ES2627903T3 - Profármacos de análogos de nucleótidos de fosfonato y métodos para seleccionar y preparar los mismos - Google Patents

Abstract

Un método para la fabricación de 9-[2-(fosfonometoxi)propil]adenina (PMPA) o 9-[2-(fosfonometoxi)etil] adenina (PMEA) que comprende hacer reaccionar 9-(2-hidroxipropil)adenina (HPA) o 9-(2-hidroxietil)adenina (HEA),, alcóxido de magnesio, y p-toluenosulfonoloxometilfosfonato protegido.

Description

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Profarmacos de analogos de nucleotidos de fosfonato y metodos para seleccionar y preparar los mismos Descripcion

Esta solicitud se refiere a profarmacos de analogos de nucleosidos de metoxifosfonato. En particular, esta se refiere a metodos mejorados para preparar e identificar dichos profarmacos.

Se conocen muchos analogos de nucleotidos de metoxifosfonato. En general, dichos compuestos tienen la estructura A-OCH2P(O)(OR)2 donde A es el resto de un analogo de nucleosido y R es independientemente hidrogeno o diversas funcionalidades protectoras o de profarmacos. Veanse las Patentes de los Estados Unidos N° 5.663.159, 5.977.061 y 5.798.340, Oliyai et al, "Pharmaceutical Research" 16(11):1687-1693 (1999), Stella et al., (J. M ed. Chem, 23(12):1275-1282 (1980). Aarons, L., Boddy, A, y Petrak, K. (1989) Novel Drug Delivery and Its Therapeutic Application (Prescott, L. F. y Nimmo, W. S., ed., paginas. 121-126; Bundgaard, H. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) paginas 70-74 y 79-92; Banerjee, P. K. y Amidon, G. L. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) paginas. 118-121; Notari, R. E. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) paginas 135156; Stella, V. J. arid Himmelstein, K. J. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) paginas 177-198; Jones, G. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) paginas 199-241; Connors, T. A. (1985) Design of Prodrugs (Bundgaard, H., ed.) paginas 291-316. El documento US 5.977.089 describe la smtesis de 9-[2- (fosfonometoxi)propil]adenina. El documento WO 00/35460 describe la smtesis de 9-[2-(fosfonometoxi)etil]adenina

Sumario de la invencion

Los profarmacos de analogos de nucleotidos de metoxifosfonato que se destinan a la terapia antiviral o antitumoral, aunque son conocidos, se han seleccionado tradicionalmente por su efecto sistemico. Por ejemplo, dichos profarmacos se han seleccionado por su biodisponibilidad potenciada, es decir, su capacidad para ser absorbidos del tracto gastrointestinal y convertirse rapidamente en el farmaco parental para asegurar que el farmaco parental esta disponible en todos los tejidos. Sin embargo, los solicitantes han descubierto actualmente que es posible seleccionar profarmacos que se enriquecen en los sitios terapeuticos, tal como se ilustra por los estudios que se describen en el presente documento en los que los analogos estan enriquecidos en sitios focales localizados de infection por VIH. El objetivo de esta invencion es, entre otras ventajas, producir menos toxicidad para los tejidos circundantes y mayor potencia del farmaco parental en tejidos que son las dianas de la terapia con el analogo de nucleotidos de metoxifosfonato parental.

Por consiguiente, en virtud de estas observaciones, se uso un metodo de exploration para identificar un profarmaco de un analogo de nucleotido de metoxifosfonato que conferia una actividad potenciada en un tejido diana que comprende:

(a) proporcionar al menos uno de dichos profarmacos;

(b) seleccionar al menos una diana tisular terapeutica y al menos un tejido no diana;

(c) administrar el profarmaco al tejido diana y a dicho al menos un tejido no diana; y

(d) determinar la actividad antiviral relativa conferida por el profarmaco en los tejidos en la etapa (c).

En realizaciones preferentes, los tejidos diana son sitios donde el VIH se replica activamente y/o que sirven como reservorio del VIH, y el tejido no diana es un animal intacto. Inesperadamente, se descubrio que la selection del tejido linfoide como tejido diana para la puesta en practica de este metodo para VIH condujo a la identification de profarmacos que potencian el suministro de farmaco activo a dichos tejidos.

Un compuesto preferido de esta divulgation, que se ha identificado por este metodo tiene la estructura (1),

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donde Ra es H o metilo,

y composiciones quiralmente enriquecidas del mismos, sales, su base libre y solvatos de los mismos. Un compuesto preferido de esta divulgacion tiene la estructura (2)

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Y sus diastereomeros, sales, base libre y solvatos enriquecidos.

Ademas, se descubrio inesperadamente que la quiralidad de los sustituyentes del atomo de fosforo y/o el sustituyente amidato influyen en el enriquecimiento observado en la puesta en practica de esta divulgacion. As^ en otra realization de la divulgacion, se proporcionan compuestos enriquecidos diastereomericamente que tienen la estructura (3)

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que estan sustancialmente libres del diastereomero (4)

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en la que

R1 es un oxiester que es hidrolizable in vivo, o hidroxilo;

B es una base heteroticlica;

R2 es hidroxilo, o el resto de un aminoacido unido al atomo de P a traves de un grupo amino del aminoacido y que tiene cada sustituyente carboxi del aminoacido opcionalmente esterificado, pero ambos R1 y R2 no son hidroxilo;

E es -(CH2)2-, -CH(CH3)CH2-, -CH(CH2F)CH2-, -CH(CH2OH)CH2-, -CH(CH=CH2)CH2-, -CH(CeCH)CH2-, - CH(CH2N3)CH2-,

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-CH(R6)OCH(R6)-, -CH(R®)CH2O- o -CH(R8)O-, en el que el enlace de la derecha esta unido a la base heterodclica;

la lmea discontinua representa un doble enlace opcional;

R4 y R5 son independientemente hidrogeno, hidroxi, halo, amino o un sustituyente que tiene 1-5 atomos de carbono seleccionados de aciloxi, alquiloxi, alquiltio, alquilamino y dialquilamino;

R6 y R6 son independientemente H, alquilo C1-C6, hidroxialquilo C1-C6 o alcanoflo C2-C7;

R7 es independientemente H, alquilo C1-C6, o se toman conjuntamente para formar -O- o -CH2-;

R8 es H, alquilo C1-C6, hidroxialquilo C1-C6 o haloalquilo C1-C6; y R9 es H, hidroximetilo o aciloximetilo;

y sus sales, bases libres, y solvatos.

Los diastereomeros de estructura (3) se designan como isomeros (S) en el centro quiral del fosforo.

Las realizaciones preferidas de esta divulgacion son los compuestos enriquecidos diastereomericamente que tienen la estructura (5a)

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que esta sustancialmente libre del diastereomero (5b)

en la que

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R5 es metilo o hidrogeno;

R6 es independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o arilalquilo, o R6 es independientemente alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o arilalquilo que se sustituye con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados de alquilamino, alquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, dialquilamino, hidroxilo, oxo, halo, amino, alquiltio, alcoxi, alcoxialquilo, ariloxi, ariloxialquilo, arilalcoxi, arilalcoxialquilo, haloalquilo, nitro, nitroalquilo, azido, azidoalquilo, alquilacilo, alquilacilalquilo, carboxilo o alquilacilamino;

R7 es la cadena lateral de cualquier aminoacido de origen natural o farmaceuticamente aceptable y en el cual, si la cadena lateral comprende un carboxilo, el grupo carboxilo esta esterificado opcionalmente con un grupo alquilo o arilo;

R11 es amino, alquilamino, oxo, o dialquilamino; y

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R12 es amino o H,

y sus sales, tautomeros, bases libres y solvatos.

Una realizacion preferida de esta divulgacion es el compuesto de estructura (6), 9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1- (isopropoxicarbonil)etil]amino]fenoxifosfinil]metoxi]propil]adenina, tambien denominado en el presente documento como GS-7340.

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Otra realizacion preferida de esta divulgacion es la sal de fumarato de la estructura (5) (estructura (7)), fumarato de 9-[(R)-2-[(S)-[[(S)-1-(isopropoxicarbonil)etil]amino]fenoxifosfinil]metoxi]propil]adenina (1:1), tambien denominada en el presente documento como GS-7340-2.

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Los compuestos de las estructuras (1)-(7) se formulan opcionalmente en composiciones que contienen excipientes farmaceuticamente aceptables. Dichas composiciones se usan en dosis eficaces en la terapia o profilaxis de las infecciones virales (particularmente por VIH y hepadnavirales).

La presente invencion proporciona un metodo para la fabricacion facil de 9-[2-(fosfonometoxi)propil]adenina (en lo sucesivo "PMPA" o 9-[2-(fosfonometoxi)etil] adenina (en lo sucesivo "PMEA") usando alcoxido de magnesio, que comprende combinar 9-(2-hidroxipropil)adenina o 9-(2-hidroxietil)adenina, p-toluenosulfoniloximetilfosfonato protegido y alcoxido de magnesio, y recuperar PMPA o PMEA, respectivamente.

Descripcion detallada de la invencion

Los farmacos parentales de los analogos de nucleotidos de metoxifosfonato para su uso en este metodo de exploracion son compuestos que tienen la estructura A-CH2P(O)(OH)2 en la que A es el resto de un analogo de nucleosido. Estos compuestos se conocen de por sf y no son parte de esta invencion. Mas en particular, los compuestos parentales comprenden una base heterodclica B y un aglucon E, que en general tiene la estructura

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B—E—P—OH

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en la que el grupo B se define mas adelante y el grupo E se define anteriormente. Se describen ejemplos en las Patentes de los Estados Unidos N° 4.659.825, 4.808.716, 4.724.233, 5.142.051, 5.130.427, 5.650.510, 5.663.159, 5.302.585, 5.476.938, 5.696.263, 5.744.600, 5.688.778, 5.386.030, 5.733.896, 5.352.786 y 5.798.340 y los documentos EP 821.690 y 654.037.

Los profarmacos para su uso en el metodo de exploracion de esta divulgacion son analogos covalentemente modificados de los analogos de nucleotidos de metoxifosfonato parentales descritos en el parrafo anterior. En general, el atomo de fosforo del farmaco parental es el sitio preferido para la modificacion del profarmaco, pero se encuentran otros sitios en la base heterodclica B o del aglucon E. Muchos de dichos profarmacos ya se conocen. Principalmente, estos son esteres o amidatos del atomo de fosforo, pero tambien incluyen sustituciones en la base y el aglucon. Ninguna de estas modificaciones de por sf son parte de esta invencion y ninguna se considerara limitante del alcance de la invencion del presente documento.

El atomo de fosforo de los analogos de nucleotidos de metoxifosfonato contiene dos valencias para las modificaciones covalentes tales como la amidacion o esterificacion (a menos que un fosforil hidroxilo se esterifique con un sustituyente hidroxilo del aglucon E, despues de lo cual solamente queda una valencia del fosforo libre para la sustitucion). Los esteres son normalmente ariloxi. Los amidatos generalmente son monoaminoacidos de origen natural que tienen grupo(s) carboxilo(s) libre(s) esterificados con un grupo alquilo o arilo, habitualmente grupos fenilo, cicloalquilo, o grupos t-, o s- alquilo. Se divulgan profarmacos adecuados para su uso en el metodo de exploracion, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos N° 5.798.340. Sin embargo, cualquier profarmaco que se crea que es potencialmente capaz de convertirse in vivo, dentro de las celulas del tejido diana, en el farmaco parental del analogo de nucleotido de metoxifosfonato libre, por ejemplo, bien mediante hidrolisis, oxidacion, u otra transformacion covalente que sea el resultado de la exposicion a tejidos biologicos, es adecuado para su uso en el metodo de esta invencion. Puede que dichos profarmacos no se conozcan en este momento, pero se identifiquen en el futuro y, por lo tanto, se conviertan en candidatos adecuados disponibles para ensayarlos en el metodo. Dado que los profarmacos son simplemente candidatos para la exploracion en los metodos, sus estructuras no son relevantes para practicar o permitir el metodo de exploracion, aunque, por supuesto, sus estructuras finalmente disponen si un profarmaco mostrara o no selectividad en el ensayo.

Los pro-restos unidos al farmaco parental pueden ser los mismos o distintos. Sin embargo, cada profarmaco que se va a usar en el ensayo de exploracion diferira estructuralmente de los otros profarmacos a ensayar. En general, se seleccionan profarmacos diferentes, es decir, distintos estructuralmente, basandose bien en su estereoqmmica o en su estructura covalente, o estas caractensticas vanan en combinacion. Cada profarmaco ensayado, sin embargo, de modo deseable, es estructural y estereoqmmicamente sustancialmente puro, de lo contrario el resultado del ensayo de exploracion sera de menos utilidad. Esta, por supuesto, dentro del alcance de esta invencion ensayar unicamente un solo profarmaco en una realizacion individual del metodo de esta invencion, aunque normalmente despues se comparanan los resultados con estudios anteriores con otros profarmacos.

Se ha descubierto que la estereoqmmica de los profarmacos es capaz de influir en el enriquecimiento en los tejidos diana. Los sitios quirales estan en el atomo de fosforo y tambien se encuentran en sus sustituyentes. Por ejemplo, los aminoacidos que se usan en la preparacion de amidatos pueden estar en las formas D o L, y los esteres de fosfonato o los esteres de aminoacidos tambien pueden contener centros quirales. Tambien se encuentran sitios quirales en la parte del analogo de nucleosido de las moleculas, pero estos normalmente ya estan dictados por la estereoqmmica del farmaco parental y no variaran como parte de la exploracion. Por ejemplo, se prefiere el isomero R de PMPA, ya que este es mas activo que el isomero S correspondiente. Normalmente, estos diastereomeros o enantiomeros se enriqueceran quiralmente si no puros en cada sitio de modo que los resultados de la exploracion seran mas significativos. Tal como ha indicado, la distincion de los estereoisomeros se confiere mediante enriquecimiento o purificacion del estereoisomero (normalmente este sera un diastereomero mas que un enantiomero en el caso de la mayor parte de los analogos de nucleotidos de metoxifosfonato) libre de otros estereoisomeros en el centro quiral en cuestion, de modo que cada compuesto de ensayo sea sustancialmente homogeneo. Por sustancialmente homogeneo o quiralmente enriquecido, se entiende que el estereoisomero deseado constituye mas de aproximadamente el 60 % en peso del compuesto, generalmente mas de aproximadamente el 80 % y preferentemente mas de aproximadamente el 95 %.

Nuevo Metodo de Exploracion

Una vez que se ha seleccionado al menos un profarmaco candidato, se usan las etapas restantes del metodo de exploracion para identificar un profarmaco que posea la selectividad requerida para el tejido diana. Mas convenientemente, se marcan los profarmacos con un grupo detectable, por ejemplo, se marcan radiactivamente, con el fin de facilitar la deteccion mas tarde en los tejidos o celulas. Sin embargo, no se requiere un marcador dado que pueden emplearse tambien otros ensayos adecuados para el profarmaco o sus metabolitos (incluyendo el farmaco parental). Estos ensayos podnan incluir, por ejemplo, espectrometna de masas, HPLC, bioensayos o inmunoensayos. El ensayo puede detectar el profarmaco y uno cualquiera o mas de sus metabolitos, pero

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preferentemente se lleva a cabo el ensayo para detectar unicamente la generacion del farmaco parental. Esto se basa en la asuncion (que podna no estar garantizada en todos los casos) de que el grado y la velocidad de conversion del profarmaco en el difosfato parental antiviralmente activo es la misma en todos los tejidos ensayados. Por otra parte, se puede ensayar para el difosfato.

El tejido diana sera preferentemente tejido linfoide cuando la exploracion sea para profarmacos utiles en el tratamiento de una infeccion por VIH. El tejido linfoide se conocera por el experto e incluye celulas CD4, linfocitos, ganglios linfaticos, macrofagos y celulas similares a macrofagos incluyendo monocitos tales como celulas monodticas de sangre periferica (PBMC) y celulas gliales. El tejido linfoide tambien incluye tejidos no linfoides que estan enriquecidos en tejidos o celulas linfoides, por ejemplo, pulmon, piel y bazo. Otras dianas para otros farmacos antivirales seran, por supuesto, los sitios principales de replicacion o latencia del virus particular concerniente, por ejemplo, Idgado para la hepatitis y nervios perifericos para el VHS. De manera similar, los tejidos diana para los tumores seran, de hecho, los tumores en su Estos tejidos se conocen bien por el experto y podnan no requerir experimentacion excesiva para la seleccion. Cuando se hace la exploracion para compuestos antivirales, el tejido diana puede estar infectado por el virus.

Tambien se exploran los tejidos o celulas no diana como una parte del metodo del presente documento. Puede emplearse cualquier numero o identidad de dichos tejidos o celulas a este respecto. En general, se usaran los tejidos para los cuales se espera que el farmaco parental sea toxico como tejidos no diana. La seleccion de un tejido no diana depende completamente de la naturaleza del profarmaco y de la actividad del parental. Por ejemplo, los tejidos no hepaticos se seleccionanan para los profarmacos contra la hepatitis, y las celulas no transformadas del mismo tejido como el tumor bastaran para la exploracion selectiva de profarmacos antitumorales.

Cabe destacar que el metodo es diferente del que se estudia normalmente para llevarse a cabo en la determinacion de la biodisponibilidad oral de profarmacos. En los estudios de biodisponibilidad oral, el objetivo es identificar un profarmaco que pasa a la circulacion sistemica sustancialmente convertido en el farmaco parental. En la presente invencion, el objetivo es encontrar profarmacos que no se metabolizan en el tracto gastrointestinal o la circulacion. Por lo tanto, los tejidos diana a evaluar en el metodo generalmente no incluyen al intestino delgado o, si se incluyera el intestino, entonces los tejidos tambien incluinan otros tejidos adicionales distintos al intestino delgado.

Los tejidos diana y no diana que se usan en el metodo de exploracion normalmente estaran en un animal vivo intacto. Los profarmacos que contienen esteres se ensayan mas deseablemente en perros, monos u otros animales distintos de roedores; el plasma de ratones y ratas contiene altos niveles circulantes de esterasas que pueden producir un resultado enganoso si el sujeto terapeutico es un ser humano o un mairnfero superior.

No es necesario practicar este metodo con animales intactos. Tambien se encuentra dentro del alcance de esta invencion emplear organos perfundidos, cultivo in vitro de organos (por ejemplo, injertos de piel) o lmeas celulares mantenidas en diversas formas de cultivo celular, por ejemplo, frascos rotatorios o sistemas de suspension de gravedad cero. Por ejemplo, pueden usarse celulas MT-2 como una diana tisular para seleccionar profarmacos para VIH. Por lo tanto, no debe interpretarse que el termino "tejido" requiera de estructuras celulares organizadas, o las estructuras de tejidos tal como estos pueden encontrarse en la naturaleza, aunque tales senan preferibles. Mas bien, el termino "tejido" debe interpretarse como un sinonimo de celulas de una fuente, origen o estadio de diferenciacion particular.

El tejido diana y el no diana pueden ser de hecho el mismo tejido, pero los tejidos estaran en un estado biologico distinto. Por ejemplo, podna usarse el metodo del presente documento para seleccionar profarmacos que confieren actividad en un tejido infectado con virus (tejido diana), pero que permanecen sustancialmente inactivos en celulas no infectadas con virus (correspondientes al tejido no diana). Podna emplearse la misma estrategia para seleccionar profarmacos profilacticos, es decir, profarmacos que se metabolizan a formas activas antivirales incidentales para la infeccion viral, pero que siguen sin metabolizarse sustancialmente en las celulas no infectadas. De manera similar, podnan explorarse los profarmacos en celulas transformadas y en el tejido homologo no transformado. Esto sena particularmente util en el ensayo comparativo para seleccionar profarmacos para el tratamiento de neoplasias hematologicas, por ejemplo, leucemias.

Sin quedar limitados por ninguna teona particular del funcionamiento, se cree que los profarmacos tisulares selectivos se toman selectivamente por las celulas diana y/o se metabolizan selectivamente dentro de la celula, en comparacion con otros tejidos o celulas. La ventaja que es unica de los profarmacos de metoxifosfonato del presente documento es que su metabolismo para el dianion a pH fisiologico asegura que estos seran incapaces de volver a difundirse hacia el exterior de la celula. Por lo tanto, estos siguen siendo eficaces durante largos periodos de tiempo y se mantienen a concentraciones intracelulares elevadas, mostrando de este modo una potencia aumentada. Se cree que los mecanismos para aumentar la actividad en el tejido diana incluyen la captacion aumentada por las celulas diana, retencion intracelular potenciada, o ambos mecanismos trabajando conjuntamente. Sin embargo, el modo mediante el cual ocurre la selectividad o suministro potenciado en el tejido diana no es importante. Tampoco es importante que todas las conversiones metabolicas del profarmaco al compuesto parental ocurran dentro del tejido diana. Solo es necesario que ocurra la ultima conversion que confiere actividad en el tejido diana; el

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metabolismo en otros tejidos puede proporcionar intermediarios que se convierten en formas antivirales en el tejido diana.

El grado de selectividad o del suministro potenciado deseado variara dependiendo del compuesto parental y del modo en el que se mida (% de distribucion de dosis o concentracion de farmaco parental). En general, si el farmaco parental ya posee una ventana terapeutica generosa, puede ser suficiente un bajo grado de selectividad para el profarmaco deseado. Por otra parte, los compuestos toxicos pueden requerir una exploracion mas exhaustiva para identificar profarmacos selectivos. Puede reducirse el gasto relativo del metodo de esta invencion explorando solamente en el tejido diana y en tejidos contra los cuales se sabe que el compuesto parental es relativamente toxico, por ejemplo, para PMEA, que es nefrotoxico a dosis mas altas, el foco principal estara en el rinon y los tejidos linfoides.

La etapa de determinacion de la actividad antiviral relativa de un profarmaco en los tejidos seleccionados se lleva a cabo generalmente ensayando los tejidos diana y no diana para la presencia o actividad relativa de un metabolito del profarmaco, cuyo metabolito se conoce por tener, o se convierte en, un metabolito que tiene actividad antiviral o antitumoral. Por lo tanto, normalmente se podna determinar la cantidad relativa del farmaco parental en los tejidos a lo largo de sustancialmente el mismo curso temporal con el fin de identificar profarmacos que se metabolizan preferentemente en el tejido diana en un metabolito antiviral o antitumoralmente activo o en un precursor del mismo que produce finalmente el metabolito activo en el tejido diana. En el caso de los compuestos antivirales, el metabolito activo es el difosfato de los compuestos de fosfonato parentales. Este metabolito es el que se incorpora en el acido nucleico viral, truncando de este modo la elongacion de la cadena de acido nucleico e interrumpiendo la replicacion viral. Los metabolitos del profarmaco pueden ser metabolitos anabolicos, metabolitos catabolicos, o el producto conjunto del anabolismo y catabolismo. El modo mediante el cual se produce el metabolito no es importante en la practica del metodo de esta invencion.

El metodo no se limita a ensayar un metabolito que posee de por sf actividad antiviral o antitumoral. En su lugar, se pueden ensayar los precursores inactivos de los metabolitos activos. Los precursores del metabolito de difosfato antiviralmente activo incluyen el monofosfato del farmaco parental, monofosfatos de otros metabolitos del farmaco parental (por ejemplo, una modificacion intermedia de un sustituyente en la base heterodclica), el parental en sf mismo y metabolitos generados por la celula en la conversion del profarmaco en el parental antes de la fosforilacion. Las estructuras precursoras pueden variar considerablemente ya que estas son el resultado del metabolismo celular. Sin embargo, esta informacion ya se conoce o podna determinarse facilmente por un experto en la materia.

Si el profarmaco que se esta ensayando no muestra actividad antitumoral o antiviral de por sf, entonces, pueden requerirse ajustes en los resultados en bruto del ensayo. Por ejemplo, si el procesamiento intracelular del metabolito inactivo a un metabolito activo sucede a distintas velocidades entre los tejidos ensayados, los resultados en bruto con el metabolito inactivo necesitanan un ajuste para tener en cuenta las diferencias entre los tipos celulares que se deben a que el parametro relevante es la generacion de actividad en el tejido diana, no la acumulacion de metabolitos inactivos. Sin embargo, la determinacion de los ajustes adecuados podna estar dentro de la capacidades generales. Por lo tanto, cuando la etapa (d) del metodo del presente documento requiere la determinacion de la actividad, la actividad puede medirse bien directamente o extrapolarse. Esto no significa que el metodo del presente documento este limitado a ensayar unicamente intermediarios que son activos de por sf. Por ejemplo, tambien podna ensayarse la ausencia o disminucion del profarmaco en los tejidos ensayados. La etapa (d) unicamente requiere la evaluacion de la actividad conferida por el profarmaco en tanto este interactua con el tejido concerniente, y esta puede basarse en la extrapolacion u otra medicion indirecta.

La etapa (d) del metodo requiere la determinacion de la actividad "relativa" del profarmaco. Se entendera que esta no requiere que cada uno y todos los ensayos o series de ensayos deban contener tambien necesariamente ejecuciones con el tejido no diana seleccionado. Por el contrario, se encuentra dentro del alcance de esta invencion emplear controles historicos del tejido o tejidos no diana, o algoritmos que representan resultados esperables de dichos tejidos no diana, con el fin de proporcionar el punto de referencia de la actividad no diana.

Los resultados obtenidos en la etapa (d) se usan entonces para seleccionar o identificar de un modo optimo un profarmaco que produce mayor actividad antiviral en el tejido diana que en el tejido no diana. Este es el profarmaco que se selecciona para el desarrollo posterior.

Se apreciara, que puede realizarse alguna evaluacion preliminar de los farmacos candidatos antes de la puesta enpractica del metodo de esta invencion. Por ejemplo, se necesitara que el profarmaco sea capaz de pasar sin metabolizarse en gran medida a lo largo del tracto gastrointestinal, se necesitara que sea sustancialmente estable en sangre, y debena ser capaz de permear las celulas al menos hasta cierto grado. En la mayor parte de los casos tambien se necesitara que complete un primer paso por la circulacion hepatica sin metabolismo sustancial. Dichos estudios preliminares son opcionales y se conocen bien por los expertos en la materia.

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El mismo razonamiento que se ha descrito anteriormente para la actividad antiviral, es tambien aplicable a los profarmacos antitumorales de analogos de nucleotidos de metoxifosfonato. Estos incluyen, por ejemplo, profarmacos de PMEG, el analogo de guanilo de PMEA. En este caso, los fosfonatos citotoxicos tales como PMEG, son candidatos valiosos en virtud de que su citotoxicidad confiere, de hecho, su actividad antitumoral.

Un compuesto identificado mediante este nuevo metodo de exploracion puede introducirse entonces en un programa preclinico o clinico tradicional para confirmar que se cumplen los objetivos deseados. Normalmente, se considera que un profarmaco es selectivo si la actividad o concentration del farmaco parental en el tejido diana (% de distribution de la dosis) es 2x, y preferentemente 5x mayor que la del compuesto parental en el tejido no diana. Como alternativa, un profarmaco candidato puede compararse contra un profarmaco de referencia. En este caso, la selectividad es relativa en vez de absoluta. Los profarmacos selectivos seran aquellos que dan como resultado una concentracion o actividad aproximadamente 10x mayor en el tejido diana en comparacion con el prototipo, aunque el grado de selectividad es un aspecto discrecional.

Nuevo Metodo para la Preparation de los Materiales de Partida o Intermediarios

Tambien se incluye en el presente documento un metodo mejorado para la fabrication de los materiales de partida preferidos (farmacos parentales) de esta invention, PMEA y (R)-PMPA. Normalmente, este metodo comprende hacer reaccionar 9-(2-hidroxipropil)adenina (HPA) o 9-(2-hidroxietil)adenina (HEA) con un alcoxido de magnesio, anadir posteriormente el aglucon sinton p-tolueno-sulfoniloximetilfosfonato (tosilato) protegido a la mezcla de reaction, y recuperar PMPA o PMEA, respectivamente.

Preferentemente, el HPA es el enantiomero R enriquecido o aislado. Si se usa una mezcla quiral de HPA, puede aislarse el R-PMPA de la mezcla quiral de PMPA despues de completar la sintesis.

Normalmente el tosilato esta protegido por grupos alquilo inferiores, pero otros grupos adecuados seran evidentes para el experto. Puede ser conveniente emplear el tosilato presustituido con los sustituyentes del profarmaco de fosfonato que son capaces de actuar como grupos protectores en la reaccion de tosilacion, permitiendo de este modo evitar la etapa de desproteccion y recuperar, por lo tanto, directamente el profarmaco o un intermedio.

El grupo alquilo del alcoxido de magnesio no es critico y puede ser cualquier alquilo Ci-Ce ramificado o normal, pero preferentemente es f-butilo (para PMPA) o isopropilo (para PMEA). Tampoco son criticas las condiciones de reaccion, pero preferentemente comprenden calentar la mezcla de reaccion a aproximadamente 7075 °C con agitation u otra agitation moderada.

Si no hay un interes en la retention de los sustituyentes de fosfonato, se desprotege el producto (habitualmente con bromotrimetilsilano cuando el grupo protector del tosilato es alquilo), y despues se recupera el producto mediante cristalizacion u otro metodo convencional tal como sera evidente para el experto.

Base Heterociclica

En los compuestos de esta divulgation representados en las estructuras (3) y (4), la base heterociclica B se selecciona de las estructuras

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R15 es H, OH, F, Cl, Br, I, OR16, SH, SR16, NH2, o NHR17;

R16 es alquilo Ci-Ce o alquenilo C2-C6 incluyendo CH3, CH2CH3, CH2CCH, CH2CHCH2 y C3H7,

R17 es alquilo C1-C6 o alquenilo C2-C6 incluyendo CH3, CH2CH3, CH2CCH, CH2CHCH2, y C3H7;

R18 es N, CF, CCl, CBr, Cl, CR19, CSR19 o COR19;

R19 es H, alquilo C1-C9, alquenilo C2-C9, alquinilo C2-C9, alquil-C1-C9-alcoxi C1-C9, o aril-alquilo C7-C9 no sustituido o sustituido por OH, F, Cl, Br o I, incluyendo R19 por lo tanto -CH3, -CH2CH3, -CHCH2, -CHCHBr, - CH2CH2Cl, -CH2CH2F, -CH2CCH, -CH2CHCH2, -C3H7, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2OC2H5, -CH2OCCH, - CH2OCH2CHCH2, -CH2C3H7, CH2CH2OH, -CH2CH2OCH3,- CH2CH2OC2H5, -CH2CH2OCCH, -

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CH2CH2OCH2CHCH2 y -CH2CH2OC3H7;

R20 es N o CH;

R21 es N, CH, CCN, CCF3, CCeCH o CC(O)NH2;

R22 es H, OH, NH2, SH, SCH3, SCH2CH3, SCH2CCH, SCH2CHCH2, SC3H7, NH(CH3), N(CH3)2, NH(CH2CH3), N(CH2CH3)2, NH(CH2CCH), NH(CH2CHCH2), NH(C3H7), halogeno (F, Cl, Br o I) o X en el que X es - (CH2)m(O)n(CH2)mN(R10)2 en el que cada m es independientemente 0-2, n es 0-1, y R10 independientemente es

H,

alquilo C1-C15, alquenilo C2-C15, arilalquenilo C6-C15, arialquinilo C6-C15, alquinilo C2-C15, alquilamino C1-

C6- alquilo C1-C6, aralquilo C5-C15, heteroaralcilo C6-C15, arilo C5-C6, heterocicloalquilo C2-C6, alquilo C2-C15, alquenilo C3-C15, arilalquenilo C6-C15, alquinilo C3-C15, arilalquinilo C7-C15, alquilamino C1-

C6-alquilo -C1-C6, aralquilo C5-C15, heteroalcilo C6-C15 o heterocicloalquilo C3-C6 en el que el metileno del resto alquilo no adyacente a N6 se ha reemplazado por -O-,

opcionalmente ambos R10 estan unidos entre s^ con N para formar un heterociclo C2-C5 saturado o insaturado que contiene uno o dos heteroatomos de N y opcionalmente un heteroatomo de O o S adicional,

o uno de los grupos R10 anteriores que esta sustituido con de 1 a 3 halo, CN o N3; pero opcionalmente al menos un grupo R10 no es H;

R23 es H, OH, F, Cl, Br, I, SCH3, SCH2CH3, SCH2CCH, SCH2CHCH2, SC3H7, OR16, NH2, NHR17 o R22; y R24 es O, S o Se.

B tambien incluye bases heterodclicas tanto protegidas como no protegidas, particularmente bases de purina y de pirimidina. Se conocen grupos protectores para aminas exodclicas y otros grupos labiles (Greene et al. "Protective Groups in Organic Synthesis") e incluyen N-benzoflo, isobutirilo, 4,4'-dimetoxitritilo (DMT) y similares. La seleccion del grupo protector sera evidente para el experto habitual y dependera de la naturaleza del grupo labil y de la qmmica que se espera encontrar para el grupo protector, por ejemplo acida, basica, oxidativa, reductora u otras condiciones. Las especies protegidas ilustrativas son N4-benzoilcitosina, N6-benzoiladenina, N2-isobutirilguanina y similares.

Las bases protegidas tienen las formulas Xa.1, XIa.1, XIb.1, XIIa.1 o XIIIa.1

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en las que R18, R20, R21, R24 tienen los significados que se definen anteriormente; R22A es R39 o R22 siempre que R22 no sea NH2; R23A es R39 o R23 siempre que R23 no sea NH2; R39 es NHR40, NHC(O)R36 o CR41N(R38)2 en el que R36 es alquilo C1-C19, alquenilo C1-C19, arilo C3-C10, adamantoflo, alquilanilo, o arilo C3-C10 sustituido con 1 o 2 atomos o grupos seleccionados de halogeno, metilo, etilo, metoxi, etoxi, hidroxi y ciano; R38 es alquilo C1-C10, o ambos R38 conjuntamente son 1-morfolino, 1- piperidina o 1-pirrolidina; R40 es alquilo C1-C10, incluyendo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, hexilo, octilo y decanilo; y R41es hidrogeno o CH3.

Para las bases de estructuras XIa.1 y XIb.1, si R esta presente en R22A o R23A, ambos grupos R39 en la misma base generalmente seran el mismo. Los R36 ilustrativos son fenilo, fenilo sustituido con uno de los sustituyentes arilo R36 anteriores, -C10H15 (donde C10H15 es 2-adamantoflo), -CH2C6H5 -C6H5, -CH(CH3)2, -CH2CH3, metilo, butilo, t-butilo, heptanilo, nonanilo, undecanilo, o undecenilo.

Las bases espedficas incluyen hipoxantina, guanina, adenina, citosina, inosina, timina, uracilo, xantina, derivados 8-aza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; derivados 7-desaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; derivados 1-desaza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina,

hipoxantina, inosina y xantina; derivados 7-desaza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina,

hipoxantina, inosina y xantina; derivados 3-desaza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina,

hipoxantina, inosina y xantina; 6-azacitosina; 5-fluorocitosina, 5-clorocitosina; 5-yodocitosina; 5-bromocitosina; 5-

metilcitosina, 5-bromoviniluracilo, 5-fluorouracilo, 5-clorouracilo; 5-yodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo;

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5-metoximetiluracilo; 5-etiniluracilo y 5-propiniluracilo.

Preferentemente, B es un resto de 9-purinilo seleccionado de guanilo, 3-desazaguanilo, 1-desazaguanilo, 8- azaguanilo, 7-desazaguanilo, adenilo, 3-desazaadenilo, 1-desazadenilo, 8-azaadenilo, 7-desazaadenilo, 2,6- diaminopurinilo, 2-aminopurinilo, 6-cloro-2-aminopurinilo y 6-tio-2-aminopurinilo o un B' es un resto de 1-pirimidinilo seleccionado de citosinilo, 5-halocitosinilo, y 5-(alquilo Ci-C3)citosinilo.

Los grupos B preferidos tienen la formula

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en la que

R22 independientemente es halo, ox^geno, NH2, X o H, pero opcionalmente al menos un R22 es X;

X es -(CH2)m(O)n(CH2)mN(R10)2 en el que m es 0-2, n es 0-1, y

R10 independientemente es

H,

alquilo C1-C15, alquenilo C2-C15, arilalquenilo C6-C15, arilalquinilo C6-C15, alquenilo C2-C15, alquilamino C1- C6-alquilo-C1-C6, aralquilo C5-C15, heteroaralcilo C6-C15, arilo C5-C6, heterocicloalquilo C2-C6, alquilo C2-C15, alquenilo C3-C15, arilalquenilo C6-C15, alquinilo C3-C15, arilalquinilo C7-C15, alquilamino C1- C6-alquilo-C1-C6, aralquilo C5-C15, heteroalquilo C6-C15 o heterocicloalquilo C3-C6 en el que el metileno en el resto alquilo no adyacente a N6 se ha reemplazado por -O-,

opcionalmente ambos R10 estan unidos entre sf con N para formar un heterociclo C2-C5 saturado o insaturado que contiene uno o dos heteroatomos de N y opcionalmente un heteroatomo de O o S adicional,

o uno de los grupos R10 anteriores se sustituye con de 1 a 3 halo, CN o N3; pero opcionalmente al menos un grupo R10 no es H;

y Z es N o CH, siempre que los nucleos heterodclicos vanen de la purina en no mas de un Z.

Los grupos E representan los aglucones empleados en los analogos de nucleotidos de metoxifosfonato. Preferentemente, el grupo E es -CH(CH3)CH2- o -CH2CH2-. Tambien, se prefiere que los grupos laterales en los centros quirales en el aglucon esten sustancialmente unicamente en la configuracion (R) (excepto para el hidroximetilo, que es el enantiomero (S) enriquecido).

R1 es un oxiester hidrolizable in vivo que tiene la estructura -OR35 u -OR6 en la que R35 se define en la columna 64, lmea 49 de la Patente de los Estados Unidos 5.798.340, incorporada al presente documento a modo de referencia, y R6 se define anteriormente. Preferentemente R1 es ariloxi, generalmente fenoxi no sustituido o para- sustituido (tal como se define en R6).

R2 es un resto de aminoacido, opcionalmente siempre que cualquier grupo carboxi unido por menos de 5 atomos al amidato de N este esterificado. R2 normalmente tiene la estructura

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en la que

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n es 1 o 2;

R11 es R6 o H; preferentemente R6 = alquilo C3-C9; alquilo C3-C9 independientemente sustituido con OH, halogeno, O o N; arilo C3-C6; arilo C3-C6 que esta sustituido independientemente con OH, halogeno, O o N; o C3-C6 arilalquilo que esta sustituido independientemente con OH, halogeno, O o N;

R12 independientemente es H o alquilo C1-C9 que esta no sustituido o sustituido por sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en OH, O N, COOR11 y halogeno; arilo C3-C6 que esta no sustituido o sustituido por sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en OH, O, N, COOR11 y halogeno; o aril-alquilo C3-C9 que esta no sustituido o sustituido por sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en OH, O, N, COOR11 y halogeno;

R13 independientemente es C(O)-OR11; amino; amida, guanidinilo; imidazolilo, indolilo, sulfoxido; fosforilo; alquilamino C1-C3, alquildiamino C1-C3; alquenilamino C1-C6; hidroxi; tiol, alcoxi C1-C3, alctiol C1-C3; (CH2)nCOOR11; alquilo C1-C6 que esta no sustituido o sustituido con OH, halogeno, SH, NH2, fenilo, hidroxifenilo o alcoxifenilo C7-C10; alquenilo C2-C6, que esta no sustituido o sustituido con OH, halogeno, SH, NH2, fenilo, hidroxifenilo o alcoxifenilo C7-C10; y arilo C6-C12 que esta no sustituido o sustituido con OH, halogeno, SH, NH2, fenilo, hidroxifenilo o alcoxifenilo C7-C10; y

R14 es H o alquilo C1-C9 o alquilo C1-C9 sustituido independientemente con OH, halogeno, COOR11, O o N; arilo C3-C6; arilo C3-C6 que esta sustituido independientemente con OH, halogeno, COOR11, O o N; o arilalquilo C3-C6 que esta sustituido independientemente con OH, halogeno, COOR11, O o N.

Preferentemente, R11 es alquilo C1-C6, mas preferentemente isopropilo, R13 es la cadena lateral de un aminoacido de origen natural, n = 1, R12 es H y R14 es H. En el compuesto de estructura (2), la invencion incluye metabolitos en los cuales los esteres de fenoxi y de isopropilo se han hidrolizado a -OH. De manera similar, los metabolitos desesterificados enriquecidos de fosfonoamidato de los compuestos (5a), 5(b) y (6) estan incluidos dentro del alcance de esta invencion.

Arilo y sustitucion de "O" o "N" se definen en la columna 16, lmeas 42-58, de la patente de los Estados Unidos N° 5.798.340.

Normalmente, los aminoacidos estan en los aminoacidos naturales o I. Se exponen ejemplos espedficos adecuados en la Patente de los Estados Unidos N° 5.798.340, por ejemplo la Tabla 4 y col. de 8-10 del mismo.

Alquilo tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, es un hidrocarburo secundario, terciario o dclico normal. A menos que se indique los contrario alquilo es C1-C12. Los ejemplos son -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH2CH2CH3, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, -C(CH3)3, -

CH2CH2CH2CH2CH3, -CH(CH3)CH2CH2CH3, -CH(CH2CH3)2, -C(CH3)2CH2CH3, -CH(CH3)CH(CH3)2, -

CH2CH2CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)CH2CH3, -CH2CH2CH2CH2CH2CH3, -CH(CH3)CH2CH2CH2CH3, -

CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3), -C(CH3)2CH2CH2CH3, -CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3, -CH(CH3)CH2CH(CH3)2, -

C(CH3)(CH2CH3)2, -CH(CH2CH3)CH(CH3)2, -C(CH3)2CH(CH3)2 y -CH(CH3)C(CH3)3. El alquenilo y alquinilo se definen del mismo modo, pero contienen al menos un doble o triple enlace, respectivamente.

En los casos donde se divulgan grupos enol o ceto, debe interpretarse que tambien se ensenan los tautomeros correspondientes.

Los compuestos de profarmacos de esta invencion se proporcionan en la forma de base libre o las diversas sales enumeradas en la Patente de los Estados Unidos N° 5.798.340, y se formulan con excipientes farmaceuticamente aceptables o diluyentes solvatantes para su uso como productos farmaceuticos tambien como se expone en la Patente de los Estados Unidos N° 5.798.340. Estos profarmacos tienen las utilidades antivirales y las anteriormente establecidas para los farmacos parentales (vease la Patente de los Estados Unidos 5.798.340 y otras citas relacionadas con los analogos de nucleotidos de metoxifosfonato). Se entendera que el diastereomero de estructura (4) al menos es util como un intermedio en la produccion qrnmica del farmaco parental mediante hidrolisis in vitro, sin importar su caracter relativamente no selectivo tal como se revela en los estudios del presente documento.

La invencion se entendera mas completamente con referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 a:

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De adenina a PMEA usando Isopropoxido de Magnesio. A una suspension de adenina (16,8 g, 0,124 moles) en DMF (41,9 ml) se le anadio carbonato de etileno (12,1 g, 0,137 moles) e hidroxido sodico (0,100 g, 0,0025 moles). La mezcla se calento a 130 °C durante toda la noche. La reaccion se enfrio por debajo de 50 °C y se le anadio tolueno (62,1 ml). La suspension se enfrio adicionalmente a 5 °C durante 2 horas, se filtro y se enjuago con tolueno (2x). El solido humedo se seco in vacuo a 65 °C para producir 20,0 g (90 %) de 9-(2-hidroxietil)adenina en forma de un solido de color blanquecino. Pf: 238-240 °C.

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Se anadio Isopropoxido de Magnesio (11,2 g, 0,0784 moles), o como alternativa f-butoxido de magnesio, a la mezcla seguido de dietfl p-toluenosulfoniloximetilfosfonato (66,0 g, 0,162 moles) a lo largo de una hora. La mezcla de reaccion se agito a 80 °C durante 7 horas. Se retiraron 30 ml de volatiles por medio de destilacion al vado y se recargo la reaccion con 30 ml de DMF reciente. Despues de enfriarse a temperatura ambiente, se anadio bromotrimetilsilano (69,9 g, 0,450 moles), y la mezcla se calento a 80 °C durante 6 h. La reaccion se concentro para producir una goma espesa. La goma se disolvio en 360 ml de agua, se extrajo con 120 ml de diclorometano, se ajusto a pH 3,2 con hidroxido sodico, y la suspension resultante se removio a temperatura ambiente durante toda la noche. La reaccion se enfrio a 4 °C durante 1 hora. Los solidos se eliminaron mediante filtracion, se lavo con agua (2x), y se seco in vacuo a 56 °C para producir 20 g (65,4 % ) de 9-[2-(fosfonometoxi)etil]adenina (PMEA) en forma de un solido de color blanco. Pf: > 200 °C dec. RMN 1H (D2O) • 3,49 (t, 2H); 3,94 (t, 2H); 4,39 (t, 2H); 8,13 (s, 1H); 8,22 (s, 1H).

Ejemplo lb

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De adenina a PMPA usando t-Butoxido de Magnesio. A una suspension de adenina (40 g, 0,296 moles) en DMF (41,9 ml) se le anadio carbonato de (R)-propileno (34,5 g, 0,338 moles) e hidroxido sodico (0,480 g, 0,012 moles). La mezcla se calento a 130 °C durante toda la noche. La reaccion se enfrio a 100 °C y se anadio tolueno (138 ml) seguido de acido metanosulfonico (4,7 g, 0,049 moles) mientras se mantema la temperatura de reaccion a 100-110 °C. Se anadio tolueno adicional (114 ml) para crear una solucion homogenea. La solucion se enfrio a 3 °C a lo largo de 7 horas y despues de llevo a 3 °C durante de una hora. El solido resultante se aislo mediante filtracion y se enjuago con acetona (2x). El solido humedo se seco in vacuo a 80 °C para producir 42,6 g (75 % ) de -9-[2-(hidroxi)propil]adenina (HPA) en forma de un solido de color blanquecino. Pf: 188-190 °C.

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La (R)-9-[2-(hidroxi)propil]adenina (HPA) (20,0 g, 0,104 moles) se suspendio en DMF (44,5 ml) y se calento a 65 °C. Se anadio t-butoxido de magnesio (14,2 g, 0,083 moles) o como alternativa isopropoxido de magnesio, a la mezcla a lo largo de una hora seguido por dietfl p-toluenosulfoniloximetilfosfonato (66,0 g, 0,205 mol) a lo largo de dos horas mientras que se mantuvo la temperatura a 78 °C. La mezcla se removio a 75 °C durante 4 horas. Despues de enfriarse por debajo de 50 °C, se anadio bromotrimetilsilano (73,9 g, 0,478 moles) y se calento la mezcla a 77 °C durante 3 horas. Cuando se completo, la reaccion se calento a 80 °C y se retiraron los volatiles mediante destilacion atmosferica. El residuo se disolvio en agua (120 ml) a 50 °C y despues se extrajo con acetato de etilo (101 ml). El pH de la fase acuosa se ajusto a 1,1 con hidroxido sodico, se sembro con (R)-PMPA autentico y se reajusto el pH de la capa acuosa a pH 2,1 con hidroxido sodico. La solucion resultante se removio a temperatura ambiente durante toda la noche. La reaccion se enfrio a 4 °C durante 6 horas. El solido aislo por filtracion. Se lavo con agua (60 ml), y se seco in vacuo a 50 °C para producir 18,9 g (63,5%) de (R)-9-[2-(fosfonometoxi)propil]adenina (PMPA) en bruto en forma de un solido de color blanquecino.

La (R)-9-[2-(fosfonometoxi)propil]adenina en crudo se calento a reflujo en agua (255 ml) hasta que se disolvieron todos los solidos. La solucion se enfrio a temperatura ambiente a lo largo de cuatro 4 horas. La mezcla resultante se agito a 4 °C durante tres horas. El solido se aislo por filtracion, se lavo con agua (56 ml) y acetona (56 ml), y se seco in vacuo a 50 °C para producir 15,0 g, (50,4 % ) de (R)-9-[2-(fosfonometoxi)propil]adenina (PMPA) en forma de un solido de color blanco. Pf: 278-280 °C.

Ejemplo 2

Preparation de GS-7171 (III)

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Se cargo un reactor revestido de vidrio con PMPA anhidro, (I) (14,6 kg, 50,8 moles) fenol (9,6 kg, 102 moles) y 1 -metil-2-pirrolidinona (39 kg). La mezcla se calento a 85 °C y se anadio trietilamina (6,3 kg, 62,3 mol) Despues se anadio una solucion de 1,3-diciclohexilcarbodiimida (17,1 kg, 82,9 moles) en 1 -metil-2-pirrolidinona (1,6 kg) a lo largo de 6 horas a 100 °C. Se continuo calentando durante 16 horas. La reaccion se enfrio a 45 °C, se anadio agua (29 kg), y se enfrio a 25 °C. Se retiraron los solidos de la reaccion mediante filtracion y se enjuagaron con agua (15,3 kg). El combinado filtrado y enjuagado se concentro hasta una suspension de color canela bajo presion reducida, se anadio agua (24,6 kg), y se ajusto a pH = 11 con NaOH (25 % en agua). Se retiraron los finos mediante filtracion a traves de tierra de diatomeas (2 kg) seguidas por un enjuagado en agua (4,4 kg). El filtrado combinado y enjuagado se extrajo con etilacetato (28 kg). La solucion acuosa se ajusto a pH = 3,1 con HCl (37 % en agua) (4 kg). El crudo II se aislo mediante filtracion y se lavo con metanol (12,7 kg). La torta humeda de crudo II se suspendio en metanol (58 kg). Los solidos se aislaron mediante filtracion, se lavaron con metanol (8,5 kg), y se secaron bajo presion reducida para obtener 9,33 kg de II en forma de un polvo de color blanco: RMN 1H (CD2OD) 6

1,2 (d, 3H), 3,45 (c, 2H), 3,7 (c, 2H), 4 (m, 2H), 4,2 (c, 2H), 4,35 (dd, 2H), 6,6 (d, 2H), 7 (t, 1H), 7,15 (t, 2H), 8,15 (s,

1H), 8,2 (s, 1H); RMN 31P (D2O) 6 15,0 (desacoplado).

GS-7171 (IN). (Esquema 1) Se cargo un reactor revestido con vidrio con monofenil PMPA, (II) (9,12 kg, 25,1 moles) y acetonitrilo (30,7 kg). Se anadio cloruro de tionilo (6,57 kg, 56,7 moles) por debajo de los 50 °C. La mezcla se calento a 75 °C hasta que se disolvieron los solidos. La temperatura de reaccion aumento hasta 80 °C y los volatiles (11,4 kg) se recogieron mediante destilacion atmosferica bajo nitrogeno. El residuo del recipiente se enfrio a 25 °C se anadio diclorometano (41 kg), y se enfrio a -29 °C. Se anadio una solucion de ester isopropflico de (L)-alanina (7,1 kg, 54,4 moles) en diclorometano (36 kg) a lo largo de 60 minutos a -18 °C seguida de trietilamina (7,66 kg, 75,7 moles) a lo largo de 30 minutos de -18 a -11 °C. La mezcla de reaccion se calento a temperatura

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ambiente y se lavo cinco veces con una solucion de dihidrogenofosfato (10 % en agua, 15,7 kg en cada lavado). La solucion organica se seco con sulfato sodico anhidro (18,2 kg), se filtro, se enjuago con diclorometano (28 kg), y se concentro hasta un aceite bajo presion reducida. Se cargo acetona (29 kg) en el aceite y se concentro la mezcla bajo presion reducida. Se cargo acetona (18,8 kg) en el aceite resultante. Se purifico la mitad del producto mediante cromatograffa a lo largo de un lecho de 38 x 38 cm de 22 kg de gel de silice con una malla de 60.230 a 400. Se eluyo la columna con 480 kg de acetona. Se repitio la purificacion en la segunda mitad del aceite usando gel de silice reciente y acetona. El producto limpio que portaba fracciones se concentro bajo presion reducida hasta un aceite. Se cargo acetonitrilo (19,6 kg) en el aceite y se concentro la mezcla bajo presion reducida. Se cargo acetonitrilo (66,4 kg) y se enfrio la solucion a de 0 a -5 °C durante 16 horas. Se retiraron los solidos por filtracion y se concentro el filtrado bajo presion reducida a 5,6 kg III en forma de un aceite de color oscuro: RMN 1H (CDCh) 6 1,1 (m 12H), 3,7 (m, 1H), 4,0 (m, 5H), 4,2 (m, 1H), 5,0 (m, 1H), 6,2 (s, 2H), 7,05 (m, 5H), 8,0 (s, 1H), 8,25 (d, 1H); RMN 31P (CDCl3) 6 21.0, 22,5 (desacoplado).

Metodo alternativo para GS-7171 (III)

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Monofenil PMPA (II). Se coloco un matraz de fondo redondo con condensador de reflujo y una entrada de nitrogeno en un bano de aceite a 70 °C. Se cargo el matraz con PMPA anhidro (I) (19,2 g, 67 mmoles), se anadieron N,N-dimetilformamida (0,29 g, 3,3 mmoles) y sulfona de tetrametileno (40 ml). Se anadio cloruro de tionilo (14,2 g, 119 mmoles) a lo largo de 4 horas. Se aumento el calor a 100 °C a lo largo del mismo tiempo. Se obtuvo como resultado una solucion homogenea. Se anadio fenoxitrimetilsilano (11,7 g, 70 mmoles) a la solucion a lo largo de 5 minutos. El calentamiento en el bano de aceite a 100 °C continuo durante dos horas mas. La se vertio reaccion en acetona que se removio rapidamente (400 ml) con enfriamiento a 0 °C. Se aislaron los solidos mediante filtracion, se secaron bajo presion reducida, y se disolvieron en metanol (75 ml). El pH de la solucion se ajusto a 3,0 con una solucion de hidroxido potasico (45 % ac.) con enfriamiento en hielo/agua. Los solidos resultantes se aislaron mediante filtracion, se lavaron con metanol, y se secaron bajo presion reducida a 20,4 g II (Esquema 2) en forma de un polvo de color blanco.

GS-7171 (III). Se combinaron monofenil PMPA (II) (3 g, 8,3 mmoles), sulfona de tetrametileno (5 ml) y N,N- dimetilformamida (1 gota) en un matraz de fondo redondeado en un bano de aceite a 40 °C. Se anadio cloruro de tionilo (1,96 g, 16,5 mmoles). Despues de 20 minutos se retiro la solucion clara del calor, se diluyo con diclorometano (10 ml) y se anadio a una solucion de ester isopropflico de (L)-alanina (5 g, 33 mmoles) y diisopropiletilamina (5,33 g, 41 mmoles) en diclorometano (20 ml) a -10 °C. La mezcla de reaccion se calento a temperatura ambiente y se lavo tres veces con una solucion de dihidrogenofosfato de sodio (1 % ac., 10 ml cada lavado). La solucion organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y se concentro bajo presion reducida hasta un aceite. El aceite se combino con acido fumarico (0,77 g, 6,6 mmoles) y acetonitrilo (40 ml) y se calento hasta el reflujo para dar una solucion homogenea. La solucion se enfrio en un bano con hielo y se aislaron los solidos mediante filtracion. La sal de fumarato solida de GS-7171 se seco bajo presion reducida hasta 3,7 g. La sal (3,16 g,

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5,3 mmoles) se suspendio en diclorometano (30 ml) y se removio junto con una solucion de carbonato potasico (5 ml, 2,5 M en agua) hasta que se disolvio el solido. Se aislo la capa organica, despues se lavo con agua (5 ml), se seco sobre sulfato sodico anhidro, y se concentro bajo presion reducida para proporcionar 2,4 g de III en forma de una espuma de color canela.

Ejemplo 3

A. Separacion de Diastereomeros mediante Cromatograffa de Elucion en Semi-discontinua

Los diastereomeros de GS-7171 (III) se resolvieron por cromatograffa de elucion semi-discontinua usando un una columna de HPLC semi-preparativa comercialmente disponible Chiralpak AS, 20 pm, de 21 x 250 mm con una columna de seguridad Chiralpak AS, 20 pm, de 21 x 50 mm. Chiralpak® AS es un material de empaquetado patentado fabricado por Diacel y vendido en Norteamerica por Chiral Technologies, Inc. (Patentes de los Estados Unidos 5.202.433, RE 35.919, 5.434.298, 5.434.299 y 5.498.752). Chiralpak AS es una fase estacionaria quiral (FEQ) comprendida por amilosetris[(S)-a-metilbencil carbamato] que recubre un soporte de gel de sflice.

La mezcla diastereomerica de GS-7171 se disolvio en la fase movil, y se bombearon affcuotas de aproximadamente 1 g de GS-7171 en el sistema cromatografico. El diastereomero no deseado, designado como GS- 7339, fue el primer pico de mayor amplitud (aprox. 15 min. de duracion) en eluirse de la columna. Cuando el pico de GS-7339 habfa terminado de eluirse, la fase movil se conmuto inmediatamente por alcohol mefflico al 100 %, que causo que el diastereomero deseado, designado como GS-7340 (IV), se eluyera como un pico agudo de la columna con el frente de disolvente de alcohol mefflico. El alcohol mefflico se uso para reducir el tiempo de ciclo total. Despues del primer par de inyecciones, se recogieron ambos diastereomeros como una sola fraccion grande que contema uno de los diastereomeros purificados (>99,0 % de un solo diastereomero). Los disolventes de la fase movil se retiraron in vacuo para producir el diastereomero en forma de una espuma desmenuzable.

Aproximadamente el 95% de la masa del GS-7171 de partida se recupero en las dos fracciones diastereomericas. La fraccion de GS-7340 comprendio aproximadamente el 50 % de la masa total recuperada.

Las condiciones cromatograficas fueron las siguientes:

:GS-7120 - Acetonitrilo: Alcohol Isopropflico (90:10)

: Alcohol Mefflico al 100 %

: 10 ml/minuto

: aproximadamente 45 minutos,

: UV a 275 nm.

: Ambiente

: GS-7115 (diastereomero B)

: GS-7340 (diastereomero A; (IV))

Fase movil (Inicial)

(Final)

Flujo

Tiempo de Ejecucion

Deteccion

Temperatura:

Perfil de Elucion

B. Separacion de los Diasteromeros de GS-7171 mediante Cromatograffa LMS

Para una descripcion general de la cromatograffa de lecho de movimiento simulado (LMS), vease Strube et al., "Organic Process Research and Development" 2:305-319 (1998).

El GS-7340 (IV). GS-7171 (III), 2,8 kg, se purifico mediante cromatograffa de lecho de movimiento simulado a lo largo de 10 cm mediante lechos de 5 cm de empaquetado (Chiral Technologies Inc., Chiralpak AS de 20 micrometros que recubre el gel de sflice) (1,2 kg). Las columnas se eluyeron con metanol al 30 % en acetonitrilo. Las fracciones que portaban el producto se concentraron hasta una solucion de IV en acetonitrilo (2,48 kg). La solucion se solidifico hasta una masa cristalina humeda con acetonitrilo en reposo. La masa cristalina se seco bajo presion reducida hasta un polvo cristalino de color canela, 1,301 kg de IV, pureza diastereomerica del 98,7%: pf 117 - 120 °C; RMN 1H (CDCla) 8 1,15 (s, 3,7 (t, 1H), 4,0 (m, 5H), 4,2 (dd, 1H), 5,0 (m, 1H), 6,05 (s, 2H), 7,1 (m, 5H), 8,0 (s, 1H), 8,2 (s, 1H); RMN 31P (CDCla) 8 21.0 (desacoplado).

C. Separacion de Diastereomeros mediante C18 RP-HPLC

El GS-7171 (III) se cromatografio mediante HPLC de fase inversa para separar los diastereomeros usando el siguiente protocolo resumido.

Columna cromatografica: Phenomenex Luna™ C18(2), 5 pm, tamano de poro 100 A, (Phenomenex, Torrance,

CA), o equivalente

Columna de Seguridad: Pellicular C18 (Alltech, Deerfield, IL), o equivalente Fase movil: A - 0,02 % (85 % ) ^PO4 en agua: acetonitrilo (95:5)

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B - 0,02 % (85 % ) H3PO4 en agua: acetonitrilo (50:50) Gradiente de Fase Movil:

Tiempo

% de Fase movil A: % de Fase movil B:

0

100

0

5

100 0

7

70 30

32

70 30

40

0 100

50

0 100

Tiempo de Ejecucion: 50 minutos

Retraso en el equilibrado: 10 min al 100 % de la fase movil A

Velocidad de Flujo: Temperature:

Deteccion

Solucion de la Muestra: Tiempos de retencion:

1,2 ml/min Ambiente UV a 260 nm.

tampon de fosfato de sodio 20 mM, pH 6. GS-7339, aproximadamente 25 minutos GS-7340, aproximadamente 27 minutos

D. Separacion del Diastereomero mediante Cristalizacion

GS-7340 (IV). Una solucion de GS-7171 (III) en acetonitrilo se concentro hasta una espuma de color ambar (14,9 g) bajo presion reducida. Se disolvio la espuma en acetonitrilo (20 ml) y se sembro con un cristal de IV. La mezcla se removio durante toda la noche, se enfrio a 5 °C, y se aislaron los solidos mediante filtracion. Se secaron los solidos hasta 2,3 g de IV en forma de cristales de color blanco del 98 % de pureza diastereomerica (RMN 31P: RMN 1H (CDCl3) 6 1,15 (s, 3,7 (t, 1H), 3,95 (m, 2H), 4,05 (m, 2H), 4,2 (m, 2H), 5,0 (m, 1H), 6,4 (s, 2H), 7,1 (m, 5H), 8,0 (s, 1H), 8,2 (s, 1H); RMN 31P (cDch) 6 19,5 (desacoplado) El analisis del cristal por rayos X de un solo cristal seleccionado de este producto dio los siguientes datos:

Color del cristal, Habito Dimensiones del Cristal Sistema Cristalina Tipo de reticulacion

Parametros de Reticulacion

Grupo Espaciador valor Z

Dcalc

F000

p(MoKa)

decolorado, columna 0,25 X 0,12 X0,08 mm ortorrombico Primitiva a = 8,352(1) A b = 15,574(2) A c = 18,253(2) A V = 2374,2(5) A3 P2-|2-|21 (#19)

4

1,333 g/cm3 1008,00 1,60 cm-1

Ejemplo 4

Preparacion de la Sal de Fumarato de GS-7340

GS-7340-02 (V). (Esquema 1) Se cargo un reactor revestido de vidrio con GS-7340 (IV) (1,294 kg, 2,71 moles) con acido fumarico (284 g, 2,44 moles) y acetonitrilo (24,6 kg). La mezcla se calento hasta el reflujo para disolver los solidos, se filtro mientras estaba caliente y se enfrio a 5 °C durante 16 horas. El producto se aislo mediante filtracion, se enjuago con acetonitrilo (9,2 kg), y se seco hasta 1329 g (V) en forma de un polvo de color blanco: pf 119,7 -121,1 °C; [a]o20-41,7° (c 1,0, acido acetico).

Ejemplo 5

Preparacion de GS-7120 (VI)

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Se cargo un matraz de fondo redondeado de 5 l con monofenil PMPA, (II) (200 g, 0,55 moles) y acetonitrilo (20 ml). Se anadio cloruro de tionilo (0,144 kg, 1,21 moles) por debajo de 27 °C. La mezcla se calento a 70 °C hasta que se disolvieron los solidos. Se retiraron los volatiles (0,45 l) mediante destilacion atmosferica bajo nitrogeno. El residuo del recipiente se enfrio a 25 °C, se anadio diclorometano (1,6 kg) y se enfrio la mezcla a 20 °C. Se anadio una solution de ester etflico del acido (L)-a aminobutrnco (0,144 kg, 1,1 moles) en diclorometano (1,33 kg) a lo largo de 18 minutos de -20 a -10 °C seguido de trimetilamina (0,17 kg, 1,65 moles) a lo largo de 15 minutos a de -8 a - 15 °C. La mezcla de reaction se calento a temperatura ambiente y se lavo cuatro veces con una solucion de dihidrogenofosfato de sodio (10 % ac., 0,3 l cada lavado). La solucion organica se seco con sulfato de sodio anhidro (0,5 kg) y se filtro. Los solidos se enjuagaron con diclorometano (0,6 kg) y el filtrado combinado y enjuagado se concentro hasta un aceite bajo presion reducida. El aceite se purifico mediante cromatograffa a lo largo de un lecho de 15 x 13 cm de 1,2 kg de gel de sflice 60 con una malla de 230 a 400. La columna se eluyo con un gradiente de diclorometano y metanol. Las fracciones que portaban el producto se concentraron bajo presion reducida para proporcionar 211 g de VI (Esquema 3) en forma de una espuma de color canela.

Ejemplo 5a:

Separation de los Diastereomeros de GS-7120 mediante Cromatograffa de Elucion Semi-discontinua

La mezcla diastereomerica se purifico usando las condiciones descritas para GS-7171 en el Ejemplo 3A excepto por lo siguiente:

Fase movil (Inicial) (Final)

Perfil de Elucion

GS-7120 - Acetonitrilo: Alcohol Isopropilico (98:2) Alcohol M etflico al 100 %

GS-7341 (diastereomero B)

GS-7342 (diastereomero a)

Ejemplo 6

Separacion de los Diastereomeros de GS-7120 mediante Cristalizacion

Se cargo un matraz de fondo redondeado de 1 l con monofenil PMPA, (II) (50 g, 0,137 moles) y acetonitrilo (0,2 l). Se anadio cloruro de tionilo (0,036 kg, 0,303 moles) con una exotermia de 10 °C. La mezcla se calento hasta el reflujo hasta que se disolvieron los solidos. Se retiraron Los volatiles (0,1 l) mediante destilacion atmosferica bajo nitrogeno. El residuo del recipiente se enfrio a 25 °C se anadio diclorometano (0,2 kg), y la mezcla se enfrio a -20 °C. Se anadio una solucion de ester efflico del acido (L)-a aminobutrnco (0,036 kg, 0,275 moles) en diclorometano (0,67 kg) a lo largo de 30 minutos a de -20 a -8 °C seguido de trietilamina (0,042 kg, 0,41 moles) a lo largo de 10 minutos a hasta -6 °C. La mezcla de reaccion se calento a temperatura ambiente y se lavo cuatro veces con una solucion de dihidrogenofosfato (10 % ac., 0,075 l cada lavado). La solucion organica se seco con sulfato de sodio anhidro (0,1 kg) y se filtro. Los solidos se enjuagaron con acetato de etilo (0,25 l, y el filtrado combinado y enjuagado se concentro hasta un aceite bajo presion reducida. El aceite se diluyo con acetato de etilo (0,25 l), se sembro, se removio durante toda la noche y se enfrio hasta -15 °C. Los solidos se aislaron mediante filtracion y se desecaron bajo presion reducida para proporcionar 17,7 g de GS-7342 (Tabla 5) en forma de un polvo de color canela: RMN 1H (CDCl3) 5 0,95 (s, 3H), 1,3 (m, 6H), 1,7. (m, 2H), 3,7 (m, 2H), 4,1 (m, 6H), 4,4 (dd, 1H), 5,8 (s, 2H), 7,1 (m, 5H), 8,0 (s, 1H), 8,4 (s, 1H); RMN 31P (CDCh) 5 21 (desacoplado).

Ejemplo 7

Separacion de los Diastereomeros de GS-7097

5

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La mezcla diastereomerica se purifico usando las condiciones descritas para GS-7171 (Ejemplo 3A) excepto por lo siguiente:

Fase movil (Inicial) (Final)

Perfil de Elucion

: GS-7120 - Acetonitrilo: Alcohol Isopropflico (95:5) : Alcohol Metilico al 100 %

: GS-7115 (diastereomero B)

: GS-7114 (diastereomero A)

Ejemplo 8

Procedimiento Alternativo para la Preparacion de GS-7097

El GS-7097: Fenil PMPA, Etil L-Alanil Amidato, Fenil PMPA (15,0 g, 41,3 mmoles) hidrocloruro de etil ester de L-alanina (12,6 g, 83 mmoles) y trietilamina (11,5 ml, 83 mmoles) se suspendieron conjuntamente en 500 ml de piridina bajo N2 seco. Esta suspension se combino con una solucion de trifenilfosfina (37,9 g, 145 mmoles), Aldritiol 1 (2,2'-dipiridil disulfuro) (31,8 g, 145 mmoles) y 120 ml de piridina. La mezcla se calento a una temperatura interna de 57 °C durante 15 horas. La reaccion completa se concentro al vado hasta una pasta amarilla 100 g. La pasta se purifico mediante cromatograffa en columna a lo largo de un lecho de 25 x 11 cm de 1,1 kg de gel de sflice con una malla de 60.230 a 400. La columna se eluyo con 8 litros de metanol al 2 % en diclorometano seguidos de un gradiente lineal a lo largo de un curso de 26 litros de eluyente hasta una composicion final de metanol al 13 %. Las fracciones limpias que portaban el producto se concentraron para producir 12,4 g de crudo (5), en teona el 65 %. Este material estaba contaminado con aproximadamente el 15 % (en peso) de hidrocloruro de trimetilamina por la RMN 1H. Se retiro la contaminacion disolviendo el producto en 350 ml de acetato de etilo, extrayendo con 20 ml de agua, secando la solucion organica sobre sulfato de sodio anhidro, y concentrandolo para producir 11,1 g de GS- 7097 puro en forma de un solido de color blanco, rendimiento del 58 %. El proceso tambien se emplea para sintetizar la mezcla diastereomerica de GS-7003a y GS-7003b (el amidato de fenilalanilo) y la mezcla de GS-7119 y GS-7335 (el amidato de glicilo). Estos diastereomeros se separan usando un procedimiento de elucion semi-discontinua tal como se muestra en el Ejemplo 3A, 6 y 7.

Ejemplo 9

Estudios In vitro de los Diastereomeros del Profarmaco

La actividad anti-VIH-1 y la citotoxicidad in vitro en celulas y la estabilidad en plasma humano y extractos de celulas MT-2 de GS-7340 (base libre) y fumarato de tenofovir diisoproxilo (TDF), se muestran en la Tabla 1. El GS- 7340 muestra un aumento de 10 veces en la actividad antiviral con respecto a TDF y un aumento de 200 veces en la estabilidad en plasma. Se espera que esta mayor estabilidad en plasma sea el resultado de niveles mas altos de GS-7340 en la circulacion que los de TDF despues de la administracion oral.

Tabla 1. Actividad y Estabilidad In vitro

Actividad para VIH-1 Citotoxicidad Estabilidad T 1/2 (min)

CI50 pm

CC50 pM Plasma Humano Extracto de Celulas MT-2 (P/MT-2)

GS 7340

0,005 > 40 90,0 28,3 3,2

TDF

0,05 70 0,41 70,7 0,006

Tenofovir

5 6000 -- -- --

Con el fin de estimar el PMPA intracelular relativo que resulta del metabolismo intracelular del TDF en comparacion con la del GS-7340, se marcaron radiactivamente tanto los profarmacos como el PMPA y se enriquecieron dentro de la sangre completa humana a cantidades equimolares. Despues de 1 hora, se aislaron el plasma, los globulos rojos (RBC) y las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y se analizaron mediante HPLC con deteccion radiometrica. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Despues de 1 hora, el GS-7340 da como resultado 10x y 30x la concentracion de las especies de PMPA en los PBMC en comparacion con TDF y PMPA, respectivamente. En plasma, despues de 1 hora, el 84 % de la radioactividad se debe al GS-7340 intacto, mientras que no se detecta TDF despues de 1 hora. Dado que no se detecta TDF intacto en plasma, la diferencia de 10x a 1 hora entre TDF y GS-7340 es la minima diferencia esperada in vivo. El cromatograma de HPLC para los tres compuestos en los PBMC se muestra en la Figura 1. (HPLC/C-14 Trazas de Extractos de PBMC de Sangre Humana Incubada durante 1 h a 37°C con TDF, GS-7340 o PMPA).

Claims (5)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   Reivindicaciones

   1. Un metodo para la fabricacion de 9-[2-(fosfonometoxi)propil]adenina (PMPA) o 9-[2-(fosfonometoxi)etil] adenina (PMEA) que comprende hacer reaccionar 9-(2-hidroxipropil)adenina (HPA) o 9-(2-hidroxietil)adenina (HEA),, alcoxido de magnesio, y p-toluenosulfonoloxometilfosfonato protegido.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1 que comprende ademas recuperar PMPA o PMEA, respectivamente.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2 en el que el fosfonato del p-toluenosulfonoloxometilfosfonato esta protegido por ester etilico.
4. 4. El metodo de cualquiera de las reivindicaicones 1 a 3 en el que el alcoxido es un alcoxido C1-C6.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 4 en el que el alcoxido es t-butilo u oxido de isopropilo.

   Figura 1.

   CO

   800'

   600-

   400-

   200-

   TDF

   TDF/PBMC

   PMPA

   PMPAp

   PMPApp

   10

   15

   =■?

   20

   GS-7340/PBMC

   imagen1

   800‘

   600-

   400-

   200-

   PMPA/PBMC

   PMPA

   10

   15

   20

   Cone. ug/mL

   Figura 2

   imagen2

   Exposicion a PMPA (ABC)

   Figura 3

   ABC (0-24 H) para el PMPA en PBMC y Plasma Despues de una Dosis Oral de 10 mg-eq/kg de los profarmacos de PMPA a Perros.

   imagen3