NO20131717L - Prodroger av fosfonatnukleotidanaloger, og fremgangsmåter for utvelgelse og fremstilling av disse - Google Patents

Abstract

En ny fremgangsmåte er tilveiebrakt for screening av prodroger av metoksyfosfonatnukleotidanaloger for å identifisere prodroger som selektivt er målrettet mot ønskede vev, med antiviral eller antitumoraktivitet. Denne fremgangsmåten har ført til identifisering av nye blandede esteramidater av PMPA for retroviral eller hepadnaviral behandling, omfattende forbindelser ifølge struktur (5a) som har substituentgrupper som er definert heri. Preparater av disse nye forbindelsene i farmasøytisk akseptable eksipienser og deres anvendelse i terapi og profylakse er tilveiebrakt. Tilveiebrakt er også en forbedret fremgangsmåte for anvendelse av magnesiumalkoksid for fremstilling av startmaterialer og forbindelser for anvendelse heri.

Description

Denne søknaden er rettet mot prodroger av metoksyfosfonatnukleotidanaloger. Spesielt er den rettet mot forbedrede fremgangsmåter for fremstilling og identifisering av slike prodroger.

Mange metoksyfosfonatnukleotidanaloger er kjent. Generelt har slike forbindelser strukturen A-OCH2P(0)(OR)2, hvor A er residuet til en nukleosidanalog og R uavhengig er hydrogen eller ulike beskyttende eller prodrogegrupper. Se US patentskrifter nr. 5 663 159, 5 977 061 og 5 798 340; Oliyai et al., Pharmaceutical Research, 16(11): 1687-1693 (1999); Stella et al., J. Med. Chem., 23(12): 1275-1282 (1980); Aarons, L, Boddy, A. og Petrak, K. (1989), Novel Drug Delivery and Its Therapeutic Application (Prescott, L.F. og Nimmo, W.S., red.), s. 121-126; Bundgaard, H. (1985), Design of Prodrugs (Bundgaard, H., red.), s. 70-74 og 79-92; Banerjee, P.K. og Amidon, G.L. (1985), Design of Prodrugs (Bundgaard, H., red.), s. 118-121; Notari, R.E. (1985), Design of Prodrugs (Bundgaard, H., red.) s. 135-156; Stella, V.J. og Himmelstein, K.J. (1985), Design of Prodrugs (Bundgaard, H., red.), s. 177-198; Jones, G. (1985), Design of Prodrugs (Bundgaard, H., red.) s. 199-241; Connors, T.A. (1985), Design of Prodrugs (Bundgaard, H., red.) s. 291-316. All litteratur og alle patentsitater er her uttrykkelig innlemmet gjennom referanse.

Oppsummering av oppfinnelsen

Prodroger av metoksyfosfonatnukleotidanaloger ment til bruk i antiviral eller antitumorterapi er kjent og er blitt utvalgt på grunnlag av deres systemiske effekt. Slike prodroger er f.eks. blitt utvalgt på grunnlag av forsterket biotilgjengelighet, det vil si evnen til å bli absorbert fra tarmkanalen og raskt omdannes til mordrogen for å sikre at mordrogen er tilgjengelig for alle vev. Søkerne har nå imidlertid funnet at det er mulig å velge prodroger som kan bli anriket på behandlede steder, som illustrert ved studiene beskrevet her, hvor analogene er anriket i avgrensede fokale steder for HIV-infeksjon. Formålet med denne oppfinnelsen er, blant andre fordeler, å gi mindre toksisitet til omkringliggende vev og større effekt av mordrogen i vev som er målet for behandlingen med mor-metoksyfosfonatnukleotidanalogen.

Følgelig er det i samsvar med disse observasjoner tilveiebrakt en screenings-fremgangsmåte for å identifisere en metoksyfosfonatnukleotidanalogprodroge som gir forsterket aktivitet i et målvev, omfattende:

(a) tilveiebringelse av minst én av de angitte prodrogene,

(b) utvelgelse av minst ett terapeutisk målvev og minst ett ikke-målvev, (c) administrering av prodrogen til målvevet og til minst ett ikke-målvev,

og

(d) bestemme den relative antivirale aktiviteten tildelt av prodrogen i vevene i trinn (c).

I foretrukne utførelsesformer er målvevet steder hvor HIV er aktivt replikert og/eller som tjener som et HIV-reservoar, og ikke-målvevet er et intakt dyr. Uventet fant vi at valg av lymfoid vev som målvev for utførelsen av denne fremgangsmåten for HIV førte til identifisering av prodroger som forsterker leveringen av aktiv droge til slike vev.

En foretrukket forbindelse ifølge oppfinnelsen som er blitt identifisert ved denne fremgangsmåten, har strukturen (1)

hvor Ra er H eller metyl,

og kiralt anrikede preparater derav, salter, deres frie baser og solvater derav.

En foretrukket forbindelse ifølge oppfinnelsen har strukturen (2)

og dens anrikede diastereomerer, salter, frie baser og solvater.

I tillegg fant vi uventet at kiraliteten til substituentene på fosforatomet og/eller de amiderte substituentene har innflytelse på anrikningen observert i den praktiske utførelsen av denne oppfinnelsen. Således tilveiebringes, i en annen utførelsesform av oppfinnelsen, diastereomert anrikede forbindelser ifølge oppfinnelsen som har strukturen

(3)

som er vesentlig fri for diastereomeren (4)

hvor

R<1>er en oksyester som er hydrolyserbar in vivo, eller hydroksyl,

B er en heterosyklisk base,

R<2>er hydroksyl eller et aminosyreresidu bundet til P- atomet via en aminogruppe i aminosyren og har hver karboksysubstituent på aminosyren valgfritt forestret, men ikke både R<1>eller R2 er hydroksyl<**>,

E er -CH20(CH2)2-, -CH2OCH(CH3)CH2-, -CH2OCH(CH2F)CH2-, - CH2OCH(CH2OH)-CH2-, -CH2OCH(CH=CH2)CH2-, -CH2OCH(C=CH)CH2-, -CH2OCH(CH2N3)CH2-

-CH2OCH(R<6>)OCH(R<6>')-, -CH2OCH(R<9>)CH20- eller -CH2OCH(R<8>)0-, hvor bindingen på høyre side er knyttet til den heterosykliske basen,

den stiplede linjen representerer en valgfri dobbeltbinding,

R4 og R<5>er uavhengig hydrogen, hydroksy, halogen, amino eller en substituent som har 1-5 karbonatomer valgt fra acyloksy, alkoksy, alkyltio, alkylamino og dialkylamino,

R<6>og R<6>' er uavhengig H, Ci-6-alkyl, Ci-6-hydroksyalkyl eller C2-C7-alkanoyl, R<7>er uavhengig H, Ci_6-alkyl eller er satt sammen for å danne -O- eller -CH2-, R<8>er H, Ci.6-alkyl, Ci_6-hydroksyalkyl eller Ci-C6-halogenalkyl, og

R<9>er H, hydroksymetyl eller acyloksymetyl,

og deres salter, frie baser og solvater.

Diastereomerer av struktur (3) er betegnet (S)-isomerene med fosfor som kiralt senter.

Foretrukne utførelsesformer ifølge oppfinnelsen er diastereomerisk anrikede forbindelser som har struktur (5a): som er vesentlig fri for diastereomer (5b):

hvor

R<5>er metyl eller hydrogen,

R<6>uavhengig er H, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl eller arylalkyl, eller R<6>uavhengig er alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl eller arylalkyl som er substituert med fra 1 til 3 substituenter valgt fra alkylamino, alkylaminoalkyl, dialkylaminoalkyl, dialkylamino, hydroksyl, okso, halogen, amino, alkyltio, alkoksy, alkoksyalkyl, aryloksy, aryloksyalkyl, arylalkoksy, arylalkoksyalkyl, haloalkyl, nitro, nitroalkyl, azido, azidoalkyl, alkylacyl, alkylacylalkyl, karboksyl eller alkylacylamino,

R<7>er sidekjeden til enhver naturlig forekommende eller farmasøytisk akseptabel aminosyre, og dersom sidekjeden omfatter karboksyl, er karboksylgruppen valgfritt forestret med en alkyl- eller arylgruppe,

R<11>er amino, alkylamino, okso eller dialkylamino, og

R<12>er amino eller H,

og dens salter, tautomerer, frie baser og solvater.

En foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er forbindelsen med struktur (6), 9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-l-(iso-propoksykarbonyl)etyl]amino]fenoksyfosfinyl]metoksy]propyl]-adenin, også benevnt her som GS-7340

En annen foretrukket utførelsesform ifølge denne oppfinnelsen er fumarat-saltet av struktur (5) (struktur (7)), 9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-l-(isopropoksykarbonyl)etyl]-amino]fenoksyfosfinyl]metoksy]propyl]adeninfumarat (1:1), også benevnt her som GS-7340-2

Forbindelsene med strukturene (l)-(7) er valgfritt formulert i preparater inneholdende farmasøytisk akseptable eksipienser. Slike preparater er anvendt i effektive doser til behandlingen eller profylakse av virale (spesielt HIV eller hepadnavirale) infeksjoner.

I en videre utførelsesform er en fremgangsmåte for lettvint fremstilling av 9-[2-(fosfonometoksy)propyl]adenin (heretter "PMPA") eller 9-[2(fosfonometoksy)etyl]adenin (heretter "PMEA") tilveiebrakt gjennom anvendelse av magnesiumalkoksid, som omfatter kombinasjon av 9-(2-hydroksypropyl)adenin eller 9-(2-hydroksyetyl)adenin, beskyttet p- toluensulfonyloksymetylfosfonat og magnesiumalkoksid, og gjenvinning av henholdsvis PMPA eller PMEA.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Mordroge-metoksyfosfonatnukleotidanalogen til anvendelse i denne screeningsfremgangsmåten er forbindelser som har strukturen A-OCH2P(0)(OH)2, hvor A er residuet til en nukleosidanalog. Disse forbindelsene er kjent per se og er ikke del av denne oppfinnelsen. Nærmere bestemt omfatter morforbindelsene en heterosyklisk base B og et aglykon E med den generelle strukturen

hvor gruppen B er definert nedenfor, og gruppen E er definert ovenfor. Eksemplene er beskrevet i US patentskrifter nr. 4 659 825, 4 808 716, 4 724 233, 5 142 051, 5 130 427, 5 650 510, 5 663 159, 5 302 585, 5 476 938, 5 696 263, 5 744 600, 5 688 778, 5 386 030, 5 733 896, 5 352 786 og 5 798 340, og EP 821 690 og 654 037.

Prodroger for anvendelse i screeningsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kovalent modifiserte analoger av mormetoksyfosfonatnukleotidanalogene beskrevet i foregående avsnitt. Generelt er fosforatomet i mordrogen det foretrukne setet for prodroge-modifikasjon, men andre seter er også funnet på den heterosykliske basen B eller aglykon E. Mange slike prodroger er allerede kjent. De er primært estere eller amider av fosforatomet, men omfatter også substitusjoner på basen og aglykonet. Ingen av disse modifikasjonene er per se del av denne oppfinnelsen, og ingen er ansett for å være begrensende for omfanget av oppfinnelsen heri.

Fosforatomet til metoksyfosfonatnukleotidanalogene inneholder to valenser for kovalent modifikasjon, slik som aminering eller forestring (med mindre ett fosforylhydroksyl er forestret med en aglykon E-substituent, hvorpå bare én fosforatomvalens er tilgjengelig for substitusjon). Esterne er typisk aryloksy. Amidater er vanligvis naturlig forekommende monoaminosyrer som har fri karboksylgruppe(r) forestret med en alkyl- eller arylgruppe, vanligvis fenyl, sykloalkyl eller t-, n- eller s-alkylgrupper. Egnede prodroger for anvendelse til screeningsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er beskrevet i f.eks. US patentskrift nr.

5 798 340. Imidlertid er enhver prodroge som potensielt er antatt å være i stand til å bli omdannet in vivo innen målvevscellene til den frie metoksyfosfonatnukleotidanalog-mordrogen, f.eks. enten ved hydrolyse, oksidasjon eller andre kovalente transformasjoner som er et resultat av eksponering overfor biologisk vev, egnet for anvendelse i fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen. Det kan være at slike prodroger ikke er kjent på dette tidspunkt, men identifiseres i fremtiden og således kan være egnede kandidater som er tilgjengelige for testing i fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen. Fordi prodrogene kun er kandidater for screening i fremgangsmåtene, er deres struktur ikke relevant for utførelsen eller muliggjøring av screeningsfremgangsmåten, selv om deres struktur selvfølgelig i siste instans er avgjørende for om hvorvidt en prodroge vil vise seg å være selektiv i analysen.

Pro-gruppene bundet til mordrogen kan være de samme eller forskjellige. Hver prodroge som anvendes i screeningsanalysen, vil imidlertid være strukturelt forskjellig fra de andre prodrogene som testes. Forskjellige, det vil si strukturelt forskjellige, prodroger er generelt valgt på grunnlag av enten deres stereokjemi eller deres kovalente struktur, eller disse trekkene(s)<**>variens i kombinasjon. Hver testede prodroge er imidlertid ønskelig strukturelt og stereokjemisk vesentlig ren, ellers vil utbyttet av screeningsanalysen være mindre nyttig. Det er selvfølgelig innen omfanget av denne oppfinnelsen å teste kun en enkelt prodroge i en individuell utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, selv om man typisk da vil sammenligne resultatene av tidligere studier med andre prodroger.

Vi har funnet at stereokjemien til prodrogene er i stand til å påvirke anrikningen i målvevet. Kirale seter er ved fosforatomet og er også funnet i dets substituenter. For eksempel kan aminosyrer anvendt i fremstilling av amidater ha D- eller L-former, og fosfonatesterne eller aminosyreesterne kan likeledes inneholde kirale sentre. Kirale seter er også funnet på nukleosidanalogdelen til molekylene, men disse er karakteristisk nok allerede bestemt av stereokjemien til mordrogen og vil ikke varieres som del av screeningen. For eksempel er R-isomeren til PMPA foretrukket fordi den er mer aktiv enn den tilsvarende S-isomeren. Karakteristisk vil disse diastereomerene eller enantiomerene være kiralt anriket, om ikke rene, ved hvert sete, slik at resultatet av screeningen vil være mer meningsfulle. Som kjent gis stereoisomerene særtrekk ved anrikning eller rensing av stereoisomerene (karakteristisk vil det være en diastereomer heller enn en enantiomer i tilfelle av de fleste metoksyfosfonatnukleotidanaloger), fri fra andre stereoisomerer ved det aktuelle kirale senteret, slik at hver testforbindelse er vesentlig homogen. Med vesentlig homogen eller kiralt anriket mener vi at den ønskede stereoisomer utgjør mer enn ca. 60 vekt% av forbindelsen, ordinært mer enn ca. 80 % og fortrinnsvis mer enn ca. 95 %.

Nv screeninasfremaanasmåte

Så snart minst én prodrogekandidat er blitt utvalgt, anvendes de gjenværende trinn av screeningsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for å identifisere en prodroge som innehar den nødvendige selektivitet for et målvev. Det er mest beleilig at prodrogene merkes med en påvisbar gruppe, f.eks. radiomerket, for å forenkle senere påvisning i vev eller celler. En markør er imidlertid ikke påkrevd, siden andre egnede analyser for prodrogen eller dens metabolitter (omfattende mordrogen) også kan anvendes. Disse analysene kan f.eks. omfatte massespektrometri, HPLC, bioanalyser eller immunanalyser. Analysen kan påvise prodrogen eller én eller flere av dens metabolitter, men fortrinnsvis utføres analysen for å påvise kun dannelsen av mordrogen. Dette er basert på antakelsen (som ikke er berettiget i alle tilfeller) at graden og hastigheten av omdannelsen av prodrogen til antiviralt aktivt mor-difosfat er den samme i alle testede vev. Ellers kan man teste for difosfatet.

Målvevet vil fortrinnsvis være lymfoid vev når man screener for prodroger som er nyttige i behandlingen av HIV-infeksjon. Lymfoid vev vil være kjent for fagmannen og omfatter CD4-celler, lymfocytter, lymfeknuter, makrofager og makrofaglignende celler omfattende monocytter, slik som perifere blodmonocyttceller (PBMC-er) og gliaceller. Lymfoid vev omfatter også ikke-lymfoid vev som er anriket med hensyn til lymfoide vev eller celler, f.eks. lunge, hud og milt. Andre mål for andre antivirale medikamenter vil selvfølgelig være det primære replikasjons- eller latensstedet for det aktuelle viruset det handler om, f.eks. lever for hepatitt og perifere nerver for HSV. Tilsvarende målvev for tumorer vil faktisk være tumorene selv. Disse vevene er vel kjent for fagmannen og vil ikke kreve uberettiget eksperimentering for utvelgelse. Når man screener for antivirale forbindelser, kan målvevet være infisert av viruset.

Ikke-målvev eller celler er også screenet som en del av fremgangsmåten heri. Ethvert antall eller enhver identitet til slike vev eller celler kan anvendes i dette henseende. Generelt vil vev hvor mordrogen er forventet å være toksisk, anvendes som ikke-målvev. Utvelgelse av et ikke-målvev er fullstendig avhengig av prodrogens egenskaper og aktiviteten til mordrogen. For eksempel vil ikke-hepatisk vev utvelges for prodroger mot hepatitt, og ikke-transformerte celler fra samme vev som tumoren vil være tilstrekkelig for antitumorselektiv prodrogescreening.

Det bør bemerkes at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er forskjellig fra studier som typisk foretas for å bestemme oral biotilgjengelighet av prodroger. I orale biotilgjengelighetsstudier er formålet å identifisere en prodroge som passerer inn i systemisk sirkulasjon tilstrekkelig omdannet til mordroge. I foreliggende oppfinnelse er formålet å finne prodroger som ikke er metabolisert i mage-tarmkanalen eller sirkulasjon. Således inkluderer målvevene som evalueres i fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen generelt ikke tynntarmen, eller dersom tarmen er omfattet, omfatter vevene også ytterligere vev andre enn tynntarmen.

Mål- og ikke-målvevene anvendt i screeningsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vil karakteristisk være i et intakt levende dyr. Det er mer ønskelig at prodroger inneholdende estere testes i hunder, aper eller andre dyr enn gnagere. Muse- og rotte-plasma inneholder høye sirkulerende nivåer av esteraser som kan gi et villedende resultat dersom den ønskede terapeutiske pasient er et menneske eller høyere dyr.

Det er ikke nødvendig å utføre denne fremgangsmåten med intakte dyr. Det er også innen omfanget av denne oppfinnelsen å anvende perfuserte organer, in wfro-kultur av organer (f.eks. hudtransplantater) eller cellelinjer opprettholdt i ulike former for cellekultur, f.eks. rulleflasker eller nullgravitasjonssuspensjonssystemer. MT-2-celler kan f.eks. anvendes som målvev for utvelgelse av HIV-prodroger. Således skal uttrykket "vev" ikke tolkes dit hen at organiserte cellulære strukturer er nødvendig eller strukturer av vev slik som de kan finnes i naturen, selv om slike ville være foretrukket. Uttrykket "vev" skal heller tolkes som å være synonymt med celler fra en bestemt kilde, et opphav eller differensieringsstadium.

Mål- og ikke-målvevet kan faktisk være samme vev, men vevene vil være i ulik biologisk tilstand. For eksempel kunne metoden her anvendes for å utvelge prodroger som kan gi aktivitet i antiviralt infiserte vev (målvev), men som forblir vesentlig inaktive i virus-uinfiserte celler (tilsvarende ikke-målvev). Samme strategi kunne anvendes for å velge ut profylaktiske prodroger, det vil si prodroger som metaboliseres til antiviralt aktive former som følge av viral infeksjon, men som forblir vesentlig ikke-metabolisert i uinfiserte celler. Tilsvarende kunne prodroger screenes i transformerte celler og det ikke-transformerte komplementærvevet. Dette vil være særlig nyttig ved sammenlignende tester for å velge ut prodroger for behandling av hematologiske kreftformer, f.eks. leukemier.

Uten å være begrenset av en bestemt teori om virkemåte, er vevsselektive prodroger antatt å være selektivt tatt opp av målcellene og/eller selektivt metabolisert innen cellen sammenlignet med andre vev eller celler. Den unike fordelen med de her beskrevne metoksyfosfonatprodrogene er at deres metabolisme til et dianion ved fysiologisk pH sikrer at de vil være ute av stand til å diffundere tilbake ut av cellen. De forblir derfor effektive over et lengre tidsrom og er opprettholdt ved forhøyede intracellulære konsentrasjoner, for derved å utvise forhøyet styrke. Mekanismene for forhøyet aktivitet i målvevet er antatt å omfatte økte opptak av målcellene, økt intracellulær retensjon eller at begge mekanismer arbeider sammen. Måten som selektiviteten eller den økte leveringen foregår på i målvevet, er imidlertid ikke viktig. Det er heller ikke viktig at all metabolsk omdannelse av prodrogen til morforbindelsen foregår innen målvevet. Det er kun den endelige medikamentaktivitetstildelende omdannelse som trenger å foregå i målvevet. Metabolismen i andre vev kan tilveiebringe intermediater som endelig omdannes til antivirale former i målvevet.

Graden av selektivitet eller økt leveranse som er ønsket, vil variere med mor-forbindelsen og måten det er målt på (% dosedistribusjon eller mor-medikament-konsentrasjon). Generelt kan, dersom mor-medikamentet allerede har et bredt terapeutisk vindu, en lav grad av selektivitet være tilstrekkelig for den aktuelle prodrogen. På den annen side kan toksiske forbindelser kreve mer vidtgående screening for å identifisere selektive prodroger. Den relative kostnad for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan reduseres ved kun å screene i målvevet og i vev hvor mor-forbindelsen er kjent å være relativt toksisk, for f.eks. PMEA, som er nefrotoksisk ved høyere doser, vil det primære fokus være på nyrer og lymfoide vev.

Trinnet for bestemmelse av den relative antivirale aktiviteten til en prodroge i de utvalgte vevene er vanligvis oppnådd ved å analysere mål- og ikke-målvevet med hensyn til det relative nærvær av eller aktivitet til en metabolitt av prodrogen, som er kjent for å ha eller omdannes til en metabolitt som har antiviral eller antitumoraktivitet. Således vil man karakteristisk bestemme den relative mengde av mormedikamentet i vevene hovedsakelig i det samme tidsforløpet for å identifisere prodroger som er fortrinnsvis metabolisert i målvevet til en antiviral eller antitumoraktiv metabolitt eller forløper derav, som i målvevet endelig produserer den aktive metabolitt. Når det gjelder antivirale forbindelser, er den aktive metabolitt difosfatet av mor-fosfonatforbindelsene. Det er denne metabolitten som innlemmes i den virale nukleinsyren og derved avkorter forlengelsen av nukleinsyretråden og stanser viral replikasjon. Metabolitter av prodrogen kan være anabolske metabolitter, katabolske metabolitter eller produkter av både anabolisme og katabolisme. Måten som metabolitten er produsert på, er ikke viktig i utførelsen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Fremgangsmåten, ifølge oppfinnelsen, er ikke begrenset til analyser av metabolitter som perse innehar antiviral eller antitumoraktivitet. I stedet kan man analysere inaktive forløpere til aktive metabolitter. Forløpere til antiviralt aktiv difosfat-metabolitt omfatter monofosfat fra mor-drogen, monofosfater av andre metabolitter av mordrogen (f.eks. en mellomliggende modifikasjon av en substituent på den heterosykliske base), mordrogen selv og metabolitter generert av cellen ved omdannelse av prodrogen til mordrogen før fosforylering. Forløperstrukturene kan variere vesentlig, ettersom de er et resultat av cellulær metabolisme. Denne informasjonen er imidlertid allerede kjent eller kan lett bestemmes av en fagperson innen teknikken.

Dersom prodrogen som blir analysert ikke utviser antitumor- eller antiviral aktivitet per se, så kan justeringer i forhold til råanalyseresultatene være nødvendig. Dersom f.eks. intracellulær prosessering av den inaktive metabolitt til en aktiv metabolitt foregår ved forskjellige hastigheter i de forskjellige vevene som blir testet, vil det være nødvendig å justere råanalyseresultatene av den aktive metabolitt for å ta hensyn til forskjellene blant celletypene, fordi den relevante parameter er dannelsen av aktivitet i målvevet, og ikke akkumulering av inaktive metabolitter. Bestemmelse av korrekt justering vil være innenfor ordinære kunnskaper. Når således fremgangsmåtens trinn (d) krever bestemmelse av aktiviteten, kan aktivitet enten måles direkte eller ekstrapoleres. Det betyr ikke at fremgangsmåten her er begrenset til bare analysering av intermediater som er aktive perse. For eksempel kan også fravær eller nedgang i prodrogen i testvevet også måles. Trinn (d) krever kun vurdering av aktiviteten utøvd av prodrogen når den interagerer med det aktuelle vevet, og dette kan baseres på ekstrapolering eller andre indirekte målinger.

Trinn (d) i metoden, ifølge denne oppfinnelsen, krever bestemmelse av "den relative" aktiviteten til prodrogen. Vil det være underforstått at dette ikke krever at hver eneste analyse eller serie av analyser nødvendigvis også må inneholde kjøringer med det utvalgte ikke-målvevet. Tvert imot er det innenfor omfanget av denne oppfinnelsen å anvende historiske kontroller for ikke-målvev eller vev, eller algoritmer som representerer resultater som forventes fra slike ikke-målvev i den hensikt å tilveiebringe en standard ikke-målaktivitet.

Resultatene oppnådd i trinn (d) anvendes deretter optimalt for å velge ut eller identifisere en prodroge som produserer større antiviral aktivitet i målvevet enn i ikke-målvevet. Det er denne prodrogen som velges for videre utvikling.

Man vil innse at en viss forhåndsvurdering av prodrogekandidater kan gjennomføres før fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen utføres. Foreksempel vil det være nødvendig at prodrogen er i stand til å passere i det alt vesentlige ikke-metabolisert gjennom mage-tarmkanalen, det vil være nødvendig at den er vesentlig stabil i blod og den skal, i hvert fall til en viss grad, være i stand til å trenge inn i celler. I de fleste tilfeller vil det også være nødvendig å fullføre en første passasje i den hepatiske sirkulasjon uten vesentlig metabolisme. Slike forhåndsstudier er valgfrie, og er vel kjent for fagfolk innen området.

Den samme begrunnelsen som er beskrevet ovenfor for antiviral aktivitet, er også gyldig for antitumorprodroger av metoksyfosfonatnukleotidanaloger. Disse omfatter f.eks. prodroger av PMEG, guanylanalogen av PMEA. I dette tilfellet er cytotoksiske fosfonater, slik som PMEG, verdt å gå videre med fordi deres cytotoksisitet faktisk bidrar med antitumoraktivitet.

En forbindelse identifisert ved denne nye screeningsfremgangsmåten kan innlemmes i et tradisjonelt preklinisk eller klinisk program for å bekrefte at det ønskede formålet er blitt oppnådd. Karakteristisk er en prodroge ansett for å være selektiv dersom aktiviteten eller konsentrasjonen av mordrogen i målvevet (% dosedistribusjon) er større enn 2 x, og fortrinnsvis 5 x, aktivitetenen til morforbindelsen i ikke-målvevet. Alternativt kan en prodrogekandidat sammenlignes med en standardprodroge. I dette tilfellet er selektiviteten relativ heller enn absolutt. Selektive prodroger vil være de som resulterer i større enn ca. 10 x konsentrasjon eller aktivitet i målvevet sammenlignet med prototypen, selv om graden av selektivitet er et spørsmål om skjønn.

Nv fremgangsmåte for fremstilling av startmaterialer eller intermediater

Også inkludert heri er en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av foretrukne startmaterialer (mordroger) ifølge denne oppfinnelsen, PMEA og (R)-PMPA. Denne fremgangsmåten omfatter karakteristisk reaksjon av 9-(2-hydroksypropyl)adenin (HPA) eller 9-(2-hydroksyetyl)adenin (HEA) med et magnesiumalkoksid, hvorpå det beskyttede aglykonsynton-p-toluensulfonyloksymetylfosfonat(tosylat) tilsettes til reaksjonsblandingen, og gjenvinning av PMPA eller PMEA.

Fortrinnsvis er den anrikede eller isolerte HPA, R-enantiomer. Dersom en kiral HPA-blanding anvendes kan R-PMPA isoleres fra den kirale PMPA-blandingen etter at syntesen er fullført.

Typisk er tosylatet beskyttet av lavere alkylgrupper, men andre egnede grupper vil også være åpenbare for fagmannen. Det kan være praktisk å anvende forhåndssubstituert tosylat med prodrogefosfonatsubstituenter som er i stand til å virke som beskyttende grupper i tosyleringsreaksjonen, og derved tillate en å omgå avbeskyttende trinn og direkte gjenvinne prodrogen eller et intermediat for dette.

Alkylgruppen til magnesiumalkoksid er ikke avgjørende og kan være ethvert Ci-6-forgrenet eller normalt alkyl, men er fortrinnsvis t-butyl (for PMPA) eller isopropyl (for PMEA). Reaksjonsbetingelsene er heller ikke kritiske, men omfatter fortrinnsvis oppvarming av reaksjonsblandingen til ca. 70-75 °C med omrøring eller annen moderat risting.

Dersom det ikke er noen interesse for å bevare fosfonatsubstituentene, avbeskyttes produktet (vanligvis med bromtrimetylsilan, hvor den tosylerte beskyttende gruppen er alkyl), og produktet gjenvinnes deretter ved krystallisering eller andre vanlige fremgangsmåter som vil være åpenbare for fagmannen.

Heterosyklisk base

I forbindelsene, ifølge denne oppfinnelsen, beskrevet i strukturene (3) og (4) er den heterosykliske base B valgt fra strukturene

hvor

R<15>er H, OH, F, Cl, Br, I, OR<16>, SH, SR<16>, NH2eller NHR<17>,

R<16>er d-C6-alkyl eller C2-C6-alkenyl, inkludert CH3, CH2CH3, CH2CCH, CH2CHCH2og C3H7,

R<17>er d-C6-alkyl eller C2-C6-alkenyl, inkludert CH3, CH2CH3, CH2CCH, CH2CHCH2og C3H7,

R<18>er N, CF, CCI, CBr, CI, CR<19>, CSR<19>eller COR<19>,

R<19>er H, Ci-Cg-alkyl, C2-C9-alkenyl, C2-C9-alkynyl, Ci-Cg-alkyl Ci-Cg-alkoksy eller C7-C9-aryl-alkyl, usubstituert eller substituert med OH, F, Cl, Br eller I, R<19>inkluderer derfor -CH3, -CH2CH3, -CHCH2, -CHCHBr, -CH2CH2CI, -CH2CH2F, -CH2-CCH, -CH2CHCH2, - C3H7, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2OC2H5, -CH2OCCH, -CH2-OCH2CHCH2, -CH2C3H7, -CH2CH2OH,

-CH2CH2OCH3, -CH2CH2OC2H5, -CH2CH2OCCH, -CH2CH2OCH2CHCH2og -CH2CH2OC3H7,

R<20>er N eller CH,

R<21>er N, CH, CCN, CCF3, CC^CH eller CC(0)NH2,

R<22>er H, OH, NH2, SH, SCH3, SCH2CH3, SCH2CCH, SCH2CHCH2, SC3H7, NH(CH3), N(CH3)2, NH(CH2CH3), N(CH2CH3)2, NH(CH2CCH), NH(CH2CHCH2), NH(C3H7), halogen (F, Cl, Br eller I) eller X, hvor X er -(CH2)m(O)n(CH2)mN(R<10>)2, hvor hver m uavhengig er 0-2, n er 0-1, og R<10>uavhengig er H, Ci-Ci5-alkyl, C2-Ci5-alkenyl, C6-Ci5-aryl-alkenyl, C6-Ci5-arylalkynyl, C2-Ci5-alkynyl, Ci-C6-alkylamino-Ci-C6-alkyl, C5-Ci5-aralkyl, C6-Ci5-heteroaralkyl, C5-C6-aryl, C2-C6-heterosykloalkyl, C2-Ci5-alkyl, C3-Ci5-alkenyl, C6-Ci5-arylalkenyl, C3-Ci5-alkynyl, C7-Ci5-arylalkynyl, Ci-C6-alkylamino-Ci-C6-alkyl, C5-Ci5-aralkyl, C6-Ci5-heteroalkyl eller C3-C6-heterosykloalkyl, hvor metylen i alkylgruppen som ikke er ved siden av N<6>, er erstattet med -O-, begge R<10>er valgfritt knyttet sammen med N for å danne en mettet eller umettet C2-C5-heteroring inneholdende 1 eller 2 N-heteroatomer og valgfritt et ytterligere O- eller S-heteroatom, eller en av de foregående R<10->gruppene som er substituert med 1-3 halogen, CN eller N3, men valgfritt er minst én R<10->gruppe ikke H,

R<23>er H, OH, F, Cl, Br, I, SCH3, SCH2CH3, SCH2CCH, SCH2-CHCH2, SC3H7, OR<16>, NH2, NHR<17>eller R22, og

R24 er O, S eller Se.

B omfatter også både beskyttede og ikke-beskyttede heterosykliske baser, særlig purin- og pyrimidinbaser. Beskyttende grupper for eksosykliske aminer og andre labile grupper er kjent (Greene et al., "Protective Groups in Organic Synthesis") og omfatter N-benzoyl, isobutyryl, 4,4'-dimetoksytrityl (DMT) og lignende. Valget av beskyttende gruppe vil være åpenbar for den gjennomsnittlige fagmannen og vil avhenge av egenskapene til den labile gruppen og kjemien som den beskyttende gruppen er forventet å møte, f.eks. sure, basiske, oksidative, reduktive eller andre betingelser. Eksempler på beskyttede grupper er N<4->benzoylcytosin, N<6->benzoyladenin, N<2->isobutyrylguanin og lignende.

Beskyttede baser har formel Xa.l, Xla.l, Xlb.l, XIIa.1 eller XIIIa.1

hvor R<18>, R<2>0,R2<1>, R<24>har betydningene som tidligere definert, R<22A>erR<39>eller R<22>, forutsatt atR22ikke er NH2,R23<A>er R<39>eller R<23>, forutsatt at R<23>ikke er NH2, R39 er NHR40,NHC(0)R<36>ellerCR41N(R<38>)2, hvor R<36>er Ci-Cig-alkyl, Ci-Cig-alkenyl, C3-Ci0-aryl, adamantoyl, alkylanyl

eller C3-Ci0-aryl substituert med 1 eller 2 atomer eller grupper valgt fra halogen, metyl, etyl, metoksy, etoksy, hydroksy og cyan, R38 er Ci-Cio-alkyl, eller begge R<38>sammen er 1-morfolin, 1-piperidin eller 1-pyrrolidin, R<40>er Ci-Cia-alkyl, omfattende metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, heksyl, oktyl og dekanyl, og R<41>er hydrogen eller CH3.

For basene ifølge strukturene Xla.l og Xlb.l, dersom R39 er til stede ved R<22A>eller R<23A>, vil beggeR39-gruppene på samme base generelt være det samme. R<36>er eksempelvis fenyl, fenyl substituert med én av de foregående R<36->arylsubstituentene, -Ci0-H15(hvor Ci0H15er 2-adamantoyl), -CH2-C6H5, -C6H5, -CH(CH3)2, -CH2CH3, metyl, butyl, t-butyl, heptanyl, nonanyl, undekanyl eller undekenyl.

Spesifikke baser omfatter hypoxantin, guanin, adenin, cytosin, inosin, tymin, uracil, xantin, 8-azaderivater av 2-aminopurin, 2,6-diaminopurin, 2-amino-6-klorpurin, hypoxantin, inosin og xantin; 7-deaza-8-azaderivater av adenin, guanin, 2-aminopurin, 2,6-diaminopurin, 2-amino-6-klorpurin, hypoxantin, inosin og xantin; 1-deazaderivater av 2-aminopurin, 2,6-diaminopurin, 2-amino-6-klorpurin, hypoxantin, inosin og xantin; 7-deazaderivater av 2-aminopurin, 2,6-diaminopurin, 2-amino-6-klorpurin, hypoxantin, inosin og xantin; 3-deazaderivater av 2-aminopurin, 2,6-diaminopurin, 2-amino-6-klorpurin, hypoxantin, inosin og xantin; 6-azacytosine, 5-fluorcytosin, 5-klorcytosin, 5-jodcytosin, 5-bromcytosin, 5-metylcytosin, 5-bromvinyluracil, 5-fluoruracil, 5-kloruracil, 5-joduracil, 5-bromuracil, 5-trifluormetyluracil, 5-metoksymetyluracil, 5-etynyluracil og 5-propynyluracil.

Fortrinnsvis er B et 9-purinylresidu valgt fra guanyl, 3-deazaguanyl, 1-deazaguanyl, 8-azaguanyl, 7-deazaguanyl, adenyl, 3-deazaadenyl, 1-dezazadenyl, 8-azaadenyl, 7-deazaadenyl, 2,6-diaminopurinyl, 2-aminopurinyl, 6-klor-2-aminopurinyl og 6-tio-2-aminopurinyl eller en B' er et 1-pyrimidinylresidu valgt fra cytosinyl, 5-halocytosinyl og 5-(Ci-C3-alkyl)cytosinyl.

Foretrukne B-grupper har formelen

hvor

R<22>uavhengig er halogen, oksygen, NH2, X eller H, men valgfritt er minst énR22X; X er -(CH2)m(O)n(CH2)mN(R<10>)2, hvor m er 0-2, n er 0-1, og R<10>uavhengig er H, Ci-Ci5-alkyl, C2-Ci5-alkenyl, C6-Ci5-arylalkenyl C6-Ci5-arylalkynyl, C2-Ci5-alkynyl, Ci-Ce-alkylamino-Ci-C6-alkyl, C5-Ci5-aralkyl, C6-Ci5-heteroaralkyl, C5-C6-aryl, C2-C6-heterosyklo-alkyl, C2-Ci5-alkyl, C3-Ci5-alkenyl, C6-Ci5-arylalkenyl, C3-Ci5-alkynyl, C7-Ci5-arylalkynyl, Ci-C6-alkylamino-Ci-C6-alkyl, C5-Ci5-aralkyl, C6-Ci5-heteroalkyl eller C3-C6-heterosykloalkyl, hvor metylen i alkylgruppen som ikke er i nabostilling i forhold til N<6>, er blitt erstattet med -O-, begge R<10>er valgfritt knyttet sammen med N for å danne en mettet eller umettet C2-C5-heteroring inneholdende 1 eller 2 N-heteroatomer og valgfritt et ytterligere O- eller S-heteroatom, eller én av de foregående R<10->gruppene er substituert med 1-3 halogen, CN eller N3, men valgfritt er minst én R<10->gruppe ikke H, og Z er N eller CH, forutsatt at heteroringens kjerne ikke er forskjellig fra purin i mer enn én Z.

E-grupper representerer aglykonene anvendt i metoksyfosfonatnukleotidanalogene. Fortrinnsvis er E-gruppen -CH2OCH(CH3)CH2eller -CH2OCH2CH2-. Det er også foretrukket at sidegruppene ved kirale sentre i aglykonet er i det alt vesentlige ene og alene i (R)-konfigurasjon (med unntak av hydroksymetyl, som er den anrikede (S)-enantiomer).

R<1>er en in vivo hydrolyserbar oksyester som har strukturen -OR<35>eller -OR<6>, hvor R<35>er definert i kolonne 64, linje 49, i US patentskrift nr. 5 798 340, som her er innlemmet gjennom referanse, og R6 er definert ovenfor. Fortrinnsvis er R<1>aryloksy, vanligvis usubstituert eller pa ra substituert (som definert i R<6>) fenoksy.

R<2>er et aminosyreresidu, eventuelt forutsatt at enhver karboksygruppe bundet med mindre enn ca. 5 atomer til amidatet N, er forestret. R<1>har karakteristisk strukturen

hvor

n er 1 eller 2,

R<11>erR<6>eller H, fortrinnsvis R6 = C3-C9-alkyl, C3-C9-alkyl substituert uavhengig med OH, halogen, O eller N, C3-C6-aryl, C3-C6-aryl som er uavhengig substituert med OH, halogen, O eller N, eller C3-C6-arylalkyl som er uavhengig substituert med OH, halogen, O eller N,

R<12>er uavhengig H eller Ci-Cg-alkyl som er usubstituert eller substituert med substituenter uavhengig valgt fra gruppen bestående av OH, O, N, COOR<11>og halogen, C3-C6-aryl som er usubstituert eller substituert med substituenter uavhengig valgt fra gruppen bestående av OH, O, N, COOR<11>og halogen, eller C3-C9-arylalkyl som er usubstituert eller substituert med substituenter uavhengig valgt fra gruppen bestående av OH, O, N, COOR<11>og halogen,

R<13>er uavhengig C(0)-OR<u>, amino, amide, guanidinyl, imidazolyl, indolyl, sulfoksid, fosforyl, Ci-C3-alkylamino, Ci-C3-alkyldiamino, Ci-C6-alkenylamino, hydroksy, tiol, Ci-C3-alkoksy, Ci-C3-alktiol, (CH2)nCOOR<u>, Q-Ce-alkyl som er usubstituert eller substituert med OH, halogen, SH, NH2, fenyl, hydroksyfenyl eller C7-Ci0, alkoksyfenyl, C2-C6-alkenyl som er usubstituert eller substituert med OH, halogen, SH, NH2, fenyl, hydroksyfenyl eller C7-Ci0-alkoksyfenyl og C6-Ci2-aryl som er usubstituert eller substituert med OH, halogen, SH, NH2, fenyl, hydroksyfenyl eller C7-Ci0-alkoksyfenyl, og

R<14>er H eller Ci-Cg-alkyl eller Ci-Cg-alkyl uavhengig substituert med OH, halogen, COOR<11>, O eller N, eller C3-C6-aryl, C3-C6-aryl som er uavhengig substituert med OH, halogen, COOR<11>, O eller N, eller C3-C6-arylalkyl som er uavhengig substituert med OH, halogen, COOR<11>, O eller N.

R<11>er fortrinnsvis d-C6-alkyl, mest foretrukket isopropyl, R<13>er sidekjeden til en naturlig forekommende aminosyre, n =1,R<12>er H, og R14 er H. I forbindelsen med struktur (2) omfatter oppfinnelsen metabolitter hvor fenoksy- og isopropylestere er blitt hydrolysert til -OH. Tilsvarende er de deforestrede, anrikede fosfonoamidatmetabolittene til forbindelsene (5a), 5(b) og (6) inkludert av omfanget av denne oppfinnelsen.

Aryl og "O"- eller "N"-substitusjoner er definert i kolonne 16, linjer 42-58, i US patentskrift nr. 5 798 340.

Karakteristisk er aminosyrene i sin naturlige form eller l-aminosyrer. Egnede spesifikke eksempler er utlagt frem i US patentskrift nr. 5 798 340, f.eks. i tabell 4 og kolonner 8-10 deri.

Alkyl er, når brukt her, med mindre noe annet er angitt, en normal, sekundær, tertiær eller syklisk hydrokarbon. Med mindre noe annet er angitt, er alkyl Ci-Ci2. Eksempler er -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH2CH2(CH3), - CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, -C(CH3)3, -CH2CH2CH2CH2CH3, -CH(CH3)CH2CH2CH3, - CH(CH2CH3)2, -C(CH3)2CH2CH3), -CH(CH3)CH(CH3)2, -CH2CH2CH(CH3)2), -CH2CH-(CH3)CH2CH3, -CH2CH2CH2CH2CH2, -CH(CH3)CH2CH2CH2CH3, -CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3), - C(CH3)2CH2CH2CH3, -CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3, -CH(CH3)CH2CH(CH3)2, -C(CH3)(CH2CH3)2, - CH(CH2CH3)CH(CH3)2, -C(CH3)2CH(CH3)2og -CH(CH3)C(CH3)3. Alkenyl og alkynyl er definert på samme måte, men inneholder henholdsvis minst én dobbel- eller trippelbinding.

Der hvor enol- eller ketogrupper er vist, skal de tilsvarende tautomerer også anses for beskrevet.

Prodrogeforbindelser, ifølge denne oppfinnelsen, er tilveiebrakt i form av fri base eller de ulike saltene listet opp i US patentskrift nr. 5 798 340, og er formulert med farmasøytisk akseptable eksipienser eller løsningsfortynnere for anvendelse som farmasøytiske produkter, som også er beskrevet i US patentskrift nr. 5 798 340. Disse prodrogene har den antivirale aktivitet og anvendelsesområdet allerede fastslått for mordrogene (se US patentskrift nr. 5 798 340 og andre referanser i forbindelse med metoksyfosfonatnukleotidanaloger). Det vil være underforstått at den diastereomere struktur (4) i det minste er nyttig som et intermediat i den kjemiske fremstillingen av mor- drogen ved hydrolyse in vitro, uavhengig av dets relativt ikke-selektive karakter, som avdekket i undersøkelsene heri.

Oppfinnelsen vil bli mer fullstendig forstått ved henvisning til de følgende eksempler:

Eksempel la

Adenin til PMEA ved anvendelse av maqnesiumisopropoksid

Til en oppløsning av adenin (16,8 g, 0,124 mol) i DMF (41,9 ml) ble det tilsatt etylenkarbonat (12,1 g, 0,137 mol) og natriumhydroksid (0,100 g, 0,0025 mol). Blandingen ble varmet opp til 130 °C natten over. Reaksjonen ble avkjølt til under 50 °C, og toluen (62,1 ml) ble tilsatt. Vellingen ble videre avkjølt til 5 °C i 2 timer, filtrert og renset med toluen (2 x). Det våte, faste stoffet ble tørket under vakuum ved 65 °C, hvorved man fikk 20,0 g (90 %) 9-(2-hydroksyetyl)adenin i form av et offwhite, fast stoff. Smeltepunkt: 238-240 °C.

9-(2-hydroksyetyl)adenin (HEA) (20,0 g, 0,112 mol) ble oppslemmet i DMF (125 ml) og varmet opp til 80 °C. Magnesiumisopropoksid (11,2 g, 0,0784 mol) eller alternativt magnesium-t-butoksid ble tilsatt til blandingen, etterfulgt av dietyl-p-toluensulfonyloksymetylfosfonat (66,0 g, 0,162 mol) i løpet av 1 time. Blandingen ble omrørt ved 80 °C i 7 timer. 30 ml flyktige forbindelser ble fjernet ved hjelp av vakuumdestillasjon, og reaksjonsblandingen ble tilsatt 30 ml nytt DMF. Etter avkjøling til romtemperatur ble bromtrimetylsilan (69,6 g, 0,450 mol) tilsatt, og blandingen ble varmet opp til 80 °C i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert, hvorved man fikk en tykk, viskøs masse. Den tykke, viskøse massen ble løst i 360 ml vann, ekstrahert med 120 ml diklormetan, pH ble justert til 3,2 med natriumhydroksid, og den resulterende vellingen ble omrørt ved romtemperatur natten over. Vellingen ble avkjølt til 4 °C i 1 time. De faste stoffene ble isolert ved filtrering, vasket med vann (2 x) og tørket under vakuum ved 56 °C, hvorved man fikk 20 g (65,4 %) 9-[2-(fosfonometoksy)etyl]adenin (PMEA) i form av et hvitt, fast

stoff. Smeltepunkt > 200<*>C, dek.<X>H-NMR (D20)»3,49 (t, 2 H), 3,94 (t, 2 H), 4,39 (t, 2 H), 8,13 (S, 1 H), 8,22 (s, 1 H).

Eksempel lb

Adenin til PMPA ved anvendelse av maqnesium- t- butoksid

Til en oppløsning av adenin (40 g, 0,296 mol) i DMF (41,9 ml) ble tilsatt (R)-propylenkarbonat (34,5 g, 0,338 mol) og natriumhydroksid (0,480 g, 0,012 mol). Blandingen ble varmet opp ved 130 °C natten over. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 100 °C, og toluen (138 ml) ble tilsatt, etterfulgt av metansulfonsyre (4,7 g, 0,049 mol) mens reaksjonstemperaturen ble opprettholdt mellom 100 og 110 °C. Ytterligere toluen (114 ml) ble tilsatt for å skape en homogen løsning. Løsningen ble avkjølt til 3 °C i løpet av 7 timer og deretter opprettholdt ved 3 °C i 1 time. Det resulterende faste stoffet ble isolert ved filtrering og renset med aceton (2 x). Det våte, faste stoffet ble tørket under vakuum ved 80 °C, hvorved man fikk 42,6 g (75 %) (R)-9-[2-(hydroksy)propyl]adenin (HPA) i form av et offwhite, fast stoff. Smeltepunkt: 188-190°C.

(R)-9-[2-(hydroksy)propyl]adenin (HPA) (20,0 g, 0,104 mol) ble oppløst i DMF (44,5 ml) og varmet opp til 65 °C. Magnesium-t-butoksid (14,2 g, 0,083 mol) eller alternativt magnesiumisopropoksid ble tilsatt til blandingen i løpet av 1 time, etterfulgt av dietyl-p-toluensulfonyloksymetylfosfonat (66,0 g, 0,205 mol) i løpet av 2 timer mens temperaturen ble holdt ved 78 °C. Blandingen ble omrørt ved 75 °C i 4 timer. Etter avkjøling til under 50 °C ble bromtrimetylsilan (73,9 g, 0,478 mol) tilsatt, og blandingen ble varmet opp til 77 °C i 3 timer. Når den var fullstendig, ble reaksjonsblandingen varmet opp til 80 °C, og flyktige forbindelser ble fjernet ved hjelp av atmosfærisk destillasjon. Den gjenværende rest ble løst i vann (120 ml) ved 50 °C og deretter ekstrahert med etylacetat (101 ml). pH i den vandige fasen ble justert til pH 11 med natriumhydroksid, krystallisert

med autentisk (R)-PMPA, og pH i det vandige laget ble rejustert til pH 2,1 med natriumhydroksid. Den resulterende vellingen ble omrørt ved romtemperatur over natten. Vellingen ble avkjølt til 4 °C i 3 timer. Det faste stoffet ble isolert ved filtrering, vasket med vann (60 ml) og tørket under vakuum ved 50 °C, hvorved man fikk 18,9 g (63,5 %) rå-(R)-9-[2(fosfonometoksy)propyl]adenin (PMPA) i form av et offwhite, fast stoff.

Rå-(R)-9-[2-(fosfonometoksy)propyl]adenin ble varmet opp med tilbakeløpskjøling i vann (255 ml) inntil alle faste stoffer var oppløst. Løsningen ble avkjølt til romtemperatur i løpet av 4 timer. Den resulterende vellingen ble avkjølt til 4 °C i 3 timer. Det faste stoffet ble isolert ved filtrering, vasket med vann (56 ml) og aceton (56 ml) og tørket under vakuum ved 50 °C, hvorved man fikk 15,0 g (50,4 %) (R)-9-[2-(fosfono-metoksy)propyl]adenin (PMPA) i form av et hvitt, fast stoff. Smeltepunkt: 278-280°C.

Eksempel 2

Fremstilling av GS- 7171 flin

En glasskledd reaktor ble tilsatt vannfritt PMPA, (I) (14,6 kg, 50,8 mol), fenol (9,6 kg, 102 mol) og l-metyl-2-pyrrolidinon (39 kg). Blandingen ble varmet opp til 85 °C, og trietylamin (6,3 kg, 62,3 mol) ble tilsatt. En løsning av 1,3-disykloheksylkarbodiimid (17,1 kg, 82,9 mol) i l-metyl-2-pyrrolidinon (1,6 kg) ble deretter tilsatt i løpet av 6 timer ved 100 °C. Oppvarmingen ble fortsatt i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 45 °C, vann (29 kg) ble tilsatt og avkjølt til 25 °C. Faste stoffer ble fjernet fra reaksjonsblandingen ved filtrering og renset med vann (15,3 kg). Det kombinerte filtratet og vaskevannet ble konsentrert til en brun velling under redusert trykk, og vann (24,6 kg) ble tilsatt og justert til pH = 11 med NaOH (25 % i vann). Fine partikler ble fjernet ved filtrering gjennom diatoméjord (2 kg), etterfulgt av rensing med vann (4,4 kg). Det kombinerte filtratet og rensevannet ble ekstrahert med etylacetat (28 kg). Den vandige løsningen ble justert til pH = 3,1 med HCI (37 % i vann) (4 kg). Rå-II ble isolert ved filtrering og vasket med metanol (12,7 kg). En våt kake av rå-II ble slemmet i metanol (58 kg). Faste stoffer ble fjernet ved filtrering, vasket med metanol (8,5 kg) og tørket under redusert trykk, hvorved man fikk 9,33 kg II i form av et hvitt pulver.<L>H-NMR (D20) 5 1,2 (d, 3 H), 3,45 (q, 2 H), 3,7 (q, 2 H), 4 (m, 2 H), 4,2 (q, 2 H), 4,35 (dd, 2 H), 6,6 (d, 2 H), 7 (t, 1 H), 7,15 (t, 2 H), 8,15 (s, 1 H), 8,2 (s, 1 H);<31>P-NMR (D20) 5 15,0 (utkoblet).

GS- 7171 ( III) ( reaksionsskiema 1)

En glasskledd reaktor ble tilsatt monofenyl-PMPA, (II) (9,12 kg, 25,1 mol) og acetonitril (30,7 kg). Tionylklorid (6,57 kg, 56,7 mol) ble tilsatt når temperaturen var under 50 °C. Blandingen ble varmet opp ved 75 °C inntil faste stoffer var oppløst. Reaksjonstemperaturen ble økt til 80 °C, og flyktige forbindelser (11,4 kg) ble samlet opp ved atmosfærisk destillasjon under nitrogen. Den gjenværende rest i reaksjonsbeholderen ble avkjølt til 25 °C, diklormetan (41 kg) ble tilsatt, og det ble avkjølt til -29 °C. En løsning av (L)-alaninisopropylester (7,1 kg, 54,4 mol) i diklormetan (36 kg) ble tilsatt i løpet av 60 minutter ved -18 °C, etterfulgt av trietylamin (7,66 kg, 75,7 mol) i løpet av 30 minutter ved

-18 til -11 °C. Reaksjonsblandingen ble varmet til romtemperatur og vasket fem ganger med natriumdihydrogenfosfatløsning (10 % i vann, 15,7 kg pr. vask). Den organiske

løsningen ble tørket med vannfritt natriumsulfat (18,2 kg), filtrert, vasket med diklormetan (28 kg) og konsentrert til en olje under redusert trykk. Aceton (20 kg) ble tilsatt til oljen, og blandingen ble konsentrert under redusert trykk. Aceton (18,8 kg) ble tilsatt til den resulterende oljen. Halve produktløsningen ble renset ved kromatografi over en 38 x 38 cm seng med 22 kg silikagel 60, med maskestørrelse 230-400. Kolonnen ble eluert med 480 kg aceton. Opprensingen ble gjentatt med den andre halvparten av oljen ved å benytte ny silikagel og aceton. Rene produktholdige fraksjoner ble konsentrert under redusert trykk til en olje. Acetonitril (19,6 kg) ble tilsatt til oljen, og blandingen ble konsentrert under redusert trykk. Acetonitril (66,4 kg) ble tilsatt, og løsningen ble avkjølt til 0-5 °C i 16 timer. Faste stoffer ble fjernet ved filtrering, og filtratet ble konsentrert under redusert trykk til 5,6 kg III i form av en mørk olje. ^-NMR (CDCI3) 5 1,1 (m 12 H), 3,7 (m, 1 H), 4,0 (m, 5 H), 4,2 (m, 1 H), 5,0 (m, 1 H), 6,2 (s, 2 H), 7,05 (m, 5 H), 8,0 (s, 1 H), 8,25 (d, 1 H);<31>P-NMR (CDCI3) 5 21,0, 22,5 (utkoblet).

Alternativ metode for GS- 7171 flin

Monofenvl- PMPA fin

En rundbunnet kolbe med tilbakeløpskondensator og nitrogeninngang ble plassert i et oljebad ved 70 °C. Kolben ble tilsatt vannfritt PMPA (1) (19,2 g, 67 mmol), N,N-dimetylformamid (0,29 g, 3,3 mmol) og tetrametylensulfon (40 ml). Tionylklorid (14,2 g, 119 mmol) ble tilsatt i løpet av 4 timer. Oppvarmingen ble økt til 100 °C i løpet av samme tidsrom. Resultatet ble en homogen løsning. Fenoksytrimetylsilan (11,7 g, 70 mmol) ble tilsatt til løsningen i løpet av 5 minutter. Oppvarming av oljebadet ved 100 °C fortsatte i 2 timer eller mer. Reaksjonsblandingen ble helt inn i raskt omrørt aceton (400 ml) med avkjøling til 0 °C. Faste stoffer ble isolert ved filtrering, tørket under redusert trykk og løst i metanol (75 ml). pH i løsningen ble justert til 3,0 med kaliumhydroksidløsning (45 % vandig) med avkjøling i is/vann. Det resulterende faste stoffet i form av et hvitt, pulver ble isolert ved filtrering, vasket med metanol og tørket under redusert trykk til 20,4 g II (reaksjonsskjema 2).

GS- 7171 flin

Monofenyl-PMPA (II) (3 g, 8,3 mmol), tetrametylensulfon (5 ml) og N,N-di-metylformamid (1 dråpe) ble slått sammen i en rundbunnet kolbe i et oljebad ved 40 °C. Tionylklorid (1,96 g, 16,5 mmol) ble tilsatt. Etter 20 minutter ble den klare løsningen fjernet fra varmen og fortynnet med diklormetan (10 ml) og tilsatt til en løsning av (L)-alaniniso-propylester (5 g, 33 mmol) og diisopropyletylamin (5,33 g, 41 mmol) i diklormetan (20 ml) ved -10 °C. Reaksjonsblandingen ble varmet til romtemperatur og vasket tre ganger med natriumdihydrogenfosfatløsning (10 % vandig, 10 ml pr. vask). Den organiske løsningen ble tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk til en olje. Oljen ble slått sammen med fumarsyre (0,77 g, 6,6 mmol) og acetonitril (40 ml) og varmet ved tilbakeløpskjøling for å gi en homogen løsning. Løsningen ble avkjølt i et isvannbad, og det faste stoffet ble isolert ved filtrering. Det faste stoffet, GS-7171-fumaratsalt, ble tørket under redusert trykk til 3,7 g. Saltet (3,16 g, 5,3 mmol) ble oppslemmet i diklormetan (30 ml) og ble omrørt med kaliumkarbonatløsning (5 ml, 2,5 M i vann) inntil det faste stoffet var oppløst. Det organiske sjikt ble isolert og deretter vasket med vann (5 ml), tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk for å gi 2,4 g III i form av et brungult skum.

Eksempel 3

A. Diastereomerseparasjon med batcheluerinqskromatoqrafi

Diastereomerer av GS-7171 (III) ble separert ved batchelueringskromatografi ved å anvende en kommersielt tilgjengelig "Chiralpak" AS, 20 nm, 21 x 250 mm semi-preparativ HPLC-kolonne med en "Chiralpak" AS, 20 nm, 21 x 50 mm beskyttelseskolonne. "Chiralpak" AS er et patentbeskyttet pakkemateriale fremstilt av Diacel og solgt i Nord-Amerika av Chiral Technologies, Inc. (US patentskrifter nr. 5 202 433, RE 35 919, 5 434 298, 5 434 299 og 5 498 752). "Chiralpak" AS er en kiral stasjonærfase (CSP) bestående av amylosetris[(S)-a-metylbenzylkarbamat] belagt på et støttemateriale av silikagel.

GS-7171-diastereomerblandingen ble løst i mobilfase, og porsjoner på ca. 1 g GS-7171 ble pumpet inn i det kromatografiske systemet. Den uønskede diastereomeren, betegnet GS-7339, utgjorde den første brede hovedtoppen (av ca. 15 minutters varighet) som eluerte fra kolonnen. Når GS-7339-toppen var eluert ferdig, ble mobilfasen umiddelbart endret til 100 % metylalkohol, som forårsaket at den ønskede diastereomer, betegnet GS-7340 (IV), ble eluert som en skarp topp fra kolonnen sammen med metylalkohol-løsningsfronten. Metylalkohol ble anvendt for å redusere den totale syklustiden. Etter de første par injeksjonene ble begge diastereomerer samlet opp som en enkelt stor fraksjon inneholdende en av de rensede diastereomerene (> 99,0 % enkeltdiastereomer). Mobil-faseløsningsmidlene ble fjernet under vakuum, hvorved man fikk rensede diastereomer i form av et skjørt skum.

Cirka 95 % av startvekten til GS-7171 ble gjenvunnet i de to diastereomere fraksjonene. GS-7340-fraksjonen omfattet ca. 50 % av den totale gjenvunne vekt.

De kromatografiske betingelsene var som følger:

Mobilfase (initielt): GS-7171 - acetonitril:isopropylalkohol

(90:10)

(slutt): 100 % metylalkohol Væskestrømhastighet: 10 ml/minutt

Kjøretid: ca. 45 minutter

Deteksjon: UV ved 275 nm

Temperatur: romtemperatur

Elueringsprofil: GS-7339 (diastereomer B)

GS-7340 (diastereomer A, (IV))

B. Diastereomerseparasion av GS- 7171 ved SMB- kromatoqrafi

For en generell beskrivelse av "simulated moving bed"-(SMB)kromatografi, se Strube et al., Organic Process Research and Development, 2:305-319 (1998).

GS- 7340 ( IV)

GS-7171 (III), 2,8 kg, ble renset ved hjelp av "simulated moving bed"-kromatografi over en 10 cm x 5 cm seng av pakkemateriale (Chiral Technologies Inc., 20 mikron "Chiralpak" AS belagt på silikagel) (1,2 kg). Kolonnene ble eluert med 30 % metanol i acetonitril. Produktholdige fraksjoner ble konsentrert til en løsning av IV i acetonitril (2,48 kg). Løsningen stivnet til en krystallinsk, våt masse med acetonitril ved henstand. Den krystallinske massen ble tørket under redusert trykk til et brungult, krystallinsk pulver, 1,301 kg IV, 98,7 % diastereomer renhet: smp. 117-120 °C.<X>H-NMR (CDCI3) 5 1,15 (m, 12 H), 3,7 (t, 1 H), 4,0 (m, 5 H), 4,2 (dd, 1 H), 5,0 (m, 1 H), 6,05 (s, 2 H), 7,1 (m, 5 H), 8,0 (s, 1 H), 8,2 (s, 1 H);<31>P-NMR (CDCI3) 5 21,0 (utkoblet<**>).

C. Diastereomerseparasjon ved hjelp av C18- RP- HPLC

GS-7171 (III) ble kromatografert med omvendt fase-HPLC for å separere diastereomerene ved å anvende den følgende sammendragsprotokoll.

Kromatografisk kolonne: "Phenomenex Luna" C18(2), 5 nm, 100 Å

porestørrelse (Phenomenex, Torrance, CA), eller tilsvarende

Beskyttelseskolonne: Pellicular C18 (Alltech, Deerfield, IL), eller

ekvivalent

Mobilfase: A - 0,02 % (85 %) H3P04i vann:acetonitril

(95:5)

B - 0,02 % (85 %) H3PO4i vann:acetonitril

(50:50)

Mobilfasegradient:

Kjøretid: 50 minutter

Likevektsforsinkelse: 10 minutter ved 100 % mobilfase A Væskestrømhastighet: 1,2 ml/minutt

Temperatur: romtemperatur

Deteksjon: UV ved 260 nm

Prøveløsning: 20 mM natriumfosfatbuffer, pH 6 Retensjonstid: GS-7339, ca. 25 minutter

GS-7340, ca. 27 minutter

D. Diastereomerseparasion ved krvstalliserina

GS- 7340 ( IV)

En løsning av GS-7171 (III) i acetonitril ble konsentrert til et gult skum (14,9

g) under redusert trykk. Skummet ble løst opp i acetonitril (20 ml) og krystallisert med en krystall av IV. Blandingen ble omrørt natten over og avkjølt til 5 °C, og det faste stoffet ble

isolert ved filtrering. Det faste stoffet ble tørket til 2,3 g IV i form av hvite krystaller, 98 %

diastereomer renhet (<31>P-NMR):<l>H NMR (CDCI3) 5 1,15 (m, 12 H), 3,7 (t, 1 H), 3,95 (m, 2 H), 4,05 (m, 2 H), 4,2 (m, 2 H), 5,0 (m, 1 H), 6,4 (s, 2 H), 7,1 (m, 5 H), 8,0 (s, 1 H), 8,2 (s, 1 H);<31>P-NMR (CDCI3) 5 19,5 (utkoblet). Røntgenkrystallografianalyser av en enkelt krystall valgt fra dette produktet gav følgende data:

Krystallfarge, form: fargeløs, kolonne

Krystalldimensjoner: 0,25 x 0,12 x 0,08 mm

Krystallsystem: ortorombisk

Atomnettverkstype: primitivt

Atomnettverksparametere: a = 8,352 (1) Å

b = 15,574 (2) Å

c = 18,253 (2) Å

V = 2374,2 (5) Å<3>

Romgruppe: P2i2!2!(#19)

Z-verdi: 4

Dka,k<:>1,333 g/cm<3>

Fooo: 1008,00

n(MoKa): 1,60 cm"<1>

Eksempel 4

Fremstilling av fumaratsalt av GS- 7340

GS- 7340- 02 ( V) ( reaksionsskiema 1)

En glasskledd reaktor ble tilsatt GS-7340 (IV) (1,294 kg, 2,71 mol), fumarsyre (284 g, 2,44 mol) og acetonitril (24,6 kg). Blandingen ble varmet med tilbakeløpskjøling for å løse opp det faste stoffet, filtrert mens den ennå var varm og avkjølt til 5 °C i 16 timer. Produktet ble isolert ved filtrering, vasket med acetonitril (9,2 kg) og tørket til 1329 g (V) i form av et hvitt pulver: smp. 119,7-121,1 °C; [ a]™ -41,7° (c 1,0, eddiksyre).

Eksempel 5

Fremstilling av GS- 7120 ( VP

En 5 I rundbunnet kolbe ble tilsatt monofenyl-PMPA, (II) (200 g, 0,55 mol) og acetonitril (0,629 kg). Tionylklorid (0,144 kg, 1,21 mol) ble tilsatt ved en temperatur under 27 °C. Blandingen ble varmet til 70 °C inntil faste stoffer var oppløst. Flyktige forbindelser (0,45 I) ble fjernet ved atmosfærisk destillasjon under nitrogen. Resten i reaksjonsbeholderen ble avkjølt til 25 °C, diklormetan (1,6 kg) ble tilsatt, og blandingen ble avkjølt til

-20 °C. En løsning av (L)-a-aminosmørsyreetylester (0,144 kg, 1,1 mol) i diklormetan (1,33 kg) ble tilsatt i løpet av 18 minutter ved -20 til -10 °C, etterfulgt av trietylamin (0,17 kg, 1,65 mol) i løpet av 15 minutter ved -8 til -15 °C. Reaksjonsblandingen ble varmet til romtemperatur og vasket fire ganger med natriumdihydrogenfosfatløsning (10 % vandig

løsning, 0,3 I pr. vask). Den organiske løsningen ble tørket med vannfritt natriumsulfat (0,5 kg) og filtrert. De faste stoffene ble vasket med diklormetan (0,6 kg), og det sammenslåtte filtratet og vaskevannet ble konsentrert til en olje under redusert trykk. Oljen ble renset ved kromatografi over en 15 x 13 cm seng med 1,2 kg silikagel 60, maskestørrelse 230-400. Kolonnen ble eluert med en gradient av diklormetan og metanol. Produktholdige fraksjoner ble konsentrert under redusert trykk for å gi 211 g VI (reaksjonsskjema 3) i form av et brungult skum.

Eksempel 5a

Diastereomersepa rasjon av GS- 7120 ved batcheluerinqskromatoqrafi

Den diastereomere blandingen ble renset ved å anvende betingelser beskrevet for GS-7171 i eksempel 3A med unntak av det følgende: Mobilfase (initiell): GS-7120 - acetonitril:isopropylalkohol

(98:2)

(slutt): 100 % metylalkohol

Elueringsprofil: GS-7341 (diastereomer B)

GS-7342 (diastereomer A)

Eksempel 6

Diastereomersepa rasjon av GS- 7120 ved krystallisasjon

En 1 I rundbunnet kolbe ble tilsatt monofenyl-PMPA, (II) (50 g, 0,137 mol) og acetonitril (0,2 I). Tionylklorid (0,036 kg, 0,303 mol) ble tilsatt med en temperaturøkning på 10 °C. Blandingen ble varmet ved tilbakeløpskjøling inntil faste stoffer var oppløst. Flyktige forbindelser (0,1 I) ble fjernet ved atmosfærisk destillasjon under nitrogen. Resten i reaksjonsbeholderen ble avkjølt til 25 °C, diklormetan (0,2 kg) ble tilsatt, og blandingen ble avkjølt til -20 °C. En løsning med (L)-a-aminosmørsyreetylester (0,036 kg, 0,275 mol) i diklormetan (0,67 kg) ble tilsatt i løpet av 30 minutter ved -20 til -8 °C, etterfulgt av trietylamin (0,042 kg, 0,41 mol) i løpet av 10 minutter ved opptil -6 °C. Reaksjonsblandingen ble varmet til romtemperatur og vasket fire ganger med natriumdihydrogen-fosfatløsning (10 % vandig, 0,075 I pr. vask). Den organiske løsningen ble tørket med vannfritt natriumsulfat (0,1 kg) og filtrert. De faste stoffene ble vasket med etylacetat (0,25 I, og det sammenslåtte filtratet og vaskevannet ble konsentrert til en olje under redusert trykk. Oljen ble fortynnet med etylacetat (0,25 I), krystallisert, omrørt over natten og avkjølt til -15 °C. Det faste stoffet ble isolert ved filtrering og tørket under redusert trykk for å gi 17,7 g GS-7342 (tabell 5) i form av et brungult pulver.<X>H-NMR (CDCI3) 5 0,95 (t, 3 H), 1,3 (m, 6 H), 1,7 (m, 2 H), 3,7 (m, 2 H), 4,1 (m, 6 H), 4,4 (dd, 1H), 5,8 (s, 2 H), 7,1 (m, 5 H), 8,0 (s, 1 H), 8,4 (s, 1 H);<31>P-NMR (CDCI3) 5 21 (utkoblet).

Eksempel 7

Diastereomersepa rasjon av GS- 7097

Den diastereomere blandingen ble renset ved å anvende betingelser beskrevet for GS-7171 i eksempel 3A med unntak av det følgende: Mobilfase (initiell): GS-7120 - acetonitril:isopropylalkohol

(95:5)

(slutt): 100 % metylalkohol

Elueringsprofil: GS-7115 (diastereomer B)

GS-7114 (diastereomer A)

Eksempel 8

Alternativ fremgangsmåte for fremstilling av GS- 7097

GS- 7097: fenyl- PMPA, etvl- L- alanvlamidat

Fenyl-PMPA (15,0 g, 41,3 mmol), L-alaninetylesterhydroklorid (12,6 g, 83 mmol) og trietylamin (11,5 ml, 83 mmol) ble blandet sammen i en velling i 500 ml pyridin under tørr N2. Denne suspensjonen ble kombinert med en løsning av trifenylfosfin (37,9 g, 145 mmol), aldritiol 2 (2,2'-dipyridyldisulfid) (31,8 g, 145 mmol) og 120 ml pyridin. Blandingen ble varmet ved en intern temperatur på 57 °C i 15 timer. Den fullstendige reaksjonen ble konsentrert under vakuum for å gi en gul masse, 100 g. Massen ble renset ved kolonnekromatografi over en 25 x 11 cm seng med 1,1 kg silikagel 60, maskestørrelse 230-400. Kolonnen ble eluert med 8 I 2 % metanol i diklormetan, etterfulgt av en lineær gradient over et forløp av 26 I eluent opp til en endelig sammensetning på 13 % metanol. Rene produktholdige fraksjoner ble konsentrert, hvorved man fikk 12,4 g rå-(5), teoretisk 65 %. Dette materialet var kontaminert med ca. 15 % (vekt) trietylaminhydroklorid som vist ved ^-NMR. Kontaminasjonen ble fjernet ved å løse opp produktet i 350 ml etylacetat, ekstrahere med 20 ml vann og tørke den organiske løsningen over vannfritt natriumsulfat og konsentrering, hvorved man fikk 11,1 g rent GS-7097 i form av et hvitt, fast stoff, utbytte 58 %. Fremgangsmåten er også anvendt for å syntetisere den diastereomere blandingen av GS-7003a og GS-7003b (fenylalanylamidatet) og blandingen av GS-7119 og GS-7335 (glysylamidatet). Disse diastereomerene separeres ved å anvende batcheluerings-fremgangsmåten som vist i eksemplene 3A, 6 og 7.

Eksempel 9

In wfro- studier av prodroqediastereomerer

In Wtro-anti-HIV-l-aktiviteten og cytotoksisiteten i MT-2-celler og stabilitet i humant plasma og MT-2-celleekstrakter av GS-7340 (fri base) og tenofovirdisoproksil-fumarat (TDF) er vist i tabell 1. GS-7340 viser en 10 gangers økning i antiviral aktivitet i forhold til TDF og en 200 gangers økning i plasmastabilitet. Denne høyere plasma-stabiliteten er forventet å resultere i høyere sirkulerende nivåer av GS-7340 enn TDF etter oral administrasjon.

For å estimere den relative intracellulære PMPA-konsentrasjon som et resultat av intracellulær metabolisme av TDF, sammenlignet med GS-7340, ble begge prodroger og PMPA radiomerket og innført i intakt humant fullblod ved ekvimolare konsentrasjoner. Etter 1 time ble plasma, røde blodcelleR (RBC-er) og perifere blodmononukleære celler (PBMC-er) isolert og analysert ved hjelp av HPLC med radiometrisk påvisning. Resultatene er vist i tabell 2.

Etter 1 time oppnår GS-7340 henholdsvis 10 x og 30 x den totale intracellulære konsentrasjonen av PMPA-typer i PBMC-er sammenlignet med TDF og PMPA. I plasma, etter 1 time er 84 % av radioaktiviteten forårsaket av intakt GS-7340, mens ikke noe TDF er påvist ved 1 time. Siden ikke noe intakt TDF er påvist i plasma, er forskjellen på 10 x ved 1 time mellom TDF og GS-7340 minimumsforskjellen forventet in vivo. HPLC-kromatogram for alle tre forbindelsene i PBMC-er er vist i figur 1.

Met. X og Met. Y (metabolitter X og Y) er vist i tabell 5. "Lower case" "p" angir fosforylering. Disse resultatene ble oppnådd etter 1 time i humant blod. Med økende tid er forskjellene in vitro forventet å øke, siden 84 % av GS-7340 fortsatt er intakt i plasma etter 1 time. Fordi intakt GS-7340 er til stede i plasma etter oral administrasjon, burde den relative kliniske effekten være relatert til IC50-verdier observert in vitro.

I tabell 3 nedenfor er IC50-verdier av tenofovir, TDF, GS-7340, flere nukleosider og proteaseinhibitoren nelfinavir listet opp. Som vist, er nelfinavir og GS-7340 2-3 ganger mer potent enn alle andre nukleotider eller nukleosider.

1. A.S. Mulato og J.M. Cherrington, Antiviral Research, 36, 91 (1997)

Ytterligere undersøkelser av anti-HIV-1 aktiviteten i in wtro-cellekultur og CC50for separerte diastereomerer ifølge oppfinnelsen ble utført, og resultatene er oppført i

tabellen nedenfor.

Referanse foranalyse: Arimilli, M.N. et al. (1997), Synthesis, in vitro biological evaluation and oral bioavailbility of 9-[2-(phosphonomethoxy)propyl]adenine (PMPA) prodrugs, Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 8(6):557-564.

"Phe-metylester" er metylfenylalaninylmonoamidat, fenylmonoester av tenofovir, "gly-metylester" er metylglysylmonoamidat, fenyl monoester av tenofovir.

I hvert tilfelle ovenfor er isomer A antatt å ha den samme absolutte stereokjemi som GS-7340 (S), og isomer B er antatt å ha samme absolutte stereokjemi som GS-7339.

In wtro-metabolisme og stabilitet av separerte diastereomerer ble bestemt i PLCE, MT-2-ekstrakt og humant plasma. En biologisk prøve, 80 ul, listet opp nedenfor, ble overført til et sentrifugerør med skrukork og inkubert ved 37 °C i 5 minutter. En løsning inneholdende 0,2 mg/ml av testforbindelsen i en egnet buffer, 20 ul, ble tilsatt den biologiske prøven og blandet. Reaksjonsblandingen, 20 ul, ble umiddelbart tatt ut og blandet med 60 ul metanol inneholdende 0,015 mg/ml 2-hydroksymetylnaftalen som en intern standard for HPLC-analyse. Prøven ble tatt som nulltidsprøve. Deretter ble, ved bestemte tidspunkter, 20 ul av reaksjonsblandingen tatt ut og blandet med 60 ul metanol inneholdende den interne standard. Blandingen oppnådd på denne måten ble sentrifugert ved 15 000 G i 5 minutter, og supernatanten ble analysert ved HPLC under betingelsene beskrevet nedenfor.

Følgende biologiske prøver er evaluert.

(1) PLCE (griseleverkarboksyesterase fra Sigma, 160n/mg protein, 21 mg protein/ml) fortynnet 20 ganger med PBS (fosfatbufret saltvann). (2) MT-2-celleekstrakt ble preparert fra MT-2-celler i henhold til den publiserte fremgangsmåten [A. Pompon, I. Lefebvre, J.-L. Imbach, S. Kahn og D. Farquhar, "Antiviral Chemistry & Chemotherapy", 5:91-98

(1994)], med unntak av at HEPES-buffer, som beskrevet nedenfor, ble anvendt som medium.

(3) Humant plasma (sammenslått normalt humant plasma fra George King

Biomedical Systems, Inc.).

Følgende buffersystemer er anvendt i undersøkelsene.

I studien av PLCE var testforbindelsen løst i PBS. PBS (fosfatbufret saltvann, Sigma) inneholder 0,01 M fosfat, 0,0027 M kaliumklorid og 0,137 M natriumklorid, pH 7,4 ved 37 °C.

I studien av MT-2-celleekstrakter var testforbindelsen løst i HEPES-buffer. HEPES-buffer inneholder 0,010 M HEPES, 0,05 M kaliumklorid, 0,005 M magnesiumklorid og 0,005 M dl-ditiotreitol, pH 7,4 ved 37 °C.

I studien av humant plasma var testforbindelsen løst i TBS. TBS (trisbufret saltvann, Sigma) inneholder 0,05 M Tris, 0,0027 M kaliumklorid og 0,138 M natriumklorid, pH 7,5 ved 37 °C.

HPLC-analysene ble utført under følgende betingelser.

Kolonne: Zorbax Rx-C8, 4,6 x 250 mm, 5 n (MAC-MOD Analytical, Inc., Chadds Ford, PA) Deteksjon: UV ved 260 nm

Væskestrøm hastig het: 1,0 ml/minutt

Kjøretid: 30 minutter

Injeksjonsvolum: 20 jllI

Kolonnetemperatur: romtemperatur

Mobilfase A: 50 mM kaliumfosfat (pH 6,0)/CH3CN =

95/5 (v/v)

Mobilfase B: 50 mM kaliumfosfat (pH 6,0)/CH3CN =

50/50 (v/v)

Gradientkjøring: 0 min 100 % mobilfase A

25 min 100 % mobilfase B 30 min 100 % mobilfase B Resultatene er vist nedenfor i tabell 5 (utvalgte IC50- resultater fra Tabell 4 er også inkludert).

Eksempel 10

Plasma- og PBMC- eksponerinq etter oral administrasjon av prodroqediastereomerer til beaqlehunder

Farmakokinetikken for GS-7340 ble studert i hunder etter oral administrasjon av 10 mg-ekv./kg dose.

Formuleringer

Prodrogene ble formulert som løsninger i 50 mM sitronsyre innen 0,5 time før dosene ble gitt. Alle forbindelsene anvendt i studiene ble syntetisert av Gilead Sciences. Følgende partier ble anvendt:

Doseadministrasion og prøveinnsamlinq

"In-life"-fasen av denne studien ble utført i overensstemmelse med anbe-falingene fra "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (National Institute of Health Publication 86-23) og ble godkjent av instituttkomiteen for dyrepleie og -anvendelse. Fastede hannbeaglehunder (10 ± 2 kg) ble anvendt i studiene. Hvert medikament ble administrert i form av en enkelt dose ved hjelp av oral gavage (1,5-2 ml/kg). Dosen var 10 mg-ekv. med PMPA/kg. For PBMC-er ble blodprøver samlet inn ved 0 (predose), 2,8 og 24 timer etter dose. For plasma ble blodprøver samlet inn ved 0 (predose), 5, 15 og 30 minutter, og 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 og 24 timer postdose. Blod (1,0 ml) ble prosessert umiddelbart for isolasjon av plasma ved sentrifugering ved 2000 rpm i 10 minutter. Plasma-prøver ble frosset og lagret ved -70 °C inntil de ble analysert.

Fremstilling av perifere blodmononukleære celler ( PBMC)

Fullblod (8 ml) tatt ved angitte tidspunkter ble blandet i like deler fosfatbufret saltvann (PBS), lagt på 15 ml Ficoll-Paque-løsning (Pharmacia Biotech.) og sentrifugert ved 400 x g i 40 minutter. PBMC-laget ble fjernet og vasket én gang med PBS. Den dannede PMBC-pelleten ble rekonstituert i 0,5 ml PBS, cellene ble resuspendert og talt ved å anvende hemocytometer, og lagret ved -70 °C inntil de ble analysert. Antallet celler multiplisert med gjennomsnittlig enkeltcellevolum ble anvendt i beregningen av intracellulære konsentrasjoner. En rapportert verdi på 200 femtoliter/celle ble anvendt som volumet til hvilende PBMC (B.L. Robins, R.V. Srinivas, C. Kim, N. Bischofberger og A. Fridland, Antimicrob. Agents Chemother., 42, 612 (1998).

Bestemmelse av PMPA og prodroger i plasma og PBMC- er

Konsentrasjonen av PMPA i hundeplasmaprøvene ble bestemt ved derivatisering av PMPA med kloracetaldehyd for å frembringe et meget fluorescerende N^N^etenadeninderivat (L. Naesens, J. Balzarini og E. De Clercq, Clin. Chem., 38, 480

(1992). Kort beskrevet ble 100 jllI plasma blandet med 200 ul acetonitril for å felle ut protein. Prøvene ble deretter fordampet til tørrhet under redusert trykk ved romtemperatur. Tørkede prøver ble rekonstituert i 200 jllI derivatiseringscocktail (0,34 % kloracetaldehyd i 100 mM natriumacetat, pH 4,5), virvelmikset og sentrifugert. Supernatanten ble deretter overført til et rent rør med skrukork og inkubert ved 95 °C i 40 minutter. Derivatiserte prøver ble deretter fordampet til tørrhet og rekonstituert i 100jllI vann før HPLC-analyse.

Før intracellulært PMPA kunne bestemmes ved hjelp av HPLC, måtte store mengder adenin forbundet med ribonukleotider som er til stede i PBMC-ekstraktene, fjernes ved selektiv oksidasjon. Vi anvendte en modifisert fremgangsmåte i henhold til Tanaka et al. (K. Tanaka, A. Yoshioka, S. Tanaka og Y. Wataya, Anal. Biochem., 139, 35 (1984)). Kort beskrevet ble PBMC-prøvene blandet 1:2 med metanol og fordampet til tørrhet under redusert trykk. De tørkede prøvene ble derivatisert som beskrevet i plasmaanalysen. Derivatiserte prøver ble blandet med 20 ul 1 M rhamnose og 30 jllI 0,1 M natriumperjodat og inkubert ved 37 °C i 5 minutter. Etter inkubasjonen ble 40jllI 4 M metylamin og 20 jllI 0,5 M inosin tilsatt. Etter inkubasjon ved 37 °C i 30 minutter ble prøvene fordampet til tørrhet under redusert trykk og rekonstituert i vann for HPLC-analyse.

Ingen intakt prodroge ble påvist i noen av PBMC-prøvene. For plasmaprøver som potensielt inneholdt intakte prodroger, ble eksperimenter utført for å bekrefte at ingen videre omdannelse til PMPA foregikk i løpet av derivatiseringen. Prodrogestandardene ble tilsatt til medikamentfritt plasma og derivatisert som beskrevet. Det var ingen påvisbare nivåer av PMPA til stede i noen av plasmaprøvene, og den projiserte omdannelsesprosent var mindre enn 1 %.

HPLC-systemet bestod av et P4000-løsningsleveringssystem med AS3000-autoinjektor og F2000-fluorescensdetektor (Thermo Separation, San Jose, CA). Kolonnen var en Inertsil ODS-2-kolonne (4,6 x 150 mm). Mobilfasene som ble anvendt, var: A, 5 % acetonitril i 25 mM kaliumfosfatbuffer med 5 mM tetrabutylammoniumbromid (TBABr), pH 6,0; B, 60 % acetonitril i 25 mM kaliumfosfatbuffer med 5 mM TBABr, pH 6,0. Væske-strømhastigheten var 2 ml/minutt, og kolonnetemperaturen ble opprettholdt ved 35 °C ved hjelp av en kolonneovn. Gradientprofilen var 90 % A/10 % B i 10 minutter for PMPA og 65 % A/35 % B i 10 minutter for prodrogen. Påvisning var ved fluorescens med eksitasjon ved 236 nm og emisjon ved 420 nm, og injeksjonsvolumet var 10 ul. Resultater ble opparbeidet og lagret på et laboratoriedataopparbeidelsessystem (PeakPro, Beckman, Allendale, NJ).

Farmakokinetiske beregninger

PMPA- og prodrogeeksponeringer ble uttrykt som områder under konsentrasjonskurven i plasma eller PBMC fra 0 til 24 timer (AUC). AUC-verdiene ble beregnet ved å anvende trapezoidalregelen.

Plasma- og PBMC- konsentrasioner

Resultatene av denne undersøkelsen er vist i figurene 2 og 3. Figur 2 viser tidskurven til GS-7340-2-metabolismen oppsummert for plasma- og PBMC-eksponeringer etter oral administrasjon av rene diastereoisomerer av PMPA-prodroger.

Søylediagrammet i figur 2 viser AUC (0-24 timer) for tenofovir i PBMC-er og plasma fra hund etter s.c. administrasjon av PMPA, TDF og amidatesterprodroger. Alle amidatprodrogene utviste økninger i PBMC-eksponering. For eksempel resulterte GS-7340 i en ca. 21 gangers økning i PBMC-eksponering sammenlignet med PMPA s.c. og TDF; og en henholdsvis 6,25 gangers og 1,29 gangers nedgang i plasmaeksponeringen.

Disse dataene fastslår at GS-7340 in vivo kan leveres oralt, minimaliserer systemisk eksponering til PMPA og sterkt forhøyer den intracellulære konsentrasjonen av PMPA i cellene som primært er ansvarlige for HIV-replikasjon.

Eksempel 11

Biodistribusion av GS- 7340

Som del av den prekliniske karakteriseringen av GS-7340 ble dets biodistribusjon i hunder bestemt. Vevsdistribusjonen av GS-7340

(isopropylalaninylmonoamidat, fenyl monoester av tenofovir) ble undersøkt etter oral administrasjon til beaglehunder. To hanndyr ble gitt orale doser med<14>C=GS-7340(8,85 mg-ekv. PMPA/kg, 33,2nCi/kg, 8-karbonet til adenin er merket) i en vandig løsning (50 mM sitronsyre, pH 2,2). Plasma og perifere blodmononukleære celler (PBMC-er) ble skaffet til veie i løpet av en 24 timers periode. Urin og feces ble samlet inn fra buret i løpet av 24 timer. Ved 24 timer etter dosen ble dyrene avlivet, og vev til analyse ble fjernet. Total radioaktivitet i vevene ble bestemt ved oksidasjon og væskescintillasjonstelling.

Biodistribusjonen av PMPA etter 24 timer etter en enkelt oral dose av radiomerket GS-7340 er vist i tabell 4 sammen med resultater fra en tidligere studie med TDF (GS-4331). Når det gjelder TDF, er prodrogekonsentrasjonen i plasma under analysens deteksjonsnivå, og hovedtypen observert i plasma er mordrogen. Nivåene til PMPA i de lymfatiske vev, benmarg og skjelettmuskulatur er økt 10 ganger etter administrasjon av GS-7340.

Akkumulering i lymfatiske vev er i overensstemmelse med resultatene observert fra PBMC-analysene, siden disse vevene er sammensatt primært av lymfocytter. Likeledes er akkumulering i benmargen sannsynligvis årsaken til den høye prosenten av lymfocytter (70 %) i dette vevet.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av 9-[2-(fosfonometoksy)propyl]adenin, karakterisert ved at den omfatter reaksjon av 9-(2-hydroksypropyl)adenin (HPA) eller 9-(2-hydroksyetyl)adenin (HEA), magnesiumalkoksid og beskyttet p-toluensulfonyloksymetylfosfonat.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor den videre omfatter gjenvinning av henholdsvis PMPA eller PMEA.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvor fosfonatet til p-toluensulfonyloksymetylfosfonat er beskyttet av etylester.

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3, hvor alkoksidet er et Ci -6 -alkoksid.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvor alkoksidet er t-butyl eller isopropyloksid.