NO20110945L - Makrocykliske isokinolin-peptid-inhibitorer av hepatitt C-virus - Google Patents

Abstract

Makrocykliske isokinolin-peptider er beskrevet som har den generelle formel: En forbindelse med formel I: hvor R1 til R9, Q og W er beskrevet i beskrivelsen. Preparater omfattende forbindelsene og metodene for anvendelse av forbindelsene til å hemme HCV er også beskrevet.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår generelt antivirale forbindelser og mer spesifikt forbindelser som hemmer virkningen av NS3-protease (også referert til her som "serinprotease") kodet for av Hepatitt C-virus (HCV), preparater omfattende slike forbindelser og metoder for å hemme virkning av NS3-protease.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

HCV er et viktig humant patogen, beregnet å infisere 170 millioner personer verden over - omtrent fem ganger antallet infisert av humant immunsvikt-virus type 1. En stor del av disse HCV-infiserte individer utvikler alvorlig progressiv leversykdom, omfattende cirrhose og hepatocellulært karsinom (Lauer, G. M.; Walker, B. D. N. Engl. J. Med. (2001), 345, 41-52).

For tiden anvender den mest effektive HCV-terapi en kombinasjon av alfa-interferon og ribavirin, hvilket fører til langvarig effektivitet hos 40% av pasientene (Poynard, T. et al. Lancet (1998), 352, 1426-1432). Nyere kliniske resultater demonstrerer at pegylert alfa-interferon er bedre enn umodifisert alfa-interferon som monoterapi (Zeuzem, S. et al. N. Engl. J. Med. (2000), 343, 1666-1672). Imidlertid, selv med eksperimentelle terapeutiske regimer som involverer kombinasjoner av pegylert alfa-interferon og ribavirin, oppnår en vesentlig del av pasientene ikke langvarig reduksjon i viral belastning. Således er det et klart og umettet medisinsk behov for å utvikle effektive terapeutiske midler for behandling av HCV-infeksjon.

HCV er et positiv-trådet RNA-virus. Basert på en sammenligning av den utledede aminosyresekvens og den omfattende similaritet i den 5' utranslaterte region er HCV klassifisert som en separat slekt i Flaviviridae-familien. Alle medlemmer av Flaviviridae-familien har innkappede virioner som inneholder et positiv tråd RNA-genom som koder for alle kjente virus-spesifikke proteiner via translasjon av en enkel, uavbrutt, åpen leseramme.

Betraktelig heterogenitet er funnet innen nukleotidet og den kodede aminosyresekvens gjennom hele HCV-genomet. Minst seks viktige genotyper erkarakterisertog mer enn 50 undertyper er beskrevet. Hoved-genotyper av HCV avviker i deres distribusjon verden over og den kliniske betydning av den genetiske heterogenitet av HCV er fortsatt uklar til tross for en rekke undersøkelser av den mulige effekt av genotyper på patogenese og terapi.

Enkeltrådet HCV RNA-genom er omtrent 9500 nukleotider i lengde og har en enkel åpen leseramme (ORF) som koder for et enkelt stort polyprotein med ca. 3000 aminosyrer. I infiserte celler er dette polyprotein spaltet ved multiple seter av cellulære og virale proteaser for å produsere strukturelle og ikke-strukturelle (NS) proteiner. I tilfellet av HCV blir dannelsen av modne ikke-strukturelle proteiner (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A og NS5B) utført av to virale proteaser. Den første spalter ved NS2-NS3-forbindelsen; den andre er en serinprotease inneholdt i den N-terminale region av NS3 og medierer alle de påfølgende spaltninger nedstrøms for NS3, både i cis, ved NS3-NS4A spaltningssetet og i trans, for de resterende NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B-seter. NS4A-proteinet synes å tjene multiple funksjoner, ved å virke som en kofaktor for NS3-protease og muligens assistere i membranlokalisering av NS3 og andre virale replikase-komponenter. Kompleksdannelse mellom NS3 protease-domenet og dets kofaktor, NS4A, er essensiell for effektiv proteolytisk spaltning av de fire respektive seter. NS3-proteinet oppviser også nukleosid trifosfatase og RNA helikase-aktiviteter. NS5B er en RNA-avhengig RNA-polymerase som er involvert i replikasjon av HCV.

Blant forbindelsene som har demonstrert effektivitet i hemning av HCV-replikasjon, som selektive HCV-serinproteaseinhibitorer, er de makrocykliske peptid-forbindelser beskrevet i internasjonal søknad PCT/CA00/00353 (publikasjon nf. WO 00/59929).

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer makrocykliske isokinolin-forbindelser med den følgende formel:

En forbindelse med formel I:

hvor:

(a) Ri, R2, R3, R4, Rsog R6er hver uavhengig H; Ci-6alkyl; C3-7cykloalkyl; C1-6alkoksy; C3-7cykloalkoksy; halogen-Ci-6alkoksy; halogen-C1-6alkyl; cyano; halogen; hydroksyl; C1-6alkanoyl; nitro; amino; mono-eller di-(Ci-6) alkylamin; mono- eller di-(C3-7) cykloalkylamin; mono- eller di-Ci-6alkylamid; mono- eller di-(C3-7) cykloalkylamid; karboksyl; (C1-6) karboksyester; tiol; Ci-6tioalkyl; Ci.6alkylsulfoksyd;Ci^alkylsulfon; Ci.6alkylsulfonamid; C6-10aryl eventuelt substituert med Het; C7-14alkylaryl; C6-10aryloksy; C7-14alkylaryloksy; 5-7 leddet monocyklisk heteroaryloksy; eller Het; hvor nevnte Ri til R6eventuelt er bundet til isokinolin-gruppen av en Ci-6alkyl-linker-gruppe; (b) R7er NH2eller -NRi0Rn; hvor R10er C1-6alkyl, C1-6halogenalkyl, C(0)-NR12Ri3, C(0)-ORi4, C(0)-SRi5eller -C(0)-Ri6; Rner H, Cm alkyl eller C1-6 halogenalkyl, forutsatt at hvis enten R12 eller R13 er H, da er Rn

H;

R12 og R13 er hver uavhengig H; Cm alkyl, C3.7 cykloalkyl eller C4-10 alkylcykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, C1-3 alkoksy, C1-3 halogenalkoksy, C1-3 alkyl eller C1-3 halogenalkyl; eller aryl; og hvor R12og R13 sammen med nitrogenet som de er bundet til kan danne en 4-7-leddet heterocyklisk gruppe;

Ru og R15 er hver uavhengig C1-6 alkyl, C3-7 cykloalkyl eller C4-10 alkylcykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, C1-3 alkoksy, C1-3 halogenalkoksy, C1-3 alkyl eller C1-3 halogenalkyl; aryl eller Het;

Ri6er H; Ci.6 alkyl, C3.7cykloalkyl eller C4-10 alkylcykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, C1-3alkoksy, C1-3 halogenalkoksy, Ci-3 alkyl eller C1-3 halogenalkyl; aryl eller Het;

(c) Rs og Rg er hver uavhengig H eller C1-3 alkyl eventuelt substituert med halogen eller C1.3 alkoksy eller C1.3 halogenalkoksy; (d) Q er en C3-9 mettet eller umettet kjede eventuelt inneholdende ett til tre heteroatomer uavhengig valgt fra O, S(0)m; hvor m er 0, 1 eller 2 eller NR17, hvor R17 er H; C1-6 alkyl eller C1-6 cykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, C1-6 alkoksy, cyano eller C1-6 halogenalkoksy; -C(0)-Ria, C(0)-ORi9, C(O)-NR20R2i eller -SO2R22;

Ris, R2o,og R21 er hver uavhengig H; C1-6 alkyl eller C1-6 cykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, Ci.6 alkoksy, cyano eller d-6halogenalkoksy;

R19er C1-6 alkyl eller C1-6 cykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, C1-6 alkoksy, cyano eller C1-6 halogenalkoksy;

R22 er aryl, C1-6 alkyl eller C1-6 cykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, Ci.6 alkoksy, cyano eller Ci.6 halogenalkoksy; og

(e) W er OH, -NH-SOn-R23 eller NH-SOn- R24;hvor n er 1 eller 2, R23er C1-8alkyl, C4-10 alkylcykloalkyl, usubstituert C3.7 cykloalkyl eller cyklopropyl eller cyklobutyl eventuelt substituert med C7-9 alkylaryl eller

Ci^talkyl eventuelt substituert med halogen, C1-3alkoksy, cyano, amin, mono- eller di-Ci-6alkylamin, mono- eller di-Ci-6alkylamid eller karboksylat; og R24er C6-io aryl eller Het;

eller en farmasøytisk godtagbar enantiomer, diastereomer, salt, solvat eller prodrug derav.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også preparater omfattende forbindelsene eller farmasøytisk godtagbare salter, solvater eller prodrug derav og en farmasøytisk godtagbar bærer. Spesielt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse farmasøytiske preparater nyttige for å hemme HCV NS3-protease omfattende en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse eller et farmasøytisk godtagbart salt, solvat eller prodrug derav og en farmasøytisk godtagbar bærer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre metoder for behandling av pasienter infisert med HCV, omfattende administering til pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse eller et farmasøytisk godtagbart salt, solvat eller prodrug derav. I tillegg tilveiebringer foreliggende oppfinnelse metoder for hemning av HCV NS3-protease ved å bringe NS3-proteasen i kontakt med en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ved foreliggende oppfinnelse er det nå mulig å tilveiebringe forbedrede medikamenter omfattende forbindelsene ifølge oppfinnelsen som kan være effektive ved behandling av pasienter infisert med HCV. Spesifikt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse peptidforbindelser som kan hemme funksjonen av NS3-protease, f.eks. i kombinasjon med NS4A-protease. Videre gjør foreliggende oppfinnelse det mulig å administrere kombinasjonsterapi til en pasient hvorved en forbindelse i henhold til foreliggende oppfinnelse, som er effektiv til å hemme HCV NS3-protease, kan administreres med en annen forbindelse som har anti-HCV-aktivitet, f.eks. en forbindelse som er effektiv til å hemme funksjonen av et mål valgt fra gruppen bestående av HCV metalloprotease, HCV-serinprotease, HCV-polymerase, HCV-helikase, HCV-NS4B-protein, HCV-inntrenging, HCV-sammensetning, HCV-utgang, HCV- NS5A-protein, IMPDH og en nukleosid-analog for behandling av en HCV-infeksjon.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Stereokjemiske definisjoner og konvensjoner anvendt her følger generelt McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Book Company, New York (1984) og Stereochemistry of Organic Compounds, Eliel, E. og Wilen, S., John Wiley & Sons, Inc., New York (1994). Mange organiske forbindelser eksisterer i optisk aktive former, dvs. de har evnen til å rotere planet av plan-polarisert lys. Ved beskrivelse av en optisk aktiv forbindelse blir prefiksene D og L eller R og S anvendt for å angi den absolutte konfigurasjon av molekylet omkring dets chirale senter(e). Prefiksene d og I eller (+) og (-) blir anvendt for å angi rotasjonen av plan-polarisert lys av forbindelsen, med (-) eller I som betyr at forbindelsen er venstredreiende og (+) eller d, som betyr at forbindelsen er høyredreiende. For en gitt kjemisk struktur er disse forbindelser, betegnet stereoisomerer, identiske bortsett fra at de er speilbilder av hverandre. En spesifikk stereoisomer av et speilbilde-par kan også refereres til som en enantiomer og en blanding av slike isomerer er ofte betegnet en enantiomer blanding. Med referanse til tilfellene hvor (R) eller (S) blir anvendt, er det for å angi den absolutte konfigurasjon av en substituent i sammenheng med hele forbindelsen og ikke i sammenheng med substituenten alene.

Hvis ikke på annen måte spesifikt angitt her, har betegnelsene angitt nedenfor de følgende definisjoner.

Betegnelsene "racemisk blanding" og "racemat" refererer til en ekvimolar blanding av to enantiomere arter, som mangler optisk aktivitet.

Betegnelsen "chiral" angir molekyler som har egenskapen at de ikke er overleggbare over speilbilde-partneren, mens betegnelsen "achiral" angir molekyler som er overleggbare over deres speilbilde-partner.

Betegnelsen "stereoisomerer" angir forbindelser som har identisk kjemisk sammensetning, men avviker med hensyn til arrangement av atomer eller grupper i rommet.

Betegnelsen "diastereomer" angir en stereoisomer som ikke er en enantiomer, f.eks. en stereoisomer med to eller flere sentere av chiralitet og hvis molekyler ikke er speilbilder av hverandre. Diastereomerene har forskjellige fysiske egenskaper, f.eks. smeltepunkter, kokepunkter, spektral-egenskaper og reaktiviteter. Blandinger av diastereomerene kan separeres under høyoppløsning analytiske prosedyrer så som elektroforese og kromatografi.

Betegnelsen "enantiomerer" angir to stereoisomerer av en forbindelse som ikke er overleggbare speilbilder av hverandre.

Betegnelsen "terapeutisk effektiv mengde" betyr den totale mengden av hver aktiv komponent som er tilstrekkelig til å gi en meningsfull pasientfordel, f.eks. forlenget reduksjon av viral belastning. Når anvendt for en individuell aktiv bestanddel, administrert alene, angir betegnelsen den bestanddel alene. Når anvendt for en kombinasjon angir betegnelsen kombinerte mengder av de aktive bestanddelene som resulterer i den terapeutiske effekt, hvorvit administrert i kombinasjon, serielt eller samtidig.

Betegnelsen "forbindelser ifølge oppfinnelsen" og ekvivalente uttrykk, menes å omfatte forbindelser med formel I og farmasøytisk godtagbare enantiomerer, diastereomere salter og solvater, f.eks. hydrater og prodrug. Tilsvarende menes referanser til mellomprodukter, å omfatte deres salter og solvater, når sammenhengen tillater dette. Referanser til forbindelsen ifølge oppfinnelsen omfatter også de foretrukne forbindelser, f.eks. formel II og A-M.

Betegnelsen "derivat" betyr en kjemisk modifisert forbindelse hvor modifikasjonen er betraktet rutinemessig av en fagmannn, så som en ester eller et amid av en syre, beskyttelsesgrupper, så som en benzylgruppe for en alkohol eller tiol og tert-butoksykarbonylgruppe for et amin.

Betegnelsen "solvat" betyr en fysisk assosiasjon av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse med ett eller flere løsningsmiddel-molekyler, hvorvidt organisk eller uorganisk. Denne fysiske assosiering omfatter hydrogen-binding. I visse tilfeller kan solvatet isoleres, for eksempel når én eller flere løsningsmiddel-molekyler er innført i krystall-gitteret av det krystallinske faste stoff. "Solvat" omfatter både løsning-fase og isolerbare solvater. Eksempler på solvater omfatter hydrater, etanolater, metanolater, isopropanolater og lignende.

Betegnelsen "prodrug" som anvendt her betyr derivater av forbindelsene ifølge oppfinnelsen som har kjemisk eller metabolsk spaltbare grupper og blir, ved solvolyse eller under fysiologiske betingelser, forbindelsene ifølge oppfinnelsen som er farmasøytisk aktive in vivo. Et prodrug av en forbindelse kan dannes på konvensjonell måte med en funksjonell gruppe av forbindelsene så som med en amino-, hydroksy- eller karboksy-gruppe når til stede. Prodrug-derivatformen gir ofte fordeler av oppløselighet, vev-kompatilibitet eller forsinket frigjøring i en pattedyr-organisme (se Bundgard, H., Design of Prodrugs, s. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985). Prodrug omfatter syrederivater velkjent for fagfolk på området, så som for eksempel estere fremstilt ved omsetning av den parentale sure forbindelse med en egnet alkohol eller amider fremstilt ved omsetning av den parentale syreforbindelse med et egnet amin.

Betegnelsen "pasient" omfatter både humane og andre pattedyr.

Betegnelsen "farmasøytisk preparat" betyr et preparat omfattende en forbindelse ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med minst én ytterligere farmasøytisk bærer, dvs. adjuvans, tilsetningsmiddel eller konstituent, så som fortynningsmidler, konserveringsmidler, fyllmidler, strømningsregulerende midler, desintegreringsmidler, fuktemidler, emulgeringsmidler, suspenderingsmidler, søtningsmidler, smaksgivende midler, parfymerende midler, antibakterielle midler, antifungale midler, smøremidler og dispenserings-midler, avhengig av typen av administreringsmetoden og doseformene. Bestanddeler listet opp i Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1999) kan foreksempel anvendes.

Betegnelsen "farmasøytisk godtagbar" blir anvendt her for å referere til de forbindelser, materialer, preparater, f.eks. forbindelsene og deres enantiomerer, diastereomerer, salter, solvater eller prodrug og/eller doseformer som innenfor omfanget av sunn medisinsk bedømmelse, er egnet for anvendelse i kontakt med vevet til pasienter for behandling uten for høy toksisitet, irritasjon, allergisk respons eller andre problemer eller komplikasjoner som er i samsvar med et rimelig risiko/fordel-forhold.

Betegnelsen "behandling av" angir: (i) forhindrng av en sykdom, lidelse eller tilstand som forekommer hos en pasient som kan være predisponert for sykdommen, lidelsen og/eller tilstanden, men ikke ennu har vært diagnosert å ha den; (ii) hemning av sykdommen, lidelsen eller tilstanden, dvs. stansing av dens utvikling; og (iii) lindring av sykdommen, lidelsen eller tilstanden, dvs. forårsake regresjon av sykdommen, lidelsen og/eller tilstanden.

Betegnelsen "substituert" som anvendt her omfatter substitusjon med fra én til det maksimale antall av mulige bindingssteder på kjernen, f.eks. organisk rest, til hvilken substituenten er bundet, f.eks. mono-, di-, tri- eller tetra-substituert, hvis ikke på annen måte spesifikt angitt.

Nomenklaturen anvendt for å beskrive organiske rester, f.eks. hydrokarboner og substituerte hydrokarboner, følger generelt standard nomenklatur kjent på området, hvis ikke på annen måte spesifikt definert. Kombinasjoner av grupper, f.eks. alkylalkoksyamin eller arylalkyl, omfatter alle mulige stabile konfigurasjoner, hvis ikke på annen måte spesifikt angitt. Således kan en alkylaryl-substituent være bundet til et kjernesegment ved enten alkyl-delen eller aryl-delen av alkylaryl-substituenten, gitt at den resulterende forbindelsen er stabil. Visse rester og kombinasjoner er definert nedenfor for illustrasjonsformål.

Betegnelsen "halogen" som anvendt her betyr en halogensubstituent valgt fra brom, klor, fluor eller jod. Betegnelsen "halogenalkyl" betyr en alkylgruppe som er substituert med én eller flere halogensubstituenter.

Betegnelsen "alkyl" som anvendt her betyr acykliske, lineære eller forgrenede hydrokarbon-substituenter som har det spesifiserte antall karbonatomerog omfatter, foreksempel metyl, etyl, propyl, butyl, tert-butyl, heksyl, 1-metyletyl, 1-metylpropyl, 2-metylpropyl, 1,1-dimetyletyl. Således angir C-i-6 alkyl en alkylgruppe som har fra ett til seks karbonatomer. Betegnelsen "lavere alkyl" betyr en alkylgruppe som har fra ett til seks, fortrinnsvis fra ett til fire karbonatomer. Betegnelsen "alkylester" betyr en alkylgruppe i tillegg inneholdende en estergruppe. Generelt omfatter et angitt karbonantall-område, f.eks. C2-6alkylester, alle karbonatomene i resten.

Betegnelsen "alkenyl" som anvendt her betyr en alkylrest inneholdende minst én dobbeltbinding, f.eks. etenyl (vinyl) og alkyl.

Betegnelsen "alkoksy" som anvendt her betyr en alkylgruppe med det angitte antall karbonatomer bundet til et oksygenatom. Alkoksy omfatter for eksempel metoksy, etoksy, propoksy, 1-metyletoksy, butoksy og 1,1-dimetyletoksy. Den sistnevnte rest er referert til på området som tert-butoksy. Betegnelsen "alkoksykarbonyl" betyr en alkoksygruppe i tillegg inneholdende en karbonylgruppe.

Betegnelsen "cykloalkyl" som anvendt her betyr en cyklisk hydrokarbon-substituent inneholdende det angitte antall karbonatomer og omfatter for eksempel cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl, cykloheptyl og spiro-cykliske grupper så som spirocyklopropyl og spirocyklobutyl. Betegnelsen "cykloalkoksy" som anvendt her betyr en cykloalkylgruppe bundet til et oksygenatom, så som for eksempel cyklobutyloksy eller cyklopropyloksy. Betegnelsen "alkylcykloalkyl" betyr en cykloalkylgruppe bundet til en alkylgruppe. Det angitte karbonantall-området omfatter det totale antall karbonatomer i resten, hvis ikke på annen måte spesifikt angitt. Således kan C4-10alkylcykloalkyl inneholde fra 1-7 karbonatomer i alkylgruppen og fra 3-9 karbonatomer i ringen, f.eks. cyklopropylmetyl eller cykloheksyletyl.

Betegnelsen "aryl" som anvendt her betyr en aromatisk gruppe inneholdende det angitte antall av karbonatomer, så som, men ikke begrenset til, fenyl, indanyl eller naftyl. For eksempel angir C6-10aryl en aromatisk gruppe som har fra seks til ti karbonatomer som kan være i form av en monocyklisk eller bicyklisk struktur. Betegnelsen "halogenaryl" som anvendt her angir aryl mono-, di- eller tri-substituert med ett eller flere halogenatomer. Betegnelsene "alkylaryl", "arylalkyl" og "aralkyl" betyr en arylgruppe substituert med én eller flere alkylgrupper. Hvis ikke karbonantallet for hver gruppe er spesifisert, gjelder det angitte området hele substituenten. Således kan en C7-14alkylarylgruppe ha fra 1-8 karbonatomer i alkylgruppen for en monocyklisk aromatisk gruppe og fra 1-4 karbonatomer i alkylgruppen for en kondensert aromatisk gruppe. Binding av gruppen til bindingsstedet på molekylet kan være enten ved arylgruppen eller alkylgruppen. Hvis ikke en spesifikk arylrest er spesifisert, f.eks. fluor-fenyl eller resten er angitt å være usubstituert, omfatter arylrestene, f.eks. i en aryl-substituent eller en alkylaryl-substituent, de substituert med typiske substituenter kjent for fagfolk på området, f.eks. halogen, hydroksy, karboksy, karbonyl, nitro, sulfo, amino, cyano, dialkylamino halogenalkyl, CF3, halogenalkoksy, tioalkyl, alkanoyl, SH, alkylamino, alkylamid, dialkylamid, karboksyester, alkylsulfone, alkylsulfonamid og alkyl(alkoksy)amin. Eksempler på alkylarylgrupper omfatter benzyl, butylfenyl og 1 -naftylmetyl.

Betegnelsen "alkanoyl" som anvendt her betyr lineære eller forgrenede 1-oksoalkylrester inneholdende det angitte antall karbonatomer og omfatter, for eksempel formyl, acetyl, 1-oksopropyl (propionyl), 2-metyl-1-oksopropyl, 1-oksoheksyl og lignende.

Betegnelsen "alkylamid" som anvendt her betyr et amid mono-substituert med alkyl, så som

Betegnelsen "heterocyklisk gruppe" også referert til som "Het", som anvendt her betyr 7-12 leddede bicykliske heterocykliske grupper og 4-7-leddede monocykliske heterocykliske grupper.

Foretrukne bicykliske heterocykliske grupper er 7-12-leddede kondenserte bicykliske ringsystemer (begge ringer deler et nabostilt par av

atomer) inneholdende fra ett til fire heteroatomer valgt fra nitrogen, oksygen og svovel, hvor begge ringene i den heterocykliske gruppen er fullstendig umettet. Nitrogen- og svovel-heteroatomer kan eventuelt være oksydert. Den bicykliske heterocykliske gruppen kan inneholde heteroatomer i én eller begge ringer.

Hvis ikke en spesifikk heterocyklisk gruppe er spesifisert, f.eks. en fluorert 7-12-leddet bicyklisk heterocyklisk gruppe eller den heterocykliske gruppen er angitt å være usubstituert, omfatter de heterocykliske gruppene de substituert med typiske substituenter kjent for fagfolk på området. For eksempel kan den bicykliske heterocykliske gruppen også inneholde substituenter på hvilket som helst av ring-karbonatomene, f.eks. én til tre substituenter. Eksempler på egnede substituenter omfatter C1-6alkyl, C3-7cykloalkyl, C1-6alkoksy, C3-7cykloalkoksy, halogen-Ci-6alkyl, CF3, mono- eller di- halogen-Ci-6alkoksy, cyano, halogen, tioalkyl, hydroksy, alkanoyl, N02, SH,, amino, Ci.6alkylamino, di-(Ci-6> alkylamino, di-(Ci-6> alkylamid, karboksyl, (C1-6) karboksyester, C1-6alkylsulfon, Ci-6alkylsulfonamid, Ci-6alkylsulfoksyd, di-(Ci-6) alkyl(alkoksy)amin, C6-10aryl, C7-i4alkylaryl og en 4-7-leddet monocyklisk heterocyklisk gruppe. Når to substituenter er bundet til nabostilte karbonatomer i den bicykliske heterocykliske gruppen, kan de sammen danne en ring, f.eks. et fem-, seks- eller syv-leddet ringsystem inneholdende opptil to heteroatomer valgt fra oksygen og nitrogen. Den bicykliske heterocykliske gruppen kan være bundet til molekylet, f.eks. Ri i formel I, ved hvilket som helst atom i ringen og fortrinnsvis karbon.

Eksempler på bicykliske heterocykliske grupper omfatter, men er ikke begrenset til, de følgende ringsystemer:

Foretrukne monocykliske heterocykliske grupper er 4-7-leddede mettede, delvis mettede eller fullstendig umettede ringsystemer (denne sisnevnte underklasse er her også referert til som umettet heteroaromatisk gruppe) inneholdende i ringen fra ett til fire heteroatomer valgt fra nitrogen, oksygen og svovel, hvor svovel- og nitrogen-heteroatomene eventuelt kan være oksydert. Hvis ikke en spesifikk heterocyklisk gruppe er spesifisert, f.eks. en C1-6alkoksy-substituert 4-7-leddet monocyklisk heterocyklisk gruppe eller den heterocykliske gruppen er angitt å være usubstituert, omfatter de heterocykliske gruppene de substituert med typiske substituenter kjent for fagfolk på området. For eksempel kan den monocykliske heterocykliske gruppen også inneholde substituenter på hvilket som helst av ringatomene, f.eks. én til tre substituenter. Eksempler på egnede substituenter omfatter C1-6alkyl, C3-7cykloalkyl, C1-6alkoksy, C3-7cykloalkoksy, halogen-Ci-6alkyl, CF3, mono- eller di-halogen-Ci-6alkoksy, cyano, halogen, tioalkyl, hydroksy, alkanoyl, NO2, SH, amino, C1-6alkylamino, di-(Ci-6) alkylamino, di-(Cr6) alkylamid, karboksyl, (Ci-6) karboksyester, C1-6 alkylsulfon, Ci-6alkylsulfoksyd, Ci-6alkylsulfonamid, di-(C1-6) alkyl(alkoksy)amin, C6-ioaryl, C7-14alkylaryl og en ytterligere 4-7 leddet monocyklisk heterocyklisk gruppe. Den monocykliske heterocykliske gruppen kan være bundet til molekylet, f.eks. Ri i formel I, ved hvilket som helst atom i ringen.

Eksempler på monocykliske heterocykliske grupper omfatter, men er ikke begrenset til, de følgende (og deres tautomerer):

Fagfolk på området vil forstå at de heterocykliske gruppene anvendt i forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse må være stabile. Generelt er stabile forbindelser de som kan syntetiseres, isoleres og formuleres ved anvendelse av teknikker kjent for fagfolk på området uten nedbrytning av forbindelsen.

Betegnelsen "substituent" med referanse til en aminosyre eller et aminosyre-derivat betyr en rest avledet fra den tilsvarende a-aminosyre. For eksempel representerer substituentene metyl, iso-propyl og fenyl henholdsvis aminosyrene alanin, valin og fenylglycin.

Når anvendt for navngivning av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse angir betegnelsene "PV, P1, P2, P3 og P4", som anvendt her, de relative stillinger av aminosyre-restene av en proteaseinhibitor-binding i forhold til bindingen av det naturlige peptid-spaltningssubstrat. Spaltning skjer i det naturlige substrat mellom P1 og P1' hvor ikke-primære stillinger angir aminosyrer ved å starte fra C-terminus-enden av det peptide naturlige spaltningssete mot N-terminus; mens primære stillinger utgår fra N-terminus-enden av spaltningsted-angivelsen mot C-terminus. For eksempel angir P1' den første stilling fra høyreenden av C-terminus av spaltningssetet (dvs. N-terminus første stilling); mens P1 starter nummerering fra venstresiden av C-terminus spaltningssetet, P2: andre stilling fra C-terminus, etc.) [se Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London Series (1970), B257, 249-264].

I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes forbindelser med formel I:

hvor:

(a) Ri, R2, R3, R4, Rsog R6hver uavhengig er H; Ci-6 alkyl; C3-7cykloalkyl; C1-6alkoksy; C3-7cykloalkoksy; halogen-Ci-6alkoksy; halogen-C1-6alkyl; cyano; halogen; hydroksyl; C1-6alkanoyl; nitro; amino; mono- eller di-(Ci-6) alkylamin; mono- eller di-(C3-7) cykloalkylamin; mono- eller di-Ci-6 alkylamid; mono- eller di-(C3-7) cykloalkyl amid; karboksyl; (Ci-6) karboksyester; tiol; Ci-6tioalkyl; Cmalkylsulfoksyd;Cmalkylsulfon; Ci.6alkylsulfonamid; C6-10aryl eventuelt substituert med Het; C7-14alkylaryl; C6-10aryloksy; C7-14alkylaryloksy; 4-7 leddet monocyklisk heteroaryloksy; eller Het; hvor nevnte Ri til R6eventuelt er bundet til isokinolin-gruppen med en Ci-6alkyl-linkergruppe;

(b) R7er NH2eller -NR10R11; hvor R10er Ci-6alkyl, Ci-6halogenalkyl, C(0)-NR12Ri3, C(0)-ORi4, C(0)-SRi5eller -C(0)-Ri6; Rner H, Cm alkyl eller Cm halogenalkyl, forutsatt at hvis enten Ri2eller R13er H da er Rn

H;

Ri2 og R13er hver uavhengig H; Cm alkyl, C3-7cykloalkyl eller C4-10alkylcykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, C1-3alkoksy, C1-3halogenalkoksy, C1-3alkyl eller C1-3halogenalkyl; eller aryl; og hvor Ri2og R13sammen med nitrogenet som de er bundet til, kan danne en 4-7-leddet heterocyklisk gruppe; Ru og R15er hver uavhengig Ci-6alkyl, C3-7cykloalkyl eller C4-10alkylcykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, C1.3alkoksy, C1.3halogenalkoksy, C1-3alkyl eller C1.3halogenalkyl; aryl eller Het; R16er H; Cm alkyl, C3-7cykloalkyl eller C4-10alkylcykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, C1-3alkoksy, C1-3halogenalkoksy, C1-3alkyl eller C1-3halogenalkyl; aryl eller Het;

(c) R8og R9er hver uavhengig H eller C1.3alkyl eventuelt substituert med halogen eller C1-3alkoksy eller C1-3halogenalkoksy; (d) Q er en C3-9mettet eller umettet kjede eventuelt inneholdende ett til tre heteroatomer uavhengig valgt fra O, S(0)m; hvor m er 0, 1 eller 2 eller NR17, hvor R17er H; Cm alkyl eller Cm cykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, Cm alkoksy, cyano eller Cm halogenalkoksy; -C(0)-Ri8, C(0)-ORi9, C(O)-NR20R2i eller -S02R22; Ri8, R2o,og R2i er hver uavhengig H; Cm alkyl eller d-6 cykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, Cm alkoksy, cyano eller Cm halogenalkoksy; Rig er d-6 alkyl eller d-6 cykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, d-6 alkoksy, cyano eller d-6 halogenalkoksy; R22er aryl, d_6 alkyl eller d_6 cykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, d-6 alkoksy, cyano eller d-6 halogenalkoksy; og (e) W er OH, -NH-SOn-R23eller NH-SOn- R24;hvor n er 1 eller 2, R23er d-a alkyl, C4-10alkylcykloalkyl, usubstituert C3-7cykloalkyl eller cyklopropyl eller cyklobutyl eventuelt substituert med C7-9alkylaryl eller d^ alkyl eventuelt substituert med halogen, d-3 alkoksy, cyano, amin, mono- eller di-d-6 alkylamin, mono- eller di-d-6 alkylamid eller karboksylat; og R24er C6-io aryl eller Het;

eller en farmasøytisk godtagbare enantiomer, diastereomer, salt, solvat eller prodrug derav.

Fortrinnsvis er Ri bundet til d-stilling og er valgt fra H; d-6 alkyl; C3-7cykloalkyl; d-6 alkoksy; C3-7cykloalkoksy; halogen-d-6 alkoksy; halogen-d-6 alkyl; cyano; halogen; d-6 alkanoyl; mono- eller di-(d-6) alkylamin; mono- eller di-d-6 alkylamid; karboksyl; C6-10aryl eventuelt substituert med Het; C7-14alkylaryl; C6-io aryloksy eller Het. Fortrinnsvis er R2, R3og R4bundet til henholdsvis d-, C5- og Ce-stillinger, og er hver uavhengig valgt fra H; d-6 alkyl; C3-7cykloalkyl; d-6 alkoksy; C3-7cykloalkoksy; halogen-d-6 alkoksy; halogen-d-6 alkyl; cyano; halogen; hydroksyl; d-6 alkanoyl; mono- eller di-(d-6) alkylamin; mono- eller di-(d-7) cykloalkylamin; mono- eller di-d-6 alkylamid; mono- eller di-(d-7) cykloalkylamid; karboksyl; C6-10aryl eventuelt substituert med Het; C7-14alkylaryl; d-10 aryloksy; eller Het. Fortrinnsvis er Rsog R6bundet til henholdsvis C7-og C8-stillinger og er hver uavhengig valgt fra H; d-3 alkyl; C3^ cykloalkyl; C1-3alkoksy; d^ cykloalkoksy; halogen-d.3 alkoksy; halogen-Ci-3alkyl; cyano; halogen; hydroksyl; d-3 alkanoyl; mono- eller di-(C1-3) alkylamin; mono- eller di-(d-4) cykloalkylamin; mono- eller di-d-3 alkylamid; mono- eller di-(d-4) cykloalkylamid; eller karboksyl. Om ønsket kan én eller flere av Ri-, R2-, R3-, R4-, Rs-og R6-substituentene være bundet til isokinolin-gruppen med en d-6 alkyl-linkergruppe, f.eks. en metylengruppe.

Fortrinnsvis er Q en C3-9mettet eller umettet kjede eventuelt inneholdende ett til tre heteroatomer uavhengig valgt fra O, S(0)m; hvor m er 0, 1 eller 2 eller NRi7, hvor R17er H; d-6 alkyl, d-6 cykloalkyl, -C(0)-Ri8, C(O)-OR19, C(0)-NR2oR2ieller-S02R22. Fortrinnsvis er Ri8, R2o,og R2ihver uavhengig H; d-6 alkyl eller d-6 cykloalkyl; R19er d-6 alkyl eller d-6 cykloalkyl; og R22er aryl, d-6 alkyl eller d-6 cykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen.

Fortrinnsvis er W OH, -NH-SOn-R23eller NH-SOn- R24hvor n er 1 eller 2, R23er usubstituert C3.7cykloalkyl, cyklopropyl,eller cyklobutyl eventuelt substituert med C7-9alkylaryl eller d-4 alkyl; og R24er C6-10aryl eller Het.

I henhold til ett aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes forbindelser med formel II:

hvor:

(a) Ri er H; d-6 alkyl; C3-7cykloalkyl; d-6 alkoksy; C3-7cykloalkoksy; halogen-d-6 alkoksy; halogen-d-6 alkyl; cyano; halogen; d-6 alkanoyl; mono- eller di-(Ci-6) alkylamin; mono- eller di-Ci-6alkylamid; karboksyl; C6-10aryl eventuelt substituert med Het; C7-14alkylaryl; C6-10aryloksy eller Het; hvor nevnte Ri eventuelt er bundet til isokinolin-gruppen med en C1-6alkyl-linkergruppe; R2, R3og R4er hver uavhengig H; C1-6 alkyl; C3-7cykloalkyl; d-6 alkoksy; C3-7cykloalkoksy; halogen-d-6 alkoksy; halogen-d-6 alkyl; cyano; halogen; hydroksyl; d-6 alkanoyl; mono- eller di-(d-6) alkylamin; mono- eller di-(d-7) cykloalkylamin; mono- eller di-d-6 alkylamid; mono- eller di-(d-7) cykloalkylamid; karboksyl; C6-10aryl eventuelt substituert med Het; C7-14alkylaryl; C6-10aryloksy; eller Het; hvor nevnte R2til R4eventuelt er bundet til isokinolin-gruppen med en d-3 alkyl-linkergruppe; R5og R6er hver uavhengig H; d_3 alkyl; C3-4cykloalkyl; d-3 alkoksy; d^i cykloalkoksy; halogen-d-3 alkoksy; halogen-d-3 alkyl; cyano; halogen; hydroksyl; d-3 alkanoyl; mono- eller di-(Ci-3> alkylamin; mono- eller di-(d-4) cykloalkylamin; mono- eller di-d-3 alkylamid; mono- eller di-(d-4) cykloalkyl amid; eller karboksyl; (b) R7er NH2eller -NR10R11; hvor R10er d-6 alkyl, C1-6halogenalkyl, C(0)-NR12Ri3, C(0)-ORi4eller -C(0)-Ri6; Rner H, d-6alkyl eller d-6 halogenalkyl, forutsatt at hvis enten R12eller R13er H da er RnH; Ri2 og R13er hver uavhengig H; d-6 alkyl, d-7 cykloalkyl eller C4-10alkylcykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, d-3 alkoksy, d-3 halogenalkoksy, d-3 alkyl eller d-3 halogenalkyl; og hvor Ri2og R13sammen med nitrogenet som de er bundet til kan danne en 4-7 leddet heterocyklisk gruppe; Ru og R15er hver uavhengig d_6 alkyl, C3-7cykloalkyl eller C4-10alkylcykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, d-3 alkoksy, d-3 halogenalkoksy, d-3 alkyl eller d-3 halogenalkyl; Ri6er H; d-6 alkyl, d-7 cykloalkyl eller d-10 alkylcykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen, d-3 alkoksy, d_3 halogenalkoksy, d_3 alkyl eller d_3 halogenalkyl; aryl eller Het; (c) R8og R9er hver uavhengig H eller d-3 alkyl eventuelt substituert med halogen eller d-3 alkoksy eller d-3 halogenalkoksy; (d) Q er en C3-9 mettet eller umettet kjede eventuelt inneholdende ett til tre heteroatomer uavhengig valgt fra O, S(0)m; hvor m er 0, 1 eller 2 eller NRi7, hvor R17 er H; Ci-6 alkyl, Cm cykloalkyl, -C(0)-Ri8,C(0)-ORi9, C(0)-NR2oR2i eller-SO2R22; R-is, R2o,og R21er hver uavhengig H; Cm alkyl eller Cm cykloalkyl; R19er Cm alkyl eller Cm cykloalkyl; R22 er aryl, Cm alkyl eller Cm cykloalkyl, hver eventuelt substituert med halogen; og (e) W er OH, -NH-SOn-R23 eller NH-SOn- R24, hvor n er 1 eller 2, R23er usubstituert C3-7 cykloalkyl eller cyklopropyl eller cyklobutyl eventuelt substituert med C7-9 alkylaryl eller C1-4 alkyl; og R24 er C6-io aryl eller Het;

eller en farmasøytisk godtagbar enantiomer, diastereomer, salt, solvat eller prodrug derav.

Fortrinnsvis er Ri H; Cm alkoksy; mono- eller di-(Cm) alkylamin; en 5-eller 6-leddet monocyklisk heterocyklisk gruppe; eller C6-io aryl eventuelt substituert med en 5- eller 6-leddet monocyklisk heterocyklisk gruppe. Fortrinnsvis er R2, R3, RaOQR§ hver uavhengig H; Cm alkoksy; halogen-Cm alkoksy; hydroksyl; eller mono- eller di-(Ci_6) alkylamin.

Fortrinnsvis er R7 NH2 eller -NHR10; hvor R10er C(0)-NRi2Ri3, eller C(0)-ORi4; og R12 og R13 er Cm alkyl eventuelt substituert med halogen; og R14 er Cm alkyl eller C3-7 cykloalkyl eventuelt substituert med halogen.

Fortrinnsvis er Q en Cs-7-leddet kjede som har én dobbeltbinding eventuelt inneholdende ett heteroatom uavhengig valgt fra O, S(0)m; hvor m er 0,1 eller 2 eller NR17, hvor R17 er H; d-6 alkyl eller d-6 cykloalkyl. I et foretrukket aspekt av oppfinnelsen har Q den følgende struktur:

hvor P er en C3mettet kjede eventuelt inneholdende ett heteroatom uavhengig valgt fra O, S(0)m; hvor m er 0,1 eller 2 eller NR17(som definert i forbindelsen med formel II).

I ett aspekt av oppfinnelsen er W fortrinnsvis -NH-SCVR23, hvor n er 1 eller 2 og R23er usubstituert C3-7cykloalkyl eller cyklopropyl eller cyklobutyl eventuelt substituert med C7-9alkylaryl eller C1-4alkyl. I et annet aspekt av oppfinnelsen er W NH-SOn- R24, hvor n er 1 eller 2 og R24er Het.

Fortrinnsvis, når R24er Het, er Het valgt fra gruppen bestående av:

I henhold til et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse, tilveiebringes forbindelser med formel III:

hvor:

(a) Ri er H; C1-3alkoksy; di-(Ci-6) alkylamin; en 5- eller 6-leddet monocyklisk heterocyklisk gruppe; eller C6-10aryl eventuelt substituert med en 5- eller 6-leddet monocyklisk heterocyklisk gruppe; R2, R3, Riiog R5er hver uavhengig H; C1-3alkoksy; halogen; eller di-(Ci-e) alkylamin; (b) R7er -NHRi0; hvor R10er C(0)-NHRi3eller C(0)-ORi4; R13og Ru er C1-6alkyl; (c) Q er en Cs-7-leddet kjede som har én dobbeltbinding eventuelt inneholdende ett heteroatom uavhengig valgt fra O, S(0)m; hvor m er 0,

1 eller 2 eller NR17, hvor R17er H; Ci-6alkyl eller Ci-6cykloalkyl; og

(d) R23er usubstituert C3-7cykloalkyl eller cyklopropyl eller cyklobutyl eventuelt substituert med C7-9alkylaryl eller C1-4alkyl;

eller en farmasøytisk godtagbar enantiomer, diastereomer, salt, solvat eller prodrug derav.

Fortrinnsvis er Ri valgt fra gruppen bestående av pyridin, pyrrolidin, morfolin, piperazin, oksazol, isoksazol, tiazol, imidazol, pyrrol og pyrazol. I ett foretrukket aspekt er Ri fenyl eventuelt substituert med ett eller flere elementer valgt fra gruppen bestående av C1-3alkoksy, halogen, karboksyl, di-(Ci-3) alkylamin, C1-3halogenalkyl, trifluormetyl, trifluormetoksy og hydroksy. I et annet foretrukket aspekt er Ri di-(Ci-3> alkylamin. I et annet foretrukket aspekt er Ri piperazin substituert med ett eller flere elementer valgt fra gruppen bestående av C1-3alkyl, C5-7cykloalkyl eller pyridin. Fortrinnsvis er R2klor eller fluor. I ett foretrukket aspekt er R2di-(Cm) alkylamin eller metoksy.

I ett foretrukket aspekt har Q en struktur valgt fra de følgende:

I et annet foretrukket aspekt har Q en struktur valgt fra de følgende:

Eksempler på foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen er valgt fra gruppen bestående av

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, som inneholder en basisk gruppe, kan danne salter ved tilsetning av en farmasøytisk godtagbar syre. Syreaddisjonssaltene blir dannet fra en forbindelse med formel I og en farmasøytisk godtagbar uorganisk syre, omfattende men ikke begrenset til saltsyre, bromhydrogensyre, jodhydrogensyre, svovelsyre, fosforsyre eller en organisk syre så som p-toluensulfonsyre, metansulfonsyre, eddiksyre, benzosyre, sitronsyre, malonsyre, fumarsyre, maleinsyre, oksalsyre, ravsyre, sulfaminsyre eller vinsyre. Således omfatter eksempler på slike farmasøytisk godtagbare salter klorid, bromid, jodid, sulfat, fosfat, metansulfonat, citrat, acetat, malonat, fumarat, sulfamat og tartrat.

Salter av en amingruppe kan også omfatte kvaternære ammoniumsalter hvor amino-nitrogenet bærer en egnet organisk gruppe så som en alkyl-, alkenyl-, alkynyl- eller aralkyl-gruppe.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse, som er substituert med en sur gruppe, kan eksistere som salter dannet gjennom base-addisjon. Slike base-addisjonssalter omfatter de avledet fra uorganiske baser som omfatter for eksempel alkalimetallsalter (f.eks. natrium og kalium), jordalkalimetallsalter (f.eks. kalsium og magnesium), aluminiumsalter og ammoniumsalter. I tillegg omfatter egnede base-addisjonssalter salter av fysiologisk godtagbare organiske baser så som trimetylamin, trietylamin, morfolin, pyridin, piperidin, pikolin, dicykloheksylamin, N,N'-dibenzyletylendiamin, 2-hydroksyetylamin, bis-(2-hydroksyetyl)amin, tri-(2-hydroksyetyl)amin, prokain, dibenzylpiperidin, N-benzyl-P-fenetylamin, dehydroabietylamin, N,N'-bishydroabietylamin, glukamin, N-metylglukamin, kollidin, kinin, kinolin, etylendiamin, ornitin, cholin, N.N-benzylfenetylamin, klorprokain, dietanolamin, dietylamin, piperazin, tris(hydroksymetyl)aminometan og tetrametylammoniumhydroksyd og basiske aminosyrer så som lysin, arginin og N-metylglutamin. Disse salter kan fremstilles ved metoder kjent for fagfolk på området.

Lister over egnede salter kan finnes i for eksempel i Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18. ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990, s. 1445.

Visse forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse og deres salter kan også eksistere i form av solvater med vann, for eksempel hydrater eller med organiske løsningsmidler så som metanol, etanol eller acetonitril for å danne henholdsvis et metanolat, etanolat eller acetonitrilat. Foreliggende oppfinnelse omfatter hvert solvat og blandinger derav.

I tillegg kan forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse eller et salt eller solvat derav, oppvise polymorfisme. Foreliggende oppfinnelse omfatter også hvilken som helst slik polymorf form.

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse (Formel I, II eller III) inneholder også to eller flere chirale sentere og kan eksistere i forskjellige optisk aktive former. For eksempel kan forbindelser med formel I omfatte en cyklopropylgruppe som representert i P1-fragmentet nedenfor: hvor Ciog C2hver representerer et asymmetrisk karbonatom i stillinger 1 og 2 av cyklopropylringen. Uansett andre mulige asymmetriske sentere ved andre segmenter av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, betyr tilstedeværelsen av disse to asymmetriske sentere at forbindelsene kan eksistere som blandinger av diastereomerer, så som diastereomerene av forbindelser med formel III hvor Q er konfigurert enten syn til amidet eller syn til karbonylgruppen som vist nedenfor.

Foreliggende oppfinnelse omfatter både enantiomerer og blandinger av enantiomerer av forbindelsene, så som racemiske blandinger.

Enantiomerene kan spaltes ved metoder kjent for fagfolk på området, for eksempel ved dannelse av diastereoisomere salter som kan separeres ved krystallisering, gass-væske- eller væske-kromatografi, selektiv omsetning av én enantiomer med et enantiomer-spesifikt reagens. Det vil forstås at når den ønskede enantiomer blir omdannet til en annen kjemisk enhet ved en separeringsteknikk, da er et ytterligere trinn nødvendig for å danne den ønskede enantiomere form. Alternativt kan spesifikke enantiomerer syntetiseres ved asymmetrisk syntese ved anvendelse av optisk aktive reagenser, substrater, katalysatorer eller løsningsmidler eller ved omdannelse av én enantiomer til den andre ved asymmetrisk transformasjon.

Visse forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan også eksistere i forskjellige stabile konformasjonsformer som kan separeres. Torsjonsasymmetri på grunn av begrenset rotasjon om en asymmetrisk enkeltbinding, for eksempel på grunn av sterisk hindring eller ringspenning, kan tillate separering av forskjellige konformerere. Foreliggende oppfinnelse omfatter hver konformasjons-isomer av disse forbindelser og blandinger derav.

Visse forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan eksistere i zwitterion-form og foreliggende oppfinnelse omfatter hver zwitterion-form av disse forbindelser og blandinger derav.

Utgangsmaterialene nyttige for å syntetisere forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er kjent for fagfolk på området og kan lett fremstilles eller er kommersielt tilgjengelige.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved metoder kjent for fagfolk på området. De følgende metoder angitt nedenfor er gitt for illustrative formål og er ikke ment å begrense omfanget av oppfinnelsen. For eksempel kan forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse som har strukturen med formel 1,11 eller III syntetiseres som vist i det følgende skjema, fra forbindelser med formel IV, Formel VIIA eller VIIB. Det vil forstås at det kan være foretrukket eller nødvendig å fremstille en slik forbindelse hvor en funksjonell gruppe er beskyttet ved anvendelse av en konvensjonell beskyttelsesgruppe og deretter fjerne beskyttelsesgruppen for å tilveiebringe en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse. Detaljene angående anvendelse av beskyttelsesgrupper i henhold til foreliggende oppfinnelse er kjent for fagfolk på området.

a-karboksylsyren i en forbindelse med formel VIIA eller VIIB blir koblet med R23SO2NH2(R23som definert ovenfor) i nærvær av et peptid-koblingsmiddel, så som CDI eller EDAC og i nærvær av en base, så som 4-dimetylaminopyridin (4-DMAP) og/eller 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU), for å danne en forbindelse med formel I, II eller III.

Ved konstruksjon av forbindelser med formel I blir PV terminus innført i molekylene ved anvendelse av én av de generelle prosesser beskrevet ovenfor og beskrevet mer detaljert nedenfor. I noen eksempler er P1 '-elementene, som er cykloalkylsulfonamider, alkylsulfonamider eller heteroarylsulfonamider kommersielt tilgjengelig eller kan fremstilles fra det tilsvarende alkyl- eller cykloalkyl-sulfonylklorid ved behandling av nevnte sulfonylklorid med ammoniakk . Alternativt kan disse sulfonamider syntetiseres ved anvendelse av den generelle prosess-beskrivelse i det følgende Skjema. Der blir kommersielt tilgjengelig 3-klor-propylsulfonylklorid (1) omdannet til et egnet beskyttet sulfonamid som for eksempel ved behandling med tert-butylamin. Sulfonamidet oppnådd (2) blir deretter omdannet til det tilsvarende cykloalkylsulfonamid ved behandling med to ekvivalenter av en base så som butyllitium i et løsningsmiddel så som THF ved lav temperatur. Det resulterende cykloalkylsulfonamid kan avbeskyttes ved behandling med en syre for å gi det ønskede ubeskyttede cykloalkylsulfoamid. Nevnte P1 '-fragment kan innføres i forbindelser med formel I.

Forbindelser som har strukturen med formel IV, VI, VIIA eller VIIB kan fremstilles, for eksempel som beskrevet her og i internasjonal søknad nummer PCT/US01/45145, publikasjon nr. WO 02/060926, publisert 8. august 2002; internasjonal søknad nummer PCT/CA00/00353, publikasjon nr. WO 00/59929, publisert 12. oktober 2000; og U.S. patent 6,323,180 bevilget 27. november 2001.

Forbindelser som har strukturen med formel IV kan også fremstilles ved kobling av den kjemiske forløper A med den kjemiske forløper B som vist nedenfor.

Kjemisk forløper B, som også er vist ovenfor, kan for eksempel syntetiseres som følger.

Behandling av kommersielt tilgjengelig eller lett syntetisert imin (B1) med 1,4-dihalogenbuten (B2) med tilstedeværelse av en base tilveiebringer iminet (B3). Syrehydrolyse av B3 tilveiebringer deretter B, som har en vinyl-substituent syn til karboksylgruppen. Det er foretrukket for forbindelser B3 og B at vinylgruppen er syn til esteren. Amingruppen i B kan beskyttes ved anvendelse av en Boc-gruppe for å gi den fullstendig beskyttede aminosyre B4. Dette mellomproduktet er et racemat som kan spaltes ved en enzymatisk prosess hvor estergruppen i B4 blir spaltet for å gi den tilsvarende karboksylsyre. Uten å være bundet til noen spesiell teori er det antatt at denne reaksjonen er selektiv ved at én av enantiomerene B4 (1S, 2R) undergår reaksjonen med en meget større hastighet enn dens speilbilde B4 (1 R, 2S) hvilket gir en kinetisk spaltning av mellomprodukt-racematet. I eksemplet angitt ovenfor er den mer foretrukne stereoisomer for integrering i tripepidene B4 (1 R, 2S). I nærvær av enzymet undergår denne enantiomer ikke esterspaltning og derved blir denne enantiomer B5 gjenvunnet fra reaksjonsblandingen. Imidlertid undergår den mindre foretrukne enantiomer B4 (1S, 2R) esterspaltning, dvs. enzym-katalysert hydrolyse, for å gi den frie syren B6. Esteren (B5) kan separeres fra syreproduktet (B6) ved rutinemessige metoder så som for eksempel vandige ekstraksjonsmetoder eller kromatografi.

Forbindelser med formel I kan også omdannes til andre forbindelser med formel I som beskrevet her. Et eksempel på en slik fremgangsmåte er Skjemaet nedenfor, hvor en forbindelse med formel I (1) som bærer en Boc-gruppe ved P4-stilling blir omdannet til en forbindelse med formel I (3) hvor nevnte forbindelse bærer en urinstoff-gruppe i P4-stilling. Omdannelsen av (1) til (3) kan utføres i en to-trinns-prosess hvor det første er omdannelse av (1) til amin (2) ved behandling av (1) med en syre så som TFA i et løsningsmiddel så som metylenklorid. Det resulterende amin TFA-salt kan behandles med et isocyanat i nærvær av én ekvivalent av base for å gi en forbindelse med formel I (3) hvor P3-gruppen er innkappet med et urinstoff. Som tidligere angitt vil fagfolk på området forstå at mellomprodukt (2) kan anvendes som utgangsmateriale for fremstilling av forbindelser med formel I hvor P3-gruppen er innkappet med et amid eller et karbamat. Konstruksjon av nevnte forbindelser med formel I kan oppnås ved anvendelse av standard betingelser for dannelse av nevnte P4-funksjonaliterer fra aminer.

Prosedyrer for fremstilling av P2-mellomprodukter og forbindelser med formel I er vist i skjemaene nedenfor. Det skal bemerkes at i mange tilfeller er reaksjoner vist bare for én stilling av et mellomprodukt. Imidlertid skal det forstås at slike reaksjoner kan anvendes for å gi modifikasjoner til andre stillinger innen dette mellomproduktet. Videre er nevnte mellomprodukter, reaksjonsbetingelser og metoder gitt i de spesifikke eksempler bredt anvendelige for forbindelser med andre substitusjonsmønstere. De generelle Skjemaer beskrevet nedenfor er fulgt av eksempler her. Både generelle og spesifikke eksempler er ikke-begrensende.

Skjemaet ovenfor viser koblingen av en N-beskyttet C4-hydroksyprolin-gruppe med en isokinolin heterocyklisk gruppe for å danne mellomprodukt (4) og den påfølgende modifikasjon av nevnte mellomprodukt (4) til en forbindelse med formel I ved fremgangsmåten med peptid-forlengelse og en ring-lukkende olefin-metatese-reaksjon som beskrevet her. Det skal bemerkes at i det første trinn, som er kobling av C4-hydroksy-prolingruppen med isokinolin-elementet, blir en base anvendt. Fagfolk på området vil forstå at denne kobling kan utføres ved anvendelse av baser så som kalium-tert-butoksyd eller natriumhydrid, i et løsningsmiddel så som DMF eller DMSO eller THF. Denne kobling til isokinolin-ringsystemet skjer ved C1 -stillingen (nummerering for isokinolin-ringsystemet vist i mellomprodukt 2) og er styrt av klor-gruppen som blir fortrengt i denne prosessen. Det skal bemerkes at alternative utgående grupper kan anvendes i denne stilling så som fluor som vist i Skjemaet. Nevnte fluor-mellomprodukter (3) er tilgjengelige fra den tilsvarende klorforbindelse ved anvendelse av litteratur-prosedyrer beskrevet her.

I en underklasse av eksempler her blir isokinoliner innført i de endelige forbindelser og spesifikt i P2-regionen av nevnte forbindelser. Fagfolk på området vil forstå at flere generelle metoder er tilgjengelige for syntese av isokinoliner. Videre kan nevnte isokinoliner dannet ved disse metoder lett innføres i endelige forbindelser med formel I ved anvendelse av prosessene beskrevet her. Én generell metodikk for syntese av isokinoliner er vist i skjemaet nedenfor, hvor kanelsyre-derivater, vist generelt som struktur (2) blir

omdannet til 1-klorisokinoliner i en fire-trinns prosess. Nevnte klorisokinoliner kan deretter anvendes i koblingsreaksjoner til C4-hydroksyprolin-derivater som beskrevet her. Omdannelsen av kanelsyrer til klorkinoliner begynner med behandling av kanelsyre med et alkylklorformiat i nærvær av en base. Det resulterende an hyd rid blir deretter behandlet med natriumazid som resulterer i dannelse av et acylazid (3) som vist i Skjemaet. Alternative metoder er tilgjengelige for dannelse av acylazider fra karboksylsyrer ettersom for eksempel nevnte karboksylsyre kan behandles med difenylfosforylazid (DPPA) i et aprotisk løsningsmiddel så som metylenklorid i nærvær av en base. I neste trinn av reaksjonssekvensen blir acylazidet (3) omdannet til det tilsvarende isokinolon (4) som vist i Skjemaet. Ved tilfellet blir acylazidet oppvarmet til en temperatur på omtrent 190°C i et høytkokende løsningsmiddel så som difenylmetan. Denne reaksjonen er generell og gir moderate til gode utbytter av substituert isokinolon fra de tilsvarende kanelsyre-derivater. Det skal bemerkes at nevnte kanelsyre-derivater er tilgjengelige kommersielt eller kan oppnås fra det tilsvarende benzaldehyd- (1) derivat ved direkte kondensering med malonsyre eller derivater derav og også ved anvendelse av en Wittig-

reaksjon. Mellomprodukt-isokinoloner (4) kan omdannes til de tilsvarende 1-klorisokinoliner ved behandling med fosforoksyklorid. Denne reaksjonen er generell og kan anvendes for hvilken som helst av isokinolonene vist her for å omdanne en hydroksy-substituent til den tilsvarende klorforbindelse.

En alternativ metode for syntese av isokinolin-ringsystemet er Pomeranz-Fritsh-prosedyren. Denne generelle metoden er beskrevet nedenfor. Fremgangsmåten begynner med omdannelse av et benzaldehyd-derivat (1) til et funksjonalisert imin (2). Nevnte imin blir deretter omdannet til isokinolin-ringsystemet ved behandling med syre ved forhøyet

temperatur. Denne isokinolin-syntese som beskrevet ovenfor er generell og det skal bemerkes at denne prosessen er spesielt nyttig for å frembringe isokinolin-mellomprodukter som er substituert i C8-stilling (bemerk: i mellomprodukt (3) i Skjemaet ovenfor er C8-stilling av isokinolin-ringen substituert med substituent R6). Mellomprodukt-isokinoliner (3) kan omdannes til de tilsvarende 1-klorkinoliner (5) i en totrinns prosess som vist. Det første trinn i denne sekvensen er dannelse av isokinolin-N-oksyd (4) ved behandling av isokinolin (3) med meta-klorperbenzosyre i et aprotisk løsningsmiddel så som diklormetan. Mellomprodukt (4) kan omdannes til det tilsvarende 1-klorisokinolin ved behandling med fosforoksyklorid i kloroform under tilbakeløp.

En annen metode for syntese av isokinolin-ringsystemet er vist nedenfor. I denne prosessen blir et orto-alkylbenzamid-derivat (1) behandlet med en sterk base så som tert-butyllitium i et løsningsmiddel så som THF ved lav temperatur. Til denne reaksjonsblanding blir deretter satt et nitrilderivat, som undergår en addisjons-reaksjon med anionet avledet fra deprotonering av (1), hvilket resulterer i dannelse av (2). Denne reaksjonen er generell og kan anvendes for dannelse av substituerte isokinoliner. Mellomprodukt (2) i skjemaet ovenfor kan omdannes til det tilsvarende 1-klorisokinolin ved metodene beskrevet her.

En ytterligere metode for syntese av isokinoliner er vist nedenfor. Deprotonering av mellomprodukt (1) ved anvendelse av tert-butyllitium er beskrevet ovenfor. Ved foreliggende metode blir imidlertid nevnte mellomprodukt-anion oppfanget av en ester, hvilket resulterer i dannelse av mellomprodukt (2) som vist nedenfor. Ved en påfølgende reaksjon blir ketonet (2) kondensert med ammonium-acetat ved forhøyet temperatur hvilket gir dannelse av kinolon (3). Denne reaksjonen er generell og kan anvendes for konstruksjon av substituerte isokinoloner som deretter kan omdannes til de tilsvarende 1-klorisokinoliner som beskrevet her. Enda en ytterligere metode for konstruksjon av isokinoliner kan finnes i skjemaet nedenfor. I det første trinn av denne prosessen blir et orto-alkylarylimin-derivat så som (1) underkastet deprotoneringsbetingelser (sek-butyllitium, THF) og det resulterende anion blir behandlet ved

tilsetning av et aktivert karboksylsyre-derivat så som et Weinreb-amid. Det resulterende keto-imin (2) kan omdannes til det tilsvarende isokinolin ved kondensering med ammoniumacetat ved forhøyede temperaturer. Denne

metoden er generell og kan anvendes for syntese av substituerte isokinoliner. Nevnte isokinoliner kan omdannes til de tilsvarende 1-klorisokinoliner ved metodene beskrevet her. Konstruksjon av funksjonaliserte isokinolin-ringsystemer er også mulig ved anvendelse av [4+2] cykloaddisjons-reaksjoner. For eksempel som vist nedenfor tilveiebringer anvendelse av vinyl-isocyanater (1) ved cykloaddisjonsreaksjoner med benzyn-forløpere (2) funksjonaliserte isokinoloner (3). Nevnte isokinoliner kan innføres i forbindelser med formel I ved anvendelse av metodene beskrevet her. Isokinolinene beskrevet her og som blir innført i forbindelsene med formel I kan være ytterligere funksjonalisert. Det er klart for fagfolk på området at ytterligere funksjonalisering av nevnte heterocykliske grupper kan utføres enten før eller etter innføring av disse funksjonaliteter i forbindelser med formel I. De følgende skjemaer illustrere dette punkt. For eksempel viser skjemaet nedenfor omdannelsen av et 1-klor-

6-fluor-isokinolin til de tilsvarende 1-klor-6-alkoksy-isokinolin-arter, ved behandling av (1) av (ekv.1) med natrium- eller kalium-alkoksyd-arter i alkohol-løsningsmiddel fra hvilket alkoksydet er avledet ved romtemperatur. I noen

tilfeller kan det være nødvendig å oppvarme reaksjonen for å drive den til fullførelse. Mellomprodukt (2) av ligning 1 kan innføres i forbindelser med formel I ved beskrivelsene her. Som vist i ligning 2 kan den analoge reaksjon også utføres på et substrat hvor 6-fluor-isokinolin-elementet er innført i den makrocykliske gruppen. Behandling av mellomprodukt 2 i ligning 2 med natrium- eller kalium-alkoksyd-arter i alkohol-løsningsmidlet fra hvilket alkoksydet er avledet, kan gi forbindelser med formel 1.

Skjemaet nedenfor tilveiebringer et generelt eksempel på modifikasjon av isokinoliner som definert her ved anvendelse av palladium-medierte koblingsreaksjoner. Nevnte koblinger kan anvendes for å funksjonalisere et isokinolin ved hver stilling av ringsystemet for å tilveiebringe at nevnte ring blir hensiktsmessig aktivert eller funksjonalisert, som for eksempel med et klorid som vist i skjemaet. Denne sekvens begynner med 1-klorisokinolin (1) som etter behandling med metaklorperbenzosyre kan omdannes til det tilsvarende N-oksyd (2). Nevnte mellomprodukt (2) kan omdannes til det tilsvarende 1,3-diklorisokinolin (3) ved behandling med fosforoksyklorid i kloroform under tilbakeløp. Mellomprodukt (3) kan kobles med N-Boc-4-hydroksyprolin ved metodene beskrevet her for å gi mellomprodukt (5) som vist i Skjemaet. Mellomprodukt (5) kan underkastes en Suzuki-kobling med en aryl-boronsyre, i nærvær av et palladiumreagens og base og i et løsningsmiddel så som THF eller toluen eller DM F for å gi C3-arylisokinolin-mellomproduktet (6). Heteroarylboronsyrer kan også anvendes i denne Pd-medierte koblingsprosess for å gi C3-heteroarylisokinoliner. Mellomproduktet (6) kan omdannes til endelige forbindelser med formel I ved metodene beskrevet her. Palladium-medierte koblinger av heteroaryl-systemer med aryl- eller heteroaryl-elementer kan også anvendes ved et senere syntesetrinn ved konstruksjon av forbindelser med Formel I som vist nedenfor. Der blir det makrocykliske tripeptide acylsulfonamid-mellomprodukt (1) koblet til et 1-klor-3-bromisokinolin (2) ved anvendelse av den tidligerere beskrevne prosess med alkoksyd-fortrengning av en heteroarylhalogen-gruppe for å gi mellomprodukt (3). Koblingen av (1) og (2) kan utføres i nærvær av en katalysator så som lantanklorid. Isokinolin-ringsystemet i mellomprodukt (3) kan videre funksjonaliseres ved anvendelse av enten Suzuki-koblinger (Prosess 1: underkasting av (3) for heteroaryl- eller aryl-boronsyrer i nærvær av en palladium-katalysator så som palladium-tetrakis(trifenylfosfin) og en base så som cesiumkarbonat i løsningsmidler så som DMF) eller Stille-koblinger (Prosess 2: underkasting av (3) for heteraryl- eller aryl-tinn-derivater i nærvær av palladium-katalysator så som palladium-tetrakis(trifenylfosfin i løsningsmidler så som toluen).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også preparater omfattende en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse eller en farmasøytisk godtagbar enantiomer, diastereomer, salt, solvat eller prodrug derav og en farmasøytisk godtagbar bærer. Farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller en farmasøytisk godtagbar enantiomer, diastereomer, salt, solvat eller prodrug derav og en farmasøytisk godtagbar bærer, med en farmasøytisk godtagbar bærer, f.eks. tilsetningsmiddel eller konstituent-fortynningsmiddel.

Den aktive bestanddel, dvs. forbindelsen, i slike preparater omfatter typisk fra 0,1 vektprosent til 99,9 prosent etter vekt av preparatet og omfatter ofte fra ca. 5 til 95 vektprosent.

Således, i ett aspekt ved oppfinnelsen, tilveiebringes et preparat omfattende forbindelsen med formel 1 og en farmasøytisk godtagbar bærer. Fortrinnsvis omfatter preparatet videre en forbindelse som har anti-HCV-aktivitet. Som anvendt her betyr betegnelsen "anti-HCV-aktivitet" at forbindelsen er effektiv til å hemme funksjonen av et mål valgt fra gruppen bestående av HCV-metalloprotease, HCV-serinprotease, HCV-polymerase, HCV-helikase, HCV-NS4B protein, HCV-inntrenging, HCV-sammensetning, HCV-utgang, HCV-NS5A-protein, IMPDH og en nukleosid-analog for behandling av en HCV infeksjon. Ofte er den andre forbindelsen som har anti-HCV-aktivitet effektiv til å hemme funksjonen av mål i HCV-livscyklusen forskjellig fra HCV NS3-protease-protein.

I ett foretrukket aspekt er forbindelsen som har anti-HCV-aktivitet et interferon. Fortrinnsvis er interferonet valgt fra gruppen bestående av interferon alfa 2B, pegylert interferon alfa, konsensus-interferon, interferon alfa 2A, lymfoblastoid interferon tau.

I et annet aspekt ved oppfinnelsen er forbindelsen som har anti-HCV-aktivitet valgt fra gruppen bestående av interleukin 2, interleukin 6, interleukin 12, en forbindelse som forbedrer utvikling av en type 1 hjelper-T-celle-respons, interfererende RNA, anti-sense RNA, Imiqimod, ribavirin, en inosin-5'-monofosfat-dehydrogenase-inhibitor, amantadin og rimantadin.

I ett foretrukket aspekt av oppfinnelsen omfatter preparatet en forbindelse ifølge oppfinnelsen, et interferon og ribavirin.

I et annet foretrukket aspekt av oppfinnelsen er forbindelsen som har anti-HCV-aktivitet en lavmolekylær forbindelse. Som anvendt her betyr betegnelsen "lavmolekylær forbindelse" en forbindelse som har en molekylvekt mindre enn 1500 dalton, fortrinnsvis mindre enn 1000 dalton. Fortrinnsvis er den lavmolekylære forbindelse effektiv til å hemme funksjonen av et mål valgt fra gruppen bestående av HCV-metalloprotease, HCV-serinprotease, HCV-polymerase, HCV-helikase, HCV-NS4B protein, HCV-inntrenging, HCV-sammensetning, HCV-utgang, HCV NS5A-protein, inosin-monofosfat-dehydrogenase ("IMPDH") og en nukleosid-analog for behandling av en HCV-infeksjon.

Visse illustrative HCV-inhibitor-forbindelser som kan administreres med forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter de beskrevet i de følgende publikasjoner: WO 02/04425 A2 publisert 17. januar 2002, WO

03/007945 A1 publisert 30. januar 2003, WO 03/010141 A2 publisert 6. februar 2003, WO 03/010142 A2 publisert 6. februar 2003, WO 03/010143 A1 publisert 6. februar 2003, WO 03/000254 A1 publisert 3. januar 2003, WO 01/32153 A2 publisert 10. mai 2001, WO 00/06529 publisert 10. februar 2000, WO 00/18231 publisert 6. april 2000, WO 00/10573 publisert 2. mars 2000, WO 00/13708 publisert 16. mars 2000, WO 01/85172 A1 publisert 15. november 2001, WO 03/037893 A1 publisert 8. mai 2003, WO 03/037894 A1 publisert 8. mai 2003, WO 03/037895 A1 publisert 8. mai 2003, WO 02/100851 A2 publisert 19. desember 2002, WO 02/100846 A1 publisert 19. desember 2002, EP 1256628 A2 publisert 13. november 2002, WO 99/01582 publisert 14. januar 1999, WO 00/09543 publisert 24. februar 2000.

Tabell 1 nedenfor lister opp noen illustrative eksempler på forbindelser som kan administreres med forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres med andre anti-HCV-aktivie forbindelser i kombinasjonsterapi, enten sammen eller separat eller ved kombinasjon av forbindelsene i et preparat.

De farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres oralt, parenteralt eller via et implantert reservoir. Oral administrering eller administrering ved injeksjon er foretrukket. I noen tilfeller kan pH i formuleringen reguleres med farmasøytisk godtagbare syrer, baser eller buffere for å forbedre stabiliteten til den formulerte forbindelse eller dens leveringsform. Betegnelsen parenteral som anvendt her omfatter subkutan, intrakutan, intravenøs, intramuskulær, intra-artikulær, intrasynovial, intrasternal, intratekal og intralesjonal injeksjons- eller infusjonsteknikk.

Når oralt administrert kan de farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse administreres i hvilken som helst oralt godtagbar doseform omfattende, men ikke begrenset til, kapsler, tabletter og vandige suspensjoner og løsninger. I tilfellet av tabletter for oral anvendelse omfatter bærere som er vanlig anvendt laktose og maisstivelse. Smøremidler, så som magnesiumstearat, blir også typisk tilsatt. For oral administrering i kapselform omfatter nyttige fortynningsmidler laktose og tørket maisstivelse. Når vandige suspensjoner blir administrert oralt, er den aktive bestanddel kombinert med emulgerings- og suspenderingsmidler. Om ønsket kan visse søtningsmidler og/eller smaksgivende midler og/eller fargemidler tilsettes. Andre egnede bærere for de ovenfor angitte preparater kan finnes i standard farmasøytiske tekster, f.eks. i "Remington's Pharmaceutical Sciences", 19. ed., Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1995.

De farmasøytiske preparater kan fremstilles ved kjente prosedyrer ved anvendelse av velkjente og lett tilgjengelige ingredienser. Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres for å gi rask, forlenget eller forsinket frigjøring av den aktive bestanddel etter administrering til pasienten ved anvendelse av prosedyrer velkjent på området. Ved fremstilling av preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse blir den aktive bestanddel vanligvis blandet med en bærer eller fortynnet med en bærer eller innelukket i en bærer som kan være i form av en kapsel, dosepose, papir eller annen beholder. Når bæreren tjener som et fortynningsmiddel, kan den være et fast, halvfast eller flytende materiale som virker som konstituent, tilsetningsmiddel eller medium for den aktive bestanddel. Således kan preparatene være i form av tabletter, piller, pulvere, små kuler, pastiller, doseposer, eliksirer, suspensjoner, emulsjoner, løsninger, siruper, aerosol-preparater, (som fast stoff eller i et flytende medium), myke og harde gelatinkapsler, suppositorier, sterile injiserbare løsninger, sterilt pakkede pulvere og lignende. Ytterligere detaljer angående utforming og fremstilling av egnede leveringsformer av de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen er kjent for fagfolk på området.

Dosenivåer på mellom ca. 0,01 og ca. 1000 milligram pr. kg. ("mg/kg") kroppsvekt pr. dag, fortrinnsvis mellom ca. 0,5 og ca. 250 mg/kg kroppsvekt pr. dag av forbindelsene ifølge oppfinnelsen er typiske ved monoterapi for forhindring og behandling av HCV-mediert sykdom. Typisk vil de farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse administreres fra ca. 1 til ca. 5 ganger pr. dag eller alternativt, som en kontinuerlig infusjon. Slik administrering kan anvendes som kronisk eller akutt terapi. Mengden av aktiv bestanddel som kan kombineres med bærermaterialene for å produsere en enkel doseform vil variere avhengig av verten som behandles og den spesielle administreringsmetode.

Som fagfolk vil forstå kan lavere eller høyere doser enn de angitt ovenfor være nødvendig. Spesifikk dose og behandlingsregimer for hvilken som helst spesiell pasient vil avhenge av en rekke faktorer, omfattende aktiviteten til den spesifikke forbindelse anvendt, alder, kroppsvekt, generell helsetilstand, kjønn, diett, tidspunkt for administrering, utskillelseshastighet, medikament-kombinasjon, alvorlighetsgraden og forløpet av infeksjonen, pasientens disponering for infeksjonen og bedømmelsen til behandlende lege. Generelt blir behandling initiert med små doser hovedsakelig mindre enn den optimale dose av peptidet. Deretter blir dosen øket med små økninger inntil den optimale effekt under omstendighetene blir oppnådd. Generelt blir forbindelsen mest ønskelig administrert i et konsentrasjonsnivå som generelt vil gi antiviralt effektive resultater uten å forårsake noen som helst sjenerende eller skadelige bivirkninger.

Når preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en kombinasjon av en forbindelse ifølge oppfinnelsen og ett eller flere ytterligere terapeutiske eller profylaktiske midler, er både forbindelsen og det ytterligere middel vanligvis til stede i dosenivåer mellom ca. 10 til 100% og mer foretrukket mellom ca. 10 og 80% av dosen normalt administrert i et monoterapi-regime.

Når disse forbindelser eller deres farmasøytisk godtagbare enantiomerer, diastereomerer, salter, solvater eller prodrug er formulert sammen med en farmasøytisk godtagbar bærer, kan det resulterende preparat administreres in vivo til pattedyr, så som mennesker, for å hemme HCV NS3-protease eller for å behandle eller forhindre HCV-virus-infeksjon.

Følgelig tilveiebringer et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse metoder for å hemme HCV NS3-protease aktivitet i pasienter ved administering av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse eller en farmasøytisk godtagbar enantiomer, diastereomer, salt eller solvat derav.

I ett aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes en metode for behandling av en HCV-infeksjon hos en pasient, omfattende administering til pasienten av en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen ifølge oppfinnelsen eller en farmasøytisk godtagbar enantiomer, diastereomer, solvat, prodrug eller salt derav.

Fortrinnsvis er metoden for administering av forbindelsen effektiv til å hemme funksjonen av HCV NS3-protease-proteinet. Ved et foretrukket aspekt omfatter metoden videre administering av en annen forbindelse som har anti-HCV-aktivitet (som beskrevet ovenfor) før, etter eller samtidig med en forbindelse ifølge oppfinnelsen.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes som laboratorie-reagenser. Forbindelser kan bidra til å gi forskningsverktøy for utforming av virale replikasjonsforsøk, validering av dyreforsøksystemer og strukturelle biologi-undersøkelser for ytterligere å forbedre kunnskap om HCV sykdoms-mekanismer. Videre er forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse nyttige for etablering eller bestemmelse av bindingssetet for andre antivirale forbindelser, for eksempel ved kompetitiv hemning.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for å behandle eller forhindre viral forurensning av materialer og derfor redusere risiko for viral infeksjon hos laboratorie- eller medisinsk personale eller pasienter som kommer i kontakt med slike materialer, f.eks. blod, vev, kirurgiske instrumenter og utstyr, laboratorie-instrumenter og utstyr og blod-oppsamlings- eller transfusjonsapparater og materialer.

Videre kan forbindelsene og preparatene ifølge oppfinnelsen anvendes for fremstilling av et medikament for behandling av HCV-infeksjon hos en pasient.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også prosesser for spalting av en blanding av alkylester-enantiomerer omfattende å bringe blandingen i kontakt med et enzym effektivt til preferensielt å fremme hydrolyse av én av enantiomerene;karakterisert vedat kontakten blir utført i nærvær av en buffer. En slik blanding av alkylester-enantiomerer kan være et resultat av fremstilling av kjemisk forløper B, beskrevet ovenfor.

Fortrinnsvis har alkylesteren den følgende formel

hvor:

R25er en amino-beskyttelsesgruppe, så som for eksempel karbamater, f.eks.

BOC-iminer eller amider; og

R26er valgt fra gruppen bestående av C1-10alkyl, C6-14aryl, C7-16alkylaryl, C3-7cykloalkyl eller C3-10alkyl-cykloalkyl.

Den spesielle buffer anvendt i prosessene ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke kritisk. Typisk vil bufferen ha en pKa på +1 for pH ved hvilken hydrolysen blir utført, f.eks. pH fra ca. 7,0 til 11. Således, hvis hydrolysen blir utført ved f.eks. en pH på 8,0, kan en buffer med en pKa på fra ca. 7,0 til 9,0 anvendes. Foretrukne buffere er fosfater, borater og karbonater. Eksempler på egnede buffere omfatter: 2-[(2-amino-2-oksoetyl)amino]etansulfonsyre, N-(2-acetamido)-2-iminodieddiksyre, n,n-bis(2-hydroksyetyl)glycin, 1,3-bis[tris(hydroksymetyl)metylamino]propan, o-borsyre, karbonsyre, 2- (cykloheksylamino)etansulfonsyre, dietylmalonsyre, glycylglycin, N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etan-sulfonsyre (HEPES), N-2-hydroksycthylpiperazin-N'-3-propan-sulfonsyre, imidazol, 3- (N-morfolino)propansulfonsyre, o-fosforsyre,

piperazin-N-N'-bis(2-etansulfonsyre),

piperazin-1,4-bis(2-hydroksypropansulfonsyre),

3-[tris(hydroksymetyl)metyl]amino-propansulfonsyre,

2-[tris(hydroksymetyl)metyl]amino-etansulfonsyre,

N-[tris(hydroksymetyl)metyl]glycin og tris(hydroksylmetyl)aminometan.

Hvilket som helst enzym effektivt til preferensielt å hydrolysere den ønskede alkylester-enantiomer kan anvendes i henhold til foreliggende oppfinnelse. Proteaser, lipaser og esteraser blir ofte anvendt for hydrolyse av karboksylsyreester-bindinger. Enzymene egnet for anvendelse i henhold til foreliggende oppfinnelse, uansett opprinnelse eller renhet, kan anvendes i fri tilstand, enten i flytende eller tørr form eller immobilisert på en bærer så som for eksempel ved fysisk adsorpsjon eller oppfanging. Eksempler på lipaser omfatter lipaser fra Candida rugosa, hvetekim, svin bukspyttkjertel, Rhizopus arrhizus, Candida antarctica, Mucor miehei, Aspergillus niger, Pseudomonas-arter, Candida lipolytica, Humicola langinosa og Mucor javanicus. Eksempler på esterase omfatter griselever-esterase (PLE), hestelever-esterase (HLE), acetylcholin-esterase (ACE), kolesterol-esterase, esterase fra Bacillus subtilis (karboksylesterase NP). Proteaser er generelt definert som hydrolaser som virker på peptid-bindinger som deres naturlige substrat, men de kan spalte en karboksylsyreester-binding siden en ester-binding er meget svakere enn en peptid- (amid) binding. Eksempler på proteaser omfatter a-chymotrypsin, thermolysin, papain, proteaser fra Aspergillus sp., Bacillus sp., Rhizopus sp., Penicillum sp., Streptomyces griseus.

I esteren med formel VIII er det chirale senter i syregruppen fullt substituert. Dette representerer et vanskelig mål for "hydralitic" enzymer ettersom deres naturlige substrater (så som naturlige aminosyrer) vanligvis inneholder minst ett a-hydrogen. Meget overraskende ble det ved foreliggende oppfinnelse funnet at visse proteaser var meget effektive for enantioselektiv hydrolyse av ester VIII. Foretrukne proteaser omfatter proteaser fra stammer valgt fra gruppen bestående av Bacillus globigii, Bacillus licheniformis, Bacillus halodurans, Bacillus clausii og Aspergillus oryzae. Eksempler på egnede enzymer omfatter de valgt fra gruppen bestående av Alcalase<®>(subtilisin, alkalisk protease, Novozymes North America Inc., Franklington, NC), Savinase<®>(substilisin, alkalisk protease, Novozymes), ChiroCLEC™- BL (subtilisin, alkalisk protease, Altus Biologics, Inc.,), Protease N (subtilisin, alkalisk protease, Amano) og Flavourzyme™ (fungal protease/peptidase, Novozymes). Ytterligere detaljer om slike enzymer er kjent på området. Slike enzymer er kommersielt tilgjengelige. Disse enzymer kan anvendes alene eller anvendes som blandinger derav.

Esterhydrolyse fører til frigjøring av en alkohol og en karboksylsyre, som kan nedsette pH betydelig hvis ingen buffer er til stede. I henhold til foreliggende oppfinnelse er det funnet at å inkludere buffer i reaksjonsblandingen kan stabilisere pH under hydrolyse, og således bidra til høyere enzymaktivitet og stabilitet.

Videre er det ifølge foreliggende oppfinnelse, mulig å utføre hydrolysen ved forhøyede temperaturer, fortrinnsvis ca. 30 til 60°C og i korte tidsperioder, fortrinnsvis mindre enn ca. syv dager, mer foretrukket fra ca. to timer til tre dager.

EKSEMPLER

De spesifikke eksempler som følger illustrerer synteser av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse og skal ikke betraktes som begrensende for omfanget av kravene som følger. Metodene kan tilpasses variasjoner for å produsere forbindelser omfattet av foreliggende oppfinnelse, men ikke spesifikt beskrevet. Videre vil variasjoner av metodene for å produsere samme forbindelser på noe forskjellig måte også være opplagte for fagfolk på området.

Kjemiske forkortelser vanlig anvendt for å identifisere kjemiske forbindelser beskrevet her omfatter Bn: benzyl; Boe: tert-butyloksykarbonyl {Me3COC(0)}; BSA: bovint serum albumin; CDI: karbonyldiimidazol; DBU: 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-undec-7-en; CH2CI2=DCM: metylen klorid; TBME: fert-butylmetyleter; DEAD: dietylazodikarboksylat; DIAD: diisopropylazodikarboksylat; DIEA: diisopropyletylamin; DIPEA: diisopropyletylamin; 4-DMAP: 4-dimetylaminopyridin; DCC: 1,3-dicykloheksylkarbodiimid; DMF: dimetylformamid; DMSO: dimetylsulfoksyd; DPPA: difenylfosforylazid; Et: etyl; EtOH: etanol; EtOAc: etylacetat; Et20: dietyleter; Grubb's katalysator: bis(tricykloheksylfosfin)benzyliden-ruthenium(IV)diklorid; Grubb's 2. generasjon katalysator: tricykloheksylfosfin[1,3- bis(2,4,6-trimetylfenyl)-4,5-dihydroimidazol-2-yliden][benzyliden]ruthenium(IV)diklorid; HATU: [0-(7-azabenzotriazol-1 -yl)-N,N,N',N,-tetrametyluronium-heksaf1uorfosfat; HBTU: [0-(1 H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetrametyluronium-heksalfuorfosfat; HOBT, 1-hydroksybenzotriazol; HOAT, 1-hydroksy-7-azabenzotriazol; HPLC: høytrykk-væskekromatografi; MS: massespektrometri; Me: metyl; MeOH: metanol; NMM: N-metylmorfolin; NMP: N-metylpyrrolidin; Pr: propyl; PPA: polyfosforsyre; TBAF: tetra-n- butylammonium-fluorid; 1,2-DCE eller DCE: 1,2-dikloretan; TFA: trifluoreddiksyre; THF: tetrahydrofuran.

Løsningsprosentdeler uttrykker et vekt til volum forhold og løsningsforhold uttrykker et volum til volum forhold, hvis ikke angitt på annen måte. Kjernemagnetiske resonans- (NMR) spektra ble registrert enten på et Bruker 300, 400 eller 500 megahertz (MHz) spektrometer; kjemiske skift (8) er angitt i deler pr. million. "Flash" kromatografi ble utført på silikagel (Si02) kjent for fagfolk på området. Alle væskekromatografi- (LC) data ble registrert på en Shimadzu LC-10AS væskekromatograf ved anvendelse av en SPD-10AV UV-Vis detektor og massespektrometri- (MS) data ble bestemt med en Micromass Platform for LC i elektrospray modus (ES+).

Hvis ikke på annen måte angitt ble hver forbindelse analysert ved LC/MS, ved anvendelse av én av tre metoder, som har de følgende betingelser.

Kolonner: Metode A) - YMC Xterra ODS S7 mikrometer (>m") 3,0x50 millimeter ("mm") dvs. 3,0 mm diameter med 50 mm lengde.

Gradient: 100% løsningsmiddel A/0% løsningsmiddel B til

0% løsningsmiddel A/100% løsningsmiddel B

Gradient-tid: 4 min (A)

Holdetid: 1 min (A); 2 min

Strømningshastighet: 4 ml/min

Detektor-bølgelengde: 220 nanometer ("nm")

Løsningsmiddel A: 10% MeOH / 90% H20 / 0,1 % TFA

Løsningsmiddel B: 10% H20 / 90% MeOH / 0,1% TFA.

Kolonner: Metode B) - YMC Xterra ODS S7 3,0x50 mm Gradient: 100%

løsningsmiddel A/0% løsningsmiddel B til

0% løsningsmiddel A/100% løsningsmiddel B

Gradienttid: 2 min

Holdetid: 1 min

Strømningshastighet: 5 ml/min

Detektor-bølgelengde: 220 nm

Løsningsmiddel A: 10% MeOH / 90% H20 / 0,1 % TFA

Løsningsmiddel B: 10% H20 / 90% MeOH / 0,1% TFA.

Kolonner: Metode D) - YMC Xterra C18 5^M 3,0x50 mm Gradient:

100% løsningsmiddel A/0%løsningsmiddel B til 0%

løsningsmiddel A/100% løsningsmiddel B

Gradienttid: 3 min

Holdetid: 1 min

Strømningshastighet: 5 ml/min

Detektor-bølgelengde: 220 nm

Løsningsmiddel A: 10% MeOH / 90% H20 / 0,1 % TFA

Løsningsmiddel B: 10% H20 / 90% MeOH / 0,1% TFA.

Hvis ikke på annen måte angitt ble preparativ HPLC utført under de følgende betingelser.

Gradienttid: 10 min

Holdetid: 2 min

Strømningshastighet: 25 ml/min

Detektor-bølgelengde: 220 nM

Løsningsmiddel A: 10% MeOH / 90% H20 / 0,1 % TFA

Løsningsmiddel B: 10% H20 / 90% MeOH / 0,1 % TFA

De rene fraksjoner ble samlet og 0,1 N NaOH ble anvendt for å bringe pH opptil 7. Løsningen ble konsentrert i vakuum og deretter ble pH forsiktig senket til pH 3-4 ved anvendelse av 0,1 N HCI. Blandingen ble raskt ekstrahert med etylacetat (3x). De samlede ekstrakter ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga de rensede produkter.

Forbindelser og kjemiske mellomprodukter ifølge foreliggende oppfinnelse, beskrevet i de følgende eksempler, ble fremstilt i henhold til de følgende metoder.

Eksempel 1 Fremstilling av Representative Mellomprodukter

Fremstilling av P2 isokinolin-mellomprodukter for innføring i forbindelser med formel 1

Metode A

Trinn V.

Til en løsning av 3-metoksy-kanelsyre (11,04 g, 62 mmol) og trietylamin (12,52 g, 124 mmol) i aceton (80 ml) ble satt etylklorformiat (omtrent 1,5 ekvivalenter) dråpevis ved 0°C. Etter omrøring ved denne temperatur i 1 time ble vandig NaN3(6,40 g, 100 mmol i 35 ml H20; passende forholdsregler må tas ved anvendelse av natriumazid) tilsatt dråpevis og reaksjonsblandingen ble omrørt i 16 timer ved omgivelsestemperatur. Vann (100 ml) ble satt til blandingen og flyktig materiale ble fjernet i vakuum. Den resulterende oppslemningen ble ekstrahert med toluen (3X50 ml) og de samlede organiske lag ble tørket over MgSCv Den tørkede løsningen ble satt dråpevis til en oppvarmet løsning av difenylmetan (50 ml) og tributylamin (30 ml) ved 190°C. Toluenet ble avdestillert ettersom tilsatt. Etter fullstendig tilsetning ble reaksjonstemperaturen hevet til 210°C i 2 timer. Etter avkjøling ble det utfelte produktet oppsamlet ved filtrering, vasket med heksan (2X50 ml) og tørket, hvilket ga det ønskede produkt som et hvitt, fast stoff (5,53 g, 51%) (Nicolas Briet at el, Tetrahedron, 2002, 5761-5766).

LC-MS (retensjonstid: 0,82 min, metode B), MS m/ z 176 (M<+>+H).

En altenativ fremgangsmåte til den ovenfor anvender difenylfosforyl-azid for omdannelse av karboksylsyren til det tilsvarende acylazid. I en ett-kar prosedyre blir deretter syren omdannet til det tilsvarende kinolon. Fremgangsmåten er beskrevet nedenfor for fremstilling av 4-metyl-2/-/- isokinolin-1-on fra 3-fenyl-but-2-ensyre: En løsning av 3-fenyl-but-2-ensyre (16,2 g), difenylfosforylazid (27,5 g) og trietylamin (10,1 g) i benzen (100 ml) ble omrørt i 1 time. Etter filtrering gjennom et silikagelsjikt, vasking med benzen og konsentrasjon, ble residuet oppløst i difenylmetan (80 ml) og tilbakeløpskokt i 3 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble faste stoffer oppsamlet gjennom et sjikt med vasking med benzen og tørket, hvilket ga 10 g (63%) av det ønskede 4-metyl-2/-/-isokinolin-1-on som et fast stoff.<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 2,30 (s, 3 H), 7,00 (s, 1 H), 7,54 (m, 1 H), 7,77 (m, 2 H), 8,33 (d, J=7,34 Hz, 1 H).

Trinn 2:

6-metoksy-2H-isokinolin-1-on ( 5,0 g, 28,4 mmol) i POCI3(10 ml) ble

oppvarmet til svakt tilbakeløp i 3 timer og deretter inndampet i vakuum (Nicolas Briet at el, Tetrahedron, 2002, 5761-5766). Residuet ble hellet i isvann (20 ml) og nøytralisert til pH 10 med 10 M NaOH. Ekstrahert med CHCI3. Det organiske laget ble vasket med saltvann, tørket over MgS04, filtrert, inndampet. Residuet ble renset ved "flash" kromatografi (1:1 heksan-etOAc), hvilket ga 4,41 g (80%) av det ønskede produkt som et hvitt, fast stoff.

<1>H NMR (CD3OD) 5 3,98 (s, 3H), 7,34-7,38 (m, 2 H), 7,69 (d, J=5,5 Hz, 1H), 8,10 (d, J=6,0 Hz, 1H), 8,23 (d, J=9,5 Hz, 1H);

LC-MS (retensjonstid: 1,42 min, metode B), MS m/z 194 (M<+>+H).

Trinn 3:

Til en løsning av N-BOC-3-(f?)-hydroksy-L-prolin (892 mg, 3,89 mmol) i DMSO (40 ml) ved omgivelsestemperatur ble satt kalium-tert-butoksyd (1,34 g, 12,0 mmol) i én porsjon. Den dannede suspensjon ble omrørt ved denne temperatur i 30 min før den ble avkjølt til 10°C. 1-klor-6-metoksy-isokinolin (eksempel 11, Trinn 2) (785 mg, 4,05 mmol) ble tilsatt som fast stoff i én porsjon og den endelige blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 12 timer. Behandlet med iset 5% sitronsyre (vandig), ekstrahert med EtOAC (100 ml). Den vandige fasen ble ekstrahert med EtOAC igjen. De samlede organiske lag ble vasket med henholdsvis 5% sitronsyre (vandig) og saltvann, tørket over MgS04, filtrert. Filtratet ble inndampet i vakuum til tørrhet, hvilket ga 1,49 g (99%) av det ønskede produkt som et gråhvitt skum. Dette materialet ble anvendt i neste reaksjonstrinn som rått, uten ytterligere rensning.

<1>H NMR (CD3OD) 5 1,42, 1,44 (rotamerer, 9H), 2,38-2,43 (m, 1H), 2,66-2,72 (m, 1H), 3,80-3,87 (m, 2H), 3,92 (s, 3H), 4,44-4,52 (m, 1H), 5,73 (b, 1H), 7,16-7,18 (m, 2H), 7,24-7,25 (m, 1H), 7,87-7,88 (m, 1H), 8,07 (d, J=8,5 Hz, 1H); LC-MS (retensjonstid: 1,62 min, metode B), MS m/z 389 (M<+>+H).

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn 1:

Modifikasjoner: 15 g 3-metoksy-3-fenyl-akrylsyre anvendt, 250 mg produkt oppnådd (2% utbytte).

Produkt:

<1>H NMR (400 MHz, CD3COCD3) 5 ppm 3,85 (s, 3 H), 6,96 (s, 1 H), 7,54 (m, 1 H), 7,71 (m, 1 H), 7,86 (d, J=8,07 Hz, 1 H), 8,31 (d, J=8,07 Hz, 1 H).

Trinn 2:

Modifikasjoner: 200 mg 4-metoksy-2/-/-isokinolin-1-on anvendt, 150 mg produkt oppnådd (68% utbytte).

Produkt:

<1>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 ppm 4,05 (s, 2 H), 7,71 (m, 1 H), 7,72 (m, 2 H), 7,80 (s, 1 H), 8,23 (dd, J=18,71, 7,70 Hz, 2 H).

Trinn 3:

Modifikasjoner: 122 mg 1-klor-4-metoksy-isokinolin anvendt, 218 mg produkt oppnådd (89% utbytte).

Produkt:

MS: (M+Na)+411.

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

1

Trinn 1:

Modifikasjoner: 20 g 2-metylkanelsyre anvendt, 14,3 g produkt oppnådd (72% utbytte)

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 2,54 (s, 1 H), 6,69 (d, J=7,3 Hz, 1 H), 7,23 (d, J=7,3 Hz, 1 H), 7,39 (t, J=7,8 Hz, 1 H), 7,50 (d, J=7,1 Hz, 1 H), 8,30 (d, J=8,1 Hz, 1 H), 11,62(s, 1 H); MS: (M+H)<+>160.

Trinn 2:

Modifikasjoner: 14,4 g 5-metyl-2/-/-isokinolin-1-on anvendt, 10,6 g produkt oppnådd (66% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 ppm 2,67 (s, 3 H), 7,55 (m, 2 H), 7,70 (dd, J=5,9, 1,0 Hz, 1 H), 8,19 (m, 1 H), 8,28 (d, J=5,9 Hz, 1 H); MS: (M+H)<+>178.

Trinn 3:

Modifikasjoner: 533 mg 1-klor-5-metyl-isokinolin anvendt, 1116 mg produkt oppnådd (100% utbytte).

Produkt:

Data: MS: (M+H)<+>373.

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn 1:

Modifikasjoner: 10 g 2-metoksy-kanelsyre anvendt, 5,3 g produkt oppnådd (53% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 3,95 (s, 3 H), 6,94 (d, J=7,3 Hz, 1 H), 7,08 (d, J=8,1 Hz, 1 H), 7,14 (d, J=7,3 Hz, 1 H), 7,43 (t, J=8,1 Hz, 1 H), 7,99 (d, J=8,1 Hz, 1 H), 10,92 (s, 1 H); MS: (M+H)<+>176.

Trinn 2:

Modifikasjoner: 5,3 g 5-metoksy-2/-/-isokinolin-1-on anvendt, 5,38 g produkt oppnådd (92% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 ppm 4,01 (s, 3 H), 7,04 (d, J=7,8 Hz, 1 H), 7,57 (t, J=8,1 Hz, 1 H), 7,88 (d, J=8,6 Hz, 1 H), 7,97 (d, J=5,9 Hz, 1 H), 8,25 (d, J=5,9 Hz, 1 H); MS: (M+H)<+>194.

Trinn 3:

Modifikasjoner: 581 mg 1-klor-5-metoksy-isokinolin anvendt, 1163 mg produkt oppnådd (100% utbytte).

Produkt:

Data: MS: (M+H)<+>389.

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn 1:

Modifikasjoner: 25 g 2-klorkanelsyre anvendt, 14,6 g produkt oppnådd (59% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CD3OD ) 5 ppm 7,22 (d, J=7,3 Hz, 1 H), 7,42 (t, J=7,8 Hz, 1 H), 7,73 (d, J=7,8 Hz, 1 H), 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H), 10,61 (s, 1 H); MS: (M+H)<+>180.

Trinn 2:

Modifikasjoner: 14,2 g 5-klor-2/-/-isokinolin-1-on anvendt, 8,28 g produkt oppnådd (53% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 ppm 7,60 (dd, J=8. 6, 7,6 Hz, 1 H), 7,83 (m, 1 H), 8,00 (d, J=5,9 Hz, 1 H), 8,29 (dt, J=8,9, 1,0 Hz, 1 H), 8,38 (d, J=5,9 Hz, 1 H); MS: (M+H)+198.

Trinn 3:

Modifikasjoner: 594 mg 1,5-diklor-isokinolin anvendt, 1174 mg produkt oppnådd (100% utbytte).

Produkt:

Data: MS: (M+H)<+>393.

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn 1:

Modifikasjoner: 16,6 g 2-fluorkanelsyre anvendt, 8,55 g produkt oppnådd (51% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CD3COCD3) 5 ppm 6,62 (d, J=7,3 Hz, 1 H), 7,32 (d, J=7,3Hz, 1 H), 7,47 (m, 2 H), 8,09 (m, 1 H).

Trinn 2:

Modifikasjoner: 8,4 g 5-fluor-2/-/-isokinolin-1-on anvendt, 7,5 g produkt oppnådd (80% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 ppm 7,43 (ddd, J=9,7, 7,8, 0,9 Hz, 1 H), 7,62 (td, J=8,2, 5,4 Hz, 1 H), 7,84 (d, J=5,6 Hz, 1 H), 8,14 (d, J=8,6 Hz, 1 H), 8,33 (d, J=5,9 Hz, 1 H); MS: (M+H)<+>182.

Trinn 3:

Modifikasjoner: 203 mg 1-klor-5-fluor-isokinolin anvendt, 384 mg produkt oppnådd (90% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CD3SOCD3) 5 ppm 1,34, 1,36 (2s, 9 H, rotamers), 2,35 (m, 1 H), 2,61 (m, 1 H), 3,65 (d, J=12,23 Hz, 1 H), 3,80 (m, 1 H), 4,35 (m, 1 H), 5,70 (s, 1 H), 7,48 (d, J=6,11 Hz, 1 H), 7,63 (m, 2 H), 7,99 (m, 1 H), 8,10 (d, J=5,87 Hz, 1 H); MS: (M+Na)<+>399.

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn V.

Modifikasjoner: 16,6 g 4-fluorkanelsyre anvendt, 8,2 g produkt oppnådd (49% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CD3COCD3) 5 ppm 6,57 (d, J=7,09 Hz, 1 H), 7,21 (d, J=7,09 Hz, 1 H), 7,50 (m, 1 H), 7,72 (dd, J=8,68, 5,26 Hz, 1 H), 7,90 (dd, J=9,54, 2,93 Hz, 1 H).

Trinn 2:

Modifikasjoner: 8,15 g 7-fluor-2/-/-isokinolin-1-one anvendt, 7,6 g produkt oppnådd (84% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 ppm 7,52 (td, J=8,6, 2,6 Hz, 1 H), 7,59 (d, J=5,6 Hz, 1 H), 7,86 (dd, J=9,1, 5,4 Hz, 1 H), 7,95 (dd, J=9,5, 2,5 Hz, 1 H), 8,26 (d, J=5,6 Hz, 1 H); MS: (M+H)<+>182.

Trinn 3:

Modifikasjoner: 191 mg 1-klor-7-fluor-isokinolin anvendt, 350 mg produkt oppnådd (93% utbytte).

Produkt:

Data: MS: (M+Na)<+>399.

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn 1:

Modifikasjoner: 9,13 g 4-klorkanelsyre anvendt, 4 g produkt oppnådd (44% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CD3SOCD3) 5 ppm 6,58 (d, J=7,1 Hz, 1 H), 7,20 (dd, J=7,1, 5,9 Hz, 1 H), 7,72 (m, 2 H), 8,10 (m, 1 H).

Trinn 2:

Modifikasjoner: 3,5 g 7-klor-2/-/-isokinolin-1-on anvendt, 2,8 g produkt oppnådd (72% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (500 MHz, CDCI3) 5 ppm 7,59 (d, J=5,5 Hz, 1 H), 7,69 (dd, J=8,9, 2,1 Hz, 1 H), 7,80 (d, J=8,6 Hz, 1 H), 8,29 (d, J=5,5 Hz, 1 H), 8,34 (s, 1 H); MS: (M+H)<+>198.

Trinn 3:

Modifikasjoner: 208 mg 1,7-diklor-isokinolin anvendt, 350 mg produkt oppnådd (89% utbytte).

Produkt:

Data: MS: (M+Na)+415.

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn V.

Modifikasjoner: 25 g 4-metylkanelsyre anvendt, 15,3 g produkt oppnådd (62% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 2,50 (s, 3 H), 6,54 (d, J=7,1 Hz, 1 H), 7,13 (d, J=7,1 Hz, 1 H), 7,49 (m, 2 H), 8,22 (s, 1 H), 11,49 (s, 1 H); MS: (M+H)<+>160.

Trinn 2:

Modifikasjoner: 15,3 g 7-metyl-2/-/-isokinolin-1-on anvendt, 5,15 g produkt oppnådd (30% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 ppm 2,58 (s, 3 H), 7,56 (m, 2 H), 7,73 (d, J=8,3 Hz, 1 H), 8,09 (s, 1 H), 8,20 (d, J=5,6 Hz, 1 H); MS: (M+H)<+>178.

Trinn 3:

Modifikasjoner: 205 mg 1-klor-7-metyl-isokinolin anvendt, 350 mg produkt oppnådd (89 % utbytte).

Produkt:

Data: MS: (M+H)<+>373.

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn V.

Modifikasjoner: 33 g 4-metoksykanelsyre anvendt, 7 g produkt oppnådd (33% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (500 MHz, CD3COCD3) 5 ppm 3,90 (s, 3 H), 6,49 (d, J=7,0 Hz, 1 H), 7,10 (d, J=7,3 Hz, 1 H), 7,28 (dd, J=8,6, 2,8 Hz, 1 H), 7,57 (d, J=8,9 Hz, 1 H), 7,71 (d, J=2,8 Hz, 1 H).

Trinn 2:

Modifikasjoner: 4 g 7-metoksy-2/-/-isokinolin-1-on anvendt, 3g produkt oppnådd (68 % utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 ppm 3,98 (s, 3 H), 7,38 (dd, J=8,9, 2,6 Hz, 1 H), 7,52 (m, 2 H), 7,73 (d, J=8,8 Hz, 1 H), 8,16 (d, J=5,4 Hz, 1 H).

Trinn 3:

Modifikasjoner: 533 mg 1-klor-7-metoksy-isokinolin anvendt, 1115 mg produkt oppnådd (100 % utbytte).

Produkt:

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn 1:

Modifikasjoner: 19,6 g 4-fluor-3-metoksykanelsyre anvendt, 9,5 g produkt oppnådd (48% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CD3COCD3) 5 ppm 4,00 (s, 1 H), 6,49 (d, J=7,34 Hz,

1 H), 7,19 (d, J=7,09 Hz, 1 H), 7,29 (d, J=8,07 Hz, 1 H), 7,86 (d, J=11,74 Hz, 1

H).

Trinn 2:

Modifikasjoner: 9 g 7-fluor-6-metoksy-2/-/-isokinolin-1-on anvendt, 7 g produkt oppnådd (70% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 ppm 4,04 (s, 3 H), 7,17 (d, J=8,07 Hz, 1 H), 7,48 (d, J=5,62 Hz, 1 H), 7,94 (d, J=11,49 Hz, 1 H), 8,20 (d, J=5,62 Hz, 1 H).

Trinn 3:

Modifikasjoner: 222 mg 1-klor-7-fluor-6-metoksy-isokinolin anvendt, 406 mg produkter oppnådd.

Produkter:

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn 1:

Modifikasjoner: 3,8 g 3-(2,3-dihydro-benzofuran-7-yl)-akrylsyre anvendt, 2 g produkt oppnådd (53% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 3,37 (t, J=9,05 Hz, 1 H), 4,73 (t, J=9,05 Hz, 2 H), 6,67 (d, J=7,09 Hz, 1 H), 7,10 (d, J=7,09 Hz, 1 H), 7,37 (d, J=8,07 Hz, 1 H), 7,81 (d, J=8,07 Hz, 1 H); MS: (M+H)<+>188.

Trinn 2:

Modifikasjoner: 1,87 g 2,3-dihydro-7H-furo[2,3-f]isokinolin-6-one anvendt, 1,84 g produkt oppnådd ( 90% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 Hz, CDCI3) 5 ppm 3,43 (t, J=9,05 Hz, 2 H), 4,82 (t, J=9,05 Hz, 2 H), 7,52 (d, J=8,56 Hz, 1 H), 7,66 (d, J=5,62 Hz, 1 H), 7,84 (d, J=8,31 Hz, 1 H), 8,19 (d, J=5,62 Hz, 1 H); MS (M+H)<+>206.

Trinn 3:

Modifikasjoner: 206 mg 6-klor-2,3-dihydro-furo[2,3-f]isokinolin anvendt, 300 mg produktblanding oppnådd.

Produkter:

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn V.

Modifikasjoner: 1,14 g 3-(2,3-dihydro-benzofuran-4-yl)-akrylsyre anvendt, 600 mg produkt oppnådd (52% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 ppm 3,35 (t, J=8,93 Hz, 2 H), 4,74 (t, J=8,93 Hz, 2 H), 6,49 (d, J=7,09 Hz, 1 H), 6,95 (d, J=8,56 Hz, 1 H), 7,25 (d, J=7,09 Hz, 1 H), 8,13 (d, J=8,80 Hz, 1 H); MS (M+H)<+>188.

Trinn 2:

Modifikasjoner: 560 mg 1,7-dihydro-2/-/-furo[3,2-f]isokinolin-6-on anvendt, 380 mg produkt oppnådd (48% utbytte).

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 Hz, CDCI3) 5 ppm 3,47 (t, J=9,05 Hz, 2 H), 4,84 (t, J=9,05 Hz, 2 H), 7,24 (d, J=8,56 Hz, 1 H), 7,33 (d, J=5,87 Hz, 1 H), 8,20 (m, 2 H); MS (M+H)<+>206.

Trinn 3:

Modifikasjoner: 105 mg 6-klor-1,2-dihydro-furo[3,2-f]isokinolin anvendt, 390 mg produktblanding oppnådd.

Produkter:

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Trinn 1:

Modifikasjoner: En blanding av 6-metoksy-2/-/-isokinolin-1-on (700 mg) og NCS (532 mg) i MeCN (10 ml) ble tilbakeløpskokt i 3 timer. Filtrering ga 600 mg (72%) av det ønskede produkt som et fast stoff.

Produkt:

Data:<1>H NMR(400 MHz, CD3OD) 5 ppm 3,96 (s, 1 H), 7,19 (dd, J=8,80, 2,45 Hz, 1 H), 7,28 (d, J=2,45 Hz, 1 H), 7,34 (s, 1 H), 8,25 (d, J=9,05 Hz, 1 H); MS: (M+H)<+>210.

Trinn 2:

Modifikasjoner: 500 mg 4-klor-6-metoksy-2H-isokinolin-1-on anvendt, 400 mg produkt oppnådd.

Produkt:

Data:<1>H NMR (400 Hz, CDCI3) 5 ppm 4,01 (s, 3 H), 7,35 (d, J=2,45 Hz, 1 H), 7,41 (d, J=2,45 Hz, 1 H), 8,24 (d, J=9,29 Hz, 1 H), 8,27 (s, 1 H); MS: (M+H)<+>229.

Metode B

Trinn 1:

En blanding av 4-metoksy-2-metyl-benzosyre (5,00 g, 30,1 mmol) og tionylklorid (20,0 g, 0,17 mol) ble oppvarmet til tilbakeløp i 30 min. Flyktig materiale fjernet i vakuum. Etter pumping natten over ble det viskøse oljeaktige syreklorid anvendt rått for neste reaksjon uten noen rensning.

Til en løsning av 4-metoksy-2-metyl-benzoylklorid i CH2CI2(60 ml) ved 0°C ble satt dietylamin dråpevis. Den dannede blanding fikk oppvarmes til omgivelsestemperatur i 2 timer med omrøring. De flyktige stoffene fjernet i vakuum. Residuet ble utgnidd med EtOAc (100 ml) og filtrert. Filtratet ble vasket med 1M HCI, 1M NaOH og saltvann, tørket over MgSCv Avdampning av løsningsmidlet ga 6,51 g (98%) av det ønskede produkt som en viskøs olje. LC-MS (retensjonstid: 1,20 min, metode B), MS m/ z 222 (M<+>+H).

Trinn 2:

Til en løsning av N,N-dietyl-4-metoksy-2-metyl-benzamid (221 mg, 1,0 mmol) i THF (2 ml) ved -78°C ble satt n-BuLi (0,84 ml 2,5 M i heksan, 2,10 mmol) dråpevis. Den dannede oransje løsning ble holdt ved denne temperatur i ytterligere 30 min før dråpevis tilsetning av benzonitril (103 mg, 1,0 mmol). Den endelige løsning fikk oppvarmes til omgivelsestemperatur natten over med omrøring. Behandlet med iset 5% sitronsyre. Filtrert, vasket med vann, tørket. Utgnidning med 2:1 heksan-etOAc (5 ml) ga 205 mg (82%) av det ønskede produkt som et hvitt, fast stoff.

<1>H NMR (de-DMSO) 5 3,89 (s, 3H), 6,84 (s, 1H), 7,05-7,07 (m, 1H), 7,18 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,44-7,51 (m, 3H), 7,78 (d, J=7,0 Hz, 1H), 8,11 (d, J=9,0 Hz, 1H);

LC-MS (retensjonstid: 1,20 min, metode B), MS m/ z 252 (M<+>+H).

Trinn 3:

Dette produktet, 1-klor-6-metoksy-3-fenyl-isokinolin, ble fremstilt ved samme metode som beskrevet ovenfor bortsett fra anvendelse av 6-metoksy-3-fenyl-2H-isokinolin-1-on istedet.

<1>H NMR (CDCI3) 5 3,97 (s, 3H), 7,12 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,23-7,26 (m, 1H), 7,40-7,42 (m, 1H ), 7,46-7,50 (m, 2H), 7,89 (s, 1H), 8,08 (d, J=7,0 Hz, 2H), 8,21 (d,

J=9,0 Hz, 1H); LC-MS (retensjonstid: 1,90 min, metode B), MS m/ z 270, 271

(M<+>+H).

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Til en løsning av N,N-dietyl-4-metoksy-2-metyl-benzamid (332 mg, 1,5 mmol) i THF (15 ml) ved -78°C ble satt t-BuLi (1,7 M løsning i pentan, 1,3 ml, 2,25 mmol). Den resulterende røde løsning ble omrørt ved -78°C i 10 min, deretter ble 2-cyanopyridin (156 mg, 1,5 mmol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble deretter oppvarmet til romtemperatur og omrørt natten over. Reaksjonen ble stanset med mettet NH4CI-løsning og blandingen ble ekstrahert med etylacetat to ganger. De samlede organiske lag ble tørket (MgSCu) og konsentrert. Råproduktet ble renset ved prep. HPLC, hvilket ga et gulaktig fast stoff som TFA-salt. (85 mg, 15% utbytte)

<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 3,91 (m, 3 H), 7,09 (dd, J=9,05, 2,45 Hz, 1 H), 7,17 (d, J=2,45 Hz, 1 H), 7,37 (s, 1 H), 7,42 (m, 1 H), 7,92 (m, 1 H), 8,08 (d, J=8,07 Hz, 1 H), 8,18 (d, J=9,05 Hz, 1 H), 8,65 (d, J=4,89 Hz, 1 H).

LC-MS (retensjonstid: 2,14 min.), MS m/z 253 (MH<+>).

Trinn 2 (Skjema 3, Trinn 1):

6-metoksy-3-pyridin-2-yl-2H-isokinolin-1-on-TFA-salt (85 mg, 0,232 mmol) ble oppvarmet under tilbakeløp med POCI3(3,0 ml) i 2 dager. Deretter ble POCI3avdestillert og residuet ble behandlet med is. Det ble deretter nøytralisert med 10 N NaOH-løsning og det brune faste stoffet ble oppsamlet som rent produkt.

(62 mg, 99% utbytte)

LC-MS (retensjonstid: 2,063 min.), MS m/z 271 (MH<+>).

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Til en løsning av N,N-dietyl-4-metoksy-2-metyl-benzamid (332 mg, 1,5 mmol) i THF (15 ml) ved -78°C, ble satt t-BuLi (1,7 M løsning i pentan, 1,3 ml, 2,25 mmol). Den resulterende røde løsning ble omrørt ved -78°C i 10 min, deretter ble 4-cyanopyridin (164 mg, 1,575 mmol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble deretter oppvarmet til romtemperatur og omrørt natten over. Reaksjonen ble stanset med mettet NH4CI-løsning og det gule presipitat ble oppsamlet som rent produkt. (145 mg, 38% utbytte)

<1>H NMR(CD3OD, 400 MHz) 5 3,91 (s, 3 H), 7,18 (dd, J=8,8 Hz, 2,8 Hz, 1 H), 7,26 (m, 2 H), 8,06 (d, J=6,0 Hz, 2H), 8,16 (d, J=8,8 Hz, 1H), 8,84 (d, J=6,0 Hz, 2H).

LC-MS (retensjonstid: 1,300 min.), MS m/z 253 (MH<+>).

Trinn 2 (Skjema 3, trinn 1):

6-metoksy-3-pyridin-4-yl-2H-isokinolin-1-on (134 mg, 0,531 mmol) ble oppvarmet under tilbakeløp med POCI3(6,0 ml) i 5 dager. Deretter ble POCI3avdestillert og residuet ble behandlet med is. Det ble deretter nøytralisert med

mettet NaHCCvløsning og det brune faste stoff ble oppsamlet som rent produkt. (125 mg, 87% utbytte)

<1>H NMR(DMSO-d<6>, 400 MHz) 5 3,99 (s, 3 H), 7,53 (dd, J=9,04 Hz, 2,44 Hz, 1 H), 7,59 (d, J=2,69 Hz, 1 H), 8,26 (d, J=9,05 Hz, 1 H), 8,30 (d, J=5,38 Hz, 2 H), 8,73 (s, 1 H), 8,85 (d, J=6,36 Hz, 2 H).

LC-MS (retensjonstid: 2,027 min.), MS m/z 271 (MH<+>).

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Til en løsning av N,N-dietyl-4-metoksy-2-metyl-benzamid (332 mg, 1,5 mmol) i THF (15 ml) ved -78°C, ble satt t-BuLi (1,7 M løsning i pentan, 1,3 ml, 2,25 mmol). Den resulterende røde løsning ble omrørt ved -78°C i 10 min, deretter ble 4-dimetylamino-benzonitril (219 mg, 1,5 mmol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble deretter oppvarmet til romtemperatur og omrørt natten over. Reaksjonen ble stanset med mettet NH4CI-løsning og det gule presipitat ble oppsamlet og utgnidd med eter, hvilket ga et gråhvitt, fast stoff som rent produkt. (247 mg, 56% utbytte)

<1>H NMR(DMSO-d<6>, 400 MHz) 5 2,97 (s, 6 H), 3,87 (s, 3 H), 6,72 (s, 1 H), 6,78 (d, J=8,80 Hz, 2 H), 6,97 (dd, J=8,80, 2,45 Hz, 1 H), 7,10 (d, J=2,45 Hz, 1 H), 7,65 (d, J=8,80 Hz, 2 H), 8,05 (d, J=8,80 Hz, 1 H), 11,11 (s, 1 H).

LC-MS (retensjonstid: 2,023 min.), MS m/z 295 (MH<+>).

3-(4-dimetylamino-fenyl)-6-metoksy-2H-isokinolin-1-on (245 mg, 0,83 mmol) ble oppvarmet under tilbakeløp med POCI3(10,0 ml) i 2 dager. Deretter ble POCI3avdestillert og residuet ble behandlet med is. Det ble deretter nøytralisert med 10 N NaOH-løsning og ekstrahert med etylacetat to ganger. De organiske lag ble samlet og tørket (MgS04). Inndampning av løsningsmiddel ga et oransje fast stoff som produkt (215 mg, 83% utbytte)

<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 3,01 (s, 6 H), 3,96 (s, 3 H), 6,88 (d, J=9,05 Hz, 2 H), 7,20 (dd, J=9,17, 2,57 Hz, 1 H), 7,28 (d, J=2,45 Hz, 1 H), 7,94 (s, 1 H), 7,96 (d, J=9,05 Hz, 2 H), 8,13 (d, J=9,29 Hz, 1 H).

LC-MS (retensjonstid: 2,543 min.), MS m/z 313 (MH<+>).

En blanding av [4-(1-klor-6-metoksy-isokinolin-3-yl)-fenyl]-dimetyl-amin (110 mg, 0,35 mmol) og tetrabutyl-fosfonium-hydrogen-difluorid (0,5 g) ble oppvarmet ved 140°C i Smith mikrobølge-reaktor i 20 min. Deretter ble det tilsatt vann og ekstrahert med etylacetat. Det organiske laget ble separert, vasket med vann og tørket (MgS04). Inndampning av løsningsmiddel ga et brunaktig fast stoff som produkt. (85 mg, 82% utbytte)

LC-MS (retensjonstid: 2,320 min.), MS m/z 297 (MH<+>).

Metode C

Trinn V.

Til en løsning av N-BOC-3-(f?)-hydroksy-L-prolin (6,22 g, 26,9 mmol) i DMF (250 ml) ved 0°C ble satt NaH (60%, 3,23 g, 80,8 mmol) i mange porsjoner. Den dannede suspensjon ble omrørt ved denne temperatur i 30 min. 1,3-diklor-isokinolin (5,33 g, 26,9 mmol) ble tilsatt som fast stoff i én porsjon og den endelige blanding ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 12 timer. Behandlet med iset 5% sitronsyre (vandig), ekstrahert med EtOAC (300 ml). Den vandige fasen ble ekstrahert med EtOAC igjen. De samlede organiske lag ble vasket med henholdsvis 5% sitronsyre (vandig) og saltvann, tørket over MgS04, filtrert. Filtratet ble inndampet i vakuum til tørrhet, hvilket ga 10,53 g (99,8%) av 4-(6-metoksy-isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidine-1,2-dikarboksylsyre-1-tert-butylester som et gråhvitt skum. Dette materialet ble anvendt i neste reaksjonstrinn som rått uten ytterligere rensning.

<1>H NMR (CD3OD) 5 1,43, 1,44 (rotamerer, 9H), 2,39-2,44 (m, 1H), 2,68-2,72 (m, 1H), 3,80-3,90 (m, 2H), 4,44-4,52 (m, 1H), 5,77 (b, 1H), 7,39 (s, 1H), 7,58 (t, J=7,3 Hz, 1H), 7,71-7,78 (m, 2H), 8,16 (d, J=7,5 Hz, 1H);

LC-MS (retensjonstid: 1,80 min, metode B), MS m/ z 392 (M<+>+H).

Trinn 2:

En blanding av 4-(6-metoksy-isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-1,2-dikarboksylsyre-1-tert-butylester (39 mg, 0,10 mmol), fenylboronsyre (14,6 mg, 0,12 mmol), natrium-tert-butoksyd (38 mg, 0,40 mmol) og ((t-Bu)2POH)2PdCI2(POPd) (5 mg, 0,01 mmol) i THF (2 ml) ble oppvarmet til tilbakeløp i 4 timer. Etter avkjøling ble den dannede blanding behandlet med 5% sitronsyre (vandig) og ekstrahert med EtOAc (20 ml). Det organiske laget ble vasket med saltvann, tørket over MgSCv, filtrert, inndampet. Residuet ble renset ved prep-HPLC, hvilket ga 36 mg (83%) av det ønskede produkt som et gråhvitt skum.

<1>H NMR (CD3OD) 5 1,43, 1,45 (rotamerer, 9H), 2,51-2,56 (m, 1H), 2,74-2,82 (m, 1H), 3,88-3,92 (m, 1H), 3,98-4,01 (m, 1H), 4,50-4,57 (m, 1H), 5,95 (b, 1H), 7,36-7,39 (m, 1H), 7,45-7,48 (m, 2H), 7,55 (t, J=7,3 Hz, 1H), 7,70 (t, J=7,5 Hz, 1H), 7,84-7,89 (m, 2H), 8,14-8,17 (m, 3H), 9,05 (b, 1H);

LC-MS (retensjonstid: 1,97 min, metode B), MS m/ z 435 (M<+>+H).

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Fremstilt ved anvendelse av 4-metoksyfenylboronsyre

<1>H NMR (CD3OD) 5 1,40, 1,45 (rotamerer, 9H), 2,50-2,55 (m, 1H), 2,73-2,81 (m, 1H), 3,81-3,89 (m, 4H), 3,98-4,01 (m, 1H), 4,50-4,57 (m, 1H), 5,93 (b, 1H), 7,02 (d, J=9,0 Hz, 2H), 7,50 (t, J=7,3 Hz, 1H), 7,67 (t, J=7,5 Hz, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,83 (d, J=8,5 Hz, 1H), 8,09 (d, J=8,5 Hz, 2H), 8,15 (d, J=8,0 Hz, 1H); LC-MS (retensjonstid: 2,00 min, metode B), MS m/ z 465 (M<+>+H).

Det følgende mellomprodukt ble fremstilt som beskrevet ovenfor:

Fremstilt ved anvendelse av 4-pyridylboronsyre

<1>H NMR (CD3OD) 5 1,43, 1,46 (rotamerer, 9H), 2,53-2,56 (m, 1H), 2,80-2,89 (m, 1H), 3,90-3,93 (m, 1H), 4,00-4,05 (m, 1H), 4,50-4,57 (m, 1H), 6,00, 6,05 (rotamerer, 1H), 7,80 (t, J=7,3 Hz, 1H), 7,87 (t, J=7,5 Hz, 1H), 8,08 (d, J=8,5 Hz, 1H), 8,32 (d, J=8,0 Hz, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,84 (d, J=6,0 Hz, 2H), 8,84 (d, J=6,5 Hz, 2H);

LC-MS (retensjonstid: 1,39 min, metode B), MS m/z 436 (M<+>+H).

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Fremstilt ved anvendelse av 4-N,N-dimetylamino-fenylboronsyre LC-MS (retensjonstid: 1,64 min, metode B), MS m/z 478 (M<+>+H).

Metode D

Trinn 1:

Til en løsning av N,N-dietyl-4-metoksy-2-metyl-benzamid (633 mg, 2,9 mmol) i THF (15 ml) ved -78°C ble satt n-BuLi (2,3 ml 2,5 M i heksan, 5,74 mmol) dråpevis. Den dannede røde løsning ble holdt ved denne temperatur i ytterligere 30 min før den ble kanylert til en løsning av tiazol-2-karboksylsyre-etylester (A. Medici et al, Tetrahedron Lett. 1983, s. 2901) (450 mg, 2,9 mmol) i THF (5 ml) ved -78°C. Den endelige mørkegrønne løsning ble holdt ved denne temperatur i 2 timer med omrøring. Behandlet med mettet NH4CI (vandig) og ekstrahert med EtOAc (50 ml). Det organiske laget ble vasket med mettet NH4CI (vandig) og saltvann, tørket, renset ved "flash" kolon ne kromatografi, under eluering med 2:1 EtOAc:heksan for å gi 405 mg (45%) av det ønskede produkt som en gråhvit viskøs olje.

<1>H NMR (CDCI3) 5 1,08 (t, J=7,0 Hz, 6H), 3,22 (b, 2H), 3,44 (b, 2H), 3,79 (s, 3H), 4,59 (s, 2H), 6,79-6,81 (m, 1H), 6,86 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,16 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,66 (d, J=3,0 Hz, 1H), 8,00 (d, J=3,0 Hz, 1H);

LC-MS (retensjonstid: 1,30 min, metode B), MS m/ z 333 (M<+>+H).

Trinn 2:

En blanding av N,N-dietyl-4-metoksy-2-(2-okso-2-tiazol-2-yl-etyl)-benzamid (405 mg, 1,22 mmol) og NH4OAc (3,0 g, 38,9 mmol) ble oppvarmet til 140°C i et lukket rør i 1 time. Den smeltede løsning ble hellet i is-vann, filtrert, og kaken vasket grundig med vann. Det tørkede brunaktige faste stoff (240 mg, 76%) ble anvendt rått for neste reaksjon uten ytterligere rensning.

LC-MS (retensjonstid: 1,24 min, metode B), MS m/ z 259 (M<+>+H).

Trinn 3:

Dette produktet, 1-klor-6-metoksy-3-tiazol-2-yl-isokinolin, ble fremstilt som beskrevet ovenfor bortsett fra anvendelse av 6-metoksy-3-tiazol-2-yl-2H-isokinolin-1-on istedet.

<1>H NMR (CDCI3) 5 3,97 (s, 3H), 7,16 (d, J=4,0 Hz, 1H), 7,27-7,31 (m, 1H), 7,46 (d, J=5,0 Hz, 1H ), 7,93 (d, J=5,5 Hz, 1H), 8,22 (d, J=15,5 Hz, 1H), 8,39 (s, 1H); LC-MS (retensjonstid: 1,66 min, metode B), MS m/ z 277 (M<+>+H).

Trinn 4:

Dette produktet ble fremstilt ved samme metode som beskrevet ovenfor bortsett fra anvendelse av 1-klor-6-metoksy-3-tiazol-2-yl-isokinolin istedet.

<1>H NMR(CD3OD)5 0,97-1,09 (m, 12H), 1,24-1,29 (m, 10H), 1,44-1,46 (m, 1H), 1,87-1,90 (m, 1H), 2,20-2,26 (m, 1H), 2,30-2,36 (m. 1H), 2,65-2,71 (m, 1H), 2,93-2,96 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 4,12-4,27 (m, 2H), 4,38-4,52 (m, 2H), 5,12 (d, J=10,5 Hz, 1H), 5,29 (d, J=17,5 Hz, 1H), 5,69-5,74 (m, 1H), 5,99 (b, 1H), 7,14 (d, J=9,0 Hz, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,66 (d, J=3,5 Hz, 1H), 7,93 (d, J=3,0 Hz, 1H), 8,05 (s, 1H), 8,11 (d, J=9,0 Hz, 1H), 9,14 (b, 1H);

LC-MS (retensjonstid: 1,89 min, metode B), MS m/ z 797 (M<+>+H).

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

6-metoksy-3-(3-metoksy-isoksazol-5-yl)-2H-isokinolin-1-on ble fremstilt ved anvendelse av N,N-dietyl-4-metoksy-2-[2-(3-metoksy-isoksazol-5-yl)-2-okso-etylj-benzamid.

<1>H NMR (DMSO-de) 5 3,89 (s, 3H), 3,97 (s, 3H), 7,01 (s, 1H), 7,14-7,16 (m, 2H), 7,43 (s, 1H), 8,13 (d, J=8,5 Hz, 1H);

LC-MS (retensjonstid: 1,31 min, metode B), MS m/ z 273 (M<+>+H). 1 -klor-6-metoksy-3-(3-metoksy-isoksazol-5-yl)-isokinolin ble fremstilt ved anvendelse av 6-metoksy-3-(3-metoksy-isoksazol-5-yl)-2H-isokinolin-1 -on<1>H NMR (CDCI3) 5 3,97 (s, 3H), 4,04 (s, 3H), 6,60 (s, 1H), 7,17 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,31-7,33 (m, 1H), 8,02 (s, 1H), 8,23 (d, J=9,0 Hz, 1H);

LC-MS (retensjonstid: 1,73 min, metode B), MS m/ z 291, 293 (M<+>+H)

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

N,N-dietyl-4-metoksy-2-[2-(5-metoksy-oksazol-2-yl)-2-okso-etyl]-benzamid ble fremstilt ved anvendelse av 5-metoksy-oksazol-2-karboksylsyre-etylester LC-MS (retensjonstid: 1,24 min, metode B), MS m/ z 347 (M<+>+H).

6-metoksy-3-(5-metoksy-oksazol-2-yl)-2H-isokinolin-1 -on ble fremstilt ved anvendelse av N,N-dietyl-4-metoksy-2-[2-(5-metoksy-oksazol-2-yl)-2-okso-etyl]-benzamid.

<1>H NMR (DMSO-de) 5 3,94 (s, 3H), 4,01 (s, 3H), 6,34 (s, 1H), 6,99 (d, J=2,0 Hz, 1H), 7,12-7,14 (m, 1H), 7,25 (s, 1H), 8,32 (d, J=9,0 Hz, 1H);

LC-MS (retensjonstid: 1,22 min, metode B), MS m/ z 274 (M<+>+H).

1-klor-6-metoksy-3-(5-metoksy-oksazol-2-yl)-isokinolin ble fremstilt ved anvendelse av 6-metoksy-3-(5-metoksy-oksazol-2-yl)-2H-isokinolin-1-on.

<1>H NMR (CDCI3) 5 3,96 (s, 3H), 4,00 (s, 3H), 6,34 (s, 1H), 7,12 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,28-7,31 (m, 1H), 8,13 (s, 1H), 8,23 (d, J=9,0 Hz, 1H);

LC-MS (retensjonstid: 1,58 min, metode B), MS m/ z 291, 293 (M<+>+H).

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Til en løsning av N,N-dietyl-4-metoksy-2-metyl-benzamid (332 mg, 1,5 mmol) i THF (15 ml) ved -78°C ble sattt-BuLi (1,7 M løsning i pentan, 2,12 ml, 3,6

mmol). Den resulterende røde løsning ble omrørt ved -78°C i 10 min, deretter ble metyl-nikotinat (206 mg, 1,5 mmol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -78°C i 2 timer. Deretter ble reaksjonen stanset med mettet NH4CI-løsning og ekstrahert med etylacetat to ganger. De samlede organiske lag ble tørket (MgS04) og konsentrert. Råproduktet ble renset ved prep. HPLC, hvilket ga en gulaktig tykk olje som TFA-salt. (124 mg, 19% utbytte)

LC-MS (retensjonstid: 1,740 min.), MS m/z 349 (M+Na<+>).

N>N-dietyl-4-metoksy-2-(2-okso-2-pyridin-3-yl-etyl)-benzamid (120 mg, 0,272 mmol) ble oppvarmet med ammoniumacetat (1 g) i 3 timer. Deretter ble det avkjølt og tilsatt vann. Ekstrahert med etylacetat og det organiske laget ble separert. Det ble deretter tørket (MgS04) og konsentrert, hvilket ga et brunaktig fast stoff som produkt. (65 mg, 95% utbytte)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d<6>) 5 3,89 (s, 3 H), 6,93 (s, 1 H), 7,10 (dd, J=8,80, 2,45 Hz, 1 H), 7,19 (d, J=2,45 Hz, 1 H), 7,52 (dd, J=7,46, 4,77 Hz, 1 H), 8,15 (m, 2 H), 8,64 (dd, J=4,89, 1,47 Hz, 1 H), 8,96 (d, J=1,71 Hz, 1 H), 11,51 (s, 1

H).

LC-MS (retensjonstid: 1,377 min.), MS m/z 253 (MH<+>).

6-metoksy-3-pyridin-3-yl-2H-isokinolin-1-on (65 mg, 0,258 mmol) ble oppvarmet under tilbakeløp med POCI3(2,5 ml) i 7 dager. Deretter ble POCI3avdestillert og residuet ble behandlet med is. Det ble deretter nøytralisert med 10N NaOH-løsning og ekstrahert med etylacetat to ganger. De samlede organiske lag ble tørket (MgS04) og konsentrert hvilket ga et gult, fast stoff som produkt. (27 mg, 39% utbytte)

LC-MS (retensjonstid: 2,090 min.), MS m/z 271 (MH<+>).

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Til en løsning av N,N-dietyl-4-metoksy-2-metyl-benzamid (332 mg, 1,5 mmol) i THF (15 ml) ved -78°C ble satt t-BuLi (1,7 M løsning i pentan, 2,2 ml, 3,75 mmol). Den resulterende røde løsning ble omrørt ved -78°C i 10 min, deretter ble N,N-dimetylantranilsyre-metylester (269 mg, 1,5 mmol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -78°C i 2 timer. Deretter ble reaksjonen stanset med mettet NH4CI-løsning og ekstrahert med etylacetat to ganger. De samlede organiske lag ble tørket (MgS04) og konsentrert. Råproduktet ble renset ved prep. HPLC, hvilket ga en gulaktig tykk olje som produkt (256 mg, 46% utbytte).

<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 0,99-1,13 (m, 6 H), 3,23-3,31 (m, 8 H), 3,39 (m, 2 H), 3,82 (s, 3 H), 4,35 (s, 2 H), 6,91 (dd, J=8,44, 2,57 Hz, 1 H), 6,99 (d, J=2,45 Hz, 1 H), 7,22 (d, J=8,56 Hz, 1 H), 7,69 (t, J=7,70 Hz, 1 H), 7,84 (m, 1 H), 7,96 (d, J=8,31 Hz, 1 H), 8,18 (d, J=7,83 Hz, 1 H).

LC-MS (retensjonstid: 1,557min.), MS m/z 369(MH<+>).

2-[2-(2-dimetylamino-fenyl)-2-okso-etyl]-N,N-dietyl-4-metoksy-benzamid (250 mg, 0,678 mmol) ble oppvarmet med ammoniumacetat (1,5 g) i 2 timer. Deretter ble det avkjølt og tilsatt vann. Ekstrahert med etylacetat og det organiske laget ble separert. Det ble deretter tørket (MgS04) og konsentrert, hvilket ga et gulaktig fast stoff som produkt (125 mg, 63% utbytte).

<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 2,95 (s, 6 H), 3,92 (s, 3 H), 6,92 (s, 1 H), 7,12 (dd, J=8,80, 2,45 Hz, 1 H), 7,16 (d, J=2,45 Hz, 1 H), 7,35 (m, 1 H), 7,55 (m, 2 H), 7,63 (d, J=7,83 Hz, 1 H), 8,20 (d, J=9,05 Hz, 1 H).

LC-MS (retensjonstid: 2,097 min.), MS m/z 295 (MH<+>).

3-(2-dimetylamino-fenyl)-6-metoksy-2H-isokinolin-1-on (125 mg, 0,425 mmol) ble oppvarmet under tilbakeløp med POCI3(4,0 ml) i én dag. Deretter ble POCI3avdestillert og residuet ble behandlet med is. Det ble deretter nøytralisert med 10N NaOH-løsning og ekstrahert med etylacetat to ganger. De organiske lag ble samlet og tørket (MgS04). Inndampning av løsningsmiddel ga et brunaktig fast stoff som produkt (82 mg, 62% utbytte)

LC-MS (retensjonstid: 2,040 min.), MS m/z 313 (MH<+>).

En blanding av [2-(1-klor-6-metoksy-isokinolin-3-yl)-fenyl]-dimetyl-amin (82 mg, 0,262 mmol) og tetrabutyl-fosfonium-hydrogen-difluorid (1,0 g) ble oppvarmet ved 140°C i Smith mikrobølge-reaktor i 20 min. Deretter ble den tilsatt vann og ekstrahert med etylacetat. Det organiske laget ble separert, vasket med vann og tørket (MgS04). Inndampning av løsningsmiddel ga råproduktet som ble renset ved prep. HPLC, hvilket ga en gulaktig olje som produkt. (85 mg)

<1>H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 3,41 (s, 6 H), 4,00 (s, 3 H), 7,42 (dd, J=9,05, 2,45 Hz, 1 H), 7,53 (s, 1 H), 7,71 (m, 2 H), 7,99 (m, 1 H), 8,16 (m, 2 H), 8,31 (s, 1 H).

LC-MS (retensjonstid: 1,873 min.), MS m/z 297 (MH<+>).

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Til en løsning av N,N-dietyl-4-metoksy-2-metyl-benzamid (332 mg, 1,5 mmol) i THF (15 ml) ved -78°C ble satt t-BuLi (1,7 M løsning i pentan, 2,2 ml, 3,75 mmol). Den resulterende røde løsningen ble omrørt ved -78°C i 10 min, deretter ble (3-dimetylamino)benzosyre-metylester (269 mg, 1,5 mmol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -78°C i 2 timer. Deretter ble reaksjonen stanset med mettet NH4CI-løsning og ekstrahert med etylacetat to ganger. De samlede organiske lag ble tørket (MgS04) og konsentrert. Råproduktet ble renset ved prep. HPLC, hvilket ga en gulaktig tykk olje som TFA-salt. (245 mg, 33% utbytte)

1H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 1,01 (t, J=6,85 Hz, 3 H), 1,09 (m, 3 H), 3,11 (s, 6H), 3,21 (m, 2 H), 3,40 (m, 2 H), 3,79 (s, 3 H), 4,39 (s, 2 H), 6,84-6,91 (m, 2 H), 7,19 (d, J=8,32 Hz, 1 H), 7,35 (m, 1 H), 7,49 (t, J=8,07 Hz, 1 H), 7,66-7,71 (m, 2 H).

LC-MS (retensjonstid: 1,930 min.), MS m/z 369 (MH<+>).

2-[2-(3-dimetylamino-fenyl)-2-okso-etyl]-N,N-dietyl-4-metoksy-benzamid (240 mg, 0,497 mmol) ble oppvarmet med ammoniumacetat (2,0 g) i 2,5 timer. Deretter ble den avkjølt og tilsatt vann. Et brunaktig fast stoff ble oppsamlet som rent produkt. (95 mg, 65% utbytte)

1H NMR (400 MHz, CD3OD) 5 2,98 (s, 6 H), 3,88 (s, 3 H), 6,74-6,87 (m, 2 H), 7,01-7,07 (m, 3 H), 7,18 (d, J=2,44 Hz, 1 H), 7,28 (t, J=7,82 Hz, 1 H), 8,10 (d, J=8,80 Hz, 1 H).

LC-MS (retensjonstid: 1,773 min.), MS m/z 295 (MH<+>).

3-(3-dimetylamino-fenyl)-6-metoksy-2H-isokinolin-1-on (92 mg, 0,312 mmol) ble oppvarmet under tilbakeløp med POCI3(3,0 ml) i 2 dager. Deretter ble POCI3avdestillert og residuet ble behandlet med is. Det ble deretter nøytralisert med mettet NaHC03-løsning og ekstrahert med etylacetat to ganger. De organiske lag ble samlet og tørket (MgS04). Inndampning av løsningsmiddel ga en brunaktig tykk olje som produkt. (72 mg, 74% utbytte)

LC-MS (retensjonstid: 2,297 min.), MS m/z 313 (MH<+>).

En blanding av [3-(1-klor-6-metoksy-isokinolin-3-yl)-fenyl]-dimetylamin (72 mg, 0,23 mmol) og tetrabutyl-fosfonium-hydrogen-difluorid (0,5 g) ble oppvarmet ved 140°C i Smith mikrobølge-reaktor i 20 min. Deretter ble den tilsatt vann og ekstrahert med etylacetat. Det organiske laget ble separert, vasket med vann og tørket (MgS04). Inndampning av løsningsmiddel ga en brunaktig olje som produkt. (58 mg, 85% utbytte)

LC-MS (retensjonstid: 2,193 min.), MS m/z 297 (MH<+>).

De følgende mellomprodukter ble fremstilt som beskrevet her og kan innføres i forbindelser med formel 1

Kondensering av etylbrompyruvat med etyl-tiourinstoff i dioksan under tilbakeløp ga monoalkylamino-tiazol som HBr-salt i kvantitativt utbytte. Alkylering av 2-etylamino-tiazol-4-karboksylsyre-etylester med Etl i DM F ga 2-dietylamino-tiazol-4-karboksylsyre-etylester. LC/MS m/z 229 (MH)<+>

Metode E

Trinn 1:

En suspensjon av 2-cyanometyl-4-metoksy-benzosyre-metylester (1,9 g og TsOH.H20 ( 0,15 g, mmol) i morfolin 5 ml) ble tilbakeløpskokt i 4 timer og løsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble omkrystallisert fra EtOAc/heksaner med dråper av MeOH for å gi produktet (0,43 g, 17%): LC-MS retensjonstid: 1,07 metode H), MS m/z 266 (M<+>+1).

Trinn 2:

En blanding av 6-metoksy-3-morfolin-4-yl-isokinolin-1-ol (0,298 g, 1,15 mmol) i POCI3(20 ml) ble tilbakeløpskokt i 2 timer, løsningsmidlet fjernet i vakuum og kaldt vann tilsatt. pH ble regulert til >11 ved tilsetning av 1,0N NaOH. Det vandige laget ble ekstrahert med EtOAc. Ekstrakten ble tørket (MgS04) og løsningsmidlet fjernet i vakuum for å gi produktet (0,299 g, 94%): LC-MS retensjonstid: 1,68 metode H), MS m/ z 279 (M<+>+1).

Trinn 3:

En blanding av 1-klor-6-metoksy-3-morfolin-4-yl-isokinolin (0,050 g, 0,18 mmol) og tetrabutyl-fosforium-hydrgen-difluorid (0,8 g, 2,8 mmol) [Synlett 1992, (4), 345-6] ble oppvarmet ved 140°C i mikrobølger i 10 min. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med EtOAc og filtrert gjennom en ISCO 25 g prekolonne med et lag av silisiumgel på toppen, og løsningsmidlet fjernet for å gi produktet (0,037 mg, 77%):<1>H NMR (KLOROFORM-D) 5 ppm 3,48 (m, 4 H), 3,84 (m, 4 H), 3,89 (s, 3 H), 6,46 (d, J=1,22 Hz, 1 H), 6,85 (s, 1 H), 6,90 (dd, J=9,16, 2,44 Hz, 1 H), 7,82 (d, J=8,85 Hz, 1 H). LC-MS retensjonstid: 1,56 metode H), MS m/ z 263 (M<+>+1).

Metode F

6-fluor- og 6-alkyl-isokinoliner anvendt ved fremstilling av forbindelser med formel 1 ble fremstilt via Pomeranz-Fritsch-syntese ( Typisk prosedyre: Fremstilling av optisk aktiv 8,8-disubstituert-1,1-biisokinolin, K. Hirao, R. Tsuchiya, Y. Yano, H. Tsue, Heterocycles 42(1) 1996, 415-422) som beskrevet nedenfor. Produktene ble omdannet til 1-klor-derivater via N-oksyd-mellomprodukter.

Generelt synteseskjema

Reagenser og reaksjonsbetingelser: (a) tilbakeløp i benzen, azeotrop fjerning av vann; (b) første trinn: etyl-klorformiat, trimetyl-fosfitt i THF, andre trinn: titantetraklorid i kloroform; (c) MCPBA i CH2CI2; (d) POCI3i benzen

Fremstilling av 6-isopropoksyl- og 6-fert-butoksyl-isokinolin-mellomprodukter: Noen 6-alkoksy-1-klor isokinoliner ble fremstilt ved en direkte, ipso-fortrengning av 6-fluor-1-klorisokinolin med de tilsvarende alkoksyd-metallioner så som kalium-fetr-butoksyd (53%) og natrium-isopropoksyd (54%).

Generelt synteteseskjema

6-fluor-1-klorisokinolin ble underkastet en aromatisk nukleofil fortrengning med natrium-isopropoksyd og kalium-fetr-butoksyd i DMF, hvilket ga henholdsvis de tilsvarende 6-isopropoksyl- (54%):<1>H NMR (400 MHz, KLOROFORM-d) 5 ppm 1,43 (d, J=6,11 Hz, 6 H) 4,76 (m, J=6,11 Hz, 1 H) 7,08 (d, J=2,45 Hz, 1 H) 7,29 (dd, J=9,29, 2,45 Hz, 1 H) 7,50 (d, J=5,62 Hz, 1 H) 8,18 (d, J=5,87 Hz, 1 H)

8,24 (d, J=9,29 Hz, 1 H) og 6-fert-butoksyl-1-klor-isokinoliner (55%):<1>H NMR (400 MHz, KLOROFORM-d) 5 ppm 1,48 (s, 9 H) 7,31 (m, 2 H) 7,47 (d, J=5,62

Hz, 1 H) 8,18 (d, J=5,62 Hz, 1 H) 8,21 (d, J=9,78 Hz, 1 H) som hovedprodukt. Disse 6-alkoksyl-1-klor-isokinoliner ble innført i forbindelser med formel 1 som beskrevet her.

Metode G

Generelt synteseskjema

Denne syntese anvender teknologiene beskrevet, til dels, i de følgende referanser: (1) Hojo, Masaru; Masuda, Ryoichi; Sakaguchi, Syuhei; Takagawa, Makoto, Synthesis (1986), (12), 1016-17 (2) Rigby, James H.; Holsworth, Daniel D.; James, Kelly. Vinyl Isocyanates In Synthesis. [4 + 2] Cykloaddition Reactions With Benzyne Addends. Journal Of Organic Chemistry (1989), 54(17), 4019-20 (3) Uchibori, Y.; Umeno, M.; Yoshiokai, H.; Heterocycles, 1992, 34 (8), 1507-1510

Trinn 1d: Fremstilling av racemisk ( 1R2S)/( 1S, 2ff)- 1- amino- 2- vinylcvklopropan-karboksylsvre- etvlester- hydroklorid ( Metode A og Metode B) og chiral spaltning av dette racemat for fremstilling av N - ( 1R 2S)- 1- amino- 2- vinylcvklopropankarboksvlsvre- etvlester- hvdroklorid ( Metode C)

Den angitte forbindelse ble fremstilt (Trinn d) racemisk ved hver av de følgende metoder A og B. Dette racemat kunne også spaltes for å gi chiral Boc-(1R, 2S)-1-amino-2-vinylcyklopropyl-karboksylsyreester som ble avbeskyttet under sure betingelser, hvilket ga (1R, 2S)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyreester-hydroklorid (Metode C).

Metode A

A. 1 Fremstilling av A/- benzyl- imin av glycin- etylester

Glycin-etylester-hydroklorid (303,8 g, 2,16 mole) ble suspendert i tert-butylmetyleter (1,6 L). Benzaldehyd (231 g, 2,16 mol) og vannfritt natriumsulfat (154,6 g, 1,09 mole) ble tilsatt og blandingen avkjølt til 0°C ved anvendelse av et is-vann-bad. Trietylamin (455 ml, 3,26 mol) ble tilsatt dråpevis over 30 min og blandingen omrørt i 48 timer ved romtemperatur. Reaksjonen ble deretter stanset ved tilsetning av is-kaldt vann (1 L) og det organiske laget ble separert. Den vandige fasen ble ekstrahert med fert-butylmetyleter (0,5 L) og de samlede organiske faser vasket med en blanding av mettet vandig NaHC03(1 L) og saltvann (1 L). Løsningen ble tørket over MgSCvog konsentrert i vakuum, hvilket ga 392,4 g av A/-benzyl-imin-produktet som en tykk gul olje som ble anvendt direkte i neste trinn.<1>H NMR (CDCI3, 300 MHz) 8 1,32 (t, J=7,1Hz, 3H), 4,24 (q, J=7,1Hz, 2H), 4,41 (d, J=1,1Hz, 2H), 7,39-7,47 (m, 3H), 7,78-7,81 (m, 2H), 8,31 (s, 1H).

A. 2 Fremstilling av racemisk A/- Boc-( 1R2S)/( 7S, 2/ ?)- 1- amino- 2-vi nylcy klopropa n- ka rboksylsyre- etylester

Til en suspensjon av litium-fetr-butoksyd (84,06 g, 1,05 mol) i tørr toluen (1,2 L), ble satt dråpevis en blanding av A/-benzyl-imin av glycin-etylester (100,4 g, 0,526 mol) og transA ,4-dibrom-2-buten (107,0 g, 0,500 mol) i tørr toluen (0,6 L) over 60 min. Etter fullføring av tilsetningen, ble den dyprøde blandingen behandlet ved tilsetning av vann (1 L) og fert-butylmetyleter (TBME, 1 L). Den vandige fasen ble separert og ekstrahert en andre gang med TBME (1 L). De organiske fasene ble samlet, 1N HCI (1 L) ble tilsatt og blandingen omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Den organiske fasen ble separert og ekstrahert med vann (0,8 L). De vandige fasene ble deretter samlet, mettet med salt (700 g), TBME (1 L) ble tilsatt og blandingen avkjølt til 0°C. Den omrørte blandingen ble deretter gjort basisk til pH 14 ved dråpevis tilsetning av 10N NaOH, det organiske laget separert og den vandige fasen ekstrahert med TBME (2 x 500 ml). De samlede organiske ekstrakter ble tørket (MgS04) og konsentrert til et volum på 1L. Til denne løsningen av fritt amin ble satt BOC20 eller di-ferf-butyldikarbonat (131,0 g, 0,6 mol) og blandingen ble omrørt 4 dager ved romtemperatur. Ytterligere di-fert-butyldikarbonat (50 g, 0,23 mol) ble satt til reaksjonen, blandingen ble tilbakeløpskokt i 3 timer og fikk deretter avkjøles til romtemperatur natten over. Reaksjonsblandingen ble tørket over MgS04og konsentrert i vakuum, hvilket ga 80 g rått materiale. Dette residuet ble renset ved "flash" kromatografi (2,5 kg Si02, eluert med 1% til 2% MeOH/CH2CI2), hvilket ga 57 g (53%) racemisk A/-Boc-(1R2S)/(1S,2f?)-1-amino-2- vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester som en gul olje som stivnet under henstand i kjøleskap:<1>H NMR (CDCI3, 300 MHz) 5 1,26 (t, J=7,1 Hz, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,43-1,49 (m, 1H), 1,76-1,82 (br m, 1H), 2,14 (q, J=8,6 Hz, 1H), 4,18 (q, J=7,2 Hz, 2H), 5,12 (dd J=10,3, 1,7 Hz, 1H), 5,25 (br s, 1H), 5,29 (dd, J=17,6, 1,7 Hz, 1H), 5,77 (ddd, J=17,6, 10,3, 8,9 Hz, 1H); MS m/ z 254,16 (M-1)

A. 3 Fremstilling av racemisk ( 1/ ?, 2S)/( 1S, 2ffl 1- amino- 2- vinvlcvklopropankarboksvlsvre- etylester- hydroklorid

A/-Boc-(1R,2S)/(1S,2/?)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (9,39 g, 36,8 mmol) ble oppløst i 4N HCI/dioksan (90 ml, 360 mmol) og ble omrørt i 2 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble konsentrert for å gi (1/?,2S)/(1S,2/?)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester-hydroklorid i kvantitativt utbytte (7 g, 100%).<1>H NMR (metanol-d4) 5 1,32 (t, J=7,1, 3H), 1,72 (dd, J=10,2, 6,6 Hz, 1H), 1,81 (dd, J=8,3, 6,6 Hz, 1H), 2,38 (q, J=8,3 Hz, 1H), 4,26-4,34 (m, 2H), 5,24 (dd, 10,3, 1,3 Hz, 1H) 5,40 (d, J=17,2, 1H), 5,69-5,81 (m, 1H).

B. 1 Fremstilling av racemisk N- Boc- 1- amino- 2- vinvlcvklopropankarboksvlsvre- etylester- hydroklorid

Metode B

Til en løsning av kalium-ferf-butoksyd (11,55 g, 102,9 mmol) i THF (450 ml) ved -78°C ble satt kommersielt tilgjengelig /V,A/-dibenzyl-imin av glycinetylester (25,0 g, 93,53 mmol) i THF (112 ml). Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 0°C, omrørt i 40 min og ble deretter avkjølt igjen til -78°C. Til denne løsningen ble satt transA ,4-dibrom-2-buten (20,0 g, 93,50 mmol), blandingen ble omrørt i 1 time ved 0°C og avkjølt igjen til -78°C. Kalium-ferf-butoksyd (11,55 g, 102,9 mmol) ble tilsatt, blandingen ble umiddelbart oppvarmet til 0°C og ble omrørt én time til før konsentrering i vakuum. Råproduktet ble tatt opp i Et20 (530 ml), 1N vandig HCI-løsning (106 ml, 106 mmol) ble tilsatt og den resulterende bifasiske blanding ble omrørt i 3,5 timer ved romtemperatur. Lagene ble separert og det vandige laget ble vasket med Et20 (2x) og gjort basisk med en mettet vandig NaHCCvHøsning. Det ønskede amin ble ekstrahert med Et20 (3x) og den samlede organiske ekstrakt ble vasket med saltvann, tørket (MgSCvi) og konsentrert i vakuum for å oppnå fritt amin. Dette materialet ble behandlet med en 4N HCI-løsning i dioksan (100 ml, 400 mmol) og konsentrert, hvilket ga (1f?,2S)/(1S,2/?)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester-hydroklorid som et brunt halvfast stoff (5,3 g, 34% utbytte) identisk med materialet oppnådd fra prosedyre A, bortsett fra tilstedeværelse av en liten uidentifisert aromatisk urenhet (8%).

Metode C

C. 1 Spaltning av / V- Boc-( 1R2S)/( 1S, 2ff)- 1- amino- 2- vinylcvklopropankarboksvlsvre- etvlester

Spaltning A

Til en vandig løsning av natriumfosfat-buffer (0,1 M, 4,25 liter ("L"), pH 8) i en 12 Liter mantlet reaktor, holdt ved 39°C og omrørt ved 300 rpm ble satt 511 gram Alcalase 2,4L (ca. 425 ml) (Novozymes North America Inc.). Da temperaturen på blandingen nådde 39°C ble pH regulert til 8,0 ved tilsetning av 50% NaOH i vann. En løsning av racemisk A/-Boc-(1R2S)/(1S,2/?)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (85 g) i 850 ml DMSO ble deretter tilsatt over en periode på 40 min. Reaksjonstemperaturen ble deretter holdt ved 40°C i 24,5 timer i løpet av hvilken tid pH i blandingen ble regulert til 8,0 etter 1,5 timer og 19,5 timer ved anvendelse av 50% NaOH i vann. Etter 24,5 timer ble enantio-overskudd av esteren funnet å være 97,2% og reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur (26°C) og omrørt natten over (16 timer) hvoretter enantio-overskudd av esteren ble funnet å være 100%. pH i reaksjonsblandingen ble deretter regulert til 8,5 med 50% NaOH og den resulterende blandingen ble ekstrahert med MTBE (2x2 L). Den samlede MTBE-ekstrakt ble deretter vasket med 5% NaHC03(3 x 100 ml), vann (3 x 100 ml) og inndampet i vakuum, hvilket ga enantiomert ren /V-Boc-(1/?,2S)/-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester som lysegult fast stoff (42,55 g; renhet: 97% ved 210 nm, inneholdende ingen syre; 100% enantiomert overskudd ("ee").

Det vandige laget fra ekstraksjonsprosessen ble deretter surgjort til pH 2 med 50% H2S04og ekstrahert med MTBE (2x2 L). MTBE-ekstrakten ble vasket med vann (3 x 100 ml) og inndampet, hvilket ga syren som lysegult fast stoff (42,74 g; renhet: 99% ved 210 nm, inneholdende ingen ester).

Spaltning B

Til 0,5 ml 100 mM Heps«Na buffer (pH 8,5) i en brønn av en 24 brønn plate (kapasitet: 10 ml/brønn) ble satt 0,1 ml Savinase 16.0L (protease fra Bacillus clausii) (Novozymes North America Inc.) og en løsning av racemisk A/-Boc-(1R2S)/(1S,2/?)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (10 mg) i 0,1 ml DMSO. Platen ble lukket og inkubert ved 250 rpm ved 40°C. Etter 18 timer ble enantio-overskudd av esteren funnet å være 44,3% som følger: 0,1 ml av reaksjonsblandingen ble fjernet og blandet godt med 1 ml etanol; etter sentrifugering ble 10 mikroliter ful") av supernatanten analysert ved chiral HPLC. Til den gjenværende reaksjonsblanding ble 0,1 ml DMSO tilsatt og platen ble inkubert i ytterligere 3 dager ved 250 rpm ved 40°C, hvoretter fire ml etanol ble satt til brønnen. Etter sentrifugering ble 10^l av supernatanten analysert ved chiral HPLC og enantio-overskudd av esteren ble funnet å være 100%.

Spaltning C

Til 0,5 ml 100 mM Heps«Na buffer (pH 8,5) i en brønn av en 24 brønn plate (kapasitet: 10 ml/brønn) ble satt 0,1 ml Esperase 8,OL, (protease fra Bacillus halodurans) (Novozymes North America Inc.) og en løsning av racemisk /V-Boc-(1 /?,2S)/(1 S,2R)-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (10 mg) i 0,1 ml DMSO. Platen ble lukket og inkubert ved 250 rpm ved 40°C. Etter 18 timer ble enantio-overskudd av esteren funnet å være 39,6% som følger: 0,1 ml av reaksjonsblandingen ble fjernet og blandet godt med 1 ml etanol; etter sentrifugering ble 10fal av supernatanten analysert ved chiral HPLC. Til den gjenværende reaksjonsblanding ble 0,1 ml DMSO tilsatt og platen ble inkubert i ytterligere 3 dager ved 250 rpm ved 40°C, hvoretter fire ml etanol ble satt til brønnen. Etter sentrifugering ble 10 fal av supernatanten analysert ved chiral HPLC og enantio-overskudd av esteren ble funnet å være 100%.

Prøveanalyse ble utført på følgende måte:

1) Prøvepreparering: Ca. 0,5 ml av reaksjonsblandingen ble blandet godt med 10 volumer av EtOH. Etter sentrifugering ble 10^l av supernatanten injisert på HPLC-kolonne.

2) Omdannelse-bestemmelse:

Kolonne: YMC ODS A, 4,6 x 50 mm, S-5^m

Løsningsmiddel: A, 1 mM HCI i vann; B, MeCN

Gradient: 30% B i 1 min; 30% til 45% B over 0,5 min; 45% B i 1,5 min; 45% til 30% B over 0,5 min.

Strømningshastighet: 2 ml/min

UV-deteksjon: 210 nm

Retensjonstid: syre, 1,2 min; ester, 2,8 min.

3) Enantio-overskudd-bestemmelse for esteren:

Kolonne: CHIRACEL OD-RH, 4,6 x 150 mm, S-5^m

Mobil fase: MeCN/50 mM HCI04i vann (67/33)

Strømningshastighet: 0,75 ml/min.

UV-deteksjon: 210 nm.

Retensjonstid:

(1S,2/?)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre 5,2 min;

Racemisk tfR^ SyCISéRyi-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester 18,5 min og 20,0 min;

(1R,2S)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester 18,5 min.

Spaltning D

5 L av 0,3 M natriumfosfat-buffer (pH 8) ble holdt ved 38°C i en 20 Liter mantlet reaktor, omrørt ved 130 rpm. Fire liter Alcalase 2,4L (Novozymes North America Inc.) og 1 liter Dl vann ble satt til reaktoren. Da temperaturen på blandingen var nær 38°C, ble pH regulert til 7,8 med 10N NaOH. En løsning av racemisk /V-Boc-(1 /?,2S)/(1 S,2R)-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (500 gram) i 5 liter DMSO ble satt til reaktoren over en periode på 1 time via en tilsetningstrakt. Reaksjonstemperaturen ble deretter regulert til 48°C. Etter 21 timer nådde enantio-overskudd av esteren 99,3%. Oppvarmning ble stanset etter 24 timer og reaksjonsblandingen ble langsomt avkjølt til romtemperatur (ca. 25°C) og omrørt natten over. pH i reaksjonsblandingen ble regulert til 8,5 med 10N NaOH og blandingen ble ekstrahert med MTBE (2x4 L). Den samlede MTBE-ekstrakt ble vasket med 5% NaHC03(3 x 400 ml) og vann (3 x 400 ml) og inndampet, hvilket ga enantiomert ren A/-Boc-(1 R,2S)/-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester som lysegule krystaller (259 g; renhet: 96,9% ved 210 nm, inneholdende ingen syre; 100% ee).

Spaltning E

10 L av 0,1 M natriumfosfat-buffer (pH 8) ble holdt ved 40°C i en 20 Liter mantlet reaktor, omrørt ved 360 rpm. 1,5 liter Alcalase 2,4L (Novozymes North America Inc.) ble satt til reaktoren. Da temperaturen på blandingen nådde 38°C, ble pH regulert til 8,0 med 10N NaOH. En løsning av racemisk A/-Boc-(1R2S)/(1S,2R)-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (200 gram) i 2 liter DMSO ble satt til reaktoren over en periode på 1 time via en tilsetningstrakt. Reaksjonstemperaturen ble deretter regulert til 40°C. Etter 3 timer ble pH regulert til 8,0 med 10N NaOH. Etter 21 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til 25°C. pH i reaksjonsblandingen ble regulert til 8,5 med 10N NaOH og blandingen ble ekstrahert med MTBE (2x5 L). Den samlede MTBE-ekstrakt ble vasket med 5% NaHC03(3 x 500 ml) og vann (3 x 200 ml) og inndampet, hvilket ga 110 gram gul olje. Oljen ble ved romtemperatur satt under husvakuum og ga enantiomert ren A/-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2- vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester som fargeløs lang stav krystall (101 g; renhet: 97,9% ved 210 nm, inneholdende ingen syre; 100% ee). Krystall-strukturen av enantiomert ren A/-Boc-(1R2S)/-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester erkarakterisert vedenkel krystall-analyse (røntgen NB#: 52795-093, refkode: 634592N1). Den absolutte konfigurasjon er ikke etablert på grunn av mangel av et kjent chiralt senter eller tungatom(er). En kjedestruktur langs den krystallografiske a-akse blir dannet via intermolekylær hydrogen-binding mellom amidgruppen og karbonyl-oksygenatomet (N...0 3,159 A).

Struktur av A/-Boc-(1 /?,2S)-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester:

Spaltning F

5 L av 0,2 M natriumborat-buffer (pH 9) ble holdt ved 45°C i en 20 liter mantlet reaktor, omrørt ved 400 rpm. Tre liter Dl-vann og fire liter Savinase 16L, type EX (Novozymes North America Inc.) ble satt til reaktoren. Da temperaturen på blandingen nådde 45°C ble pH regulert til 8,5 med 10N NaOH. En løsning av racemisk A/-Boc-(1 /?,2S)/(1 S,2R)-1 -amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester (200 gram) i 2 liter DMSO ble satt til reaktoren over en periode på 40 min, via en tilsetningstrakt. Reaksjonstemperaturen ble deretter regulert til 48°C. Etter 2 timer ble pH regulert til pH 9,0 med 10N NaOH. Etter 18 timer nådde enantio-overskudd av esteren 72% og pH ble regulert til 9,0 med 10N NaOH. Etter 24 timer ble temperaturen senket til 35°C. Etter 42 timer ble temperaturen hevet til 48°C og pH ble regulert til 9,0 med 10N NaOH. Oppvarmning ble stanset etter 48 timer og reaksjonen ble langsomt avkjølt til romtemperatur (ca. 25°C) og omrørt natten over. Etter 66 timer var pH i reaksjonsblandingen 8,6. Blandingen ble ekstrahert med MTBE (2x4 L). Den samlede MTBE-ekstrakt ble vasket med 5% NaHC03(6 x 300 ml) og vann (3 x 300 ml) og inndampet, hvilket ga enantiomert ren A/-Boc-(1R,2S)/-1-amino-2-vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylestersom lysegul krystall (101 Ag; renhet: 95,9% ved 210 nm, inneholdende ingen syre; 98,6% ee). C. 2 Fremstilling av chiral ( 7/ ?, 2S)- 1- amino- 2- vinylcvklopropan- karboksvlsvre- etvlester- hvdroklorid

A/-BOC-( 7R,2S)-1 -amino-2-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester (8,5 g, 33,3 mmol) ble omrørt under en N2-atmosfære med 200 ml 4N HCI/dioksan (Aldrich) ved romtemperatur i 3 timer. Løsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk mens temperaturen ble holdt under 40°C. Dette ga 6,57 g (-100%) av (7R,2S)-1 -amino-2-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester-hydroklorid som et lyst gyldenbrunt fast stoff.<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) 5 1,31 (t, J=7,0 Hz, 3 H), 1,69-1,82 (m, 2 H), 2,38 (q, J=8,8 Hz, 1 H), 4,29 (q, J=7,0 Hz, 2 H), 5,22 (d, J=10,3 Hz, 1 H), 5,40 (d, J=17,2 Hz, 1 H), 5,69-5,81 (m, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 0,58 min), MS m/ z 156 (M<+>+1).

Eksempel 2. Fremstilling av Forbindelse 1.14- tert- butoksvkarbonylamino- 18-( isokinolin- 1- vloksv)- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza- tricvklori4. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 4-karboksylsyre

Trinn 2A, Fremstilling av 2-( 1- etoksvkarbonvl- 2- vinvl- cvklopropylkarbamovl)- 4-( isokinolin- 1- vloksv)- pvrrolidin- 1- karboksvlsvre- tert- butylester

En omrørt oppslemning av 4-(isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-1,2-dikarboksylsyre-1-tert-butylester (5,69 g, 15,9 mmol) i 200 ml metylenklorid ble behandlet sekvensielt med diisopropyletylamin (13,8 ml, 79,0 mmol), HBTU (7,10 g, 18,7 mmol), HOBT«H20 (2,86 g, 18,7 mmol) og 1f?,2S-1-amino-2- vinylcyklopropan-karboksylsyre-etylester-hydroklorid (3,19 g, 16,7 mmol). Den gyldne homogene løsningen ble omrørt ved romtemperatur under N2i 18 timer og deretter konsentrert i vakuum, hvilket ga 10 g av en brun olje. Denne ble fordelt mellom etylacetat og mettet vandig NaHC03. Den organiske fasen ble vasket med saltvann, tørket (MgSCvi) og konsentrert i vakuum. "Flash" kromatografi (2-5% MeOH i metylenklorid) ga 5,5 g (70%) av 2-(1-etoksykarbonyl-2-vinyl-cyklopropylkarbamoyl)-4-(isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-1-karboksylsyre-tert-butylester: LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,42 min), MS m/ z 496 (M<+>+1).

Trinn 2B, Fremstilling av 1-{ r4-( isokinolin- 1- vloksy)- pyrrolidin- 2- karbonyll-aminol- 2- vinvl- cvklopropankarboksvlsvre- etvlester- bis- hydroklorid

En omrørt oppslemning av 2-(1-etoksykarbonyl-2-vinyl-cyklopropylkarbamoyl)-4-(isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-1-karboksylsyre-tert-butylester (5,40 g, 10,9 mmol) ble behandlet med 2N HCI/eter (Aldrich) (250 ml) i 24 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert i vakuum, hvilket ga 5,3 g (~100%) av 1 -{[4-(isokinolin-1 -yloksy)-pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester-bis-hydroklorid som et hvitt, fast stoff: LC-MS (Metode A, retensjonstid: 2,40 min), MS m/ z 396 (M<+>+1).

Trinn 2C, Fremstilling av 1-{ ri-( 2- tert- butoksvkarbonvlamino- non- 8- enovl)- 4-( isokinolin- 1- vloksv)- pvrrolidin- 2- karbonvll- amino)- 2- vinyl-cyklopropankarboksvlsvre- etylester

2(S)-ferf-butoksykarbonylamino-8-nonensyre (anskaffet fra RSP Amino Acids) (1,0 g, 3,68 mmol) oppløst i 100 ml DMF ble behandlet sekvensielt med 1-{[4-(isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester-bis-hydroklorid (1,46 g, 3,68 mmol), N-metylmorfolin (1,4 ml, 12,9 mmol) og HATU (PE biosystems) (1,68 g, 4,42 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur under N2i 24 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble fordelt mellom etylacetat og pH 4 buffer (biftalat). Den organiske fasen ble vasket med mettet vandig NaHC03, tørket (MgSCv) og konsentrert i vakuum, hvilket ga 2,2 g av råproduktet. "Flash" kromatografi (20-50% etylacetat/heksan) ga 1,9 g (79%) av 1-{[1-(2-tert-butoksykarbonylamino-non-8-enoyl)-4-(isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinyl-cyklopropankarboksylsyre-etylester som et glassaktig fargeløst fast stoff: LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,72 min), MS m/ z 649 (M<+>+1).

Trinn 2D, Fremstilling av 14- tert- butoksvkarbonvlamino- 18-( isokinolin- 1- vloksv)-2, 15- diokso- 3, 16- diaza- tricyklo[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 4- karboksylsyre-etvlester

En løsning av 1-{[1-(2-tetr-butoksykarbonylamino-non-8-enoyl)-4-(isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester (1,72 g, 2,65 mmol) og tricykloheksylfosfin[1,3-bis(2,4,6-trimetylfenyl)-4,5-dihydroimidazol-2-yliden][benzyliden]ruthenium(IV)diklorid (Strem) (225 mg, 0,265 mmol) i 650 ml metylenklorid ble tilbakeløpskokt under N2. Den lys oransje homogene løsningen ble tilbakeløpskokt i 24 timer, hvilket ga en mørk oransje løsning. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og konsentrert i vakuum, hvilket ga 1,7 g av en oransje olje. "Flash" kromatografi (20-40% etylacetat/heksan) ga 1,4 g (85%) av 14-fert-butoksykarbonylamino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre etylester som et hvitt, fast stoff:<1>H NMR (300 MHz, CD3CI3) 5 1,29 (t, J=7,3 Hz, 3 H), 1,34 (s, 9 H), 1,35-1,71 (m, 9 H), 1,86-1,97 (m, 2 H), 2,08-2,27 (m, 2 H), 2,38-2,47 (m, 1 H), 2,96-3,04 (m, 1 H), 4,02-4,23 (m, 4 H), 4,55 (m, 1 H), 4,91 (dd, J=8,4 Hz, 4,0 Hz, 1 H), 5,25 (t, J=9,5 Hz, 1 H), 5,32 (d, J=8,8 Hz, 1 H), 5,50 (m, 1 H), 5,81 (m, 1 H), 6,96 (s, 1 H), 7,23 (m, 1 H), 7,51 (t, J=7,3 Hz, 1 H), 7,65 (t, J=8,4 Hz, 1 H), 7,73 (d, J=8,4 Hz, 1 H), 7,93 (d, J=5,9 Hz, 1 H), 8,17 (d, J=8,4Hz, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,52 min), MS m/ z 621 (M<+>+1).

Trinn 2E, Fremstilling av Forbindelse 1. 14- tert- butoksvkarbonylamino- 18-( isokinolin- 1- vloksv)- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza- tricvklori4. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 4-karboksylsyre

14-fert-butoksykarbonylamino-18-(isokinolin-1 -yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre-etylester (1,10 g, 1,77 mmol) ble oppløst i det blandede løsningsmiddel-system; THF (18 ml), metanol (8 ml) og vann (2 ml). Pulverisert litiumhydroksyd-hydrat (744 mg, 17,7 mmol) ble tilsatt. Den lysegule gule oppslemning ble omrørt ved romtemperatur under N2i 24 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble fordelt mellom eter og vann. Eterfasen ble kastet og den vandige fasen ble behandlet med 4N HCI inntil pH var 4. Denne sure løsning ble ekstrahert med eter fire ganger. De samlede eterekstrakter ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga 0,95 g (90%) av 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre som et hvitt, fast stoff:<1>H NMR (300 MHz, CD3CI3) 5 1,30 (s, 9 H), 1,34-1,46 (m, 4 H), 1,52-1,68 (m, 2 H), 1,84 (m, 2 H), 2,08-2,58 (m, 6 H), 2,78-2,87 (m, 1 H), 4,07 (m, 1 H), 4,32 (d, J=11,3 Hz, 1 H), 4,41 (m, 1 H), 4,79 (t, J=7,3 Hz, 1 H), 5,14 (t, J=9,5 Hz, 1 H), 5,23 (d, J=7,3 Hz, 1 H), 5,60 (q, J=8,8 Hz, 1 H), 5,86 (s, 1 H), 7,08 (s, 1 H), 7,22 (d, J=6,2 Hz, 1 H), 7,48 (t, J=7,7 Hz, 1 H), 7,64 (t, J=8,0 Hz, 1 H), 7,72 (d, J=8,1 Hz, 1 H), 7,94 (d, J=5,9 Hz, 1 H), 8,17 (s, J=8,4 Hz, 1 H).

LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,32 min), MS m/ z 593 (M<+>+1)

Eksempel 3a, Fremstilling av cyklopropylsulfonamid

Metode A:

Til en løsning av 100 ml THF avkjølt til 0°C ble boblet inn gassformig ammoniakk inntil metning ble nådd. Til denne løsningen ble satt en løsning av 5 g (28,45 mmol) cyklopropylsulfonylklorid (anskaffet fra Array Biopharma) i 50 ml THF, løsningen ble oppvarmet til romtemperatur natten over og omrørt én ytterligere dag. Blandingen ble konsentrert inntil 1-2 ml løsningsmiddel var igjen, påført på 30 g sjikt av Si02(eluert med 30% til 60% EtOAc/heksaner), hvilket ga 3,45 g (100%) av cyklopropyl-sulfonamid som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (Metanol-d4) 5 0,94-1,07 (m, 4H), 2,52-2,60 (m, 1H);<13>C NMR (metanol-d4)5 5,92, 33,01.

Metode B:

Trinn 1: Fremstilling av N- tert- butvl-( 3- klor) propylsulfonamid

tert-butylamin (3,0 mol, 315,3 ml) ble oppløst i THF (2,5 L). Løsningen ble avkjølt til - 20°C. 3-klorpropansulfonylklorid (1,5 mol, 182,4 ml) ble tilsatt langsomt. Reaksjonsblandingen fikk oppvarmes til romtemperatur og omrørt i 24 timer. Blandingen ble filtrert og filtratet ble konsentrert i vakuum. Residuet ble oppløst i CH2CI2(2,0 L). Den resulterende løsningen ble vasket med 1N HCI (1,0 L), vann (1,0 L), saltvann (1,0 L) og tørket over Na2S04. Den ble filtrert og konsentrert i vakuum, hvilket ga et svakt gult fast stoff, som ble krystallisert fra heksan, hvilket ga produktet som et hvitt, fast stoff (316,0 g, 99%).

<1>H NMR (CDCI3) 5 1,38 (s, 9H), 2,30-2,27 (m, 2H), 3,22 (t, J = 7,35 Hz, 2H), 3,68 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 4,35 (b, 1H).

Trinn 2: Fremstilling av cvklopropansulfonsvre- tert- butvlamid

Til en løsning av N-tert-butyl-(3-klor)propylsulfonamid (2,14 g, 10,0 mmol) i THF (100 ml) ble satt n-BuLi (2,5 M i heksan, 8,0 ml, 20,0 mmol) ved -78°C. Reaksjonsblandingen fikk oppvarmes opptil romtemperatur over en periode på 1 time. De flyktige stoffene ble fjernet i vakuum. Residuet ble fordelt mellom EtOAC og vann (200 ml, 200 ml). Den separerte organiske fasen ble vasket med saltvann, tørket over Na2S04, filtrert og konsentrert i vakuum. Residuet ble omkrystallisert fra heksan, hvilket ga det ønskede produkt som et hvitt, fast stoff (1,0 g, 56%).

<1>H NMR (CDCI3) 5 0,98-1,00 (m, 2H), 1,18-1,19 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 2,48-2,51 (m, 1H), 4,19 (b, 1H).

Trinn 3: Fremstilling av cvklopropylsulfonamid

En løsning av cyklopropansulfonsyre-tert-butylamid (110,0 g, 0,62 mol) i TFA (500 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. De flyktige stoffene ble fjernet i vakuum. Residuet ble omkrystallisert fra EtOAC/heksan (60 ml/240 ml), hvilket ga det ønskede produkt som et hvitt, fast stoff (68,5 g, 91%).

<1>H NMR (DMSO-de) 5 0,84-0,88 (m, 2H), 0,95-0,98 (m, 2H), 2,41-2,58 (m, 1H), 6,56 (b, 2H).

Eksempel 3b, Fremstilling av C1- substituerte cvklopropylsulfonamider Fremstilling av A/- terf- butyl-( 1- metyl) cyklopropyl- sulfonamid.

Trinn 1a Fremstilling av A/- terf- butvl-( 3- klor) propylsulfonamid.

Som vist ovenfor.

Trinn 1b. Fremstilling av A/- tert- butvl-( 1- metvl) cvklopropyl- sulfonamid.

En løsning av A/-ferf-butyl-(3-klor)propylsulfonamid (4,3 g, 20 mmol) ble oppløst i tørr THF (100 ml) og avkjølt til -78°C. Til denne løsningen ble langsomt satt n-BuLi (17,6 ml, 44 mmol, 2,5 M i heksan). Tørris-badet ble fjernet og reaksjonsblandingen fikk oppvarmes til romtemperatur over en periode på 1,5 timer. Denne blandingen ble deretter avkjølt til -78°C og en løsning av n-BuLi (20 mmol, 8 ml, 2,5 M i heksan) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til romtemperatur, igjen avkjølt til -78°C over en periode på 2 timer og en ren løsning av metyljodid (5,68 g, 40 mmol) tilsatt. Reaksjonsblandingen fikk oppvarmes til romtemperatur natten over, behandlet med mettet NH4CI (100 ml) ved romtemperatur. Den ble ekstrahert med EtOAc (100 ml). Den organiske fasen ble vasket med saltvann (100 ml), tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga en gul olje som ble krystallisert fra heksan, hvilket ga produktet som et svakt gult fast stoff (3,1 g, 81%):<1>H NMR (CDCI3) 5 0,79 (m, 2H), 1,36 (s, 9H), 1,52 (m, 2H), 1,62 (s, 3H), 4,10 (bs, 1H).

Trinn 1c: Fremstilling av 1- metvlcvklopropylsulfonamid

En løsning av A/-fert-butyl-(1-metyl)cyklopropylsulfonamid (1,91 g, 10 mmol) ble oppløst i TFA (30 ml) og reaksjonsblandingen omrørt ved

romtemperatur i 16 timer. Løsningsmidlet ble fjernet i vakuum, hvilket ga en gul olje som ble krystallisert fra EtOAc / heksan (1 :4, 40 ml), hvilket ga Eksempel 3,1-metylcyklopropylsulfonamid, som et hvitt, fast stoff (1,25 g, 96%):<1>H NMR (CDCI3) 5 0,84 (m, 2H), 1,41 (m, 2H), 1,58 (s, 3H), 4,65 (bs, 2H). Anal. Beregnet. For C4H9N02S: C, 35,54; H, 6,71; N, 10,36. Funnet: C, 35,67; H, 6,80; N, 10,40.

Fremstilling av 1- benzylcvklopropylsulfonamid

Trinn 1b: Fremstilling av A/- teAt- butyl-( 1- benzvl) cyklopropyl- sulfonamid.

Denne forbindelsen ble oppnådd i 60% utbytte ved anvendelse av metoden beskrevet for syntese av /V-fert-butyl-(1-metyl)cyklopropylsulfonamid bortsett fra at 1,05 ekvivalenter av benzylbromid ble anvendt, fulgt av utgnidning med 10% EtOAc i heksan:<1>H NMR (CDCI3) 5 0,92 (m, 2H), 1,36 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 3,25 (s, 2H), 4,62 (bs, 1H), 7,29-7,36 (m, 5H).

Trinn 1c: Fremstilling av 1- benzvlcvklo- propylsulfonamid

Denne forbindelsen, 1-benzylcyklopropylsulfonamid, ble oppnådd i 66% utbytte fra /V-fert-butyl(1-benzyl)cyklopropylsulfonamid ved anvendelse av metoden beskrevet for syntese av 1-metylcyklopropylsulfonamid, fulgt av omkrystallisering fra en minimal mengde av 10% EtOAc i heksan:<1>H NMR (CDCI3) 5 0,90 (m, 2H), 1,42 (m, 2 H), 3,25 (s, 2 H), 4,05 (s, 2 H), 7,29 (m, 3 H), 7,34 (m, 2 H);<13>C NMR (CDCI3) 5 11,1, 36,8, 41,9, 127,4, 128,8, 129,9, 136,5.

Fremstilling av 1- propvlcvklopropylsulfonamid

Trinn 1b: Fremstilling av A/- tert- butvl-( 1- benzvl) cvklopropvl- sulfonamid.

Denne forbindelsen ble fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet for fremstilling av 1-metylcyklopropylsulfonamid bortsett fra at propyl-halogenid ble anvendt istedenfor metyljodid i det andre trinn av denne prosessen.

Fremstilling av A/- teAt- butvl-( 1- allvl) cvklopropylsulfonamid.

Denne forbindelsen, A/-fert-butyl-(1-allyl)cyklopropylsulfonamid, ble oppnådd i 97% utbytte i henhold til metoden beskrevet i syntesen av N- tert-butyl-(1-metyl)cyklopropylsulfonamid bortsett fra at 1,25 ekvivalenter av allylbromid ble anvendt som elektrofil. Forbindelsen ble anvendt direkte i neste reaksjon uten rensning:<1>H NMR (CDCI3) 5 0,83 (m, 2H), 1,34 (s, 9H), 1,37 (m, 2H), 2,64 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 4,25 (bs, 1H), 5,07-5,10 (m, 2H), 6,70-6,85 (m, 1H).

Fremstilling av 1- allvlcvklopropylsulfonamid.

Denne forbindelsen, 1-allylcyklopropylsulfonamid, ble oppnådd i 40% utbytte fra /V-fert-butyl-(1-allyl)cyklopropylsulfonamid i henhold til metoden beskrevet for syntesen av 1-metylcyklopropylsulfonamid. Forbindelsen ble renset ved kolonne-kromatografi over Si02ved anvendelse av 2% MeOH i CH2CI2som elueringsmiddel:<1>H NMR (CDCI3) 5 0,88 (m, 2 H), 1,37 (m, 2 H), 2,66 (d, J=7,0 Hz, 2 H), 4,80 (s, 2 H), 5,16 (m, 2 H), 5,82 (m, 1 H);<13>C NMR (CDCI3)5 11,2, 35,6,40,7, 119,0, 133,6.

Fremstilling av A/- tert- butyl- H-( 1 - hvdroksy) cykloheksyn- cyklopropylsulfonamid.

Denne forbindelsen ble oppnådd i 84% utbytte ved anvendelse av metoden beskrevet for syntese av /V-fert-butyl-(1-metyl)cyklopropylsulfonamid bortsett fra at 1,30 ekvivalenter av cykloheksanon ble anvendt, fulgt av omkrystallisering fra en minimal mengde av 20% EtOAc i heksan:<1>H NMR (CDCI3)5 1,05 (m, 4H), 1,26 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 1,57-1,59 (m, 6H), 1,97 (m, 2H), 2,87 (bs, 1H), 4,55 (bs, 1H).

Fremstilling av 1-( 1- cvkloheksenvl) cvklopropyl- sulfonamid.

Denne forbindelsen, 1-(1-cykloheksenyl)-cyklopropylsulfonamid ble oppnådd i 85% utbytte fra A/-tert-butyl-[1-(1-hydroksy)cykloheksyl]-cyklopropylsulfonamid ved anvendelse av metoden beskrevet for syntese av 1-metylcyklopropylsulfonamid, fulgt av omkrystallisering fra en minimal mengde av EtOAc og heksan:<1>H NMR (DMSO-d6) 5 0,82 (m, 2 H), 1,28 (m, 2 H), 1,51 (m, 2 H), 1,55 (m, 2 H), 2,01 (s, 2 H), 2,16 (s, 2 H), 5,89 (s, 1 H), 6,46 (s, 2 H);<13>C NMR (DMSO-d6) 5 11,6, 21,5, 22,3, 25,0, 27,2, 46,9, 131,6, 132,2; LR-MS (ESI): 200 (M+-1).

Fremstilling av A/- teAt- butyl-( 1- benzovl) cyklopropyl- sulfonamid.

Denne forbindelsen ble oppnådd i 66% utbytte ved anvendelse av metoden beskrevet for syntese av /V-fert-butyl-(1-metyl)cyklopropylsulfonamid bortsett fra at 1,2 ekvivalenter av metylbenzoat ble anvendt som elektrofil. Forbindelsen ble renset ved kolonnekromatografi over Si02ved anvendelse av 30% til 100% CH2CI2i heksan:<1>H NMR (CDCI3) 5 1,31 (s, 9H), 1,52 (m, 2H), 1,81 (m, 2H), 4,16 (bs, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,57 (m, 1H), 8,05 (d, J = 8,5 Hz, 2H).

Fremstilling av 1- benzovlcvklo- propvlsulfonamid.

Denne forbindelsen, 1-benzoylcyklopropyl-sulfonamid, ble oppnådd i 87% utbytte fra /V-fert-butyl(1-benzoyl)cyklopropylsulfonamid ved anvendelse av metoden beskrevet for syntese av 1-metylcyklopropylsulfonamid, fulgt av omkrystallisering fra en minimal mengde av EtOAc i heksan:<1>H NMR (DMSO-d6) 5 1,39 (m, 2 H), 1,61 (m, 2 H), 7,22 (s, 2 H), 7,53 (t, J=7,6 Hz, 2 H), 7,65 (t, J=7,6 Hz, 1 H), 8,06 (d, J=8,2 Hz, 2 H);<13>C NMR (DMSO-d6) 5 12,3, 48,4, 128,1, 130,0, 133,4, 135,3, 192,0.

Fremstilling av A/- tert- butyl-( 1 - fenvlaminokarboksv)- cvklopropylsulfonamid

Denne forbindelsen ble oppnådd i 42% utbytte ved anvendelse av metoden beskrevet for syntese av /V-fert-butyl-(1-metyl)cyklopropylsulfonamid ved anvendelse av 1 ekvivalent av fenylisocyanat, fulgt av omkrystallisering fra en minimal mengde av EtOAc i heksan,<1>H NMR (CDCI3) 8 1,38 (s, 9H), 1,67-1,71 (m, 4H), 4,30 (bs, 1H), 7,10 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,34 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,53 (t, J = 7,5 Hz, 2H).

Eksempel 4, Fremstilling av cvkloalkvlsulfonamider fra cvkloalkvlbromider Fremstilling av cvklobutvlsulfonamid fra cvklobutvlbromid

Til en løsning av 5,0 g (37,0 mmol) cyklobutylbromid i 30 ml vannfri dietyleter (Et20) avkjølt til -78 °C ble satt 44 ml (74,8 mmol) 1,7M fert-butyllitium i pentaner og løsningen ble langsomt oppvarmet til -35°C over 1,5 timer. Denne blandingen ble kanylert langsomt inn i en løsning av 5,0 g (37,0 mmol) nydestillert sulfurylklorid i 100 ml heksaner avkjølt til -40°C, oppvarmet til 0°C over 1 time og forsiktig konsentrert i vakuum. Denne blandingen ble gjenoppløst i Et20, vasket én gang med noe is-kaldt vann, tørket (MgS04) og konsentrert forsiktig. Denne blandingen ble gjenoppløst i 20 ml THF, satt dråpevis til 500 ml mettet NH3i THF og ble omrørt natten over. Blandingen ble konsentrert i vakuum til et rått, gult, fast stoff og ble omkrystallisert fra en minimal mengde av CH2CI2i heksaner med 1-2 dråper MeOH, hvilket ga 1,90 g (38%) cyklobutylsulfonamid som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (CDCI3) 5 1,95-2,06

(m, 2H), 2,30-2,54 (m, 4H), 3,86 (p, J=8 Hz, 1H), 4,75 (brs, 2H);13C NMR (CDCI3) 5 16,43, 23,93, 56,29. HRMS m/z (M-HV beregnet for C4H8NS02: 134,0276, funnet 134,0282.

Fremstilling av cyklopentyl- sulfonamid

En løsning av 18,5 ml (37,0 mmol) 2M cyklopentyl-magnesiumklorid i eter ble satt dråpevis til en løsning av 3,0 ml (37,0 mmol) nydestillert sulfurylklorid (oppnådd fra Aldrich) i 100 ml heksaner avkjølt til -78°C. Blandingen ble oppvarmet til 0°C over 1 time og ble deretter forsiktig konsentrert i vakuum. Denne blandingen ble gjenoppløst i Et20 (200 ml), vasket én gang med noe iskaldt vann (200 ml), tørket (MgS04) og konsentrert forsiktig. Denne blandingen ble gjenoppløst i 35 ml THF, satt dråpevis til 500 ml mettet NH3i THF og ble omrørt natten over. Blandingen ble konsentrert i vakuum til et rått, gult, fast stoff, residuet ble filtrert gjennom 50 g silikagel ved anvendelse av 70% EtOAc-heksaner som elueringsmiddel og løsningen ble deretter konsentrert. Residuet ble omkrystallisert fra en minimal mengde av CH2CI2i heksaner med 1-2 dråper MeOH, hvilket ga 2,49 g (41%) av cyklopentylsulfonamid som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (CDCI3) 5 1,58-1,72 (m, 2H), 1,74-1,88 (m,2H), 1,94-2,14 (m, 4H), 3,48-3,59 (m, 1H), 4,80 (bs, 2H);<13>C NMR (CDCI3) 5 25,90, 28,33, 63,54; MS m/e 148 (M-H)\

Fremstilling av cvkloheksvl- sulfonamid

En løsning av 18,5 ml (37,0 mmol) 2M cykloheksylmagnesiumklorid (TCI Americas) i eter ble satt dråpevis til en løsning av 3,0 ml (37,0 mmol)

nydestillert sulfurylklorid i 100 ml heksaner avkjølt til -78°C. Blandingen ble oppvarmet til 0°C over 1 time og ble deretter forsiktig konsentrert i vakuum. Denne blandingen ble gjenoppløst i Et20 (200 ml), vasket én gang med noe iskaldt vann (200 ml), tørket (MgS04) og konsentrert forsiktig. Denne

blandingen ble gjenoppløst i 35 ml THF, satt dråpevis til 500 ml mettet NH3i THF og ble omrørt natten over. Blandingen ble konsentrert i vakuum til et rått, gult, fast stoff, residuet ble filtrert gjennom 50 g silikagel ved anvendelse av 70% EtOAc-heksaner som elueringsmiddel og ble konsentrert. Residuet ble omkrystallisert fra en minimal mengde av CH2CI2i heksaner med 1-2 dråper MeOH, hvilket ga 1,66 g (30%) cykloheksyl-sulfonamid som et hvitt, fast stoff:<1>H NMR (CDCI3) 8 1,11-1,37 (m, 3H), 1,43-1,56 (m, 2H), 1,67-1,76 (m, 1H), 1,86-1,96 (m, 2H), 2,18-2,28 (m, 2H), 2,91 (tt, J=12, 3,5 Hz, 1H), 4,70 (bs, 2H);<13>CH NMR (CDCI3) 5 25,04, 25,04, 26,56, 62,74; MS m/e 162 (M-1)\

Eksempel 5, Fremstilling av Forbindelse 2, [ 18-( isokinolin- 1- vloksv)- 4-metansulfonvlaminokarbonvl- 2, 15- diokso- 3, 16- diazatricvklo[ 14. 3. 0. 04, 6lnonadec- 7- en- 14- vll- karbaminsvre- tert- butvlester

Fremstilt fra 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre (50 mg, 0,075 mmol) og metansulfonamid (9,3 mg, 0,098 mmol) som beskrevet i den generelle prosedyren ovenfor, hvilket ga [18-(isokinolin-1-yloksy)-4-metansulfonylaminokarbonyl-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester som et hvitt pulver:<1>H NMR (300 MHz, CD3CI3)5 1,18 (s, 9 H), 1,25-1,96 (m, 11 H), 2,26 (m, 1 H), 2,54 (m, 1 H), 2,71 (m, 2 H), 3,18 (s, 3 H), 4,08 (m, 1 H), 4,26 (m, 1 H), 4,64 (m, 2 H), 5,00 (m, 2 H), 5,73 (m, 1 H), 6,01 (s, 1 H), 6,73 (s, 1 H), 7,28 (d, J=5,5 Hz, 1 H), 7,50 (t, J=7,3 Hz, 1 H), 7,65-7,76 (m, 2 H), 7,98 (d, J=5,9 Hz, 1 H), 8,19 (d, J=7,7 Hz, 1 H), 10,28 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,57 min), MS m/ z 670 (M<+>+1).

Eksempel 6, Fremstilling av Forbindelse 3, H8-( isokinolin- 1- vloksv)- 2. 15-diokso- 4-( propan- 2- sulfonvlaminokarbonyl)- 3, 16- diaza- tricvklo-H4. 3. 0. 04' 6lnonadec- 7- en- 14- vll- karbaminsvre- tert- butvlester

14-tert-butoksykarbonylamino-18-(isokinolin-1 -yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre (67 mg, 0,10 mmol) ble oppløst i 5 ml THF og behandlet med CDI (21 mg, 0,13 mmol). (Fuktighet ble omhyggelig unngått ved å anvende ovnstørket glassvare og holde en tørr N2-atmosfære). Etter tilbakeløpsbehandling av reaksjonsblandingen i én time, ble den avkjølt til romtemperatur og behandlet sekvensielt med isopropylsulfonamid (16 mg, 0,13 mmol) og DBU (20 mg, 0,13 mmol). Etter omrøring i 24 timer ved romtemperatur ble THF fjernet ved rotasjonsinndampning. Residuet ble fordelt mellom etylacetat og pH 4 buffer. Den organiske fasen ble tørket (MgSCv) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. "Flash" kromatografi (1-5% MeOH/metylenklorid) ga 50 mg (71%) av det ønskede produkt. Ytterligere rensning ved preparativ HPLC (YMC ODS-A, S5, 20 x 100mm, gradient: 60% til 100% B) ga 30 mg (43%) av [18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-4-(propan-2-sulfonylaminokarbonyl)-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester som et hvitt pulver:<1>H NMR (300 MHz, CD3CI3) 8 1,22 (S, 9 H), 1,31 (d. J=6,6 Hz, 3 H), 1,41 (d, J=6,9 Hz, 3 H), 1,20-1,96 (m, 11 H), 2,30 (q, J=8,4 Hz, 1 H), 2,56 (m, 1 H), 2,69 (m, 2 H), 3,69 (m, 1 H), 4,03 (m, 1 H), 4,29 (m, 1 H), 4,62 (m, 2 H), 4,97-5,06 (m, 2 H), 5,68 (q, J=9,5 Hz, 1 H), 5,91 (s, 1 H), 6,76 (s, 1 H), 7,23 (m, 1 H), 7,45 (t, J=7,7 Hz, 1 H), 7,63 (t, J=8,1 Hz, 1 H), 7,71 (d, J=8,1 Hz, 1 H), 7,97 (d, J=5,9 Hz, 1 H), 8,17 (d, J=8,1 Hz, 1 H), 9,89 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,79 min), MS m/ z 670 (M<+>+1). Eksempel 7, Fremstilling av Forbindelse 4, [ 4- cvklopropansulfonvlamino-karbonyl- 18-( isokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza-tricvklori4. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 14- vn- karbaminsvre- tert- butvlester

Fremstilt fra 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre-eterat (100 mg, 0,15 mmol) og cyklopropylsulfonamid (24 mg, 0,20 mmol) som beskrevet i den generelle prosedyre ovenfor. "Flash" kromatografi (2% metanol/metylenklorid) ga 55 mg (53%) av [4-cyklopropansulfonylamino-karbonyl-18-(isokinolin-1 -yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo-[14.3.0.04,6]-nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester som et hvitt pulver:<1>H NMR (500 MHz, CD3CI3) 5 0,89-0,95 (m, 1 H), 1,03-1,16 (m, 3 H),1,22 (s, 9 H), 1,18-1,48 (m, 8 H), 1,78 (m, 1 H), 1,87 (m, 1 H), 1,94 (m, 1 H), 2,29 (q, J=9,0 Hz, 1 H), 2,56 (m, 1 H), 2,67 (dd, J=7,9 Hz, 2,7 Hz, 2 H), 2,90 (m, 1 H), 4,04 (dd, J=11,3 Hz, 4,0 Hz, 1 H), 4,29 (m, 1 H), 4,61 (m, 2 H), 4,97-5,03 (m, 2 H), 5,70 (m, 1 H), 5,94 (s, 1 H), 6,67 (s, 1 H), 7,25 (m, 1 H), 7,47 (t, J=7,3 Hz, 1 H), 7,64 (t, J=7,3 Hz, 1 H), 7,72 (d, J=7,9 Hz, 1 H), 7,97 (d, J=5,8 Hz, 1 H), 8,17 (d, J=8,5 Hz, 1 H), 10,20 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,67 min), MS m/ z 696 (M<+>+1).

Eksempel 8, r4-( 1- benzvl- cvklopropansulfonvlaminokarbonvl)- 18-( isokinolin- 1-vloksv)- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza- tricvklori4. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 14- vn-karbaminsvre- tert- butvlester

Fremstilt fra 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre (50 mg, 0,075 mmol) og 1-benzyl-cyklopropansulfonsyre-amid (21 mg, 0,098 mmol, fremstilt som beskrevet ovenfor), hvilket ga [4-(1-benzyl-cyklopropan-sulfonylaminokarbonyl)-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-ferf-butylester som et hvitt pulver:<1>H NMR (500 MHz, CD3CI3) 5 1,23 (s, 9 H), 1,04-1,92 (m, 14 H), 1,96 (m, 1 H), 2,32 (dd, J=17,7 Hz, 9,5 Hz, 1 H), 2,59 (m, 1 H), 2,70 (m, 2 H), 3,20 (d, J=13,4 Hz, 1 H), 3,41 (d, J=13,7 Hz, 1 H), 4,02 (m, 1 H), 4,29 (m, 1 H), 4,61 (m, 2 H), 5,01 (d, J=7,6 Hz, 1 H), 5,15 (m, 1 H), 5,78 (m, 1 H), 5,92 (s, 1 H), 6,65 (s, 1 H), 7,08 (d, J=8,2 Hz, 2 H), 7,26 (m, 4 H), 7,46 (t, J=7,3 Hz, 1 H), 7,64 (t, J=7,3 Hz, 1 H), 7,72 (d, J=8,2 Hz, 1 H), 7,97 (d, J=5,8 Hz, 1 H), 8,17 (d, J=8,9 Hz, 1 H), 10,05 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,87 min), MS m/ z 786 (M<+>+1).

Eksempel 9, Fremstilling av Forbindelse 6, [ 18-( isokinolin- 1- yloksv)- 2, 15-diokso- 4-( 1 - propvl- cvklopropansulfonvlaminokarbonyl)- 3, 16- diaza- tricykloH 4. 3. 0. 04, 6lnonadec- 7- en- 14- yll- karbaminsyre- etrt- butylester

Fremstilt fra 14-fert-butoksykarbonylamino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre (50 mg, 0,075 mmol) og 1-propyl-cyklopropansulfonsyre-amid (16 mg, 0,098 mmol, fremstilt som beskrevet ovenfor), hvilket ga [18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-4-(1 -propyl-cyklopropansulfonylaminokarbonyl)-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-fert-butylester som et hvitt pulver:<1>H NMR (300 MHz, CD3CI3) 5 0,82-0,93 (m, 5 H), 1,23 (s, 9 H), 1,30-1,94 (m, 17 H), 2,28 (m, 1 H ), 2,54 (m, 1 H), 2,68 (dd, J=8,1 Hz, 3,2 Hz, 2 H), 4,05 (m, 1 H), 4,30 (m, 1 H), 4,63-4,66 (m, 2 H), 4,96-5,09 (m, 2 H), 5,70 (m, 1 H), 5,92 (s, 1 H), 6,69 (s, 1 H), 7,23 (m, 1 H), 7,46 (t, J=8,1 Hz, 1 H), 7,63 (t, J=8,1 Hz, 1 H), 7,72 (d, J=8,1 Hz, 1 H), 7,97(d, J=5,9 Hz, 1 H), 8,17 (d, J=8,4 Hz, 1 H), 10,12 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,77 min), MS m/ z 738 (M++1).

Eksempel 10, Fremstilling av Forbindelse 7, [ 18-( isokinolin- 1- vloksv)- 2, 15-diokso- 4-( 1 - propvl- cvklopropansulfonvlaminokarbonvl)- 3, 16- diazatricvklo[ 14. 3. 0. 04' 61nonadec- 14- vn- karbaminsvre- tert- butylester

Til en blanding av 73 mg (0,1 mmol) [18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-4-(1 -propylcyklopropansulfonylamino-karbonyl)-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester i 3 ml metanol ble satt 332 mg (2 mmol) av dikalium-azodikarboksylat. Iseddik (240 mg, 4 mmol) i 2 ml metanol ble tilsatt langsomt med en sprøytepumpe over 5 timer. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur. Etter 5 timer ble ytterligere 332 mg (2 mmol) dikalium-azodikarboksylat og 240 mg (4 mmol) iseddik tilsatt i løpet av 5 timer og omrøring ble fortsatt natten over. Denne cyklus ble gjentatt to ganger. LC-MS viste ca. 40% utgangsmateriale fortsatt igjen. Løsningsmidlet ble deretter fjernet på en rotasjonsinndamper. Vann ble satt til residuet og blandingen ble ekstrahert tre ganger med etylacetat. Den ble deretter tørket med magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert i vakuum. Den resulterende olje ble oppløst i metanol og renset ved preparativ HPLC (YMC ODS-A, S5, 20x100 mm, gradient: 80% B til 85% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 25 ml/min) for å isolere produktet som et hvitt pulver (25 mg, 34%).

<1>H NMR (500 MHz, CD3CI3) 5 0,91 (m, 5 H), 1,30 (s, 9 H), 1,20-1,80 (m, 21 H), 1,86-1,93 (m, 2 H), 2,57 (m, 1 H), 2,67 (m, 1 H), 4,10 (m, 1 H), 4,36 (d, J=12,2 Hz, 1 H), 4,44 (t, J=8,2 Hz, 1 H), 4,61 (t, J=7,9 Hz, 1 H), 5,16 (d, J=8,2 Hz, 1 H), 5,92 (bs, 1 H), 6,58 (bs, 1 H), 7,25 (m, 1 H), 7,49 (t, J=7,3 Hz, 1 H), 7,65 (t, J=7,3Hz, 1 H), 7,73 (d, J=8,2Hz, 1 H), 7,97 (d, J=5,8Hz, 1 H), 8,15 (d, J=8,2 Hz, 1 H), 10,09 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,83 min), MS m/ z 740(M<+>+1).

Eksempel 11, Fremstilling av Forbindelse 8, [ 18-( isokinolin- 1- yloksv)- 4-( 1- metvl-cvklopropansulfonvlaminokarbonyl)- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza-tricyklori4. 3. 0. 0461nonadec- 7- en- 14- yll- karbaminsyre- tert- butylester

Fremstilt fra 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre-eterat (105 mg, 0,177 mmol) og 1-metyl-cyklopropansulfonsyre-amid (31 mg, 0,23 mmol, fremstilt som beskrevet ovenfor). "Flash" kromatografi (2% metanol/metylenklorid) ga 73 mg (58%) av [18-(isokinolin-1-yloksy)-4-(1-metyl-cyklopropansulfonylaminokarbonyl)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester som et hvitt pulver: LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,50 min), MS m/ z 710 (M<+>+1).

Eksempel 12, Fremstilling av Forbindelse 9, r4- cvklobutansulfonvlamino-karbonyl- 18-( isokinolin- 1 - yloksy)- 2, 15- diokso- 3, 16- diazatricvklo[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 14- vn- karbaminsvre- tert- butvlester

Fremstilt fra 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre-eterat (114 mg, 0,192 mmol) og cyklobutansulfonsyre-amid (34 mg, 0,25 mmol) som beskrevet i den generelle prosedyre ovenfor. "Flash" kromatografi (2% metanol/metylenklorid) ga 73 mg (58%) av [18-(isokinolin-1-yloksy)-4-(1-metyl-cyklopropansulfonylaminokarbonyl)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester som et hvitt pulver: LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,55 min), MS m/ z 710 (M<+>+1).

Eksempel 13, Fremstilling av Forbindelse 10, r4- cyklopropansulfonvlamino-karbonvl- 18-( isokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 3. 16- diaza- tricvklon 4. 3. 0. 04, 6!-nonadec- 14- vn- karbaminsvre- tert- butylester

Til en blanding av 140 mg (0,2 mmol) [4-cyklopropansulfonylamino-karbonyl-18-(isokinolin-1 -yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.04,6]-nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester i 3 ml metanol ble satt 656 mg (4 mmol) av dikalium-azodikarboksylat. Iseddik (480 mg, 8 mmol) i 2 ml metanol ble tilsatt langsomt med en sprøytepumpe over 5 timer. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur. Etter 5 timer ble ytterligere 656 mg (4 mmol) dikalium-azodikarboksylat og 480 mg (8 mmol) iseddik tilsatt i løpet av 5 timer og omrøringen ble fortsatt natten over. Denne cyklus ble ble gjentatt to ganger. LC-MS viste at ca. 40% utgangsmateriale fortsatt var igjen. Løsningsmidlet ble deretter fjernet på en rotasjonsinndamper. Vann ble satt til residuet og blandingen ble ekstrahert tre ganger med etylacetat. Den ble deretter tørket med magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert i vakuum. Den resulterende oljen ble oppløst i metanol og renset ved preparativ HPLC (YMC XTERRA, S5, 30x50 mm, gradient:72% B til 78% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 40 ml/min) for å isolere produktet som et hvitt pulver (80 mg, 57%). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,59 min), MS m/ z 698 (M<+>+1).

Eksempel 14, Fremstilling av Forbindelse 11.Cvklopropansulfonsvre- ri4-amino- 18-( isokinolin- 1- vloksv)- 2. 15- diokso- 3. 16- diaza- tricvklori4. 3. 0. 04, 61-nonadec- 7- en- 4- karbonvn- amid- bis- hydroklorid

En omrørt oppslemning av [4-cyklopropan-sulfonylaminokarbonyl-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester (1,20 g, 1,7 mmol) ble behandlet med 4N HCI/dioksan (Aldrich) (10 ml) i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert i vakuum, hvilket ga 1,10 g (92%) av cyklopropansulfonsyre-[14-amino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karbonyl]-amid-bis-hydroklorid som et hvitt, fast stoff: LC-MS (Metode B, retensjonstid: 1,39 min), MS m/ z 596 (M<+>+1-2 HCI).

Eksempel 15. Fremstilling av Forbindelse 12 [ 4- cvklopropansulfonvlaminokarbonvl- 18-( isokinolin- 1 - vloksv)- 2. 15- diokso- 3. 16- diaza- tricvklon 4. 3. 0. 04, 6!-nonadec- 7- en- 14- yll- karbaminsyre- metylester

Til en blanding av cyklopropansulfonsyre-[14-amino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karbonyl]-amid-bis-hydroklorid (50 mg, 0,075 mmol) i 2 ml DCM ble satt 44 (0,25 mmol) av DIPEA og 9 mg (0,10 mmol) metylklorformiat. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Den ble deretter fortynnet med EtOAc og vasket med pH 4 buffer (2x) og saltvann (1x). Den organiske fasen ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. "Flash" kromatografi (2% MeOH/DCM) ga 40 mg (82%) av det ønskede produkt som et hvitt, fast stoff: LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,05 min), MS m/ z 654 (M<+>+1).

Eksempel 16, Fremstilling av Forbindelse 13, [ 4- cvklopropansulfonyl-aminokarbonvl- 18-( isokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 3, 16- diazatricvklo[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 14- vn- karbaminsvre- 2, 2- dimetvl- propvlester

Til en blanding av cyklopropansulfonsyre-[14-amino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karbonyl]-amid-bis-hydroklorid (50 mg, 0,075 mmol) i 2 ml DCM ble satt 44 (0,25 mmol) DIPEAog 15 mg (0,1 mmol) neopentyl-klorformiat. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Den ble deretter fortynnet med EtOAc og vasket med pH 4 buffer (2x) og saltvann (1x). Den organiske fasen ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. Den resulterende oljen ble oppløst i metanol og renset ved preparativ HPLC (YMC XTERRA, S5, 30x50 mm, gradient: 65% B til 100% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 40 ml/min) for å isolere produktet som et hvitt pulver (42 mg, 79%): LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,58 min), MS m/ z 710 (M<+>+1).

Generell prosedyre for fremstilling av klorformiater

Denne prosedyren ble anvendt for fremstilling av ikke kommersielt tilgjengelige klorformiater. Til en løsning av 5,96 g (67,6 mmol) kommersielt tilgjengelige reagenser (S)-3-hydroksytetrahydrofuran og pyridin (5,8 ml; 72 mmol) i THF (150 ml) avkjølt til 0°C ble satt en 1,93 M løsning av fosgen i toluen (48 ml, 92,6 mmol over 10 min under argon. Den resulterende løsningen fikk oppvarmes til romtemperatur over 2 timer, det resulterende faste stoffet filtrert og moderluten forsiktig konsentrert i vakuum ved romtemperatur inntil teoretisk masse ble oppnådd. Det resulterende residuet ble oppløst i 100 ml THF for å fremstille en 0,68M stamløsning av 3(S)-okso-tetrahydrofuran-klorformiat som kunne lagres i fryser inntil anvendelse. På analog måte kunne andre kommersielt tilgjengelige alkoholer omdannes til 0,68 M stamløsninger av de tilsvarende klorformiater.

Eksempel 17, Fremstilling av Forbindelse 14, [ 4- cvklopropansulfonvlaminokarbonvl- 18-( isokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 3. 16- diaza- tricvklon 4. 3. 0. 04, 6!-nonadec- 7- en- 14- vll- karbaminsvre- tetrahvdro- pyran- 4- vlester

Fremstilt fra cyklopropansulfonsyre-[14-amino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2>15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karbonyl]-amid-bis-hydroklorid (50 mg, 0,075 mmol, 44 (0,25 mmol) DIPEA og 0,17 ml (0,1 mmol) tetrahydropyran-klorformiat (fremstilt ved behandling av tetrahydropyran-4-ol med fosgen) i DCM som beskrevet ved metoden ovenfor, hvilket ga 28 mg (52%) av et hvitt, fast stoff. Preparativ HPLC-betingelse: YMC XTERRA, S5, 19x100 mm, gradient: 50% B til 100% B, 10 min, hold 2 min, strømningshastighet 25 ml/min. LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,13 min), MS m/ z 724 (M<+>+1).

Eksempel 18, Fremstilling av Forbindelse 15, 14- cvklopropansulfonvlamino-karbonyl- 18-( isokinolin- 1 - yloksy)- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza- tricyklo-[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 14- vn- karbaminsvre- tetrahvdro- furan- 3- vlester

Fremstilt fra cyklopropansulfonsyre-[14-amino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2>15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karbonyl]-amid-bis-hydroklorid (50 mg, 0,075 mmol), 44 (0,25 mmol) DIPEA og 0,10 ml (0,1 mmol) tetrahydro-furan-3-yl-klorformiat (fremstilt ved behandling av tetrahydrofuran-3-ol med fosgen) i DCM som beskrevet ved metoden ovenfor, for å gi 28 mg (52%) av et hvitt, fast stoff. Preparativ HPLC-betingelse: YMC ODS-A, S5, 30x50 mm, gradient: 50% B til 85% B, 8 min, hold 2 min, strømningshastighet 45 ml/min. LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,05 min), MS m/ z 710 (M<+>+1). Eksempel 19, Fremstilling av Forbindelse 16, r4- cyklopropansulfonylamino-karbonvl- 18-( isokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 3. 16- diaza- tricvklo-[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 14- vn- karbaminsvre- isopropvlester

Fremstilt fra cyklopropansulfonsyre-[14-amino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karbonyl]-amid-bis-hydroklorid (50 mg, 0,075 mmol), 44^L (0,25 mmol) DIPEA og 0,10 ml (0,1 mmol) 1 M isopropyl-klorformiat i toluen (Aldrich) som beskrevet ved metoden ovenfor, hvilket ga 40 mg (78%) av et hvitt, fast stoff. Preparativ HPLC betingelse: YMC XTERRA, S5, 30x50 mm, gradient: 50% B til 100% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 40 ml/min) NMR (300 MHz, CD3OD) 5 . LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,32 min), MS m/ z 682 (M<+>+1).

Eksempel 20. Fremstilling av ( 1S. 4R6S. 14S. 18lff- 7- c/ s- 14- tert-butoksvkarbonylamino- 18- hvdroksv- 2, 15- diokso- 3, 16- diazatricyklo-[ 14. 3. 0. 04, 6lnonadec- 7- en- 4- karboksvlsvre for anvendelse ved fremstilling av Forbindelse 17 i Eksempel 21

Trinn 20 A: Fremstilling av 1-( 2($)- tert- butoksvkarbonvlamino- non- 8- enovl)-4( ff)- hvdroksv- pvrrolidin- 2( S)- karboksvlsvre- metvlester

En løsning av 2(S)-ferf-butoksykarbonylamino-8-nonensyre (anskaffet fra RSP Amino Acids) (3,5 g, 12,9 mmol) i 200 ml DCM ble behandlet sekvensielt med 4(R)-hydroksypyrrolidin-2(S)-karboksylsyre-metylester-hydroklorid (2,15 g, 11,8 mmol), A/-metylmorfolin (4,25 ml, 38,6 mmol) og HATU (5,37 g, 14,1 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur under N2i 3 dager og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble fordelt mellom etylacetat og pH

4 buffer (biftalat). Den organiske fasen ble vasket med mettet vandig NaHC03, tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. "Flash" kromatografi (50% etylacetat/heksan til 100% etylacetat) ga 4,7 g (-100%) av 1-(2(S)-tert-butoksykarbonylamino-non-8-enoyl)-4(/?)-hydroksy-pyrrolidin-2(S)-karboksylsyre-metylester som en fargeløs olje:<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) 8 1,33-1,50 (m, 8 H), 1,46 (s, 9 H), 1,57 (m, 1 H), 1,72 (m, 1 H) 2,08 (m, 2 H), 2,28 (m, 1 H), 3,72 (s, 3 H,) 3,75-3,87 (m, 2 H), 4,36 (m, 1 H), 4,51 (bs, 1 H), 4,57 (t, J=8,2 Hz, 1 H), 4,95 (d, J=10,4 Hz, 1 H), 5,01 (m, 1 H), 5,83 (m, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,01 min), MS m/ z 399 (M<+>+1). Trinn 20 B: Fremstilling av 1-{ ri-( 2( S)- etAt- butoksvkarbonvlamino- non- 8- enovl)-4(/ ?)- hvdroksv- pvrrolidin- 2( S) karbonvn-( 1/ ?)- amino)- 2( S)- vinyl- cvklopropan-karboksvlsyre- etylester

1-(2(S)-tert-butoksykarbonylamino-non-8-enoyl)-4(R)-hydroksy-pyrrolidin-2(S)-karboksylsyre-metylester (4,7 g, 11,8 mmol) ble oppløst i THF (80 ml), metanol (20 ml) og vann (40 ml). Pulverisert litiumhydroksyd (5,6 g, 233 mmol) ble tilsatt. Den lysegule oppslemning ble omrørt ved romtemperatur under N2i 16 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble fordelt mellom eter og vann. Eterfasen ble kastet og den vandige fasen ble behandlet med 1N HCI inntil pH ble 4. Denne sure løsning ble ekstrahert med EtOAc (3x). De samlede EtOAc-ekstrakter ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum,

hvilket ga 4,36 g (96%) av 1-(2(S)-fert-butoksykarbonylamino-8-nonenoyl)-4(R)-hydroksy-pyrrolidin-2(S)-karboksylsyre som et hvitt, fast stoff. Denne syren ble deretter oppløst i 150 ml DMF og (1R,2S)-1-amino-2-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester-hydroklorid (2,61 g, 13,6 mmol), /V-metylmorfolin (2,5 ml, 22,6 mmol) og HATU (5,2 g, 13,7 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen

ble omrørt ved romtemperatur under N2i 16 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble fordelt mellom etylacetat og pH 4 buffer (biftalat). Den organiske fasen ble vasket med mettet vandig NaHC03, tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. "Flash" kromatografi (60%-80% etylacetat/heksan) ga 6,0 g (98%) av 1-{[1-(2(S)-ferf-butoksykarbonylamino-non-8-enoyl)-4(/?)-hydroksy-pyrrolidin-2(S)karbonyl]-(1/?)-amino}-2(S)-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester som et hvitt, fast stoff:<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) 5 1,25 (t, J=7,2 Hz, 3 H), 1,33-1,80 (m, 10 H), 1,46 (s, 9 H), 2,09 (m, 3 H), 2,25 (m, 2 H), 3,76 (m, 2 H), 4,14 (m, 2 H), 4,27 (dd, J=8,5, 5,2 Hz, 1 H), 4,50 (m,2 H),4,94(d, J=10,1 Hz, 1 H), 5,01 (dd, J=17,1,1,8 Hz, 1 H), 5,11 (dd, J=10,4, 1,8 Hz, 1 H), 5,30 (d, J=15,6 Hz, 1 H), 5,80 (m, 2 H), 8,57 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,21 min), MS m/ z 522 (M<+>+1).

Trinn 20C: Fremstilling av ( 1S, 4/ ?, 6S, 14S, 18f?)- 7- c/ s- 14- tert- butoksvkarbonvlamino- 18- hvdroksv- 2, 15- diokso- 3, 16- diazatricvklori4. 3. 0. 04, 61nonadec-7- en- 4- karboksylsvre- etylester

En løsning av 1-{[1-(2(S)-fetr-butoksykarbonyl-amino-non-8-enoyl)-4(/?)-hydroksy-pyrrolidin-2(S)karbonyl]-(1/?)-amino}-2(S)-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester (800 mg, 1,53 mmol) i 2 L metylenklorid ble spylt med N2i 0,5 time. Deretter ble tricykloheksylfosfin[1,3-bis(2,4,6-trimetyl-fenyl)-4,5-dihydroimidazol-2-yliden][benzyliden]-ruthenium(IV)diklorid (Strem) (64 mg, 0,075 mmol) tilsatt og blandingen ble spylt med N2i ytterligere 10 min. Den lys-oransje homogene løsning ble tilbakeløpskokt i 2 timer, hvilket ga en mørk-oransje løsning. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og konsentrert i vakuum, hvilket ga en oransje olje. "Flash" kromatografi

(etylacetat) ga 460 mg (61%) av (IS^ReS.USJSRJ-Z-c/s-U-fert-butoksykarbonylamino-18-hydroksy-2,15-diokso-3,16-diazatricyklo[14.3.0.04,6]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre-etylester som et grått fast stoff.<1>H NMR (500 MHz, CDCI3)5 1,19 (t, J=7, 2 Hz, 3 H), 1,42 (s, 9 H), 1,22-1,8 (m, 8 H), 1,87 (m, 2 H), 2,03-2,22 (m, 4 H), 2,63 (m, 1 H), 3,65 (m, 1 H), 4,09 (m, 3 H), 4,45 (m, 1 H), 4,56 (s, 1 H), 4,82 (m, 1 H), 5,23 (m, 1 H), 5,51 (s, 1 H), 7,16 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 2,97 min), MS m/ z 494 (M<+>+1).

Trinn 20 D: ( 1S, 4R6S, 14S. 18f?)- 7- c/ s- 14- etrt- butoksvkarbonvlamino- 18-hvdroksv- 2. 15- diokso- 3. 16- diazatricvklon 4. 3. 0. 04, 61- nonadec- 7- en- 4-karboksvlsvre

Til en løsning av (1S,4f?,6S,14S,18f?)-7-c/s-14-fert-butoksykarbonylamino-18-hydroksy-2,15-diokso-3,16-diazatricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre-etylester (493 mg, 1,0 mmol) i THF (4 ml), metanol (1 ml) og vann (2 ml), ble satt pulverisert litiumhydroksyd (480 mg, 20 mmol) og den lysegule oppslemning ble omrørt ved romtemperatur under N2i 16 timer. Blandingen ble deretter konsentrert i vakuum og residuet fordelt mellom eter og vann. Eterfasen ble kastet og den vandige fasen ble behandlet med 1N HCI inntil pH 4. Denne sure løsningen ble ekstrahert med EtOAc tre ganger. De samlede EtOAc-ekstrakter ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga 460 mg (98%) av Eksempel 26, (1S,4R6S,14S,18R)-7-c/'s-14-fert-butoksykarbonylamino-18-hydroksy-2,15-diokso-3,16-diazatricyklo[14.3.0.0<4,6>]-nonadec-7-en-4-karboksylsyre som et grått, fast stoff.<1>H NMR (500 MHz, CD3OD)5 ppm 1,26 (t, J=7,2 Hz, 3 H), 1,35-1,52 (m, 15 H), 1,57-1,68 (m, 3 H), 1,79 (m, 1 H), 2,04 (m, 1 H), 2,16-2,41 (m, 3 H), 3,80 (dd, J=10,7, 4,3 Hz, 1 H), 3,88 (m, 1 H), 4,38 (dd, J=8,9, 3,1 Hz, 1 H), 4,55 (m, 2 H), 5,39 (t, J=9,8 Hz, 1

H), 5,58 (m, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 2,64 min), MS m/ z 466 (M<+>+1). Eksempel 21, Fremstilling av Forbindelse 17B, rø- cvklopropansulfonylamino-karbonyl- 18-( 6- metoksv- isokinolin- 1 - yloksv)- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza-tricvklori4. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 14- vn- karbaminsvre- tert- butvlester

Til en blanding av 4-tert-butoksykarbonylamino-18-hydroksy-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4><6>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre (215 mg, 0,46 mmol) i DMSO (5 ml) ble satt f-BuOK (125 mg, 1,11 mmol) og 1 -klor-6-metoksy-isokinolin (110 mg, 0,56 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 16 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter fordelt mellom eter (10 ml) og vann (10 ml). Den vandige fasen ble surgjort til pH 4 ved anvendelse av 1N HCI. Den resulterende løsningen ble ekstrahert med EtOAc (3 x 20 ml). De samlede EtOAc-ekstrakter ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert i vakuum, hvilket ga et hvitt, fast stoff. "Flash" kromatografi (2% MeOH/CH2CI2) ga 140 mg (49%) av karboksylsyre-derivatet som et hvitt, fast stoff. LC-MS (Metode B, retensjonstid: 1,80 min), MS m/ z 543 (M<+>+1). Det faste stoffet ovenfor (140 mg, 0,22 mmol) ble behandlet med cyklopropylsulfonamid (35 mg, 0,28 mmol) som beskrevet i den generelle prosedyre ovenfor, for å gi råproduktet. "Flash" kromatografi (2% MeOH/DCM) ga 90 mg av det ønskede produkt. Ytterligere rensning ved preparativ HPLC (YMC Xterra, S5, 30 x 50mm, 50% til 100%B, gradient 9 min, hold 1 min, strømningshastighet 40 ml/min ) ga 30 mg (19%) av produktet som et hvitt pulver: LC-MS (Metode B, retensjonstid: 1,86 min), MS m/ z 726 (M<+>+1).

Eksempel 22, Fremstilling av 1-{ r4-( 6- metoksv- isokinolin- 1- vloksv)- pvrrolidin- 2-karbonvll- amino)- 2- vinyl- cvklopropankarboksvlsvre- etvlester ( som bis- HCI- salt) for anvendelse i Eksempel 24

Fremstilt ved anvendelse av samme syntesesekvens anvendt for fremstilling av produktet i Trinn 2B av Eksempel 3 bortsett fra at 6-metoksy-1-klorkinolin (beskrevet i Eksempel 1, f.eks. Trinn 1a og Trinn 1b) ble anvendt istedenfor 1-klorkinolin.

Eksempel 23, Fremstilling av Eksempel 23 , 2( S)- tert- butoksvkarbonylamino- 3-pent- 4- enylsulfanylpropionsvre for anvendelse i Eksempel 24.

Trinn 1: Til en løsning av /V-Boc-cystein-metylester (3,36 g, 0,014 mol) i metanol (166 ml) ved romtemperatur ble satt trietylamin (10,8 ml) og 1-brompent-4-en (3,19 g, 21 mmol, 1,5 ekvivalenter) og den resulterende løsning ble omrørt ved romtemperatur natten over. Blandingen ble deretter konsentrert i vakuum og den resulterende gjenværende blanding ble renset ved anvendelse av "flash" kromatografi (heksan, etylacetat gradient) for å gi 1,76 g (41 %) av den ønskede tioeter.<1>H NMR (500 MHz, CDCI3) 5 1,43 (s, 9H), 1,64 (m, 2H), 2,11 (m, 2H), 2,51 (m, 2H), 2,95 (m, 2H), 3,75 (s, 3H), 4,51 (m, 1H), 4,95-5,03 (m, 2H), 5,34 (m, 1H), 5,80 (1H, m). LC-MS (Metode B, bortsett fra at gradient-tid var 3 min. og strømningshastigheten var 4 ml/min, retensjonstid: 2,29 min), MS m/ z 304(M<+>+1).

Trinn 2: Tioeter-produktet fra trinn 1 (9,51 g, 31,4 mmol) ble satt til en blanding av 1M LiOH i vann (200 ml) og THF (200 ml) og den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over. Reaksjonsblandingen ble deretter surgjort ved anvendelse av 1N saltsyre og den resulterende blanding ble ekstrahert mange ganger med etylacetat. Ekstraktene ble samlet, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum for å gi den ønskede syre som ble anvendt som den var i neste reaksjon.

Eksempel 24, Fremstilling av Forbindelse 18B, K- cyklopropansulfonyl-aminokarbonvl- 18-( 6- metoksv- isokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 12- tia- 3, 16-diaza- tricvklo[ 14. 3. 0. 04' 61nonadec- 7- en- 14- vn- karbaminsvre- tert- butylester

Trinn 24 A, Fremstilling av 1-{[ 1-( 2- tert- butoksvkarbonylamino- 3- pent- 4-envlsulfanvl- propionvl)- 4-( 6- metoksv- isokinolin- 1- vloksv)- pyrrolidin- 2- karbonvn-aminol- 2- vinvl- cvklopropankarboksvlsvre- etvlester

Til en løsning av karboksylsyren i Eksempel 23 (289 mg, 1,00 mmol, 1 ekv.) i DMF (9 ml) ble satt sekvensielt dipeptid-produktet i Eksempel 22 (498 mg, 1,00 mmol, 1 ekv), HATU (456 mg, 1,20 mmol, 1,2 ekv) og N-metylmorfolin (385 \ iL, 3,50 mmol, 3,5 ekv). Løsningen ble omrørt ved romtemperatur natten over, på hvilket tidspunkt LC/MS viste dannelse av produkt og forsvinning av utgangsmateriale 2. En pH 4 buffer-løsning ble tilsatt og blandingen ble ekstrahert tre ganger med etylacetat. De organiske lag ble vasket med saltvann, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum. Kromatografi ble utført (Silikagel, etylacetat/heksan gradient) for å oppnå rent tripeptid 3 i kvantitativt utbytte.

<1>H NMR (400 MHz, CDCI3) 5 8,03 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 7,89 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,56 (br s, 1H), 7,15-7,09 (m, 2H), 7,01 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,86-5,68 (m, 3H), 5,39-5,22 (m, 2H), 5,12-4,82 (m, 4H), 4,61 (tilsynelatende q, J = 6,8 Hz, 1H), 4,24-4,04 (m, 3H), 3,91 (s, 3H), 3,02-2,90 (m, 1H), 2,84-2,69 (m, 2H), 2,66 (m, 3H), 2,24-2,08 (m, 2H), 1,88 (dd, J = 5,5, 8,0 Hz, 1H), 1,68 (app kint, J = 7,5 Hz, 2H), 1,56 (dd, J= 5,4, 9,5 Hz, 1H), 1,42 (m, 1H), 1,31 (s, 9H), 1,27-1,20 (m, 4H).[m/z] + H 697, ERRA 3,0 X 50mm S7 retensjonstid = 1,937 min, HPLC metode 2 min gradient 0% B til 100% B, deretter 1 min ved 100% B (3 min total kjøretid)

Trinn 24 B, Fremstilling av 14- tert- butoksvkarbonvlamino- 18-( 6- metoksv-isokinolin- 1 - yloksv)- 2, 15- diokso- 12- tia- 3, 16- diaza- tricyklo[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec-7- en- 4- karboksylsvre- etylester

Til en løsning av tripeptid-produktet i Trinn 24A (384,6 mg, 553 \ imo\, 1 ekv.) i dikloretan (159 ml) ble satt tricykloheksylfosfin[1,3-bis(2,4,6-trimetylfenyl)-4,5-dihydroimidazol-2-yliden[benzylidin]ruthenium(IV)diklorid (48,5 mg, 57 jamol, 0,10 ekv.) og tilbakeløpskokt i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert i vakuum. Kromatografi ble utført (silikagel, etylacetat/heksan gradient) for å oppnå ren makrocyklisk forbindelse, i 73% utbytte.

1H NMR (500 MHz, CDCI3) 5 8,04 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,86 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,59 (br s, 1H), 7,16-7,09 (m, 2H), 7,00 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,78-5,71 (m, 1H), 5,64 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,58-5,50 (m, 1H), 5,36 (m, 1H), 5,03 (dd, J = 4,2, 8,3 Hz, 1H), 4,81-4,75 (m, 1H), 4,27-4,14 (m, 2H), 3,98-3,93 (m, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,13-3,02 (m, 2H), 3,00-2,94 (m, 1H), 2,69 (dt, J = 3,9, 11,2 Hz, 1H), 2,52-2,42 (m, 2H), 2,36-2,26 (m, 2H), 2,16-2,08 (m, 1H), 1,96 (dd, J = 5,5, 8,2 Hz, 1H), 1,86-1,76 (m, 1H), 1,68-1,58 (m, 2H), 1,37 (s, 9H), 1,29 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 1,27-1,21 (m, 1H).

[m/z] + H 669

XTERRA 3,0 X 50mm S7 retensjonstid = 1,797, HPLC metode 2 min gradient 0% B til 100% B, deretter 1 min med 100% B (3 min total kjøretid)

Trinn 24 C, Fremstilling av 18A, 14- tert- butoksykarbonylamino- 18-( 6- metoksy-isokinolin- 1 - yloksv)- 2, 15- diokso- 12- tia- 3, 16- diaza- tricyklo[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec-7- en- 4- karboksylsyre

Til en løsning av det makrocykliske esterprodukt i Trinn 24B (271 mg, 406 umol, 1 ekv.) i THF (4,1 ml) ble satt LiOH (97 mg, 4,04 mmol, 10 ekv.), vann (0,45 ml) og MeOH (1,9 ml). Reaksjonen ble omrørt i 16 timer, på hvilket tidspunkt LC/MS viste at hydrolysen var fullstendig. En 1 M løsning av HCI i vann ble tilsatt og den resulterende blandingen ble ekstrahert 3 ganger med etylacetat. De organiske ekstrakter ble vasket med saltvann, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum for å gi ren karboksylsyre i kvantitativt utbytte.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 12,50 (br s, 1H), 8,59 (br s, 1H), 8,22 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 8,14-8,07 (m, 1H), 7,46 (br s, 2H), 7,33-7,25 (m, 2H), 5,95 (br s, 1H), 5,79-5,56 (m, 2H), 4,66-4,57 (m, 1H), 4,50-4,37 (m, 2H), 4,24-4,11 (m, 2H), 4,05 (s, 3H), 3,60-3,40 (m, 2H), 3,09-2,97 (m, 1H), 2,91-2,81 (m, 1H), 2,65-2,58 (m, 1H), 2,56-2,44 (m, 2H), 2,44-2,33 (m, 1H), 1,84-1,73 (m, 1H), 1,72-1,57 (m, 2H), 1,34 (s, 9H), 1,08-0,95 (m, 1H).

[m/z] + H 641

XTERRA 3,0 X 50mm S7 retensjonstid = 1,673, HPLC metode 2 min gradient 0% B til 100% B, deretter 1 min med 100% B (3 min total kjøretid)

Trinn 24D, Fremstilling av Forbindelse 18B, [ 4- cvklopropansulfonylamino-karbonyl- 18-( 6- metoksv- isokinolin- 1 - yloksv)- 2, 15- diokso- 12- tia- 3, 16- diazatricvklo[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 14- vl1- karbaminsvre- tert- butvlester

Til en løsning av karboksylsyreproduktet i Trinn 24 C (236,3 mg, 369 jamol, 1 ekv.) i THF (5,2 ml) ble satt karbonyl-diimidazol (143 mg, 738 jamol, 2 ekv.) og tilbakeløpskokt i 2,5 timer. Løsningen ble avkjølt til romtemperatur, på hvilket tidspunkt cyklopropyl-sulfonamid (158 mg, 1,1 mmol, 3 ekv.) og DBU (127 \ iL, 849 famol, 2,3 ekv.) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. En 1M løsning av HCI i vann ble tilsatt og produktet ble ekstrahert tre ganger inn i metylenklorid. De organiske lag ble vasket med saltvann, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum. Kromatografi ble utført (silikagel, etylacetat/heksan gradient) for å oppnå ren sulfonamidforbindelse 18, i 78% utbytte.

<1>H NMR (400 MHz, CD30D) 5 8,10 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 7,89-7,83 (m, 2H), 7,21 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,13 (br s, 1H), 7,05 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 5,81 (br s, 1H), 5,68 (tilsynelatende q, J = 8,9 Hz, 1H), 5,16 (tilsynelatende t, J= 9,7 Hz, 1H), 4,59-4,52 (m, 2H), 4,40-4,32 (m, 1H), 4,12-4,04 (m, 1H), 3,89 (s, 3H), 2,98-2,78 (m, 3H), 2,73-2,41 (m, 6H), 2,02-1,98 (m, 1H), 1,75 (dd, J = 5,5, 8,2 Hz, 1H), 1,71-1,53 (m, 3H), 1,32-1,20 (m, 1H), 1,16 (s, 9H), 1,14-0,95 (m, 2H).

[m/z] + H 744

XTERRA 3,0 X 50mm, S7 retensjonstid = 1,700, HPLC metode 2 min gradient 0% B til 100% B, deretter 1 min ved 100% B (3 min total kjøretid)

Eksempel 25, Fremstilling av Forbindelse 19, 4- cyklopropansulfonylamino-karbonyl- 18-( 6- metoksv- isokinolin- 1 - yloksv)- 2, 12, 12, 15- tetraokso- 12-tia- 3, 16- diaza- tricykloH 4. 3. 0. 0461nonadec- 7- en- 14- yll- karbaminsyre- tert-butvlester

Til en løsning av Forbindelse 18 (84,7 mg, 114^mol) i MeOH (1,4 ml) og vann (460^L) ved 0°C ble satt oxone (210,6 mg, 343^mol, 3,0 ekv.). Blandingen ble omrørt i 20 min ved 0°C, deretter omrørt i 3 timer ved omgivelsestemperatur. Vann og metylenklorid ble deretter tilsatt og lagene separert. Det vandige laget ble ekstrahert to ganger til med metylenklorid. De samlede organiske lag ble tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum. Produktet ble renset ved prep. TLC (etylacetat), hvilket ga sulfonet (37,2 mg, 42% utbytte).

<1>H NMR (CD3OD) 5 8,11 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 7,23 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,20-7,15 (m, 1H), 7,11 (dd, J= 1,8, 8,9 Hz, 1H), 5,87-5,81 (m, 1H), 5,61-5,47 (m, 2H), 4,96-4,90 (m, 1H), 4,67 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 4,46-4,39 (m, 1H), 4,27-4,20 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,84-3,72 (m, 1H), 2,94-2,84 (m, 2H), 2,67-2,58 (m, 2H), 2,47-2,37 (m, 1H), 2,37-2,25 (m, 2H), 1,85-1,73 (m, 2H), 1,72-1,64 (m, 1H), 1,49-1,38 (m, 1H), 1,20 (s, 9H), 1,16-1,02 (m, 3H), 1,00-0,82 (m, 3H).

Eksempel 26, Fremstilling av Forbindelse 27 og Forbindelse 28

Trinn 26A: Fremstilling av isopropvl- pyrrolidin- 5- on- 2( S)- karboksvlat

En løsning av L-pyroglutaminsyre (Aldrich, 25,0 g, 195 mmol) og para-toluensulfonsyre-monohydrat (3,71 g, 19,5 mmol) ble tilbakeløpskokt i isopropanol (40 ml) under nitrogen i 6 timer ved anvendelse av en Dean-Stark-felle-variasjon (kondensat returnert gjennom en Soxhlet ekstraktar fylt med 4 Å molekylsikter). Etter avkjøling til romtemperatur ble reaksjonsblandingen fortynnet med eter, vasket med mettet vandig natriumbikarbonat og deretter mettet vandig NaCI, tørket (MgSCvt) og inndampet, hvilket ga en fargeløs sirup. Den krystalliserte ved setning. Utgnidning av det krystallinske residuet i heksan ga 31,9 g (96%) isopropyl-pyrrolidin-5-on-2(S)-karboksylat som hvite prismer:<1>H NMR (300 MHz, kloroform-D) 5 6,35 (br s, 1 H), 5,04 (sept. 1 H, J = 6,2 Hz), 4,18 (dd, 1 H, J = 8,4, 5,3 Hz), 2,51-2,28 (m, 3 H), 2,27-2,12 (m, 1 H), 1,24 (d, 6 H, J = 6,2 Hz). LCMS m/z 172 (M+H)<+>.

Trinn 26B: Fremstilling av isopropvl- 1-( tert- butoksvkarbonvl)- pyrrolidin- 5- on-2( S)- karboksvlat

En løsning av isopropyl-pyrrolidin-5-on-2(S)-karboksylat (produkt fra trinn 26A, 31,9 g, 188 mmol), di-tert-butyl-dikarbonat (48,6 g, 225 mmol) og DM AP (2,30 g, 8,8 mmol) i acetonitril (300 ml) ble omrørt ved romtemperatur under N2i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble inndampet til ca. 100 ml, fortynnet med eter, vasket med 1N HCI deretter mettet vandig NaCI, tørket (MgSCv) og inndampet, hvilket ga isopropyl-1-(tert-butoksykarbonyl)pyrrolidin-5-on-2(S)-karboksylat som en lysegul olje, 50,1 g (99%):<1>H NMR (300 MHz, kloroform-D) 5 5,06 (sept. 1 H, J = 6,2 Hz), 4,53 (dd, 1 H, J = 9,5, 2,9 Hz), 2,66-2,40 (m, 2H), 2,36-2,22 (m, 1 H), 2,03-1,93 (m, 1 H), 1,47 (s, 9 H), 1,26 (d, 3 H, J = 6,2 Hz), 1,24 (d, 3 H, J = 6,2 Hz). LCMS m/z 272 (M+H)<+>. Trinn 26C: Fremstilling av isopropvl- 2( S)-( tert- butoksvkarbonylamino)- 5-hydroksypentanoat

Til en løsning av isopropyl-1-(tert-butoksykarbonyl)pyrrolidin-5-on-2(S)-karboksylat (produkt fra trinn 26B, 49,5 g, 183 mmol) i metanol (300 ml) ble satt natrium-borhydrid (10,0 g, 263 mmol) i -1 g porsjoner over 1,5 timer. Reaksjonsblandingen ble omrørt under nitrogen i ytterligere 10 minutter. Den ble fortynnet med vann, ekstrahert med eter, de kombinerte organiske fraksjoner vasket med mettet vandig NaCI, tørket (MgSCM) og inndampet, hvilket ga en lysegul olje. "Flash" kromatografi (silikagel, 20-30% etylacetat/heksan) ga 31,8 g (64%) isopropyl-2(S)-(tert-butoksykarbonylamino)-5-hydroksypentanoat som en fargeløs sirup:<1>H NMR (300 MHz, kloroform-D) 5 5,16 (brd, 1 H, J = 7,3 Hz), 5,03 (sept., 1 H, J = 6,2 Hz), 4,28 (brd, 1 H, J = 6,2 Hz), 3,67 (br dd, J = 10,2, 5,5 Hz), 1,94-1,79 (m, 2 H), 1,76-1,67 (m, 1 H), 1,66-1,56 (m, 2 H), 1,43 (s, 9 H), 1,25 (d, 3 H, J = 6,2 Hz), 1,23 (d, 3 H, J = 6,2 Hz). LCMS m/z 276 (M+H)<+>.

Trinn 26D: Fremstilling av isopropvl- 5- allvloksv- 2( S)-( tert- butoksvkarbonvlamino) pentanoat

En avgasset blanding av isopropyl-2(S)-(tert-butoksykarbonylamino)-5-hydroksypentanoat (produkt fra trinn 26C, 17,6 g, 63,9 mmol), allyl-metylkarbonat (24,0 ml, 213 mmol), Pd2(dba)3(1,62 g, 1,78 mmol) og BINAP (4,42 g, 7,10 mmol) i THF (150 ml) ble tilbakeløpskokt under nitrogen i 3 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble reaksjonsblandingen fortynnet med eter, filtrert gjennom celite og inndampet, hvilket ga en mørkebrun sirup. "Flash" kromatografi av residuet (silikagel, 30% eter/heksan) ga isopropyl-5-allyloksy-2(S)-(tert-butoksykarbonylamino)pentanoat som en viskøs fargeløs olje, 16,3 g (81%):<1>H NMR (300 MHz, kloroform-D) 5 5,88 (ddt, 1 H, 17,4, 10,4, 5,5), 5,28 (m, 1 H), 5,22-5,11 (m, 1 H), 5,02 (sept., 1 H, J = 6,2 Hz), 4,21 (brt, 1 H, J = 6,7 Hz), 3,94 (dt, 2 H, J = 5,9, 1,5 Hz), 3,42 (t, 2 H, J = 5,9 Hz), 1,90-1,82 (m, 1 H), 1,75-1,57 (m, 3 H), 1,42 (s, 9 H), 1,21 (d, 3 H, J = 6,2 Hz), 1,19 (d, 3 H, J = 6,2 Hz). LCMS m/z 316 (M+H)<+>.

Trinn 26E: Fremstilling av 5- allvloksv- 2( S)-( tert- butoksvkarbonylamino)-pentansvre

En blanding av isopropyl-5-allyloksy-2(S)-(tert-butoksykarbonylamino)-pentanoat (produkt fra trinn 26D, 16,1 g, 51,1 mmol) og litiumhydroksyd-hydrat (4,19 g, 102 mmol) i THF/vann (100 ml/ 20 ml) ble omrørt ved romtemperatur under nitrogen i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med vann, vasket med eter, pH i vandig fraksjon ble regulert til~4, ekstrahert med eter, kombinerte organiske fraksjoner vasket med mettet NaCI, tørket (MgSCv) og inndampet, hvilket ga 5-allyloksy-2(S)-(tert-butoksykarbonylamino)pentansyre som en lysegul sirup:<1>H NMR (300 MHz, kloroform-D) 5 5,89 (ddt, 1 H, J = 17,4, 10,4, 5,5), 5,25 (dd, 1 H, J = 17,4, 1,6 Hz), 5,17 (dd, 1 H, J = 10,4, 1,6 Hz), 4,30 (brd, 1 H, J = 6,2), 3,96 (dt, 2 H, J = 5,9, 1,5 Hz), 3,46 (t, 2 H, J = 5,9 Hz), 1,96-1,86 (m, 1 H), 1,85-1,77 (m, 1 H), 1,75-1,64 (m, 2 H), 1,43 (s, 9 H). LCMS m/z 274 (M+H)<+>.

Trinn 26F Fremstilling av 1-{[ 1-( 5- allvloksv- 2- tetr- butoksvkarbonylamino-pentanovl)- 4-( 6- metoksv- isokinolin- 1- vloksv)- pyrrolidin- 2- karbonvn- amino)- 2-vi nyl- cvklopropa nka rboksvlsvre- etvlester

En løsning av 1-{[4-(6-metoksy-isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinyl-cyklopropankarboksylsyre-etylester-dihydroklorid (Eksempel 22) (3,60 g, 7,25 mmol) og 5-allyloksy-2-tert-butoksykarbonylamino-pentansyre (produktet fra trinn 26E, 1,98 g, 7,25 mmol) i 75 ml DMF ble behandlet med HATU (3,31 g, 8,7 mmol) og N-metylmorfolin (2,79 ml, 25,4 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur under N2i 4 timer og deretter behandlet med pH 4 buffer (biftalat). Den resulterende blandingen ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fasen ble vasket med mettet vandig NaCI, tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. "Flash" kromatografi (silikagel, 10-60% etylacetat/heksan) ga 3,91 g (-79%) av 1-{[1-(5-allyloksy-2-tert-butoksykarbonylamino-pentanoyl)-4-(6-metoksy-isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinyl-cyklopropankarboksylsyre-etylester som et gult sammenfalt skum:<1>H NMR (500 MHz, METANOL-D4) 5 1,05-1,16 (m, 1 H), 1,32 (s, 9 H), 1,37-1,50 (m, 3 H), 1,51-1,67 (m, 3 H), 1,68-1,84 (m, 2 H), 2,17-2,30 (m, 1 H), 2,32-2,50 (m, 1 H), 2,58-2,73 (m, 1 H), 2,80 (s, 1 H), 3,33-3,52 (m, 2 H), 3,86-3,95 (m, 5 H), 4,00-4,06 (m, 1 H), 4,07-4,22 (m, 3 H), 4,23-4,38 (m, 1 H), 4,58-4,67 (m, 1 H), 5,04-5,17 (m, 2 H), 5,18-5,34 (m, 2 H), 5,65-5,94 (m, 3 H), 7,07-7,28 (m, 3 H), 7,82-7,92 (m, 1 H), 7,96-8,13 (m, 1 H). LC-MS (Metode B, retensjonstid: 1,75 min), MS m/ z 681 (M<+>+1).

Trinn 26 G: Fremstilling av 14- tert- butoksvkarbonylamino- 18-( 6- metoksv-isokinolin- 1- vloksv)- 2, 15- diokso- 10- oksa- 3. 16- diaza- tricvklori4. 3. 0. 04, 61-nonad ec- 7- en- 4- karboksvlsvre- etvleste r

En løsning av 1-{[1-(5-allyloksy-2-tert-butoksykarbonylamino-pentanoyl)-4-(6-metoksy-isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester (produktet fra trinn 26F, 2,0 g, 2,94 mmol) i 800 ml benzen ble behandlet med Grubb's andre generasjon katalysator (375 mg, 0,44 mmol). Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 50°C, omrørt under N2i 2 timer og deretter konsentrert i vakuum. "Flash" kromatografi (silikagel, 25-100% etylacetat/heksan) og behandling med aktivert karbon ga 677,6 mg (-35%) av 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(6-metoksy-isokinolin-1 -yloksy)-2,15-diokso-10-oksa-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre-etylester som et brunt sammenfalt skum:<1>H NMR (500 MHz, METANOL-D4) 5 1,06-1,30 (m, 12 H), 1,51-2,03 (m, 6 H), 2,41-2,70 (m, 3 H), 3,39-3,50 (m, 1 H), 3,51-3,61 (m, 1 H), 3,77-3,87 (m, 1 H), 3,92 (s, 3 H), 4,02-4,18 (m, 3 H), 4,24 (d, J=6,41 Hz, 1 H), 4,36-4,48 (m, 1 H), 4,55 (d, J=11,29 Hz, 1 H), 4,65 (t, J=8,39 Hz, 1 H), 5,55-5,72 (m, 2 H), 5,85 (s, 1 H), 7,08 (d, J=8,85 Hz, 1 H), 7,17 (s, 1 H), 7,24 (d, J=5,80 Hz, 1 H), 7,89 (d, J=5,80 Hz, 1 H), 8,16 (d, J=9,16 Hz, 1 H). LC-MS (Metode B, retensjonstid: 1,58 min), MS m/ z 653 (M<+>+1).

Trinn 26H, Fremstilling av Forbindelse 27, 14- tert- butoksvkarbonvlamino- 18-( 6-metoksv- isokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- d iokso- 10- oksa- 3. 16- diazatricvklo[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 4- karboksvlsvre

Til en løsning av 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(6-metoksy-isokinolin-1 -yloksy)-2,15-diokso-10-oksa-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-4-karboksylsyre-etylester (produktet fra trinn 26 G, 667 mg, 1,02 mmol) i 25,7 ml THF ble satt 2,9 ml vann, 11,4 ml metanol og pulverisert litiumhydroksyd (489 mg, 20,4 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 6 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble fordelt mellom etylacetat og 20,4 ml 1N vandig HCI. Til den resulterende løsning ble satt pH 4 buffer (biftalat). Den organiske fasen ble vasket med vann, mettet vandig NaCI, tørket (MgSCM) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. "Flash" kromatografi (silikagel, 0-10% metanol/kloroform) ga 446 mg (-70%) av 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(6-metoksy-isokinolin-1 -yloksy)-2,15-diokso-10-oksa-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre som et svakt rosa sammenfalt skum:<1>H NMR (500 MHz, METANOL-D4) 5 0,99-1,16 (m, 1 H), 1,22 (s, 9 H), 1,50-2,04 (m, 6 H), 2,40-2,73 (m, 3 H), 3,41-3,50 (m, 1 H), 3,51-3,62 (m, 1 H), 3,73-3,86 (m, 1 H), 3,90 (s, 3 H), 4,03 (d, J=10,52 Hz, 1 H), 4,21 (d, J=8,31 Hz, 1 H), 4,42-4,72 (m, 3 H), 5,65 (s, 2 H), 5,82 (s, 1 H), 7,06 (d, J=9,05 Hz, 1 H), 7,15 (s, 1 H), 7,22 (d, J=5,87 Hz, 1 H), 7,87 (m, J=9,29 Hz, 2 H), 8,14 (d, J=8,56 Hz, 1 H). LC-MS (Metode B, retensjonstid: 1,46 min), MS m/ z 625 (M<+>+1).

Trinn 261, Fremstilling av Forbindelse 28, [ 4- cvklopropansulfonvlaminokarbonyl-18-( 6- metoksv- isokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 10- oksa- 3, 16- diaza-tricvklori4. 3. 0. 0461nonadec- 7- en- 14- vll- karbaminsvre- tert- butylester

En løsning av 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(6-metoksy-isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-10-oksa-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4f3>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre (produktet fra trinn 26H, 146,5 mg, 0,235 mmol) og karbonyldiimidazol (76 mg, 0,47 mmol) i 5 ml THF ble omrørt ved tilbakeløp under N2i 2 timer og fikk deretter komme til romtemperatur. Til reaksjonsblandingen ble satt cyklopropansulfonsyre-amid (86 mg, 0,71 mmol) og 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (81 fal, 0,54 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur under N2i 4 timer og deretter behandlet med pH 4 buffer (biftalat). Den resulterende blandingen ble ekstrahert med EtOAc. Den organiske fasen ble vasket med mettet vandig NaCI, tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. "Flash" kromatografi (silikagel, 0-8% metanol/kloroform) ga 111,7 mg (~65%) av [4-cyklopropansulfonylamino-karbonyl-18-(6-metoksy-isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-10-oksa-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester (forbindelse 27) som et hvitt pulver:<1>H NMR (500 MHz, METANOL-D4) 5 0,96-1,17 (m, 6 H), 1,20 (s, 9 H), 1,24-1,32 (m, 1 H), 1,49-1,64 (m, 2 H), 1,65-1,79 (m, 2 H), 1,79-2,06 (m, 2 H), 2,45-2,60 (m, 1 H), 2,62-2,76 (m, 2 H), 2,86-2,98 (m, 1 H), 3,47-3,61 (m, 2 H), 3,62-3,73 (m, 1 H), 3,92 (s, 3 H), 4,00 (d, J=10,38 Hz, 1 H), 4,18 (d, J=10,99 Hz, 1 H), 4,55-4,72 (m, 3 H), 5,44 (t, J=9,92 Hz, 1 H), 5,69-5,78 (m, 1 H), 5,86 (s, 1 H), 7,07 (d, J=7,02 Hz, 1 H), 7,17 (s, 1 H), 7,24 (d, J=5,80 Hz, 1 H), 7,85-7,95 (m, 2 H), 8,18 (d, J=8,85 Hz, 1 H). LC-MS (Metode B, retensjonstid: 1,52 min), MS m/ z 728 (M<+>+1).

Fremstilling av Forbindelse 61

Fremstilling av Forbindelse 61 ble utført som vist i skjemaet ovenfor og ved anvendelse av prosedyrer beskrevet nedenfor:

Fremstilling av Eksempel 28:

Eksempel 28 ble fremstilt ved tilsetning av en DMF-løsning av N-trityl-beskyttet treonin til en DMF-løsning av natriumhydrid avkjølt til -15 C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 30 minutter ved -15 C hvoretter 5-brom-1-penten ble tilsatt og den resulterende blanding ble oppvarmet til -5 C. Reaksjonsblandingen ble holdt ved -5 C i 3 dager etter hvilken tid reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 1N vandig HCI og opparbeidet ved anvendelse av standard ekstraksjonsprosedyrer som beskrevet ovenfor. Eksempel 28 ble oppnådd i ren form ved standard kromatografi-prosedyrer.

Fremstilling av Eksempel 29

Eksempel 29 ble fremstilt ved kobling av Eksempel 28 med Eksempel 22 som vist i skjemaet ved anvendelse av den generelle prosedyre beskrevet ovenfor for fremstilling av strukturelt beslektede Forbindelser og Eksempler.

Fremstilling av Eksempel 30

Eksempel 30 ble fremstilt fra Eksempel 29 som vist i skjemaet ved anvendelse av prosedyrer beskrevet ovenfor for fremstilling av strukturelt beslektede Forbindelser og Eksempler.

Fremstilling av Eksempel 31

Eksempel 31 ble fremstilt fra Eksempel 30 som vist i skjemaet. I tilfellet ble 100 av mg Eksempel 30 oppløst i 2 ml DCM og den resulterende løsning ble behandlet med 82 mikroliter av en 4:1 løsning av vann og trifluoreddiksyre. Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i mange timer hvoretter reaksjonsblandingen ble konsentrert og den resulterende råprodukt-blanding ble renset ved kromatografi for å gi Eksempel 31.

Fremstilling av Forbindelse 61

Forbindelse 61 ble fremstilt fra Eksempel 31 som vist i skjemaet og ved anvendelse av prosedyrer beskrevet ovenfor for fremstilling av beslektede Forbindelser og Eksempler.

Fremstilling av Forbindelse 62, Forbindelse 66 og Forbindelse 70

Forbindelse 62 ble fremstilt fra Forbindelse 61 som vist i skjemaet og ved anvendelse av metodene beskrevet ovenfor for fremstilling av beslektede forbindelser og Eksempler.

Fremstilling av Forbindelse 63, 64, 65. Forbindelse 67, 68, 69, Forbindelse 71.

72. 73

Forbindelser 63, 64, 65, 67, 68, 69, 71, 72 og 73 ble fremstilt som vist i synteseskjemaet ovenfor og ved anvendelse av prosedyrer beskrevet her for syntese av beslektede Eksempler og Forbindelser.

Eksempel 36: Fremstilling av Forbindelse 79 og Forbindelse 80

Trinn 36A: Fremstilling av N- t- butoksvkarbonvl- 3-( 4- pentenyltio)- L- valin-metvlester

Til en løsning av 7,12 g (48 mmol, 1,0 ekv) av L-penicillamin i 100 ml 1,4-dioksan og 25 ml vann ved romtemperatur ble satt 9,60 ml (96 mmol, 2,0 ekv.) av 10N vandig natriumhydroksyd-løsning, fulgt av dråpevis tilsetning av 12,00 ml (101 mmol, 2,1 ekv) av 5-brom-1 -penten over mange minutter. Den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 68 timer. På dette tidspunkt ble 12,50 g (57 mmol, 1,2 ekv.) di-tert-butyl-dikarbonat tilsatt og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i ytterligere 6 timer. Blandingen ble konsentrert under vakuum og residuet ble oppløst i vann. Den vandige blandingen ble vasket med dietyleter, regulert til pH 3 ved anvendelse av 1N saltsyre og deretter ekstrahert med etylacetat. De samlede ekstrakter ble vasket med saltvann, tørket over vannfritt magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert under vakuum.

Råproduktet (12,20 g) ble oppløst i 120 ml vannfri dimetylsulfoksyd. Til denne løsningen ble satt 10,50 g (76 mmol) kaliumkarbonat og 4,70 ml (76 mmol) jodmetan og den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 24 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med vann og ekstrahert med etylacetat. De samlede ekstrakter ble vasket med vann (2X) og saltvann, tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert og konsentrert under vakuum. Kolonnekromatografi på silikagel (eluering: 2 -10% etylacetat/heksan) ga 8,54 g av N-tert-butoksykarbonyl-3-(4-pentenyltio)-L-valin-metylester som en fargeløs olje. NMR (300 MHz, CDCI3): 5 5,76 (d av d av t, 1 H, J = 17,2, 10,3, 6,6 Hz), 5,35 (br d, 1 H, J = 9,0 Hz), 5,05-4,94 (m, 2 H), 4,27 (br d, 1 H, J = 9,0 Hz), 3,73 (s, 3 H), 2,52 (m, 2 H), 2,13 (kvart., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,61 (kvint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,43 (s, 9 H), 1,35 (s, 3 H), 1,33 (s, 3 H).

Trinn 36B: Fremstilling av N- tert- butoksvkarbonvl- 3-( 4- pentenvltio)- L- valin

Til en løsning av 8,52 g (25,7 mmol) N-tert-butoksykarbonyl-3-(4-pentenyltio)-L-valin-metylester i 200 ml tetrahydrofuran ved romtemperatur ble satt en løsning av 1,10 g (26,2 mmol) litiumhydroksyd-monohydrat i 50 ml vann. Den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 65 timer. Til reaksjonsblandingen ble deretter satt 28 ml 1.00N saltsyre. Blandingen ble fortynnet med dietyleter, vasket med vann (3X) og saltvann, tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert og konsentrert under vakuum, hvilket ga 8,10 g av N-tert-butoksykarbonyl-3-(4-pentenyltio)-L-valin som en fargeløs olje.. NMR (300 MHz, CDCI3): 5 5,75 (d av d av t, 1 H, J = 17,2, 10,3, 6,6 Hz), 5,40 (br s, 1 H), 5,05-4,94 (m, 2 H), 4,28 (br s, 1 H), 2,56 (m, 2 H), 2,13 (kvart., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,63 (kvint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,44 (s, 9 H), 1,39 (s, 3 H), 1,37 (s, 3 H).

Trinn 36C: Fremstilling av ( 1S, 4R 6S, 14R 18fl)- 7- c/ s- 14- tert-butoksvkarbonylamino- 13, 13- dimetvl- 18-( 6- metoksv- isokinolin- 1 - yloksv)- 2, 15-diokso- 12- tia- 3, 16- diazatricvklo[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 4- karboksvlsvre

( Forbindelse 79)

Denne forbindelsen ble fremstilt fra N-tert-butoksykarbonyl-3-(4-pentenyltio)-L-valin ved anvendelse av metodene beskrevet i eksempel 24. ESI-massespektrum: m/e: 669 (M+H)<+>, 667 (M-H)"; høyoppløsning massespektrum: beregnet for C34H45N4O8S: 669,2958, funnet: 669,2975; NMR (500 MHz, CD3OD) 5 8,06 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 7,90 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,24 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,16 (s, 1 H), 7,09 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 6,69 (d, 1 H, J = 8,5 Hz), 5,80 (s, 1 H), 5,72 ( quart., 1 H, J = 8,5 Hz), 5,46 (t, 1 H, J = 8,5 Hz), 4,71 (t, 1 H, J = 8,5 Hz), 4,64 (d, 1 H, J = 9,1 Hz), 4,45 (d, 1 H, J = 11,6 Hz), 4,22 (m, 1 H), 3,91 (s, 3 H), 2,78 (m, 1 H), 2,74-2,68 (m, 2 H), 2,56 (m, 1 H), 2,36-2,28 (m, 2 H), 2,21 (m, 1 H), 1,75 (m, 1 H), 1,72-1,64 (m, 2 H), 1,60 (m, 1 H), 1,45 (s, 3 H), 1,39 (s, 3 H), 1,21 (s, 9 H).

Trinn 36D: Fremstilling av ( 1S, 4R 6S, 14R 18f?)- \ 7 - cis - 4 - cvklopropansulfonvl- aminokarbonvl- 13, 13- dimetvl- 18-( 6- metoksvisokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 12- tia- 3, 16- diaza- tricvklon 4. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 14-yllkarbaminsvre- tert- butylester ( Forbindelse 80)

Denne forbindelsen ble fremstilt fra forbindelse 79 ved anvendelse av metoden beskrevet i eksempel 24D. ESI-massespektrum: m/e: 772 (M+H)<+>, 770 (M-H)"; høyoppløsning massespektrum: beregnet for C37H50N5O9S2: 772,3050, funnet: 772,3060; NMR (500 MHz, CD3OD) 5 8,06 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 7,90 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,24 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,17 (s 1 H), 7,08 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 6,62 (d, 1 H, J = 8,5 Hz), 5,83 (s, 1 H), 5,74 (quart., 1 H, J = 8,5 Hz), 5,26 (t, 1 H, J = 8,5 Hz), 4,67 (m, 1 H), 4,46 (m, 2H), 4,19 (m, 1 H), 3,92 (s, 3 H), 2,93 (m, 1 H), 2,74-2,67 (m, 3 H), 2,58-2,48 (m, 3 H), 2,11 (m, 1 H), 1,82-I, 75 (m, 2 H), 1,61 (m, 1 H), 1,54 (m, 1 H), 1,45 (s, 3 H), 1,37 (s, 3 H), 1,27 (m, 1 H), 1,18 (s, 9 H), 1,09 (m, 1 H), 1,07-0,99 (m, 2 H).

Eksempel 37: Fremstilling av Forbindelse 84 og Forbindelse 85

Trinn 37A: Fremstilling av N- tert- butoksvkarbonvl- 0-( 4- pentenyl)- L- serin-metvlester

Til en løsning av 10,26 g (50 mmol, 1,0 ekv) av N-tert-butoksykarbonyl-L-serin i 500 ml vannfri dimetylsulfoksyd ved romtemperatur ble satt 2,00 g (50 mmol, 1,0 ekv) av 60% natriumhydrid i mineralolje. Denne blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 0,5 time inntil utvikling av gass hadde opphørt. Til den resulterende løsning ble satt 6,00 ml (50 mmol, 1,0 ekv) av 5-brom-1-penten umiddelbart fulgt av ytterligere 2,00 g (50 mmol, 1,0 ekv.) av 60% natriumhydrid i mineralolje. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Blandingen ble fortynnet med 2000 ml vann, regulert til pH 3-4 ved tilsetning av 50 ml 1,00N saltsyre og ekstrahert med etylacetat. Den organiske fasen ble vasket med vann (2X) og saltvann, tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert og konsentrert under vakuum. For å fjerne den gjenværende mineralolje ble det resulterende materiale oppløst i en fortynnet vandig natriumhydroksyd-løsning. Denne vandige løsningen ble vasket med heksan og deretter regulert til pH 4 ved anvendelse av saltsyre og ekstrahert med etylacetat. Ekstrakten ble vasket med vann (2X) og saltvann, tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert og konsentrert under vakuum.

Råproduktet (7,70 g) ble oppløst i 100 ml vannfri dimetylsulfoksyd. Til denne løsningen ble satt 7,80 g (56 mmol) kaliumkarbonat og 3,50 ml (56 mmol) jodmetan og den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 24 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med vann og ekstrahert med etylacetat. De samlede ekstrakter ble vasket med vann (2X) og saltvann, tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert og konsentrert under vakuum. Kolonnekromatografi på silikagel (eluering: 2 -10% etylacetat/heksan) ga 6,70 g av N-tert-butoksykarbonyl-0-(4-pentenyl)-L-serin-metylester som en fargeløs olje. NMR (300 MHz, CDCI3): 5 5,78 (d av d av t, 1 H, J = 17,2, 10,2, 6,6 Hz), 5,34 (br d, 1 H, J = 8,0 Hz), 5,03-4,92 (m, 2 H), 4,40 (m, 1 H), 3,81 (d av d, 1 H, J = 9,5, 2,9 Hz), 3,74 (s, 3 H), 3,61 (d av d, 1 H, J = 9,5, 3,5 Hz), 3,42 (m, 2 H), 2,06 (kvart., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,61 (kvint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,44 (s, 9 H).

Trinn 37B: Fremstilling av N- tert- butoksvkarbonvl- 0-( 4- pentenyl)- L- serin

Til en løsning av 6,65 g (23 mmol) N-tert-butoksykarbonyl-0-(4-pentenyl)-L-serin-metylester i 500 ml tetrahydrofuran ved romtemperatur ble satt en løsning av 1,95 g (46 mmol) litiumhydroksyd-monohydrat i 100 ml vann. Den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 40 timer. Til reaksjonsblandingen ble deretter satt 46 ml 1.00N saltsyre. Blandingen ble fortynnet med etylacetat, vasket med vann (3X) og saltvann, tørket over vannfritt natriumsulfat, filtrert og konsentrert under vakuum, hvilket ga 6,30 g av N-tert-butoksykarbonyl-0-(4-pentenyl)-L-serin som en fargeløs olje. NMR (300 MHz, CDCI3): 5 5,77 (d av d av t, 1 H, J = 17,2, 10,2, 6,6 Hz), 5,37 (br d, 1 H, J = 8,0 Hz), 5,03-4,92 (m, 2 H), 4,42 (m, 1 H), 3,87 (d av d, 1 H, J = 9,5, 2,6 Hz), 3,63 (d av d, 1 H, J = 9,5, 4,0 Hz), 3,45 (t, 2 H, J = 6,6 Hz), 2,07 (kvart., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,64 (kvint., 2 H, J = 7,3 Hz), 1,44 (s, 9 H).

Trinn 37C: Fremstilling av ( 1S. 4R6S. 14S. 18lf)- 7- c/ s- 14- tert-butoksvkarbonvlamino- 18-( 6- metoksvisokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 12- oksa-3, 16- diazatricvklo[ 14. 3. 0. 04, 61- nonadec- 7- en- 4- karboksvlsvre ( Forbindelse 84)

Denne forbindelsen ble fremstilt fra N-tert-butoksykarbonyl-3-(4-pentenyltio)-L-valin ved anvendelse av metodene beskrevet i eksempel 26. ESI-massespektrum: m/e: 625 (M+H)<+>, 623 (M-H)"; høy-oppløsning massespektrum: beregnet for C32H41N4O9: 625,2874, funnet: 625,2871; NMR (500 MHz, CD3OD) 5 8,12 (d, 1 H, J = 9,0 Hz), 7,89 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,24 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,17 (s, 1 H), 7,12 (d, 1 H, J = 9,0 Hz), 5,83 (s, 1 H), 5,63 (kvart., 1 H, J = 8,8 Hz), 5,45 (t, 1 H, J = 8,8 Hz), 4,74 (m, 1 H), 4,60 (br s, 1 H), 4,36 (d, 1 H, J = 11,0 Hz), 4,16 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 3,91 (s, 3 H), 3,74 (m, 2 H), 3,62 (m, 1 H), 3,49 (m, 1 H), 2,66 (m, 1 H), 2,57 (m, 1 H), 2,47-2,33 (m, 2 H), 2,19 (m, 1 H), 1,78 (m, 2 H), 1,69 (m, 1 H), 1,48 (m, 1 H), 1,30 (s, 9 H).

Trinn 37D: Fremstilling av ( 1S, 4R6S, 14S, 18f?)- r7- c/ s- 4- cvklopropansulfonvlaminokarbonvl- 18-( 6- metoksv- isokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 12- oksa- 3, 16-diaza- tricvklo[ 14. 3. 0. 04' 61nonadec- 7- en- 14- vn- karbaminsvre- tert- butylester

( Forbindelse 85)

Denne forbindelsen ble fremstilt fra forbindelse 84 ved anvendelse av metoden beskrevet i eksempel 261. ESI-massespektrum: m/e: 728 (M+H)\ 726 (M-H)"; høyoppløsning massespektrum: beregnet for C35H46N5O10S: 728,2966, funnet: 728,2972; NMR (500 MHz, CD3OD) 5 8,12 (m, 1 H), 7,89 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,25 (d, 1 H, J = 5,8 Hz), 7,18 (s, 1 H), 7,12 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 5,89 (s, 1 H), 5,66 (quart., 1 H, J = 8,8 Hz), 5,19 (t, 1 H, J = 8,8 Hz), 4,71 (m, 1 H), 4,52 (br s, 1 H), 4,36 (d, 1 H, J = 10,0 Hz), 4,12 (m, 1 H), 3,92 (s, 3 H), 3,65 (m, 2 H), 3,47 (m, 2 H), 2,92 (m, 1 H), 2,64 (m, 1 H), 2,56 (m, 1 H), 2,45 (m, 2 H), 2,19 (m, 1 H), 1,77 (m, 1 H), 1,70-1,60 (m, 2 H), 1,54 (m, 1 H), 1,28 (s, 9 H), 1,15-0,98 (m, 4 H).

Eksempel 38: Fremstilling av Forbindelse 58:

Trinn 38a: Fremstilling av 1-{[ 1-( 2- tert- butoksvkarbonylamino- non- 8- enovl)- 4-( tert- butvl- dimetvl- silanvloksv)- pvrrolidin- 2- karbonvn- amino)- 2-vinylcvklopropankarboksvlsvre- etylester

Til en blanding av 1-{[1-(2(S)-fetr-butoksykarbonylamino-non-8-enoyl)-4(/?)-hydroksy-pyrrolidin-2(S)karbonyl]-(1R)-amino}-2(S)-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester (1,5 g, 2,87 mmoL) i 10 ml DMF ble satt imidazol (0,25 g, 3,67 mmoL) og tert-butyl-dimetylsilylklorid (516 mg, 3,44 mmoL). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i to dager. Reaksjonsblandingen ble deretter konsentrert i vakuum og residuet ble oppløst i etylacetat. Denne løsningen ble vasket med vann, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum for å oppnå et rått fast stoff. Rensning ved "flash" kromatografi (under eluering med 20% etylacetat i heksan) ga 1,43 g (78%) av 1-{[1-(2-tert-butoksykarbonylamino-non-8-enoyl)-4-(tert-butyl-dimetyl-silanyloksy)-pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester som et hvitt, fast stoff.

<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) 5 0,10 (s,6 H), 0,89 (s, 9 H), 1,22 (m, 3 H), 1,31-1,48 (m, 16 H), 1,50-1,75 (m, 3 H), 2,06 (m, 3 H), 2,11-2,33 (m, 2 H), 3,70 (m, 2 H), 4,03-4,19 (m, 2 H), 4,21 (m, 1 H), 4,45 (t, J=7,87 Hz, 1 H), 4,59 (m, 1 H), 4,91 (d, J=9,15 Hz, 1 H), 4,98 (d, J=17,20 Hz, 1 H), 5,08 (dd, J=10,25, 1,83 Hz, 1 H), 5,27 (dd, J=17,38, 1,65 Hz, 1 H), 5,65-5,87 (m, 2 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 4,00 min), MS m/ z 636 (M<+>+1).

Trinn 38b: Fremstilling av 14- tert- butoksykarbonylamino- 18-( tert- butyl- dimetyl-silanvloksv)- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza- tricvkloH 4. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 4-karboksvlsyre- etylester

Til en løsning av 1-{[1-(2-tert-butoksykarbonylamino-non-8-enoyl)-4-(tert-butyl-dimetyl-silanyloksy)-pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester (1,63 g, 2,56 mmoL) i 640 ml metylenklorid ble satt 215 mg (0,26 mmol) tricykloheksylfosfin[1,3-bis(2,4,6-tri[benzyliden]ruthenium(IV)diklorid. Blandingen ble oppvarmet ved tilbakeløp i 15 min. Residuet ble konsentrert i vakuum og deretter renset ved "flash" kromatografi under eluering med 30% etylacetat/heksan. For ytterligere å avfarge prøven ble råproduktet kromatografert en andre gang under eluering med 50% eter i heksan, hvilket ga 1,5 g (96%) av 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(tert-butyl-dimetyl-silanyloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre-etylester som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (500 MHz, CD3CI) 5 0,06 (s, 3 H), 0,07 (s, 3 H), 0,86 (s, 9 H), 1,18-1,24 (m, 6 H), 1,34-1,64 (m, 14 H), 1,86-1,96 (m, 3 H), 2,02-2,09 (m, 1 H), 2,11-2,17 (m, 1 H), 2,19-2,28 (m, 1 H), 2,57-2,63 (m, 1 H), 3,50-3,54 (m, 1 H), 3,71 (dd, J=10,22, 6,26 Hz, 1 H), 4,06-4,17 (m, 2 H), 4,52-4,58 (m, 2 H), 4,75 (d, J=8,55 Hz, 1 H), 5,21 (t, J=9,92 Hz, 1 H), 5,35 (d, J=7,63 Hz, 1 H), 5,45-5,50 (m, 1 H), 6,94 (s,1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,88 min), MS m/ z 608 (M<+>+1).

Trinn 38c: Fremstilling av 14- tert- butoksvkarbonylamino- 18-( tert- butvl- dimetvl-silanvloksv)- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza- tricvkloH 4. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 4-karboksvlsvre

Til en løsning av 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(tert-butyl-dimetyl-silanyloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre-etylester (1,5 g, 2,47 mmol) i et blandet løsningsmiddelsystem av THF (4 ml), metanol (1 ml) og vann (2 ml), ble satt pulverisert litiumhydroksyd-monohydrat (1,0 g, 50 mmoL). Den lysegule oppslemning ble omrørt ved romtemperatur under N2i 4 timer. Blandingen ble deretter konsentrert i vakuum og residuet fordelt mellom eter og vann. Eterfasen ble kastet og den vandige fasen ble behandlet med 1N HCI inntil den nådde pH 4. Denne sure løsningen ble ekstrahert med EtOAc (3x). De samlede EtOAc-ekstrakter ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga 1,2 g (84%) av 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(tert-butyl-dimetyl-silanyloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre som et gråhvitt, fast stoff.<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) 0,12 (s, 6 H), 0,89 (s, 9 H), 1,23-1,64 (m, 17 H), 1,70-1,87 (m, 1 H), 1,90-2,49 (m, 6 H), 3,70-3,80 (m,1 H), 3,83-3,90 (m, 1 H), 4,28-4,36 (m, 1 H), 4,47-4,55 (m, 1 H), 4,65 (s, 1 H), 5,30-5,39 (m, 1 H), 5,53-5,62 (m, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,69 min), MS m/ z 580 (M<+>+1).

Trinn 38d: Fremstilling av [ 18-( tert- butvl- dimetvl- silanyloksv)- 4- cvklopropansulfonvlaminokarbonvl- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza- tricvklori4. 3. 0. 04, 61nonadec- 7-en- 14- vn- karbaminsvre- tert- butylester

14-tert-butoksykarbonylamino-18-(tetr-butyl-dimetyl-silanyloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre (500 mg, 0,86 mmoL) ble oppløst i 25 ml THF og behandlet med CDI (180 mg, 1,12 mmoL). (Fuktighet ble omhyggelig unngått ved å anvende ovnstørket glassvare og holde en tørr N2-atmosfære). Etter tilbakeløpsbehandling av reaksjonsblandingen i 2 timer ble den avkjølt til romtemperatur og behandlet sekvensielt med cyklopropylsulfonamid (135 mg, 1,12 mmoL) og DBU (170 mg, 1,12 mmoL). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 4 timer ved romtemperatur og THF ble fjernet ved rotasjonsinndampning. Residuet ble fordelt mellom etylacetat og pH 4 buffer. Den organiske fasen ble tørket (MgSCv) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. Det ble deretter renset ved "flash" kromatografi (under eluering med 33% etylacetat i heksan), hvilket ga 300 mg (51 %) av [18-(tert-butyl-dimetyl-silanyloksy)-4-cyklopropansulfonylamino-karbonyl-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) 5 1H 0,07 (s, 3 H), 0,08 (s, 3 H), 0,85 (s, 9 H), 0,87-1,49 (m, 21 H), 1,73-1,95 (m, 3 H), 2,08-2,16 (m, 1 H), 2,25-2,36 (m, 2 H), 2,42-2,56 (m, 1 H), 2,85-2,93 (m, 1 H), 3,65-3,74(dd, J=10,61, 3,66 Hz, 1 H), 3,89 (d, J=10,25 Hz, 1 H), 4,34 (m, J=9,70, 9,70 Hz, 1 H), 4,43 (t, J=7,87 Hz, 1 H), 4,57 (s, 1 H), 4,94-5,01 (m, 1 H), 5,10 (d, J=8,78 Hz, 1 H), 5,66-5,75 (m, 1 H), 6,55 (s, 1 H), 10,13 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,81 min), MS m/ z 683 (M<+>+1).

Trinn 38e: ( 4- cyklopropansulfonvlaminokarbonyl- 18- hydroksv- 2, 15- diokso- 3, 16-diaza- tricvklo[ 14. 3. 0. 04' 61nonadec- 7- en- 14- vl)- karbaminsvre- tert- butylester

Til en blanding av [18-(tert-butyl-dimetylsilanyloksy)-4-cyklopropan-sulfonylaminokarbonyl-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.04,6]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester (330 mg, 0,48 mmoL) i 25 ml THF ble satt tetrabutylammoniumfluorid (150 mg, 0,54 mmoL). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer og deretter ble THF fjernet ved rotasjonsinndampning. Residuet ble fordelt mellom etylacetat og vann. Den organiske fasen ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. Det ble deretter renset ved utgnidning med heksan, hvilket ga 200 mg (73%) av (4-cyklopropansulfonylaminokarbonyl-18-hydroksy-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl)-karbaminsyre-tert-butylester som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (500 MHz, CD3CI) 5 1,87-1,64 (m, 21 H), 1,70-1,98 (m, 3 H), 2,15-2,56 (m, 5 H), 2,85-2,94 (m, 1 H), 3,71 (d, J=13,91 Hz, 1 H), 4,10-4,26 (m, 2 H), 4,51 (t, J=7,87 Hz, 1 H), 4,62 (s, 1 H), 4,98 (m, 1 H), 5,06 (d, J=8,78 Hz, 1 H), 5,64-5,71 (m, 1 H), 6,72 (s, 1 H), 10,24 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 2,85 min), MS m/z 569 (M<+>+1).

Trinn 38f: Fremstilling av forbindelse 58: r( Z)-( 1S. 4R. 14S. 18R)- 4- cvklopropansulfonvlaminokarbonvl- 2, 15- diokso- 18-( 3- fenvl- isokinolin- 1- vloksv)- 3, 16- diazatricvklo[ 14. 3. 0. 04, 6lnonadec- 7- en- 14- vll- karbaminsvre- tert- butvlester

Til en blanding av (4-cyklopropansulfonylaminokarbonyl-18-hydroksy-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl)-karbaminsyre-tert-butylester (20 mg, 0,035 mmoL) i 1 ml DMF ble satt kalium-t-butoksyd (22 mg, 0,196 mmoL). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 5 min og deretter ble 1-klor-3-fenylisokinolin (15 mg, 0,062 mmoL) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 15 timer og deretter konsentrert i vakuum. Dette råprodukt ble utgnidd med eter. Residuet ble oppløst i MeOH og deretter renset ved preparativ HPLC.(YMC XTERRA, S5, 19x100 mm, gradient: 60% B til 100% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 25 ml/min), hvilket ga 10 mg (39%) av forbindelse 58, [(Z)-(1S,4R,14S,18R)-4-cyklopropansulfonyl-aminokarbonyl-2,15-diokso-18-(3-fenyl-isokinolin-1 -yloksy)-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester, som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (500 MHz, CD3CI) 5 0,90-1,64 (m, 21 H), 1,76-1,97 (m, 3 H), 2,26-2,31 (m, 1 H), 2,52-2,63 (br s, 1 H), 2,69-2,81 (m, 2 H), 2,88-2,93 (m, 1 H), 4,11 (d, J=11,60 Hz, 1 H), 4,33 (m, 1 H), 4,61 (d, J=7,94 Hz, 2 H), 4,99 (t, J=9,31 Hz, 1 H), 5,05 (d, J=7,93 Hz, 1 H), 5,69-5,74 (m, 1 H), 6,08 (s, 1 H), 6,60 (s, 1 H), 7,38-7,47(m, 2 H), 7,50 (t, J=7,63 Hz, 2 H), 7,63 (t, J=7,32 Hz, 1 H), 7,71 (s, 1 H), 7,77 (d, J=8,24Hz, 1 H), 8,10 (d, J=7,32Hz, 2 H), 8,18 (d, J=7,93 Hz, 1 H), 10,27 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,72 min), MS m/z 772 (M++1).

Eksempel 39: Fremstilling av forbindelser 144 og 145

Trinn 39a: Fremstilling av ( S)- 2-( tert- butoksvkarbonvl)- 3-( 2- nitro- N-( pent-4- enyl) fenvlsulfonamido) propansyre v

Fremstilling av ( S)- metvl- 3- amino- 2-( tert- butoksvkarbonyl) propanoat // : Til en blanding av / (Boc-DAP-OH)(3,0 g 14,7 mmol) i 50 ml metylenklorid ble satt 5 ml metanol. Til denne løsningen ble langsomt satt (trimetylsilyl)diazometan (2 M i eter, 7,9 ml, 15,8 mmoL). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer inntil alt det faste stoffet var oppløst og løsningen ble lysegul. Den ble deretter konsentrert, hvilket ga 3,2 g (99%) av (S)-metyl-3-amino-2-(tert-butoksykarbonyl)propanoat ti som en fargeløs olje. 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) 5 1,46 (s, 9 H), 2,82-3,00 (m, 2 H), 3,71 (s, 3 H), 4,14 (brs, 1 H).

Fremstilling av ( S)- metyl- 2-( tert- butoksvkarbonvl)- 3-( 2- nitrofenyl-sulfonamido) propanoat tii: Til en blanding av (S)-metyl-3-amino-2-(tert-butoksykarbonyl)-propanoat ti (1,6 g, 7,3 mmoL) i DCM (50 ml) ble satt DIPEA (1,64 ml, 9,4 mmoL) og 2-nitrobenzensulfonylklorid (1,62 g, 7,3 mmoL). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Den ble deretter konsentrert, oppløst i etylacetat, som deretter ble vasket med mettet natriumbikarbonat, saltvann og tørket over magnesiumsulfat. Den ble deretter filtrert og konsentrert, hvilket ga 2,9 g (98%) av (S)-metyl-2-(tert-butoksykarbonyl)-3-(2-nitrofenylsulfonamido)propanoat tii som et gult skum.<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz) 5 1,41 (s, 9 H), 3,36-3,51 (m, 2 H), 3,71 (s, 3 H), 4,22 (m, 1 H), 7,80-7,90 (m, 3 H), 8,07-8,10 (m, 1 H).

Fremstilling av ( S)- metvl- 2-( tert- butoksvkarbonvl)- 3-( 2- nitro- N-( pent- 4-envl) fenylsulfonamido) propanoat iv .

Til en blanding av (S)-metyl-2-(tert-butoksykarbonyl)-3-(2-nitrofenylsulfonamido)-propanoat i77 (150 mg, 0,37 mmol) i 3 ml DMF ble satt kaliumkarbonat (102 mg, 0,74 mmoL). Denne blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 20 min fulgt av tilsetning av 5-brom-1 -penten (65^L, 0,55 mmoL). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 dager. Den ble deretter filtrert, konsentrert og renset ved silikagel-kromatografi (under eluering med 25% etylacetat i heksan), hvilket ga 75 mg (43%) av (S)-metyl 2-(tert-butoksykarbonyl)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enyl)fenylsulfonamido)propanoat iVsom et gult, fast stoff.<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz) 5 1,42 (s, 9 H), 1,54-1,64 (m, 2 H), 1,97 (q, J=7,20 Hz, 2 H), 3,37 (m, 2 H), 3,57-3,80 (m, 2 H), 3,72 (s, 3 H), 4,42 (dd, J=8,60, 5,31 Hz, 1 H), 4,91-5,01 (m, 2 H), 5,69-5,79 (m, 1 H), 7,75-7,85

(m, 3 H), 8,04 (m, 1 H). LC-MS (Metode D, retensjonstid: 2,68 min), MS m/ z 372 (M<+>+1-Boc).

Fremstilling av ( S)- 2-( tert- butoksvkarbonyl)- 3-( 2- nitro- N-( pent- 4-enyl) fenvlsulfonamido) propansyre v .

(S)-metyl-2-(tert-butoksykarbonyl)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enyl)fenylsulfonamido)-propanoat #V(500 mg, 1,06 mmol) ble oppløst i det blandede løsningsmiddelsystem: THF (4 ml), metanol (1 ml) og vann (2 ml). Pulverisert litiumhydroksyd (250 mg, 10,4 mmol) ble tilsatt. Den lysegule oppslemning ble omrørt ved romtemperatur i 15 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble fordelt mellom eter og vann. Eterfasen ble kastet og den vandige fasen ble behandlet med 1 N HCI inntil pH var 4. Denne sure løsningen ble ekstrahert med etylacetat fire ganger. De samlede etylacetat-ekstrakter ble tørket (MgSCu) og konsentrert i vakuum, hvilket ga 430 mg (89%) av (S)-2-(tert-butoksykarbonyl)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enyl)fenylsulfonamido)propansyre v som en gul olje.<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz) 5 1,38 (s, 9 H), 1,51-1,60 (m, 2 H), 1,89-1,98 (m, 2 H), 3,28-3,32 (m, 2 H), 3,59-3,64 (dd, J=14,95, 9,46 Hz, 1 H), 3,71-3,74 (m, 1 H), 4,33 (dd, J=9,61, 4,43 Hz, 1 H), 4,87-4,94 (m, 2 H), 5,63-5,72 (m, 1 H), 7,71-7,77 (m, 3 H), 8,01 (dd, J=7,48, 1,37 Hz, 1 H). LC-MS (Metode D, retensjonstid: 2,04 min), MS m/ z 358 (M<+>+1-Boc).

Trinn 39b: Fremstilling av ( 1R. 2S)- etvl- 1-(( 3R. 5S)- 1-(( S)- 2-( tert-butoksvkarbonvl)- 3-( 2- nitro- N-( pent- 4- envl) fenylsulfonamido) propanovl)-3-( isokinolin- 1- vloksv) pyrrolidin- 5- karboksamido)- 2-vinylcyklopropankarboksvlat

(S)-2-(tert-butoksykarbonyl)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enyl)fenylsulfon-amido)propansyre (1,10 g, 2,40 mmol) oppløst i 20 ml DCM ble behandlet sekvensielt med 1-{[4-(isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinyl-cyklopropankarboksylsyre-etylester-bis-hydroklorid (1,27 g, 2,72 mmol), N-metylmorfolin (0,92 ml, 8,34 mmol) og HATU (PE biosystems) (1,28 g, 3,36 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur under N2i 15 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble fordelt mellom etylacetat og pH 4 buffer (biftalat). Den organiske fasen ble vasket med mettet vandig NaHC03, tørket (MgSCvi) og konsentrert i vakuum, hvilket ga 2,0 g av råproduktet. "Flash" kromatografi (30% heksan/etylacetat) ga 1,4 g (70%) av (1R.2S)-etyl-1-((3R,5S)-1-((S)-2-(tert-butoksykarbonyl)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enyl)fenylsulfonamido)propanoyl)-3-(isokinolin-1-yloksy)pyrrolidin-5-karboksamido)-2-vinylcyklopropankarboksylat som et blårødt fast stoff.<1>H NMR (CD3OD, 500 MHz) 5 1,23-1,31 (m, 9 H), 1,46-1,52 (m, 4 H), 1,59 (brs, 1 H), 1,66 (br s, 1 H), 1,74 (dd, J=7,93, 5,19 Hz, 1 H), 2,00 (br s, 2 H), 2,29 (q, J=8,95 Hz, 1 H), 2,47 (m, 1 H), 2,72 (m, 1 H), 3,38-3,51 (m, 2 H), 3,68 (m, 2 H), 4,09-4,26 (m, 3 H), 4,37 (d, J=11,29 Hz, 1 H), 4,64 (m, 1 H), 4,72 (m, 1 H), 4,95 (d, J=10,99 Hz, 1 H), 4,99 (dd, J=18,92, 1,53 Hz, 1 H), 5,12 (d, J=10,68 Hz, 1 H), 5,32 (d, J=17,40 Hz, 1 H), 5,73-5,86 (m, 2 H), 5,92 (s, 1 H), 7,36 (m,1 H), 7,58 (m,1 H), 7,73 (m, 1 H), 7,80-7,88 (m, 4 H), 7,99 (m, 1 H), 8,11 (m,1 H), 8,24 (d, J=8,24 Hz, 1 H). LC-MS (Metode D, retensjonstid: 3,15 min), MS m/ z 835 (M<+>+1).

Trinn 39c:

En løsning av (1R,2S)-etyl-1-((3R,5S)-1-((S)-2-(tert-butoksykarbonyl)-3-(2-nitro-N-(pent-4-enyl)fenylsulfonamido)propanoyl)-3-(isokinolin-1-yloksy)pyrrolidin-5-karboksamido)-2-vinylcyklopropan-karboksylat (1,40 g, 1,67 mmol) og tricykloheksylfosfin[1,3- bis(2,4,6-trimetylfenyl)-4,5-dihydroimidazol-2-yliden][benzyliden]ruthenium(IV)-diklorid (Aldrich), (204 mg, 0,24 mmol) i 1500 ml metylenklorid ble tilbakeløpskokt under N2. Kort etter at den nådde tilbakeløpstemperatur ble reaksjonsblandingen homogen og lysoransje av farge. Etter tilbakeløpsbehandling i 2 timer ble den mørke oransje reaksjonsblanding avkjølt til romtemperatur og konsentrert i vakuum, hvilket ga 1,7 g av en oransje olje. "Flash" kromatografi (30% heksan/etylacetat) ga 1,1 g (82%) av esteren vist ovenfor som et blårødt fast stoff.<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz) 5 1,11-1,31 (m, 12 H), 1,51-1,80 (m, 4 H), 1,97-2,15 (m, 2 H), 2,34-2,50 (m, 2 H), 2,62-2,69 (m, 1 H), 3,17-3,33 (m, 2 H), 3,44-3,60 (m, 2 H), 4,01-4,05 (m, 1 H), 4,12 (q, J=7,32 Hz, 2 H), 4,37 (d, J=13,17 Hz, 1 H), 4,58 (t, J=8,42 Hz, 1 H), 4,71 (m, 1 H), 5,61 (m, 2 H), 5,88 (s, 1 H), 6,91 (d, J=9,15 Hz, 1 H), 7,30 (d, J=5,49 Hz, 1 H), 7,52 (t, J=7,50 Hz, 1 H), 7,66-7,73 (m, 1 H), 7,76-7,80 (m, 4 H), 7,95 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 8,11 (d, J=7,32 Hz, 1 H), 8,17 (d, J=8,05 Hz, 1 H), 8,84 (s, 1 H). LC-MS (Metode D, retensjonstid: 2,91 min), MS m/ z 807 (M<+>+1). Trinn 39d: Fremstilling av forbindelse 144

Etylesteren fremstilt i trinn 39c (1,1 g, 1,3 mmol) ble oppløst i det blandede løsningsmiddelsystem: THF (16 ml), metanol (4 ml) og vann (8 ml). Pulverisert litiumhydroksyd-hydrat (540 mg, 13,2 mmol) ble tilsatt. Den lysegule oppslemningen ble omrørt ved romtemperatur i 15 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble fordelt mellom eter og vann. Eterfasen ble kastet og den vandige fasen ble behandlet med 1 N HCI inntil pH ble 4. Denne sure løsningen ble ekstrahert med etylacetat fire ganger. De samlede etylacetat-ekstrakter ble tørket (MgSCu) og konsentrert i vakuum, hvilket ga 878 mg (85%) av forbindelse 144 som et blårødt fast stoff.<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz) 5 1,11, 1,31 (s, 9 H), 1,56-1,68 (m, 4 H), 2,04-2,16 (m, 2 H), 2,42-2,66 (m, 2 H), 2,68-2,75 (m, 1 H), 3,22-3,30 (m, 2 H), 3,48-3,63 (m, 2 H), 4,02-4,14 (m, 1 H), 4,46 (d, J=12,44 Hz, 1 H), 4,62 (t, J=8,42 Hz, 1 H), 4,70-4,73 (m, 1 H), 5,64 (m, 2 H), 5,90 (s, 1 H), 7,36 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 7,57 (t, J=7,68 Hz, 1 H), 7,71-7,87 (m, 5 H), 7,98 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 8,15 (m, 1 H), 8,22 (d, J=8,05 Hz, 1 H). LC-MS (Metode D, retensjonstid: 2,78 min), MS m/ z 779 (M<+>+1).

Trinn 39e: Fremstilling av forbindelse 145

Forbindelse 144 (0,878 g, 1,1 mmol) ble oppløst i 15 ml THF og behandlet med CDI (255 mg, 1,58 mmol). (Fuktighet ble omhyggelig unngått ved anvendelse av ovnstørket glassvare og oppretholdelse av en tørr N2-atmosfære). Etter tilbakeløpsbehandling av reaksjonsblandingen i én time ble den avkjølt til romtemperatur og behandlet sekvensielt med cyklopropylsulfonamid (194 mg, 1,6 mmol) og DBU (245 mg, 1,6 mmol). Etter omrøring i 24 timer ved romtemperatur ble THF fjernet ved rotasjonsinndampning. Residuet ble fordelt mellom etylacetat og pH 4 buffer. Den organiske fasen ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. "Flash" kromatografi (3% MeOH/metylenklorid) ga 0,68 g (70%) av forbindelse 145 som et hvitt, fast stoff. 1H NMR (CD3OD, 300 MHz) 5 1,07-1,37 (m, 13 H), 1,11 (s, 9 H), 1,60-1,78 (m, 4 H), 1,97-2,02 (m, 1 H), 2,28-2,35 (m, 1 H), 2,44-2,51 (m, 1 H), 2,75-2,68 (m, 1 H), 2,75-2,80 (m, 1 H), 2,94-3,00 (m, 1 H), 3,20-3,25 (m, 1 H), 3,28-3,47 (m, 2 H), 3,57-3,62 (m, 1 H), 4,05-4,08 (m, 1 H), 4,51 (d, J=12,21 Hz, 1 H), 4,65-4,68 (m, 1 H), 4,84 (m, 1 H), 5,15-5,23 (m, 1 H), 5,70-5,75 (m, 1 H), 5,94 (s, 1 H), 7,35 (d, J=6,10 Hz, 1 H), 7,57 (t, J=7,32 Hz, 1 H), 7,74 (t, J=7,78 Hz, 1 H), 7,78-7,89 (m, 4 H), 8,00 (d, J=5,80 Hz, 1 H), 8,20-8,25 (m, 2 H). LC-MS (Metode D, retensjonstid: 2,89min), MS m/ z 882 (M<+>+1).

Eksempel 40: Fremstilling av Forbindelse 151

Til en blanding av forbindelse 145 (680 mg, 0,77 mmol) i acetonitril (20 ml) ble satt kaliumkarbonat (319 mg, 2,31 mmol) og benzentiol (186 mg, 1,69 mmol). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble fortynnet med vann og denne vandige løsning ble regulert til pH 5 med 1 N HCI. Et hvitt, fast stoff utfelte i løsningen. Denne heterogene blandingen ble ekstrahert med etylacetat (3x). De samlede ekstrakter ble tørket (MgS04) og konsentrert, hvilket ga et lysegult fast stoff. Dette rå faste stoff ble deretter utgnidd med heksan mange ganger, hvilket ga 510 mg (95%) av forbindelse 151 som et gråhvitt fast stoff.<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz) 5 1,06-1,88 (m, 13 H), 1,23, 1,31 (s, 9 H), 1,65 (dd, J=9,70, 5,67 Hz, 1 H), 1,80 (dd, J=8,23, 5,67 Hz, 2 H), 2,03 (brs, 1 H), 2,18 (brs, 1 H), 2,37-2,52 (m, 3 H), 2,85-2,99 (m, 2 H), 3,09-3,15 (m, 1 H), 3,27 (m, 1 H), 3,44 (m, 2 H), 4,15-4,20 (m, 1 H), 4,46 (m, 1 H), 4,74-4,85 (m, 2 H), 5,32 (t, J=10,25 Hz, 1 H), 5,71 (m, 1 H), 5,98(br s, 1 H), 7,37 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 7,58 (t, J=8,23 Hz, 1 H), 7,74 (t, J=7,68 Hz, 1 H), 7,85 (d, J=8,05 Hz,1 H), 8,00 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 8,22 (d, J=8,05 Hz, 1 H). LC-MS (Metode D, retensjonstid: 2,01 min), MS m/ z 697 (M<+>+1).

Eksempel 41: Fremstilling av Forbindelse 146

Til en blanding av forbindelse 151 (20 mg, 0,029 mmol) i 2 ml DCM ble satt trietylamin (14 mg, 0,138 mmol) og eddiksyreanhydrid (8 mg, 0,078 mmol). Denne reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble oppløst i metanol og renset ved preparativ HPLC (YMC XTERRA, S5, 30x50 mm, gradient: 45% B til 85% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 25 ml/min), hvilket ga 10 mg (47%) av forbindelse 146 som et hvitt, fast stoff, 1H NMR (CD3OD, 300 MHz, 60°C) 5 1,08-1,22 (m, 13 H), 1,55-1,74 (m, 4 H), 2,09-2,21 (m, 2 H), 2,13 (s, 3 H), 2,33-2,48 (m, 2 H), 2,66-2,75 (m, 1 H), 2,90-2,99 (m, 1 H), 3,12-3,25 (m, 2 H), 3,45-3,60 (m, 2 H), 3,75-3,84 (m, 1 H), 4,98-4,05 (m, 1 H), 4,70 (t, J=7,68 Hz, 1 H), 4,89-4,97 (m, 1 H), 5,26 (t, J=10,43 Hz, 1 H), 5,2-5,75 (m, 1 H), 5,92 (s, 1 H), 7,29 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 7,50 (t, J=7,50 Hz, 1 H), 7,64-7,69 (m, 1 H), 7,77 (m, 1 H), 7,95 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 8,18 (d, J=8,78 Hz, 1 H). LC-MS (Metode D, retensjonstid: 2,64 min), MS m/ z 739 (M++1).

Eksempel 42: Fremstilling av Forbindelse 147

Til en blanding av forbindelse 151 (100 mg, 0,144 mmol) i 5 ml DMF ble satt kaliumkarbonat (40 mg, 0,290 mmol) og metyljodid (13^L, 0,21 mmol). Denne reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Den ble deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble oppløst i metanol og renset ved preparativ HPLC (YMC XTERRA, S5, 30x50 mm, gradient: 45% B til 70% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 25 ml/min), hvilket ga 75 mg (73%) av forbindelse 147 som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz, 60 °C) 5 1,02-1,28 (m, 13 H), 1,64 (dd, J=9,70, 5,67 Hz, 1 H), 1,72-1,81(m, 2 H), 1,91-2,10 (m, 1 H), 2,13-2,30

(m, 1 H), 2,36-2,50 (m, 2 H), 2,54-2,68 (m, 1 H), 2,76-2,99 (m, 2 H), 3,05 (s, 3 H), 3,11-3,46 (m, 4 H), 3,79-3,96 (m, 1 H), 4,17 (m, 1 H), 4,76 (m, 2 H), 5,31 (t, J=10,06 Hz, 1 H), 5,71 (m, 1 H), 5,99 (s, 1 H), 7,33 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 7,55 (t, J=7,50 Hz, 1 H), 7,70 (t, J=7,68 Hz, 1 H), 7,81 (m, 1 H), 7,96 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 8,17 (d, J=8,42 Hz, 1 H). LC-MS (Metode D,

retensjonstid: 1,98 min), MS m/ z 711 (M<+>+1).

Eksempel 43: Fremstilling av Forbindelse 148

Til en blanding av forbindelse 151 (20 mg, 0,029 mmol) i 2 ml DCM ble satt diisopropylamin (15^L, 0,086 mmol) og metyl-klorformiat (8 mg, 0,085 mmol). Denne reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble oppløst i metanol og renset ved preparativ HPLC (YMC XTERRA, S5, 30x50 mm, gradient: 50% B til 90% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 25 ml/min), hvilket ga 15 mg (69%) av forbindelse 148 som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz) 5 1,09 (s, 9 H), 1,07-1,45 (m, 13 H), 1,56-1,61 (m, 1 H), 1,70-1,76 (m, 3 H), 2,95-2,10 (m, 1 H), 2,13-2,26 (m, 1 H), 2,33-2,55 (m, 2 H), 2,71-2,78 (m, 1 H), 2,93-3,02 (m, 1 H), 3,33 (m, 2 H), 3,48-3,57 (m, 2 H), 3,75 (s, 3 H), 4,04-4,12 (m,1 H), 4,64 (t, J=8,42Hz, 1 H), 4,90 (m, 2 H), 5,19 (t, J=10,25 Hz, 1 H), 5,69-5,77 (m, 1 H), 5,93 (s, 1 H), 7,34 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 7,55 (t, J=6,95 Hz, 1 H), 7,72 (t, J=7,32 Hz, 1 H), 7,83 (d, J=7,32 Hz, 1 H), 7,98 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 8,20 (d, J=8,42 Hz, 1 H), 9,21 (s, 1 H). LC-MS (Metode D, retensjonstid: 2,75 min), MS m/ z 755 (M<+>+1).

Eksempel 44: Fremstilling av Forbindelse 150

Til en blanding av forbindelse 151 (20 mg, 0,029 mmol) i 2 ml DCM ble satt diisopropylamin (15^L, 0,086 mmol) og tert-butyl-isocyanat (8 , 0,058 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble oppløst i metanol og renset ved preparativ HPLC (YMC XTERRA, S5, 30x50 mm, gradient: 55% B til 90% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 25 ml/min), hvilket ga 15 mg (65%) av forbindelse 150 som et hvitt, fast stoff (15 mg, 65%).<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz) 5

1,06-1,34 (m, 13 H), 1,21 (s, 9 H), 1,40 (s, 9 H), 1,58-1,75 (m, 3 H), 1,97-2,09 (m, 1 H), 2,11-2,23 (m, 1 H), 2,37-2,50 (m, 2 H), 2,69-2,82 (m, 1 H), 2,94-3,04 (m, 1 H), 3,22 (m, 1 H), ,36-3,46 (m, 2 H), 4,12 (d, J=12,44 Hz, 1 H), 4,39 (d, J=11,34 Hz, 1 H), 4,50-4,57 (m, 1 H), 4,69 (t, J=8,23 Hz, 1 H), 5,20-5,27 (m, 1 H), 5,69-5,78 (m, 1 H), 5,90 (s, 1 H), 7,34 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 7,57 (t, J=7,14Hz, 1 H), 7,73 (m, 1 H), 7,83 (m, 1 H), 7,98 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 8,24 (d, J=8,05 Hz, 1 H). LC-MS (Metode D, retensjonstid: 3,04 min), MS m/ z 796 (M<+>+1).

Eksempel 45: Fremstilling av Forbindelse 153

Til en blanding av forbindelse 151 (20 mg, 0,029 mmol) i 2 ml

DCM ble satt diisopropylamin (15^L, 0,086 mmol) og

metansulfonylklorid (5 L 0,065 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble oppløst i metanol og renset ved preparativ HPLC (YMC XTERRA,

S5, 30x50 mm, gradient: 50% B til 90% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 25 ml/min), hvilket ga 17 mg (76%) av forbindelse 153 som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (CD3OD, 300 MHz) 5 1,02-1,49(m,

13 H), 1,59 (m, 1 H), 1,72-1,86 (m, 3 H), 1,96-2,09 (m, 1 H), 2,37-2,50

(m, 2 H), 2,63-2,80 (m, 2 H), 2,91-3,08 (m, 5 H), 2,97 (s, 3 H), 3,22-3,45 (m, 3 H), 4,19 (dd, J=11,89, 3,48 Hz, 1 H), 4,52 (d, J=11,71 Hz, 1 H),

4,62 (dd, J=9,88, 7,32 Hz, 1 H), 4,83-4,96 (m, 1 H), 5,17 (t, J=10,06 Hz, 1 H), 5,75 (m, 1 H), 5,94 (s, 1 H), 7,33 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 7,57 (d,

J=8,05 Hz, 1 H), 7,72 (t, J=7,50 Hz, 1 H), 7,82 (m, 1 H), 7,99 (d, J=6,22 Hz, 1 H), 8,20 (d, J=8,42 Hz, 1 H). LC-MS (Metode D, retensjonstid: 2,59 min), MS m/ z 775 (M<+>+1).

Eksempel 46: Fremstilling av forbindelse 141: r( Z)-( 1S, 4R, 13S, 17R)- 4-cvklopropansulfonvlaminokarbonvl- 17-( 6- metoksv- isokinolin- 1- yloksv)- 2, 14-diokso- 10- oksa- 3. 15- diaza- tricvklon 3. 3. 0. 046loktadec- 7- en- 13- vll-karbaminsvre- etrt- butvlester Trinn 46a: Fremstilling av ( S)- 4- allvloksv- 2-( tert-butoksvkarbonvlamino) smørsvre

Til en blanding av natriumhydrid (913 mg, 22,8 mmoL) i DMF ved 0°C ble satt N-t-Boc-L-homoserin (2 g, 9,13 mmoL). Denne reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 15 min og deretter ble allylbromid (1,38 g, 11,4 mmoL) tilsatt. Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 2 timer. Den ble deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble fortynnet med vann og sekvensielt vasket med heksan og eter. De organiske lag ble kastet og det vandige laget ble forsiktig regulert til pH 3 med 1 N HCI. Denne sure vandige løsning ble ekstrahert med etylacetat. Den organiske fasen ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga 2,2 g (93%) av (S)-4-allyloksy-2-(ferf-butoksykarbonylamino)smørsyre som en fargeløs olje.<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) 5 1,42 (s, 9 H), 1,80-1,90 (m, 1 H), 2,04-2,16 (m, 1 H), 3,50-3,54 (m, 2 H), 3,97 (d, J=4,39 Hz, 2 H), 4,23 (dd, J=8,78, 4,39 Hz, 1 H), 5,15 (d, J=10,25 Hz, 1 H), 5,26 (dd, J=17,38, 1,65 Hz, 1 H), 5,84-5,97 (m, 1 H). Dette utgangsmaterialet ble anvendt i syntesen av (1R,2S)-etyl 1-((3R,5S)-1-((S)-4-(allyloksy)-2-(tert-butoksykarbonyl)butanoyl)-3-(6-metoksyisokinolin-1-yloksy)pyrrolidine-5-karboksamido)-2-vinylcyklopropan-karboksylat som beskrevet i eksempel 2.

Trinn 46b: Fremstilling av ( ZW1S. 4R. 13S. 17R)- 13- tetr- butoksvkarbonvlamino-17-( 6- metoksv- isokinolin- 1 - yloksv)- 2, 14- diokso- 10- oksa- 3, 15- diaza-tricvklori3. 3. 0. 04, 61oktadec- 7- en- 4- karboksvlsvre- etvlester

En løsning av (1R,2S)-etyl 1-((3R,5S)-1-((S)-4-(allyloksy)-2-(tert-butoksykarbonyl)butanoyl)-3-(6-metoksyisokinolin-1-yloksy)pyrrolidin-5-karboksamido)-2-vinylcyklopropankarboksylat (220 mg, 0,33 mmol) i 84 ml metylenklorid ble tilsatt tricykloheksylfosfin[1,3-bis(2,4,6-trimetyl-fenyl)-4,5-dihydroimidazol-2-yliden][benzyliden]-ruthenium(IV)diklorid (27 mg, 0,032 mmol). Den lys oransje homogene løsningen ble tilbakeløpskokt i 3 timer, hvilket ga en mørk oransje løsning. På dette tidspunkt ble en ytterligere porsjon av ruthenium-katalysator (13 mg, 0,016 mmoL) tilsatt og tilbakeløpsbehandling ble fortsatt i ytterligere 2 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og konsentrert i vakuum, hvilket ga en oransje olje. "Flash" kromatografi (etylacetat deretter 10% MeOH i etylacetat) ga 174 mg (80%) av (Z)-(1 S,4R, 13S,17R)-13-fert-butoksykarbonylamino-17-(6-metoksy-isokinolin-1 - yloksy)-2,14-diokso-10-oksa-3,15-diaza-tricyklo[13.3.0.0<4f3>]oktadec-7-en-4-karboksylsyre-etylester som et hvitt, fast stoff. LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,74 min), MS m/ z 639(M++1).

Trinn 46c: Fremstilling av forbindelser 140 og 141:

(Z)-( 1 S,4R, 13S, 17R)-13-fert-butoksykarbonylamino-17-(6-metoksy-isokinolin-1-yloksy)-2,14-diokso-10-oksa-3>15-diaza-tricyklo[13.3.0.0<4,6>]oktadec-7-en-4-karboksylsyre-etylester ble hydrolysert i henhold til Eksempel 2 (trinn 2E), hvilket ga forbindelse 140. Forbindelse 140 ble omdannet til forbindelse 141, [(Z)-(1 S,4R, 13S, 17R)-4-cyklopropansulfonylaminokarbonyl-17-(6-metoksy-isokinolin-1-yloksy)-2,14-diokso-10-oksa-3,15-diaza-tricyklo[13.3.0.0<46>]oktadec-7-en-13-yl]-karbaminsyre-ferf-butylester, i henhold til Eksempel 7. LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,51 min), MS m/ z 714(M<+>+1).

Eksempel 47: Generell prosedyre for fremstilling av P4- karbamater fra tertiære alkoholer.

Fremstilling av forbindelse 56: KZH1S. 4R. 14S. 18R)- 4-cvklopropansulfonvlaminokarbonvl- 18-( isokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 3, 16-diaza- tricyklori4. 3. 0. 046lnonadec- 7- en- 14- vn- karbaminsyre- 1- metyl-cvklobutvlester

Trinn 47a: Fremstilling av 1- metvlcvklobutanol:

Til en løsning av 6 ml metylmagnesium-jodid (3M i eter) ved -10°C ble dråpevis satt cyklobutanon (1 g, 14,3 mmol). Blandingen ble omrørt i 2,5 timer (-10°C til romtemperatur). Fortynnet HCI ble satt til reaksjonsblandingen inntil alt bunnfall var oppløst. Den homogene reaksjonsblandingen ble ekstrahert med eter (2x). De samlede eterekstrakter ble tørket (MgSCv), filtrert og konsentrert i vakuum, hvilket ga 0,9 g (73%) av 1-metylcyklobutanol som en gul olje.

Trinn 47b. Fremstilling av r( Z)-( 1S, 4R, 14S, 18R)- 4- cyklopropansulfonvlamino-karbonvl- 18-( isokinolin- 1 - vloksv)- 2, 15- diokso- 3. 16- diaza- tricvklon 4. 3. 0. 04, 6!-nonadec- 7- en- 14- vn- karbaminsvre- 1- metvl- cvklobutylester

Til en oppslemning av KH (400 mg, 35% i olje, 3,5 mmol) ble satt 5 ml heksan. Den ble omrørt i 5 min og deretter ble heksanet fjernet. Denne prosessen ble gjentatt tre ganger. THF (5 ml) ble satt til denne forhåndsvaskede KH og deretter ble 1-metyl-cyklobutanol (200 mg, 2,3 mmol) tilsatt ved 0°C. Blandingen ble omrørt (0°C til romtemperatur) i 1 time og deretter ble karbonsyre-dipyridin-2-ylester (753 mg, 3,5 mmol) tilsatt. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer og reaksjonsblandingen ble fortynnet med mettet vandig NH4CI. Blandingen ble deretter ekstrahert med EtOAc og løsningsmidlet ble fjernet i vakuum for å oppnå 200 mg rå karbonsyre-1 -metyl-cyklobutylester-pyridin-2-ylester som et oransje fast stoff. Det ble anvendt direkte i neste trinn uten ytterligere rensning.

Til en suspensjon av 50 mg (0,073 mmol) av forbindelse 11 [1-(2-amino-3,3-dimetyl-butyryl)-4-(6-metoksy-isokinolin-1-yloksy)-pyrrolidin-2-karboksylsyre-(1-cyklopropansulfonylaminokarbonyl-2-vinyl-cyklopropyl)-amid-bis-hydroklorid-salt] i CH2CI2ble satt diisopropyletylamin (29 mg , 0,22 mmoL) og 70 mg ( 0,33 mmol) av reagenset ovenfor (karbonsyre-1 -metyl-cyklobutylester-pyridin-2-ylester). Denne reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over og deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble renset ved preparativ HPLC, hvilket ga 32 mg (62%) av forbindelse 56 som et hvitt, fast stoff. Preparative HPLC-betingelser: YMC XTERRA, S5, 19x100 mm, gradient: 50% B til 90% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 25 ml/min. LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,47 min), MS m/z 708 (M<+>+1).

Forbindelse 59 ble fremstilt ved den generelle metode anvendt for forbindelse 56 (eksempel 47): 1 -metylcyklopropanol ble omdannet til reagenset karbonsyre-1 -metyl-cyklopropylester-pyridin-2-ylester fremstilt i henhold til metoden ovenfor (eksempel 47). 1-metyl-1-cyklopropanol ble fremstilt ved en liten modifikasjon av metoden beskrevet av Kulinkovich, O.G.; Sviridov, S.V.; og Vasilevski, D.A. Synthesis, 1991, 234: Til en omrørt løsning av metylacetat (1,85 g, 25 mmol) og Ti(OPr-/')4 (744^L, 2,5 mmol) i dietyleter (80 ml) ble satt etylmagnesium-bromid (3M løsning i dietyleter) (18 ml, 53 mmol) i dietyleter (60 ml) langsomt over en periode på 1 time mens reaksjonstemperaturen blir holdt ved 18-20°C. Da tilsetningen var fullstendig ble omrøring fortsatt i 10 min. Blandingen blir hellet i avkjølt (5 °C) 10% vandig H2S04(250 ml) og produktet blir ekstrahert med dietyleter (3 x 50 ml). De samlede eter ekstrakter blir vasket med vann (50 ml), tørket (MgS04) og forsiktig konsentrert ved rotasjonsinndampning (~20 torr, romtemperatur), hvilket gir 1,7 g 1-metyl-1-cyklopropanol (renhet -80%).<1>H NMR (300 MHz, CDCI3) 5 0,42-0,45 (m, 2 H), 0,73-0,77 (m, 2 H), 1,44 (s, 3 H), 1,64 (br s, 1 H).

De følgende forbindelser ble også fremstilt ved anvendelse av den generelle prosedyre ovenfor: forbindelse 50 ble fremstilt fra 1 - metylcyklopentanol; forbindelser 39 og 51 ble fremstilt fra 1,1,1-trifluor-2-metylpropan-2-ol, forbindelse 55 ble fremstilt fra 1,1-difluor-2-metylpropan-2-ol-(1,1-difluor-2-metylpropan-2-ol ble fremstilt i henhold til metoden beskrevet av Dickey, J. B.og Towne, E. B. US2700686), forbindelser 40 og 52 ble fremstilt fra 1-klor-2-metylpropan-2-ol, forbindelse 124 ble fremstilt fra 1,1,1-triklor-2-metylpropan-2-ol, forbindelse 123 ble fremstilt fra 3-hydroksy-3-metylbutan-2-on og forbindelse 139 ble fremstilt fra S-tert-butyl-O-4-nitrofenyl-karbonotioat (vist nedenfor) (Dette reagens ble fremstilt som beskrevet av E.M. Gordon, J.C. Barrish, G.S. Bisacchi, C-Q. Sun, J.A. Tino, G.D. Vite og R. Zahler i US 005559256A.).

Eksempel 48. Fremstilling av forbindelse 126.

Til en blanding av forbindelse 11 {cyklopropansulfonsyre-[14-amino-18-(isokinolin-1-yloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karbonyl]-amid-bis-hydroklorid} (20 mg, 0,029 mmol) i 2 ml DCM ble satt 18

(0,10 mmol) DIPEA og 4 mg (0,04 mmol) t-butyl-isocyanat. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over. Den ble deretter fortynnet med EtOAc

og vasket med pH 4 buffer (2x) og saltvann (1x). Den organiske fasen ble tørket (MgSCv) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. Den resulterende oljen ble oppløst i metanol og renset ved preparativ HPLC (YMC XTERRA, S5, 19x100 mm, gradient: 50% B til 100% B, 15 min, hold 2 min,

strømningshastighet 25 ml/min) for å isolere forbindelse 126 som et hvitt pulver (17 mg, 82%): LC-MS (Metode D, retensjonstid: 3,24 min), MS m/ z 695 (M<+>+1).<1>H NMR (300 MHz, CDCI3) 5 0,86-0,96 (m, 2 H), 1,12 (s, 9 H), 1,01-1,49 (m, 18 H), 1,52-1,66 (m, 1 H), 1,70-1,78 (m, 1 H), 1,83-1,95(m, 2 H), 2,14-2,25 (m, 1 H), 2,49 (brs, 1 H), 2,71 (m, 2 H), 2,86-2,92 (m, 1 H), 4,07 (dd, J=11,71, 4,03 Hz, 1 H), 4,40-4,44 (m, 1 H), 4,62-4,69 (m, 2 H), 4,94-5,00 (m, 1 H), 5,65-5,74 (m, 1 H), 5,97 (br s, 1 H), 7,03 (s, 1 H), 7,32 (d, J=6,22 Hz, 1 H), 7,50-7,52 (m, 1 H), 7,68-7,78 (m, 2 H), 8,00 (d, J=5,86 Hz, 1 H), 8,22 (d, J=7,68 Hz, 1 H), 10,15 (s, 1 H).

Eksempel 49: Fremstilling av Forbindelse 58:

Trinn 49a: Fremstilling av 1-{ H-( 2- tert- butoksvkarbonvlamino- non- 8- enovl)- 4-( tert- butyl- dimetvlsilanvloksv)- pyrrolidin- 2- karbonvll- amino)- 2-vinvlcvklopropankarboksvlsvre- etvlester

Til en blanding av 1-{[1-(2(S)-fert-butoksykarbonylamino-non-8-enoyl)-4(R)-hydroksy-pyrrolidin-2(S)karbonyl]-(1/?)-amino}-2(S)-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester (1,5 g, 2,87 mmoL) i 10 ml DMF ble satt imidazol (0,25 g, 3,67 mmoL) og tert-butyl-dimetylsilylklorid (516 mg, 3,44 mmoL). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i to dager. Reaksjonsblandingen ble deretter konsentrert i vakuum og residuet ble oppløst i etylacetat. Denne løsningen ble vasket med vann, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum for å oppnå et rått fast stoff. Rensning ved "flash" kromatografi (under eluering med 20% etylacetat i heksan) ga 1,43 g (78%) av 1-{[1-(2-tetr-butoksykarbonylamino-non-8-enoyl)-4-(tert-butyldimetylsilanyloksy)pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester som et hvitt, fast stoff.

<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) 5 0,10 (s,6 H), 0,89 (s, 9 H), 1,22 (m, 3 H), 1,31-1,48 (m, 16 H), 1,50-1,75 (m, 3 H), 2,06 (m, 3 H), 2,11-2,33 (m, 2 H), 3,70 (m, 2 H), 4,03-4,19 (m, 2 H), 4,21 (m, 1 H), 4,45 (t, J=7,87 Hz, 1 H), 4,59 (m, 1 H), 4,91 (d, J=9,15 Hz, 1 H), 4,98 (d, J=17,20 Hz, 1 H), 5,08 (dd, J=10,25, 1,83 Hz, 1 H), 5,27 (dd, J=17,38, 1,65 Hz, 1 H), 5,65-5,87 (m, 2 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 4,00 min), MS m/ z 636 (M<+>+1).

Trinn 49b: Fremstilling av 14- tert- butoksvkarbonvlamino- 18-( tert- butvldimetvl-silanyloksv)- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza- tricyklo[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 4-karboksvlsvre- etvlester

Til en løsning av 1-{[1-(2-tert-butoksykarbonylamino-non-8-enoyl)-4-(tert-butyl-dimetyl-silanyloksy)-pyrrolidin-2-karbonyl]-amino}-2-vinylcyklopropankarboksylsyre-etylester (1,63 g, 2,56 mmoL) i 640 ml metylenklorid ble satt 215 mg (0,26 mmol) tricykloheksylfosfin[1,3-bis(2,4,6-tri[benzyliden]ruthenium(IV)diklorid. Blandingen ble oppvarmet ved tilbakeløp i 15 min. Residuet ble konsentrert i vakuum og deretter renset ved "flash" kromatografi under eluering med 30% etylacetat/heksan. For ytterligere å avfarge prøven ble råproduktet kromatografert en andre gang under eluering med 50% eter i heksan, hvilket ga 1,5 g (96%) av 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(tert-butyl-dimetyl-silanyloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre-etylester som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (500 MHz, CD3CI) 5 0,06 (s, 3 H), 0,07 (s, 3 H), 0,86 (s, 9 H), 1,18-1,24 (m, 6 H), 1,34-1,64 (m, 14 H), 1,86-1,96 (m, 3 H), 2,02-2,09 (m, 1 H), 2,11-2,17 (m, 1 H), 2,19-2,28 (m, 1 H), 2,57-2,63 (m, 1 H), 3,50-3,54 (m, 1 H), 3,71 (dd, J=10,22, 6,26 Hz, 1 H), 4,06-4,17 (m, 2 H), 4,52-4,58 (m, 2 H), 4,75 (d, J=8,55 Hz, 1 H), 5,21 (t, J=9,92 Hz, 1 H), 5,35 (d, J=7,63 Hz, 1 H), 5,45-5,50 (m, 1 H), 6,94 (s,1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,88 min), MS m/ z 608 (M<+>+1).

Trinn 49c: Fremstilling av 14- tert- butoksvkarbonylamino- 18-( tert- butvl- dimetvl-silanyloksv)- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza- tricyklo[ 14. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 4-karboksvlsvre

Til en løsning av 14-tert-butoksykarbonylamino-18-(tert-butyldimetyl-silanyloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre-etylester (1,5 g, 2,47 mmol) i et blandet løsningsmiddelsystem av THF (4 ml), metanol (1 ml) og vann (2 ml), ble satt pulverisert litiumhydroksyd-monohydrat (1,0 g, 50 mmoL). Den lysegule oppslemning ble omrørt ved romtemperatur under N2i 4 timer. Blandingen ble deretter konsentrert i vakuum og residuet fordelt mellom eter og vann. Eterfasen ble kastet og den vandige fasen ble behandlet med 1 N HCI inntil den nådde pH 4. Denne sure løsningen ble ekstrahert med EtOAc (3x). De samlede EtOAc-ekstrakter ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga 1,2 g (84%) av 14-tert- butoksykarbonylamino-18-(tert-butyl-dimetyl-silanyloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre som et gråhvitt, fast stoff.<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) 0,12 (s, 6 H), 0,89 (s, 9 H), 1,23-1,64 (m, 17 H), 1,70-1,87 (m, 1 H), 1,90-2,49 (m, 6 H), 3,70-3,80 (m,1 H), 3,83-3,90 (m, 1 H), 4,28-4,36 (m, 1 H), 4,47-4,55 (m, 1 H), 4,65 (s, 1 H), 5,30-5,39 (m, 1 H), 5,53-5,62 (m, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,69 min), MS m/ z 580 (M<+>+1).

Trinn 49d: Fremstilling av [ 18-( tert- butvl- dimetvl- silanvloksv)- 4-cvklopropansulfonvlaminokarbonyl- 2, 15- diokso- 3, 16- diaza-tricyklori4. 3. 0. 0461nonadec- 7- en- 14- yll- karbaminsyre- tert- butylester

14-tert-butoksykarbonylamino-18-(tert-butyldimetylsilanyloksy)-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-4-karboksylsyre (500 mg, 0,86 mmoL) ble oppløst i 25 ml THF og behandlet med CDI (180 mg, 1,12 mmoL). (Fuktighet ble omhyggelig unngått ved anvendelse av ovnstørket glassvare og opprettholdelse av en tørr N2-atmosfære). Etter tilbakeløpsbehandling av reaksjonsblandingen i 2 timer, ble den avkjølt til romtemperatur og behandlet sekvensielt med cyklopropylsulfonamid (135 mg, 1,12 mmoL) og DBU (170 mg, 1,12 mmoL). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 4 timer ved romtemperatur og THF ble fjernet ved rotasjonsinndampning. Residuet ble fordelt mellom etylacetat og pH 4 buffer. Den organiske fasen ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. Det ble deretter renset ved "flash" kromatografi (under eluering med 33% etylacetat i heksan), hvilket ga 300 mg (51%) av [18-(tert-butyl-dimetyl-silanyloksy)-4-

cyklopropansulfonylaminokarbonyl-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) 5 1H 0,07 (s, 3 H), 0,08 (s, 3 H), 0,85 (s, 9 H), 0,87-1,49 (m, 21 H), 1,73-1,95 (m, 3 H), 2,08-2,16 (m, 1 H), 2,25-2,36 (m, 2 H), 2,42-2,56 (m, 1 H), 2,85-2,93 (m, 1 H), 3,65-3,74(dd, J=10,61, 3,66 Hz, 1 H), 3,89 (d, J=10,25 Hz, 1 H), 4,34 (m, J=9,70, 9,70 Hz, 1 H), 4,43 (t, J=7,87 Hz, 1 H), 4,57 (s, 1 H), 4,94-5,01 (m, 1 H), 5,10 (d, J=8,78 Hz, 1 H), 5,66-5,75 (m, 1 H), 6,55 (s, 1 H), 10,13 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,81 min), MS m/ z 683 (M<+>+1).

Trinn 49e: ( 4- cvklopropansulfonvlaminokarbonvl- 18- hvdroksv- 2, 15- diokso- 3, 16-diaza- tricvklori4. 3. 0. 04' 61nonadec- 7- en- 14- yl)- karbaminsvre- tert- butvlester

Til en blanding av [18-(tert-butyl-dimetylsilanyloksy)-4-cyklopropan-sulfonyl-aminokarbonyl-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-tert-butylester (330 mg, 0,48 mmoL) i 25 ml THF ble satt tetrabutylammonium-fluorid (150 mg, 0,54 mmoL). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer og deretter ble THF fjernet ved rotasjonsinndampning. Residuet ble fordelt mellom etylacetat og vann. Den organiske fasen ble tørket (MgSCv) og konsentrert i vakuum, hvilket ga råproduktet. Det ble deretter renset ved utgnidning med heksan, hvilket ga 200 mg (73%) av (4-cyklopropansulfonylaminokarbonyl-18-hydroksy-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl)-karbaminsyre-tert-butylester som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (500 MHz, CD3CI) 5 1,87-1,64 (m, 21 H), 1,70-1,98 (m, 3 H), 2,15-2,56 (m, 5 H), 2,85-2,94 (m, 1 H), 3,71 (d, J=13,91 Hz, 1 H), 4,10-4,26 (m, 2 H), 4,51 (t, J=7,87 Hz, 1 H), 4,62 (s, 1 H), 4,98 (m, 1 H), 5,06 (d, J=8,78 Hz, 1 H), 5,64-5,71 (m, 1 H), 6,72 (s, 1 H), 10,24 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 2,85 min), MS m/ z 569 (M<+>+1).

Trinn 49f: Fremstilling av forbindelse 58: r( Z)-( 1S, 4R, 14S, 18R)- 4-cvklopropansulfonvlaminokarbonvl- 2, 15- diokso- 18-( 3- fenvl- isokinolin- 1- vloksv)-3, 16- diaza- tricvklori4. 3. 0. 04, 61nonadec- 7- en- 14- vn- karbaminsvre- terf- butylester

Til en blanding av (4-cyklopropansulfonylaminokarbonyl-18-hydroksy-2,15-diokso-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl)-karbaminsyre-tert-butylester (20 mg, 0,035 mmoL) i 1 ml DMF ble satt kalium-t-butoksyd (22 mg, 0,196 mmoL). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 5 min og deretter ble 1-klor-3-fenylisokinolin (15 mg, 0,062 mmoL) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 15 timer og deretter konsentrert i vakuum. Dette råprodukt ble utgnidd med eter. Residuet ble oppløst i MeOH og deretter renset ved preparativ HPLC.(YMC XTERRA, S5, 19x100 mm, gradient: 60% B til 100% B, 15 min, hold 2 min, strømningshastighet 25 ml/min), hvilket ga 10 mg (39%) av forbindelse 58, [(Z)-(1S,4R,14S,18R)-4-cyklopropansulfonylamino-karbonyl-2,15-diokso-18-(3-fenyl-isokinolin-1 -yloksy)-3,16-diaza-tricyklo[14.3.0.0<4,6>]nonadec-7-en-14-yl]-karbaminsyre-ferf-butylester, som et hvitt, fast stoff.<1>H NMR (500 MHz, CD3CI) 5 0,90-1,64 (m, 21 H), 1,76-1,97 (m, 3 H), 2,26-2,31 (m, 1 H), 2,52-2,63 (br s, 1 H), 2,69-2,81 (m, 2 H), 2,88-2,93 (m, 1 H), 4,11 (d, J=11,60 Hz, 1 H), 4,33 (m, 1 H), 4,61 (d, J=7,94 Hz, 2 H), 4,99 (t, J=9,31 Hz, 1 H), 5,05 (d, J=7,93 Hz, 1 H), 5,69-5,74 (m, 1 H), 6,08 (s, 1 H), 6,60 (s, 1 H), 7,38-7,47(m, 2 H), 7,50 (t, J=7,63 Hz, 2 H), 7,63 (t, J=7,32 Hz, 1 H), 7,71 (s, 1 H), 7,77 (d, J=8,24Hz, 1 H), 8,10 (d, J=7,32Hz, 2 H), 8,18 (d, J=7,93 Hz, 1 H), 10,27 (s, 1 H). LC-MS (Metode A, retensjonstid: 3,72 min), MS m/ z 772 (M<+>+1).

Forbindelsene i tabeller 2 og 3 ble fremstilt ved anvendelse av metodene beskrevet i eksemplene ovenfor:

Forbindelsene i tabeller 4 og 5 kunne fremstilles ved anvendelse av metodene beskrevet i eksemplene ovenfor:

Eksempel 50

Biologiske undersøkelser

Rekombinant HCV NS3/ 4A protease- kompleks FRET peptid- forsøk

Formålet med dette in vitro forsøk var å måle hemning av HCV NS3 protease-komplekser, avledet fra BMS-stamme, H77C stamme eller J4I6S stamme, som beskrevet nedenfor, av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse. Dette forsøket gir en indikasjon på hvor effektive forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse vil være for hemning av HCV proteolytisk aktivitet.

Serum fra en HCV-infisert pasient ble anskaffet fra Dr. T. Wright, San Francisco Hospital. En konstruert full-lengde cDNA (kompliment deoksyribonukleinsyre) templat av HCV-genom (BMS-stamme) ble konstruert fra DNA-fragmenter oppnådd ved revers transkripsjon-PCR (RT-PCR) av serum RNA (ribonukleinsyre) og ved anvendelse av primere valgt på basis av homologi mellom andre genotype 1a stammer. Fra bestemmelsen av hele genom-sekvensen, ble en genotype 1a gitt til HCV-isolatet i henhold til klassifiseringen ifølge Simmonds et al (Se P Simmonds, KA Rose, S Graham, SW Chan, F McOmish, BC Dow, EA Follett, PL Yap og H Marsden, J. Clin. Microbiol., 31(6), 1493-1503 (1993)). Aminosyresekvensen av den ikke-strukturelle region, NS2-5B, ble vist å være >97% identisk med HCV-genotype 1a (H77C) og 87% identisk med genotype 1b (J4L6S). De infeksiøse kloner, H77C (1a genotype) og J4L6S (1b genotype) ble oppnådd fra R. Purcell (NIH) og sekvensene er publisert i Genbank (AAB67036, se Yanagi, M., Purcell, R.H., Emerson, S.U. og Bukh, J. Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 94 (16), 8738-8743

(1997); AF054247, se Yanagi, M., St Claire, M., Shapiro, M., Emerson, S.U., Purcell, R.H. og Bukh, J, Virology 244 (1), 161-172. (1998)).

H77C- og J4L6S-stammer ble anvendt for produksjon av rekombinant NS3/4A protease-komplekser. DNA som koder for rekombinant HCV NS3/4A protease-kompleks (aminosyrer 1027 til 1711) for disse stammer ble manipulert som beskrevet av P. Gallinari et al. (se Gallinari P, Paolini C, Brennan D, Nardi C, Steinkuhler C, De Francesco R. Biochemistry. 38(17):5620-32, (1999)). Kort angitt ble en tre-lysin solubiliseringshale tilsatt ved 3-enden av den NS4A-kodende region. Cysteinet i P1-stilling av NS4A-NS4B spaltningssetet (aminosyre 1711) ble endret til glycin for å unngå proteolytisk spaltning av lysin-merket. Videre ble en cystein til serin mutasjon innført ved PCR ved aminosyre-stilling 1454 for å forhindre autolytisk spaltning i NS3-helikase- domene. Variant DNA-fragment ble klonet i den pET21b bakterielle ekspresjons-vektor (Novagen) og NS3/4A-komplekset ble uttrykt i Escherichia. coli stamme BL21 (DE3) (Invitrogen) ved å følge protokollen beskrevet av P. Gallinari et al. (se Gallinari P, Brennan D, Nardi C, Brunetti M, Tomei L, Steinkuhler C, De Francesco R., J Virol. 72(8):6758-69 (1998)) med modifikasjoner. Kort angitt ble NS3/4A-ekspresjon fremkalt med 0,5 mM isopropyl-p-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) i 22 timerr ved 20°C. En typisk fermentering (10L) ga omtrent 80 g av våt cellepasta. Cellene ble resuspendert i lyse-buffer (10 ml/g) bestående av 25 mM N-(2-hydroksyetyl)-piperazin-N'-(2-etansulfonsyre) (HEPES), pH 7,5, 20% glycerol, 500 mM natriumklorid (NaCI), 0,5% Triton-X100,1 mikrogram/milliliter Og/ml") lysozym, 5mM magnesiumklorid (MgCb), 1 ug/ml Dnasel, 5mM p-merkaptoetanol (PME), proteaseinhibitor - etylendiamin tetraeddiksyre (EDTA) fri (Roche), homogenisert og inkubert i 20 min. ved 4°C. Homogenatet ble ultralydbehandlet og klaret ved ultrasentrifugering ved 235000 g i 1 time ved 4°C. Imidazol ble satt til supernatanten til en endelig konsentrasjon på 15 mM og pH regulert til 8,0. Den rå proteinekstrakt ble lastet på en nikkel - nitrilotrieddiksyre- (Ni-NTA) kolonne pre-ekvilibrert med buffer B (25 mM HEPES, pH 8,0, 20% glycerol, 500 mM NaCI, 0,5% Triton-X100, 15 mM imidazol, 5mM |3ME). Prøven ble lastet med en strømningshastighet på 1 ml/min. Kolonnen ble vasket med 15 kolonne-volumer av buffer C (samme som buffer B bortsett fra med 0,2% Triton-X100). Proteinet ble eluert med 5 kolonnevolumer av buffer D (samme som buffer C bortsett fra med 200 mM imidazol).

NS3/4A-protease-kompleks-inneholdende fraksjoner ble samlet og lastet på en avsaltingskolonne Superdex-S200 pre-ekvilibrert med buffer D (25 mM HEPES, pH 7,5, 20% glycerol, 300 mM NaCI, 0,2% Triton-X100, 10 mM pME). Prøven ble lastet med en strømningshastighet på 1 ml/min. NS3/4A-protease-kompleks-inneholdende fraksjoner ble samlet og konsentrert til omtrent 0,5 mg/ml. Renheten av NS3/4A-protease-kompleksene, avledet fra BMS-, H77C-og J4L6S-stammer, ble bedømt å være større enn 90% ved SDS-PAGE og masse-spektrometri-analyser.

Enzymet ble lagret ved -80°C, tint på is og fortynnet før anvendelse i forsøksbuffer. Substratet anvendt for NS3/4A-protease-forsøk var RET S1 (Resonance Energy Transfer Depsipeptide Substrate; AnaSpec, Inc. kat # 22991) (FRET peptid), beskrevet av Taliani et al. i Anal. Biochem. 240(2):60-67

(1996). Sekvensen av dette peptid er løst basert på NS4A/NS4B naturlig spaltningssete bortsett fra at det er en ester-binding istedenfor en amidbinding ved spaltningssetet. Peptidsubstratet ble inkubert med én av de tre rekombinante NS3/4A-komplekser, i fravær eller nærvær av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse og dannelse av fluorescent reaksjonsprodukt ble fulgt i sanntid ved anvendelse av Cytofluor Series 4000.

Reagensene var som følger: HEPES og glycerol (Ultrapure) ble anskaffet fra GIBCO-BRL. Dimetylsulfoksyd (DMSO) ble anskaffet fra Sigma, p-merkaptoetanol ble anskaffet fra Bio Rad.

Forsøksbuffer: 50 mM HEPES, pH7,5; 0,15M NaCI; 0,1% Triton; 15% Glycerol; 10 mM pME. Substrat: 2 \ jlM endelig konsentrasjon (fra en 2 mM stamløsning i DMSO lagret ved -20°C). HCV NS3/4A type 1a (1b), 2-3 nM endelig konsentrasjon (fra en 5^M stamløsning i 25 mM HEPES, pH 7,5, 20% glycerol, 300 mM NaCI, 0,2% Triton-X100, 10 mM pME). For forbindelser med styrker nær forsøksgrensen, ble forsøket gjort mer sensitivt ved tilsetning av 50^g/ml Bovint Serum Albumin (Sigma) til forsøksbufferen og reduksjon av slutt protease-konsentrasjon til 300 pM.

Forsøket ble utført i en 96-brønn polystyren sort plate fra Falcon. Hver brønn inneholdt 25 mikroliter ("ul") NS3/4A-protease-kompleks i forsøksbuffer, 50 \ i\ av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse i 10% DMSO/forsøksbuffer og 25 substrat i forsøksbuffer. En kontroll (ingen forbindelse) ble også fremstilt på samme forsøksplate. Enzymkomplekset ble blandet med forbindelse eller kontroll-løsning i 1 min før initiering av enzymatisk reaksjon ved tilsetning av substrat. Forsøksplaten ble lest umiddelbart ved anvendelse av Cytofluor Series 4000 (Perspective Biosystems). Instrumentet ble satt til å lese en emisjon på 340 nm og eksitasjon på 490 nm ved 25°C. Reaksjoner ble generelt fulgt i omtrent 15 minutter.

Prosent hemning ble beregnet med den følgende ligning:

hvor 5F er forandring i fluorescens over det lineære område av kurven. En ikke-lineær kurve-tilpasning ble anvendt for hemning-konsentrasjonsdata og 50% effektiv konsentrasjon (IC50) ble beregnet ved anvendelse av Excel Xl-fit programvare ved anvendelse av ligningen, y=A+((B-A)/(1+((C/x)<A>D))).

Alle forbindelsene testet ble funnet å ha IC50 på 1,2 \ jlM eller mindre. Videre ble forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse, som ble testet mot mer enn én type av NS3/4A-kompleks, funnet å ha lignende hemmende egenskaper selv om forbindelsene sammen demonstrerte større styrke mot 1b-stammer sammenlignet med 1 a-stammer.

Spesifisitetsforsøk

Spesifisitetsforsøk ble utført for å demonstrere selektiviteten av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse for å hemme HCV NS3/4A-protease sammenlignet med andre serin- eller cysteinproteaser.

Spesifisetene av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse ble bestemt mot en rekke serinproteaser: human nøytrofil elastase (HNE), porcin pankreatisk elastase (PPE) og human pankreatisk chymotrypsin og én cysteinprotease: human lever cathepsin B. I alle tilfeller ble en 96-brønn plateformat-protokoll ved anvendelse av kolorimetrisk p-nitroanilin- (pNA) substrat spesifikt for hvert enzym anvendt som beskrevet tidligere (PCT patentsøknad Nr. WO 00/09543) med noen modifikasjoner for serinprotease-forsøket. Alle enzymer ble anskaffet fra Sigma mens substratene var fra Bachem.

Hvert forsøk omfattet en 2 timers enzym-inhibitor pre-inkubering ved romtemperatur fulgt av tilsetning av substrat og hydrolyse til -30% omdannelse som målt på en Spektramax Pro mikroplateleser. Forbindelse-konsentrasjoner varierte fra 100 til 0,4 mikromolar ('VM") avhengig av deres styrke.

De endelige betingelser for hvert forsøk var som følger:

50 millimolar ("mM") Tris(hydroksymetyl)aminometan-hydroklorid (Tris-HCI) pH 8, 0,5 M natriumsulfat (Na2S04), 50 mM NaCI, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 0,01% Tween-20 med: 133^M succ-AAA-pNA og 20 nM HNE eller 8 nM PPE; 100^M succ-AAPF-pNA og 250 pM Chymotrypsin.

100 mM NaHP04(natriumhydrogen-fosfat) pH 6, 0,1 mM EDTA, 3% DMSO, 1 mM TCEP (Tris(2-karboksyetyl)fosfin-hydroklorid), 0,01% Tween-20, 30^M Z-FR-pNA og 5 nM Cathepsin B (enzym-lager aktivert i buffer inneholdende 20 mM TCEP før anvendelse).

Prosentdelen av hemning ble beregnet ved anvendelse av formelen:

En ikke-lineær kurve-tilpasning ble anvendt for hemning-konsentrasjonsdata og den 50% effektive konsentrasjon (IC50) ble beregnet ved anvendelse av Excel Xl-fit programvare.

HCV Replikon-forsøk ble anvendt ved foreliggende oppfinnelse og ble fremstilt, utført og validert som følger:

Generering av HCV- replikon

Et HCV-replikon helcelle-system ble etablert som beskrevet av Lohmann V, Korner F, Koch J, Herian U, Theilmann L, Bartenschlager R., Science 285(5424): 110-3 (1999). Dette systemet tillot oss å bedømme virkningene av våre HCV-protease-forbindelser på HCV-RNA-replikasjon. Kort angitt, ble ved anvendelse av HCV-stamme 1B-sekvens beskrevet i Lohmann artikkelen (Aksesjonsnummer: AJ238799), HCV cDNA syntetisert ved Operon Technologies, Inc. (Alameda, CA) og full-lengde replikon ble deretter sammensatt i plasmid pGem9zf(+) (Promega, Madison, Wl) ved anvendelse av standard molekylære biologiteknikker. Replikonet består av (i) HCV 5' UTR kondensert til de første 12 aminosyrer av kapsid-protein, (ii) neomycin-fosfotransferase-gen (neo), (iii) IRES fra encefalomyokarditt-virus (EMCV) og (iv) HCV NS3 til NS5B gener og HCV 3' UTR. Plasmid DNA ble linearisert med Seal og RNA-transkripter ble syntetisert in vitro ved anvendelse av T7 MegaScript transkripsjons-sett (Ambion, Austin, TX) i henhold til produsentens rettledning. For å danne cellelinjer ble 4 x 10<6>Huh-7 celler (elskverdig gitt av R. Bartenschlager og tilgjengelig fra Health Science Research Resources Bank, Japan Health Sciences Foundation) elektroporert (GenePulser System, Bio-Rad) med 10 mikrogram ("^g") av RNA-transkript og platet inn i 100 mm skåler. Etter 24 timer ble selektive media inneholdende 1,0 milligram/milliliter ("mg/ml") G418 tilsatt og medier ble byttet hver 3 til 5 dager. Omtrent 4 uker etter elektroporering ble små kolonier synlige som ble isolert og ekspandert for videre analyse. Disse cellelinjer ble holdt ved 37°C, 5% C02, 100% relativ fuktighet i DMEM (Kat# 11965-084) Gibco-BRL, Rockville, MD, med 10% varme-inaktivert kalveserum (Sigma), 10 ml 100X penicillin/streptomycin (Kat# 15140-122) Gibco-BRL, Rockville, MD, Geneticin (Kat# 10131-027) Gibco-BRL, Rockville, MD ved 1 mg/ml. Én av cellelinjene (deponert som ATCC Aksesjonsnummer PTA-4583 i American Type Culture Collection) som hadde omtrent 3.000 kopier av HCV-replikon RNA/celle ble anvendt for utvikling av forsøket (HCV 1 b-377-neo replikon-celler).

FRET forsøk

Huh7 celler som konstitutivt uttrykker HCV-replikon ble dyrket i Dulbecco's Modifisert Eagle Medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1 mg/ml G418 (Gibco-BRL). Celler ble podet natten før (1,5 x 10<4>celler/brønn) i 96-brønn vev-kultur sterile plater. Forbindelse og kontroller uten forbindelse ble fremstilt i DMEM inneholdende 4% FCS, 1:100 Penicillin/Streptomysin, 1:100 L-glutamin og 5% DMSO i fortynningsplaten (0,5% DMSO endelig konsentrasjon i forsøket). Forbindelse / DMSO blandinger ble satt til cellene og inkubert i 4 dager ved 37°C. Etter 4 dager ble celler først bedømt for cytotoksisitet ved anvendelse av alamar Blue (Trek Diagnotstic Systems) for en CC5oavlesning. Toksisitet av forbindelse (CC5o) ble bestemt ved tilsetning av 1/10 volum av alamar Blue til mediet for inkubering av cellene. Etter 4 timer ble fluorescens-signalet fra hver brønn lest, med en eksitasjons- bølgelengde på 530 nm og en emisjonsbølgelengde på 580 nm, ved anvendelse av Cytofluor Series 4000 (Perspective Biosystems). Platene ble deretter skyllet grundig med fosfat-bufret saltløsning (PBS) (3 ganger 150^l). Cellene ble lyset med 25^l av et lyse-forsøksreagens inneholdende et HCV protease-substrat (5X celle luciferase-cellekultur lyse-reagens (Promega #E153A) fortynnet til 1X med destillert vann, NaCI tilsatt til 150 mM endelig, FRET-peptidet fortynnet til 10^M endelig fra et 2 mM lager i 100% DMSO). HCV-protease-substratet (FRET-peptid; AnaSpec, Inc. kat. # 22991, beskrevet av Taliani et al. i Anal. Biochem. 240(2):60-67 (1996)) inneholder en fluorescens-donor, EDANS, nær den ene enden av peptidet og en akseptor, DABCYL, nær den andre enden. Fluorescensen av peptidet blir dempet av intermolekylær resonans-energioverføring (RET) mellom donor og akseptor, men ettersom NS3-protease spalter peptidet blir produktene frigjort fra RET-demping og fluorescensen av donoren blir synlig. Platen ble deretter plassert i Cytofluor 4000 instrument som var satt til 340 nm eksitasjon / 490 nm emisjon, automatisk modus i 21 cykler og platen lest i en kinetisk modus ved 25°C. Reaksjoner ble generelt fulgt i omtrent 15 minutter.

Prosent hemning av både effektivitet og cytotoksisitet ble beregnet med den følgende ligning:

hvor 8F er forandringen i fluorescens over det lineære område av kurven. En ikke-lineær kurve-tilpasning ble anvendt for hemnings-konsentrasjonsdata og 50% effektiv konsentrasjon (EC50og CC50) ble beregnet ved anvendelse av Excel Xl-fit programvare ved anvendelse av ligningen, y=A+((B-A)/(1+((C/x)<*>D))).

Luciferase- forsøk

Som et sekundært forsøk ble ECso-bestemmelser fra replikon FRET-forsøk bekreftet i et luciferase-rapportørforsøk. Anvendelse av et replikon-luciferase-rapportør-forsøk ble først beskrevet av Krieger et al (Krieger N, Lohmann V og Bartenschlager R, J. Virol. 75(10):4614-4624 (2001)). Replikon- konstruksjonen beskrevet for vårt FRET-forsøk ble modifisert ved å erstatte resistens-gen-neomycin med en kassett inneholdende Renilla Luciferase-gen kondensert til en sekvens som representerer et NS3-spaltningssete (NS4A/B sete), fulgt av Blasicidin resistens-gen (restriksjonsseter Asc1 / Pme1 anvendt for subkloningen). Den adaptive mutasjon i stilling 1179 (serin til isoleucin) ble også innført (Blight KJ, Kolykhalov, AA, Rice, CM, Science 290 (5498): 1972-1974). En cellelinje inneholdende replikonet ble valgt og holdt i 1,25fag/ml Blasticidin. Luciferase-rapportør-forsøket ble satt opp ved poding av replikonceller natten før med en densitet på 7000 celler/brønn i 96-brønn plater. Én dag senere ble media byttet til friskt DMEM inneholdende 4% FBS og forbindelse-fortynninger ble fremstilt og tilsatt til en endelig konsentrasjon på 0,5% DMSO (endelig media-volum på 150^l). Etter en ytterligere 4 dagers inkubering i en 37°C / 5% C02-inkubator, ble celler analysert for Renilla luciferase-aktivitet ved anvendelse av Promega Dual-Glo luciferase-forsøks-system. Media (100^l) ble fjernet fra hver brønn. Til de resterende 50 \ i\ av medium ble 50 \ i\ Dual-Glo Luciferase Reagent tilsatt og platene beveget i 10 minutter til 2 timer ved romtemperatur. Dual-Glo Stop & Glo Reagent (50 ble deretter satt til hver brønn og platene ble igjen beveget i ytterligere 10 minutter til 2 timer ved romtemperatur. Platene ble lest på en Packard TopCount NXT ved anvendelse av et luminescens-program.

Prosentdel hemning ble beregnet ved anvendelse av formelen nedenfor:

Verdiene ble angitt i kurver og analysert ved anvendelse av XLFit for å oppnå EC5o-verdi.

Representative forbindelser ifølge oppfinnelsen ble bedømt i det HCV-NS3/4A-protease rekombinante enzymforsøk, det HCV-replikon-celle-baserte forsøk og/eller i mange av de beskrevne spesifisitetsforsøk. For eksempel ble Forbindelse 2 funnet å ha en IC50på 26 nM mot BMS-stamme NS3/4A-protease i enzymforsøket. Lignende styrkeverdier ble oppnådd med de publiserte H77C- (IC5opå 4,2 nM) og J4L6S- (IC5opå 1,9 nM) stammer. EC5o-verdiene i replikon-forsøket var 146 nM.

I spesifisitetsforsøket ble samme forbindelser funnet å ha den følgende aktivitet: HNE > 100^M; PPE > 100^M; Chymotrypsin > 100^M; Cathepsin B > 100^M. Disse resultater indikerer at denne familien av forbindelser er meget spesifikk for NS3-protease og mange av disse medlemmer hemmer HCV-replikon-replikasjon.

Forbindelsene testet ble funnet å ha aktiviteter i områdene som følger: IC50 aktivitetsområder (NS3/4A BMS-stamme): A er <50uM; B er <5uM; C er <0,5uM; D er <0,05uM

EC50 aktivitetsområde (for forbindelser testet): A er <50uM; B er <5uM; C er <0,5uM; D er <0,05uM

Kombinasionsundersøkelser

Ettersom klinisk medikament-resistens ofte utvikles ved virale infeksjoner etter enkelt-middel terapier, er det et behov for å bedømme additive, antagonistiske eller synergistiske egenskaper av kombinasjonsterapier. Vi anvendte HCV-replikon-systemet, som beskrevet ovenfor, for å bedømme den potensielle anvendelse av vår NS3-protease makrocykliske inhibitor i kombinasjonsterapier med Intron A og inhibitorer som målsøker andre HCV-proteiner. Tre HCV-antivirale midler, Intron A (rekombinant Interferon alfa-2b) en HCV NS5A inhibitor som har den følgende struktur:

MS(ESI) m/z= 691,2 (MH<+>); HPLC romtemperatur 1,21 min; Renhet (99%) og en NS5B-replikase-inhibitor (forbindelse 2006; WO 03/010141), ble testet i 2-medikament kombinasjoner med den makrocykliske HCV NS3-proteaseinhibitor forbindelse 28. I tillegg ble forbindelse 28 også testet i 3-medikament-kombinasjoner med NS5A- og NS5B-inhibitorer.

For forsøkene vist i Tabeller 8 og 9 ble inhibitorene testet ved elleve konsentrasjoner hver. 200x stamløsninger av hver inhibitor-konsentrasjon ble fremstilt med 2- eller 3-ganger fortynning i DMSO før tilsetning til celler/medier. Medikamentene ble testet som monoterapier og i kombinasjon med NS3-proteaseinhibitor ved forskjellige konsentrasjonsforhold. Celler ble eksponert for forbindelser i 4 dager og mengden av HCV-hemning ble deretter bestemt ved anvendelse av FRET-forsøket. De potensielle cytotoksisiteter av disse kombinerte midler ble også analysert parallelt ved Alamar Blue-merking. CC50-verdier for forbindelsene presentert var større enn den høyeste testede inhibitor-konsentrasjon. Graden av antagonisme, additivitet eller synergisme ble bestemt over et område av medikament-konsentrasjoner og kombinasjons- respons kurver tilpasset for å bedømme de antivirale effekter av medikament-behandlingskombinasjoner. Konsentrasjonsforhold ble analysert ved anvendelse av metoden ifølge Chou (Chou, Ting-Chao og Rideout (Ed.), (1991) Synergism and Antagonism in Chemotherapy, s. 61-101, Academic Press, New York). Tabeller 8 og 9 rapporterer beregnede ECso-verdier for forbindelsene testet, så vel som kombinasjonsindekser (Cl). Alle estimater ble databehandlet ved anvendelse av SAS Proe NLIN og en to-parameter logistikk. Alle kombinasjonsindekser ble testet for avvik av additivitet ved anvendelse av isobologram-metoder. Asymptotiske konfidens-intervaller ble også beregnet for hver av kombinasjons-indeksene. Disse intervaller blir anvendt for å teste for avvik fra additivitet ved å sammenligne binding til én - en lavere binding av intervallet større enn 1 indikerer antagonism, en øvre binding på mindre enn 1 indikerer synergisme og en verdi på 1 inneholdt i intervallet indikerer additivitet.

I tillegg til kombinasjonensindeks-metoden ovenfor, ble Universal Response Surface Approach (URSA) også anvendt for å bedømme de antivirale effekter av kombinasjoner av NS5A- eller NS5B-inhibitorer med NS3-proteaseinhibitor. Forsøkene ble utført i et matriks format med 8 konsentrasjoner av NS3-proteaseinhibitor krysset mot 10 konsentrasjoner av NS5A- eller NS5B inhibitor på hver av tre plater. 200x stamløsninger av hver inhibitor-konsentrasjon ble fremstilt ved 3 ganger fortynning i DMSO. Effekter på replikasjon ble bedømt i HCV-replikon-systemet som beskrevet ovenfor. Data ble analysert ved anvendelse av URSA som beskrevet i Greco, Park and Rustum (Greco, Park, Sookog Rustum (1990) Application of a New Approach for the Quantitation of Drug Synergism to the Combination of cis-Diamminedichloroplatinum and 1- p- D- Arabinofuranosylcytosine, Cancer Research, 50, 5318-5327). Interaksjonen av de to medikamenter ble bedømt ved anvendelse av ikke-lineær regresjon med en halverings-algoritme. Syv parametere ble beregnet. Disse omfatter den minimale respons eller respons i fravær av medikament, den maksimale respons eller respons i nærvær av et uendelig medikament, EC50for de to medikamenter, hellingsparametere for de to medikamenter og medikament-interaksjons-parameter a som gir bedømmelse av synergisme, antagonisme eller additivitet. Tabeller 10 og 11 presenterer nøkkel beregnede parametere og standard feil. Additivitet forekommer når a er lik null, synergi hvis interaksjonsparameteren er større enn null og antagonisme når interaksjons-parameteren er mindre enn null. Konfidens-intervall for interaksjons-parameter er også presentert. Dette intervall blir anvendt for å teste avvik fra additivitet ved å sammenligne bindingmed null - en lavere binding av intervallet større enn null indikerer synergi, en øvre binding på mindre enn null indikerer antagonisme og en verdi på null i intervallet

indikerer additivitet.

Tabell 8 oppsummerer data fra kombinasjoner av forbindelse 28 med Intron A. ECso-verdier for hver monoterapi er også presentert. I to forsøk ga kombinasjon av forbindelse 28 med Intron-A enten synergistiske eller additive effekter ved 75%, 90 og 95% effektive doser.

Virkningene av forbindelse 28 i kombinasjon med HCV NS5A inhibitor er oppsummert i Tabell 9. Synergi eller additivitet ble observert i to forsøk ved 75, 90 og 95% effektive doser av forbindelse 28. Det er viktig at ingen medikament-antagonisme ble observert med 75, 90 eller 95% effektive doser når forbindelse 28 ble kombinert med HCV-NS5A-inhibitor eller Interferon-alfa-2b. Oppfølgings-forsøk ved anvendelse av disse samme inhibitor- kombinasjoner i matriks-format (Tabell 10) ga resultater lignende kombinasjons-indeks-forsøk; additivitet for kombinasjonen av NS5A-inhibitor med forbindelse 28.

Matriks-format ble også anvendt for å undersøke aktiviteten til kombinasjoner av HCV-NS5B-inhibitor, med forbindelse 28 (Tabell 11). I to forsøk ble total additivitet observert.

Forbindelse 28 ble også testet i 3-medikament kombinasjonsforsøk med NS5A-inhibitor og NS5B-inhibitor (Tabell 12). Start-konsentrasjoner for mono-terapier besto av en 0,667 \ jlM løsning av NS5A-inhibitor, en 0,3 \ iM løsning av forbindelse 28 og en 2,5^M løsning av NS5B-inhibitor. Start-konsentrasjon for den triple kombinasjon inneholdt en blanding av 1/3 av hver av de ovenfor angitte konsentrasjoner. Doserespons-kurver for alle tre mono-terapier og den triple kombinasjonsterapi ble oppnådd ved anvendelse av 3 ganger fortynninger og data-analyse ble utført som beskrevet ovenfor for kombinasjons-indeks-forsøk. Synergistiske effekter ble observert ved anvendelse av den triple kombinasjon. Ingen medikament-antagonisme ble observert ved 75, 90 eller 95% effektive doser med 3-medikament-kombinasjonen.

Disse resultater demonstrerer at kombinasjonsbehandling av replikon-celler med HCV-NS3-proteaseinhibitor, forbindelse 28 og Intron A og/eller inhibitorer som målsøker HCV NS5A og/eller NS5B, gir additive til synergistiske antivirale effekter. Evnen til anvendelse av disse NS3-proteaseinhibitorer i kombinasjonsterapi kan gi store fordeler over enkel-medikament-terapi for behandling av HCV.

Fagfolk på området vil forstå at selv om oppfinnelsen er beskrevet ovenfor med hensyn til spesifikke aspekter, skal andre aspekter være innenfor omfanget av kravene som følger. Alle dokumenter referert her inntas herved ved referanse som om angitt fullstendig.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for spaltning av en blanding av alkylester-enantiomerer karakterisert ved at den omfatter å bringe blandingen i kontakt med et enzym effektivt til preferensielt å fremme hydrolyse av én av enantiomerene; karakterisert ved at kontakten blir utført i nærvær av en buffer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at alkylesteren har den følgende formel:

hvor: R25 er en amino-beskyttelsesgruppe; og R26 er valgt fra gruppen bestående av C1 -10 alkyl, C6 -14 aryl, C7 -16 alkylaryl, C3 -7 cykloalkyl eller C3 -10 alkyl cykloalkyl.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bufferen er valgt fra gruppen bestående av fosfater, borater og karbonater.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at enzymet er en protease.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at enzymet er valgt fra gruppen bestående av Bacillus globigii, Bacillus licheniformis, Bacillus halodurans, Bacillus clausii, Aspergillus oryzase og blandinger derav.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at enzymet er valgt fra gruppen bestående av Alcalase <®> (subtilisin protease), Savinase <®> (subtilisin protease), Esperase <®> (subtilisn protease), Flavourzyme™ (fungal protease) og blandinger derav.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kontakten blir utført ved pH fra ca. 7,0 til 11.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kontakten blir utført ved en temperatur på fra ca. 30 til 60°C.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kontakten blir utført i en tid på mindre enn ca.syv dager.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at kontakten blir utført i en tid fra ca.to timer til tre dager.