e	ω
	H	Ω
	Ω	Ρ
		ω
	2
		ω
	2
	H	α
	K
	Ω	ο
	Ω	Ω
	ω	ο
		(Λ
	ω
	ρ	U3
	σ	Ω
H	ο	ω
H	ω
H	ο	ρ)
>	(Λ	ο
		Η
<ti	ω	υ
P	Ω	<
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(ti Ρ (ΰ	ω + 8
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β	(Ό !
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	Ρ	ο	η	ω	b-
ο	β	•		ο	ο
Η	0 φ	03	Η	ο	ο
+ 8	X φ	+ 8	+ 8	. +8	+ 8
Ο	0	Ο	Ο	Ο	ω
•	Ο	0	0	0
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ω	b-	Ο	ω	XJ*	(Ν
α	Ο	ο	0	ο	ο
Η	ο	rri	ο	rri	ι—I
+ ί	4 1	+ 8	+ 0	+ 8	+ 8
0	νθ	0	03	Ο	ω
•	•	•	Ο	ο	4
\0	Ο Η	m Η	b-	m Η	m

φ
Ρ		Φ
β	0	Ρ	0
φ	Ρ	β	Ρ
β	Φ	Φ	iti
Η	β	β	β
Μ	Η	Ω	Η
U3	Ω	ω

	ω	X—
	Μ Ο	•ri	φ
0	0 θ'	Ρ	Ρ
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0	φ □	(ΰ	ο
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Ή
03		03	03	00	b
o		e		o	0
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Os soros de murganhos portadores de tumores MCA-1490 ou MCA-1511 passaram através de colunas imuno-adsorventes de mAb

4.72 ou mAb 8.2, acoplados por covalência a agarose. Lavaram-se as colunas, e o material ligado eluíu-se com RaSCR e dessalinizou-se em Sephadex G-25 equilibrada com BBS. Ensaiaram-se os eluentes e eluatos de cada coluna para a supressão da fase indutiva de DTH cõmo descrito nas Tabelas XIII e XVI.

A resposta destes murganhos foi significativamente inferior à dos murganhos imunizados que receberam dissolvente a f inferior a 0,01 pelo teste t de Student.

Como mostrado na Tabela VIII, soros de murganhos portadores de MCA-1490 suprimem DTH a nCA-1490 depois de passarem através de uma coluna de controlo (de mAb 8.2) mas não depois de passarem através de uma coluna de mAb 4.72, e o material que suprimiu DTH para KCA-1490 recuperou-se num eluato da última coluna. A imuno-adsorção com mAb 4.72 não removeu a capacidade dos soros de mur ganhos portadores de um tum'or diferente, MCA-1511, para suprimirem DTH para esse tumor.

Estes resultados indicam que a supressão de DTH para MCA-1490 estava associada com um idiotopo reconhecido por mAb 4.72 e que a supressão de DTH para MCA-1511 não envolvia aquele idiotopo.

6·6 Soroterapia em,Murganhos com Tumores MCA-1490 ou MCA-1511

Investigou-se se a injecção de mAb 4.72 e 5.96 protegia murganhos contra a inoculação com as células de tumor apropria-

das (MCA-1490 ou MCA-1511, respectivamente) e se tinha qualquer efeito terapêutico sobrace tumores estabelecidos. Injectaram-se os mAb intraperitonealmente; não se escolheu a via i.v. devido ao facto (ver secção 6.3 supra) de os murganhos injectados desse mo do apresentavam reactividade DTH decrescente para antigénios de tumor.

Na primeira série de experiências, injectaram-se murganhos (20 por grupo) com mAb 4.72 ou com mAb 8.2 (controle). Cinco dias mais tarde, inocularam-se com células MCA-1490 a uma dose que, de acordo com os testes piloto, originou o crescimento progressivo do tumor em aproximadamente 90% dos recipientes.

A sensibilização com mAb 4.72 atrasou o aparecimento do sarcoma MCA-1490 transplantado, entre 5 a 9 dias em comparação com os controlos, mas nao houve diferença significativa na percentagem de murganhos mortos de tumores em crescimento progressi vo. 0 crescimento do sarcoma MCA-1511 antigenicamente não relacio nado não foi afectado, A variação da quantidade de mAb 4.72 injectada não melhorou os resultados. Além disso, numa experiência em que os murganhos receberam 100 vezes a quantidade de mAb 4.72 que podia sensibilizar para DTH, o crescimento de MCA-1490 aeele rou-se em comparação com os murganhos de controlo e com tumores de controlo. Um efeito duplo tem sido referido também, na manipu lação de imunidade para antigénios virais, utilizando anticorpos anti-idiotípicos (Kennedy, R.C. and Dreesman, G.R., 1984, J. Exp. Med. 159:655; Kennedy, R.C., et al., 1984, J. Virol. 50:951).

Numa segunda série de experiências, injectaram-se, primei- 91

ro, os murganhos com células MCA-1490 por via subcutânea, seguido, 7 ou 8 dias mais farde por i.p. de 100y/g de mAb; nesta altu ra, os tumores tornaram-se aberfamente palpáveis em cerca de 50% dos murganhos. Repetiu-se a injecção de anticorpo com intervalos de 4 a 5 dias para um total de quatro injecções. Em todos os 10 murganhos com mAb 4.72 administrado, os nódulos de tumor pequenos originais regrediram quando se terminou a experiência depois de 6 semanas. Nesta altura, 6 dos 10 murganhos com mAb 8.2 de controlo administrado tinham tumores em crescimento progressivo com uma área de superfície maior ou igual a 0,20 cm². Esta diferença entre os dois grupos foi significativa para P menor ou igual a 0,05.

Para testar os limites desta forma de terapia, aumentou-se a dose de células de tumor, administrando células de tumor numa dosagem duas vezes superior ã necessária para o crescimento em 10C% dos recipientes. Os dois sarcomas antigenicamente distintos trataram-se em paralelo com o mAb anti-idiotípico apropriado (4.72 e 5.96, respectivamente). Injectaram-se grupos de 10 murga nhos com mAb 8.2 (como um controle), ou dissolvente (como outro controlo), começando nove dias depois da transplantação quando todos os murganhos tinham tumores nitidamente palpáveis (maiores do que 0,2 cni )· Como mostrado na Figura 5, o tratamento com mAb

4.72 limitou o crescimento de, MCA-1490, mas não de MCA-1511, e o tratamento com mAb 5.96 inibiu, 'de maneira semelhante, MCA-1511, mas não MCA-1490. As diferenças entre os murganhos que receberam o mAb anti-idiotípico apropriado e os que raceberam qualquer dos três controles (o mAb anti-idiotípico não apropriado, o mAb 8.2

- 92V

ou dissolvente) era estatisticamente significahte para P menor ou igual a 0,001. A Figura 6 apresenta estes dados com mais pormenor, mostrando o número de murganhos com tumores em cada grupo tratado com mAb 4.72 ou com mAb 5.96. Em cada um dos dois grupos que receberam anticorpo anti-idiotípico apropriado, os tumores regrediram em 5 ou 7 dos 10 murganhos tratados, e três destes ra tos (em cada um dos dois grupos) permaneceram isentos de tumores durante duas semanas depois da última injecção de anticorpo. ííes ta altura, todos os murganhos nos grupos de controlo tinham turno res com uma área de superfície superior a 1,5 cm^, e alguns dos murganhos tinham já morrido com tumores»

Concluiu-se que o tratamento de murganhos com sarcomas MCA-1490 e MCA-1511 estabelecidos, utilizando injecção intraperitoneal do mAb anti-idiotípico apropriado, apresentava actividade anti-tumoral significativa.

6.7 Argumentação

Descreveu-se aqui a prova de que células I e células B anti -idiotípicas se geraram em murganhos portadores de um sarcoma em crescimento ou que tinham sido imunizados para um tumor desses.

As células T transportando o mesmo idiotopo incluiam células que veiculavam DTH específico de tumor e células que produziram um factor supressor específico de tumor, solúvel» Utilizando mAb anti-idiotípico, pode-se manipular a resposta anti-tumoral de mo do a limitar o crescimento de sarcomas singeneicos estabelecidos, expressando os antigénios de tumor relevantes.

Utilizaram-se dois mAb, 4.72 e 5.96. Isolaram-se de murga93 -

nhos BALB/c que tinham sido imunizados para sarcomas MCA-1490 ou MCA-1511, respectivamente. Consideraram-se os dois mAb como anti -idiotípicos de acordo com três descobertas que se relacionam as suas funções. Primeiro, cada mAb induziu DTH específico de tumor em murganhos singeneicos na aus‘encia de antigénio de tumor. Segundo, esta indução alotipicamente restringida. Terceiro, nenhum mAb se ligou ao tumor imunizante.

Identificou-se o idiotopo definido por mAb 4.72 em células T que veiculam DTH para MCA-1490, o que se realizou numa experiência em que se utilizou o mAb 4.72 para isolar, de nódulos linfa ticos de murganhos respondendo a MCA-1490, uma pequena fracção de linfócitos que expressaram o idiotopo definido de 4.72 e a partir do qual se pode estabelecer uma linha de células T, 90.3. Os murganhos primitivos que receberam as células 90.3 retardaram DTH para mCA-1490 mas não para MCA-1511, e as células 90.3 evita ram o crescimento de sarcoma MCA-1490 mas não de sarcoma MCA-1510 ou MCA-1511· Cheever et al. (1986, J» Exp. Med, 163:1100) demons z 4 trou a capacidade de células T Lyt 1 2 para limitarem a progres são de leucemia murina. Contudo, o seu protocolo inclui a restimulação de células de cultura com antigénio assim como com IL-2.

A especificidade de tumor das células 90.3 manifesta-se contra elas sendo células assassinas activadas por linfocina.

Verificou-se que os produtos de células T que suprimem a resposta de DTH a MCA-1490 expressam o idiotopo definido pelo mAb 4.72. Este facto foi demonstrado em estudos de quatro hibridomas de células T que se obtiveram por fusão de timocitos de murganhos

- 94 ^ν portadores de tumores MCA-1490 em crescimento com células BW5147 (Nelson, K., et al., 1985, in T-Cell Hybridòmas, Taussig, M.J., ed., CRG Press, p. 129). Verificou-se anteriormente que os produ tos destes hibridomas suprimem a lise de células MCA-1490 marcadas com ³¹Cr por células T citolíticas especificamente imunológi cas (Nelson, K.A., et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Soi. U.S.A. 77:2866) e suprimem a indução de DTH para MCA-1490 (Cory, J., et al., 1981 in Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridòmas, Hammer ling, G.J., et al., eds., Elsevier/North-Holland Biomedical Press, p. 505); esta supressão era específica para a resposta a MCA-1490 f

e restrita para 0 alotipo. Alem disso, verificou-se que os facto res supressores se ligam a células MCA-1490 a partir das quais eles puderam recuperar-se por eluição (Nelson, K.A., et al«, 1980, supra). Nos exemplos aqui descritos, demonstra-se que 0 mAb 4.72 inibe a ligação dos quatro factores supressores a células MCA-1490. Este facto sugere que 0 idiotopo definido pelo mAb 4.72 se associa com 0 sítio, no factor supressor, que se liga a um antigénio de tumor em células MCA-1490. Os factores supressores T transportando o idiotopo definido por mAb 4.72 podiam suprimir a indução para DTH por mAb 4.72 e a transferência de DTH para MCA-1490 por células T da linha 90.5 (os quais, como referido supra, expressam 0 idiotopo defihido por mAb 4.72}.

Com base nestes dados, sugere-se 0 seguinte modelo: 0 mAb

4.72 define um idiotopo que ocorre nas células T reguladoras esl pecíficas de tumor e que é dominante na resposta imunolégica de murganhos BAEB/c para MCA-1490. Durante esta resposta, o mesmo idiotopo ou um idiotopo de reacção cruzada activa um clone de cé ·

- 951

lula B produzindo anticorpo anti-idiotípico. gupoe-se que o últi mo anticorpo regula as células T supressoras e as células T reac tivas a DTH. Este modelo considera, como suportado por vários es tudos.(Rajewski, K. and Takemori, T„, 1983, Ann. Rev_o Immunol. 1:569; Urbain, J., et al., Ann. Immunol. 133D:179; Binz, H. and Wigzell, H., 1978, J. Exp. Med. 147:63; Ertl, H.C.J., et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 79:7479), que as células T e B interagem em redes idiotípicas. Este modelo considera também que um anticorpo anti-idiotípico derivado de célula B (mAb 4.72 neste exemplo) surgiu em resposta a um idiotopo de célula T e não a uma série paralela de células B positiva de idiotopo. Em suporte desta hipótese, não se tem nenhuma prova de ligação de células de tumor a anticorpos como resposta de murganhos a MCA-1490, nem se conseguiu induzir tal anticorpo por imunização com mAb 4.72. Este facto está em contraste com a facilidade em demonstrar as células T reactivas a antigénio, idiotopo positivas. Os dados sustentam a hipótese de que um idiotopo de célula T pode induzir uma resposta anti-idiotípica no compartimento das células B, que por seu turno podem regular as respostas da célula T nas duas direcções, superior e inferior.

Um modelo alternativo considera que o idiotopo definido pelo mAb 4.72 exibe uma imagem interna do antigénio de tumor MCA-1490. Contudo, é difícil reconciliar aquele modelo com a restricção do alotipo (igh-l) da indução de DTH por mAb 4.72.

No presente estudo, utilizou-se o mAb anti-idiotípico 4.72 numa tentativa bem sucedida para remover a actividade supressora de soros de murganhos portadores de MCA-1490. Todos os factores

de soro circulantes que se podem detectar-se por medição da supressão de DTH para MCA-1490 mostraram expressar o idiotopo defi nido por 4.72.

Como descrito supra, examinou-se a exiquibilidade de manipu lação da resposta imunológica ao tumor por utilização de mAb anti -idiotípico. Escolheram-se mAb 4.72 e 5.96, porque podiam induzir células reactivas DTH em murganhos primitivos, e porque o idioto po definido por um dos mAb, 4.72, era expressa em células reacti vas DHT em murganhos imunes. A primeira série de experiências dirigiu-se ã questão da prevenção de tumor, por administração de mAb antes da transplantação do tumor, enquanto uma segunda série de experiâncias tratava da terapia de tumores já estabelecidos. Quando os murganhos recebiam mAb 4.72 antes de serem inoculados com células MCA-1490, normalmente o crescimento exterior do tumor era retardado por alguns dias. Estes efeitos anti-tumorais não melhoravam com o aumento da dose de mAb; de facto, uma experiência com um aumento de 100 vezes na dose de mAb mostrou crescimento acelerado do tumor.

Numa segunda série de experiências, investigou-se o valor terapêutico da injecçao em murganhos, com sarcomas estabelecidos, por via intraperitoneal com mAb anti-idiotípico apropriado. A in jecção de mAb 4.72 (mas não de mAb 5.96) limitou o crescimento de sarcoma MCA-1490 e, mais importante induziu a regressão em 3 de 10 sarcomas e prolongou a sobrevivência dos murganhos tratados. A injecçao de mAb 5.96 (mas não de mAb 4.72) teve um efeito semelhante em murganhos com sarcoma MCA-1511, induzindo também a

- 97kc regressão em 3 de 10 sarcomas.

7. ANTICORPO ANTI-IDIOTÍPICO ESPECÍFICO DE UM IDIOTIPO QUE RECONHECE UM ANTIGÉNIO GANGLIOSÍDICO GD3 ASSOCIADO A MELANOMA HUMANO anticorpo monoclonal de murganho (mAb) MG-21 (Hellstrom et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:1499-1502) reconhece um antigénio gangliosídico GD3 que se expressa na superffe cie de células de muitos melanomas humanos e em vestígios nas cé lulas normais (Dippold, W.G., et al., 1980, Proc. Natl. Acad.

Bei. U.S.A. 77:6114-6118; Nudelman, E., et al., 1982, J.;Mõl, Chem. 257:12752-12756; Yeh, Μ.Ϊ., et al., 1982, Int. J. Câncer 29:269-275). 0 mAb MG-21 apresenta citotoxicidade dependente de complemento (CDC) para células GD3-positivas com soro humano como fonte de complemento, e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) para células GD3-positivas com linfocitos humanos (Hellstrom et al., 1985, supra). 0 antigénio DG3 ao qual o MG-21 se liga tem sido utilizado com algum sucesso como o alvo para um mAb murino administrado passivamente, R24 (Houghton, A.N., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:1242-1246), com especificidade e actividade biológica semelhante ã do MG-21. Como descri to nos exemplos infra, utilizou-se MG-21 (Abl) como imuno-génico para gerar um anticorpo anti-idiotípico monoclonal de murino (Ab2), o qual se designou por 2C1. Este mAb, que é uma IgG2a, se leccionou-se pela sua capacidade em inibir a ligação de MG-21 a uma linha de células de melanoma GD3-positiva. Verificou-se que o mAb 2C1 se ligava a MG-21 com elevada avidez mas não a qualquer dos outros seis mAb de murganho. Pode-se eliminar completamente a ligação de MG-21 a células de melanoma GD3-positivas assim como purificar GD3, e este inibiu as propriedades GDG e ADCC de MG-21 numa maneira dependente da dose. Utilizando mAb 2C1 como uma son da, desenvolveu-se um ensaio para controlar os anticorpos humanos para mAb MG-21 em pacientes que receberam mAb MG-21 com fim terapêutico ou para diagnostico. Nas subsecções seguintes apresen ta-se uma descrição pormenorizada de cada fase deste aspecto des ta invenção.

7·! Materiais Ξ Métodos

7.1.1 Murganhos

Adquiriram-se murganhos fêmea BALB/c de oito a doze semanas de idade do Animal Facilities of the Fred Hutchinson Câncer Rese arch Center (Seattle, WA).

7.1.2 Células alvo

Utilizou-se o clone 13 da linha de células de melanoma humano M-2669; para simplicidade, refere-se aqui como M-2669. Esta estabeleceu-se a partir de um melanoma metastásico, clonado (Beaumier, P.L., et al., 1986, J. Nucl. Med. 27:824-828). As células deste clone expressam fortemente o antigénio GD3 definido por mAb MG-21 como determinado por um ensaio d.e ligação (id.).

As células de melanoma cresceram em ar com 6$ de CO^ num meio de cultura RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, New York) contendo 15$ de soro de feto de vitelo inactivado paio calor (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) tamponado com NaHCO^ e complementado

com penicilina (lOOU/ml), estreptomicina (lOOmg/ml) e L-glutamina (290mg/litro).

7.1.3 Glicolípido

Purificou-se o antigénio gangliosídico GD3 de células de melanoma do clone 13, M-2669 como descrito (Nudelman, E., et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:12752-12756), e que foi facultado pelo Dr. Sen-itiroh Hakomori do Pred Hutchinson Câncer Research Center (Seattle, WA).

J

7.1.4 Anticorpos monoclonais

MG-21 (Hellstrom, I., et al„, 1985, Proc. Natl. Acad.

Sei. U.S.A. 82:1499-1502) é um anticorpo IgG3 que se liga a um antigénio gangliosídico GD3 que se expressa fortemente em cerca de 80-90$ dos melanomas humanos. (Nudelman, E., et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:12752-12756; Yeh, M.-Y., 1982, Int. J. Câncer 29:269-275). 0 MG-21 pode veicular CDC na presença de soro humano e ADCC na presença de linfócitos de sangue periféricos humanos (PBL), e este pode inihir o crescimento exterior de xeno-trans plantes de melanoma humano em murganhos nus. (Hellstrom, I., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:1499-1502).

mAb 2A-14’é uma IgG3 que se liga também ao antigénio gan gliosídico GD3, mas a um epitopo que por experiências de bloqueio cruzado mostra ser diferente do reconhecido por MG-21.

mAb 96.5 é uma IgG2a que se liga a p97, uma glicoproteína de superfície de célula associada com melanoma (Brown, J.P., et al.,1981, J. Immunol. 127:539-546).

- 100

9 mAb L6 e uma IgG2a que se liga a um antigénio de hidrato de carbono que se expressa fortemente nas células de muitos carcinomas humanos mas não em melanomas (Hellstrom, I., et al., 1986, Câncer Res. 46:3917-3923).

mAb L20 é uma IgGl que identifica uma proteína de 110 kd que se expressa na superfície de células de muitos carcinomas hu manos mas não em melanomas (id.).

mAb 7T1.1 é uma imunoglobulina IgG3 específica para anti génio de sangue do grupo A que se expressa fortemente em muitos carcinomas humanos.

mAb 1G3.10 é um anticorpo de IgG3 específico para o anti génio semelhante ao do sangue de grupoA que também se expressa em muitos carcinomas humanos.

mAb 26.8, que se utilizou como um Ab2 de controlo, é uma IgGl que se liga a um idiotopo em mAb 96.5 específico para o antigénio do melanoma p97. 0 mAb 26.8 pode inibir a ligação de mAb 96.5 a p97.

P1.17 é uma proteína de IgG2a de mieloma de murino que se obteve da American Type Cullure Collection (ATCC n2 de aceita ção NS TIB 10).

Purificaram-se os anticorpos de um meio de cultura consumi do ou de líquido ascítico por cromatografia de afinidade em Proteína A-Sepharose CL-4B como descrito por Ey et al. (1978, Immunochemistry 15:429-436).

- 101

7.1.5 Ligação de ànticorpo com hemocianina de molusco (dapa)

O anticorpo MG-21 acoplou-se a hemocianina de molusco (KLH) por ligação química cruzada na presença de glutaraldeído de acor do com os procedimentos de Bona et al. (1979, J. Exp. Med. 149:815-823). Rapidamente, misturou-se 1 ml de solução de mAb MG-21 (3,6 mg/ml) com 1 ml de solução de KLH (3 mg/ml) em tampão de fosfato 0,1m, pH 7,5. Iniciou-se a ligação por adição de I ml de uma solução a 0,25% de glutaraldeído (Sigma Chemical, St. Louis, ΜΌ). agitou-se a mistura ã temperatura ambiente durante 1 hora. Parou-se a reacção por adição de 250 1 de glicina 1M. 0 conjugado de anticorpo-KLH armazenou-se congelado a -20°C antes da utilização.

7.1.6 Produção de anticorpos anti-idiotípicos monoclonais (Ab2) específicos para MiG-21 (Abl)

Imunizaram-se por via intraperitoneal murganhos fêmeas BALB/c com 8 semanas de idade com 100y^g de conjugado de MG-21-KLH em adjuvante completo de Freund. Duas semanas mais tarde, administrou-se i.p. a mesma quantidade de conjugado em adjuvante incompleto de Freund. Decorridas outras oito semanas inocularam-se de novo os murganhos com conjugado em solução de cloreto de sódio. Quatro dias depois da última imunização, removeram-se os baços e as células recolhidas fundiram-se com células de mieloma de murino HS-1 com utilização de polietilenoglicol. Seleccionaram-se os hibridomas que segregavam anticorpos anti-idiotípicos específicos para MG-21, desenvolvidos em meio HAT, e clonaram-se

- 102 utilizando procedimentos estabelecidos. (Yeh, M.-Y., et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:2927-2951).

7.1.7 Ensaio de inibição da ligação de mAb (Abl)

Utilizaram-se ensaios de imuno-absorção ligada a enzimas (ELISAS) para a sondagem inicial de ligação de anticorpos a hibridomas que segregam anticorpos anti-idiotípicos. Neste ensaio, testaram-se os sobrenadantes da cultura de hibridoma para a inibi çao da ligação de MG-21 (Abl”) a células M-2669, como prova da presença de anticorpos anti-idiotípicos (”Ah2”). As células de melanoma M-2669, semeadas em placas de cloreto de polivinilo (10^ células/cavidade) e fixadas com 0,5% de glutaraldeído, utilizaram-se como alvos. Misturaram-se 100yxl de mAb MG-21 (5 Ag/ /ml) com igual volume de sobrenadanter^de hibridoma, incubaram-se a 4°G durante 2-4 horas, e então adicionaram-se as células alvo. Depois de outra incubação durante 1 hora a 37°C, lavaram-se as placas três vezes com Tween-20 a 0,05% em PBS (tampão PBS-Tween). Incubaram-se então as células com 100y»l de conjugado de anticor po de IgG anti-murganho caprino-peroxidase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) diluído a l/lO.OOO em tampão PBS-Tween a 57°C durante 30 minutos, e lavaram-se de novo. Deitaram -se 100y<L de o-fenilenodiamina (OPD) contendo 0,015% de D^Og em fosfato de citrato, pH 5,0, em cada cavidade como substrato para a peroxidase. Cerca de 3-5 minutos mais tarde, adicionaram-se 100y/1 de HgSO^ 1,3N para bloquear a reacção substrato-enzima. Mediu-se a absorvãncia a um comprimento de onda de 492nm/630nm de feixe duplo para cada cavidade num leitor de microplacas GSC

- 103(-

(Genetic System Corp., Seattle, WA).

Para investigar a dependência da dose, do efeito inibidor de anticorpo anti-idiotípico (Ab2) na ligação de MG-21 (Abl) a células © ao antigénio GD3, misturaram-se 100 jA. de uma concentra ção fixa (5yíg/ml) de MG-21 com 100y/1 de várias concentrações de anticorpos de controlo ou anti-idiotípicos apropriados, incubaram-se a 37 C durante 1 hora, e então adicionaram-se a cavidades pré-revestidas com células M-2669 (10^/tubo) ou antigénio GS3 purificado (200ng/50yzl/tubo). Os procedimentos restantes foram como os que se referiram antes.

7.1.8 Determinação de isotipo de imunoglobulina

Utilizaram-se anti-soros desenvolvidos em caprinos para uma classe específica de imunoglobulina de murganho (.Southern Biotechnology Assoe., Birmingham, AL). Diluíram-se 50jA. de cada um desses anti-soros em PBS (lyfl/ml), colocaram-se em placas de 96 cavidades (Dynateoh, Alexandria, VA), e incubaram-se durante a noite a 4°0. Lavaram-se as placas uma vez com tampão PBS-Tween, e depois incubaram-se durante 1 hora ã temperatura ambiente com 100y/1 por cavidade de meio RPMI 1640 contendo 15% de soro fetal de vitela (FCS). Depois da lavagem, adicionaram-se 50jA. do meio de cultura de hibridoma consumido; seguido da incubação das placas ã temperatura ambiente durante 1 hora e de uma lavagem com tampão PBS-Tween. Subsequentemente, adicionaram-se 50 de conjugado de anticorpo anti-IgG de murino desenvolvido em caprinos diluído a 1/10.000 em tampão PBS-Tween a cada cavidade. Incubaram-se as placas durante 30 minutos a 37°C e lavaram-se cinco

JE

vezes com tampão PBS-Tveen, depois do que se adicionaram 100 y<l de substrato OPD a cada cavidade. Cinco minutos mais tarde, interrompeu-se a reacção por adição de 100yíl de H^SO^ 1,3N, e mediu-se a absorvancia num leitor de microplacas GSC.

7.1.9 Ensaio de ligação de anticorpos anti-idiotípicos (Ãb2)

Utilizou-se um ensaio de ligação para determinar se a capa cidade de Ab2 para inibir a ligação de MG-21 (Abl) era específica. Adicionou-se MG-21 purificado a 0,5y/g/100j/L para revestir cada cavidade de placas de cloreto de polivinilo de 96 cavidades (Gostar, Cambridge, MA), depois do que se adicionaram 200y<L por cavidade de meio RPMI 1640 contendo 15% de FCS como um bloqueador” para evitar a ligação do anticorpo ao plástico. Depois de lavagem, adicionaram-se 100y/l de Ab2 purificado ou imunoglobuli na P1.17 de controlo a várias concentrações. Incubaram-se as pia cas a 37°C durante 30 minutos, lavaram-se depois três vezes com tampão PBS-Tween» Adicionaram-se então 100yd. de IgH anti-murganho desenvolvido no coelho conjugada com peroxidase que tinha o mesmo isotipo que Ah2, depois da diluição em tampão PBS-Tween. Depois de incubação durante 30 minutos a 37°C, seguida de lavagem prolongada, adicionaram-se 100y/1 de substrato OPD e incubaram-se durante 3-5 minutos na ausência de luz. Einalmente, adide H^SO^ 1,3N. Leram-se as placas por intermé dio de um leitor de microplacas GSC.

7.1.10 Ensaio de radio-iodização de anticorpos e ligação ¹²⁵I-Ab2 cionaram-se 100 id.

directa a

- 105V

Incubaram-se 100de mAb purificado com 500 uCi de Na r (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) e 40ycg de cloramina-T em 500ytl de PBS a 4°C durante três minutos. 0 mAb marcado separou-se do ²I livre por filtração de gel numa coluna de Sephadex G-25; a actividade específica foi de aproximadamente 4xl0^cpm/ g. Diluíu-se o mAb marcado em 15% de FCS em PBS antes da utilização.

Para um ensaio de ligação directa de ¹²^I-Ab2, 100 jjú. de vários mAb purificados (50y/g/ml) em NaHCO^ 15mM a pH 9 colocaram -se em placas com 96 cavidades (Dynatech, Alexandria, VA) a 4°C durante a noite. Depois de lavagem, bloquearam-se as cavidades por incubação durante a noite a 4°C com 200JaI de meio RPMI 1640 contendo 15% de FCS. Lavaram-se as placas três vezes com tampão

PBS-Tween, e adicionaram-se 2,5x10 cpm de Ab2 marcado em 100y<l de FCS a 30% a cada cavidade e incubaram-se â temperatura ambien te durante 1 hora. Depois de lavagem completa, dissolveu-se a radioactividade ligada, em 100^1 de NaOH 2M, transferiu-se para tubos de ensaio, e contou-se·num contador Gama (Beckman, Irvine, CA).

7.1.11 Conjugação anticorpo-FITC

Conjugou-se isotiocianato de fluoresceína (FITC) com mAb MG-21 como descrito por Goding (Goding, J.W., 1976, J. Immunol. Methods 13:215-226). Logo a seguir, fez-se a diálise, de 2mg de MG-21 purificado durante a noite, em tampão de carbonato/bicarbonato 0,2M, pH 9,5. Adicionou-se o FITC (Molecular Probes Inc., Junction City, 0S) dissolvido em dimetilsulfóxido (lmg/ml), numa /

- 106

proporção de 40 ^g EIIC/mg de anticorpo. Incubou-se a mistura a 37 C durante 45 minutos, depois do que o mAb conjugado se separou do EITO livre por passagem através de uma coluna G-25 Sephadex equilibrada com PBS contendo NaN^ a 0,1%. A proporção conju gação de anticorpo/fluoresceína foi de cerba de 3,5 a 4,0. 0 mAb conjugado armazenou-se a -20°G em PBS contendo 1% de albumina de soro de bovino (BSA).

7.1.12 Análise de separador de células activadas por fluorescência

Para a análise de inibição de ligação utilizando um separa dor de células activadas por fluorescência (EACS), incubaram-se 100 /íl de MG-21 conjugado com EITO durante 30 minutos a 37°G com 100yzl de várias concentrações de Ab2 purificado ou anticorpos de controlo em 10% de soro de murganho normal» Adicionaram-se então *

as misturas de anticorpo a tubos de ensaio contendo 1x10 de células ET—2666 fixadas com para-formaldeído em 100^ul de PBS. Depois de 30 minutos de incubação, lavaram-se as células duas vezes com PBS, e depois analisaram-se com um separador de células activadas por fluorescência, Coulter Epics C (Coulter Corporation, Hialeah, EI). Expressaram-se os resultados em equivalência de fluorescência linear (LEE), que representa a intensidade de fluo rescência relativa.

7.1.13 Ensaio de citotoxicidade dependente do complemento

Para testar se o Ab2 específico para MG-21 podia inibir a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de mAb MG-21, utilizou-se um ensaio de libertação de 51Cr de 4 horas (Hells- ΙΟΊ -

trom, 1,, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:1499-15u2). Logo a seguir, marcaram-se 10^ células alvo com 100 Ci de ^^Cr durante duas horas a 37°C. Depois de marcadas, as células lavaram-se três vezes, suspenderam-se de novo em meio RPMI 1640 contendo FGS a 15%, e suspenderam-se 20.000 células marcadas em 45yAl de meio RPMI 1640, e semearam-se em cada uma das ca vidades de placas de fundo em V Microtiter (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA). Combinaram-se várias concentrações de MG-21 purificado com diferentes concentrações de Ab2 purificado (ou mAb de controlo) para testar a inibição de CDC. Estes adicio naram-se em 90yíl por cavidade seguido de 65y/1 de soro humano não aquecido,·não diluido. Depois de incubação durante 4 horas a 37°C, centrifugaram-se as placas a 400x g, removeram-se 100yd de sobrenadantes de cada cavidade, e determinou-se o nível de radio actividade com um contador Gama (Beckman, Irvine, CA). Definiu-se a libertação espontânea como o cpm libertado no meio a partir de células alvo que nãó tinham sido expostas a anticorpo ou a complemento, e a libertação total determinou-se como 0 cpm liber tado de células alvo que foram lisadas por osmose. Calculou-se a percentagem de citotoxicidade pela seguinte fórmula:

Libertação - Libertação

Percentagem de Experimental - Expontânea citoxicidade “---------—---x 100

Libertação - Libertação

Total Expontânea

- 108

7.1.14 Ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo

Para testar se o Ab2 pode inibir a citoxicidade celular de pendente de anticorpo (ADCC) de mAb MG-21, utilizou-se um ensaio de libertação de 4 horas. Utilizaram-se PBL· de seres humanos sau dáveis como células efectoras. Separaram-se em Ficoll-Hypaque e pré-sondades para a baixa actividade de célula assassina natural (EK). Apenas se utilizaram os linfécitos com baixa actividade EK (inferior a 10% de libertação de ^^Cr durante quatro horas). Depois de se marcarem as células alvo, colocaram-se em placas (2x10^ células/50y<l) microtituladores como para o ensaio CDC. Adicionaram-se 50y<l de MG-21 purificado e 50yVl de Ab2 purifica do (ou mAb de controlo) a várias concentrações, seguidos de 2x10^ linfécitos por cavidade em 50 /1 de meio; a proporção entre linρ Λ focitos e células alvo foi de 100:1. Incubaram-se as misturas, centrifugaram-se as placas, e transferiram-se 100yzl de sobrenadanfces de cada cavidade para medição da radioactividade. Calculou-se a percentagem de citotoxicidade como para o ensaio CDC.

7.1.15 Ensaio de competição para detecção de anticorpos anti-MG-21 em soros de doentes

Desenvolveu-se um ensaio de competição utilizando anticorpos anti-idiotípicos monoclonais (Ab2) como uma prova para a detecção de anticorpos anti-Mg-21 em soros de doentes tratados com mAb MG-21. Logo de seguida, adicionaram-se 100de Ab2 Í5yfg/ml) em tampão de HaHCO^ 15mM, pH 9, a cada cavidade de placas de ensaio de pré-ligação Ealcon (Becton Dickinsm, Oxnard, CA), incuba — 109

ram-se â temperatura ambiente durante 1 hora, e subsequentemente lavaram-se com tampão PBS-Tween. Pré-incubaram-se 75 /(1 de mAb MG-21 (lytg/ml) durante 45 minutos com iguais volumes de soros de um paciente ou com uma ”pool” de soros humanos normais; dilui ram-se os soros a 1:2,5, 1:5 e 1:10 em PBS. Subsequentemente, adicionaram-se 100y<l das misturas âs placas revestidas de Ab2. Depois de uma incubação adicional durante 30 minutos â temperatu ra ambiente, lavaram-se as placas duas vezes com tampão PBS-Tween. Diluiram-se 100 y4L de anticorpo anti-IgG3 do rato desenvolvido no coelho conjugado com peroxidase (Zymed Laboratories Inc.,

South San Francisco, CA), a 1:1.000 em tampão PBS-Tween, lavaram -se e incubaram-se durante 30 minutos ã temperatura ambiente. Depois de três lavagens com tampão PBS-Tween encheram-se as cavi dades com 100^1 de substrato OPB contendo 0,015$ de Η₂θ2 ^em ^°fato citrato, pH 5,0. Cinco minutos mais tarde, adicionaram-se 100yíil de H^SO^ θ leram-se as placas num leitor de microplacas CSC. Galculou-se a percentagem de inibição da ligação de MG-21 a mAb pela fórmula seguinte:

D0 na presença de soro

Percentagem de inibição-(l - -2—---) _x ^qq

D0 na presença de soro humano normal

Testaram-se por este ensaio amostras de soro de três a oito pacientes com melanoma avançado, que se associaram numa fase I de uma experiência de mAb MG-21. Logo de seguida, introduziu-se MG-21 em albumina de soro humano, nestes pacientes, duran te um período de tempo de 4-6 horas, sendo as introduções repe- 1Γ

tidas diariamente durante 7 dias. Recolheram-se as amostras de soro antes do tratamento e a vários intervalos depois, e armazenaram-se a -80°C para análise.

7.2 Resultados

7.2.1 Selecção de hibridomas

Fundiram-se células do baço de murganhos, imunizados com MG-21, com células N.S-1 para gerar hibridomas que podiam produzir mAb para determinantes idiotípicos em MG-21; os últimos mAb são referidos como Ab2. Duas semanas depois da fusão, testaram-se os sobrenadantes de hibridoma para a inibição da ligação de anticor pos MG-21 a células M-2669. Clonou-se e desenvolveu-se um hibridoma, 2C1, que tinha aquela actividade. Como apresentado na Figu ra 7, o sobrenadante do hibridoma 2C1 inibiu fortemente a ligação de MG-21 a células M-2669 mas não se ligou ele próprio ás cé lulas M-2669. Utilizou-se o sobrenadante do mieloma NS-1 como um controlo e não inibiu a ligação de MG-21.

hibridoma 2C1 cresceu como um tumor de ascite, quando inoculado por via intraperitoneal num murganho BALB/c sensibilizado com pristano. Verificou-se que o mAb 2C1 era um IgG2 por meio de um imuno-ensaio de enzima de fase solida com anti-soros de classe específica para anti-Ig de murganho desenvolvido em ca prino.

Como apresentado na Figura 8, o mAb 2C1 proporcionou uma ligação forte a MG-21 quando testado por ELISA a concentrações entre 0,08^Ag/ml e 2y/g/ml, observando-se ainda uma ligação signi ficativa a 6,4 mg/ml. Νέο se verificou qualquer ligação a P1.17,

- 111

uma proteína de mieloma de IgG2a (Fig.8).

7.2.2 0 mAb 2G1 é específico para MG-21

Para determinar o grau de especificidade de 2G1 para MG-21, 125 realizou-se um ensaio de ligação utilizando 2C1 marcado com I. Seis mAbs de murganho, que se tinham gerados contra uma variedade de tumores humanos, incluiram-se como controlo. Como se mostra na Figura 9, os mAbs 2C1 ligaram-se fortemente a MG-21 mas nao a qualquer dos seis mAbs de controlo, dois dos quais (2A-14 e 96.5) eram específicos para antigénios associados a melanoma que eram diferentes do epítopo reconhecido pelo MG-21. Destes dois mAbs, 2A-14 reage com um epitopo do antigénio GD3 o qual é diferente do reconhecido pelo MG-21.

7.2.3 0 mAb 2C1 (Ab2) inibe a ligação de MG-21 (Abl) a células M-2669 e a antigénio GD3 de um modo Dependente da dose

Utilizou-se um ensaio de ligação para dosear quanto mAb 2C1 era necessário, como Ab2, para inibir a ligação de MG-21 (Abl) a células M-2669. Como se mostra na Tabela IX, os mAb 2C1 inibiram completamente a ligação de MG-21 a células M-2669, quando presentes a uma concentração igual ou superior ã de MG-21; duas imunoglobulinas de controlo, mAb 26.8 e P1.17,,não proporcionaram inibição significativa.

- 112

TABELA IX

EFEITO INIBITÓRIO DEPENDENTE DE DOSE DE mAb 2Cl NA LIGAÇÃO DE mAb MG-21 A CÉLULAS

M-2669
Concentração		Concentração	Absorvância
de Anticorpo 1		de Anticorpo 2	a 492/630 nm^
MG-21	(2.5/tg/ml)		Nenhuma	0.324 £ 0.015²
MG-21	(2.5 yUg/ml)	mAb	2C1 (10 /fg/ml)	0.071 £ 0.029*
MG-21	(2.5 /tg/ml)	mAb	2C1 (5/g/ml)	0.043 £ 0.026*
MG-21	(2.5 ytg/ml)	mAb	2C1 (2.5/g/ml)	0.053 £ 0.002*
MG-21	(2.5 ywg/ml)	mAb	2C1 (1.25 /(g/ml)	0.129 - 0.019**
MG-21	(2.5 yxg/ml)	mAb	2C1 (0.625 yíg/ml)	0.156 £ 0.023**
MG-21	(2.5 y-ig/ml)	mAb	26.8 (10^/íg/ml)	0.305 £ 0.007
MG-21	(2.5 ^ug/ml)	mAb	26.8 (5y»g/ml)	0.329 £ 0.035
MG-21	(2.5 ytg/ml)	mAb	26.8 (2.5yixg/ml)	0.315 £ 0.024
MG-21	(2.5 ywg/ml)	mAb	26.8 (l.25y,g/ml)	0.337 £ 0.035
MG-21	(2.5 ^kg/ml)	mAb	26.8 (0.625j^g/ml)	0.330 £ 0.036
mG-21	(2.5 /<g/ml)	P1.17 (10/zg/ml)	0.322 £ 0.049
mG-21	(2.5 yxg/ml)	pi.:	17 (5y,g/ml)	0.368 £ 0.019
MG-21	(2.5 yxg/ml)	Pl.	17 (2.5 /ig/ml)	0.331 £ 0.019
mG-21	(2.5 y<g/ml)	Pl.:	17 (1.25^wg/ml)	0.318 £ 0.035
mG-21	(2.5 yzg/ml)	Pl.	17 (0.625yug/ml)	0.318 £ 0.031

Os resultados apresentam-se como a media - SE o

Controlo

Diferenças estatisticamente significativas de controlo sem Ab2, P inferior a 0.01;*^, P inferior a 0.025.

- 115

Num estudo paralelo, utilizou-se GD3 purificado, que é o antígeno reconhecido pelo MG-21, em vez de células de M-2669. 0 mAb 2C1 inibiu a ligação de MG-21 ao gangliosido GD3 purificado de uma maneira dependente da dose (Tabela X)

TABELA X

EFEITO INIBITÓRIO DEPENDENTE DE DOSE DE mAb 2Cl NA LIGAÇÃO DE mAb MG-21 AO ANTIGÉNIO GANGLIOSIDICO GDJ

Concentração de Anticorpo 1	Concentração de Anticorpo 2	Absorvância
a 490	nm/630 nm^
MG-21 (2.5/g/ml)	Nenhuma	0.486	i 0.092²
MG-21 (2.5 yíg/ml)	mAb 2Cl (25y/g/ml)	0.085	± 0.006*
MG-21 (2.5 yUg/ml)	mAb 2C1 (12.5yUg/ml)	0.073	± 0.010$
MG-21 (2.5 y<g/ml)	mAb 2C1 (6.25yyg/ml)	0.075	•± 0.008*
MG-21 (2.5 yig/ml)	mAb 2Cl (3.125/íg/ml)	0.379	± 0.009
MG-21 (2.5 yig/ml)	mAb 2C1 (l. 563yxg/ml)	0.502	± 0.075
MG-21 (2.5 yxg/ml)	mAb 2C1 (0.782y<g/ml)	0.482	± 0.033
MG-21 (2.5 y<g/ml)	mAb 2C1 (0.391 y<g/ml)	0.533	± 0.078

“Gs resultados apresentam-se com média ± SE_O p

Controlo

Diferenças estatisticamente significativas do controlo sem Ab2, *, P inferior a 0.01.

- 114 Confirmou-êe o efeito inibitório de mAb 2C1 na ligação de MG-21 a células M-2669 por análise PAGS utilizando MG-21 conjugado com FITO. Partindo com 40^Ag/ml de MG-21 conjugado com FITC, que correspondia aproximadamente á concentração de saturação, adi cionaram-se quantidades em excesso de mAb 2C1 ou anticorpos de controlo a células M-2669. A Figura 10 mostra que o 2C1 inibiu completamente a ligação de MG-21 conjugado com FITC a células de tumor, enquanto os anticorpos de controlo não tinham qualquer efeito.

7.2.4 0 anticorpo 2C1 inibe a actividade CDC e ADCC de MG-21 contra células M-2669

Experiências anteriores mostraram que o MG-21 proporciona CDC e ADCC forte com células de melanoma GDJ-positivas (Hellstrom, I., et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:1499-1502). Testou-se então se 2C1 tinha qualquer efeito nestas actividades. Como se mostra na Tabela XI, a CDC de MG-21 foi completamente anu lada pela adição de mAb 2C1 a uma concentração superior a de KG-21, mas não por adição dos dois anticorpos de controlo, mAb 26.8 ou P1.17.

TABELA XI

INIBIÇÃO DE CDC DE mAb MG-21 CONTRA CÉLULAS M-2669 POR mAb 2C1
Concentração final de anticorpo 1	Concentração final de anticorpo 2	Citotoxicidade
MG-21 (5 /g/ml)	Nenhuam	100 (controlo)
MG-21 (5 /g/ml)	mAb 2 Cl (10 yUg/ml)	2*
MG-21 (5 /g/ml)	mAb 2C1 (lyjg/ml)	84
MG-21 (5ytg/ml)	mAb 2C1 (0.1 ^g/ml)	100
MG-21 (5 jug/ml)	mAb 26.8 (l0y<g/ml)	100
MG-21 (5 yíg/ml)	mAb 26.8 (l^fg/ml)	100
MG-21 (5 ^ug/ml)	P1.17 (10/íg/ml)	100
MC-21 (5 /g/ml)	P1.17 (1 /(g/ml)	100
MG-21 (1 y/g/ml)	Nenhuma	64 (controlo)
MG-21 (1 /íg/ml)	mAb 2C1 (l0y<g/ml)	1*
MG-21 (1 Jfg/ml)	mAb 2C1 (ly<g/ml)	0*
MG-21 (1 ytg/ml)	mAb 2C1 (0.1 yíg/ml)	56
MG-21 (lyig/ml)	mAb 26.8 (10y/g/ml)	69
MG-21 (ijqg/ml)	mAb 26.8 (ly<g/ml)	60
MG-21 (ly/g/ml)	P1.17 (10 yUg/ml)	67
MG-21 (l ^ug/ml)	P1.17 (1 ^g/ml)	69

** *51 ^Determinou-se a citotoxicidade num ensaio de libertação de 'cr de 4 horas utilizando soro humano normal como uma fonte de complemento. Nao se verificou qualquer citotoxicidade com soro humano isolado. Os anticorpos isolados não originaram qualquer citoto f - nè'xicidade. Determinou-se a significãncia pelo teste t de Student e é indicada por*, P inferior a 0,01.

anticorpo 2d inibiu também completamente a actividade de ADCC de MG-21 contra células M-2669 quando a sua concentração era superior ã de MG-21, enquanto não se verificou qualquer inibição significativa com os dois anticorpos de controlo (Tabela XII).

J

- 11'

TABELA XII

INIBIÇÃO DE ADCC DE mAb MG-21 CONTRA CÉLULAS M-2669 POR mAb 2 Cl

Concentração final de anticorpo 1	Concentração final de anticorpo 2	Citotoxicidade^ %
MG-21 (5/íg/ml)	Nenhuma	40 (controlo)
MG-21 (5/g/ml)	mAb 2C1 (10 ^g/ml)	4#
M’G-21 (5 /g/ml)	mAb 2C1 (l/g/ml)	16*
MG-21 (5/g/ml)	mAb 2C1 (0.1 /g/ml)	33
M'G-21 (5 /g/ml)	mAb 26.8 (10ytg/ml)	44
MG-21 (5 ytíg/ml)	mAb 26_O8 (l ^g/ml)	40
MG-21 (5 ytg/ml)	Pl.17 (10/g/ml)	34
MG-21 (5 /g/ml)	Pl.17 (1 /g/ml)	39
MG-21 (1 yUg/ml)	Nenhuma	32 (controlo)
MG-21 (1 ^wg/ml)	mAb 2C1 (10ytg/ml)	7*
MG-21 (1 /g/ml)	mAb 2C1 (lyjg/ml)	3*
MG-21 (1 yíg/ml)	mAb.2Cl (O.ly/g/ml)	16*
MG-21 (l jug/ml)	mAb 26.8 (10 ^ug/ml)	26
MG-21 {1 /g/ml)	mAb 26.8 (ly/g/ml)	23
M'G-21 (1 /íg/ml)·	Pl.17 (10 /(g/ml)	28
MG-21 (1 y/g/ml)	Pl.17 (1 /g/ml)	23
“'Determinou-se a citotoxicidade num ensaio de	libertação de ^^dCr
de 4 horas utilizando	linfocitos de sangue periférico humano nor-
mal como efectores. A	proporção entre células	efectoras e células
alvo foi de 100:1. us	anticorpos isolados não	originaram citotoxi

- 118 cidade e linfócitos isolados originaram 6,9% de citotoxicidade. As diferenças significativas comparadas com o controlo sem Ab2 calcularam-se pelo teste t de Student,*, P inferior a 0,01.

7.2.5 Detecção de anticorpos anti-MG-21 em soros de doentes utilizando mAb 201 como uma sonda

Uma vez que o mAb 2C1 é específico para MG-21, ele pode utilizar-se como um reagente para detecção de anticorpos anti-MG-21 humanos em soros de doentes tratados com KiG-21e Desenvolveu-se um ensaio de competição (ver secção 7.1.15, supra), pelo qual se testou se soros de qualquer de 3 pacientes injectados com MG-21 inibiam a ligação de EG-21 a mAb 201. Como se mostra na Tabela XIII, soros obtidos destes três pacientes 17,18 ou 21 dias, respectivamente, (ou mais tarde) depois da administraçao de MG-21, inibiram fortemente a ligação de MG-21 a mAb 2C1 com 20-83%. © pré-tratamento dos soros originaram menos do que 13% de inibição quando comparado com uma pool de soros recolhido 'de seres humanos normais.

- 119 Doente

No.

TABELA XIII

INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DE mAb MG-21 A mAb 2C1

POR SOROS DE DOENTES QUE RECEBERAM mAb MG-21

Dose de MG-2l/dia Dias depois de se % de inibição „ $ · · · para 7 dias iniciar mento do mg/M²/dia 0 mg/M²/dia 0 mg/M²/dia 0

127 o trata- de ligação

!o5	1:5	1:10
0	0	0
58	53	33
60	58	43
65	62	47
83	87	85
10	12	0
55	46	31
53	32	25
62	46	20
59	32	27
6	13	2
28	21	20
30	30	26
45	31	15
77	60	45
73	50	43

- 120

Pacientes que receberam perfusao de 4 a 6 horas de MG-21 diaria· mente durante 7 dias nas doses referidas. Retiraram-se amostras de soro em várias alturas depois do início do tratamento.

Amostras de soro diluiram-se a 1:2,5, 1:5 θ 1:10 em PBS.

anticorpo mAb 2C1 anti-idiotípico, que se descreve aqui, reconhece um idiotipo específico para um antigénio gangliosídico GB3 associado a melanoma humano. Verificou-se que o mAb 2C1 se li ga a mAb MG-21 mesmo a uma concentração baixa (0,08 mas nao a outro mAb do mesmo ou de diferente isotipos. Ele inibiu, numa maneira dependente da dose, a ligaçao de MG-21 ao antigénio gangliosídico GDJ, assim como a células de melanoma M-2669 GD3-po sitivas. Além disso, o mAb 201 anula completamente as actividades CDC e ADOC de mAb MG-21, contanto que a sua concentração seja superior ã de MG-21.

Utilizando mAb 201 como uma sonda, desenvolveu-se um ensaio para anticorpos anti-MG-21 humanos em soros de pacientes tratados com MG-21. Podem desenvolver-se ensaios análogos para outros tipos de anticorpos anti-tumor. Uma vez que anticorpos humanos liga dos a MG-21 estão presentes em períodos curtos (14-21 dias) depois do tratamento de pacientes com MG-21, excepto íe tais anticorpos forem altamente eficazes na indução de uma resposta imunológica que origine a rejeição do tumor, podem-se prever procedimentos que minimizem o desenvolvimento de tais anticorpos para utilização quando se deseja o tratamento prolongado de pacientes por administração de anticorpos anti-tumorais.

- 121

8. ANTICORPOS ANTI-IDIOTIPICOS MONOCLONAIS RELACIONADOS COM O

ANTIGÉNIO DE MELANOMA ?97

Produziram-se anticorpos anti-idiotípicos monoclonais (Ab2) relacionados com o antigénio p97 de melanoma humano. Isto realizou-se por imunização de murganhos BALB/c com 96»5, um anticorpo monoclonal (mAb) específico para epitopo p 97^a, hibridação de células de baço de murganho com células de mieloma NS-1, e selecção de hibridomas que produzem anticorpos que se ligam a fragmentos Fab preparados de mAb 96.5 (Fab 96.5)» Testou-se o Ab2 para a ligação a mAb 96.5 e a mAb definindo outros epitopos do antigénio p97, assim como para a sua capacidade para inibir a ligação entre mAb 96.5 © p97» Identificaram-se três Ab2 monoclonais que inibiam competitivamente a ligação entre p97 e mAb 96.5. Quando se injectaram em murganhos BALB/c ou C3H/HeN, dois deles induziram Ab3 que expressaram 0 mesmo idiotipo que mAb 96.5 e que eram específi cos para p97. Estes dois Ab2 comportaram-se assim como imagens internas” de p97»

8.1 Materiais e Métodos

8.1.1 Animais

Utilizaram-se neste estudo murganhos fêmeas BALB/c e C^H/HeN com aproximadamente 6 a 8 semanas de idade.

8.1.2 Células de melanoma humano

Utilizou-se uma linha SK MEL-28 como uma fonte de células alvo positivas de antigénio p97» Cada célula SK-MEL 28 expressa, na sua superfície, aproximadamente 4OO0OOO moléculas de p97.

122*-=

8.1.3 Células de melanoma de murganho

Utilizaram-se célulaê de melanoma de murganho (C57BL) B16, que tinham sido transfectadas com o gene p97 Flowman, G.D., 1986, Characterization and expression of the melanotransferrin (p97) gene, Ph.D. dissertation, University of Washington) para produzir antigénio p97 solúvel. Utilizou-se também uma linha de células (2A) da linha K-1735-M2 de melanoma de murganho C3H/HeN (Fidler,

I.J. and Hart, I.R., 1981, Câncer Res. 41:3266-3267) que, após ~ 6 transfecçao com o gene para p97, expressa aproximadamente 10 de moléculas de p97 por célula. As células K-1735-M2, com deficiência completa de p97, são referidas como células mãí (par), uma vez que a linha 2A é derivada destas.

8.1.4 Anticorpos

Utilizaram-se neste estudo sete mAb de antigénio p97 associado a melanoma humano (Brown, J.P., et al., 1981, <J. Immunol. 127:539-546). Foram definidos tres epitopos de p97 por utilização deste mAb em ansaios de inibição de ligação competitivos, nomeada mente p97^a (por mAb 96.5 o 4.1)» p97^ (por mAb 118.1, 133,1» θ 133·3)» e P97° (por mAb 8.2 e 133°2). ΰ hibridona 96.5, que produz um mAb para o epitopo 97^a» obteve-se por fusão de células de baço de um murganho BALB/c imunizado com células de mieloma NS-l (id.). Fizeram-se fragmentos Fab de mAb 96.5 por digestão com papaina e são referidos como Fab 96.5 (id.). 0 mAb F6 é uma IgG2a especifica para um antigénio proteoglicano de células de melanoma humano. Este utilizou-se para preparar fragmentos Fab (referidos como Fab F6) que se utilizaram como controlo.

A fim de se desenvolver anti-Id, injectaram-se murganhos 3ALB/c subcutâneamente com lOOytg de mAb 96.5 purificado que se tinha conjugado com hemocianina de molusco (KLH), e subsequentemente misturado com adjuvante completo de Freund (Bacto H37Ra, Difco Labs, Betroit, Ml). Um mês mais tarde, injectaram-se por via intraperitoneal com a mesma quantidade de mAb 96.5 conjugado com KLH em adjuvante incompleto de Freund (Difco). Subsequentemente injectaram-se os murganhos com mAb 96.5 em solução de clore to de sódio em intervalos de 2 semanas, mais uma ou duas vezes. Três dias depois da última injecção, sacrificaram-se e preparou-se uma suspensão de células de baço que se fundiram com células de mieloma de murganho NS-1, utilizando técnicas padrão (Kohler,

G. and Milstein, C., 1975, Nature 256:495-497).

θ.1·5 Sondagem de hibridomas

Realizou-se uma sondagem primária por ELISA-(Kohler, G. and Milstein, C„, 1975, Nature 256:495-497). Colocaram-se os Fab ’ 96.5, a uma concentração de 4ygg/ml em solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato (PBS), em placas Immunolon (Dynatech Laboratories, Chantilly VA). No dia seguinte, lavaram-se as placas com PBS contendo 0,05$ de Tween 20 e ”bloquearam-se” por incu. bação durante 1 hora com PBS contendo 0,05$ de Tween e 1% de soro fetal de vitela (FCS). Adicionaram-se sobrenadantes (50y#L) de ca da cavidade com células de hihridoma em crescimento. Uma hora mais tarde, adicionou-se uma mistura, contendo IgGl anti-murganho de caprino (Zymed, 'San Francisco, CA) que se tinha acoplado com peroxidase de rábano (HRP), 0,05$ de Tween 20, e 1$ de FG3 em·PBS. nepois de 1 hora de incubação, a ligação do anticorpo a Fab 96.5

- 124 colocado em placas, detectou-se por adição de O-fenilenodiamina (OPD) de acordo com as indicações do fabricante (Zymed). Leram-se as placas num leitor de microplacas automático (Genetia Systems Corporation, Seattle, HA) a uma absorvância de 492 nm/630 nm. Uti lizaram-se os fragmentos Fab de mAb F6 como controlo, e retiveram -se apenas os hibridomas que produziam mAb que se ligavam a Fab 96.5, mas não a Fab F6, para posterior teste. A utilização de pro cedimentos de sondagem detectou apenas hibridomas que produziam anticorpos de IgGl.

Para testar ainda os sobrenadantes para a actividade, utili zou-se um ensaio em que se diluíram duas vezes os sobrenadantes, combinaram-se com uma parte de mAb 96.5, e adicionaram-se a cavidades Immunolon nos quais se tinham colocado Fab 96.5. Depois da adição de IgG anti-murganho desenvólvido em caprinos e ΟΡΌ, deter minou-se a capacidade dos mAb 96.5 adicionados para evitarem a li gação dos sobrenadantes aos Fab plaqueados. Utilizou-se também este ensaio para testar a ligação de anti-Id a mAb definindo epitopos p97 diferentes de p97 .

Os hibridomas que produzem anticorpos que se ligam a Fab 96.5 mas nao a Fab F6 clonaram-se duas vezes por diluição limitan te, depois do que se desenvolveram e injectaram em murganhos SALB/c sensibilizados com pristano para produção de ascites.

θ· 1·6 Estudos em anticorpos anti-idiotipicos purificados

Purificaram-se Ab2 por precipitação com sulfato de amónio saturado (Mishell, B_o and Shiigi, S., 1979, in 'Select Methods in Gellular Immunology, H.H. Freemen & Co., pp. 278-281). Para iden-

tificar anti-Id que possa interferir com a ligação de mAb 96.5 a p97, plaquearam-se células de melanoma SK MEL-28 a 10^ células por cavidade/tubo. Misturaram-se Ab2 purificados com mAb 96.5 (ly/g/rnl). Detectou-sa a inibição de ligação de mAb 96.5 às células de melanoma, por adição de um confugado de HRP anti-murganho desenvolvido na cabra como referido antes. Realizaram-se também vários testes deste tipo em sobrenadantes de hibridoma.

Para estudar se Ab2 purificados podiam bloquear o sítio de ligação de Eab 96.5 ao antigénio, adicionaram-se várias concentra ções de Ab2 a cavidades de placas Immunolon nas quais se tinha plaqueado Eab 96.5. 0 antigénio p97 isolado de células de melanoma de murganho Bl6 transfectadas foi maçado iodo radioactivo (Rose, T.M., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83:1261-1265)? adicionaram-se 2 x 10^ cpm de p97 marcado, e determinou-se o numero de contagens de ligações por cavidade.

8.1.7 Competição de n97 rádio-marcado para a ligaçao a fragmentos Eab de mAb 96.5

Misturaram-se várias concentrações de Ab2 purificado com uma , 125 quantidade constante de antigénio p97 marcado com I, e plaquea ram-se as misturas em placas previamente revestidas com Eab 96.5. Depois de uma hora, lavaram-se as placas, adicionou-se NaOh 2N, e contaram-se os conteúdos das cavidades num contador gama.

8.1.8 Investigações sobre Ab3 in vivo

Injectaram-se murganhos fêmeas BALB/c e C3H/HeN, de 6 a 8 semanas de idade, por via intraperitoneal (i.p.) com 50yzg de Ab2 conjugado com KLH e misturado com adjuvante completo. Cinco dias

X

>

- 126 mais tarde, aqueles foram inoculados por uma injecção de Ab2 em adjuvante incompleto e subsequentemente injectados com Ab2 em solução de cloreto de sódio em intervalos de 5 dias. Depois de um total de 4 e 6 imunizações, respectivamente, sangraram-se os murganhos que continuaram a ser inoculados, com intervalos de 2 sema nas, durante várias semanas. Em alguns casos, o protocolo de imu-, nização iniciou-se com intervalos de 2 semanas com 4 a 5 inoculações .

Nos soros dos murganhos imunizados doseou-se a presença de anticorpos ligados a Ab2 e referidos como Ab3, mediante mistura dos soros diluídos com Ab2, e adição da mistura em placas Immunolon previamente revestidas com Fab 96.5 {como Abl), depois do que se adicionou IgGl anti-murganho de caprino conjugado com HRP e OPD. Os resultados expressaram-se sob a forma da percentagem de inibição da ligação de Ab2 a Abl. Calcularam-se por determinação do valor do D.O. (densidade óptica) para -^Ab3 Ab2), dividindo-o pelo valor de D.O. para Ab2 isolado, e substraindo o cociente de

100.

Testaram-se também os soros para a ligação de Ab3 ao antigénio p97. Plaqueou-se p97 purificado em placas Immunolon a 5 y/g/ml em PBS e deixou-se ficar durante a noite. Após o bloqueio, adicionaram-se soros diluídos, seguidos de um antisoro de caprino para a imunoglobulina de murganho que reagiu com IgG, IgM, e IgA, e se acoplou a HRP.

Utilizou-se também um ensaio de inibição de fase sólida, no qual se misturaram soros de murganho com células de melanoma de

L

- 127 - t murganho 2A que expressam p97 na superfície da célula, ou com células de melanoma de murganho (par), que não o fazem. Incubou-se primeiro a mistura durante 1 hora e então adicionou-se a placas Immunolon revestidas com o antigénio p97» Como anteriormente refe rido detectou-se a ligação por adição de OPD na presença de conjugados anti-murganho - HRP.

8.2 Resultados

8.2.1 Geração dá ligação de Ah2 a determinantes idiotípicos em mAb 96,5

Imunizaram-se murganhos BAEB/c com mAb 96.5, fundiram-se as células do baço, e fez-se a sondagem dos sobrenadantes de hibrido mas para anticorpos de IgGl para mAb 96.5, como descrito supra. Obtiveram-se aproximadamente 5.000 hibridomas de 8 fusões diferen tes. Verificou-se que sobrenadantes de 70 destes hibridomas se li gavam a Eab 96.5 e não se ligando a Eab E6 de controlo; considerou-se, portanto que muitos dos hibridomas dos quais eles derivaram, produziam Ab2. Clonaram-se sete destes hibridomas, e os mAb que eles produziram purificaram-se e testaram-se para a ligação a Eab 96.5 como se mostra na Eigura 11, os mAb produzidos pelos sete hibridomas ligaram-se a Eab 96.5, embora houvesse variação entre Ab2 nos valores de ligaçao observados a concentrações elevadas de anticorpo. Nenhum mAb se ligou a Eab E6₀

8.2.2 Testes da especificidade de Ab2 para o sitio de ligação de mAb 96.5 a antigénio

Investigou-se se qualquer dos sete Ab2, cujos dados se apre sentam na Eigura 11, identificavam o sítio de ligação de mAb 96.5

- 125 ao antigénio. Primeiro, mediu-se a capacidade do mAb para inibir a ligação de mAb 96.5 ao antigénio p97 expresso pelas células SK ΜΞΙ-28; o que se executou como descrito na Secção 8.1.6. Três cios sete Ab2, ^/5? 4/5 e 4/7? inibiram fortemente esta ligação, enquanto dois Áb2 (4/4 e 4/6) originaram uma inibição fraca, e dois Ab2 (//1 e 4/2) não originaram inibição (Fig. 12).

Segundo, estudou-se a capacidade dos sete Ab2 para competirem com p97 solúvel na ligação a mAb 96.5. Misturaram-se várias diluições de cada Ab2 com p97 marcado com iodo radioactivo e determinou-se a ligaçao de p97 a Fab 96.5 num ensaio de fase solida (Fig. 13)« Os anti-Id 4/5? 4/5? e 7=τΊ competiram com p97 radio-iodado enquanto os outros quatro anti-Id (//l, 4/2? 4/4? //6) nao competiram. Os resultados eram, assim, semelhantes aos apresentados na Figura 12.

Terceiro, demonstrou-se que os mesmos tres Ab2 com a capaci dade para competirem com p97? nomeadamente 4/5? 4r5? e 4/7? podiam bloquear os sítios de ligação de Fab 96.5 ao antigénio de mo do a diminuir entre 50 a 60$ da ligaçao de p97 rádio-iodado a Fab 96.5 (Fig. 14). Um Ab2? 4/2? originou 25$ de inibição desta ligação, e os três Ab2 restantes (44l? 4r4? //6) originaram entre 0-10$ de inibição.

Os dados sugeriram, assim, que três Ab2, 4/5? 445? θ ΨτΖ foram susceptiveis de mimetizar 0 epitopo de p97 como uma imagem interna. Contudo, existia ainda a possibilidade de que 0 impedimento estérico fosse responsável pelos efeitos observados. Testou-se, portanto, a capacidade do Ab2 para induzir uma respos- 129 ta de Ab3 in vivo, como descrito na secção 8.2.4» infra.

8.2.3 Análise de ligação de Ab2 a uma série de mAb que especificam epitopos p97 diferentes de p97^a

Seleccionaram-se para estudo sete mAb para p97° D® acordo com ensaios de medição de inibição competitiva da ligação de mAb a células p97-positivas» os sete mAb identificaram três epitopos diferentes no antigénio p97 (Brown, J.P., et al.» 1981, J. Immunol. 127:53-546)? nomeadamente p97^a (mAb 4.1 e mAb 96.52? p97^ (mAb 118,1, mAb 133.1» mAb 133.3» ® mAb 8.2) e p97° (mAb 133.2).

mAb 133.3 é uma lgG2b, os mAb 4.1 e 8.2 são IgGl, e os outros mAb são IgG2a, excepto 4.1 e 8.2 que são IgG21.

Nas experiências apresentadas na Figura 15» misturaram-se cada um dos 5 mAb de IgG2a com o Ab2 a testar, e adicionaram-se a placas revestidas com Fab 96.5» seguido da adição de IgGl-HPP de anti-murganho caprino para se detectar a ligação do respectivo Ab2 a Fab 96.5. Gomo se mostra na Figura 15» o mAb 133.3 inibiu a ligação de seis dos Ab2 testados (^1, %/3» ^4, j^/5» í^6, e %%7) a Fab 96.5 (Fig. 13)» a inibição foi, aproximadamente, do mesmo grau do verificado com mAb 96.5. A ligação de 442^ que tal como 0 outro Ab2 se tinha seleccionado para a ligação a mAb 96.5» não foi inibida. Os mAb 118.1, 133.1» e 133.2 não inibiram a ligação de qualquer dos Ab2 testados.

Utilizou-se um ensaio diferente para analisar 0 grau de ligação entre 0 Ab2 e vários mAb anti-p97 do isotipo IgGl, e 0 efei to de qualquer destas ligações na subsequente ligação de p97 rádio-marcado com o mAb anti-p97. Testaram-se os dois mAb anti-p97

- 130

de IgGl, 4.1 e 8.2, assim como mAb 96.5® Plaqueou-se cada Ab2 em placas, adicionaram-se várias concentrações de mAb 8.2, mAb 4.1, ou mab 96.5, e mediu-se a ligação do mAb anti-p97 a p97 marcado com iodo radioactivo (Fig. 16). Três Ab2, 7^3, //5, e //7, interferiram com a ligação de mAb 96.5 a p97 (de acordo com os resulta dos descritos na secção 8.2.2, supra). enquanto os outros quatro Ab2, //l, //2, //4, e #6, não interferiram. Nenhum dos Ab2 se li gou a mAb 8.2 ou mAb 4.1® Nepetiu-se a experiência, testaram-se o mAb 135.1 θ mAb 133®3 em paralelo com mAb 96.5, uma vez que os da dos apresentados na Fig. 15 mostravam que o mAb 133.3 (mas não 133.1) podia ligar-se a Ab2. A Figura 17 mostra que os sete Ab2 testados se ligam a mAb 96.5 e 133°3® Em contraste, nenhum dos Ab2 se ligou a mAb 133.1°

Realizou-se um ensaio que demonstrava que seis dos Âb2 (com excepção de //2) impedia a ligação de mAb 133°3 a células de mela noma SK MSI-28. Em adição nenhum dos Âb2 podia inibir a ligação de mAb 4.1 ou 8.2 a células SK MEI-28. Nenhum dos sete Ab2 se ligaram a P1.17, uma proteína de mielona de IgG2a, ou aos dois mAb utilizados como controlo, 16 (um anticorpo anti-carcinoma IgG2a) ou MPG24 (um proteoglicano associado a um anticorpo de IgG2a de melanoma), ou a um anti-soro de caprino para IgG2b de murganho (Tabela XIV).

- 131 TABELA XIV mAb 96.5 INIBE A LIGAÇÃO DE ALGUNS Ab2 A jk.

Eab 96.5

Inibidor

Ab2 IgG2b de

Numero	PB'S	96.5	pl.17	MPG24	L6	caprino anti-murga nho
#1	0.961	0.125	0.941	0.993	0.876	1.026
rr2	1.074	0.514	0.942	1.064	0.953	1.049
#5	0.655	0.084	0.586	0.618	0.567	0.623
	0.649	0.066	0.629	0.674	0.611	0.743
	0.555	0.061	0.521	0.557	0.506	0.541
&&	0.447	0.091	0.436	0.443	0.418	0.551
	0.554	0.074	0.515	0.577	0.504	0.627

> Como detectado por ELISA, em que vários inibidores a 80yíg/ml se misturaram com Ab2 (0,4yíg/ml) e se adicionaram a placas reves tidas com Eab 96.5° Adicionou-se de HRP-IgGl de caprino anti-murganho ãs placas e incubaram-se durante 1 hora, seguido da adição de OPD. Mediu-se DO a 492 nm.

- 132 Consideradas em conjunto, estas descobertas indicam que os sete Ab2 testados se podiam ligar ao mAb 133o3? talvez no seu sítio de ligação ao antigénio, com excepção de rr2 que não se liga ao mAb 133.3 no seu sítio de ligação ao antigénio. (0 /72 liga-se, contudo, a mAb 133«3, aparentemente noutro sítio diferente do sítio de ligação ao antigénio; ver Figura 17)₀

8.2.4 Indução, de uma resposta Ab3

Testaram-se os sete Ab2 para a sua capacidade para induzir uma resposta anticorpo Ab3 em murganhos. Na primeira série de experiências, imunizaram-se murganhos singeneicos (BALB/c) com Ab2. Para muitas destas experiências, conjugou-se 0 Ab2 com KLH.

Depois da imunização com Ab2, testaram-se os soros dos murganhos para a presença de Ab3 detectável pela sua capacidade de se ligar a Ab2. Misturaram-se várias diluições dos soros de murga nho com 0 respectivo Ab2, e adicionaram-se a placas Immunolon revestidas com Fab 96.5 (como Abl). Utilizou-se então IgGl de capri no anti-murganho - HSP para detectar a ligação do Ab2 a Fab 96.5 (Tabela XV).

- 133 TABELA XV

INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DE Ab2 A Fab 96.5 (COXO Abl) POR SOROS DE MURC-ANHOS BALB/c QUE SE TINHAM INJECTADO COM O RESPECTIVO

J	Ab2 Numero	% de Inibição
9? 1 Sangria	2^a Sangr:
		90	96
		100	99
		96	97
		95	98
		85	100
		83	98
		82	96
J		86	87
	Hb	74	92
		75	94
	#6	0	89
		25	50
	Hl	73	91
		77	92

Os soros diluiram-se a 1:10. 0 Ab2 respectivo conjugou-se com KLH antes da injeeção em murganhos. Os dados são apresentados

134 para cada 2 murganhos/grupo e para 2 sangrias subsequentes dos murganhos.

Como se mostra na Tabela XV, o soro derivado exclusivamente da primeira sangria inibiu a ligação de Ab2 a Fab 96.5. A actividade inibidora aumentou depois de uma segunda inoculação.

Testou-se a seguir se os soros de ratos imunizados se podiam ligar a p97 (tal como um Abl). Plaqueou-se o antigénio p97 solúvel, e adicionaram-se soros de murganho diluídos (depois de bloqueamento) seguido de IgG de caprino anti-murganho - HfiP. Os soros de murganhos imunizados com qualquer dos dois Ab2, rr2, rz5 ou r=r7<i ligaram-se a p97, enquanto que os soros de murganhos imunizados com qualquer dos outros cinco Ab2, incluindo //5, não se ligaram a p97 (Fig. 18). Como um controlo positivo, doseou-se a ligação a p97 de mAb 96.5 ou de um soro anti-p97 de murganho, e comparou-se a ligação observada com a que se verificou utilizando soros de murganhos imunizados com Ab2 //3 ou -/=/5. Os dados mostra ram que os últimos soros continham Ab3 específico para p97 numa concentração de aproximadamente 1-5 g/ml. A capacidade de Âb2 //3 ou //7 para induzir uma resposta de Ab3 semelhante a Abl indi cou assim que estes Ab2 eram anticorpos de imagem interna”.

Para testar ainda a especificidade do Ab3 para p97, absorve t

ram-se soros de murganhos imunizados com Ab2 com 1 x 10 células da linha 2A de melanoma de murganho p97-positiva ou com a sua linha de origem p97-negativa (como um controlo), antes de se adicio narem os soros a p97 com que se tinha revestido as placas. Detec- 13

tou-se então a ligação do Ab3 a p97 utilizando-se um conjugado de IgG de caprino anti-murganho - HRP. Como se mostra na Figura 19 (Painéis A e B), os soros de murganhos imunizados com Ab2 é/3 ou //7 continham Ab3 que se ligou a p97, esta actividade de Ab3 remo veu-se por absorção com células 2A mas não por absorção com as cé lulas originais. Havia uma quantidade inferior de ligação a p97 com soros de murganhos imunizados com Ab2 /=/4 ou com //5, e esta ligação foi também inibida por absorção com células 2A (Fig. 19, Painéis C e D). Nem 0 soro de murganho normal nem 0 soro de murga nhos imunizados com Pl.17 (como um controlo) continham anticorpos que se ligavam a p97. Embora a ligação de mAb 96=5 purificado a p97 pudesse ser completamente anulado por absorção com células 2A (Fig. 20), a ligação de anticorpos de soro de murganhos imunizados com p97 foi apenas parcialmente inibida, assim como a actividade de Ab3 de soros de murganhos imunizados com Ab2 rr3 ou com

Z Jn i~r í ·

Detectou-se também uma resposta Ab3 em murganhos C3H/HeN de pois de imunização com Ab2 conjugado com KLH. 0 soro de murganhos C3Ii/EeN imunizados ligou-se ao antigénio p97 solúvel num ELISA de fase sólida (Figs. 21,22). Por absorção dos soros de murganho com células 2A ou originais antes de se testarem para a ligação p97 solúvel verificou-se que a ligaçao era para p97»

Fizeram-se também experiências nas quais se imunizaram murganhos BALB/c e C^H/HeN com um Ab2 que não se tinha conjugado com KLH. Verificou-se que os soros destes murganhos continham anticor pos que se ligavam a Fab 96.5. Para determinar se estes anticorpos eram Ab2 que permaneciam em circulação, ou se se tinha induzi

136 -, do qualquer AM» realizou-se um ELISA com conjugados com HRP que podiam identificar não só IgGl (.0 isotipo do Ab2), mas também IgG2b e IgG^o ws resultados sugeriram que os soros de murganho continham Ab4 que se podia ligar a Abl e pertencia ãs classes IgG2b e IgG3.

8.3 Discussão

Produziu-se uma série de mAb de murganho para determinantes idiotípicos em mAb 96.5» que define p97^a, um epitopo do antigénio de melanoma p97» e analisaram-se relativamente â especificidade e capacidade para induzirem uma resposta Ab3 em murganhos. Estudaram-se sete ab2 com algum pormenor. Quatro destes Ab2 mostraram que não identificavam a região de mAb 96.5 envolvida na ligação p97, uma vez que eles não inibiam apreciavelmente a ligação entre mAb 96.5 e p97» nem a sua ligação a mAb 96.5 era inibida por p97 solúvel. Contudo, três dos Ab2, referidos como %r3, 7^5, e A^7» respectivamente, evitaram a ligação entre antigénio p97 solúvel e mAb 96.5, e o p97 solúvel evitou a ligação entre Eab 96.5 θ este Ab2.

mAb 133.3 comportou-se de maneira semelhante ao mAb 96.5 quando testado em ensaios de ligaçao com os sete Ab2, enquanto o mAb 4.1 não, facto este não esperado, uma vez que 0 mAb 133°3 tem b sido referido como identificando um epitopo (p97 ) diferente de mAb 96.5» enquanto que o mAb 4°1 tem sido referido como sendo específico para 0 mesmo epitopo (p97^a) (Brown, J;P., et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546) como mAb 96.5. As razões para a discrepância entre os resultados obtidos utilizando um ensaio para a

- 137 -

inibição competitiva da ligação de mAb a células alvo (id.), e es tes resultados, obtidos com um ensaio de medição da ligaçao entre nbl e Ab2, são desconhecidos.

Os dados de inibição da ligação ao antigénio foram consistentes com a ideia de que três destes Ab2, #5*3, >r5, e j^/7, eram do tipo “imagem interna. Contudo, os dados não excluem explicações alternativas tais como impedimento estérieo. Investigou-se, assim, se qualquer destes três Ab2 podiam induzir uma resposta imunológica nos murganhos. Uma vez que geraimente as respostas a anticorpos humonais se podem estudar mais fácil e precisamente do que respostas proporcionadas por células, investigou-se 0 Ab3 que se podia ligar a p97.

Dois Ab2, 7^3 θ rrli induziram uma resposta Ab3 semelhante a, Abl em murganhos BALB/c e C^H/HeN, indicando assim que são anti corpos de imagem interna. Um terceiro Âb2, cujo comportamento era semelhante a ^3 θ rrj quando testado in vitro, não induziu uma resposta Ab3 semelhante a Abl. A ligação do Ab3 a p97 foi competitivamente inibida por absorção com células 2A, as quais expressam p97, mas nao com células da linha original negativa a p97. 0 facto de também se ter observado uma resposta na estirpe alogeneica indica que a resposta não foi controlada por genes Th, mas, mais provavelmente, induzida pelo Ab2 actuando como uma imagem interna do antigénio p97 (Lee, V.K., et al., 1986, Biochim. Biophys. Acta 865:127-139).

Para obter exclusivamente uma resposta semelhante a Abl in vivo, era necessária a conjugação de um Ab2 com KLH. Quando não

138 se utilizava KLH, os soros dos murganhos imunizados continham anticorpos do isotipo IgGl do Ab2 e anticorpos que eram de outros isotipos (lgG2b, IgG3), e que podiam ter sido Ab4. Se o Ab4 foi, na realidade, gerado, pode ter ocorrido uma resposta Ab3 na mesma altura.

9. ANTICORPOS ANTI-IDIOTÍPICOS ESPECÍFICOS PARA ANTICORPOS 16 .

ANTI-CARCINOKA anticorpo monoclonal de murino (mAb) 16 (Abl) é uma IgG2a específica para um antigénio de hidrato de carbono associado a tu mor que se encontrou na superfície de células de muitos carcinomas humanos diferentes (Hellstrom, 1., et al., 1986, Câncer Res. 3917-3923).

Produziram-se mAb anti-idiotípicos (Ab2) contra 16. Obtiveram-se vinte e quatro Ab2 que se ligaram a fragmentos Eab prepara dos de 16 mas não a Eab preparados de uma IgG2a de controlo. Oito destes 24 mAb podiam ligar-se, a concentrações elevadas, a um dos dois mAb que foram independentemente derivados mas que tinham a mesma especificidade de 16. Catorze dos 24 Ab2 podiam inibir a li gação de 16 ao antigénio em células. Seis destes 14 Ab2 foram incapazes de se ligarem a fragmentos Eab preparados de 16 e já liga dos a células positivas de antigénio 16. Utilizando segmentos de gene de região variável clonada, verificou-se que dois destes 6 Ab2 podiam reconhecer especificamente a região variável de cadeia pesada 16, associada com uma cadeia leve irrelevante, enquanto os restantes 4 reconheciam um determinante de combinação, necessitan

do que as regiões variáveis de cadeia leve e pesada L6 estivessem associadas» Em contraste, todos os 8 Ab2 testados que se podiam 1 ligar a Fab L6 ligados a células, podiam também ligar-se à região variável de cadeia leve isolada. Os 6 Ab2 que não se ligaram a fragmentos Fab 16 ligados a células injectarara-se em murganhos BALB/c e C3H/HeN_e Dois deles (possivelmente mais) induziram anticorpos policlonais (Ab3) que expressaram o mesmo idiotipo de 16, ligaram-se a células de tumor 16-positivas e competiram com 16 para o seu sítio de ligação ao antigénio»

9.1 Materiais E Métodos

9.1.1 Animais

Obtiveram-se murganhos fêmeas BALB/c e C3H/HeN de seis a oito semanas de idade do Animal Facilities do Fred Hutchinson Câncer Research Center. Utilizaram-se neste estudo, excepto se indicado de outro modo.

9.1.2 Linhas de células

A linha H-3347 de carcinoma do cólon humano (Hellstrom, I_e, et al., 1986, Proc» Natl. Acad» Sei» U.S.A» 83:7059-7063) expressa níveis elevados do antigénio definido por L6» A linha de células T humanas CEM, que não se liga a L6, incluíu-se como um controlo negativo,

9.1.3 Anticorpos anti-tumor (ABI)

Utilizou-se, neste estudo, anticorpo monoclonal L6 (lgG2a) como o mAb anti-tumor (Abl). 0 desenvolvimento e caracterização são descritos noutro local (Hellstrom, I», et al., 1986, Câncer

140

Res. 46:3917-3923? Hellstrom, I., et al₀, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83:7059-7063). 0 mAb F26 (IgGl) e 012/28-24 (lg02a) produziram-se de hibridomas que resultaram da fusão de células de baço de murganhos BALB/c imunizados com tecido de carcinoma; a hibridação e selecção foi semelhante â que originou L6. Os últimos dois mAb competem com L6 para a ligação a células de carcinoma. 0 mAb 96.5 (Brown, J.P., et al., 1981, J. Immunol. .127:539-546) e a proteína de mieloma P1.17 (American Typé Culture Colletion Accession IÍ2 TI3 10), que são as duas IgC2a, utilizaram-se como controlo. Produziram-se fragmentos Fab de L6 e 96.5 por digestão com papaína (id,)♦ e denominam-se Fab L6 e Fab 96.5, respectivamente.

9.1.4 Geração de anticorpos anti-idiotípicos (AB2)

Utilizou-se um protocolo que se tinha utilizado com sucesso para gerar Ab2 relacionado com um antigénio de tumor diferente, p97 (ver secção 8, supra). Imunizaram-se murganhos BALB/c com 100 de L6 que se tinha acoplado a hemocianina de molusco (KJjH) como descrito (Streicher, H.Z., et al., 1986, J. Immunol. 136:1007-1014) Administrou-se a primeira imunização subcutãneamente em adjuvante H37Ra completo (Difco, Detroit, Ml), e administrou-se uma segunda dose em adjuvante incompleto de Freund intraperitonealmente (i.p.) semenas mais tarde. Duas das quatro imunizações subsequentes administraram-se i.p. em solução de cloreto de sódio com intervalos de duas semanas.

Removeram-se os baços 3 dias depois da primeira inoculação, e funcliram-se as células do baço com células de mieloma NS-1 por

- 141

centrifugação com polietilenoglicol. Depois de 10 dias, fez-se a sondagem dos hihridomas por ELISA contra fragmentos Fab que se ti nham preparado de L6 (referidos como ura Fab L6) e revestiram pia·? cas Immunolon II de 96 cavidades. (Dynatech, Chantilly, VA). Detectou-se a ligação a Fab L6 por utilização em separado de cada um dos três diferentes reagentes: um anti-soro de coelho para IgGl de murganho que se tinha acoplado com peroxidase de rábano (ILEÍP) (referido como IgGl - HRB), um anti-soro de coelho conjugado com HRP para IgG3 de murganho (referido como IgG5 - HRP anti-murganho) ou proteína A acoplada a HRP (proteína A - HRP); estes reagentes obtiveram-se de Zymed (South San Francisco, CA). Testaram-se anticorpos ligados a Fab L6 para a ligação a Fab 96.5 excluindo ligantes não específicos. Os hibridomas que mostraram produzir mAb para o idiotipo de L6 clonaram-se duas vezes por diluição limitada, seguido do teste de todos oa· sub-clones.

9*1*5 Purificação de AB2

Murganhos BALB/c machos de quatro a seis semanas de idade sensibilizaram-se com pristano. Dez dias mais tarde, injectaram6 /

-se com 5 x 10 células de hibridoma produzindo Ab2 e recolheu-se a ascite 3 a 8 semanas mais tarde. Purificou-se a ascite contendo anticorpos de IgG2a e de IgG2b sobre colunas de proteína A (Brown, J.P., et al., 1981, J. Immunol. 127:539-546), e purificou -se a ascite contendo IgGl por precipitação com sulfato de amonio, seguida de cromatografia em DEAE - Sephacel (Pharmacia, Uppsale, Sweden). Testaram-se os Ab2 purificados para a ligação a Fab 1>5 assim como para a inibição da ligação de L6 a células tí-3347 (como descrito adiante).

9.1.6 Ensaio de inibição para detectar a ligação de AB2 a, região paratopa de 16

Utilizou-se um ensaio semelhante a um utilizado anteriormen te no sistema p97 (ver secção 8, supra). Misturaram-se os.sobrenadantes contendo Ab2, ou Ab2 purificado com mAb L6 para uma concentração final de 0,1-0,4 g/L6 por ml, Incubou-se a mistura numa placa de cultura de tecido de 96 cavidades (Falcon, Becton Dickin SOTly Ox nard, CA) durante 30 minutos á temperatura ambiente, depois do que se adicionou a células de carcinoma H-3347 fixadas com glu taraldeído, que se tinham ligado nas cavidades de uma placa de 96 cavidades. Detectou-se a ligação de 16 a células H-3347 por ELISA, utilizando-se um anti-soro de caprino para IgC de murganho conjugado com HSP, ou proteína A acoplada a HRP. Expressaram-se os dados sob a forma da percentagem de inibição da ligação de L6 ãs cé lulas na presença do Ab2.

9.1.7 Ensaio de bloqueio para detectar a competição entre ÃB2 e antigénio para sítios de ligação L6

Adicionaram-se trinta g/ml de Eab ιβ a 5 x 10^ células de carcinoma H-3347 num tubo de propileno® Depois de uma incubação de 30 minutos a 4°C, lavaram-se as células para remover qualquer Fab não ligado. Marcaram-se Ab2 purificados com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Adicionaram-se várias concentrações de Ab2 marcado ao tubo de propileno, seguido da incubação a 4°U durante 30 minutos e lavagem. Detectou-se a ligação a Ab2 utilizando um separador de células activadas com fluoresceína (FACS) modelo EPIC-C, como descrito anteriormente (Hellstrom, I., et al., 1986,

- 143 -

Câncer Res. 46:3917-3923). Realizou-se também esta experiência com 16 marcado com ficoeritrina (PE) em vez de fragmentos. Eab 16 não marcados.

9.1.8 Clonagem de segmentos de gene de região variável de cadeia leve e pesada de 16

Isolou-se DNA como descrito em princípio por Blin e Stafford (1976, Uucl. Acids Res. 3:2303-2308) e em mais pormenor por ledbetter et al. (1987, Mol. Immunol. 24:1255-1261). Digeriu-se com Eco RI ou Hind III e de tamanho fraccionado em gradientes de saca rose (Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). As fracções de gradiente contendo regiões (V) variáveis específicas identificaram-se por análise de manchas de Southern (Southern, E.M., 1975,

J. Mol. Biol. 98:503-507). Os alelos expressos identificaram-se pela sua ausência da detecção, em análise de manchas de Southern, de sublinhas de L6 não produtoras. 0 DNA digerido com Eco-RI contendo o segmento de gene de região V de cadeia pesada de 16 expres so, clonou-se no vector do bacteriofago lambda EMB13 (Promega Bio tech, Madison, Wi) com extractos Gigapack (Stratagene, la Jolla, CA), plaqueou-se e sondou-se utilizando um fragmento Ybal/EcoRI contendo um indutor de cadeia pesada de murino.

Um fragmento 2.3 Kb Hind III que continha 0 indutor de cadeia pesada murina, clonou-se num vector pSV2-gpt (Mulligan, R.C. and Berg, P„, 1980, Science 209:1422-1427) contendo C-eyões humanos como um fragmento de 10.5 Kb Bam HI derivado do clone fágico HG3A (Sllison, J.U., et al., 1982 Nucl. Acids Res. 10:4071-4079).

- 144*“=;

segmento de gene de cadeia pesada variável expresso transformou -se então no vector sob a forma de um fragmento 10.5 Kb Eco RI.

Fracções de gradiente contendo DMA digerido com Hind III com a cadeia leve de L6 expressa, clonaram-se no sítio Xbal de Zap Lambda (Egtratagénio) por enchimento das Ixtremidades de Hind III com o di-nucleótido AG e das extremidades Kbal com CT ficando, assim, as extremidades coincidentes para clonagem. Fez-se a sonda gem da biblioteca resultante com um fragmento de 1Kb Pstl/Hind III do intrão que separa JK e CK no clone pBR322 contendo o fragmento de 9.5 Kb, Bam HI, com o gene K expresso de MPCll (Kelley, D.E., et al., 1982, Cell 29:681-689). Para a construção da expressão da cadeia leve quimérica, um fragmento 1 Kb Hind Ill/Xmnl contendo o indutor K de murino (de MPCll) clonou-se a montante de um fragmen to de 2.7 Kb, Eco RI que codifica a exão CK humana (Heiter, P.A., et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-1522) num vector pVC-gpt. 0 segmento de gene 6 VK expresso transferiu-se então para este vector como um fragmento Eco RI - Mot RI ligado no único sítio ?st I.

As construções de gene de cadeia pesada e de cadeia leve quiméricas, foram transfectadas na linha de célula de mieloma de murganho Ag 8.653 utilizando um electroporator Biorad de acordo com as instruções dos fabricantes, com subsequente selecção em 8,5 g/ml de ácido micofenélico. Realizaram-se transfecções semelhantes utilizando-se apenas a construção do gene de cadeia leve quimérica e a linha de célula de mieloma murino SP2/O, ou a construção de cadeia pesada quimérica e o mieloma murino J588L que expressa uma cadeia leve lambda I de murino. As linhas de células que expressavam as proteínas quiméricas identificaram-se por ELISA.

- 145 -7

Purificaram-se anticorpos 16 quiméricos em proteína A - Sepharose e biotinilaram-se como descrito anteriormente (Pohlit, H.M., et al., 1979, in Immunological Methods, I. lefkovits and B. Pernis, eds., Academic Press, New York, pp. 181-194).

9.1.9 Ensaio para a especificidade da região variável anti-idiotipo 16

Realizaram-se ensaios de competição por revestimentos de pia cas Immulon II com 100/4L de mAb 187.1 (proporcionado por Dr. Bale Yelton), seguindo-se três lavagens, e depois o sobrenadante de culturas do mAb anti-idiotípico 16. lavaram-se, então, de novo as placas, e adicionaram-se 100/& de competidor não marcado a uma concentração de 6^g/ral. Os competidores não marcados eram de sobrenadantes de cultura de transfecções expressando a cadeia pesada variável quimérica de 16 associada com cadeias leves de J558I, ou apenas a cadeia leve de variável quimérica de 16, ou meio semeado” com mAb 16 quimérico purificado ou P¥ B3281B8 (um controle, anticorpo IgGl humano irrelevante). Depois de 30 minutos â temperatura de 3O°G, adicionaram-se 50/cl de uma solução a 1 yZg/ml de anticorpo 16 quimérico biotinilado purificado, aos 100/Ul de volu me já presente na cavidade. Isto permitiu a incubação durante uma hora adicional a 37°G, lavaram-se então as placas, incubaram-se com Avidin-HRP (TAGO, Burlingame, CA) (diluição 1:1000 durante 30 minutos â temperatura ambiente), lavaram-se de novo, e desenvolve ram-se com cromogene TMB em substrato tamponado (Genetics Systems, 'Seattle, VIA). Os dados apresentaram-se como a % de inibição, considerando sem competidor (apenas meio) o valor de 100% com o valor de fundo (nenhum Ab2) subtraído.

- 14^

9.1.10 Indução de uma resposta AB3

Imunizaram-se murganhos fêmeas BALB/c e C3H/HeN, de seis a oito semanas de idade, com 50/<g de Ab2 conjugado com KLH (Streicher, H.Z., et al®, 1986, J. Immunol.13621007-1014). Fez-se uma segunda imunização semelhante uma semana depois da primeira, seguida de uma terceira e quarta imunizações, realizadas com inter valos de 1 semana, com o Ab2 administrado em solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato (PBS), e fizeram-se imunizações subsequentes a intervalos de 2 semanas com Ab2 em PBS. Todas as imunizações foram feitas por via i.p.o Depois de 4 semanas, sangraram-se os murganhos periodicamente e testaram-se os soros para a presença de Ab3 (policlonal).

9.1.11 Purificação de Ab3 policlonal

Recolheram-se soros de murganhos imunizados com Ab2, entre 6 e 20 semanas depois da primeira imunização. Conjugaram-se dez mg do respectivo Ab2 com 1 ml de Sepharose 4B activado com brometo de cianogenio (Pharmacia, Piscataway, NJ), e submeteu-se a cromatografia de acordo com as instruções do fabricante, de modo a enriquecer de Ab3 que se podia ligar ao respectivo Ab2.

9.1.12 Medição da capacidade de Ab3 para inibir a ligação de Ab2 a Fab L6

Utilizou-se um ensaio como descrito anteriormente (ver secção 8, supra). 0s soros ou Ab3 purificados a serem testados para Ab3 misturaram-se com uma concentração fixa (2,0^g/ml) de Ab2 purificado e adicionaram-se a uma placa Immunolon II com as cavidades revestidas com Fab L6; Utilizaram-se mAb L6 e PBS como con-

trolo positivo e negativo, respectivamente. Depois de 3θ minutos de incubação, detectou-se a ligação de Ab2 a Fab 16 por ELISA uti lizando uma mistura de IgGl de coelho anti-murganho com HRP/proteína A-HRP. Os dados apresentaram-se sob a forma de percentagem de inibição da ligação de Ab2 a Fab L6 pelo soro Ab3®

9.1.13 Ensaio para .ligação de Ab3. a células

Incubaram-se várias diluições de soro de murganho para serem testadas para A63 ou para Ab3 policlonal purificado, a 4°C com 5 x 10 células H-3347 durante 30 minutos em tubos de polipropile no* 0 meio de cultura, soro de murganhos imunizados com mAb 96.5 ou com Pl.17, e soro de murganho normal utilizaram-se como contro lo negativo» Lavaram-se as células duas vezes no meio. Detectou-se a ligação de Ab3 a células alvo por uma IgG anti-murino de ca nrino marcado com FITC (Tago, Burlingame, CA); adicionaram-se 5θ ã mistura de soro de murganho e células de tumor e incubaram-se durante 3U minutos. Depois de lavagem duas vezes no meio, ana lisaram-se as células utilizando FACS. As células CEM, que nao expressam 0 antigénio definido por L6, utilizaram-se como um controlo negativo de células alvo.

9-2 Resultados

9.2.1 Geração de mAb anti-idiotípico (Ab2)„. a L6 (Abl)

Obtiveram-se hibridomas que produz iat&rmAb anti-idiotípico por imunização de murganhos BALB/c com L6 e fundiram-se as células do baço com mieloma NB-1, seguido de sondagem dos sobrenadantes de hibridomas para a ligação a Fab L6. As células de cavidades com sobrenadantes ligados a Fab L6 clonaram-se duas vezes e testa

- 148 ram-se os clones para a sua capacidade em produzirem mAb ligados a Fab L6 e não a Fab 96.5 (utilizado como um controlo negativo).

Das 8 fusões, isolaram-se 24 hibridomas que produziram mAb para

Fab de L6, estabilizaram-se e utilizaram-se para a produção de as cites; estes representavam vários isótipos diferentes (Tabela XVI).

- 149

TABELA XVI mAb ANII-IDIQTIPICO A mAb 16

Hibridoma anti- mAb anti-idiotipico Ligação â região -idiotípieo (Ab2) paratopa de L6 Isotipo

4/1-6-1	L6 anti-Id 1	Sim	IgG2b
4/2-4-1	L6anti-Id 2	Sim	IgG2b
4/3-2-1	L6 anti-Id 3	Sim	IgG2a
4/5-1-1	L6 anti-Id 4	Sim	IgG2b
5/4-2-2	L6 anti-Id 5	Lao	IgG3
6/14-2-2	L6 anti-Id 6	Sim	IgGl
6/13-3-1	L6 anti-Id 7	Sim	IgGl
6/20-4-5	L6 anti-Id 8	Sim	IgGl
7/10-2-3	L6 anti-Id 9	Sim	IgGl
5/14-2-6	L6 anti-Id 10	Sim	IgGl
5/15-3-1	L6 anti-Id 11	Sim	IgGl
10/24-1-5	L6 anti-Id 12	Sim	IgGl
10/20-2-3-1	L6 anti-Id 13	Sim	IgGl
11/48-3-14	L6 anti-Id 14	Sim	IgGl
11/75-1-3	L6 anti-Id 15	Sim	IgG2a
11/81-1-2	L6 anti-Id 16	Hão	IgM
11/80-3-8	L6 anti-Id 17	Hao	' IgM
10/30-1-6-28	L6 anti-Id 18	Hao	IgG3
10/36-1-1	L6 anti-Id 19	Hao	IgG3
11/5-31-2-4	L6 anti-Id 21	Nao	IgG3
11/26/2-4	L6 anti-Id 22	Hão	IgG3
11/27-5-5-4	L6 anti-Id 23	Não	IgG3
9/66-11-2	L6 anti-Id 24	Nao	IgG3
10/46-6-4	L6 anti-Id 25	Hão	IgG3

Definida como	a capacidade para	inibir a ligaçao	de mAb L6

seu antigénio alvo em células de carcinoma H-3347.

Utilizou-se Ab2 purificado de ascite para testes posteriores (ver adiante).

9.2.2 Caracterização da ligação de Ab2 a idiotopos em 16

Uma sondagem inicial identificou 14 de 24 hibridomas testados que produziam Ab2 que inibiam 90-100% da ligação de 16 (testa do a 0,2-0,4>tg/ml) a células de carcinoma e testaram-se ainda para a capacidade de inibir a ligação de 16 ao seu antigénio alvo em células. Esperava-se que tal inibição ocorresse se o Ab2 reagis se com a região de idiotopo de 16. Utilizou-se um ELISA, com este objectivo, utilizando células H-3347 fixadas em glutaraldeído como uma fonte de antigénio. Como mostra na Figura 23, a ligaçao de L6 (0,2/<g/ml) a células de carcinoma foi inibida quando se adicionou Ab2 com uma concentração de 0,5>Zg/ml e 5Dois dos Ab2 inibidores eram IgG2a, 3 eram IgG2b, e os restantes 9 eram IgGl, enquanto que nenhum dos 7 anticorpos IgG3 ou 2 IgM eram inibidores.

0s 14 Ab2 que podiam inibir a ligação de L6 no ensaio de fa se sólida anteriormente descrito marcaram-se com FITC para análise. Analisou-se cada conjugado por um ELISA para a capacidade de se ligarem a Fab L6 assim como para a capacidade de evitar a liga ção de L6 a células de carcinoma positivas para antigénio. Isto fez-se para determinar se os anticorpos marcados se comportavam exactamente do mesmo modo como os anticorpos não marcados. Quando se adicionaram Ab2 marcados com FITC ao Fab L6, os quais se tinham adicionado numa dose de saturação, a células de carcinomas H-3347, verificou-se que 8 dos 14 Ab2 se podiam ainda ligar ao Fab L6, en quanto que a ligação de 6 Ab2 foi completamente inibida (Fig. 24)

151 Quando se utilizou neste ensaio L6 PE-marcado em vez de Fab 16, verificou-se que os 16 restantes se ligaram a células e não se deslocavam na. presença dos 6 Ab2 não ligantes (Fig. 25).

Os 6 Ab2 que inibiam a ligação de 16 ao seu antigénio alvo, e que não eram susceptíveis de se ligarem a Fab 16 ou células, previamente ligadas, seleccionaram-se para testes adicionais,,

Os estudos referidos nas secções seguintes realizaram-se em amostras destes 6 Ab2 e primariamente destinavam-se a identifi car Ab2 capazes de actuarem como imagens internas do antigénio definido por 16.

9.2.3 Especificidade do Ab2 gerador de 16

Existem dois mAb, F2-6 e 012/28-24, que têm a mesma especifi. cidade que 16 quando testados em ensaios de inibição de ligação competitiva FACS. Amostras destes dois mAb misturaram-se com várias concentrações de Ab2 para testar se o último podia inibir a ligação dos dois (semelhantes a 16) mab a células de carcinoma. Nenhum do 14 Ab2 testados inibiam a ligação de 012/28-24 ao antigénio definido por 16, quando ensaiados de maneira semelhante ao apresentado para 16 na Fig. 26. Oito dos catorze Ab2 testados podiam inibir a ligação de F26 a concentrações elevadas, 20 a 200 g/ml inibindo 1 g/ml de F26. Isto sugere que 012/28-24 tem um idiotipo diferente do de 16, e que F26 e 16 podem ter idiotopos sobrepostos.

9.2.4 Especificidade de epitopo de Ab2

Demonstrou-se a especificidade de epitopo dos anticorpos mo

- 152 -

noclonais anti-idiotípicos 16» em experiências de competição em que o 16, a cadeia pesada de 16 quimérica associada com a cadeia leve lambda 1 de J558I murina» a cadeia leve de 16 quimérica livre, ou uma IgGl humana irrelevante, se testaram para a sua capacidade em competir em cada ligação de anticorpos anti-idiotípicos com 16 quimérico biotinilado (Fig. 27)» Cada um dos 14 Ab2 mostra ram reconhecer especificamente as regiões V de 16 clonadas devido ã sua capacidade para se ligarem ã molécula de 16 quimérico bioti nilado. Verificou-se que a ligação era susceptível de se inibir por 16 quimérico não marcado» mas não por uma IgGl humana irrelevante. Oito Abs podiam ser inibidos a um grau apreciável pela cadeia leve de 16 quimérica livre (//l, //2» #4, Λ/6, /=/7, /τθ» //9 e //15) mas não pela cadeia pesada quimérica associada com lambda 1 de murganho e assim, os oito Abs reconhecem um determinante associado ã cadeia pesada variável de 16. Estes oito são os Ab2 que são susceptíveis de se ligarem ao Fab 16 ligados a células. Dois dos Ab2 (//12 e //l3) foram susceptíveis de inibição pela cadeia pesada quimérica de 16 associada com a cadeia leve de J5581, mas não pela cadeia leve quimérica livre» e reconhecem» as sim, um determinante associado a 16 V. Os restantes Ab2 (//5» //lO, //ll» © //l4) não eram susceptíveis de inibição por qualquer das regiões V clonadas» separadamente» e podem assim» ser específicos para um determinante de combinação formado apenas pela asso ciação de regiões V apropriadas. Estes resultados foram também confirmados através de estudos de ligação directa.

9.2.5 Indução de Ab3

Cinco dos 6 Ab2 que mostraram estar relacionados com 0 sítio

153 de ligação conjugaram-se com KLH e utilizaram-se para imunizar murganhos BALB/c e C3H/HeN, como descrito na secção 9.1.4. Sangra ram-se, inocularam-se os murganhos periodicamente, e analisaram-se os seus soros.

Realizou-se primeiro um ensaio de inibição de ligação para determinar se os murganhos imunizados mostravam produzir qualquer Ab3 que pudesse ser identificado pela sua capacidade em se ligar *·*· especificamente a Ab2» Misturaram-se varias diluições de soros de murganhos com Ab2 (l,O^g/ml), aplicaram-se as misturas em placas revestidas com Fab L6, e determinou-se a ligação de Ab2 ao Fab L6 por ELISA. Apresentaram-se os resultados como percentagem de inibição da ligação de Ab2 a Fab L6 na presença de um dado soro de murganho como apresentado na Fig. 28, a ligação de Ab2 (1,0/tg/ml) a Fab L6 foi inibida em 90$ com uma diluição a 1:200 de vários so ros de murganho imunizado. Verificou-se no mesmo ensaio, que os anti-soros purificados por afinidade inibiam a ligação de Ab2 o que se verificou em todos os Ab2 testados e indica que se produzi ram Ah3 na região de paratopo de Ab2. A indução de Ab3 anti-idiotípicos a Ab2 foi semelhante em murganhos BaLB/c e C3H/HeN.

9.2.6 Capacidade de Ab3 para ligar ao antigénio definido por 16

Se um Ab2 actua como uma imagem interna do antigénio 16, deve ser capaz de invocar um Ab3 que se liga especificamente ao antigénio definido por L6 (Abl). Para testar a especificidade do antigénio ao Ab3 gerado em murganhos imunizados com Ab2, testaram -se várias diluições dos soros de murganhos imunizados purifica- 154 -

dos por afinidade, para a ligação a células de linhas H-3347 de carcinoma positivo a 16; as células CEM às quais 16 não se liga utilizaram-se como controlo negativo. Os soros de murganhos C3H/ /HelI (Fig. 29) que se tinham imunizado com Ab2 //ll e #12 e os soros de murganhos BALB/c (Fig. 30) imunizados com Ab2 rrl4 ligaram-se ás células de carcinoma.

9.3 Discussão

Geraram-se anticorpos anti-idiotípicos monoclonais (Ah2) para um mAb de murganho, 16, que se ligaram a um antigénio de hidrato de carbono expresso em vários carcinomas humanos. Os Ab2 sondaram-se primeiramente para a ligação com fragmentos Fab 16, seguida de sondagem para a sua capacidade em inibir a ligaçao de 16 ao seu antigénio alvo em células de carcinoma. De um total de 24 Ab2, inicialraente seleccionados, para ligação com Fab 16, 14 Ab2 inibiram a ligação de 16 ãs células de carcinoma antigénio-positivas. Seis dos últimos Ab2 foram incapazes de se ligarem a fragmentos Fab 16 previamente ligados com antigénio em células, sugerindo que eles identificam uma região de 16 que está associada com o seu sítio de ligação com o antigénio. Quando se testaram estes 6 Ab2 para a ligação a regiões variáveis de cadeia pesada e leve 16 clonadas, 4 Ab2 ligaram-se apenas a uma combinação das re giões V apropriadas, enquanto 2 Ab2 reconheciam a região de cadeia pesada variável associada com uma cadeia leve variável irrelevante, e nenhum se podia ligar a cadeias leves. Fm contraste, todos os 8 Ab2 testados que se ligaram ao Fab quimérico livre ligados a células podiam ligar-se com cadeias leves de 16 quiméricas.

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Obteve-se uma resposta semelhante a Ahl in vivo apenas quan do se utilizaram os Ah2 que não se ligavam a Fab L6 ligados a células e que se ligavam a um.determinante de combinação ou a um de terminante associado a cadeia pesada variável. Em contraste, dos Ab2 que se ligaram a Fab L6 ligados a células de carcinoma e a ca deias leves de 16 quiméricas isoladas, todos falharam na indução de uma resposta Ab3 semelhante a Abl, em murganhos.

Os Ab2 #11, #12, e z#14 comportaram-se como Ab2 imagem interna em vários tipos diferentes de ensaios.

Dois Ab2 {#11, #12) podiam induzir uma resposta Ab3 semelhante a Abl em murganhos. Os soros de murganhos imunizados com qualquer destes Ab2 foram susceptíveis de se ligarem com a mesma especificidade de L6 a células de carcinoma. Uma vez que se induziu uma resposta Ab3 em murganhos C3H/HeN alogenéicos, não foi alotipo-restriro, como seria de esperar se o Ab2 tivesse servido como um regulador imunologico (Lee, V.K., et al., 1986, Biochim. Biophys. Acta 865:127-139)o Além disso, o Ab2 comportou-se como uma imagem interna (Urbain, J., et al., 1982, Ann. Immunol.

133D:179-189; Lee, V.E., et al., 1986, Biochim. Biophys. Acta 865:127-139) do antigénio definido por 16. Verificou-se também que um Ab2 {tf 14) podia induzir uma resposta Ab3 semelhante a Abl no sistema singeneico.

DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS

As seguintes linhas de células de hibridoma, produzindo o

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anticorpo monoclonal indicado, foram depositadas no American Type Culture Collection, Rockville, MD, e foram designados pelo número de aceitação listado

Anticorpo

monoclonal	Antigénio	Data de	Número de
Hibridoma (Ab2)	relacionado	deposito	aceitação
Linha de célula	Antigénio ganglio	7-17-87	HB 9484
2 Cl 2Cl	sídico GD3 asso-

ciado a melanoma humano

Linha de célula	II J	Antigénio p97 as- 8-13-87	HB	9498
sociado a	melano-
(24.89/1.3 cl.5)		ma humano
Linha de célula t¥7 (24.6/28.2 cl.l)		Antigénio sociado a ma humano	p97 as- 8-13-87 melano-	HB	9497
5/15-3-1	//ll	Antigénio sociado a ma humano	L6 as- 9-18-87 carcino	EB	9544
10/24-1-5	//12	Antigénio sociado a ma humano	L6 as- 4-1-88 carcino	HB	9681
11/48-3-14	//14	Antigénio sociado a ma humano	L6 as- 4-1-88 carcino	HB	9680
4/1-6-1	^1 z / -*-	Antigénio sociado a ma humano	L6 as- 9-18-87 carcino	HB	9546
6/14-2-2	ΤΤθ	Antigénio sociado a ma humano	L6 as- 9-18-87 carcino	HB	9545

- 157

A presente invenção nao é limitada no seu âmbito pelas linhas de células depositadas uma vez que este aspecto é considerado. como uma simples ilustração de um certo aspecto desta invenção e quaisquer linhas de células que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do âmbito desta invenção. Na verdade, várias modificações desta invenção adicionais âs aqui apresentadas e descritas, tornam-se evidentes para os especialistas, a partir da descrição anterior e desenhos que a acompanham. Considera-se que tais modificações estão dentro do âmbito das reivindicações em apêndice.

Ê também entendido que todos os tamanhos de pares de bases indicados para os nucleotidos são aproximados e utilizados com o objectivo de descrição.

-158-

Claims

1.- Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal anti-idiotípico que identifica especificamente um idiotipo presente num segundo anticorpo que define o antigene GD^ associado ao melanoma humano, caracterizado pelo facto de:

a) se obter um hibridoma por fusão i)de uma célula que produz um anticorpo derivada do baço de um animal imunizado com o antigene GD^ ou um anticorpo ou célula T tendo um idiotipo que identifica o antigene GD₃ com ii) uma célula de mieloma.

b) se propagar o hibridoma do passo a); e

c) se colherem os anticorpos monoclonais produzidos pelo hibri doma.

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado '-159pelo facto de o hibridoma compreender a estirpe com ο N9 de depósito

-HB9484 de ATCC

3. - Processo para a preparação de um anticorpo anti-idiotípico monoclonal que identifica especificamente um idiotipo presen te num segundo anticorpo que define o antigene p97 associado ao melanoma humano, caracterizado pelo facto de:

a) se obter um hibridoma por fusão i) de uma célula produtora de anticorpos derivada do rim de um animal imunizado com o antigene p97 ou um anticorpo ou célula T tendo um idiotipo que identifica o antigene p97 com ii) uma célula de mieloma;

b) propagar-se o hibridoma do passo a; e

c) colherem-se os anticorpos monoclonais produzidos pelo hibridoma .

J

4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o hibridoma compreender a estirpe com ο N9 de deposito

-HB9498 de ATCC .

5. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o hibridoma compreender a estirpe com ο N9 de depósito

-HB9497 de ATCC

-1606.- Processo para a preparação de um anticorpo anti-idiotípico monoclonal que identifica especificamente um idiotipo presente num segundo anticorpo gue define um antigene de carcinoma de pulmão humano, caracterizado pelo facto de:

a) se obter um hibridoma por fusão i) de uma célula produtora de anticorpos derivada do rim de um animal imunizado com o antige ne de carcinoma de pulmão ou um anticorpo ou uma célula T tendo um idiotipo que identifica o antigene de carcinoma de pulmão com ii) uma célula de mieloma;

b) propagar-se o hibridoma do passo a); e

c) colherem-se os anticorpos monoclunais produzidos pelo hibri doma.

7.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o segundo anticorpo ser constituído pelo anticorpo monoclonal L_g como o produzido pela estirpe com ο N9 de depósito

-HB8677 de ATCC ,

8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o hibridoma compreender a estirpe com ο N9 de depósito

-HB9544 de ATCC .

9, - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o hibridoma compreender a estirpe com ο N9 de depó-161 sito

-HB9681 de ATCC.

10,- Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o hibridoma compreender a estirpe com ο N9 de de pôsito

-HB9680 de ATCC.

11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o hibridoma se propagar in vivo.

12, - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o hibridoma se propagar in vivo.

13.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o hibridoma se propagar in vivo.

14.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o hibridoma se propagar injectando um rato de linha pura e se desenvolver um tumor de ascite e por os anticorpos monoclonais segregados na ascite se purificarem por cromatografia de afinidade em sefarose de proteína A ou por precipitação de sulfato de amónio.

15.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza162do pelo facto de o hibridoma se propagar injectando um rato de linha pura e se desenvolver um .tumor de ascite e por os anticorpos monoclonais segregados na ascite se purificarem por cromatografia de afinidade em sefarose de proteína A ou por precipitação com sulfato de amónio.

16.- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o hibridoma se propagar injectando um rato de linha pura e se desenvolver um tumor de ascite e por os anticorpos monoclonais segregados na ascite se purificarem por cromatografia de afinidade em sefarose de proteína A ou por precipitação de sulfato de amónio.

17.-' Método para controlar os níveis de anticorpo anti-idiotípico induzido num paciente com um tumor, tendo sido ou estando a ser administrado a esse paciente um anticorpo anti-tumor o qual exprime um idiotipo dirigido contra um determinado antigeno de tumor, caracterizado pelo facto de se medir o nível de anticorpo anti-idiotípico no soro do paciente através de um imuno-ensaio competitivo utilizando um anticorpo anti-idiotípico monoclonal, o qual reconhece específicamente o idiotipo do anticorpo anti-tumor.

18.- Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o antigeno de tumor ser constituído por um antigeno oncofetal.

19. - Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o antigeno oncofetal ser constituído por um antigeno de melanoma.

J

20. - Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o antigeno de melanoma ser constituído por p97.

21. - Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o anticorpo aceto-anti-idiotípico ser constituído pelo anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 3, confor me depositado em ATCC com o número de registo HB9498.

22. - Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o anticorpo aceto-anti-idiotípico ser constituído pelo anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 7, conforme depositado em ATCC com o numero de registo HB9497.

23. - Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o antigeno de melanoma ser constituído por GD3.

24. - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o anticorpo anti-idiotípico monoclonal ser constituído pelo anticorpo 2C1 monoclonal, conforme depositado em ATCC com o número de registo HB9484.

25. - Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o antigeno oncofetal ser constituído por um antigeno de carcinoma do pulmão, ►

26. - Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de o antigeno de carcinoma do pulmão ser um antigeno glicolipídico possuidor de reactividade com o anticorpo L6 monoclonal, conforme depositado em ATCC com o número de registo HB8677.

27. - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de o anticorpo anti-idiotípico monoclonal ser constituído pelo anticorpo monó.clonal de acordo com a reivindicação 11, conforme depositado em ATCC com o número de registo HB9544.

28. - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de o anticorpo anti-idiotípico monoclonal ser constituído pelo anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 12, conforme depositado em ATCC com o número de registo HB9681.

29. - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de o anticorpo anti-idiotípico monoclonal ' ser constituído pelo anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 14,

-165conforme depositado em ATCC com o número de registo HB9680.

30.- Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o antigeno de tumor ser constituído por um antigeno de fibrossarcoma,