JPH11500607A

JPH11500607A - マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体３ｈ１

Info

Publication number: JPH11500607A
Application number: JP8520611A
Authority: JP
Inventors: チャッタージー，マラヤ; コーラー，ヘインズ; ケイ．チャッタージー，スニル; エイ．フーン，ケニース
Original assignee: ユニバーシティオブケンタッキー
Priority date: 1994-12-28
Filing date: 1995-12-28
Publication date: 1999-01-19
Also published as: MX9704897A; US5977315A; ES2197217T3; US20010047083A1; DK0800578T3; DE69530107T2; WO1996020277A3; WO1996020219A2; EP0800578B1; AU717779C; CA2209172C; EP1298144A3; US7090842B1; AU4692796A; EP0796280A2; AU717779B2; WO1996020219A3; DE69530415T2; MX9704898A; AU4649896A

Abstract

(57)【要約】本発明は、免疫寛容を回避し、そして進行性のCEA関連疾患を有するマウス、ウサギ、サル、および患者においてCEAに対する特異的な免疫応答を誘発する、モノクローナル抗イディオタイプ抗体3H1を提供する。本発明はまた、ガン胎児性抗原上の特定のエピトープを模倣するCEA関連腫瘍および3H1を産生するハイブリドーマの検出または処置に使用され得る組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体3H1 関連出願の引用本出願は、1994年12月28日に出願された、米国特許第08/484号の一部継続出願であり、その全てが参考として本明細書中に援用される。政府の援助による研究の下で行われた発明に対する権利に関する陳述本発明は、研究の一部を米国Public Health Service（CA 47860）および国立衛生研究所（CA 57165）の援助でなされた。政府は、本発明において所定の権利を有する。発明の分野本発明は、抗イディオタイプ抗体に関する。より詳細には、本発明は、ガン胎児性抗原（CEA）の特異的エピトープに対する免疫応答を誘発する、モノクローナル抗イディオタイプ抗体3H1に関する。発明の背景広範な医学研究および多くの進歩にもかかわらず、依然としてガンは米国における死亡原因の第２位である。結腸直腸ガンは３番目に多いガンであり、そしてガンの死亡原因の第２位である。従来の治療様式（例えば、外科手術、放射線療法、および化学療法）が広く用いられ、そして多くの成功例がみられる一方、結腸直腸ガンのようなガンによる死亡率は依然として高く、新たな治療様式が強く求められている。腫瘍細胞、または腫瘍由来のワクチンを使用するヒトガンの免疫治療は、いくつかの理由のため期待されている程ではない。精製された腫瘍関連抗原を大量に得るのは通常困難である。これらは、しばしば化学的に検出されにくく、そして精製が困難である。さらに、腫瘍抗原に対する免疫生物学的応答能の問題が依然として残っている。言い換えれば、ガン患者が自己の腫瘍に対する免疫応答を効果的に成し得るかどうかという問題である。ガン関連抗体（TAA）は、しばしば「自己（self）」の一部であり、そして通常、抗原に対する寛容性（例えば、Ｔ細胞が媒介する抑制）のために、TAAが腫瘍保有宿主中において惹起する免疫応答は非常に乏しい。免疫生物学者は、分子環境を変化させることにより、（免疫応答の誘発の見地から）弱い抗原を強い抗原に変換させ得ることを習得している。ハプテンキャリアを改変すると、Ｔ細胞ヘルパー細胞が活性化され、免疫応答全体がより強力になる。従って、キャリアの改変はまた、寛容性抗原を有効な抗原に変換し得る。McBridgeら（1986）Br ．J．Cancer 53:707。多くの場合、ガン患者の免疫学的状態は抑制されるが、この場合、患者は特定のT-依存性抗原に応答することしかできず、他の抗原形態には応答し得ない。これらのことを考慮して、抗原をワクチンとして使用する前に腫瘍関連抗原への分子の改変を導入することを考えるべきである。不運なことに、これはほとんどの腫瘍抗原について達成不可能である。なぜなら、それらは十分に同定されておらず、そして、その精製が非常に困難であるからである。 Lindemann((1973)Ann ．Immunol. 124:171-184)およびJerne((1974)Ann ．Immun ol. 125:373-389)のネットワーク仮説は、エピトープ構造を、抗体の表面で発現されるイディオタイプの決定基に変換するための優れたアプローチを提示する。このネットワークの概念によると、所定の腫瘍関連抗原による免疫化は、この腫瘍関連抗原に対する抗体（Ab1という）の産生を生じ、次いでこのAb1は、Ab1に対する一連の抗イディオタイプ抗体（Ab2という）を産生するのに使用される。これらのAb2分子のいくつかは、Ab1で同定される腫瘍関連抗原の三次元構造を効果的に模倣し得る。Ab2βと呼ばれるこれらの特定の抗イディオタイプは、Ab1のパラトープに適合し、そして腫瘍関連抗原の内部イメージを発現する。Ab2βは、オリジナルの腫瘍関連抗原によって誘導されるのと同様の特異的な免疫応答を誘導し得るので、代理の腫瘍関連抗原として使用され得る。Ab2βによる免疫化は、Ab1によって同定される対応するオリジナルの腫瘍関連抗原を認識する、抗- 抗-イディオタイプ抗体（Ab3）の産生をもたらし得る。このAb1様の反応性のために、Ab3はまたAb1'とも呼ばれ、Ab3がAb1由来の他のイディオトープと異なることを示す。構造的に腫瘍関連抗原に類似する抗-Idモノクローナル抗体は、ガン患者に抗腫瘍免疫を誘導させるための抗原置換物として使用されている。Herlynら、 (1987)PNAS 84:8055-8059;Mittlemanら、(1992)PNAS 89:466-470;Chatterjeeら、(1993)Ann ．N．Y．Acad．Sci. 690:376-278。ガン治療に対する潜在的に有望なアプローチとしては、抗イディオタイプ抗体を使用する免疫療法がある。この治療の形態では、腫瘍関連タンパク質を介して腫瘍に対する患者の免疫系を刺激しようとする場合、腫瘍関連タンパク質のエピトープを模倣する抗体が投与される。WO 91/11465は、ヒトにおいて霊長類の抗イディオタイプ抗体を使用する、悪性細胞または感染性因子に対して免疫応答を刺激する方法について記載している。しかし、腫瘍に対する治療レジメにおいて、全ての抗イディオタイプ抗体が使用され得るわけではない。さらに、異なるガンは広範に変化する分子および臨床的特性を有するので、抗イディオタイプ治療は、場合に応じて、腫瘍の起源および腫瘍が発現する抗原に基づいて評価されるべきである。腫瘍関連抗原に構造的に類似している抗-Idモノクローナル抗体は、ガン患者における抗原置換物として使用されている。Herlynら、(1987)PNAS 84:8055-805 9;Mittlemanら、(1992)PNAS 89:466-470;Chatterjeeら、(1993)Ann ．N．Y．Acad ．Sci. 690:376-278。抗-Idは、免疫原性に関して、腫瘍関連抗原の部分的アナログを提供することが提唱されている。ガン胎児性抗原（CEA）は、胃腸管の内胚葉由来の新生物（例えば、結腸直腸ガンおよび膵臓ガン、ならびに乳ガンおよび肺ガンのような他の腺ガン）に存在する、180,000キロダルトンの糖タンパク質の腫瘍関連抗原である。CEAはまた、ヒト胎児の消化器官中にも見出される。循環CEAは、CEAポジティブの腫瘍を有する患者の大部分に検出され得る。特定のモノクローナル抗体がCEAに対し惹起され、そしてそのいくつかは診断および臨床的研究のために放射性標識される。Ha nsenら、(1993)Cancer 71:3478-3485;Karokiら、(1992)Hybridoma 11:391-407;G oldenberg(1993)Am ．J．Med．94:297-312。免疫系により自己抗原として認められるほとんどの腫瘍関連抗原の場合と同様に、ガン患者は免疫学的にCEAに「寛容」である（おそらく、CEAが胎児性由来であるため）。CEAポジティブの腫瘍を有する患者に関する現在までの研究では、CEAに対する免疫を産生する能力は明らかにされていなかった。従って、CEAに基づく免疫療法は、これまで不可能であった。しかし、CEAは、抗イディオタイプ抗体を用いる積極的な免疫治療において、優れた腫瘍関連抗原である。CEAは、代表的には腫瘍細胞表面に高レベルで存在する。CEAはまた、遺伝子配列が既知であり、そしてその三次元構造が同定されている最も良く特徴が調べられている抗原の１つである。CEAは、細胞-細胞相互作用に関与すると考えられている第19染色体上に位置する、免疫グロブリン超遺伝子ファミリーのメンバーである。 CEA上のエピトープの中には正常な組織に共有されるものもあるので、インタクト（intact）なCEA分子で免疫化すると、有害と思われる自己免疫反応を引き起こし得る。他方、腫瘍関連エピトープに対する免疫反応が所望される。適切な抗イディオタイプ抗体は、CEAポジティブのガン患者の抗腫瘍免疫を誘導するための優れた候補である。多くの研究者が、ラット、マウス、ヒヒ、およびヒトにおいて、CEAを模倣する抗イディオタイプ抗体を作製した。例えば、Hinodaら、( 1995)Tumor Biol. 16:48-55;Losmanら、(1994)Int ．J．Cancer 56:580-584;Irvi neら、(1993)Cancer Immunol ．Immunother. 36:281-292を参照のこと。しかし、 CEA（およびおそらく多くのエピトープ）のサイズと、CEAがいくつかの正常な組織上で発現するという事実とを考慮すれば、抗イディオタイプ抗体が、抗腫瘍免疫を引き起こす抗CEA応答を誘発するのに有効であるかどうかは不明であった。胃腸管のガン腫は、多くの場合、標準的な治療では治療不可能である。従って、この疾患に対する新規の治療上のアプローチが必要とされる。本発明は、進行性のCEA関連疾患（例えば、結腸直腸ガン）を有する胃腸管ガン患者において、抗腫瘍免疫を誘導するための抗原（Ag）置換物として、モノクローナル抗イディオタイプ抗体（3H1）を提供することによって、先行技術の欠点を克服している。本明細書中に引用する全ての刊行物は、その全体が参考として援用される。発明の要旨本発明は、ガン胎児性抗原（CEA）に対する免疫応答を誘発し得る、マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体（3H1）を提供する。本発明はまた、3H1の可変領域のアミノ酸配列および3H1のこれらの可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。従って、１つの局面では、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ATCC受託番号第HB 12003号およびそれらの子孫により産生される、モノクローナル抗イディオタイプ抗体3H1を包含する。別の局面では、本発明は、ATCC受託番号第HB1200号で示されるハイブリドーマ細胞株およびそれらの子孫を包含する。別の局面では、本発明は、配列番号２と同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号４と同一の重鎖可変領域アミノ酸配列を有するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株を包含する。別の局面では、本発明は、配列番号２と同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号４と同一の重鎖可変領域アミノ酸配列を有するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を包含する。本発明の別の局面は、配列番号２と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによってコードされる、軽鎖の可変領域、および、配列番号４と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによってコードされる、重鎖の可変領域を有する抗体である。別の局面では、本発明は、有効量のモノクローナル抗イディオタイプ抗体3H1 を含有する薬学的組成物およびワクチンを包含する。別の局面では、本発明はまた、進行性のCEA関連疾患を有する個体において、免疫応答を誘発する方法を包含する。これらの方法は、個体に有効量の3H1を投与する工程を包含する。別の局面では、本発明は、腫瘍細胞に結合している抗CEA抗体の存在を検出する方法であって、腫瘍細胞と3H1を十分な時間接触させて、抗CEA抗体に結合させる工程、および抗CEA抗体に結合している任意の3H1の存在を検出する工程を包含する方法を提供する。別の局面では、本発明は、抗CEA抗体の検出または定量のための診断キットを提供する。これらのキットは、適切なパッケージング中に3H1を含有する。本発明の別の局面は、進行性のCEA関連疾患を有する個体における、CEA関連疾患を緩和する方法である。これらの方法は、個体に有効量の3H1を投与する工程を包含する。図面の簡単な説明図１は、3H1の軽鎖可変領域のDNA配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。図２は、3H1の重鎖可変領域のDNA配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。図３は、マウスおよびラットの免疫グロブリンκ鎖の遺伝子配列であって、異なる株に対するκ鎖定常領域中の配列を比較し、そしてアロタイプの相異を強調している。BALB/c（配列番号５）、PL（配列番号６）、SJL（配列番号７）、およびM.spretus（配列番号８）に対するκ鎖定常領域の配列を含む。４つの遺伝子のアロタイプは、２つのタンパク質のアロタイプをコードする。天然に存在する他のアロタイプも可能である。この図はSolinら、(1993)Immunogenetics 37:4 01-407より引用され、それは本明細書中で参考として援用される。図４は、マウス免疫グロブリン重鎖の２つのアロタイプを示す。コードされたタンパク質（配列番号10）に加えて、新生マウスの生殖細胞のDNA配列（配列番号９）を示す。列の上に、マウスミエローマMOPC 21から得られた別のタンパク質配列（配列番号11）を示す。天然に存在する他のアロタイプも可能である。この図はHonjoら、(1979)Cell 18:559-568から引用され、それは本明細書中で参考として援用される。図５は、3H1の反応性を種々の抗体と比較した棒グラフである。直接結合RIAにより主要なIgサブクラスに属する、mAbの種々の特異性のパネルに対して、¹²⁵I- 3HIが試験された。図６は、3H1による、放射性標識8019(Ab1)の半精製CEAへの結合の阻害を示す。丸印は3H1を示し、正方形は4EA2および非関連抗体を示す。3H1は25ngの濃度から結合を100％阻害し始めた。図７は、CEAによる、8019(Ab1)の3H1への結合の阻害を示したグラフである。黒丸は半精製CEAを示し、白丸は8019に結合しないコントロールの糖タンパク質を示す。半精製CEAは、2.5μgで抗Id 3H1のヨウ素化8019への結合を50％阻害したが、非関連糖タンパク質は、それより高濃度でも結合を阻害しなかった。図８は、3H1で免疫化したマウス由来の血清の、CEAへの結合を示した棒グラフである。第１のバーはPBS-BSAであり、第２のバーは抗4EA2であり、第３のバーは免疫化前の血清であり、そして第４のバーは3H1で免疫化したマウス由来の血清である。これらは、不溶化CEAに結合する抗体を誘導し、3H1での免疫化を示す。図9-1〜9-4は、8019(Ab1)(図5-1)；3H1で免疫化したマウス由来の血清(図5-2) ；免疫化前の血清(図5-3)と反応させたLS174-T細胞のFACS分析を示す。3H1で免疫化したマウス由来の血清は、8019(Ab1)(5-1)で得られた結合パターンと類似の明白な結合(5-2)を示した。CEAを発現しないヒトＢ細胞リンパ腫細胞では、顕著な結合は観察されなかった（図5-4）。図10は、3H1で免疫化したウサギ由来の血清によりLS174-T細胞に結合した8019 の阻害を示すグラフである。白丸は8019(Ab1)を示し、黒丸はウサギ#730由来の血清を示す。白正方形はウサギ#729由来の血清を示し、白三角形は免疫化前の血清を示す。図11は、ウサギ血清中のAb3のCEAへの結合を示す、免疫ブロットの弱い発色の（half-tone）複写物である。全ての反応は、CEAの半精製抽出物と共にSDS-PAGE によって分離された。レーン１、分子量マーカー；レーン２、Buffaro blackで染色されたCEA抽出物；レーン３、8019；レーン４、ウサギ血清（3H1で免疫化後）；レーン５、免疫化前のウサギ血清；レーン６、非関連抗Id 4EA2で免疫化された、ウサギ由来のコントロール血清。図12は、マウス血清中Ab3のCEAへの結合を示す、免疫ブロットの弱い発色の複写物である。レーン１、8019(Ab1)；レーン２、モノクローナルマウスAb3；レーン３、コントロール。図13は、Ab3によって免疫染色された（イムノペルオキシダーゼ）正常組織およびガン組織の切片を示す、弱い発色の複写物である。正常および悪性結腸の組織の両方におけるAb3の反応性のパターンは、Ab1について得られたものとほぼ同一であった。図14は、Ab3によって免疫染色された（イムノペルオキシダーゼ）正常組織およびガン組織の切片を示す、弱い発色の複写物である。mAb Ab3との反応が、腫瘍細胞の染色を示したが分泌されたムチンの染色は示さなかったのに対して、80 19(Ab1)との反応は、腫瘍細胞ならびに分泌されたムチン物質の染色をもたらした。図15は、ヒト胃腸ガン腫に対するイディオタイプをスキームで示す。図16は、ラジオイムノアッセイ（RIA）によって、サル(PRO667)Ab3血清による 3H1のAb1(8019)への結合の阻害を示すグラフである。白正方形は、免疫化前の血清を示し、黒正方形は第２の注入後の血清を示し、白丸は第３の注入後の血清を示し、そして白三角形は第４の注入後の血清を示す。図17は、ELISAによる、サルAb3血清の精製CEAへの結合を示す棒グラフである。白のバーは免疫化前の血清を示し、間隔の狭い斜線をつけたバーは免疫血清を示し、そして水平に斜線をつけたバーはコントロール血清を示す。実線で結んだ黒丸は、非関連抗原CEAを示す。図18は、ELISAによる、サルAb3血清(PRO667)の精製CEAへの結合の動力学を示すグラフである。中心に点を有する白丸は、免疫化前の血清を示し、白丸は第１の注入後の血清を示し、十字は第２の注入後の血清を示し、白正方形は第４の注入後の血清を示す。図19-1および19-2は、サルAb3血清を有するLS174-T細胞の、免疫フローサイトメトリー分析を示すグラフである。図19-1において、腫瘍細胞と、免疫化前の血清および3H1で免疫化したサル由来のAb3血清（１：100希釈）とを反応させた。図19-2において、CEAを発現しないMOLT-4細胞と、3H1に対する免疫化前のおよび免疫サルAb3血清と反応させた。図20-1〜20-4は、サルAb3による、結腸腺ガンおよび正常結腸のイムノオキシダーゼ染色を示す弱い発色の複写物である。以下の腫瘍細胞の一連の切片を染色した。20-1、サルAb3(50μg/ml)；20-2、8019 IgG₁(50μg/ml)；20-3、非関連サルAb3(50μg/ml)。図20-4は、サルAb3(50μg/ml)による、正常結腸細胞の染色を示す。図21は、Ab3サルPRO 667（レーン１）、8019（レーン２）、および非関連Ab2 で処置されたAb3サル（レーン３）で免疫沈降させた後の、¹²⁵I標識CEAを用いるSDS- PAGEゲルのオートラジオグラムの弱い発色の複写物である。図22は、精製サルAb3による、LS174-T細胞へのAb1の結合の阻害を示すグラフである。中心に点を有する正方形は、3H1で免疫化されたサル由来の精製Ab3を示す。白丸は、コントロール11D10で免疫化されたサル由来の精製Ab3を示す。図23は、ヒトAb3血清によるAb1(8019)の3H1への結合阻害を、RIAにより示したグラフである。黒正方形は患者#1を示し、黒三角は患者#2を示し、白正方形は患者#3を示し、白三角は患者#4を示し、黒丸は患者#5を示す。点線は免疫化前の血清を表す。図24は、精製された放射性標識CEAとのヒトAb3の反応性を示す棒グラフである。各バーはサンプルを表し、サンプル1-12は患者1-12に由来し、サンプル13はPB S-BSAコントロールであり、そしてサンプル14はAb1 8019(10μg)である。図25-1〜25-3は、CEAポジティブ結腸ガン細胞株LS174-Tと患者のAb3血清との反応のフローサイトメトリーを示すトレースの複写物である。腫瘍細胞を、3H1 （図25-1）およびマウスAb1（図25-2）で免疫化した患者由来のAb3血清と反応させた。図25-3において、CEA(Raji)を発現しないヒトＢリンパ腫細胞をAb3と反応させた。実線はAb3血清を示し、点線は免疫化前の血清を示す。図26は、患者のAb3による、Ab1のLS174-Tへの結合の阻害を示す棒グラフである。黒塗りのバーはAb3を示し；斜線のバーはAb1を示す。図27は、8019(レーン１)、患者番号１由来のAb3(レーン２)、患者番号２由来のAb3(レーン３)、および非関連Ab2で処置した患者由来のAb3(レーン４)で免疫沈降した後のSDS-PAGEゲル分離¹²⁵I-標識CEAのオートラジオグラムの弱い発色の複写物である。図28-1〜28-6は、Ab1および患者のAb3による、オートロガスおよびアロジェニックの結腸腺ガンおよび正常結腸の、イムノペルオキシダーゼ染色を示す弱い発色の複写物である。一連の切片は以下により染色される：オートロガス腫瘍上の患者のAb3(図29-1)；アロジェニック腫瘍上の患者のAb3(図29-2)；8019 I_gG₁(図 29-3)；図１に示すような、腫瘍切片上の非関連の患者のAb3(図29-4)；正常結腸上の8019 I_gG₁（図29-5）；正常結腸上の患者のAb3(図29-6)。図29-1および29-2は、２名の患者におけるＴ細胞増殖アッセイ（29-1、番号１；29-2、番号12）を示す棒グラフである。各図について、バーの各組は、以下の存在下におけるＴ細胞増殖の程度を示す：3H1-Alugel（第１の組）；イソ-アロタイプ一致のコントロール4DC6-Alugel（第２の組）；精製CEA（第３の組）；精製ウシ血清アルブミン(BSA)（第４の組）；およびフィトヘマグルチニン（第５の組）。各組について、黒の（第１の）バーは免疫化前の血清を示し、斜線の（第２の）バーは免疫化後の血清を示す。発明の実施態様本発明者らは、腫瘍関連抗原であるガン胎児性抗原（CEA）の明白かつ特異的なエピトープに対する特異的な免疫応答を誘導する、モノクローナル抗イディオタイプ抗体を発見した。このエピトープはCEAに独特のものであり、そして正常組織にまた見出されるこのファミリーの他のCEA関連低分子量メンバー上には存在しない。モノクローナル抗体8019(Ab1)（この抗体に対して3H1が惹起された）で定義される抗原決定基は、イムノペルオキシダーゼ染色および造血分析から明らかなように、正常な成人組織には存在しない。3H1を産生するハイブリドーマは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、1995年12月15日に、American Type Culture Collection(ATCC)、12301 Parkla wn Drive、Rockville、MD、U．S．A 20852に寄託された。受託番号第HB12003号を得た。本発明者らはまた、3H1が進行性のCEA関連腫瘍を有する個体の免疫応答（液性および/または細胞性）の誘発に有効であることを見出した。特定の理論に束縛されることを望まないが、これが生じ得る１つの様式は、3H1結合部位をより免疫原性にする他のエピトープの存在下、3H1結合部位がCEA中のエピトープに部分的に類似する領域を提示し得ることである。従って、本発明の抗体は、これらの個体におけるCEA関連腫瘍の処置に有用である。これはまた、Ab1またはAb3の検出にも有用である。本明細書中で使用される用語「3H1」「3H1抗体」および「3H1 モノクローナル抗イディオタイプ抗体」は、ATCCで寄託された3H1ハイブリドーマ細胞株により産生される免疫グロブリンを示すのに互換的に使用される。3H1の定義には、3H1 の重鎖および軽鎖の可変領域全体を含有し、そして標準イムノアッセイ（例えば、Fab、F(ab')₂、およびF(ab')）により8019(Ab1)に結合可能なインタクトな抗体の酵素的切断および/または化学的処理により生産されるフラグメントが含まれる。１つの実施態様では、本発明は、ハイブリドーマ細胞株ATCC HB 12003またはその子孫により産生されるモノクローナル抗イディオタイプ抗体（本明細書では、「抗Id」と呼ぶ）を包含する。本発明はまた、ATCC番号 HB 12003によって示されるハイブリドーマ細胞株を包含する。本明細書中で使用されるハイブリドーマの「子孫（progeny）」とは、ハイブリドーマの系統派生物（descendant）であり、変異または他の順応のため、オリジナルの（親）細胞と完全に同一であっても同一でなくてもよいが、免疫寛容を回避する（すなわち、CEAに対する免疫反応を引き起こす）能力を維持するモノクローナル抗体を産生する。モノクローナル抗イディオタイプハイブリドーマの産生および3H1の選択 3H1を、抗イディオタイプ応答に対し、8019抗体を免疫原として使用することによって得た。8019は、CEAファミリーの他のメンバーに存在しないCEAの独特のエピトープに結合し、実質的に、正常成人組織または顆粒細胞を含む造血細胞との交差反応性を伴わない。Koprowskiら、(1979)Somatic Cell Genet. 5:957；Mi tchell(1980)Cancer Immunol ．Immunother. 10:1。同系BALB/cマウスを４時間、8019(Ab1)で免疫化し、そして、それらの脾臓細胞を非分泌性マウスミエローマP3-653細胞と融合した。スクリーニングの手順は、以下の４つの工程を包含した：（１）8019に結合している抗体についてのポジティブ選択、（２）アイソタイプまたはアロタイプの決定基を認識する抗体に対するネガティブ選択、（３）8019のCEAへの結合を阻害する能力についてのポジティブ選択、（４）マウスおよびウサギの両方におけるオリジナルの腫瘍関連抗原(CEA)に対する液性免疫応答を誘導する能力のポジティブ選択。 8019の免疫化Idに特異的であり、そしていずれのアイソタイプまたはアロタイプ決定基にも反応しないいくらかのAb2ハイブリドーマを得た。抗8019が、8019 のパラトープに対するものであるかどうかを決定するため、種々の量のAb2ハイブリドーマ培養上清の存在下で、プレートに結合したCEAまたはCEAポジティブ細胞株LS174-Tへの放射性標識8019の結合について研究した。わずか５μlの培養上清で、試験された抗Idのいくつかは、90％より多く結合を阻害した。8019のCEA への結合を阻害し得るAb2産生株は、さらなる研究のために、増殖され、そして腹水から精製された。異なる精製Ab2を、ワクチンとして調製し、そして過去に実験を受けたことがないマウスおよびウサギに注射した。３回以上の注射の後、免疫化Ab2だけでなくCEAにも結合するAb3の存在を調べるために、血清サンプルを力価測定（titere d）した。所望の特異性を有するAb3の最高の力価を再現可能に誘導するAb2を、3 H1と命名した。3H1を得るために用いる方法の詳細を、実施例１に示す。 3H1で免疫化された動物において産生されるAb3を、さらに特徴付けした。マウスおよびウサギの両方由来の免疫血清は、CEA関連細胞株LS174-Tへの結合に対し Ab1と競合し、そして放射性ヨウ素化Ab1のAb2への結合を阻害した。このことは、マウスおよびウサギの抗-抗Id(Ab3)は、Ab1(8019)と同じイディオトープを有し得、そしてそれらはおそらく、Ab1と同じエピトープに結合することを示唆した。 CEAポジティブ抗原に結合するモノクローナルAb3もまた、3H1で免疫化したマウスから得られている。Ab3（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）を、ドットブロット解析により半精製CEAと反応させ、そしてイムノペルオキシダーゼ法によりLS174-T細胞を染色した。3H1の非ヒト霊長類（カニクイザル）への投与によっても、免疫応答を生じた（実施例３）。3H1に応答して産生されるAb3 は、CEAに特異的であった。重要なことに、CEA関連腫瘍を有するヒトは、CEA抗原に対し寛容となるが、本発明者らは、進行性のCEA関連疾患を有する患者において3H1が免疫応答を誘発することを発見した。標準的治療が奏効しなかった、CEAポジティブの進行性結腸ガン腫を有する12名の患者に、3H1を投与した。12名の患者のうち９名に、抗CEA である抗体が生じた（図23-27）。さらに、12名の患者のうち７名が、Ｔ細胞増殖アッセイ（図29）で明らかなように、細胞性免疫応答を示した。これらの７名の全ての患者はまた、Ab3応答を生じた。このことは、進行性の疾患を有する患者においてCEAに対する免疫寛容を破壊した、最初の例示である。本研究のさらに詳細な記載は、実施例３において見出される。本発明者らはまた、3H1の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸配列、ならびに3H1の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を見出した。従って、本発明は、図１に示す配列（配列番号２）と同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列および図２に示す配列（配列番号４）と同一の重鎖可変領域アミノ酸配列を有する、抗イディオタイプ抗体を包含する。本発明はまた、図１に示す配列（配列番号１）と同一のポリヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変領域、および図２に示す配列（配列番号３）と同一のポリヌクレオチド配列によりコードされる重鎖可変領域を有する、抗体を包含する。「同一の」ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、配列を整列した場合に、塩基（ポリヌクレオチド）とアミノ酸との間に正確な一致があるものをいう。実施例２は、3H1 cDNAのクローニングについて記載し、それからアミノ酸配列が推定される。本発明者らのアミノ酸配列を確認するために、10〜15の分解サイクルで、3H1の軽鎖および重鎖の配列を決定した。得られたアミノ酸配列は、cDN Aから推定された配列と同一であった。本発明はまた、図１に示す配列（配列番号２）と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖可変領域と、図２に示す配列（配列番号４）と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによってコードされる重鎖可変領域とを包含する。所定のアミノ酸配列から、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを推定することは、当業者に周知である。本発明はまた、ハイブリドーマ細胞株（そのサンプルはAmerican Type Cultur e Collection(ATCC)、12301、Parklawn Drive、Rockville、Maryland、U.S.A、2 0852に寄託され、受託番号第12003号を得た）およびその子孫を包含する。本発明はまた、図１に示す配列（配列番号２）と同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列および図２に示す配列（配列番号４）と同一の重鎖可変領域アミノ酸配列とを有するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株を包含する。軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列をコードするプラスミドは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき（定常領域の一部と共に）、に、American Type Culture Collection(ATC C)、12301、Parklawn Drive、Rockville、Maryland、U.S.A、20852に寄託された。それらは、それぞれ受託番号第号および第号を得た。本発明はまた、検出可能なシグナルを産生し得る標識に結合する3H1を包含する。これらの結合された抗体は、例えばAb1（および/またはAb3）の定量またはイメージングのような系の検出に有用である。このような標識は当業者に公知であり、そして放射性同位体、酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物を包含するが、これらに限定されない。標識は3H1に共有結合し得るか、あるいは第２の試薬（例えば、第２抗体、プロテインＡ、またはビオチン-アビジン複合体）を介して3H1に結合し得る。抗体を標識する方法は、当該分野で公知であるので、本明細書中に詳細に記載する必要はない。 3H1の調製本発明の抗体は、いくつかの方法で得ることができる。3H1は、本明細書中に記載のハイブリドーマATCC番号HB12003から産生され得る。抗体を単離する方法は、当該分野で周知である。例えば、HarlowおよびLane(1988)Antibodies: A La boratory Manual 、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、およびSambrook ら(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Labora toryを参照のこと。抗体は、組織培養物を介して、またはマウスの腹水由来のハイブリドーマから得ることができる。これらの技術は当該分野において公知である。例えば、細胞は適切な培地で培養され得、そして、消費された培地は、抗体の供給源として使用され得る。必要に応じて、マトリックスでコートしたチャンネルまたはビーズおよび細胞同時培養（co-culture）が、抗体産生細胞の増殖を促進するために含有され得る。大量の抗体を産生するためには、通常は腹水を得るのがより便利である。このような方法は当該分野で公知であり、そして、一般的には、ハイブリドーマ細胞を免疫学的に組織適合性でも免疫寛容でもない哺乳類（特にマウス）に注射する工程を包含する。哺乳類は必要に応じて、腹水の産生のために、適切な組成物（例えば、プリスタン）の先の（prior）投与により処理される。好ましくは、3H1は、組換えプロテインG-アガロースクロマトグラフィーとそれに続くプロテイン-A-CL-セファロース4Bクロマトグラフィーによって、BALB/cから精製される。あるいは、3H1は、当該分野で公知の技術を使用して化学的に合成され得、例えば、Applied Biosystems．Inc.(Foster City、CA)により製造されるような、市販の自動ペプチド合成装置を使用して合成される。 3H1はまた、Sambrookら(1989)に記載のような、ルーチンの再結合法の使用によっても得ることができる。例えば、3H1の重鎖または軽鎖のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクター（それは転写のためのコントロール配列（例えばプロモーター）を含有する）にクローン化され得る。発現ベクターは、順番に宿主細胞に導入される。宿主細胞を、ポリヌクレオチドがタンパク質に転写および翻訳されるような適切な条件の下で増殖させる。3H1の重鎖および軽鎖は別に産生され得、次いでジスルフィド結合の再配列により結合し得る。あるいは、3H1の各鎖をコードする別のポリヌクレオチドを有するベクター、または別の転写物として両方の鎖をコードする単一のポリペプチドを有するベクターは、単一の宿主細胞にトランスフェクトされ得、それは次いで、分子全体を産生し得、そして組み立て得る（assemble）。好ましくは、宿主細胞は、分子の正常な炭水化物補足物を供給し得る高等な真核細胞である。このように宿主細胞中で産生された3H1は、当該分野の標準的な技術を使用して精製され得る。これらの方法のいずれかによる3H1の産生に使用するための、次に3H1をコードするポリヌクレオチドは、3H1を産生するハイブリドーマから得ることができ、あるいは、本明細書中に提供されたDNA配列から、合成的にまたは再結合的に産生され得る。 3H1抗体は、IgG1マウスのサブクラスであり、そして、このアイソタイプの免疫グロブリンに適切な任意の技術によって単離され得る。精製方法には、塩析（例えば、硫酸アンモニウムを使用して）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン性またはアニオン性の交換カラム上で中性pHにおいて行われ、段階的にイオン強度のグラジエントを増加させながら溶出される）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル濾過HPLCを含む）、およびアフィニティー樹脂（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、ハイドロキシアパタイト、および抗免疫グロブリン）上のクロマトグラフィーが挙げられ得る。3H1はまた、8019パラトープを含有するアフィニティーカラム上で、例えば精製Ab1またはAb3の形態で精製され得る。 3H1が個体に投与される場合、3H1は好ましくは少なくとも80％の純度であり、より好ましくは、少なくとも90％の純度であり、さらにより好ましくは、発熱物質および他の混入物がない、少なくとも95％の純度である。この場合は、純度パーセントは、調製物の全タンパク質含量の重量パーセントで算出される。用途および3H1の使用方法 3H1は、いくつかの用途を有する。3H1は、進行性のCEA関連疾患を有する個体の免疫応答を誘発し、それゆえ、個体のCEA関連疾患を治療するのに使用され得る。好ましくは、免疫応答は抗CEAである。さらに、3H1は、CEAまたは3H1に結合する抗体を検出するのに使用され得る。3H1はまた、標識モノクローナル抗CEA抗体で予め処理された患者の循環系に由来する、望ましくない過剰な標識Ab1を除去するのにまた使用され得る。標識は、その意図する用途に適切な抗体に結合した任意の標識であり得、例えば、放射性同位体、トキシンのような毒性部位、および薬物が挙げられる。3H1はまた、イメージングにおいて、腫瘍の検出を増強させるのに有用である。従って、本発明は、CEA関連腫瘍のような進行性のCEA関連疾患を有する個体の免疫応答を誘発する方法を包含し、この方法は、すなわち有効量の3H1を、個体へ投与することを包含する。好ましくは、応答は、抗CEA抗体の産物である。本明細書中で使用される、「個体」は、脊椎動物であり、好ましくは哺乳類であり、そしてより好ましくはヒトである。哺乳類には、飼育動物、競技動物（sport animals）、およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。「CEA関連腫瘍」は、CEA抗原（特に腫瘍細胞の表面で発現する）を含むものである。本明細書中で使用される「進行性の」CEA関連腫瘍は、検出可能な転移（すなわち、腫瘍の原発性部位以外の部位にある検出可能な腫瘍塊）が存在することを意味する。塊は、好ましくは当該分野で公知のイメージング技術（例えば、Ｘ線またはCT スキャン）により検出される。「有効量」は、体液性および/または細胞性の、免疫応答を誘発するのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与により投与され得る。好ましくは、免疫応答は、抗CEAの産物である。 3H1抗体の投与に適切な被験体は、多数の異なる条件により同定され得る。例えば、免疫応答に対する3H1の効果を研究するのに、あるいは抗CEA特異的抗体または細胞株のような有用な試薬を得るのに、実験動物に3H1が投与され得る。好ましい実施態様では、3H1は、CEA関連腫瘍のような進行性のCEA関連疾患の処置に使用され得る。処置のために、進行性のCEA関連腫瘍を有する個体に、有効量の3H1が投与される。本明細書中で使用される、処置のための「有効量」とは、病態を緩和するのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与により与えられ得る。有効量の3H1による、進行性のCEA関連疾患を有する個体の処置は、そのように処置されない他の個体と比較して、以下の効果のいずれかを有する：疾患の進行速度の減少、病態の安定化、拡大の防止および/または軽減。本明細書中で使用される「進行性の」CEA関連腫瘍は、検出可能な転移（すなわち、腫瘍の原発性部位以外の部位にある検出可能な腫瘍塊）が存在することを意味する。塊は、好ましくは当該分野で公知のイメージング技術（例えば、Ｘ線またはCTスキャン）により検出される。進行性のCEA関連腫瘍について免疫応答を誘発し、または個体を処置するために、3H1は個体に非経口的に投与され、好ましくは、皮内に（intracutaneously ）投与される。他の投与経路として、筋肉内および皮内（intradermal）が挙げられるが、これらに限定されない。3H1はまた、培養細胞の処理、それに続くこれら培養細胞の個体への導入によって、間接的に投与され得る。投与される3H1の量は、個体の症状および投与の経路のようないくつかの要因に依存する。代表的には、投与用量は、約0.1mg〜約20mgの範囲である。より好ましくは、用量は約0.5mg〜約10mgの範囲であり、より好ましくは、約１mg〜約８mgの範囲である。好ましくは、用量は約１mg〜約４mgである。3H1は代表的には、２週間毎に４回投与され、続いて必要ならば１ヶ月毎に投与される。次回以降の注射の時期（すなわち、維持用量）は、特に、処置される個体の症状および応答に依存する。維持（追加）投与がいつ与えられるべきか（代表的には、約３ヶ月毎）を決定するために、好ましくは本明細書に記載の診断方法によってAb3 のレベルがモニターされ得る。好ましくは、3H1は薬学的に受容可能な賦形剤と共に投与される。薬学的に受容可能な賦形剤は、薬学的に有効な物質の投与を容易にする、比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤には、ワクチン組成物に形態または濃度（consistenc y）を与えることができ、あるいは希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤には、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、種々の浸透圧に対する塩、カプセル化剤、緩衝剤、ならびに皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な賦形剤の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Alfonso R ．Gennaro編、第18版、1990）に記載される。好ましくは、3H1は、3H1の存在を強化する、または3H1に対する免疫応答を強化するアジュバントと共に使用される。適切なアジュバントとしては、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、（QS-21 米国特許第5,057,540号）、DHEA（米国特許第5,407,684号および同第5,077,284号）およびその誘導体（塩を含む）、ならびに先駆体（例えば、DHEA-S）、β-2ミクログロブリン(WO 91/16924)、ムラミルジペプチド、ムラミルトリペプチド（米国特許第5,171,568号）、ならびにモノホスホリル脂質Ａ（米国特許第4,436,728；WO 92/16231）およびその誘導体（例えば、Detox^TM）、ならびにBCG（米国特許第4,726,947号）が挙げられる。他の適切なアジュバントとしては、アルミニウム塩、スクアレン混合物（SAF-1）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製物、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Quil A、コレラトキシンＢサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、ならびにTakahashiら(19 90)Nature 344:873-875に記載の免疫刺激性複合体（ISCOM）が挙げられるが、これらに限定されない。脊椎動物への使用および動物中での抗体の産生のために、フロイントアジュバントのマイトジェン組成物が使用され得る。アジュバントの選択は、アジュバント存在下におけるワクチンの安定性、投与経路、およびアジュバントの規定の受容可能性に部分的に依存し、特に、ヒトへの用途を意図した場合依存する。例えば、ミョウバンは米国食品医薬品局(FDA)によって、アジュバントとしての人体への使用に承認されている。好ましくは、ミョウバン沈澱3H 1が使用される。水酸化アルミニウム沈澱3H1の調製は、実施例３に記載される。あるいは、3H1は、リポソームにカプセル化され得る。細胞への送達のために、ポリペプチドをパッケージングするのに適切なリポソームは、当該分野で公知である。 3H1は、投与の前に加熱処理され得、そして加熱処理は、アジュバント（例えば、ミョウバン）の存在下で行われ得る。加熱処理は、好ましくは45℃で30分、水浴中の無菌バイアル中で行われる。例えば、3H1は約40℃〜80℃で、好ましくは45℃〜60℃で約５分〜２時間、好ましくは15分〜１時間の期間加熱され得る。加熱処理は投与の前のいつでも行われ得る。好ましくは、加熱処理は投与の７日以内に行われる。3H1の所望の活性が顕著に失われない限り、他の加熱処理法も使用され得る。免疫応答を生じさせる目的のために、3H1は非改変の形態で投与され得る。免疫原性を改善するために3H1を改変させるのが好ましい場合もある。本明細書中で使用される「免疫原性」は、特定の抗体または細胞性免疫応答、あるいはその両方を誘発する能力を意味する。免疫原性を改善するための方法には、特に、グルタルアルデヒドまたは二官能性結合剤のような試薬での架橋、あるいは多価プラットホーム分子への結合が挙げられる。免疫原性はまた、タンパク質キャリア（特に、Ｔ細胞エピトープを含むもの）への結合によっても改善され得る。 3H1の投与の効果を決定するために、被験体は抗体（体液性）またはCEAに対する細胞免疫応答、あるいはそれらの組合せのいずれかについてモニターされ得る。生物学的サンプル中のCEA抗体（Ab3）のレベルを決定するために、例えば、血清または血漿を被験体から得る。サンプルは必要に応じて、アッセイが行われる前に免疫グロブリンを富化される（これは、通常は必要とされない）。マウス免疫グロブリン（例えば3H1）をアッセイ試薬として使用する場合、サンプルは好ましくは、抗マウス免疫グロブリン活性を除去するために前処理される。例えば、マウス免疫グロブリンカラム上での涸渇、または非特異的マウス免疫グロブリンをサンプルに混合し、そして形成した任意の免疫沈降物を除去することにより行われ得る。このアッセイを行うために、サンプル中に存在し得る抗CEAを、非制限量のCEA の抗原等価物と接触させる。これは、単離されたCEA、直接ブロッティングまたはポリアクリルアミドゲルからの転写により付着したCEAを伴うニトロセルロース、CEAを発現する細胞（例えば、LS174T細胞）、そのような細胞からの膜調製物、あるいはCEAを含む固定化組織切片であり得る。あるいは、抗イディオタイプ、特に3H1が使用され得る。一旦免疫複合体が形成されると、それは通常非複合化CEAアナログから分離され、そして存在する複合体の量が決定される。複合体は、例えば、回収した細胞の遠心分離、または免疫沈降、または固相による捕獲（capture）により、分離され得る。存在する複合体の量は、標識を有するCEAアナログを直接供給することによって、または第２の試薬と共にインキュベートすることによって測定することができる。あるいは、競合アッセイが行われ得、ここでサンプルは最初にCE Aアナログでインキュベートされ、次いで、サンプル中に存在し得る抗CEAと競合する、標識抗CEA試薬の非制限量が添加される。適切な標識には、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、および化学発光標識が挙げられる。抗CEAを含まないことが明らかな溶液を使用して、標準曲線が構成され、そして種々の相対濃度の抗CE Aを有する溶液を、サンプルの代わりに用いる。未知の量の抗CEAを含有するサンプルは、通常並行してアッセイされ、含有される抗CEAの相対量は、標準曲線との比較により決定される。3H1抗体を用いて抗CEAのレベルを決定するのに好ましいアッセイは、以下のセクションでさらに詳細に記載される。抗CEA抗体のアイソタイプは、イムノアッセイの分離段階または標識段階のいずれかでアイソタイプ特異性試薬中に含むことによって決定され得る。例えば、抗ヒトIgGは、ヒト起源の臨床サンプルに存在するIgGクラスの抗体を、分離または検出するのに使用され得る。IgGクラスの特異的抗CEAの存在は、通常、記憶応答を示す。IgMクラスの抗CEAの存在は、通常、進行している免疫刺激（例えば、 CEA発現性腫瘍の存在に起因し得る）、または進行している3H1での処置を示す。所望であれば、生物学的サンプル中で検出される抗CEA抗体は、さらに特徴付けられ得る；例えば、抗8019(Ab1)と競合させることにより、それらがCEA上の関連するエピトープに特異的であるかどうかが決定される。Ab1およびAb3の間の競合アッセイは、実施例のセクションで詳細を記載される。抗CEA抗体はまた、それが細胞傷害性であるかどうか決定するために試験され得る。補体が媒介する細胞傷害性（CMC）が、例えば⁵¹Crで標識されたCEA発現性標的細胞（例えば、LS174-T）を使用して決定される。標識は、約10⁶個の細胞を約200μCiNa₂ ^5lCrO₄を用いて60分の間、37℃でインキュベートし、続いて洗浄することにより達成され得る。このアッセイは、抗体（または抗体を含む臨床的サンプル）を標的細胞でインキュベートすることにより行う。次いで、オプソニン化された細胞を洗浄し、そして補体供給源と共にインキュベートする；例えば、モルモット血清を、固有の抗体活性を除去するためにプレ吸着（pre-adsorbed）する。37℃における適切なインキュベーション期間の後、⁵¹Crの培地への放出が決定され、そしてオプソニン化されない細胞由来のそれと比較される。⁵¹Crの放出は、CMCの活性に関連する。抗CEA抗体を特徴付ける他の方法は、ADCC応答に関連する能力を試験することである（Chereshら（1986）、Cancer Res. 46:5112）。放射性標識CEA発現性標的細胞は、抗CEA（熱不活性化血清の形態で）で、およびエフェクター細胞でインキュベートされる。正常なヒト末梢血単核細胞（PBMC）は適切なエフェクター細胞であり、そして好ましくは、エフェクター：標的比が約100において使用される。37℃で約４時間後、放出⁵¹Crの割合は、ADCC活性の測定で決定される。 3H1を投与される被験体中の細胞性免疫応答は、特定のＴ細胞活性について標準機能アッセイを行うことで定量され得る。アッセイの１つのタイプは、Ｔ細胞の増殖を測定する。このテストにおいて、末梢血単核細胞（PBMC）は、処理された被験体から回収された、全血液サンプルから得られる。実験動物に対し、脾臓細胞もまた使用され得る。Ｔ細胞は、例えば、Ficoll^TMのようなグラジエント上で遠心分離することで豊富にされ得る。次いで、細胞を種々の濃度のCEAまたは（より一般的には）照射されたCEA発現細胞の存在下で培養する。好ましくは、刺激細胞は、特に組織適合性クラスII抗原に関して応答細胞とオートロガスである。アッセイの他のタイプは、Ｔ細胞の細胞傷害性を測定する。このテストにおいて、富化されたＴ細胞の集団は、⁵¹Crで標識されたCEA発現性標的細胞（上記のように調節された）の分解に影響を与えるために使用される。好ましくは、エフェクター細胞は、応答細胞とオートロガスであり、特に組織適合性クラスＩ抗原という。Ｔ細胞の集団は、必要に応じて、CEAまたは適切な細胞株でプレ刺激（p re-stimulated）され得る。次いで、Ｔ細胞は、約10⁴個の標識標的細胞と種々の比で結合される（例えば、マイクロタイタープレートのウェル中で）。プレートは必要に応じて、細胞接触を開始するために遠心分離され、そして細胞を共に37 ℃で４〜16時間の間培養する。⁵¹Crの培地への特異的放出パーセントは、単独で培養した標識標的（ネガティブコントロール）および0.1％Triton^TMX-100のような洗浄剤で分解された標的（ポジティブコントロール）との比較により、測定される。 3H1投与の効果を測定する他の適切な測定には、疑わしいタイプのガンの進行を決定するのに適切であり得るような臨床試験が含まれる。このような試験には、炎症指示薬、マンモグラフィー、およびラジオシンチグラフィー（本開示の他の部分に記載される）が挙げられ得る。イムノアッセイを行うための3H1の使用 3H1が使用され得る別の様式は、3H1またはCEAに結合する抗体または他の免疫組成分の存在をアッセイすることである。このような化合物は、下記の3H1の治療的投与において存在し得、あるいは、免疫競合的宿主中のCEA発現性腫瘍の存在に起因して生じ得る。アッセイは、生物学的サンプル、通常は臨床的サンプルにおいて行われ得る。本明細書中で使用される、用語「生物学的サンプル」には、培地中の細胞、細胞分解物、細胞上清、血清、血漿、生物学的液体、および組織サンプルが挙げられる。本発明の実施態様において、3H1は、生物学的サンプル中に存在し得る抗CEA（特に抗3H1イディオタイプ）の存在を検出するのに用いられる。サンプルは、アッセイを行う前に、必要に応じて抗体活性を富化することによって、適切に調製される。生物学的サンプルが、3H1の非イディオタイプ領域（特に、抗マウス免疫グロブリン）に対して抗体活性を含有する疑いがある場合、それらを除去するか、またはそれらの検出を回避するようにアッセイを行うことが好ましい。抗マウス免疫グロブリン抗体は、例えば、正常マウスIgGで沈澱させるか、またはマウスIg吸着による吸着によってサンプルから除去され得る。抗マウス免疫グロブリン抗体（特に、Fc領域に特異的な抗体）の結合は、アッセイ試薬を慎重に選択することによって、最小化し得る。3H1のF(ab')₂またはFabフラグメントおよび他のマウス免疫グロブリン試薬は、特に適切である。サンプルを適切に調製した後、3H1と任意の存在し得る抗CEAとの間で複合体を形成させる条件において、サンプルと過剰な機能的当量の3H1とを混合した。次いで複合体の量を決定し、そして予想される範囲内である、既知の量の抗CEAを含有する標準サンプルと共に形成された複合体と比較した。複合体形成は、免疫沈降またはネフロメトリーにより観察され得るが、標識（例えば、¹²⁵Iのような放射性同位体）、ペルオキシダーゼおよびβ-ガラクトシダーゼのような酵素、あるいはフルオロセインのような蛍光色素によって標識される試薬を使用するために、一般により敏感である。抗体アッセイは、液相において行われ得る。例えば、抗CEAは、標識3H1と混合され得る。あるいは、サンプル中の抗CEAは、3H1上の結合部位に対し、標識抗CE Aと競合させるのに使用され得る。一般的には、結合および未結合標識は、結合パーセントを定量するために分離される。適切な分離の方法には、ゲル濾過クロマトグラフィー、およびサンプルが得られた種に由来する免疫グロブリンに対する抗体を使用する沈澱（必要に応じて、ポリエチレングリコール存在下で）が挙げられる。あるいは、結合および未結合標識の割合は、例えば、蛍光/クエンチ標識のペア、または酵素/インヒビター標識のペアを使用して、インサイチュにおいて決定され得る。例えば、米国特許第3,996,345号(Ullmanら)を参照のこと。固相（例えば、ポリエチレン試験管、マイクロタイタープレートウェル、またはマグネティックビーズ）に結合した試薬を使用して捕獲アッセイを行うことは、通常、より便利である。競合型捕獲アッセイにおいて、サンプル中の非標識抗 CEAは、3H1に結合するために、標識抗CEAと競合する。3H1は、固相支持体に直接結合し得るか、または、例えば、抗3H1を使用して後に捕獲され得る。このアッセイにおいて、固相に関連する標識の量は、サンプル中において、抗CEAの量に対し逆に相関する。サンドイッチ型捕獲アッセイにおいて、抗CEAは、直接または第２の試薬を通して固相に結合する3H1により捕獲される。洗浄の後、抗CEAは、適切な種の抗免疫グロブリン、あるいは標識が直接的または間接的に結合する第２の3H1抗体を使用して検出される。あるいは、抗免疫グロブリンを固相に結合し得、そして標識3H1はサンドイッチ型アッセイを完結させるのに使用される。使用される抗免疫グロブリンがアイソタイプ特異性である場合、抗体のクラスもまた決定され得る。このアッセイのタイプにおいて、固相に結合する標識の量は、サンプル中の抗CEAの量と正の相関を示した。特異的抗体を測定する他の方法は、当該分野で公知であり、そして3H1を標的抗原として使用することにより抗CEAを測定するのに適用され得る。このような適用された方法の全ては、本発明において具体化される。特定の実施態様のさらなる記載は、実施例のセクションにおいて供給される。 3H1はまた、細胞の抗CEA活性（特に抗3H1イディオタイプ）のレベルを測定するのに使用され得る。好ましい実施例において、3H1は抗CEAを同定するのに使用される。Ｔ細胞は、3H1イディオタイプに結合するＴ細胞レセプターを発現するリンパ腫のような目的のために定義される。3H1は標識され、そして、抗CEAT細胞を含有する疑いのある細胞の集団と接触させられ得る。あるいは、非標識3H1 は細胞と混合され得、続いて標識抗マウス免疫グロブリンまたはプロテインＡのような２次試薬と一緒にされる。この目的に適切な標識には、放射性標識および蛍光標識が挙げられる。蛍光標識の使用はまた、蛍光活性化セルソーターにおいて、抗CEA細胞を非特異性細胞から分離させる。標識Ab1を除去するための3H1の使用本発明はまた、標識抗CEA抗体(Ab1)を受容した個体から、トキシンおよび/または標識（例えば放射性物質）の除去のために3H1を使用する方法（例えば、ラジオシンチグラフィーまたは放射線治療）を包含する。抗体標的放射性核種の使用（すなわち、放射性免疫治療）における共通の問題の１つは、治療のための放射性標識抗体の用量を制限する系における、過剰のAb1の存在である。さらに、放射性標識抗体を使用する効果的なイメージングは、過剰の循環している放射性標識抗体（それはしばしば、循環系および組織から除去するのに数日かかる）により妨げられる。本発明のこれらの方法において、標識抗CEAの投与の後の特定の時間に、3H1が個体に投与される。その意図は、腫瘍以外の部位（例えば、循環系および間隙）において、3H1を抗CEAと複合体化させ、それによりそのクリアランスを促進することである。結果として、冒されていない組織における標識部位（例えば、放射性同位体）のレベルは減少し、そして、腫瘍のイメージ（隣接する組織と比較して）は増強された。同様に、腫瘍部位における照射のために、放射性核種を被験体に与えた場合、冒されていない組織の付帯的な曝露を低減するのが望ましい。従って、本発明は、放射性標識抗CEA抗体が治療用量で投与され、続いて過剰モル量の3H1が投与される処置方法を包含する。これらの適用のいずれかにおいて、腫瘍部位に局在していない任意の抗CEAに配置および結合させるために、3H1の量は、標識抗CEAの量を過剰に越えるのに十分なモル量になるよう選択される。投与の時期および3H1の量は、放射性標識抗体の性質、使用される放射性同位体の型、および個体の容態に依存する。好ましくは、抗CEA抗体に対する3H1のモル比は少なくとも５：１であり、より好ましくは25:1〜200:1である。好ましくは、3H1は、個体が抗CEA抗体を受容した後、５〜24時間以内に投与される。本発明はまた、腫瘍細胞に結合する抗CEA抗体の存在を検出する方法を包含し、この方法は、腫瘍細胞を3H1で十分な時間処理し、抗CEA抗体に結合させる工程、および形成される複合体の存在を検出する工程を含む。この意図は、3H1を、腫瘍細胞に予め結合させた抗CEAの検出に使用すること、あるいは、多価抗CEA/3 H1免疫複合体を形成することにより、抗CEAの腫瘍細胞への結合を促進することである。前者の例では、3H1は、検出可能な標識と共に、または標識が結合し得る手段により提供される。後者の例では、抗CEAまたは3H1のいずれかは、標識と共に提供される。このストラテジーは、例えば、単離細胞懸濁液におけるCEAを有する細胞を同定するために使用され得る。細胞を抗CEAおよび3H1と共に連続的にまたは同時にインキュベートし、洗浄し、そして標識細胞を検出する。本実施態様における好ましい標識には、例えばフルオロセイン、ローダミン、およびテキサスレッドのような蛍光標識が挙げられる。必要に応じて、標識細胞は、非標識細胞から分離され得る。例えば、蛍光活性セルソーターによる分離またはアフィニティー分離において、任意の固相ポジティブまたはネガティブ免疫選択の技術の使用は、当該分野で公知である。このストラテジーはまた、例えば、罹患した被験体における腫瘍の検出またはイメージングのために使用され得る。抗CEAおよび3H1は被験体に投与（通常は連続的に）され、腫瘍部位に蓄積させられる。適切な標識には、放射線標識(例えば、¹¹¹In、¹³¹Iおよび^99mTc)が挙げられる。次いで、腫瘍をラジオシンチグラフィーの標準的な方法を使用して、検出または視覚化する。 3H1を含有する薬学的組成物およびワクチン本発明は、3H1を含有する薬学的組成物およびワクチンを包含する。このような薬学的化合物およびワクチンは、免疫応答（好ましくは抗CEA応答）を誘発するのに、および/またはCEA関連疾患の治療に有用である。薬学的に受容可能な賦形剤中の有効量の3H1からなる薬学的組成物は、単位用量の形態（無菌非経口的溶液または懸濁液、無菌経口的溶液、あるいは経口的溶液または懸濁液、水中油滴型エマルジョンまたは油中水滴型エマルジョンなど）での個体への体系的な投与に適切である。製剤または非経口および経口薬物送達は、当該分野で公知であり、そしてそれらはRemington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publ ishing(1990)に記載される。薬学的組成物の１つのタイプはワクチンである。従って、本発明はまた、有効量の3H1を含有するワクチンを包含する。本明細書中で使用される、「ワクチン」は、ヒトまたは動物に使用する薬学的組成物であり、それは特定の標的または標的の群に対するある程度の特異的な免疫学的反応性をレシピエントに授与することを意図して投与される。免疫学的反応性は、標的に対し免疫学的に反応性である抗体または細胞（詳細には、Ｂ細胞、形質細胞、Ｔヘルパー細胞、または細胞傷害性Ｔリンパ腫、およびそれらの前駆体、あるいはそれらの任意の組合せ）である。本発明の目的において、標的は、3H1に結合した腫瘍関連抗原CEAまたは任意の関連する腫瘍抗原である。免疫学的活性は、実験の目的のために、進行性のCEA関連疾患の処置のために、または特定の物質の除去のために所望され得る。ワクチンは特に、進行性のCEA関連疾患を有する個体における免疫応答を誘発するのに使用され得る。好ましくは、免疫応答は、抗CEAの産物である。好ましくは、本発明のワクチンは、アジュバントを含有する。アジュバントの例は上記で議論された。本発明のワクチンは、代表的には非経口的に投与され、他には、例えば皮下、筋肉内、腹膜腔内、または皮内のいずれかへの注射により投与される。投与はまた、鼻内、肺内（すなわち、エアロゾルによって）、経口、および静脈内に行われ得る。他の投与の形態に適切である、さらなる製剤は、坐剤および、いくつかの場合には、経口製剤を包含する。投与経路は、個体の症状および所望する臨床上の効果に依存する。投与は１週間毎または２週間毎のベースで開始され、所望する測定可能なパラメータ（例えば、免疫応答の誘発（体液性および/または細胞性））が検出されるまで行われ得る。次いで、投与は少ない頻度のベース（例えば、２週間毎または１ヶ月毎）で行われ得る。好ましくは、投与はまず、最初の４回の投与については２週間毎に行われ、続いて１ヶ月毎の投与が行われる。ワクチンは、用量処方と適合する方法で、そして、治療に有効な量で投与される。投与されるべき量は、処置されるべき個体、個体の免疫系が抗体を合成する能力、投与経路、および所望する保護の程度に依存する。投与されるべき必要とされる活性成分の適切な量は、処置を担当する実施者の判断に依存し得、そして、個体に特有であり得る。3H1についての一般的な用量範囲は、上記に示している。 3H1を含有するキット本発明はまた、3H1を含有するキット、好ましくは診断キットを包含する。3H1 を使用する診断手順は、診断研究所、実験室、実施者、または個人において行われ得る。本発明により具体化されるキットは、抗CEAまたは抗3H1活性に対するアッセイ（例えば、本明細書中で開示されたもののいずれか）の実行を可能にし、それにより検出またはこれらの活性の定量を可能にする。本発明のキットは、適切なパッケージング中の3H1を包含する。このキットは必要に応じて、この手順に有用であるさらなる成分（緩衝液、捕獲試薬、発現試薬、標識、界面活性剤、検出の方法、コントロールサンプル、取り扱い説明書、および解説書が挙げられるが、これらに限定されない）を提供し得る。以下の実施例は、例示のために提供されるが、本発明を制限するものではない。実施例実施例１． 3H1抗イディオタイプ抗体の生成および特徴づけモノクローナル抗イディオタイプ抗体産生ハイブリドーマ細胞株3H1を作製し、以下の記載に従って同定を行った。所望の特異性と機能性を有する抗体を得るためには免疫化手順およびスクリーニング手順の両方の局面が重要であった。3H 1は初期に産生された多くのAb2のひとつであり、そしてもっとも望ましい特徴を備えた候補として同定された。この免疫化抗体(Ab1)はマウス抗CEAモノクローナル抗体8019であった。応答動物もまたマウスであったため、生成したAb2は8019のイディオタイプの特徴に対するものと予想された。しかし、その中の一画分のみが8019パラトープに対するものであり得、さらにより小さい集団が、免疫原性でAb3を誘発し得、そしてさらにより小さな集団が腫瘍関連抗原と交差反応するAb3を誘発し得る。 8019をオートロガスな種において十分に免疫原性とするために、キャリアKLH に結合し、フロイントアジュバントで乳化した。これを投与量の間が２週間のみの通常でないスケジュールでレシピエント動物に反復投与した。このスケジュールに従って５匹のマウスに免疫化を行った。約３匹のマウスで、４回目の免疫化後にのみ実質的な応答が起きた。応答動物は、５回目の8019静注投与量によって追加抗原刺激を行い、脾臓細胞を単離し、そして各動物から個別にハイブリドーマを調製した。クローニングは標準的な手順に従って行った。初期スクリーニングはイムノアッセイによって行い、8019と反応するが、同じアロタイプ決定基やアイソタイプ決定基を共有する他の標的モノクローナル抗体とは反応しないクローンを同定した。重要なアッセイは、8019が固相に結合し、培養上清で重層し、そして放射性ヨウ素標識8019で展開するサンドイッチRIAであった。このアッセイでは、ハイブリドーマ上清中の抗体が、機能的に二価であって、かつ捕獲8019と展開中の8019との範囲であり得ることが要求される。イディオタイプ特異的であり、かつこのアッセイで強いシグナルを発した数個のクローンをさらなる試験用に選択した。 8019のCEAへの結合をブロックするためにAb2が必要な競合アッセイにより次のスクリーニングを行った。これによると、Ab2が8019のパラトープを認識したことが立証された。CEAは、細胞表面でCEAを発現するヒト乳房細胞腫瘍株であるMC F-7細胞の形態で提供された。このアッセイの性質上、Ab2が腫瘍細胞上でその特異的な提示様式で8019と腫瘍抗原との間の相互作用をブロックすることが必要である。最低限、それ以前のスクリーニング試験を通過した候補のAb2は、8019の細胞への結合を少なくとも85％阻害することが必要である。この最低条件を実質的に超えたAb2は約３個あり、3H1がほぼ最高レベルの阻害を提供した。最終的なスクリーニング試験は、候補のAb2をレシピエント動物に注入したときに、所望の特異性のAb3を誘発し得るか否かを決定することであった。マウス腹水から十分な量のAb2を調製し、そしてマウスとウサギで試験を行った。これらの試験動物から得られた血清について、最初、免疫化に使用した同じ標識Ab2 を用いるサンドイッチ・イムノアッセイでAb3の存在についてアッセイした。次に、ポジティブの試験結果を示す血清を、腫瘍関連抗原、すなわちCEAに対して反応するAb3の能力をアッセイした。CEAの半精製調製物を用いてマイクロタイタープレートをコーティングし、系列希釈した試検血清を重層し、そして標識抗免疫グロブリンを用いて結合したAb3を検出した。CEAに結合するAb3の力価により、抗CEA誘発物質としてのその能力の反映としてAb2の「質」を規定した。モノクローナル抗体3H1は最高の質を有する抗イディオタイプとして明らかにされ、そして本発明で具体化される種々の化合物、組成物、および手順の基礎となる。材料ガン胎児性抗原(CEA)：Rougler Biotech，Montoreal，Canadaから精製CEAを購入した（カタログ番号70015）。あるいは、過塩素酸抽出によって結腸腺ガンのヒト肝臓転移巣からCEAを単離し、そしてイオン交換クロマトグラフィーによって２回精製した後、ゲル濾過と数段階のHPLCクロマトグラフィーを行った。この方法によって得られたCEAは純度100％であり、HPLCおよびSDS-PAGEによって分子量180,000に単一バンドを生じ、そしてウマ抗CEA抗体およびウサギ抗CEA抗体により単一バンドとして免疫沈降した。分子量180,000と200,000の二つの近接して泳動するバンドが、8019抗体および他のマウスmAb抗CEAを用いるウェスタンブロット分析法によって示された。この精製CEAを上記のマウスポリクローナルAb3血清およびウサギポリクローナルAb3血清を用いるELISA実験に使用した。その他の実験は、一般に、ヒト腺ガン細胞由来の半精製抽出物を用いて行った。これは過塩素酸抽出後、大規模な透析によって調製した。抽出物中のCEAの存在は、SDS-PAGEに続いてmAb8019を用いた免疫沈降を行うことによって確認した。抗体：モノクローナル抗体8019を産生するハイブリドーマ細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC Rockville，MD)より入手した。この抗体は、当初、IgMκと記載されたが、再クローニングの間に自発スイッチ変異体が出現し、そして本発明者らの8019はIgG1κである。8019の特異性は、CEAを発現する細胞を用いるイムノペルオキシダーゼ染色および流動微小蛍光測定分析によって再確認した。本明細書中に記載した種々の実験においては、モノクローナル抗体1E3 mAb（IgG1κ;ヒト卵巣粘液ガン腫に特異的）、その他のモノクローナル抗体およびミエローママウス免疫グロブリンをコントロールとして使用した。プリスタンで初回刺激した個々のマウスに、２〜10×10⁶個の生存細胞を腹腔内注入することによって、8019ハイブリドーマおよびその他の細胞株の腹水を調製した。この腹水から45％飽和硫酸アンモニウム沈殿およびその後のProtein Ａ Sepharose(TM)CL-4B（Eyら（1978）Immunmochemistry 15:429）上のクロマトグラフィーによってIgG画分を単離した。単離されたIgGの純度は免疫拡散法、免疫電気泳動、および高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)分画によってチェックした。 8019のF(ab')₂フラグメントの調製：標準的なペプシン消化（Parham（1983）J . Immunol 131:2895）によりF(ab')₂フラグメントを調製した。要約すれば、801 9腹水由来のIgGフラグメントを0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.5）に対して透析し、そしてペプシン（25μg/mg IgG）を用い、37℃で８時間消化した。切断後、3.0M トリス緩衝液（pH8.6）でpHを7.0に調整し、そして低温で溶液をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に対して透析した。消化物をSepharose６カラムを用いるHPLCによって分離した。単離されたF(ab')₂の純度は免疫拡拡散法により、および標準的なE LISAで抗アイソタイプ試薬との反応とによって決定した。抗体のKLHとのカップリング：Maloneyら（1985;Hybridoma 4:191）によって記載された方法に従って、8019をキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)とカップリングした。抗体ストック溶液(1mg/ml)を新たに希釈したグルタルアルデヒド溶液の存在下（最終濃度0.05％）PBS中でKLH(1mg/ml)と混合した。混合物を室温で１時間トンボ返りで回転し、次いで、PBSに対して４℃で完全に透析した。同系BALB/cマウスの免疫化：BALB/cの雌を、２ヶ月の期間にわたって４回免疫化した。最初の注入は、完全フロイントアジュバントで乳化した100μgの8019を用いて腹腔内に与えた。次の２回の注入は、不完全フロイントアジュバント中、 KLHとカップリングした100μgの8019を皮下注入または腹腔内注入のいずれかで与えた。マウスは時々採血を行い、そして8019のF(ab')₂フラグメントおよびコントロールとしてプールした正常BALB/cマウス血清IgGを用いることにより、結合アッセイ中のELISAによって血清を抗Id活性についてチェックした。融合の３日前に、PBS中の8019を静脈内に注入してマウスを追加免疫した。抗イディオタイプハイブリドーマの生成ハイブリドーマ株の生成に用いた融合パートナーは、ATCCからNo.CRL-1580として入手でき、P3X63Ag8,653と祖先が関係するマウス非分泌性ミエローマ細胞株 P3-653であった。樹立ヒト細胞株を他の箇所で記載されたように(Seonら(1984)J . Immunol. 132:2089)５％ウシ胎仔血清を加えたRPMI1640中で培養した。ハイブリドーマは、本質的に、OiおよびHerzenberg（（1980）「Selected Met hods of Cellular Immunology」、MishellおよびShiigi編、Freeman Publs．351 〜372）の方法に従って生成した。50％ポリエチレングリコール（PEG、分子量約 4500）の存在下、免疫化マウス由来の脾臓細胞を、P3-653細胞と1:1から1:10の割合で混合した。次に、融合細胞を洗浄し、そして培養した。ヒポキサンチン- アミノプテリン-チミジン培地を用いてハイブリッドを選択した。抗イディオタイプ抗体(Ab2)を分泌するハイブリドーマクローンの初期選択 RIAおよびELISAによってハイブリドーマクローンの初期スクリーニングを行った。ELISAはマイクロタイタープレートのウェルを8019抗体（またはコントロール）500ng/ウェルでコーティングすることによって行った。４℃で一夜インキューベートした後、プレートをPBS中の１％ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックした。ハイブリドーマの培養上清または20×濃縮物の100μlをウェル中室温で４時間インキュベートした。PBSで洗浄後、さらにプレートを室温で４時間または４ ℃で一晩、アルカリ性ホスファターゼ標識抗イディオタイプ試薬とインキュベートし、そして基質で発色させた。ELISA検出試薬は、抗マウス免疫グロブリンであったので、プレートをコーティングするために使用した8019はF(ab')₂フラグメントであった。ELISAアッセイは特異的抗体のクラスおよびサブクラスの同定に有用である。一般に、特定のIgGサブクラスの抗体が、安定でプロテインＡクロマトグラフィーによって簡単に精製でき、かつ有用なエフェクター機能を有し得るので所望される。ハイブリドーマの上清はまた、サンドイッチRIAにより試験された。精製8019 をクロラミンT法（Hunter（1970）Proc ．Soc．Exp．Biol．Med. 133:989）によって放射性ヨウ素標識した。8019、またはコントロール抗体（種々のアイソタイプおよび関連しない特異性のモノクローナル抗体、ならびにBALB/c正常IgG）を、500ng/ウェルでPVCプレート上にコーティングした。一般に、インタクトの抗体を使用した。４℃で一晩インキュベートした後、プレートをPBS中の1％BSAでブロックした。コーティングしたプレートをハイブリドーマ上清の系列希釈液と４時間インキュベートし、そして約50,000cpmの¹²⁵I-8019を用いて展開した。このRIAアッセイは抗体についてよりストリンジェントな特異性試験であり、そしてまた抗体が２つの8019分子の間に及び得ることが必要である。所望の特性を備えるこれらのスクリーニングアッセイから多くのモノクローナルAb2分泌細胞株が明らかにされた。その中にモノクローナル抗体3H1が存在した。Ab2 が8019イディオタイプに特異的であることの確認 Ab2のイディオタイプ特異性はAb1への直接結合により確認された。種々の精製 Ab2を¹²⁵Iで標識し、そしてモノクローナル抗TAA Ab1のパネルでコーティングしたプレートへの結合について試験した。¹²⁵I-3H1を用いた実験の結果を図５に示す。結果は平均cpmで示される（n=3、標準偏差＜10％）。3H1は、8019とほぼ独占的に結合した；試験された他のAb1のいずれとも交差反応性は一つの例外を除いて実際まったく無かった：その例外とは、CEA上の関連（おそらく重複する）エピトープを認識する抗CEA抗体RWP1.1(IgG2b、κ)との軽度の交差反応である。 8019イディオタイプに対する特異性は、競合実験でさらに確立された。約25,0 00cpmの種々の標識Ab2を、Ab2、Ab1、およびその他のマウス免疫グロブリンを含む非標識競合物質のパネルの異なるメンバーと混合した。次いでこのAb2を、801 9コーティングプレートへの結合について試験した。結果を表１に示す（平均cpm 、n=3、標準偏差＜10％）。競合物質として250ngの非標識3H1または8019を用いて、90％より大きい阻害が得られた。潜在的な競合物質としてその他の免疫グロブリンを用い、5μgの濃度までは、関連Ab1抗体RWP1.1を除いて、阻害は、実際、得られなかった。 8019 パラトープに対して惹起された抗イディオタイプについてのスクリーニング Ab2が8019のパラトープに対して惹起されたか否かを決定するため、Ab2を使用して放射能標識8019のCEAへの結合について競合させた。これは二つの方法で行った：(1)プレート結合アッセイは、半精製CEA抽出物を用いて行った；(2)細胞結合アッセイは、CEAを膜成分として発現するヒト結腸ガン細胞株であるLS174T 細胞を用いて行った。プレート結合アッセイは、プレートを、過塩素酸で可溶化した半精製CEA Ag抽出物の100μl（0.1mgタンパク質/ml）と４℃で一晩インキュベートすることによってコーティングした。LS174T細胞を96ウェルの組織培養プレート中で集密の単層として増殖させた。試験Ab2の種々の希釈物（培養上清または精製抗体のいずれか）を標識8019と混合し、次いで、コーティングされたプレートまたは培養細胞に加えた。アッセイの阻害パーセントを次式に従って計算した。ここでR_Tはインヒビターを有する実験ウェルの平均cpm；R_cは平均バックグラウンドcpm；およびR_MAXは任意のインヒビターを有さない平均最大結合である。図６は、プレート結合アッセイにおけるモデル競合物質として3H1を用いて行ったこのタイプの実験の結果を示す。3H1は25ngという少量で標識8019のCEAへの結合を阻害した。精製抗体4EA2（非関連の特異性のIgG1,k）をネガティブコントロールとして使用したところ、まったく阻害を示さなかった。関連する実験で、 3H1は別の抗CEA抗体(D14)のCEAコーティングプレートへの結合を阻害し得なかった。結合特異性の確認もっとも有望なAb2について8019への結合の特異性を確認するため、競合アッセイにおける役割を逆転させた確認実験を行った。約40,000cpmの¹²⁵I-8019を、CEA Agの半精製調製物、または8019と反応しない非関連糖タンパク質Agと同時にインキュベートした（Bhattacharyaら（1982）Ca ncer Res. 42:1560）。この抗体Ag混合物をAb2コーティングプレートに添加し（ 500ng/ウェル）、そしてCEAの結合阻害能力を測定した。Ab2の量は、結合し得た 8019の量に関して限定されず、そしてそれ故少量の競合するCEAに対する鋭敏な指標であった。図７に代表的な実験の結果を示す。2.5μgの半精製CEAによって3H1のヨウ素化 8019への結合が50％阻害された。非関連糖タンパク質はより高い濃度でさえ結合を阻害しなかった。このことは、3H1が結合部位特異的な抗Idであることを示唆する。これまでに記載されたスクリーニング試験でポジティブであると試験された抗体産生クローンを用いて、マウス腹水をAb2の供給源として調製した。このAb2を標準的な技術によりProteinＡおよびProteinＧ親和性樹脂を用いるクロマトグラフィーによって精製した。腫瘍特異的な免疫応答を誘発し得る抗イディオタイプについてのスクリーニング Ab2が網状抗原として挙動するとすれば、Agへの曝露のない状態で遺伝的に制限されない様式で、かつ種の障壁を横切って、Ag特異的なAb3の産生を誘発すべきである。従って、先のスクリーニング試験を通過したAb2を、免疫化実験でさらにスクリーニングした。その目的は、Ab1とイディオタイプを共有するAb3を誘発し得、かつ腫瘍関連抗原に対して類似の結合特異性を示す候補を同定することである。試験されるべき各Ab2について、最低で、BALB/cマウス５匹とニュージーランドホワイト種ウサギ２匹を免疫化した。マウスの免疫化には、Ab2をKLHと結合させた。50μgを注入し、そして応答を試験するためにマウスから定期的に採血した。ウサギは１匹につき500μgを、０日目に完全フロイントアジュバントで乳化して、14日目に不完全フロイントアジュバントで乳化し、その後２ヶ月の間は生理食塩水（筋肉内）で注入した。このウサギから最終の注入の14日間後に採血した。抗CEA活性をELISA（一般に、Engvallら（1972）J ．Immunol. 109:129を参照のこと）によって測定した。試験血清の種々の希釈物をCEAコーティングされたウェル中でインキュベートし、そして結合した抗体をこの種に適した酵素連結抗免疫グロブリンで検出した。このアッセイは当初の腫瘍関連抗原に結合する抗体を必要とし、そして抗イディオタイプによる免疫化によって誘発されたAb3の少なくとも一部分が腫瘍抗原特異的であることを立証する。CEA特異的Ab3のレベルを系列希釈によって滴定し、そしてAb2を免疫化する「質」を規定した。関連しないモノクローナル抗体(4EA2)で免疫化したマウスおよびウサギ由来の血清をネガティブの特異性コントロールとして使用した。 3H1モノクローナル抗体は、試験した候補の中で最高の質を有することが明らかにされた。図８に示すように、3H1で免疫化したマウスの血清中に存在するAb3は、不溶化 CEAに特異的であった。免役感作したマウス（２グループ中６匹）の全ては、ELI SAで測定したとき、抗CEA抗体を発生した。免疫前のマウスまたは非関連Ab2-KLH (4EA2)で免疫化したマウス由来のコントロール血清は、純粋なCEAに対する結合を示さなかった。平行実験では、同じ抗血清の結合を、非関連卵巣腫瘍糖タンパク質でコーティングしたプレート上で比較した。各々の場合で得られた最大結合は0.3〜0.4 ODの間であり、PBS-BSAコントロールで得られたのと同じであった。関連する実験では、Ab3の培養ヒト結腸ガン腫LS174-T細胞への結合を間接免疫蛍光アッセイおよびフローサイトメトリーで試験した。図９に示すように、3H1 免疫化マウスから得たAb3含有血清は、8019(Ab1)(A)で得た結合パターンと類似であった明瞭な結合(B)を示した。CEAを発現しないヒトB細胞リンパ腫細胞とは有意な結合は得られなかった（図9D）。3H1 によって誘発されたAb3が所望の特異性を有していたことの確認 3H1の治療上の目的は、腫瘍関連抗原に対して反応する応答を誘発するその能力にあるため、得られたAb3の特異性を以下の数種類の実験で確認した。 4Bと結合したBALB/cマウス血清の免疫グロブリン画分を結合させて作製した吸着剤上を通過させることによる特異性実験を用いて、ウサギおよびマウスAb3抗血清から抗アイソタイプ活性と抗アロタイプ活性を除去した。免疫拡散法によって抗アイソタイプ活性または抗アロタイプ活性を検出し得なくなるまで吸着を繰り返した。吸着したAb3を含む血清を、１％BSA、0.05％Tween20含有PBSで希釈し、それ以上精製しないで特異性の決定に使用した。先に述べたのと同様のハイブリドーマ技術を使用し、3H1で免疫化したマウス由来の脾臓細胞を用いてモノクローナルAb3産生細胞株を生成した。阻害アッセイ：ヒト結腸ガン腫細胞への結合について、Ab3血清がAb1と競合するかどうかを決定するため、放射性ヨウ素化8019のLS174-T細胞の集密単層への結合を、異なるAb3血清およびAb1の存在下で阻害について試験した。 Ab1と3H1との間の直接結合アッセイを行うため、精製3H1を用いてプレートをコーティングし（155ng/ウェル）、放射能標識8019の3H1への結合を、Ab3および Ab1の存在下で試験した。アッセイの阻害パーセントを前記の式によって計算した。 3H1で免疫化した同系マウスから得た血清は、1/10希釈で、ヨウ素化3H1(Ab2) のAb1への結合を90％阻害した。免疫前血清、あるいは非関連Ab2、すなわち4EA2 -KLHで免疫化したマウスから得た血清による阻害は観察されなかった。これらのアッセイでは、Ab3結合による立体的妨害を排除し得ないが、これらの結果によると、Ab1(8019)とイディオトープを共有するAb3抗体の存在が示唆される。1/10 希釈の3H1免疫化したウサギ729および730の抗血清は、ヨウ素化8019のAb2への結合を、それぞれ88％および57％阻害した。免疫前ウサギ血清を用いては有意な阻害は得られなかった。 Ab3がAb1と類似の結合部位を有するとすれば、ヒトガン腫細胞株LA174-Tによって発現されたとき、CEAへの結合についてAb1と競合するはずである。一定量の放射能標識8019を、ウサギAb3血清またはAb1調製物およびLS174-T細胞の種々の希釈物と同時にインキュベートした（図10）。20ngの精製8019-IgG1(Ab1)は、結合を50％阻害したが、その一方、1/10希釈のウサギ血清は、ウサギ729および730 についてそれぞれ47％および49％阻害を生じた。このことから、ポリクローナルウサギAb3血清は、Ab1と同じAgに結合し、そしてそれ故Ab1の性質を備えたいくつかの抗体分子を含有することが示された。ウェスタンブロット分析：半精製CEA抽出物を、β-メルカプトエタノールを使用しない非還元条件下で7.5％ゲルを用いた標準的なSDS-PAGEによって分離した。電気泳動後、Towbinらの手順(（1979）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 76:4350 ）に準じてゲルをニトロセルロースフィルターにブロッティングした。フィルター細片をPBS-1％BSAでブロックした後、8019、ポリクローナルウサギAb3血清、コントロールである、非関連Ab2に対するウサギAb3血清ならびにモノクローナルAb 3培養上清と別々にインキュベートした。インキュベート後、フィルター細片をP BSで洗浄し、そしてヤギ抗マウスIgまたはヤギ抗ウサギIg-アルカリ性ホスファターゼ標識試薬とインキュベートした。このフィルター細片を再度洗浄し、免疫ブロットキット（Bio-Rad Laboratories、Richmond，CA）で提供されるBCIP試薬とNBT試薬で反応を発生させた。 SDS-PAGE分析によって、mAb8019が分子量180,000のCEAを特異的に免疫沈降させることが示されている（Mitchell（1980）Cancer Immunol ．Immunother. 10:1 ）。3H1によって誘発されたAb3がCEA分子に対して特異的であったことを確認するため、CEAの半精製抽出物をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースフィルターにブロッティングした。１つのフィルター細片（図11、レーン２）をバッファローブラックで染色した。分子量180,000の領域に二つの重複するバンドがあり(CE A)、分子量50,000の領域に１つの主要なバンド（正常な交差反応性のAg）および２〜３の薄い低分子量バンドがあった。次いで、残りのフィルター細片を、mAb8 019、ウサギAb血清、および非関連アイソタイプ適合Ab2β4EA2（ネガティブコントロール）で免疫化したウサギ血清とインキュベートした。反応は上記のように ELISAアッセイによって展開させた。抗体8019（図11、レーン３）およびウサギA b3（レーン４）はこの複合体混合物から分子量180,000ダルトンの分子だけを免疫沈降した。mAb8019またはウサギAb3血清によって沈降しなかった物質には広範囲の低分子量CEA関連Agが含まれていた。免疫前血清（図11、レーン５）またはコントロール血清（レーン６）とは反応性がなかった。このウェスタンブロッティング分析法によって、分子量180,000のCEAに対するmAB8019の特異性とウサギA b3の反応性が確認された。図12はマウス血清を用いて行った同様の実験である。3H1で免疫化したマウスで誘発されたAb3は、ウェスタンブロットにおけるCEAと同じ分子量180,000形態を同定した。 Ab1およびAb3を用いた組織切片のイムノペルオキシダーゼ染色：モノクローナルAb1、およびAb3（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）の反応性を、 Vialeら、((1989)J ．Immunol. 143: 4338)に詳細に記載されるような非常に感受性の高い染色方法（ビオチン−ストレプトアビジン試薬、Vector，Burlingame， CA）により、正常な結腸と結腸腺ガンの外科的標本と比較した。全ての切片を、マイヤー(Mayer)のヘマトキシリンを用いて対比染色した。内因性ペルオキシダーゼのブロック、第１層の脱落、または特異的抗血清に対する非免疫性相同血清の代用およびAb3培養上清に対するP3-653ミエローマ培養上清の代用を包含する適切な特異性試験を行った。 8019の反応性を、正常な結腸および結腸腫瘍標本に対するAb3（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）の反応性と比較した。正常組織および悪性の結腸組織の両方に対するAb3の反応性のパターンは、Ab1で得られた反応性のパターンとほぼ同一であった（図13）。正常な結腸粘膜とは反応しなかったが、8019および全てのAb3は、結腸腫瘍と強く反応した。染色は、より分化の少ない領域における腺様構造および（細胞質の）顆粒で顕著であった。8019（IgG1,κ）とモノクローナルAb3（IgM,κ）とを用いて得られた染色パターンの間に、微妙な違いが存在した。モノクローナル抗体Ab3は、分泌ムチンは染色されずに腫瘍細胞が染色され、8019との反応は腫瘍細胞および分泌ムチン様物質が染色された（図 14）。細胞性免疫試験：3H1で免疫化した動物もまた、CEA指向細胞免疫応答を有することを示すために、さらなる実験がまた行われ得る。3H1で免疫化したマウスの脾臓細胞が、Ｔ細胞増殖アッセイに用いられ得る。脾臓細胞を半精製CEAの存在下で５日間培養し、次いで[³H]チミジンでパルスした。3H1免疫化動物由来細胞中の取り込みがコントロールよりも大きいことは、イディオタイプ特異的細胞免疫応答の存在に一致する。免疫化したウサギもまた、CEAの半精製調製物または精製したCEAに対するDTH皮膚反応について試験され得る。Ｔ細胞細胞毒性アッセイもまた、本開示において記載されるように行われ得る。 3H1に基づく抗イディオタイプネットワークを示す概略図を図15に示す。実施例２ 3H1 cDNAのクローニングおよび配列決定他に特定されない限り、全てのクローニング技法は、本質的にSambrookら(198 9)に記載され、そして全ての試薬は、製造者の指示に従って使用された。 3H1 の種々の領域のcDNAクローニングおよび配列決定 V_H領域の配列決定のために、1×10⁷ 3H1ハイブリドーマ細胞から全RNAを単離した。全RNAの収量は約100μgであった。オリゴチミジレート−セルロースカラムの２サイクルのクロマトグラフィーを通じる通過により、mRNAを調製した。mR NAの収量は約10μgであった。第１鎖cDNAを、SuperScript Preamplificationキット(GIBCO/BRL)を用いて合成した。次いで、3H1のV_HをコードするDNAフラグメントを、リーダー（シグナルペプチド）領域アミノ酸−20〜−13、およびガンマ定常領域アミノ酸126〜119の配列に対応する5'プライマーGGGAATTCATGRAATGSASC TGGGTYWTYCTCTTおよび3'プライマーCCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG(I=イノシン，R=AまたはG，Y=CまたはT，K=GまたはT，S=CまたはG，W=AまたはT)を用いるPCRにより増幅した。さらに、5'-III部位が、他のクローニング戦略により提供される（Novagen，Madison Wisconsin）。増幅されたcDNAフラグメントをpT 7プラスミドにサブクローンし、そして、NovaBlueコンピテント細胞を、供給者（Novagen）により提供されたプロトコルを用いて形質転換した。組み換え体コロニーを、色選択（color selection）により釣り上げ、そしてプラスミドDNAを調製した。２本鎖プラスミドのDNA配列を、Sequenase Version 2.0キット（USB, Cleveland，Ohio）により決定した。プラスミド内のDNA挿入片の配列を、T7プロモータープライマー（TAATACGACTCACTATAGGG）およびU-19プライマー（CTTTTC CCAGTCACGACGT）を用いて両方向から決定した。配列決定のために少なくとも８つのクローンを釣り上げた。3H1軽鎖の配列を同様に決定した。軽鎖のための正方向プライマーは、5'-ACTAGTCGACATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG、および逆方向プライマーは、5'-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGAであり、リーダー配列の−20 〜−12アミノ酸およびマウスκ鎖の定常領域の122〜116アミノ酸に対応する。 PCR増幅におけるエラー率を最小にするために、pfu DNAポリメラーゼ（Strata gene，San Diego）をその後のすべての実験における増幅のために使用した。この熱安定性DNAポリメラーゼを用いた変異頻度は、Taq DNAポリメラーゼと比較して10分の１である。アミノ酸配列によるcDNAクローンの確認本発明者らが釣り上げた３つのクローンは全て同一の配列を有していたが、本発明者らは、単離したcDNAが実際に3H1のcDNAであったことを確認することが必要であると考えた。精製した3H1抗体の50μgを、サンプル充填緩衝液（50mM Tri s-HCl，pH6.8，1％ SDS，1％グリセロール，0.1％ β-メルカプトエタノール）で希釈し、そして100℃で３分間加熱した。変性させたタンパク質を、SDSを含む 7.5％ポリアクリルアミドゲル（BioRad Miniprotean II Dual Slab Cell）上に載せ、そして200Vで１時間電気泳動を行った。ゲル内のタンパク質を、Twobinら（(1979) Proc ．Natl．Acad．Sci．USA. 78: 4350-4354）に記載の手順により、ポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜に150mAで一晩トランスファーした。トランスファー緩衝液は、25mM Tris、192mM グリシン、20％(v/v)メタノールを含んでいた。膜を、50％メタノール−50％酢酸中の0.1％クマシーブリリアントブルー中に迅速に浸すことにより染色し、続いて10％酢酸を加えた40％メタノールを含む溶液で洗浄した。膜を室温で乾燥させた後、染色された重鎖および軽鎖のバンドを清潔な剃刀の刃で切り出した。膜スライス上のタンパク質を、パルス化−液体化学（pulsed-liquid chemistry）およびオンラインのフェニルエチオヒダンチオンアミノ酸同定を使用するApplied Biosystem Model 477Aタンパク質シークエンサーを用いる自動化エドマン分解により、N-末端のマイクロシークエンシングを行った。各タンパク質を10〜15分解サイクルにかけ、そして各サイクルからの変換した切断産物を、逆相HPLCにより解析した。配列決定を、Macr omolecular Structural Facility of the University of Kentuckyにより行った。ペプチド配列は、(Glu)ValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyであった。最初のGlu（その同一性は不確かである）を除いて、このペプチドの14アミノ酸残基は、3H1重鎖のアミノ酸2〜15と正確に一致した。これは、釣り上げたcD NAクローンが3H1重鎖のcDNAクローンであることを確証した。 3H1の軽鎖可変領域のcDNA（配列番号１）および由来するアミノ酸配列（配列番号２）を図１に示す。3H1の重鎖可変領域のcDNA（配列番号３）およびcDNA由来のアミノ酸配列（配列番号４）を図２に示す。実施例３非ヒト霊長類における3H1によって誘発される免疫応答の分析細胞株高密度のCEAを発現するヒト結腸ガン細胞株LS174-Tを、10％ウシ胎児血清、1 ％ L-グルタミン、およびペニシリン、ならびにストレプトマイシンを補足したR PMI 1640培地中で増殖させ、そして抗腫瘍応答の検出に用いた。ヒト黒色腫細胞株M21/P6（Scripps Research Institute，La Jolla，CaliforniaのRalph Reisfe ld博士により好意的に提供）およびＴ細胞株MOLT-4（両方ともCEAネガティブである）を同じ培地で増殖させ、そしてネガティブコントロールとして用いた。抗体 3H1を、実施例１に記載のように獲得した。mAb2,11D10（IgG1,κ）は、ヒト乳脂肪球（CEA）(Mukerjeeら、（1992）FASEB J．6: A2059)を模倣するマウス抗Id mAbであり、そしてコントロールとして用いた。免疫化のための3H1の調製本発明者らは、以下のように、ミョウバンを用いて沈澱させた3H1を用いてサルを免疫化した。Herlynら、(1987)PNAS 84: 8055-8059。精製したmAb抗Id(3H1)の５mgのアリコート、１mlの2％ Alu-Gel S(Serva Fine Biochem，Inc.，Garden City，Long Island，NY)を添加した。次いで、D-PBSを用いて容量を10.0mlに調整し、そして混合物をボルテックス上で室温で１時間インキュベートした。次いで混合物を、24℃にて2000rpmで10分間遠心分離した。ゲル層に結合したmAbの量は、上清中の未結合抗体の量の分光光度測定により決定した。Alu-Gelで沈澱させた抗体を、使用するまで４℃で保存した。これらの手順は、層流フード内で無菌的に行い、そして最終産生物は、無菌で、抗Id 3H1 Alu-Gelとして鮮明にラベルされ、そして発熱物質を含まない、無菌のガラスバイアルに等分した。サルの免疫化カニクイザルを、ミョウバンで沈澱させた抗Id 3H1、およびミョウバンを用いて沈澱させた抗Id 11D10（CEA特異的）コントロールを用いて免疫化した。サルを、White Sands Research Institutes，Alamogordo，New Mexicoに収容した。体重が３〜４kgの雄ザルおよび雌ザルの一対を、２mgの3H1または11D10のいずれかを用いて、４つの異なる部位で０日、14日、28日、および42日に、それぞれ皮下に免疫化した。２匹のサルだけを、財政上の理由のために単一の投与量で各抗 Id(Ab2)について使用した。２mgの投与量を、異なる抗Idワクチンを用いた事前の前臨床試験（Chattopadhyayaら、(1992)PNAS 89:2684-2688）および臨床試験（Herlynら、(1987)PNAS 84: 8055-8059; Mittelmanら、(1992)PNAS 89: 466-47 0）に基づいて選択した。血液サンプルを、免疫前および各免疫の10日後に採取した。毒性サルにおけるAb3応答の誘導は、動物において明白な副作用を全く引き起こさなかった。複数の免疫の結果として、接種部位における穏やかな局部的膨張、および炎症しか観察されなかった。サルを、物理的検察および体重測定により通常にチェックした。高度免疫化サル血清由来の抗-抗Id抗体（Ab3）の精製高度免疫化血清20mlを、セファロース4Bに結合した免疫化抗Id免疫グロブリン（3H1-IgG1）からなる免疫吸着剤カラムに通過させた。抗-抗Id抗体(Ab3)を、0. 1M グリシン塩酸緩衝液（pH2.4）で溶出し、そして３M Trisを用いてpH7.0に中和した。次いで溶出した抗体を、セファロース4Bに結合し、イソトープ−アロタイプで一致したマウス免疫グロブリンからなる免疫吸着剤カラムに通過させ、抗イソトープおよび抗アロタイプ反応物質を除去した。通過した抗体を濃縮し、そして精製したAb3として使用した。Ab3のイソトープは、ヒト抗イソトープ特異的試薬（Tago Inc.，Burlingame，CA）を用いたELISAにより決定した。ミョウバンで沈澱させた3H1を用いる免疫化によって誘導される体液性免疫の発生 (a) 3H1 に対する特異的Ab3応答第４回の免疫の10日後の免疫化したサルから得られた血清を、抗-抗Id抗体（A b3）の存在について試験した。これらのアッセイのために、血清を抗アイソタイプおよび抗アロタイプ反応性をブロックするために正常なマウス免疫グロブリン（500μg/ml）を用いて前処理し、次いでラジオイムノアッセイ（RIA）によりマイクロタイタープレート上にコートされた免疫化抗Id(3H1)との反応により、(Ab 3)の存在について調べた。１:40希釈したAb3を、マイクロタイタープレート上にコートされた抗Id MAb 3H1または11D10と共にインキュベートし、次いでサンドイッチアッセイにおいて¹²⁵Ｉ標識3H1または11D10（50,000cpm）と反応させた。結果を、サンドイッチアッセイにおいて結合したcpmとして示した(A)。結果を、平均のcpm（n＝3）として示した。データのSDは、＜10％であった。Ab2とAb1との間の結合阻害アッセイのために、精製したAb1 8019をプレートをコートするために使用し（250ng/ウェル）、そして放射能標識したAb2のAb1に対する結合を、異なる希釈のAb3血清の存在下で試験した。血清を、アッセイの前に正常なマウスIgGと共にプレインキュベートした。結果を、１：40の希釈における阻害パーセントとして示した。非関連のAb2 11D10を、コントロールとして使用した。洗浄後、抗-抗体反応を、相同のサンドイッチRIA中で¹²⁵Ｉ標識抗Id試薬を用いて標識した。免疫前血清およびコントロールAb2、11D10を用いて免疫化したサル由来の血清もまた、これらのアッセイに用いた。さらに、¹²⁵Ｉ標識モノクローナルAb2 11D10をコントロールとして用いた。結果を表１に示す。 3H1で免疫化したサル(PRO 541およびPRO 667)由来のAb3血清の連続希釈物は、免疫化Ab2,3H1に特異的に結合し、非関連のAb2,11D10との反応性は最小であった。サルAb3血清はまた放、射標識したAb2のAb1に対する結合を、1:40希釈でさえ8 0％以上阻害した（表１）。免疫前血清または非関連のAb2,11D10で免疫化したサル(PRO 723およびPRO 872)から得た血清では阻害はなかった。 Ab3応答の速度を、放射性標識したAb2のAb1に対する結合の阻害を示すサルPRO 667由来の血清を用いて、図16に示す。類似の反応性が、サルPRO 541由来の血清でも見られる。これらの結果は、サルAb3血清がAb1(8019)とイディオタイプを共有することを示す。 (b) Ab3 のイディオトープ分析上記(a)においてポジティブ反応が得られる場合、これらのサル由来のAb3血清を、¹²⁵I標識3H1の、マイクロタイタープレートに結合した8019(Ab1)に対する結合を阻害する能力、またはその逆（プレート上の3H1に対する標識8019の結合の阻害）について調べた。非関連のAb1-Ab2系(BrE1-11D10)をコントロールとして用いた(Mukerjeeら、(1992)FASEB J.6:A2059)。この実験について、精製した801 9(Ab1)をプレート（250 ng/ウェル）をコートするために用い、放射性標識3H1（約50,000cpm）の8019に対する結合を、Ab3血清の種々の希釈物の存在下で、阻害について試験した。平行したコントロール実験において、非関連のAb1-Ab2系(mA b BrE1-11D10)をコントロールとして用いた。これは、サル血清におけるAb3が8019(Ab1)とイディオトープを共有することを実証した。Ab3血清によるAb1-Ab2結合のこの阻害アッセイはまた、Ab3が真の抗- 抗Idであることを実証した。 (c) 抗-CEA抗体応答の誘導マイクロタイタープレートを純粋CEA(Rougier Biotech,Montreal,Canada)でコートし、そして種々の希釈物でのELISAによる４回目の免疫化の後に得られたAb3 血清と反応する。96ウェルマイクロタイタープレートを、１ウェルあたりCEAの純粋調製物（１mlあたり２μgのタンパク質）100μlでコートし、そして４℃で一晩インキュベートした。溶液をプレートから吸上げにより取り除き、そしてこのプレートを、１％BSAを含むPBSでブロックし、タンパク質結合部位を飽和した。室温での１時間のインキュベーション後、溶液を取り除き、ウェルをPBSで３回洗浄した。0.05％ Tween20/1％ BSAを含むPBS 50μlと混合した希釈した血清サンプル(50μl)を、２連で添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを洗浄した後、0.05％ Tween20/1％ BSAを含むPBSで1/1000希釈した酵素標識抗体0.1mlを添加し、室温で４時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、そしてジエタノールアミン緩衝液に溶解した0.1mlのホスファターゼ基質（50mlの緩衝液当たり50mgの基質）で発色させた。405nmの吸光度をELISA Reade rで読み取った。このアッセイの感受性は、１ウェルあたり0.1ngの検出された抗体より優れていた。免疫前血清および非関連のAb2 11D10で免疫化したサルから得た血清をコントロールとして使用した。非関連の抗原HMFGもまたこのアッセイにおけるコントロールとして用いた。サルPRO 541由来のAb3血清は精製CEAに特異的に結合するが(図17)、免疫前サルまたは無非関連係のAb2,11D10で免疫化したサル由来のコントロール血清はCEA に対する評価し得る結合を示さなかった。平行実験において、サルPRO 541由来の同じAb3は、コントロールCEA抗原でコートしたプレート上で比較し、ネガティブであった。サルPRO 667由来の抗CEA応答の速度を図19に示す。細胞表面CEAとの活性を決定するために、LSI74-T細胞を免疫フローサイトメトリーにより試験した。CEAポジティブLSI74-T細胞（１ウェル当たり１×10⁶）を1 00μlにてAb1(8019)およびAb3と、４℃で60分反応させた。洗浄後、細胞をヤギ抗マウスまたはヤギ抗ヒトF(ab')₂IgG-FITC標識抗体(Tago Inc.,Burlingame,CA) のいずれかとともに４℃で30分間インキュベートした。次いで、これらを２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、そして免疫フローサイトメトリー(F ACS STAR,Becton Dickinson,Sam Jose,CA)で分析した。抗原ネガティブなMOLT-4 細胞およびメラノーマ細胞M21/P6（不記載）をこのアッセイにおけるコントロールとして使用した。図28に示すように、3H1免疫化サル由来のAb3は、Ab1で得られた結合パターンと同様の明確な結合を示した(図20-1)。CEAを発現しないMOLT-4細胞との有意な結合は得られなかった（図20-2）。メラノーマ細胞との結合もなかった。次いで、本発明者らは、Ab1(8019)の反応性をサル精製Ab3(50μg/ml)の反応性と、ヒト結腸腫瘍および正常結腸標本での感受性イムノペルオキシダーゼアッセイにより比較した。このAb3抗体を上述のように血清から精製した。この方法(ビオチン-ストレプトアビジン試薬、Vector,Burlingame,CA)を同様に詳細に記載した(Battacharya-Chatterjee(1990)および(1991))。全ての切片をMeyer'sヘマトキシリンで対比染色した。内因性ペルオキシダーゼのブロック、第１層の省略、または特異的な抗血清の代わりの非免疫同種血清の代用を含む、適切な特異性試験を行い、そしてP3-653メラノーマ培養物上清をコントロールとした。結腸ガン標本上のAb3(図20-1)の反応性パターンは、Ab1 8019(図20-2)について得られた反応性パターンと同一であったが、一方非関連のサルAb3(図20-3)については反応性はなかった。また、Ab3(図20-4)またはAb1のいずれかはコントロール正常結腸切片でも反応性がなかった。Ab1または精製Ab3(図20-1、20-2)との反応は、腫瘍細胞および分泌されたムチン物質の両方の染色を生じた。この染色は、分化の少ない領域の腺様構造および顆粒（細胞質）で顕著であった。サルAb 3を正常胃、十二指腸、盲腸、平滑筋および横紋筋組織においてさらに試験し、そしてネガティブであるとわかった。 Ab3抗体が精製CEA調製物における少々の混入物と反応するが、またはこれらの抗体が腫瘍細胞上の非CEA膜タンパク質を染色する可能性をさらに除外するために、本発明者らはサル精製Ab3により沈澱された分子種を同定した。精製CEAを¹² ⁵ Iを用いてクロラミンＴ-法により標識し、先にプロテインG-Sepharoseビーズで吸着した、精製Ab3(10μg)またはAb1(10μg)またはAb2 11D10(10μg)で免疫化したサル由来の非関連のコントロールAb3またはPBS-BSAコントロールと反応させた。洗浄後、抗原-抗体でコートされたビーズをLaemmli((1970)Nature 277:680-68 5)の方法に従ってSDS-PAGEにより分析し、そしてオートラジオグラフ化した。図 21に見られるように、放射性標識物質をモノクローナル8019(Ab1)およびサルAb3 により沈降した。SDS-PAGEによる分子量は同一であった。 (d) LS174-T 細胞を用いたAb3のエピトープ分析サルで生成されたAb3、およびAb1(8019)が同じ抗原決定基に結合することを実証するために、精製Ab3による8019の抗原ポジティブ腫瘍細胞株LS174-T細胞またはCEAへの結合阻害を記載のように（Bhattacharya-Chatterjeeら、(1990)および(1991)）RIAにより調べた。このアッセイは、使い捨てのマイクロフォールド9 6ウェルマイクロフィルターコートプレート内で行った。このプレートをまず10 ％FCSおよび１％BSAを含むPBSで処理した。代表的アッセイにおいて、精製Ab1またはAb3調製物の種々の希釈の３つの50μLのアリコートおよび50μlのPBS中の５ ×10⁵生細胞を、固定量の放射性標識Ab1(約50,000 cpm)と共に、個々のウェル中で室温で連続振とうしながら２時間同時インキュベートした。インキュベーション後、プレートを吸上げによりPBS/１％BSAで３回洗浄した。洗浄したろ紙における放射能をＫ線分光計で決定した。このアッセイの阻害パーセントを下式により計算した：この式において、R_Tは阻害剤を用いた実験ウェルの平均cpmであった。R_cはバックグラウンドcpmの平均であり、R_maxは阻害剤まったくなしでの最大結合の平均であった。 Ab3がAb1と同様の結合部位を有するならば、これは、LS174-T細胞上のCEAに対する結合についてAb1と競合するはずである。固定量の放射性標識Ab1を異なる量の精製Ab3またはコントロールのAb3調製物およびLS174-T細胞とともに同時インキュベートした（図23）。150ngの精製Ab3は結合を50％阻害し、そして１μgの精製Ab3は80％の阻害をもたらした。一方、５μg濃度で使用したコントロールの Ab3はいかなる阻害も産生しなかった。同様に、50％の結合阻害が93ngのAb1で得られた。これらの結果は、Ab2-免疫サル抗体がAb1と同じ抗原に結合し、そしてそれゆえAb3調製物がAb1特性をもつ抗体分子を含有することを示す。実施例４進行性CEA-関連疾患を有するヒトにおける 3H1 によって誘発された免疫応答の分析患者の選択本研究に12人の患者が参加した（表２）。全ての患者はCEAポジティブ進行性結腸ガンを有し、そして標準的な治療に失敗した（表２）。ベースラインの研究は、全ての身体検査、胸部ラジオグラフィー、腹部コンピュータ軸断層撮影検査、血清CEAレベル、通常の血液計数および血液化学検査を包含する。全ての患者は先の治療を少なくとも４週間前に中止し、そして治療の終結時に病状が繰り返された。治療スケジュール患者を１mg、２mgまたは４mgのいずれかの水酸化アルミニウムで沈澱した3H1 （実施例２）1週間ごとに4回皮内注射して処置した。4回の注射の終了時まで患者が安定であれば、次いで注射を連続かまたは月１回のベースで行い、そして3 ヶ月ごとに評価した。患者の腫瘍の増殖が実証される場合、患者を研究から排除した。Ab2 の調整 3H1を実施例1に記載のように得、そして実施例２に記載のようにミョウバン沈澱させた。最終産物を使用前に無菌性、発熱原性および一般的な安全性についてモルモットにおいて試験した。臨床研究用新薬申請（Investigational New Drug Application）は米国食品医薬品局により認可した（BB-IND 5055）。投与の前に、3H1を水槽中でアドジュバントの存在下で45度で30分間、熱処理した。CEA の精製精製CEAをRougier Bio-tech,Montreal,Canada(カタログ番号70015)から商業的に入手した。CEAを大腸ガンのヒト肝臓転移から、過塩素酸抽出、およびイオン交換クロマトグラフィーによる２回の精製、それに続くゲル濾過および数回のHP LCクロマトグラフィーにより単離した。このCEAは100％純粋であり、高速液体クロマトグラフィーおよびSDS-PAGEにより180,000m.w.に単一バンドを生じ、そしてウマならびにウサギ抗CEA抗体により単一バンドとして免疫沈降された。このC EA調製物を、マウスモノクローナル抗体抗CEAを用いるウェスタンブロット分析により、180,000および200,000m.w.で２つの近似に移動するバンドに分解した。本発明者らはモノクローナル抗体8019を用いてウェスタンブロット分析によりその物質を再び調べた。毒性および臨床応答毒性は、注射部位における穏やかな紅斑および硬化といった局所的な反応、ならびにアセトアミノフェンにより軽減される穏やかな発熱および悪寒のみで、最小であった。抗イディオタイプ処置は造血細胞、腎臓または肝臓機能への有害な効果はまったくなかった。患者は疾患の活動について非常に厳密にモニターされた。11人の患者が進行性疾患を有していた（表２）。残りの患者は治療に入って 10ヶ月間安定であった。循環中のCEAの連続モニタリング疾患(CEAレベル)の範囲の間接的な測定を免疫化前に記録し、そして各免疫化の後、および次いで免疫化スケジュールの完了後に月１回測定した。このために、患者の血清を熱不活性化し、マウスモノクローナルAb1を伴うCEAモニタリングアッセイを妨げる免疫グロブリンを沈降させた。CEAは熱安定性であり、透明な遠心分離上清において通常のアッセイにより測定した。このCEAの連続モニタリングは、CEAを分泌しなかった５番目および10番目の患者を除いて、疾患の進行、ならびに臨床的に進行した全ての患者およびそれらの血清CEAレベルの上昇と相関した。熱抽出血清中のCEAの定量のために、１mlの0.2M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0 ）を0.5mlの血清に添加し、ボルテックス混合し、90℃で15分間インキュベートし、そして遠心分離した（1200Xg、10分間）上清を同じ日にアッセイするか、またはアッセイするまで-20℃で凍結保存した。次いで、100mlの上清をHansenら（ (1989)，Clin ．Chem. 35(1):146-151）が記載したようにCEAについて酵素免疫アッセイによりアッセイした。体液性免疫に対するアッセイ (a) 抗-3H1の全応答ミョウバン沈澱した3H1を用いる免疫化により誘導された体液性免疫の発生を、治療前、およびワクチンでの各処置の後に、患者から得られた血清を試験することにより評価した。この血清を、最初に抗-イソ／アロ／および抗-抗イディオタイプ抗体を含むヒト抗マウス抗体の全応答について、Hansenら（(1994)Clin ． Chem. 35(1):146-151）により記載されるようにサンドイッチラジオイムノアッセイにより試験した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを3H1でコートし、そして患者の血清の異なる希釈液と共にインキュベートした。洗浄後、抗原-抗体反応を、アロジェニックのサンドイッチラジオイムノアッセイにおいて、¹²⁵I-標識抗Id 3H1を用いて標識した。3H1がインタクトなIgG1として注射されるため、患者はヒト抗マウス抗体応答を有すると予想される。 12人の患者の内９人からの過免疫の血清（４回の3H1の注射後）は、アロジェニックのサンドイッチラジオイムノアッセイにより測定した免疫化Ab2、3H1に対する抗-イソ／アロ／および抗-抗イディオタイプ抗体を含むヒト抗マウス抗体の全応答の有意なレベルを示した。 (b) Ab2 への特異的Ab3応答次に、これらの免疫化された患者からの血清を、プレート上でラジオイムノアッセイにより、¹²⁵I標識Ab1（8019）のAb2 3H1への結合を阻害するその能力、またはその逆（プレート上で、放射性標識Ab2のAb1への結合の阻害）について調べた。これらの反応を過剰の正常マウス免疫グロブリンの存在下で行ない、イソタイプおよびアロタイプの決定基に対するヒト抗体をブロックした。４回目の処置の後に患者から得られた粗製血清を、正常のマウス免疫グロブリンと共にプレインキュベートし、イソタイプおよびアロタイプの決定基に対するヒト抗体をブロックした。本発明者らは、通常４回目免疫化後を用いた。なぜなら、４回の免疫化が12人の全ての患者が受けた注射の数だからである。４回を超える注射を受けた患者について、免疫応答はほぼ同等に残っているか、または力価の増加が続いた。次いで、血清の一連の希釈液をAb1-Ab2結合アッセイにおける阻害について試験した。全てのアッセイを３連で行った。Ab1とAb2との間の直接的な結合阻害に対して、精製3H1(Ab2)を用いてプレートをコートし（500mg／ウェル）、そして放射性標識8019(Ab1)のAb2への結合を、阻害について異なる患者の過免疫Ab3血清およびAb1の存在下で試験した。これは、患者の血清中のAb3 が8019(AB1)を有するイディオトープを持つかどうかを示した。また、Ab3血清によるAb1-Ab2結合間のこの阻害アッセイは、Ab3が真の抗-抗イディオタイプであるかどうかを示した。非関連なAb2をコントロールとして用いた。洗浄後、抗原- 抗体反応を、上記のアロジェニックのサンドイッチラジオイムノアッセイにおいて¹²⁵I-標識抗イディオタイプ試薬を用いて標識した。予め処置した、非免疫血清および正常のドナーからの血清をコントロールとして用いた。図23は、最初の５人の患者からの代表的なデータを示す。患者番号１、２、３および５は、１／10希釈で、イディオ化された8019の3H1への結合を62〜100％阻害し、そして結合の阻害は血清の希釈の増加に伴って低下した。患者番号４からの血清は、用いた全ての希釈液で最小の非特異的阻害を示し、そして免疫前血清は阻害を示さなかった。Ab3結合による立体障害はこれらのアッセイにおいて除外され得ないが、この結果は、Ab1を有するイディオタイプを持つ真の抗-抗イディオタイプ抗体の存在を示す。また、12人の患者の内９人はこのアッセイでAb3 応答にポジティブであった。 (c) 3H1 による抗-CEA抗体の誘導本アッセイは、患者において3H1 Ab2によって誘導されたいくつかのAb3がAb1 タイプであるかどうか、そしてCEAに結合するかどうかを決定するために行われた。Rougier Biotechから得られたCEAの純粋な調製物（先に記載ように）を用いて、非特異的結合による擬陽性の結果を得る危険性を減少させた。精製されたCE Aを¹²⁵IでクロラミンＴ法により放射ヨウ素化した。放射性標識したCEA（1×10⁶ cpm）をタンパク質G-セファロースビーズ上に予め吸着させた0.5mlの患者の血清と反応させた。反応後、このビーズを洗浄し、そしてγ線分光光度計で計数した。各サンプルについて２連で行ない、そして結合されたcpmの平均を示す。免疫前血清、リン酸緩衝化生理食塩水-ウシ血清アルブミン、ならびにＴ細胞リンパ腫に対して非関連なマウスモノクローナル抗体で処置した患者から得たAb3血清を、これらのアッセイのコントロールとして用いた。図25で示されるように、3H1を用いた免疫化は放射性標識CEAに結合した抗体を誘導した。12人の患者の内９人は、このアッセイで測定可能な抗-CEA抗体が発生した。４、８および10番の患者はヒト抗マウス抗体応答に対してアネルギーであり、そしてCEAに対して抗体を産生しなかった。一方、１、２、３、５および12 番の患者は高い結合を示し、そして６、７、９および11番の患者は、PBS-BSA（サンプル番号13）または免疫前血清（データは不記載）を用いて得られたバックグラウンド計数よりも多い結合を示した。14番のサンプルをポジティブの抗-CEA （8019）コントロールとして用いた。予め処置した、非免疫血清および正常のドナーからの血清をこれらのアッセイのコントロールとして用いた。 (d) Ab1 および患者のAb3を用いるフローサイトメトリー（FACS）分析細胞培養表面CEA、LS174-T細胞（１ウェル当たり1×10⁶）由来のCEAポジティブ結腸直腸ガン、およびCEAネガティブB細胞リンパ腫との反応性を決定するために、Raji細胞（１ウェル当たり1×10⁶）を、１：100希釈でAb1（8019）および患者の免疫血清（Ab3）と４℃にて60分間反応させた。洗浄後、細胞をヤギ抗ヒトまたはヤギ抗マウスF(ab')₂IgG-FITC標識抗体（Tago）のいずれかと40℃にて30 分間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、そしてフローサイトメトリー（FACS Star、Becton Dickinson）により分析した。免疫前の患者血清をコントロールとして用いた。図26に示されるように、代表的な3H1免疫化患者からの粗製血清は、8019(B)を用いて得られた結合パターンに類似するようにLS174-T細胞(A)に結合し、そして CEAを発現しないヒトＢ細胞リンパ腫細胞に結合しなかった（図3C）。類似の結果を全てのポジティブの患者で見出した。 (e) LS 174-T 細胞への結合に対するAb1と患者のAb3の競合 Ab3がAb1と類似の結合部位を有するなら、Ab3はLS174-T細胞上のCEAとの結合に対してAb1と競合するはずである。固定量の放射性標識8019（約90,000cpm）を、患者の精製Ab3またはAb1調製物およびLS174-T細胞と共に異なる濃度でインキュベートした。 Ab3を以下のように患者の血清から精製した。50ミリリットルの過免疫血清を、Sepharose 4Bに結合した免疫化抗-イディオタイプ免疫グロブリン（3H1）からなる免疫吸着カラム上に通過させた。カラムに結合した抗-抗イディオタイプ抗体（Ab3）を0.1Mグリシン-塩酸緩衝液（pH2.4）で溶出した。溶出した抗体を3M Trisで中和し、PBS（pH7.2）に対して透析し、次いで、Sepharose 4Bに結合した正常マウス免疫グロブリンに一致したアロタイプからなる免疫吸着カラム上を通して、抗-イソタイプおよび抗-アロタイプ反応物を取り除いた。通過した抗体を濃縮し、そして精製Ab3として用いた。Ab3のイソトープを、ヒト抗-イソトープ特異的試薬（Tago）を用いるELISAにより測定した。図27に示されるように、精製8019-IgG1(Ab1)は、0.75μgで結合を80％阻害し、一方、患者の精製Ab3（1番の患者由来）は同じ濃度で60％の阻害を生じた。全体的に、Ab1およびAb3を用いて得られた阻害曲線は、異なる希釈で非常に類似した。これは、患者のAb3がAb1のような同じ抗原エピトープに結合し、従って、Ab1 特性を有する抗体分子を含有することを示した。 (f) Ab1 およびAb3によるCEAの免疫沈降精製CEAを¹²⁵Iでクロラミン-Ｔ法により標識し、そして精製Ab3（10μg）またはAb1（10μg）、あるいはリンパ腫患者由来の非関連なコントロールAb3（10μg ）またはPBS-BSAコントロール（予めタンパク質G-Sepharoseビーズ上に吸着させた）と反応させた。洗浄後、抗原-抗体でコートしたビーズを、Lamella（(1970)Nature 227:680-685）の方法に従ってSDS-PAGEにより分析し、そしてオートラジオグラフ化した。 Ab1 8019がSDS-PAGE分析により180,000m.w.のCEAを特異的に免疫沈降させることは以前に示されている（Bhattacharya-Chatterjee(1990)）。3H1によって誘導されたAb3がCEA分子に対して特異的であることを確認するために、ヨウ素化した精製CEA調製物を、２人の患者から得られた精製Ab3調製物およびAb1により免疫沈降させ、そしてSDS-PAGEにより分析した。図27における結果は、両方の患者の Ab3（レーン２および３）が180,000m.w.CEAバンドをマウスAb1 8019（レーン１）のそれと同じように沈降させることを示している。ヨウ素化したCEAを非関連A b2(4DC6)で処置した患者から得られた精製Ab3と反応させる場合、交差反応性はなかった（レーン４）。２人のポジティブの患者のAb3調製物のいずれかで予め処置したヨウ素化CEA抗原を8019と反応させる場合、ヨウ素化調製物をCEA抗原が使い果たしたことを示唆する有意な免疫沈降はなかった（データ不記載）。 (g) 腫瘍切片とのAb3の免疫反応性モノクローナルAb1(8019)および精製Ab3の10μg/ml溶液での反応性を患者由来の結腸腺ガンのオートロガスおよびアロジェニック外科標本と、感度が非常に高い染色法（ビオチンストレプトアビジン試薬、Vector、Burlingame、CA）であるイムノペルオキシダーゼアッセイにより、Bhattacharya-Chatterjee(1990)に詳細に記載されるように比較した。全ての切片をMeyerのヘマトキシリンにより対比染色した。外因性ペルオキシダーゼのブロック、第１層の省略、または特異的抗血清に対する非免疫性の同種血清の代用、およびコントロールとしてのP3-653 ミエローマ培養上清を含む、適切な特異性試験を行なった。オートロガス悪性結腸組織上の患者Ab3の反応性のパターンは、アロジェニック腫瘍標本で得られたものと同一であった（それぞれ図28-1および図28-2）。Ab 1 8019は同一の染色パターンを示したが（図28-3）、非関連なAb2(4DC6) で処置した患者から得られたコントロールAb3との反応性はなかった(図28-4)。Ab1または精製Ab3との反応（図28-1、28-2、28-3）は、腫瘍細胞および分泌されたムチン物質の両方の染色をもたらした。染色は、分化の少ない領域の腺様構造および顆粒（細胞質）で顕著であった。結腸（図28-5および28-6）、盲腸、十二指腸、胃横紋筋または平滑筋由来の正常組織上でAb1および精製Ab3の反応性はなかった。Ｔ細胞増殖性応答に対するアッセイ細胞の免疫応答を、水酸化アルミニウムで沈澱した抗-イディオタイプ抗体3H1 および水酸化アルミニウムで沈殿したイソトープが一致した、コントロール抗- イディオタイプ抗体4DC6と共にインキュベートした末梢血単核細胞の増殖により測定した。末梢血単核細胞を、標準Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離法により４回の免疫化の後に得られた血液から単離し、そして１ウェル当たり5×10⁶細胞を異なる濃度のGH1-Alugelおよびコントロール4DC6-Alugel（10μg〜2μg）と共に、5％熱不活性化ウシ胎児血清ならびにペニシリンおよびストレプトマイシンを有するRP MI培地中でインキュベートした。非特異的マイトジェンフェトヘマグルチニン-P を１ウェル当たり2μgおよび1μgでポジティブコントロールとして用いた。細胞を５％の二酸化炭素を含有する雰囲気下、37℃にて５日間インキュベートした後、これらを³H-チミジン（１ウェル当たり１μCi）で20時間パルスした。³H-チミジンの取り込みを治療の前と後のサンプルにおいて測定した。データを１分当たりの³Hチミジン取り込みの平均計数（３組のウェル）として表した。データの標準偏差は各測定において＜10％であった。選択された数人の患者から単離した末梢血単核細胞をまた、上記プロトコルのように、異なる濃度の精製CEA（10ng〜250ng）とインキュベートした。ポジティブ増殖性応答が12人中７人の患者に見られた。７人の患者の全てはAb 3抗体応答が発生した（表２）。２人の患者（番号１および12）からの代表的なデータを図30に示す。免疫前細胞は抗-イディオタイプ抗体に対して増殖応答を有さなかったが、一方、過免疫細胞は有意な応答を有した。応答する７人の患者の内４人（２人は2mgの用量で処置し、そして２人は4mgの用量で処置した）もまた、抗原特異的Ｔ細胞応答を示唆する精製CEAの存在下でＴ細胞増殖を示した。4 DC6水酸化アルミニウム沈澱した抗-イディオタイプ抗体に一致したイソトープへの応答もまた存在し；この応答は3H1応答のそれよりもかなり小さく、免疫グロブリン分子の非-イディオタイプ成分への応答を表すようであった。コントロール4DC6-Alugelに比較して3H1-Alugelに対する応答の差（p＜0.003）は、BSAと比較したCEAに対する応答（p＜0.005）のように有意であった。alugel自身に対して応答はなかった（データは不記載）。培養物のフローサイトメトリー分析は、増殖細胞の90％以上がCD4ポジティブＴリンパ球であることを示した。ヒト抗マウス抗体応答に対してアネルギーである３人の患者もまた、いかなるＴ細胞増殖応答も示さなかった。５人の非応答者の内、３人は1mg、１人は2mg、そして１人は4mg用量の3H1-Alugelで処置した。上記の本発明は明瞭に理解される目的のために例示および実施例の方法によりかなり詳細に記載されているが、特定の改変および変更が実施されることは当業者にとって明らかである。従って、説明および実施例は添付の請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するように解釈されるべきでない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ 33/574 33/574 Ｅ 33/577 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チャッタージー，スニルケイ. アメリカ合衆国ケンタッキー 40502, レキシントン，ザウッズレーン 2400 (72)発明者フーン，ケニースエイ. アメリカ合衆国ケンタッキー 40536− 0093，レキシントン，ローズストリート 800

Claims

【特許請求の範囲】１．ハイブリドーマ細胞株ATCC受託番号HB12003号およびそれらの子孫により産生される、モノクローナル抗イディオタイプ抗体3H1。２．検出可能なシグナルを産生し得る標識をさらに含む、請求項１に記載の抗体。３．ATCC受託番号HB12003号に指定されたハイブリドーマ細胞株およびそれらの子孫。４．配列番号２と同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号４と同一の重鎖可変領域アミノ酸配列を有するモノクローナル抗イディオタイプ抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株。５．配列番号２と同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号４と同一の重鎖可変領域アミノ酸配列を有する、モノクローナル抗イディオタイプ抗体。６．配列番号２と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによってコードされた軽鎖可変領域および配列番号４と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドによってコードされた重鎖可変領域を有する、モノクローナル抗イディオタイプ抗体。７．薬学的に受容可能な賦形剤中に、有効量のモノクローナル抗イディオタイプ抗体3H1を含有する、薬学的組成物。８．有効量のモノクローナル抗イディオタイプ抗体3H1を含有するワクチン。９．アジュバントをさらに含有する、請求項８に記載のワクチン。１０．前記アジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項９に記載のワクチン。１１．進行性のガン胎児性抗原（CEA）関連疾患を有する個体において免疫応答を誘発する方法であって、有効量のモノクローナル抗イディオタイプ抗体3H1を該個体に投与する工程を包含する、方法。１２．前記免疫応答が抗CEA抗体の産物である、請求項１１に記載の方法。１３．進行性のCEA関連疾患を有する個体において免疫応答を誘発する方法であって、請求項９に記載のワクチンを該個体に投与する工程を包含する、方法。１４．前記免疫応答が、抗ガン胎児性抗原の産物である、請求項１３に記載の方法。１５．腫瘍細胞に結合している抗CEA抗体の存在を検出するための方法であって、該腫瘍細胞を請求項１に記載のモノクローナル抗体と十分な時間接触させて該抗CEA抗体に結合させる工程、および該抗CEA抗体に結合している3H1の存在を検出する工程を包含する、方法。１６．腫瘍細胞に結合している抗CEA抗体の存在を検出するための方法であって、該腫瘍細胞を請求項５に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体と十分な時間接触させて該抗CEA抗体に結合させる工程、および該抗CEA抗体に結合している3H1の存在を検出する工程を包含する、方法。１７．請求項１に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体を適切なパッケージング中に含有する、抗ガン胎児性抗原抗体の検出または定量のための診断キット。１８．請求項５に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体を適切なパッケージング中に含有する、抗ガン胎児性抗原抗体の検出または定量のための診断キット。１９．個体において抗ガン胎児性抗原応答を検出するための方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗体と、該個体由来の生物学的サンプルとを接触させる工程を包含する、方法。２０．個体において抗ガン胎児性抗原応答を検出するための方法であって、請求項５に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体と、該個体由来の生物学的サンプルとを接触させる工程を包含する、方法。２１．進行性のガン胎児性抗原関連疾患を有する個体においてガン胎児性抗原関連疾患を緩和する方法であって、有効量のモノクローナル抗体3H1を該個体に投与する工程を包含する、方法。