NO178687B - Fremgangsmåte for fremstilling av forenlige, lagringsstabile erythropoietinpreparater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av forenlige, lagringsstabile erythropoietinpreparater.

Erythropoietin (EPO) er et glycoprotein som stimulerer dannelsen av hemoglobin henholdsvis erythrqcytter i benmargen. Dette lipoprotein dannes hovedsakelig i nyrene, befinner seg

i svært små mengder i serum og utskilles delvis under fysiologiske betingelser i urinen.

Mangel på EPO ved nyreinsuffisiens fører med seg en renal anemi. Ved tilførsel av EPO i fysiologiske mengder,

dvs. noen mikrogram, i én eller flere doseringer, kan danne-elsen av erythrocytter i slike tilfeller igjen settes i gang. Ettersom kroppen reagerer følsomt allerede på små doseendrin-ger, må doseringen være nøyaktig reproduserbar. Vanligvis injiseres EPO som vandig oppløsning, enten i.m. eller i.v., eller tilføres over neseslimhinnen som spray.

Det er dog kjent at EPOr og da både det produkt som først og fremst utvinnes fra humanurin (Miyake et al., Biol. Chem. Vol. 25, 5558-5564 1977) og også de genteknologisk frembragte produkter (WO 85-02610) ikke er stabile i vandig oppløsning, og at det selv ved en oppbevaring ved -80°C opp-trer store aktivitetstap. Disse to produktene adskiller seg noe fra hverandre i glycosyleringsmønsteret og i aktiviteten, idet en direkte sammenligning med den EPO som finnes i serumet hittil ikke er kjent.

Disse aktivitetstap kan på den ene side tilbakeføres

til en forstyrrelse av EPO gjennom katalytisk virkning fra overflaten på de ampuller som tjener til oppbevaring, gjennom spor av tungmetaller, luftoxygen, etc, men på den annen side også gjennom en festing av EPO-molekyler til beholderveggen, hvorved også en delvis denaturering kan inntre. Ettersom det, som nevnt ovenfor, i hver doseringsenhet bare finnes noen få mikrogram, kan tapet gjennom adsorpsjon være betydelig allerede etter kort oppbevaringstid.

I EP-A 178 576 er det derfor blitt beskrevet hvordan denne festing til beholderveggen kan inhiberes gjennom tilsetning av polymere forbindelser, som human- eller storfe-serumalbumin, lecithin, dextran, cellulose, polyethylen-

glycol, etc, og hvorved det oppnåes en gjenfinning av EPO

på 75 - 98% etter ca. 2 timers lagring ved 20°C, i forhold til bare 16% uten slik tilsetning. Derved ble riktignok bare gjenfinningen av en radioaktiv markør ( 14C) målt, slik at forsøket ikke sier noenting om stabiliseringen av EPO mot nedbrytning.

Ifølge våre funn oppnåes imidlertid ikke en langtids-stabilisering med slike midler, dvs. at EPO-aktiviteten i mustesten avtar sterkt, og dessuten kan disse midler frem-kalle immunogene reaksjoner ved injeksjonen.

Fra EP-A 178 665 er det videre kjent "stabilisatorer", særlig for frysetørkede EPO-preparater. Ved siden av de polymere stoffene PEG 4000, gelatin og dextran 40, er det nevnt forskjellige sukkere og sukkeralkoholer, aminosyrer, uorga-niske salter og thiolforbindelser. Blandinger av disse stoffene med humanserumalbumin, gelatin og dextran er likeså nevnt. Også i dette litteratursted bestemmes bare gjenfinningen av radioaktivitet etter 2 måneders lagring av de frysetørkede produkter. Denne er angitt til å være 87 - 99%,

i motsetning til 60% uten tilsetning. Ettersom det lyofiliserte materiale benyttes som standard direkte etter fremstillingen, er det ikke angitt hvor høyt aktivitetstapet ved fremstillingen av preparatet er. Også disse preparatene opp-viser et høyt virkningstap i mustesten.

Således var oppgaven å finne frem til et godt forenlig EPO-preparat som er lagerstabilt, dvs. bevarer aktiviteten

in vivo, ikke fører til adsorpsjon på ampulle- eller sprøyte-veggene og lett kan bringes i en injiserbar form.

På overraskende måte ble denne oppgave løst gjennom fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av forenlige, lagringsstabile erythropoietinpreparater som inneholder erythropoietin, fysiologisk forenlig buffer samt eventuelt kompleksdanner, isotoni-innstillende middel, kalsiumklorid og andre stoffer som er vanlige for injeksjonsformål, som er kjennetegnet ved at man først fremstiller en oppløsning av 5-50 g/l urea, 1-50 g/l aminosyre og 0,05-5 g/l ikke-ionogent fuktemiddel, tilsetter vanlige hjelpestoffer til denne oppløs-ning og deretter tilblander erythropoietinet. Som våre forsøk har vist, har de enkelte stoffene ikke disse egenskaper, eller bare i mindre omfang.

Avgjørende for stabiliseringen er tilsetningen av urea og forskjellige aminosyrer. Urea tilsettes i 5 - 50 g/liter, fortrinnsvis 10 - 15 g/liter. Som aminosyrer nevnes eksempel-vis L-glycin, alanin, arginin,.L-leucin, L-isoleucin, 2-fenylalanin, glutaminsyre eller L-threonin. Blandinger av

de forskjellige aminosyrer synes å ha en særlig fordelaktig effekt. Disse tilsettes i mengder på 0,5 - 50 g/liter, fortrinnsvis 1-20 g/liter, idet totalmengden fortrinnsvis skal utgjøre 5-25 g/liter.

Videre er en fysiologisk forenlig buffer nødvendig, som i de for injeksjonsoppløsninger nødvendige lave konsentrasjoner (ca. 20 - 100 mmol/liter) innstiller det for EPO nød-vendige pH-område på 6,5 - 7,4, særlig 7,0 - 7,2. Foruten fosfatbuffere er også glycinat, carbonat, citrat og andre brukbare, idet foruten natriumion, også kalium- eller ammonium-ioner kan tjene som motion. En bufring bevirkes i tillegg gjennom de tilstedeværende aminosyrer.

Festingen av EPO til ampulleveggene og sprøytene ned-settes vesentlig gjennom tilsetning av små mengder av en detergent. Ettersom preparatet i overveiende grad skal injiseres, må dette stoffet være fysiologisk, særlig i.v., akseptabelt. Konsentrasjoner på 0,05 - 5 g/liter, særlig 0,1 - 0,5 g, har hevdet seg. Ikke-ionogene fuktemidler, som de forskjellige poly-makrogol-typer, særlig polyethylensorbitanlaurat ("Tween 20 eller 80") eller sorbitantrioleat ("Span 35 eller 80") eller glycerol-oleylsyrepolyglycolether ("Labra-fil"), har vist seg fordelaktig for dette formål, andre akseptable stoffer kan imidlertid på samme måte anvendes.

For å forminske innflytelsen av tungmetallioner, som helt uunngåelig slipper til ved opparbeidelsen, f.eks. fra de anvendte metallapparater, på EPO, har det videre vist seg fordelaktig å tilsette oppløsningen 0,01 - 5 g/liter av et oppløselig kalsiumsalt, fortrinnsvis 0,02 - 0,2 g/liter kalsiumklorid. Andre fysiologisk akseptable kompleksdannere, f.eks. citrat, EDTA, NTA, panthotenat, kan likeså tilsettes. Som oppløsningsmiddel anvendes rent vann for injeksjonsformål, som tilsettes 0,5 - 10 g/liter natriumklorid eller tilsvarende stoffer, som mannitol, sorbitol, etc, for inn-stilling av isotonisiteten.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppløses

alle hjelpestoffer i den nødvendige mengde vann, EPO-preparatet, som skal ha en aktivitet på ca. 100.000 til 200.000 enheter/milligram protein, tilblandes, det sterilfiltreres i passende ampuller, nedfryses og lyofiliseres skånsomt ved lave temperaturer. De erholdte preparater er holdbare under nitrogen i 2 år ved 0°C, og i 1 år ved værelsetemperatur. Ved rekondisjonering med vann oppløses de i løpet av få sekunder uten å bli turbide, og kan så injiseres enten direkte intravenøst eller intramuskulært, eller innsprøytes etter fortynning med isotone oppløsninger (f.eks. koksaltoppløsning).

Nedfrysningsprosessen har en særlig betydning. Hjelpestoffene utvelges med hensyn til type og mengde slik at det autektiske punkt for oppløsningen som skal nedfryses, ligger mellom -50 og -30°C. Ved hjelp av et datamaskinstyrt optima-liseringsprogram, kom man frem til de følgende optimale betingelser for de 3 lyofiliseringsfåsene:

Innfrysningstid: 12 - 14 timer ved - 40°C

Hovedtørking: Saltoppløsningstemperatur +10°C, trykk 10

mbar, tid 48 - 60 timer

Ettertørking: Saltoppløsningstemperatur +2 0°C, trykk 10

mbar, tid 4-6 timer.

Her er det vesentlig, ved hjelp av en Ap-måleinnretning, samt en konduktivitetmåling, å bedømme når hovedtørkingen er avsluttet, slik at produktet som skal lyofiliseres ikke oppvarmes for hurtig og en opptining av den nedfryste opp-løsning og det dermed forbundne aktivitetstap unngåes.

De tilsatte hjelpestoffer er utvalgt slik at det fåes en ensartet strukturert tilstand hos lyofiliserende is-legemer, og at det under lyofiliseringen fåes en porøs struk-tur (kake) hvorfra en optimal sublimasjon av is er mulig, fremfor alt også mot slutten av hovedtørkingen. Etter-tørkingen skjer som nevnt ovenfor ved bare +20°C og i løpet av 4 - 6 timer. Denne skånsomme behandling er viktig ettersom det ellers skjer et tap av aktivitet hos det lyofiliserende materiale.

Som regel har det således lyofiliserte produktet vann-innhold på ca. 2-5% etter Karl Fischer. Dette restvanninn-hold avhenger av type og mengde av hjelpestoffer som er tatt med i den angjeldende oppskrift.

De vandige oppløsninger av stabilisert EPO kan også fylles direkte i ampuller og uten lyofilisering bringes i handelen som bruksverdig form. Holdbarheten forkortes imidlertid derved med ca. 1 år ved 0°C og noen måneder ved værelsetemperatur i forhold til lyofilisatet.

Eksemplene nedenunder skal belyse det ovenfor beskrevne nærmere:

Eksempel 1

Erythropoietin 2000 enheter injeksjonstørrstoff

(blanding for 35.000 flasker)

Hjelpestoffene ble oppløst i en steril 100 liter V2A-dobbelmantelbeholder forsynt med røreverk:

Urea 700,0 g Natriumklorid 70,0 g Tween 20 7,0 g Natriumdihydrogenfosfat x IH2O 38,4 g Dinatriumhydrogenfosfat x 2H2O 350,0 g Kalsiumklorid x 2H20 8,4 g L-glycin 105,0 g L-leucin 140,0 g L-isoleucin 140,0 g L-threonin 35,0 g L-glutaminsyre 35,0 g

L-fenylalanin 70,0 g

Vann for injeksjonsformål 70,0 1

Til 30 1 av denne hjelpestoffoppløsning ble 214,3 ml

av et erythropoietin- råstoffparti med en EPO-titer på

140.000 enheter/liter ml tilsatt og fylt opp til sluttvolumet på 35 1, og grundig omrørt. Filtreringssystemet ble spylt med den gjenværende hjelpestoffoppløsning. Oppløsningen av blandingen ble sterilfiltrert over et membranfilter med 0,2 ym

porebredde. Den sterilfiltrerte oppløsning ble fylt på 1 ml injeksjonsflasker under aseptiske betingelser og frysetørket under følgende kriterier i et lyofiliseringsanlegg:

Innfrysningstid: 12 - 14 timer ved -40°C

Hovedtørking: Saltoppløsningstemperatur +10°C, trykk 10~^"

mbar, tid 48 - 60 timer

Ettertørking: Saltoppløsningstemperatur +2 0°C, trykk IO<-3>

mbar, tid 4-6 timer.

Det ble derved erholdt et voluminøst, åpenporet injek-sjonstørrstoff som er holdbart i minst 2 år i kjøleskap og 1 år ved værelsetemperatur, og som oppløses i løpet av noen timer i 2 ml vann for injeksjonsformål uten uklarhetsdannelse og fri for partikler.

Eksempel 2

Hjelpestoffene ble oppløst i 70 1 vann for injeksjonsformål og deretter oppdelt i to porsjoner å 35 1 ble tilsatt den nødvendige mengde EPO-aktivstoff. De andre 35 1 ble anvendt til spyling av filtreringssystemet. Oppløsningen av blandingen ble sterilfiltrert over et membranfilter med 0,2 ym porebredde. Den sterilfiltrerte oppløsning ble fylt i 1 ml injeksjonsflasker under aseptiske betingelser, og lyofilisert under de samme kriterier som angitt i eksempel 1. Det ble erholdt et hvitt, porøst, i 2 ml vann godt oppløse-lig lyofilisat som kan lagres i 2 år i kjøleskap eller 1 år ved værelsetemperatur uten store aktivitetstap.

Eksempel 3

Hjelpestoffene ble oppløst i 70 1 vann for injeksjonsformål, og deretter oppdelt i to porsjoner å 35 1. De første 3 5 1 ble tilsatt den nødvendige mengde EPO-aktivstoff. De andre 35 1 ble anvendt til spyling av filtreringssystemet. Oppløsningen av blandingen ble sterilfiltrert over et membranfilter med 0,2 ym porestørrelse. Den sterilfiltrerte oppløsning ble fylt i 1 ml injeksjonsflasker under aseptiske betingelser og lyofilisert under de samme kriterier som angitt i eksempel 1. Det ble derved erholdt et hvitt, porøst, i 2 ml vann godt oppløselig lyofilisat som kan lagres i 2 år i kjøleskap eller 1 år ved værelsetemperatur uten store aktivitetstap.

Hjelpestoffene ble oppløst i 70 1 vann for injeksjonsformål og deretter oppdelt i to porsjoner a 35 1. De første 35 1 ble tilsatt den nødvendige mengde EPO-aktivstoff. De andre 35 1 ble anvendt til spyling av filtreringssystemet. Oppløsningen av blandingen ble sterilfiltrert over et membranfilter med 0,2 ym porestørrelse. Den sterilfiltrerte oppløsning ble fylt i 1 ml injeksjonsflasker under aseptiske betingelser, og lyofilisert under de samme kriterier som angitt i eksempel 1. Det ble derved erholdt et hvitt, porøst, i 2 ml vann godt oppløselig lyofilisat som kan lagres i 2 år i kjøleskap eller 1 år ved værelsetemperatur uten store aktivitetstap.

Eksempel 5

Hjelpestoffene ble oppløst i 70 1 vann for injeksjonsformål, og deretter oppdelt i to porsjoner å 35 liter. De første 35 1 ble tilsatt den nødvendige mengde EPO-aktivstoff. De andre 35 1 ble anvendt til spyling av filtreringssystemet. Oppløsningen av blandingen ble sterilfiltrert over et membranfilter med 0,2 ym porestørrelse. Den sterilfiltrerte oppløsning ble fylt i 1 ml injeksjonsflasker under aseptiske betingelser, og lyofilisert under de samme kriterier som angitt i eksempel 1. Det ble derved erholdt et hvitt, porøst, i 2 ml vann godt oppløselig lyofilisat som kan lagres i 2 år i kjøleskap eller 1 år ved værelsetemperatur uten store aktivitetstap.

Eksempel 6

For å teste virkningen av forskjellige stabiliserings-midler, ble en standard oppskrift med 1000 enheter EPO/ml som inneholdt urea som hovedstabiliseringsmiddel, tilsatt polyvinylpyrrolidon/protein henholdsvis forskjellige aminosyrer, og produktet ble lyofilisert. Resultatene er oppsummert i tabell 1.

Stabiliteten til EPO ble bestemt etter 6 ukers lagring av lyofilisatet ved 35°C, henholdsvis 0°C, i musemilttesten etter forskriften til G. Krystal i Exp. Hematol. LI, 649-660 (1983), som følger: B6C3Fl-mus' nunkjØnn' vekt ca. 20 g (Zentralinstitut fiir Versuchstierkunde, Hannover) ble injisert på to på hverandre følgende dager med 60 ml/kg fenylhydrazinhydroklorid i.p. Etter tre ytterligere dager ble milten tatt ut, milt-cellene ble oppslemmet i sterilt komplettmedium (Dulbecco modifisert Eagle<1>s medium + 584,0 mg/l L-glutamin + 0,1 mmol/1 2-mercaptoethanol + 20% kalvefosterserum) og fortynnet til 4 x 10 kjerneholdige celler/ml. Suspensjonen, som på for-hånd ble tilsatt teststoffet, henholdsvis EPO-standarden,

1 de passende konsentrasjoner oppløst i BSA-buffer, ble for-delt på mikrotiterplater (0,2 ml/fordypning). Etter inkuba-sjon (22 timer, 37°C, luft +15% C02) ble 20 yl 3H-methyl-thymidin-oppløsning med 1 yCi tilsatt pr. fordypning og

inkubert i nye 2 timer ved 37°C. Deretter ble innholdet over-ført ved hjelp av en celle-innhøster og vasket med destillert vann. Opptaket av 3H-thymidin ble bestemt med en $-scintilla-sjonsteller og evaluert mot standardpreperatet.

Som arbeidsstandard ble "P009-EPO-standarden" fra Genetics Institute, Cambridge, Massachusetts, USA, som inneholder 112 enheter EPO/ml (og 503 ng protein/ml) (avstemt mot EPO-referansestandarden til WHO "International Reference Preparation of erythropoietin, Human, Urinary for Bioassay

(2. I.R.P., opprettet 1971)"), anvendt. Standardkonsentra-sjonene lå i området 10 - 100 mU/ml.

Lyofilisatene som skulle testes for sin EPO-aktivitet ble deretter oppløst i 2 ml vann pr. ampulle for injeksjonsformål, den videre fortynning skjedde, likeens som ved arbeidsstandarden, med BSA-buffer (8,75 g NaCl, 1,95 g CaCl x 2H„0, 1,00 g BSA (bovint serumalbumin), vann for injeksjonsformål ad 1 liter) . 3H-methyl-thymidm (spesifikk aktivitet: 2 Ci/mmol) ble erholdt fra New England Nuclear.

Eksempel 7

På lignende måte som i eksempel 6 ble en noe forandret hovedoppskrift tilsatt urea og forskjellige aminosyrer, henholdsvis blandinger av aminosyrer. For sammenligning ble to mannitol-holdige oppskrifter, som svarer til EP 178 665, også testet. Resultatene er oppsummert i tabell 2.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av forenlige, lagringsstabile erythropoietinpreparater som inneholder erythropoietin, fysiologisk forenlig buffer samt eventuelt kompleksdanner, isotoni-innstillende middel, kalsiumklorid og andre stoffer som er vanlige for injeksjonsformål, karakterisert ved at man først fremstiller en oppløsning av 5-50 g/l urea, 1-50 g/l aminosyre og 0,05-5 g/l ikke-ionogent fuktemiddel, tilsetter vanlige hjelpestoffer til denne oppløsning og deretter tilblander erythropoietinet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyren er en blanding som inneholder L-glycin, L-alanin, L-arginin, L-leucin, L-isoleucin, L-2-fenylalanin, L-glutaminsyre og/eller L-threonin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det som fuktemiddel anvendes polyethylensorbitanlaurat.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-3, karakterisert ved at preparatet fremstilles i lyofilisert form.

5. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at preparatet fremstilles i flytende, sprøyteegnet form.

6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at hver injeksjonsdose-enhet å 1-5 ml inneholder 100-1 million enheter erythropoietin.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av et erythropoietin-preparat ifølge et av kravene 1-6, karakterisert ved at hver injeksjonsdose-enhet å 1-5 ml inneholder 100-20.000 enheter erythropoietin.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et erythropoietin-preparat ifølge et av kravene 1-7, karakterisert ved at alle hjelpestoffene først oppløses i vann, erythropoietinet tilsettes, blandingen sterilfiltreres i ampuller og lyofiliseres skånsomt ved under -20 °C.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av et erythropoietin-preparat ifølge et av kravene 1-7, karakterisert ved at alle hjelpestoffene først oppløses i vann, erythropoietinet tilsettes og blandingen fylles i ampuller.