NO314308B1 - Biotin-innholdende chemiluminiserende markör, anvendelse av markören for fremstilling av en diagnostisk analyse, diagnostisk analyse og settfor diagnostisk analysering - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en unik klasse av chemiluminiserende markører som inneholder biotinsubstitusjon som er velegnet for chemiluminiserende analyser som blant annet anvender et streptavidin og/eller avidinkonjugat. De chemiluminiserende markørene i oppfinnelsen har evne til å bindes til streptavidin og/eller avidin per se eller til streptavidin og/eller avidin konjugert med en analytt. Det blir beskrevet markørstrukturer som har hydrolyttisk stabilitet slik at de tilfredsstiller de mest krevende kommersielle analysebetingelser. Oppfinnelsen angår også anvendelse av markører for fremstilling av en diagnostisk analyse, diagnostisk analyse og sett for diagnostisk analysering.

Litteraturen beskriver klasser av forbindelser som sender ut lys eller "luminiserer" ved reaksjon gjennom kjemisk behandling, for eksempel, med peroksld eller molekylært oksygen ved høy pH. Forbindelsene som har denne evnen blir betegnet chemiluminiserende materialer. Lys blir fremstilt ved nedbrytning av forbigående ("mellomliggende") struktur som blir dannet ved peroksld eller molekylært oksygenindusert reaksjon ved et sp<2> eller sp<J> hybridisert karbon i forbindelsen som er en del av en kjede eller en ring eller ringsystem.

Som litteraturen beskriver, kan enhver serie av reaksjoner som produserer mellomproduktet:

føre til moderat til sterk chemiluminescens. (?) er en struktur slik at produktet karbonylderivat er fluorescerende og X er en god avspaltbar gruppe, vanligvis med XH, for effektiv chemiluminescens, og som har en pKa på ca. <11, fortrinnsvis <11, og mest å foretrekke fra ca. 5 til ca. 8. Reaksjonen kan kreve basekatalyse. Mellomproduktet kan bli fremstilt (i isolerbar eller forbigående form, avhengig av ^) ) fra typer slik som: lignende) eller

og H2O2 (Y er halogen, -S02R, og

og hase/02.

Se Endeavour. 23, nr. 117 (1973) s. 140, The Chemistrv of Bioluminescence in " Bioluminescence in Action" (P.J. Herring, utg.), Academic Press, London, 1978, (s. 64-5), Proe. R. Soc. Lond.. B 215,s. 256 (1982), Progress in Organic Chemistry.

(W. Carruthers og J.K. Sutherland, utg.), Butterworth, London

(1973), s. 261, alle forfattet av F. McCapra.

For eksempel reagerer chemiluminiserende arylestere som inneholder slikt hybridisert karbon, betegnet en merket forbindelse, i henhold til følgende generelle reaksjon:

der A er en arylring eller ringsystem og B er en heterocyk-lisk ring eller ringsystem. I denne reaksjon blir -O-A, den avspaltbare gruppen, kløyvet ved perhydrolyse og dette resulterer i trinn som fører til det forbigående mellomprodukt, B=0, som går videre til nedbrytning og genererer luminescens.

Karaktertrekkene til noen av disse chemiluminescerende forbindelsene, deres kjemi når det gjelder fremstillingg og andre faktorer som er beslektet med disse, er mer detaljert beskrevet av McCapra, "Chemiluminescence of Organic Compounds", i Progress in Organic Chemistry, bind 8, Carruthers og Sutherland utg., Wiley & Sons (1973); Kohen, Bayer, Wilechek, Barnard, Kim, Colleins, Beheshti, Richardson og McCapra, "Development Of Luminescence-Based Immunoassays For Haptens And For Peptide Hormones", s. 149-158; in Analytical Applications Of Bioluminescence and Chemlluminescence. Academic Press, Inc. (1984); Richardson, Kim, Barnard, Collins og McCapra, Clinical Chemistr<y>. bind 31, nr. 10, s. 1664-1668 (1985); McCapra, "The Application of Chemlluminescence in Diagnostics", ioih. Conference of the American Association of Clinical Chemists, New Orleans, LA, 28. juli 1988; McCapra, "The Chemlluminescence Of Organic Compounds", Ouarterly Reviews, bind 20, s. 485-510 (1966): McCapra, "The Chemlluminescence Of Organic Compounds", Pure and A<pp>lied Chemistr<y>. Mnd 24, s. 611-629 (1970); McCapra, "The chemistry of bioluminescence", Proceedin<g>s Of Royal Society, bind B215, s. 247-278 (1982); McCapra og Beheshti, "Selected Chemical Reactions That Produce Light", Bioluminescence and Chemlluminescence: Instruments and Applications. CRC Press, bind 1, kapittel 2, s. 9-37 (1985); McCapra, "Chemilumines-cent Reactions of Acridines", kapittel IX, Acridlnes. R.M. Acheson, utg., s. 615-630, John Wiley & Sons, Inc. (1973); McCapra, "Chemical Mechanisms in Bioluminescence"; Accounts of Chemical Research, bind. 9, nr. 6, s. 201-108 (juni 1976); og I mange andre publikasjoner og presentasjoner som angår temaet.

Slik det er angitt i litteraturen over, har chemiluminiserende forbindelser en lang rekke strukturer som har blitt foreslått som markører på en lang rekke analyser som innbefatter immunoanalyser (når det gjelder dette se US-patent nr. 4383031, 4380580 og 4226993). Estrene, tiolestre og amider, alene eller konjugerte (dvs. kjemisk koblet til et annet materiale), er særlig ønskede former for chemiluminiserende markører. De taper imidlertid sin luminiserende evne over tid i et vandig system fordi de hydrolyseres til produkter som ikke tilgjengelige for analysen. Inntil det siste har disse forbindelsene ikke blitt anvendt i kommersielle analyser. Inntil foreliggende oppfinnelse manglet esteren, tiolesteren og amid formene av denne klasse av materialer tilstrekkelig hydrolytisk stabilitet til å bli lagret i den mest hensiktigmessige form over en lengere tidsperiode, som er som en komponent i et vandig system.

Det er velkjent innenfor kjemien at karboksylsyreestere, tiolestere og amider er utsatt for hydrolyttisk angrep og resulterer i dannelsen av karboksylsyre og hydroksy, merkapto eller aminokomponenten som er den teoretiske eller virkelige forløper for esteren, tiolesteren eller amidet. Hydrolyse er mer uttalt under sure eller basiske betingelser. Det er også anerkjent innenfor kjemien at visse nivåer av hydrolyse kan bli hemmet ved inkludering av riktig posisjonerte bulkgrupper som kjemisk sterisk hindrer de bindigene, se Nishioka et al., J. Org. Chem.. bind 40, nr. 17, s- 2520-2525 (1975), Fujita et al., "The Analysis of the Ortho Effect", Progress in Phvsical Organic Chemistry. 8, s. 49-89 (1976), Morrison and Boyd, Organic Chemistry. 5. utg. s. 842-843 (1987) og Maren, Advanced Organic Chemistry. 3. utg., utgitt av John Wiley & Sons, New York, NY (1985) s. 240. Ifølge March: "Et annet eksempel på sterisk hindring finner man i 2,6-disubstituert benzosyre, som er vanskelig å forestre uavhengig av hvilken resonans eller felteffekter av gruppene 1 2- eller 6-poslsjon. Med en gang de 2,6-disubstituerte benzosyrene er forestret, er estrene på tilsvarende måte vanskelig å hydrolysere." (Utdrag av originalen)

Vanskeligheten når det gjelder forestring er ikke den samme når man lager estere fra 2,6-disubstituerte fenoler, men de generelle prinsippene som er beskrevet av March kan anvendes på å øke hydrolyttisk stabilitet av den resulterende esteren så lenge som ortosubstituentene er elektrondonerende. Som det blir vist I foreliggende oppfinnelse, krever effektive nivåer av hydrolyttisk stabilitet tilstedeværelsen av et valgt nivå av elektrontiltrekkende kjemisk effekt i forbindelse med (og i tillegg til) tradisjonell kjemisk sterisk hindrende faktorer.

Den funksjonelle elektrontiltrekking eller elektrondonerende karaktertrekk til en gruppe i en organisk forbindelse blir hensiktsmessig målt relativt til hydrogen. Den relative rangering aksepterer at alle grupper på et molekyl vil skaffe tilveie noe elektrontiltrekkingseffekt, og adskiller dem ved naturen til støtet gruppen har på molekylets ytelse. En elektrontiltrekkende funksjonell gruppe, kjennetegnet ved et positivttall, vil trekke elektroner til seg selv mer enn hydrogen ville om det okkuperte samme posisjon i molekylet. Det motsatte forekommer med en "elektrondonerende gruppe", en mindre elektrontiltrekkende gruppe som i kjemisk konvensjon karakteriseres med et negativt tall. Sigma para-verdier (o"p) er det relative mål på elektrontiltrekking eller elektrondonerende kvaliteter hos en funksjonell gruppe i para-posisjon på benzosyre. Se March, over, på s. 242-250 og 617-8. Tabeller av Op-verdier for forskjellige grupper kan finnes i Hansen et al., J. Med. Chem.. 16(11):1209-1213 (1977) og Hansch og Leo, "Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology", kapittel 6, s. 49-52, (John Wiley & Sons, New York 1979). CTp-verdiene som er rapportert i Hansch-artiklene er det basert på her i karakterisering av relative verdier for grupper både i meta-og para-posisjon.

Biotin, en vannoppløselig faktor av vitamin B kompleks og et koenzym for enzymer involvert i karboksyleringsreaksjoner,

har strukturen

Egentlig har den meget høy affinitet for streptavidin og avidin, proteinene avledet henholdsvis fra Streptomyces avidinii og eggehvite. Kombinasjonen av et av disse proteinene og biotin har blitt anvendt som et markørsystem i immunoanalyser så vel som DNA-prober. Se Khosravi et al., "Novel Application of Streptavidin-Hapten Derivatives as Protein-Tracer Conjugate in Competitive-Type Immunoassays Involving Biotinylated Detection Probes", Cl in. Chem.. 37/1, s. 58-63 (1991) og Strasburger og Kohen, "Chmiluminescent Labelled Streptavidin (STAV) as a Universal Marker In Steroid and Peptide Immunoassays", Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence. bind 4, s. 112-188. Avidin er et basisk glykoprotein av ~68 kDa, har en eksepsjonelt høy blndings-affinitet (IO15 L mol-<1>) for biotin.

Funksjonen til chemiluminiserende markører i analyseanvendel-ser involverer kobling av markørforbindelsen til et substrat-molekyl. Slik kobling kan bli oppnådd ved oppløsnlngslnterak-sjon (for eksempel molekylær kompatibilitet), enhver heterolyttlsk eller homolyttlsk mekanisme indusert på kjemiske måter og influert av fysikalske effekter, slik som tid, temperatur og/eller massevirkning. Reaksjonen kan, for eksempel, være nukleofil eller elektrofll, eller den kan involvere frie radikalmekanismer. I sitt bredeste aspekt kan koblingen betraktes som oppnåelig via sterke til svake bindingskrefter.

En chemiluminiserende markør i analyser er en assosiert del av et blndlngsmaterlale. Delen er avledet fra en kjemisk forbindelse, som slik den er, innehar chemiluminiserende muligheter. Begrepet del slik det blir anvendt på markøren slik den er, er en referanse på forbindelsen før den blir assosiert med et bindende materiale. Begrepet assosiert har til hensikt å Innbefatte alle eller enhver av mekanismene for kobling av markøren til substratmolekylet.

Begrepet "funksjonell" innenfor kjemien refererer typisk til en gruppe som påvirker ytelsen til et kjemikalie eller utgjør stedet for homolyttiske eller heterolyttiske reaksjoner. En funksjonell alkylsubstltuent som, for eksempel, blir anvendt i forbindelse med lnterreaksjoner gjennom substituenten, menes en alkylgruppe substituert slik at den gjennomfører reaksjonen. Med en alkylgruppe betegnet funksjonell for de elektroniske effektene den induserer i molekylet er en referanse til alkylgruppen per se.

Oppfinnelsen angår en unik klasse av chemiluminiserende markører som Inneholder blotinsubstitusjon som er egnet for chemiluminiserende analyser ved blant annet å anvende et streptavidin og/eller avldinkonjugat. De chemiluminiserende markørene i oppfinnelsen har evne til å konjugere til streptavidin og/eller avidin per se eller til streptavidin og/eller avidin konjugert med en analytt. Markørstrukturer blir beskrevet og har god hydrolyttisk stabilitet til å tilfredsstille de mest krevende kommersielle analysebetingelser. Oppfinnelsen omfatter konjugater som Inneholder assosierte versjoner av markeringsforbindelser, analyser og sett for å gjennomføre slik analyse som utnytter konjugatene. Analysene i oppfinnelsen er nyttige for hovedsakelig enhver immunoanalyse, enten av konkurrerende eller ikke-konkurrerende typer.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter således en chemiluminiserende markørforbindelse kjennetegnet ved at den biotinylerte heterocykliske strukturen har formel: der R<1> er -(CE2)n_; r<2> er

; R3 er C^-Cg,-

alkyl; og Ra~^e er ^ eller C^-Cfc-alkyl, n =1-6.

Spesielt foretrukne utførelsesformer av markørforbindelsene i oppfinnelsen innbefatter følgende biotininnehpldende

heterocykliske forbindelser:

Oppfinnelsen omhandler også anvendelse av markøren ifølge oppfinnelsen for fremstilling av en diagnostisk analyse for deteksjon av en analytt ved anvendelse en chemiluminiserende markør konjugert med et spesifikt bindlngsmateriale.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av et chemiluminiserende markørkonjugat som innbefatter den chemiluminiserende markørforbindelsen ifølge oppfinnelsen konjugert med et spesifikt bindlngsmateriale.

Oppfinnelsen angår i tillegg anvendelse av en analyse hvor analysen er en konkurrerende eller ikke-konkurrerende immunoanalyse for den diagnostiske analysen.

Oppfinnelsen vedrører ytterligere diagnostisk analyse for påvisning av en analytt ved å anvende en chemiluminiserende markør konjugert til et spesifikt bindlngsmateriale, kjennetegnet ved at man anvender den chemiluminiserende markørforbindelse der analytten blir blandet med nevnte chemiluminescens-merkede spesifikke bindlngsmateriale, chemiluminescens blir indusert ved nedbrytning av et mellomprodukt diassoslert fra konjugatet, og luminescens fra dette blir målt for å analysere analytten.

Til slutt angår oppfinnelsen sett for diagnostisk analysering, kjennetegnet ved at det tilveiebringes et medisinglass som inneholder et merket kompleks som inneholder chemiluminiserende egenskaper som diagnostiserer en analytt ved å måle chemiluminescens forårsaket av nedbrytning av markøren, der komplekset er komplekset Ifølge oppfinnelsen.

Biotins karboksylsyredel er en funksjonell gruppe som tillater at biotin blir koblet til andre organiske og uorganiske forbindelser. Karboksylsyren kan, for eksempel, bli reagert med N-hydroksysuccinimid (NHS) i nærvær av et karbodllmld slik som DCC. Den resulterende NHS-esteren kan bli reagert relativt hensiktsmessig med en lang rekke komplementære funksjonelle grupper som Inneholder et aktivt hydrogen som er egnet for å komme inn i en nukleofil reaksjon for å danne et nukleofilt reaksjonsprodukt. Illustrasjoner på slike grupper er aminer, hydroksyl (enten alkoholisk eller aromatisk hydroksyl), tioler, amid, uretan, karboksyl (for å danne stabile anhydrider) og lignende. Kommersielt tilgjengelige funksjonaliserte biotiner innbefatter følgende:

En spesielt foretrukket klasse av Diotinylert forbindelse som er egnet for gjennomføring av oppfinnelsen, og som skaper et gunstig mellomprodukt under dannelse av chemiluminiserende markører i oppfinnelsen er reaksjonsprodukter av NHS-substituert biotin, slik som det som er beskrevet over, med aminosyrer, særlig de som inneholder aktivt hydrogen. Et eksempel er reaksjon av I. ) med lysin som resulterer i strukturen som kalles biocytin:

Den reaksjon kan bli gjennomført med en hvilken som helst av aminosyrene, slik som alanin, val in, leucin, isoleucin, tryptofan, fenylanalin, prolin, metionin, glysin, serin, treonin, tyrosin, asparagin, glutamin, cystein, lysin, arginin, histidin, aspartinsyre og glutaminsyre. Reaksjonen blir gjennomført med en hvilken som helst av aminokarboksyl-syrene, hydroksykarboksylsyrene, merkaptokarboksylsyrene og lignende. Spesielt foretrukket er reaksjonsprodukter av de 20 naturlige aminosyrene som utgjør proteiner med NHS-estere av biotin. Den reaksjonen er illustrert under. Det er en reaksjon som kan bli gjennomført i en lang rekke oppløsnings-midler og ved temperaturer i området fra -20°C til ca. 100<*>C, der reaktantene er tilstede i støkiometriske andeler for dannelse av det ønskede reaksjonsprodukt.

Reaksjonen av substituert biotin, slik som en hvilken som helst av forbindelsene I.)-III.), eller deres reaksjonsprodukt med aminosyrer eller andre funksjonelle grupper blir gjennomført i et egnet oppløsningsmiddel, slik som vann, nitriler, etere, ketoner, estere, ved moderate temperaturer fra ca. -20'C til ca. 100°C i et tidsrom som er tilstrekkelig til å sikre den ønskede grad av reaksjon. Reaksjonsproduktet blir utvunnet ved utfelling, destillasjon, krystallisasjon og lignende prosedyrer. Dersom ønskelig, kan produktet bli holdt i reaksjonsmediet og videre reagert med den heterocykliske forbindelsen som skaffer til veie de chemiluminiserende egenskapene.

Reaksjonen av funksjonalisert biotin med den heterocykliske forbindelsen kan bli gjennomført ved å anvende en heterocyk-lisk forbindelse som Inneholder en funksjonell gruppe som er komplementær med den funksjonelle gruppen av det funksjonaliserte biotin. Illustrasjoner på slike forbindelser er de funksjonallserte heterocykliske forbindelsene som er beskrevet 1 US-patentsøknader serienr. 291843 inngitt 29. desember 1988, 549564 Inngitt 6. juli 1990, 827727 inngitt 29. januar 1990 og 859956, 860410, 859995, 859676, 858955, 859994 og 860001, hver inngitt 30. mars 1992. Det er også Innbefattet sulfonamidene I europeiske patentsøknader, publikasjonsnr. 0273115 og 0257541, som Innbefatter følgende akridinium og fenantridiniumstrukturer som kan bli reagert med funksjonalisert biotin og biotininneholdende forbindelser for å danne markører Innenfor rekkevidden av oppfinnelsen: der X<*-3> kan være en funksjonell gruppe som kan reagere med den funksjonelle gruppen 1 den blotininneholdende forbindelsen, eller hydrogen, eller en enverdig organisk gruppe, fortrinnsvis som inneholder mindre enn ca. 12 karbonatomer. R', R" og RP er toverdige organiske grupper, karbonbundet til nitrogen og sulfonyl. De kan være alifatiske, aromatiske, cykloalifatiske, heterocykliske og lignende deler.

Spesielt ønskede biotinylerte chemiluminiserende heterocykliske forbindelser er de som er omfattet av formlene:

I disse tilfeller er substituentgruppene definert over. Reaksjonen i dette tilfellet Involverer en funksjonell gruppe R° bundet til akrldiniumrIngen og reaksjonen av funksjonalisert biotin med dette. I dette tilfellet omfatter R° den funksjonelle gruppen på den heterocykliske ringen og den komplementære grupen av biotlnylforbindelsen koblet til den. En aminosubstituert akridiniumester, der amino er enten i 2-, 3- eller 4-poslsjon, kan for eksempel bli reagert med en av de NHS-substituerte blotinene som er illustrert over. Dersom den funksjonelle gruppen er en karboksy- eller sulfonyltype, da vil imidlertid blotinsubstitusjonen typisk inneholde en amino- eller hydroksysubstituent, slik som tilveiebragt av biocytin, biocytinhydrazid og lignende sammensetninger.

Den heterocykliske strukturen som kan inneholde egnede ringsubstitusjoner R<w> og Rx, kan være funksjonelle eller ikke-funksjonelle. Funksjonalitet kan være med det formål å øke den hydrolyttiske stabiliteten i forbindelsen eller for å skaffe til veie koblingsmuligheter via homolyttisk eller heterolyttlske reaksjoner eller andre former for assosiering som kobler markørforbindelsen til substratet. Slike substitu-sjoner innbefatter de med formål å fremstille peri-inter-aksjoner rundt den heterocykliske bindingen for å øke ester, tiolester eller amidhydrolyttlsk stabilitet, og skaffe til veie funksjonalitet til forbindelsen for å koble til proteiner og andre materialer med komplementær funksjonalitet, og øke forbindelsens oppløselighet og chemiluminiserende effekt. Grupper som er nyttige for assosiering av forbindelsen til proteiner og andre materialer slik at den chemiluminiserende markørforbindelsen i oppfinnelsen fungerer i en koblet tilstand med dem Innbefatter, men er ikke begrenset til de som er beskrevet i de forannevnte patentsøknadene.

Peri-substltuenter innbefatter enhver gruppe som kan forårsake sterisk hindring med hensyn på karbon til hvilken ester, tiolester eller amldbindingen er festet og/eller med hensyn på karbon i esteren, tiolesteren eller amldbindingen. Foretrukne peri-substituenter innbefatter korte alkylgrupper (cl-4* for eksempel metyl, etyl og lignende), arylgrupper (for eksempel fenyl), alkaryl (for eksempel tolyl, xylyl og lignende), alkoksyalkyl ( C^_^ alkoksy, for eksempel metoksy-metyl, etoksyetyl og lignende). Peri-substituentene, hvis de er tilstede, er lokalisert på karbonatomer i den heterocykliske ringen eller rlngsystemet som er "tilgrensende til" karbonet til hvilken esteren, tiolesteren eller amldbindingen er festet. Delene kan innbefatte mer enn en peri-substituent. For eksempel kan peri-substituenter være plassert i følgende posisjoner: 1. i akridinium og akridaner: på og Cg;

2. i fenantridinium og redusert fenantridinium: på C7; og

3. i quinolinlum og redusert quinoliniura: på C3.

De ovenfor beskrevne forbedrede cherailumineserende forbindelsene er nyttige innenfor et vidt område av spesifikke bindingsanalyser for tilstedeværelse av analytt i en prøve. "Tilstedeværelse" menes her kvalitativ og/eller kvantitativ påvisning av en analytt. Slike analyser kan være rettet mot en hvilken som helst analytt som kan bli påvist ved anvendelse av den forbedrede chemiluminiserende forbindelsen i forbindelse med spesifikke bindingsreaksjoner for å danne en del derpå. Disse analysene innbefatter, uten å være begrens-ende, immunoanalyser, protelnbindingsanalyser og nukleinsyre-hybridiseringsanalyser.

I en typisk immunoanalyse er analytten immunoreaktiv og dens tilstedeværelse i en prøve kan bli bestemt på basis av dens immunoreaksjon med et analysereagens. I en typisk protein-bindingsanalyse blir tilstedeværelse av analytt i en prøve bestemt ved den spesifikke bindingsreaktiviteten av analytten med et analysereagens der reaktiviteten er noe annet enn immunoreaktivitet. Eksempler på dette innbefatter enzym-substratgjenkjenning og bindingsaffInitet av avidin for biotin. I typisk nukleinsyre-hybridiseringsanalyse blir tilstedeværelse av analytt i en prøve bestemt ved en hybridiseringsreaksjon av analytten med et analysereagens. Analyttnukleinsyre (vanligvis tilstede som dobbelttrådet DNA eller RNA) blir vanligvis først omdannet til en enkelttrådet form og immobilisert på en bærer (for eksempel nitrocel-lulosepapir). Analyttnuklelnsyren kan alternativt bli elektroforesebehandlet i en gelmatriks. Den immoblliserte analytten kan deretter bli hybridisert (dvs. spesifikt bundet) ved en komplementær sekvens av nukleinsyre.

De foregående spesifikke bindingsanalysene kan bli gjennom-ført innenfor en lang rekke analyseformater. Disse analyseformatene faller innenfor to vide kategorier. I den første kategorien utnytter analysen et chemiluminiserende konjugat som omfatter den forbedrede chemiluminiserende delen festet til et spesifikt bindlngsmateriale. "Spesifikt bindlngsmateriale" menes her et hvilket som helst materiale som binder spesifikt ved en immunoreaksjon, proteinbindingsreaksjon, nuklelnsyre-hybridlseringsreaksjon, og en hvilken som helst annen reaksjon der materialet reagerer spesifikt med en begrenset klasse av biologiske, biokjemiske eller kjemiske arter. Innenfor denne kategorien analyser deltar det chemiluminiserende konjugatet 1 en spesifikk blndingsreaksjon og tilstedeværelse av analytt i prøven er proporsjonal med dannelse av en eller flere spesifikke bindingsreaksjonspro-dukter som Inneholder det chemiluminiserende konjugatet. Analysen blir gjennomført ved at man tillater at de nødven-dige spesifikke blndingsreaksjonene foregår under egnede reaksjonsbetingelser. Dannelse av spesifikke blndingsreaksjonsprodukter som inneholder det chemiluminiserende konjugat blir bestemt ved å måle chemilumlnlscens av slike produkter som inneholder chemiluminiserende konjugat eller ved å måle chemiluminiscens av ureagert eller delvis reagert chemiluminiserende konjugat som ikke er Inneholdt 1 slike produkter.

Denne første kategorien av analyseformater blir illustrert ved sandwich-analyse, konkurrerende analyser, overflateanti-genanalyser, sekvensiell metnlngsanalyser, konkurrerende fortrengningsanalyser og hurtigstoppanalyser.

I et sandwich-format har det spesifikke blndingsmaterialet til hvilket den chemiluminiserende delen er festet, evnen til spesifikk binding med analytten. Analysen utnytter videre en reaktant som har evne til spesifikk binding med analytten for å danne en reaktant-analytt-chemiluminiserende konjugatkompleks. Reaktanten kan være festet til en faststoffase, som inkluderer uten å være begrenset til, dyppestenger, perler, rør, papir eller polymerark. I slike tilfeller vil tilstedeværelse av analytt i en prøve være proporsjonal med chemilum-inescensen 1 faststoffasen etter at spesifikke bindingsreaksjoner er fullført. Slike analyseformater er beskrevet ytterligere i US-patenter nr. 4652533, 4383031, 4380580 og 4226993, som er innbefatter her med referanse.

I et konkurrerende format utnytter analysen en reaktant som har evne til spesifikk binding med analytten for å danne et analytt-reaktantkompleks og med det spesifikke bindingsmaterialet, til hvilken den chemiluminiserende delen er festet, for å danne et chemiluminiserende konjugat-reaktantkompleks. Eeaktanten kan være festet til en faststoffase, eller alternative reaksjonsprodukter som inneholder reaktanten kan bli utfelt ved anvendelse av et annet antistoff eller ved andre kjente måter. I dette konkurrerende formatet er tilstedeværelse av analytt "proporsjonal", dvs. omvendt proporsjonal med chemiluminiescens i faststoffasen eller utfellingen. En ytterligere diskusjon av dette analysefor-matet kan man finne i de ovenfor nevnte US-patentene.

I et annet analyseformat kan analytten forekomme på eller være bundet til en større biologisk, biokjemiske eller kjemisk art. Denne formattypen kan illustreres ved en overflate-antigenanalyse. I dette formatet har det spesifikke bindingsmaterialet evne til spesifikk binding med analytten i nærvær av analytt som er proporsjonal med analytt-chemiluminescens konjugatkompleks som ble dannet som et reaksjonsprodukt. Dette illustreres ved festing av den chemiluminiserende delen via en streptavidindel til et antistoff som er spesifikt til et overflateantigen på en celle. Tilstedeværelsen av celleoverflateantigenet indikeres ved chemiluminescens av cellene etter fullføring av reaksjonen. Cellene selv kan bli anvendt i forbindelse med filtreringssystemet for å separere analytt-chemiluminiscens konjugatkomplekset som ble dannet på overflaten av cellen fra ureagert chemiluminiserende konjugat. Dette er diskutert ytterligere I US-patent nr. 4652533.

Den forbedrede chemiluminiserende delen kan bli anvendt i ytterligere analyseformater som er kjent innenfor fagområdet og som innbefatter' uten begrensning sekvensiell metning og konkurrerende fortrenging, begge disse utnytter et chemiluminiserende konjugat der både (1) spesifikt bindlngsmateriale, til hvilket delen er festet, og (2) analytten binder spesifikt med en reaktant. I det tilfellet med sekvensiell metning blir analytten reagert med reaktanten først, etterfulgt av en reaksjon av chemiluminlseringskonjugat med den gjenværende ureagerte reaktant. I det tilfellet med konkurrerende fortrengning fortrenger chemiluminiserende konjugat kompetitivt analytten som allerede har bundet seg til reaktanten.

I et hurtigstoppformat utnytter analysen en reaktant som har evne til spesifikk binding med analytten for å danne et analytt-reaktantkompleks og med det spesifikke bindingsmaterialet, til hvilket den chemiluminiserende delen er festet, for å danne et chemiluminiserende konjugat-reaktantkompleks. En hurtigstoppdel er festet til reaktanten. Når den blir bragt i nærhet av den chemiluminiserende delen, reduserer hurtigstoppdelen eller stopper chemiluminescens fra den chemiluminiserende delen. I dette hurtigstoppformatet er tilstedeværelse av analytt proporsjonal med chemiluminescens i den chemiluminiserende delen. En videre diskusjon av dette formatet finner man i US-patenter nr. 4220450 og 4277437, som med dette er innbefattet med referanse.

I betraktning av de ovenfor diskuterte analyseformatene, og i formatene som diskuteres under, kan rekkefølgen som analysereagensene blir tilsatt og reagert variere vidt slik det er kjent innenfor fagområdet. I en sandwich-analyse kan, for eksempel, reaktanten bundet til en faststoffase, bli reagert med en analytt inneholdt i en prøve og etter denne reaksjonen kan faststoffasen som inneholder kompleksert analytt bli separert fra den gjenværende prøven. Etter dette separasjons-trinnet kan chemiluminiserende konjugat bli reagert med komplekset på faststoffasen. Alternativt kan faststoffasen, prøve og chemiluminiserende konjugat bli tilsatt samtidig og reagert før separasjon. Som et ytterligere, men mindre foretrukket, alternativ kan analytten i prøven og chemiluminiserende konjugat bli reagert forut for tilsetning av reaktant på faststoffasen. Tilsvarende variasjoner i blanding og reaksjonstrinnet er mulig for konkurrerende analyseformater så vel som andre formater som er kjent innenfor fagområdet. "Tillate under egnede betingelser vesentlig dannelse" av spesifikke blndingsreaksjonsprodukter skal i denne forbindelse innbefatte mange forskjellige variasjoner når det gjelder rekkefølge for tilsetning og reaksjon av analysereagenser.

I en annen kategori av analyseformater utnytter analysen en ukonjugert forbedret chemiluminiserende forbindelse. Tilstedeværelse av analytt 1 prøven er proporsjonal med dannelse av et eller flere spesifikke blndingsreaksjonsprodukter som ikke selv inneholder den chemiluminiserende delen. I stedet chemiluminiserer den chemiluminiserende forbindelsen i andeler til dannelse av slike reaksjonsprodukter. I et eksempel av denne andre analysekategorien utnytter analysen en reaktant som har evne til binding med analytten for å danne et analytt-reaktantkompleks som forårsaker at den chemiluminiserende forbindelsen chemiluminiserer.

Analysene som er inneholdt i de ovenfornevnte kategoriene av analyseformater kan være heterogene eller homogene. I heterogene analyser blir reaksjonsproduktene, hvis dannelse er proporsjonal med tilstedeværelse av analytt i prøven, separert fra andre produkter av reaksjonen. Separasjon kan bli oppnådd ved en hvilken som helst måte, innbefattet uten å være begrenset til, separasjon av en flytende fase fra en faststoffase ved filtrering, mikrof iltrering, ' dobbelanti-stoffutfelling, sentrifugering, størrelseseksklusjonskromato-grafi, fjerning av en faststoffase (for eksempel en dyppestav) fra en prøveoppløsning eller elektroforese. I en sandwich-analyse blir, for eksempel, reaktant-analytt-chemiluminiserende konjugatkompleks separert fra ureagert chemiluminiserende konjugat. I en overflate-antigenanalyse blir analytt-chemiluminiserende konjugatkompleks separert fra ureagert chemiluminiserende konjugat. I en konkurrerende analyse blir reaktant-chemiluminiserende konjugatkompleks separert fra ureagert chemiluminiserende konjugat. I en sekvensiell metningsanalyse og 1 en konkurrerende fortreng-ningsanalyse blir reaktant-chemiluminiserende konjugatkompleks separert fra ureagert chemiluminiserende konjugat. I homogene analyser blir reaksjonsproduktene alternativt ikke separert. Etter at analysereagensene har fått anledning til å reagere, kan chemiluminiescensen bli målt fra hele analyse-blandingen uavhengig om en slik blanding er i løsning, på en faststoffase eller fordelt mellom forskjellige membranlag av en dyppestav eller annen faststoffbærer.

Til slutt skal "måle chemiluminescens" innbefatte, der det er relevant, virkningen av separering av de spesifikke blndings-reaks j onsprodukter , dannelse av disse er proporsjonale med tilstedeværelse av analytt i prøven, fra andre reaksjonsprodukter. Det skal også innbefatte der det er relevant, virkningene av utløsning av den chemiluminiserende delen til chemiluminescens i det tilfellet med de analyseformatene der dannelse av reaksjonsprodukter selv ikke utløser chemilumin-escensdelen.

Syntese av markører

Følgende eksempler viser syntesen av visse chemiluminiserende markører i foreliggende oppfinnelse. Disse chemiluminiserende markørene blir typisk laget i små mengder og prosedyrene som blir benyttet for deres fremstilling reflekterer ikke konvensjonellle storskala kjemiske fremstillingsprosedyrer. I disse reaksjonene har konvensjonelle reaksjoner blitt benyttet for å produsere chemiluminiserende markører i oppfinnelsen. Renseprosedyrene som er egnede for isolering av produkter er konvensjonelle laboratorleprosedyrer, slik som krystallisasjon ut av oppløsningsløsning ved tilsetning av et ikke-oppløsnlngsmlddel, oppløsnlngsmlddelekstranering og lignende. I slike tilfeller er det mange forskjellige oppløsningsmidler og ikke-oppløsningsmidler egnede. Utbytter er mengder utvunnet som en prosentdel av de benyttende reaktantene.

Eksempel 1

Blocytin (0,3 mg, 0,08 mmol) ble oppløst 1 bikarbonatbuffer (15 mM, pH 9,6, 100 jjL). 2,6-dimetyl-3-klorsulf onylf enyl akridinium-9-karboksylatfluorsulfonat (0,28 mg, 0,05 mmol) ble oppløst i DMF (100 uL) og bikarbonatbuf f er (25 uL) ble tilsatt. De to oppløsningene ble blandet sammen og fikk anledning til å stå ved romtemperatur. Reaksjonsblandlngen ble registrert på en C-18 reversfasekolonne ved å anvende et HPLC-system. Produktene ble påvist ved 363 nm. Et eluerings-oppløsningsmiddel av en 9:1 blanding ved volum av acetonitril og vann inneholdende 0,1# trifluoreddiksyre ble anvendt. Toppen som tilsvarer et produkt adskilt fra utgangsakrldin-iumesteren eller dens hydrolyserte form ble samlet og oppløsningsmidlene ble inndampet.

Blotinylakridinium [2,6-dimetyl-3 (NE-biotinyl-L-lysylsulfo-nyl) fenyl N-metylakridinium-9-karboksylat] BA ble testet i et immunoanalysesystem for kvantifisering av progesteron ved å anvendeet streptavidinprogesteronkonjugat.

En geit anti-kanin antistoffbelagt perle ble inkubert i 4 timer ved romtempeatur med kanin anti-progesteron antistoff (50 pL, en 1:60.000 fortynning fra forråd), progesteroninne-holdende standarder (50 jjL, i steroidfritt humant serum; 0, 0,1, 0,5, 2,0, 10,0, 20,0 og 40,0 ng/mL), streptavidinprogesteronkonjugat (50 og biotynylakridinium [BA] (100 uL, fosfatbuffer, pH 6,0). På slutten av de fire timene ble perlen vasket og talt i et Berthold<®->luminometer. Følgende data ble oppnådd.

Eksempel 2

Biocytin (6 mg, 1,6 mmol) ble oppløst i acetonitril (400 jjL) og toverdig natrlumfosfat (0,1 M, 1 mL) ble tilsatt. 2,6-dimetyl-3-klorsulfonylfenyl akridinium-9-karboksylatfluorsul-fonat (5,2 mg, 0,93 mmol) ble oppløst i acetonitril (400 pL) og toverdig natriumfosfatoppløsnign (0,01 M, 400 uL) ble tilsatt. De to oppløsningene ble blandet sammen og fikk anledning til å stå ved romtemperatur i to timer. Reaksjonsproduktet ble isolert i en C-18 reversfasekolonne ved å anvende et HPLC-system. Et elueringsoppløsningsmiddel av en 9:1 blanding ved volum av acetonitril og vann inneholdende 0, 1% trifluoreddiksyre ble anvendt. Toppen som tilsvarer et produkt adskilt fra utgangsakridiniumesteren eller dens hydrolyserte form ble samlet og oppløsningsmidlene ble inndampet.

Claims (7)

1. Chemiluminiserende markørforbindelse, karakterisert ved at den hiotinylerte heterocykliske strukturen har formel: der R1 er -(CH2)n_; R<2> er ; R3 er Ca-C6-alkyl; og Ra-Re er H eller C^-Cfc-alkyl, n =1-6.

2. Chemiluminiserende markørforbindelse ifølge krav 1, kar akterisert ved at den hiotinylerte heterocykliske strukturen har formel:

3. Anvendelse av markøren ifølge krav 1 for fremstilling av en diagnostisk analyse for. deteksjon av en analytt ved anvendelse en chemiluminiserende markør konjugert med et spesifikt bindlngsmateriale.

4. Anvendelse av et chemiluminiserende markørkonjugat som innbefatter den chemiluminiserende markørforbindelsen ifølge krav 1 konjugert med et spesifikt bindlngsmateriale.

5. Anvendelse av en analyse hvor analysen er en konkurrerende eller ikke-konkurrerende immunoanalyse for den diagnostiske analysen ifølge krav 3.

6. Diagnostisk analyse ifølge krav 3 for påvisning av en analytt ved å anvende en chemiluminiserende markør konjugert til et spesifikt bindlngsmateriale, karakterisert ved at man anvender den chemiluminiserende markørfor-bindelse ifølge krav 1 der analytten blir blandet med nevnte chemiluminescens-merkede spesifikke bindlngsmateriale, chemiluminescens blir indusert ved nedbrytning av et mellomprodukt diassoslert fra konjugatet, og luminescens fra dette blir målt for å analysere analytten.

7. Sett for diagnostisk analysering, karakterisert ved at det tilveiebringes et medisinglass som inneholder et merket kompleks som Inneholder chemiluminiserende egenskaper som diagnostiserer en analytt ved å måle chemiluminescens forårsaket av nedbrytning av markøren, der komplekset er komplekset ifølge krav 1.