NO320322B1

NO320322B1 - Forbindelse, fremgangsmate for fremstilling av denne, legemiddel og farmasoytisk preparat inneholdende denne, anvendelse av forbindelsen og fremgangsmate for fremstilling av et legemiddel.

Info

Publication number: NO320322B1
Application number: NO19971116A
Authority: NO
Inventors: Claude Monneret; Joerg Czech; Klaus Bosslet; Jean-Claude Florent; Manfred Gerken; Rainer Straub; Fredoeric Schmidt
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 1996-03-12
Filing date: 1997-03-11
Publication date: 2005-11-21
Also published as: ATE316799T1; SI0795334T1; MX9701832A; PL189604B1; US5935995A; BG61900B1; EP0795334A2; CZ74297A3; CA2199664A1; HUP9700579A3; KR970065550A; CN1168733C; NO971116D0; JPH101495A; BR9701248A; NO971116L; BR9701248A8; DK0795334T3; CA2199664C; AU1620597A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en forbindelse, en fremgangsmåte for fremstilling av denne, et legemiddel og et farmasøytisk preparat inneholdende denne, anvendelse av forbindelsen og en fremgangsmåte for fremstilling av et legemiddel.

Virkningen av farmaka (drugs) består hyppig i at patologiske overeksprimerte enzymer, cytokiner eller andre faktorer ved spesielle sykdommer hemmes i sin sykdomsfremmende aktivitet. Imidlertid strekker medikamentenes hemmende virkning seg ikke bare til de farmakologiske målstrukturer (enzym, cytokin, faktor) i det syke vev, de hemmer også de forekommende aktiviteter i sunt vev. Ut fra dette opptrer det uønskede bivirkninger ved mange medikamenter. For å mildne bivirkningene ved medikamenter er det utviklet eksperimentelle systemer som tillater en mere selektiv frisetting av medikamenter i sykt vev. Slike systemer skal beskrives kort i det følgende.

ADEPT-systemet ("Antibody directed enzyme prodrug therapy", Bagshawe 1987, "Br. J. Cancer", 56: 531-532) er et totrinnssystem der det i det første trinn injiseres et antistoffenzymkonjugat (AEK) intravenøst. Dette AEK holdes på grunn av sin tumorselektivitet tilbake i tumoren, men skilles i løpet av 2 til 7 dager ut fra sunt vev. Den i det andre trinn intravenøst injiserte prodrug (en ugiftig medikamentforløper) aktiveres i tumoren på grunn av den enzymatiske aktivitet ved AEK til giftig medikament. Som en konsekvens av denne tumorspesifikke prodrugaktivering observerer man en øket medikamentkonsentrasjon i tumoren (5-50 ganger) og en lavere medikamentkonsentrasjon i sunt vev sammenlignet med standardterapi. Dette medfører en forbedret holdbarhet samt overlegne terapeutiske virkninger ved humane tumorxenopodingsmodeller (S.K. Sharma et al., 1991, "Diease Markers", 9: 225-231).

På tilsvarende måte som ADEPT-systemet arbeider FMPA-konseptet ("Fusion protein mediated prodrug activation"), men i stedet for den xenogene og derfor immunogene AEK anvendes et ikke-immunogent, humant fusjonsprotein for tumorselektive prodrugaktivering (Bosslet et al., 1994, "Cancer Res.", 54: 2151-2159).

Også i VDEPT-systemet ("Vector dependent enzyme prodrug therapy", Trinh et al., "Cancer Res.", 55: 4808-4812), et totrinnsgenterapeutisk opplegg, aktiveres prodrugs tumorselektivt efter injeksjon av en vektor og ekspresjon av et strukturgen som koder for et enzym.

En endogen aktivering av prodrugs ("Glucuronyl-Spacer-Anthrazyclin", Jacquessy et al., 1991, WO 92/19639) i nekrotiske tumorer og betennelsesprosesser forbundet med sterke antitumorale og antibetennelsesfarmakologiske effekter, er for første gang beskrevet av Bosslet et al. i 1994 i "Cancer Res.", 54: 2151-2159 og 1995 i "Tumor Targeting", 1. 45-50 som PMT (Prodrug Monotherapie). Ved den farmakologiske bearbeiding av PMT-systemene viste det seg at både kjemien for spaceren som eliminerer seg selv og hydrofilien og den molare cytotoksisitet for medikament-komponentene i den anvendte prodrug, er av avgjørende betydning for in vivo-effektiviteten. En ytterligere effektivitetsøkning for PMT ble observert i kombinasjon med stoffer som induserer nekroser (EP 0696456 A2). Fremfor alt viser anvendelsen av antistoffkonjugater med spesifisitet for CEGF/VEGF-reseptorkomplekset, kovalent forbundet med koagulatoriske proteiner, som f.eks. den forkortede vevfaktor, en særlig god virkning i farmakologiske in vivo-modeller kombinert med egnede prodrugs.

Videre beskriver EP0642799 enzymatisk spaltbare prodrugs med en annen kjemisk struktur enn forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse.

CA-2081281 angir en kombinasjon av et antistoff-enzym konjugat pluss et glukoronid-prodrug.

Overraskende er det nu gjort mulig å syntetisere prodrugs som in vivo, efter tilsvarende endogen, enzymatisk aktivering, er ennu vesentlig mer virksomt enn de i EP 0511917 Al og EP 0595133 A2 beskrevne prodrugs. Denne overlegne virkning skyldes på den ene side den nye og fordelaktige kjemi for spaceren, på den annen side imidlertid også den høye molare cytotoksisitet for de anvendte medikamentkomponenter. Den nye, fordelaktige kjemi hos spaceren utmerker seg, særlig ved aktive bestanddeler som er bundet til spaceren via en hydroksylgruppe, ved at det skjer en frisetting av den aktive bestanddel efter enzymatisk spalting av glykosylresten ved ringslutning og avspaltning av spaceren. Herved oppnås det en forbedret stabilitet for den angjeldende prodrug ved en samtidig god enzymatisk spaltbarhet. Oppfinnelsens prodrugs er videre mere stabile under fysiologiske betingelser enn kjente prodrugs, fordi de ikke setter den aktive bestanddel så hurtig fri.

Foreliggende oppfinnelse angår prodrugs med formel I

og/eller fysiologisk godtagbare salter av forbindelsene med formel I, hvorved glykosyl står for et enzymatisk, avspaltbart poly-, oligo- eller monosakkarid,

W står for 1)5- til 14-leddet aromatisk rest,

2) naftyl,

3) indenyl,

4) antryl,

5) fenantryl,

6) en 5- til 14-leddet heterocyklisk rest med 1,2,3 eller 4 heteroatomer fra gruppen oksygen, nitrogen eller svovel,

7) Ci-6-alkyl,

8) <C>2-6-alkenyl,

9) C3_6-cykloalkyl eller

10) fenyl,

R står for 1) hydrogenatom,

2) Ci^-alkyl,

3) fenyl,

4) metoksy,

5) karboksy,

6) metyloksykarbonyl,

7) -CN,

8) -OH,

9) -N02, 10) halogen som fluor, klor eller brom,

11) sulfonyl,

12) sulfonamid eller

13) sulfon-Ci—C4-alkylamid,

p står for 0 eller 1,

n står for 0,1,2 eller 3,

X står for 1) oksygenatom,

2) -NH-,

3) metylenoksy,

4) metylenamino,

5) metylen-Ci^-alkylamino,

6) C\—C4-alkylamino eller

7) C3—C6-cykloalkylamino,

Y står for oksygenatom eller -NH-,

Z står for 1) Ci^-alkylamino,

2) -N(CH3)-,

3) -C(CH3)2-NH-,

4) -CH(CH3)-NH-,

5) -C(CH3)2-N(R<2>)-, der R<2> betyr Ci^-alkyl, eller

6) -NH-, når W betyr C i-g-alkyl, og

virkestoff (aktiv bestanddel) står for en forbindelse med biologisk virkning og som er bundet via en oksygenrest, en primær eller sekundær aminorest eller en iminorest.

Når n betyr et helt tall 2 eller 3, har restene R uavhengig av hverandre de under RI) til RI 3) nevnte betydninger. Med alkyl eller alkenyl menes rester hvis karbonatomer er rette, forgrenede eller cykliske; dobbeltbindinger kan forekomme flere ganger. Cykliske alkylrester er for eksempel 3- til 6—leddede monocykler som cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl eller cykloheksyl. Til begrepet "5- til 14-leddet", heterocyklisk rest med 1, 2,3 eller 4 heteroatomer fra gruppen oksygen, nitrogen eller svovel", hører for eksempel rester som avledes fra pyrrol, azepin, pyrrolin, pyridin, imidazol, pyrimidin, triazin, furan, 1,2-diazepin, oksazol, pyrazin, isoksazol, isoksazolin, tiazol, isotiazol, isotiazolin, indol, kinolin, isokinolin, benzimidazol, indazol, purin, pteridin, tiopyran eller tiofen.

Egnede fysiologisk godtagbare salter av forbindelsene med formel I er for eksempel alkalimetall-, jordalkalimetall-eller ammoniumsalter inkludert slike av organiske ammoniumbaser.

Med "monosakkarid" menes rester som D-glukuronyl, L-iduronyl, D—glukopyranosyl-, D-galaktopyranosyl, N-acetyl-D-glukosaminyl-, N-acetyl-D-galaktosaminyl-, D-mannopyranosyl- eller L—fukopyranosyl. Oligo- eller polysakkarider består av 2 til 20 av de ovenfor nevnte monosakkarider som er forbundet med hverandre på a- eller fi-O-glykosidisk måte. Bindingen mellom monosakkaridet og resten Y er a- eller B-glykosidisk. Egnede enzymer som bevirker spalting av glykosylresten fra resten Y er induronidase, glukosidase, galaktosidase, N-acetyl-D-glukosaminidase, N-acetyl-D-galaktosaminidase, mannosidase, fukosidase eller glukuronidase, fortrinnsvis fi-glukuronidase.

Som aktiv bestanddel egner seg forbindelser som antracyklin, fortrinnsvis doksorubicin, 4- epi-doksorubicin, 4- eller 4-deoksy-doksorubicin eller en forbindelse fortrinnsvis valgt fra gruppen etoposider, N-bis(2-kloretyl)-4-hydroksyanilin, 4-hydroksycyklo-fosfamid, vindesin, vinblastin, vinkristin, terfenadin, terbutalin, fenoterol, salbutamol, muskarin, oksyfenbutazon, salicylsyre, p-aminosalicylsyre, 5-fluoruracil, 5-fluorcytidin, 5- fluoruridin, metotreksat, diklofenac, flufenaminsyre, 4-metylaminofenazon, teofyllin, nifedipin, mitomycin C, mitoxantron, camptothecin, m-AMSA, taksol, nokodazol, kolchicin, cyklofosfamid, rachelmycin, cisplatin, melfalan, bleomycin, nitrogen-sennepsgass, fosforarnidsennepsgass, quercetin, genistein, erbstatin, tyrfostin, rohitukin-derivat ((-)-cis-5,6-dihydroksy-2-(2-klorfenyl)-8-[4-(3-hydroksy-1 -metyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on; EP 0 366 061), retinolsyre, smørsyre, forbolester, aklacinomycin, progesteron, buserelin, tamoksifen, mifepriston, onapriston, N-(4-aminobutyl)-5 -klor-2-naftalen-sulfonamid, pyridinyloksazol-2-on, kinolyloksazolon-2-on, isokinolyloksazolon-2-on, staurosporin, verapamil, forskolin, 1,9-dideoksyforskolin, kinin, kinidin, reserpin, 18-0-(3,5-dimetoksy-4-hydroksybenzoyl)-reserpat, lonidamin, butioninsulfoksimin, dietylditiokarbamat, cyklosporin A, azatioprin, klorambucil, N-(4-trifluormetyl)-fenyl-2-cyano-3-hydroksykrotonsyreamid (WO 91 17748), 15-deoksyspergualin, FK 506, ibuprofen, indometacin, aspirin, sulfasalazin, penicillinamin, klorokvin, deksametason, prednisolon, lidokain, propafenon, prokain, mefemaminsyre, paracetamol, 4-aminofenazon, muskosin, orciprenalin, isoprenalin, amilorid, p—nitrofenylguanidinbenzoat eller derivater derav som er substituert med en eller flere hydroksy-, amino- eller iminogrupper.

Foretrukket er prodrugs, der den aktive bestanddel er et cytostatikum, en antimetabolitt, at den aktive bestanddel er 5-fluoruracil, 5-fluorcytidin, 5-fluoruridin, cytosinarabinosid eller metotreksat, at den aktive bestanddel er en i DNA interkalerende substans, at den aktive bestanddel er doksorubicin, daunomycin, idarubicin, epirubicin eller mitoxantron, at den aktive bestanddel hemmer topoisomerase I og II, at den aktive bestanddel er camptothecin, etoposid eller m-AMSA, at den aktive bestanddel er en tubulinhemmer, at den aktive bestanddel er vinkristin, vinblastin, vindesin, taksol, nokodazol eller kolchicin, at den aktive bestanddel er en alkylanz, at den aktive bestanddel er cyklofosfamid, mitomycin C, rachelmycin, cisplatin, fosforarnidsennepsgass, quercetin, melfalan, bleomycin, nitrogen-sennepsgass eller N-bis-(2-kloretyl)-4-hydroksyanilin, at den aktive bestanddel er neokarzinostatin, kalicheamicin, dynamicin eller esperarmicin A, at den aktive bestanddel er en ribosom-inaktiverende forbindelse, at den aktive bestanddel er verrucarin A, at den aktive bestanddel er en tyrosinfosfokinaseinhibitor, at den aktive bestanddel er quercetin, genistein, erbstatin, tyrfostin eller et rohitukin-derivat, at den aktive bestanddel er en differensieirngsinduktor, at den aktive bestanddel er retinolsyre, smørsyre, forbolester eller aklacinomycin, at den aktive bestanddel er et hormon, hormonagonist eller hormonantagonist, at den aktive bestanddel er progesteron, buserelin, tamoksifen, mifepriston eller onapriston, at den aktive bestanddel er et stoff som forandrer den pleiotrope resistens overfor cytostatika, at den aktive bestanddel er en kalmodulin-inhibitor, at den aktive bestanddel er en proteinkinase-C-inhibitor, at den aktive bestanddel er en P-glykoprotein-inhibitor, at den aktive bestanddel er en modulator for mitokondrialt, bundet heksokinase at den aktive bestanddel er en inhibitor for y-glutamylcystein-syntetase eller glutation-S-transferase, at den aktive bestanddel er en inhibitor for peroksyddismutase, at den aktive bestanddel er en inhibitor for det ved MAk Ki67-definerte proliferasjonsassosierte protein i cellekjernen i en celle som deler seg, at den aktive bestanddel er en substans som utøver en immunosuppressiv virkning, at den aktive bestanddel er et standard immunsuppressiv, at den aktive bestanddel er et makrolid, at den aktive bestanddel er cyklosporin A, rapamycin, FK 506, at den aktive bestanddel er azetioprin, metotreksat, cyklofosfamid eller klorambucil, at den aktive bestanddel er et stoff som har anti-inflammatorisk virkning, at den aktive bestanddel er et ikke-stereoid, anti-inflammatorisk stoff, at den aktive bestanddel er en "slow acting antirheumatic drug", at den aktive bestanddel er et steroid, at den aktive bestanddel er et stoff som har antiflogistisk, analgetisk eller antipyretisk virkning, at den aktive bestanddel er et derivat av en organisk syre, at den aktive bestanddel er et ikke-surt analgetikum/antiflogistikum, at den aktive bestanddel er oksyfenbutazon, at den aktive bestanddel er et lokalanestetikum, at den aktive bestanddel er et antiarytmikum, at den aktive bestanddel er en Ca^-antagonist, at den aktive bestanddel er et anti-histaminikum, at den aktive bestanddel er et sympatomimetikum, at den aktive bestanddel er et stoff med inhibitorisk virkning på den humane urokinase, og derivater av de ovenfor nevnte aktive bestanddeler hvorved den aktive bestanddel er bundet via en oksygenrest, -NH-rest eller iminorest til resten Y til forbindelsen med formel I.

Den aktive bestanddel er fortrinnsvis den i eksemplene nevnte nitrogenforbindelse, kinin eller dipyridamol.

Foretrukket er prodrugs der,

glykolsyl betyr en enzymatisk, avspaltbar glukuronsyre,

W betyr fenyl,

R betyr hydrogenatom, CN, nitro, fluor, klor, brom,

P erO,

n er et helt tall 0,1 eller 2,

Y betyr et oksygenatom,

Z betyr -N(CH3)-, -C(CH3)2-NH-, -CH(CH3)-NH-,

-C(CH3)2-N(Ci^)-alkyl-, -CH(CH3)-N(Ci^)alkyl- og

aktivt stoff av en via en hydroksy-, amino- eller iminogruppe tilknyttet forbindelse med biologisk virkning.

Særlig foretrukket er forbindelsene: 2-[>I-metyl-N-[(4-(N,Nl-bis-(2-klore fi-D-glukuronsyre, 2-[N-metyl-N-[(4-(N,N'-bis-(2-jodetyl)anim^ B-D-glukuronsyre,

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formel I og som er kjennetegnet ved at en forbindelse med formel II, der restene glykosyl, Y, X, p, W, R, n og Z har den samme betydning som i formel I omsettes med en aktiv bestanddel som oppviser en aktivert karboksyl-, amino- eller iminorest, hvorved omsetningen skjer i nærvær av et oppløsningsmiddel fra gruppen acetonitril, dioksan, tetrahydrofuran, diklormetan, dimetylformamid, aceton, og at beskyttelsesgruppen deretter spaltes av hydrolytisk.

Aktiveringen av den aktive bestanddel skjer for eksempel i henhold til H.J. Marley i "Chem. Soc. Chem. Communication" (1987), sidene 112-113 og til H. Hagemann i "Angew. Chem.", 93 (1981), sidene 813-814. Avspaltningen av beskyttelsesgruppene skjer for eksempel med alkalimetall-lut, alkalimetallkarbonat, alkalimetallcyanid, bariumoksyd, piperidin eller morfolin i nærvær av metanol, etanol eller vann.

Oppfinnelsen angår også et legemiddel som kjennetegnes ved et virksomt innhold av minst en forbindelse med formel og/eller et fysiologisk godtagbart salt av en forbindelse med formel I, hvorved restene glykosyl, Y, X, p, W, R, n, Z og aktivt stoff er som angitt ovenfor, sammen med en farmasøytisk egnet og fysiologisk godtagbar bærer, tilsetningsstoff og/eller andre aktive bestanddeler eller hjelpestoffer.

På grunn av de farmakologiske egenskaper egner oppfinnelsens forbindelser seg fremragende for profylakse og terapi av alle slike sykdommer og forstyrrelser i hvis forløp intracellulære enzymer som kan spalte glykosylresten, overeksprimeres og/eller settes fri eller gjøres tilgjengelig ved celleødeleggelse. Dette gjelder fremfor alt sykdommer som kreft, autoimmunsykdommer eller betennelses-, immunologisk eller stoffskiftebetingede, akutte eller kroniske artritider og atropatier, særlig tumorsykdommer og reumatisk artritt.

Oppfinnelsen angår videre anvendelsen av forbindelsene med formel I for fremstilling av legemidler for profylakse og terapi av kreftsykdommer, autoimmunsykdommer og kroniske betennelsessykdommer som reumatisk artritt.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for fremstilling av et legemiddel som er kjennetegnet ved at man bringer minst en forbindelse med formel I sammen med en egnet og fysiologisk godtagbar bærer og eventuelt ytterligere aktive bestanddeler, tilsetnings- og hjelpestoffer på til en egnet administreringsform.

Egnede administreirngsformer er for eksempel injiserbare oppløsninger for hvis fremstilling det anvendes vanlige hjelpemidler som bærere, binde-, svelle- eller smøremidler eller oppløsningsformidlere. Som hyppig anvendte hjelpestoffer skal nevnes magnesiumkarbonat, titandioksyd, laktose, mannit og andre sukkere, talkum, melkeprotein, gelatin, stivelse, cellulose og derivater derav, animalske og vegetabilske oljer som levertran, solsikke-, jordnøtt- eller sesamolje, polyetylenglykol og oppløsningsmidler som sterilt vann og en- eller flerverdige alkoholer som glycerol. Det kan også anvendes liposomer eller humane proteiner som bærere.

Fortrinnsvis fremstilles og administreres de farmasøytiske preparater i doseringsenheter hvorved hver enhet som aktiv bestanddel inneholder en bestemt dose av oppfinnelsens forbindelser med formel I. Ved injeksjonsoppløsninger kan denne dose for voksne på ca. 70 kg utgjøre opptil for eksempel 10 g, fortrinnsvis dog mellom 3 og 5 g. Eventuelt kan det dog være nødvendig med høyere eller lavere dagsdoser. Administreringen av dagsdosene kan skje både ved en engangsadministrering i form av en enkelt doseringsenhet eller som flere mindre doseringsenheter, men også ved små deler oppdelte doser i bestemte intervaller.

Oppfinnelsens prodrugs kan anvendes også ved alle ikke-onkologiske sykdommer der makrofager, granulocytter og trombocytter, særlig i aktivert tilstand, forekommer. I aktivert tilstand skiller de ovenfor nevnte celler ut særlig intracellulære enzymer som muliggjør en stedsspesifikk aktivering av oppfinnelsens prodrugs.

Ved den onkologiske indikasjon skjer aktiveringen av oppfinnelsens prodrugs ved intracellulære enzymer som er satt fri fra døende tumorceller. Dette fenomen skjer fremfor alt ved større tumorer (diameter mer enn 0,3 cm), men også efter skade på tumoren ved behandling med immunotoksiner, cytostatika, bestråling, fusjonsproteiner eller antistoffenzymkonjugater.

Da glykoseandelen av oppfinnelsens prodrugs velges på en slik måte at den kun kan spaltes av, av lokalt frisatte enzymer under patofysiologiske betingelser, kan det lipofile medikament likeledes kun settes fri ved målvevet og der utfolde sin cytotoksiske virkning.

Man kan øke den overlegne virkning til en prodrug ifølge oppfinnelsen med cytotoksiske medikamentkomponenter ved at man kombinerer oppfinnelsens prodrug med en annen cytotoksiske medikamentkomponent. Herved er prodrugkombinasjoner av fordel, der det anvendes cytotoksiske komponenter med varierende aktivitets-mekanisme tilsvarende poly-kjemoterapien. Særlig egnet synes anvendelsen av aktive bestanddeler som fremkaller meget effektive enkeltstreng- og dobbeltstrengbrudd i DNA, for eksempel kalicheamicin. Av spesiell fordel er imidlertid oppfinnelsens prodrugkombinasjon der det ene medikamentet har et cytotoksisk potensial og det andre blokkerer multi-medikament-resistensen.

Videre angår oppfinnelsen et farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at det inneholder en forbindelse med formel I og et antistoff-enzymkonjugat som enzymatisk kan spalte glykosylresten i formel I. Med antistoff-enzym-konjugater menes forbindelser som spesifikt binder til tumorvev eller betent vev via antistoffdelen og har en enzymdel som kan spalte glykosylresten til forbindelsen med formel I. Eksempler på slike forbindelser er beskrevet i EP 0 501 215, EP 0 390 530 eller EP 0 623 352.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere ved hjelp av de følgende eksempler.

Eksempel 1: Nitrogenlostderivat-prodrug (F373; forbindelse 11)

ble syntetisert på følgende måte:

Utgangsmaterialet for syntesen var 2-amino-4-nitrofenol (forbindelse 1). Forbindelse 1 ble først monometylert ved hjelp av metyljodid (forbindelse 2) og aminofunksjonen ble beskyttet som BOC-derivat (forbindelse 3). Den beskyttede glukuronsyre ble innført ved hjelp av sølvoksydkobling av forbindelse 3 og bromidet (forbindelse 4) under oppnåelse av forbindelse 5. Efter avspalting av BOC-beskyttelsesgruppen med HC1 ble aminet (forbindelse 6) oppnådd. Forbindelse 7 ble omsatt til klorformat (forbindelse 8) og kondensert med forbindelse 6 til forbindelse 9. Efter avspalting av esteren av glukuronsyredelen av forbindelse 3 i to trinn (MeONa/MeOH, så vandig NaOH) oppnådde man prodrug (forbindelse 11) over forbindelse 10.

Forbindelse 2:

2-(N-metylamino)-4-nitrofenol (2)

Til en oppløsning av 2-amino-4-nitrofenol (1) (1,54 g, 10 mmol) og metyljodid (1 ml, 16 mmol) i 10 ml metanol ble det satt trietylamin (2 ml, 14,4 mmol). Efter 1 time ved 40°C ble det tilsatt ytterligere 1 ml metyljodid og 1 ml trietylamin og det hele ble omrørt i ytterligere 2 timer ved 40°c. Reaksjonsblandingen ble dampet inn under vakuum til tørr tilstand, bragt i 2N vandig natriumacetatoppløsning og ekstrahert med eddikester. Den organiske fase ble tørket med natriumsulfat og kromatografert på silikagel med diklormetammetanol 95:5 som elueringsmiddel. Utbytte: 880 mg (52%).

C7H8N203:

Smeltepunkt: 148°C (toluen)

<!>h NMR (250 MHz, DMSO) 8 7,44 (dd, <J>orto<=>9 Hz, Jmeta<=>3>0 Hz»1H)» 7»13 (d> J=3

Hz, 1H), 6,77 (d, J=9 Hz, 1H), 2,76 (s, 3H).

IR (KBr): v(cm-<!>): 3363 (OH), 1538,1338 (N02).

MS (DCI, NH3): m/z [M+H]<+>: 169

Forbindelse 3:

2-(N-BOC,N-merylamino)-4-nitrofenol (3)

Til en oppløsning av 2-N-metylamino-4-nitrofenol (2) (4,18 g, 24,9 mmol) i 50 ml tetrahydrofuran ble det satt di-tert-butyldikarbonat (14 g, 64,15 mmol), kaliumkarbonat (17 g, 123 mmol) og 50 ml vann og det hele ble omrørt over natten ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble surgjort med en mettet, vandig ammoniumkloridoppløsning, ekstrahert med eddikester, tørket med natriumsulfat og dampet inn under vakuum. Råproduktet ble omrørt i 2 timer i 100 ml metanol med kaliumkarbonat (17 g, 123 mmol), surgjort med en mettet, vandig ammoniumkloridoppløsning, ekstrahert med eddikester, tørket over natriumsulfat og dampet inn under vakuum. Produktet ble kromatografert på silikagel med diklormetan:metanol 97,5:2,5 som elueringsmiddel. Utbytte: 6,2 (93%)

Smeltepunkt: 197°C (toluen/petroleter)

<*>H NMR (250 MHz, DMSO) 8 8,10-8,00 (2H), 7,03 (d, J=8,5 Hz, 1H), 3,04 (s, 3H), 1,40-1,30 (9H). ;IR (KBr): vfcm"<1>): 3129 (OH), 1672 (CO), 1529,1339 (N02). ;MS (DCI, NH3): m/z [M+H]<+>: 269, ;[M+H-C4H8]<+>: 213, ;[M+H-C4H8OCO]<+>: 169. ;Forbindelse 5: ;2-(N-BOC,N-mer>lamino)-4-nitrofenyl-2,3,4-tri-0-acetyl-B-glukuronsyre.metylester (5) ;Til en oppløsning av 2,3,4,-tri-O-acetyl-a-D-glukuronsyre.metylesterbromid (4) (126 mg, 0,317 mmol) i 5 ml acetonitril ble det satt sølvoksyd (0,23 g, 0,992 mmol) og 2—(N-BOC,N-metylamino)-4-nitrofenol (3). Reaksjonsblandingen ble omrørt 1 time ved romtemperatur, filtrert over Celite og dampet inn under vakuum. Produktet ble kromatografert på silikagel med diklormetan:metanol 97,5:2,5 som elueringsmiddel. Utbytte: 165 mg (89%). ;<C>25<H>32<N>20l4<:>;Smeltepunkt: 80°C (toluen/petroleter) ;[<x]2D° = "39° (c=l,02 i CHC13) ;<!>h NMR (250 MHz, CDCI3): 8 8,11 (dd, Jorto^ <Hz>> <J>meta<=>2»5 Hz>1H)> 8,15-8,05 ;(1H), 7,30-7,20 (1H), 5,45-5,30 (4H), 4,25 (d, J=9 Hz, 1H), 3,73 (s, 3H), 3,13 (s, 3H), 2,15-2,05 (9H), 1,65-1,40 (9H). ;IR (CDCI3): v(cm-<l>): 1760 (CO, ester), 1699 (CO, karbamat), 1529,1349 (N02). ;MS (DCI, NH3): m/z [M+NH4]+: 602 ;Forbindelse 6: 2-(N-metylamino)-4-nitrofenyl-2,3,4-tri-0-acetyl-B-D-glukuronsyre.metylester (6) En oppløsning av 2-(N-BOC,N-metylamino)-4-nitrofenyl-2,3,4-tir-0-acetyl-B-D-glukuronsyre.metylester (5) (3 g, 5,13 mmol) i 60 ml 2,12M saltsyre i eddikester ble omrørt 1 time ved romtemperatur. Oppløsningen ble helt i overskytende, vandig, mettet natriumbikarbonatoppløsning og ekstrahert med eddikester. Den organiske fase ble tørket med natriumsulfat og dampet inn. Produktet ble kromatografert på silikagel med diklormetan:metanol 97,5:2,5 som elueringsmiddel. ;Utbytte: 2,14 g (86%) i form av et gult faststoff. ;<C>20<H>24<N>2°12<:>;Smeltepunkt: 120°C (toluen) ;[cc]<2>d° = -58° (c=l,04 i CHC13). ;<!>h NMR (250 MHz, CDCI3): 5 7,53 (dd, <J>orto=8.5 Hz» Jmeta=2>5 Hz>1H). 7>37 (d>;J=2,5 Hz, 1H), 6,91 (d, J=8,5 Hz, 1H), 5,45-5,30 (1H), 5,16 (d, J=7Hz, b, 1H), 4,50 (d, J=5 Hz, 1H), 4,24 (d, J=9 Hz, 1H), 3,75 (s, 3H), 2,90 (d, J=5 Hz, 1H), 2,10-2,05 (9H). ;IR (CDCI3): v(cm-<l>): 3443 (NH), 1758 (CO), 1553,1346 (N02). ;MS (DCI, NH3): m/z [M+H]<+>: 485. ;Forbindelse 8: ;4-[N,N-bis-(2-kloretyl)amino]fenylklorformat (8) ;Fosgen i toluen (1,93M) (8 ml, 15,4 mmol) ble satt til en suspensjon av 4-[N,N-bis(2-kloretyl)amino]fenol.hydroklorid (7) (1,85 mmol) i 30 ml tetrahydrofuran og omrørt i 30 minutter ved 0°C. Efter tilsetning av trietylamin (1 ml, 7,17 mmol) ble det omrørt en ytterligere time. Derefter ble suspensjonen filtrert og dampet inn under vakuum ved romtemperatur. Flashkromatografi over silikagel med diklormetan som elueringsmiddel ga produktet som farveløs væske som umiddelbart ble benyttet i den derpå følgende reaksjon. Utbyttet var 70%. ;<!>h NMR (250 MHz, CDCI3): 8 7,10 (d, J=9 Hz, 2H), 6,66 (d, J=9 Hz, 2H), 3,73 (t, ;J=6,5 Hz, 4H), 3,63 (t, J=6,5 Hz, 4H). ;IR (CDCI3): v(cm-<l>): 1779 (CO), 1514 (aromatisk). ;MS (DCI, NH3): m/z [M+H]<+>: 296 ;[M+2+H]<+>: 298. ;Forbindelse 9: 2-[N-metyl-N-[4-(N,N'-bis-(2-kloretyl)amino]fenyloksykarbonyl]amino]-4-nitrofenyl-2,3,4-tri-0-acetyl-B-D-glukuronsyre.metylester (9) ;Til en oppløsning av 4-[N,N-bis-(2-kloretyl)amino)fenylklorformat (8) (0,31 g, 1,04 mmol) i tetrahydrofuran (15 ml), diisopropyletylamin (0,25 ml, 1,44 mmol) ble det satt 2-(N-metylamino)-4-nitrofenyl-2,3,4-tri-O-acetyl-B-D-glukurons<y>re.met<y>lester (6) ;(0,50 g, 1,03 mmol) og det hele ble kokt i 2 timer under tilbakeløp. Efter avkjøling til romtemperatur ble det hele dampet inn. Produktet ble kromatografert på silikagel med diklormetan:metanol 97,5:2,5 som elueringsmiddel. Utbytte: 487 mg (64%). ;<C>31<H>35<N>3<O>14<CI>2<:>;Smeltepunkt: 101 °C (metanol) ;[a]<2>D° = "47° (o=l,10 i CHCI3). ;<l>HNMR(250MHz,CDCl3): 8 8,25-8,15 (2H), 7,45-7,35 (1H), 7,25-7,05 (1H), 6,95-6,85 (1H), 6,70-6,55 (2H), 5,45-5,25 (4H), 4,28 (d, J=9 Hz, 1H), 3,80-3,55 (11H), 3,38 (s, 2 diastereomere karbamater (40:60), 3H), 3,27(s), 2,20-2,00 (9H). ;IR (CDCI3): v(cm-<!>): 1760 (CO, ester), 1722 (CO, karbamat), 1530,1350 (NO2). ;MS (DCI, NH3): m/z [M+H]<+>: 744; [M+2+H]<+>: 746; ;[M+Na]<+>: 766; [M+2+Na]<+>: 768. ;Forbindelse 10: 2-[N-metyl-N-[(4-(N,N'-bis-(2-kIoretyl)amino)fenyloksykarbonyl]amino]-4-nitrofenyl-B-D-glukuronsyre.metylester (10) ;Til en suspensjon av 2-[N-metyl-N-[(4-(N,N'-bis-(2-kloretyl)amino)fenyloksy-karbonyl]aniino]-4-mtrofenyl-2,3,4-tri-0-acetyl-B-D-glu]aironsyre.metylester (9) (68 mg, 0,0915 mmol) i 5 ml metanol ble det ved 15°C satt natriummetylat (2 mg, 0,037 mmol) og deretter omrørt i 6 timer ved —15°C. Efter nøytralisering med ionebytter (Amberlite IRC-50S) og filtrering ble oppløsningen dampet inn og kromatografert på silikagel med eddikester som elueringsmiddel. ;Utbytte: 50 mg (89%). ;<C>25<H>29<N>3<O>11<CI>2<: ><i>H NMR (300 MHz, CDCI3): 5 8,22 (sl, 1H), 8,16 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,25 (d, 1H), ;7,15-6,90 (2H), 6,80-6,45 (2H), 5,06 (1H), 4,09 (1H), 4,20-3,15 (17H). ;IR (CDCI3): v(cm-<!>): 3601, 3448 (OH), 1714 (CO), 1528, 1349 (NO2). ;MS (ES): m/z [M+Na]<+>: 640; [M+2+Na]<+>: 642. ;Forbindelse 11: 2-[N-metyl-N-[(4-(N,N'-bis-(2-kloretyl)amino)fenyloksykarbonyl]amino]-4-nitrofenyl-B-D-glukuronsyre (11) Til en oppløsning av forbindelse 10 (50 mg, 0,0809 mmol) i 4 ml aceton ble det ved —15°C satt 0,3 ml av IN vandig natriumhydroksydoppløsning. Blandingen ble omrørt i 2 timer ved —15°C, nøytralisert med IN vandig saltsyre og dampet inn under vakuum (T < 40°C). Produktet ble kromatografert på silikagel med acetonitril:vann 9:1 som elueringsmiddel. ;Utbyttet var 45 mg (89%). ;<C>24<H>27<N>3<O>11<CI>2<: ><!>H NMR (250 MHz, CD3OD): 8,30 (sl, 1H), 8,24 (dd, J0rto<=>9 Hz>Jmeta<=>2>5 Hz>;1H), 7,52 (d, J=9 Hz, 1H), 6,99 (d, J=9 Hz, 2H), 6,99 (d, J=9 Hz, 2H), 5,23 (1H), 3,89 (d, J=9 Hz, 1H), 3,80-3,33 (1H). ;IR (KR): v^rrr<1>): 3418 (OH), 1705 (CO), 1516,1349 (N02). ;MS (ES): m/z [M+H]<+>: 603 ;[M+2+H]<+>: 605. ;Eksempel 2: 2-[N-metyl-N-[(4-(N^'-bis-(2-jodetyl)amino)fenyloksy-karbonyl]amino]-4-nitrofenyl-B-D-glukuronsyre (12) ;Forbindelse 12: ;;Syntesen skjedde analogt eksempel 1. ;Eksempel 3 ;Forbindelse 13: Kimn-prodrug (F 391) ;;Syntesen skjedde analogt eksempel 1. ;Eksempel 4 (forbindelse 14): Dipyridamol-prodrug (F 392) ;;Syntesen skjedde analogt eksempel 1. ;Eksempel 5: Enzymatisk spalting av F 373 ;Prodrug F 373 (forbindelse 11) ble ved inkubering med fl—glukuronidase spaltet enzymatisk til et aromatisk nitrogenlostderivat (4-[N,N-bis(2-kloretyl)amino]fenol) ;(forbindelse 7), glukuronsyre og spaceren. ;F 373 —* glukuronsyre +

Prodrug F 373 er i stabil i oppløsning i vandig DMSO. For åundersøke spaltbarheten ble 10 ul F 373-oppløsning (5 mg/ml i DMSO) tilsatt 180 ul 0.02M fosfatbuffer, pH 7,2, og

10 ul E.coli-fl-glukuronidase (Sigma) (330 Mg/ml) og det hele ble inkubert ved 37°C. En sats på 25 ul ble fortynnet med 225 ul 0,1M fosfatbuffer, pH 3,0 (85%) og acetonitril

(15%) og analysert umiddelbart ved hjelp av det følgende HPLC-system.

HPLC-system:

Det anvendte HPLC-systemet bestod av en gradientpumpe (Gynkotek, modell 480), en autosamler (Abimed, modell 231/401), en UV-detektor (Beckman, modell 166, deteksjonsbølgelengde 212 nm) og en beregningsenhet (Beckman, system Gold). Separeringen skjedde på en RP-søyle (Zorbax SB-C 18,5 nm, 125 x 4,6 mm). Den mobile fase ble dannet fra to komponenter efter følgende skjema:

A: acetonitril

B: 0,02M fosfatbuffer, pH 3,0

Man fant følgende peak-flater:

Eksempel 6: Cytotoksisitet for F 373,391,392 på tumorceller i nær- og fravær av

B-glukuronidase

I en 96-brønners mikrotiterplate ble det sådd ut 2 x IO<3> LoVo-celler pr. brønn i 100 ul MEM +10% FKS. Efter 24 timer ble testsubstansene tilsatt i 100 ul medium i de ønskede konsentrasjoner og eventuelt i tillegg B-glukuronidase (50 ug/ml sluttkonsentrasjon; Sigma G 7896). Hver gruppe bestod av 4 brønner, kontrollen ble inkubert kun med medium. Efter 65 timer ble det tilsatt 50 ul MTT (2,5 mg/ml i PBS) og efter 3 timer ble supernatanten fjernet. Det av de levende celler dannede faststoff ble oppløst ved tilsetning av 100 ul DMSO pr. brønn. Ekstinksjonen ble målt for hver brønn ved hjelp av et Multiscan-fotometer 340 CC (firma Flow) ved 492 nm. Verdiene for de 4 brønner pr. gruppe ble fastslått og derfrå beregnet man dosis-virkningskurven samt IC50 ved hjelp av Software grafitt 3,0.

Den toksiske forbindelse i prodrug F 373 er forbindelse 7 (eksempel 1, side 13) og har alene gitt en IC50 på 5 umol. Den toksiske forbindelse i prodrug F 391 er kinin og ga alene en IC50 på 103 umol. Den toksiske forbindelse i prodrug F 393 er dipyridamol og ga alene en IC5 Q-verdi på 43 umol.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved formel (I) Glykosyl-Y[-C(=Y)-X-]p-W(R)n-Z-C(=Y)-virkestoff(I) og/eller fysiologisk godtagbare salter av forbindelsen med formel I, der glykosyl står for et enzymatisk, avspaltbart poly-, oligo-eller monosakkarid, W står for 1) 5- til 14-leddet aromatisk rest, 2) naftyl, 3) indenyl, 4) antryl, 5) fenantryl, 6) en 5- til 14-leddet heterocyklisk rest med 1,2,3 eller 4 heteroatomer fra gruppen oksygen, nitrogen eller svovel, 7) Ci-6-alkyl, 8) <C>2-6-alkenyl, 9) C3_6-cykloalkyl eller 10) fenyl, R står for 1) hydrogenatom, 2) Ci^-alkyl, 3) fenyl, 4) metoksy, 5) karboksy, 6) metyloksykarbonyl, 7) -CN, 8) -OH, 9) -N02, 10) halogen som fluor, klor eller brom, 11) sulfonyl, 12) sulfonamid eller 13) sulfon-Cj—C4-alkylamid, p står for 0 eller 1, n står for 0,1,2 eller 3, X står for 1) oksygenatom, 2) -NH-, 3) metylenoksy, 4) metylenamino, 5) metylen-Ci—4-alkylamino, 6) Ci~C4-alkylamino eller 7) C3—C6-cykloalkylamino, Y står for oksygenatom eller -NH-, Z står for 1) Ci^-alkylamino, 2) -N(CH3)-, 3) -C(CH3)2-NH-, 4) -CH(CH3)-NH-, 5) -C(CH3)2-N(R<2>)-, der R<2> betyr C^-alkyl, eller 6) -NH-, når W betyr C ^-alkyl, og virkestoff (aktiv bestanddel) står for en forbindelse med biologisk virkning og som er bundet via en oksygenrest, en primær eller sekundær aminorest eller en iminorest.

2. Forbindelse med formel (I) ifølge krav 1, karakterisert v e d at W betyr fenyl, R betyr hydrogenatom, CN, nitro, fluor, klor, brom, P erO, n er et helt tall 0,1 eller 2, Y betyr et oksygenatom, Z betyr -N(CH3)-, -C(CH3)2-NH-, -CH(CH3)-NH-, -C(CH3)2-N(C i^)-alkyl-, -CH(CH3)-N(C !_4)alkyl-.

3. Forbindelse med formel (I) ifølge krav 1 eller 2, karakterisert v e d at forbindelsen med formel (I) er 2-(^-metyl-N-[(4-(N,N'-bis-(2-kloretyl)amino)fenyloksykarbonyl]amino]-4-nitrofenyl-B-D-glukuronsyre eller 2-[N-metyl-N-[(4-(N,N,-bis-(2-jodetyl)amino)fenyloksykarbonyl]amino]-4-nitrofenyl-B-D-glukuronsyre,

4. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med form (I), karakterisert ved at en forbindelse med formel (II) Glykosyl-Y-[-C(=Y)-X-]p-W(R)n-Z(n) der restene glykosyl, Y, X, p, W, R, n og Z har den samme betydning som i formel (I), omsettes med en aktiv bestanddel som har en aktivert karboksyl-, amino- eller iminorest, hvorved omsetningen skjer i nærvær av et opp løsningsmiddel fra gruppen acetonitril, dioksan, tetrahydrofuran, diklormetan, dimetylformamid, aceton, og at beskyttelsesgruppen derefter spaltes av hydrolytisk.

5. Legemiddel, karakterisert ved et virksomt innhold av minst en forbindelse med formel (I) i henhold til ett eller flere av kravene 1 til 3 og/eller et fysiologisk godtagbart salt av forbindelsen med formel (I), hvorved restene glykosyl, Y, X, p, W, R, n, Z og aktivt stoff har den samme betydning som i krav 1, sammen med en farmasøytisk egnet og fysiologisk godtagbar bærer, et tilsetningsstoff og/eller andre aktive bestanddeler eller hjelpestoffer.

6. Anvendelse av forbindelsen med formel (I) ifølge krav 1 for fremstilling av legemidler for profylakse og terapi av kreftsykdommer, autoimmunsykdommer og kroniske betennelsessykdommer som reumatisk artritt.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av et legemiddel, karakterisert v e d at man bringer minst en forbindelse med formel (I) ifølge krav 1 sammen med et farmasøytisk egnet og fysiologisk godtagbar bærer og eventuelt ytterligere egnede aktive bestanddeler, tilsetnings- eller hjelpestoffer, på en egnet administreirngsform.

8. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder en forbindelse med formel (I) ifølge ett eller flere av kravene 1 til 3 og et antistoff-enzym-konjugat som enzymatisk kan spalte glykosylresten i formel (I).