NO334155B1 - Anvendelse av konjugater, for transportering av molekyler via bisykliske membraner og for fremstilling av et medikament og/eller diagnostisk middel samt fremgangsmåte for transport in vitro - Google Patents

Anvendelse av konjugater, for transportering av molekyler via bisykliske membraner og for fremstilling av et medikament og/eller diagnostisk middel samt fremgangsmåte for transport in vitro Download PDF

Info

Publication number
NO334155B1
NO334155B1 NO20020367A NO20020367A NO334155B1 NO 334155 B1 NO334155 B1 NO 334155B1 NO 20020367 A NO20020367 A NO 20020367A NO 20020367 A NO20020367 A NO 20020367A NO 334155 B1 NO334155 B1 NO 334155B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
oligonucleotide
cell
oligonucleotides
molecule
fda
Prior art date
Application number
NO20020367A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20020367L (no
NO20020367D0 (no
Inventor
Eugen Uhlmann
Beate Greiner
Eberhard Unger
Gislinde Gothe
Marc Schwerdel
Original Assignee
Sanofi Aventis Deutschland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis Deutschland filed Critical Sanofi Aventis Deutschland
Publication of NO20020367D0 publication Critical patent/NO20020367D0/no
Publication of NO20020367L publication Critical patent/NO20020367L/no
Publication of NO334155B1 publication Critical patent/NO334155B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Description

Gjenstand for den foreliggende oppfinnelse er anvendelse av konjugater for transport av lavmolekylære forbindelser og makromolekyler gjennom biologiske membraner in vitro, og anvendelse av nevnte konjugater, for fremstilling av medikamenter for forebygging eller behandling av sykdommer, og/eller et diagnostisk middel .Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for nevnte transport in vitro.
En begrensende faktor for den terapeutiske benyttelse av molekyler hvis angrepspunkt befinner seg inne i cellen, er ofte deres utilstrekkelige cellulære opptak og ugunstige intracellulære fordeling. Typiske eksempler er makromolekyler som nukleinsyrer, som på sekvensspesifikk måte bindes til det cellulære DNA eller RNA og derved bevirker en inhibering av genekspresjonen. Antisensoligonukleotider er korte enkelttrådede nukleinsyrer som over Watson-Crik basepar bindes til et komplementært mRNA, hvis translasjon til det tilsvarende protein skal hemmes. Tripleksdannende oligonukleotider binder over såkalte "Hoogsteen-Basepar"-dannelse i den store spalte av DNA-dobbelt heliksen under dannelse av en trippelheliks, hvorved transkripsjonen av genet hemmes sekvensspesifikt. Andre intracellulært virkende oligonukleotider er f.eks. de såkalte "Decoy"-oligonukleotider som etterligner bindingsregionen for transkripsjonsfaktorer. Ved behandlingen med "Decoy"-oligonukleotider lar bestemte transkripsjonsfaktorer seg sekvensspesifikt infange, og derved hindrer en aktivering av transkripsjonen. En ytterligere gruppe av intracellulært virkende oligonukleotider, kimæreplastene, anvendes for målrettet genkorrektur (Cole-Strauss et al, Science 273 (1996) 1386-1389). Også for denne genkorrektur er opptaket av kimærplastoligonukleotidet i cellen essensielt. Eksempler på ytterligere intracelluært virkende nukleinsyrer er slike som vekselvirker med cellulære enzymer, spesielt med telomeraser (Norton et al., Nat. Biotechn. (1996), 14, 615). En ytterligere klasse av nukleinsyrer, foretrukket dobbelttrådet DNA, kan kode for bestemte proteiner som ved genterapi uttrykkes intracellulært.
For eksempel er opptaket av et oligonukleotid in vitro i en celle, for eksempel ved enkel tilsetting av oligonukleotidet i cellekulturmedium en forholdsvis ineffektiv prosess, da bare en mindre del av det tilsatte oligonukleotid faktisk opptas i cellen. Opptaksprosessen varer mange timer og fremviser først etter 8-16 timer en platåfase. Man antar at oligonukleotidene opptas i en endocytoseaktig prosess. Et generelt problem ved opptaket over endocytose består imidlertid deri at en større del av oligonukleotidene ikke foreligger fritt i cytoplasma, men foreligger innesluttet i bestemte cellestrukturer, i lysosomene og endosomene. Denne punktformede fordeling kan også i tilfellet med fluorescensmarkerte oligonukleotider faktisk iaktas fluorescensmikroskopisk. Ved denne vesikulære lokalisering er konsentrasjonen av fritt oligonukleotid, som faktisk står til disposisjon for hybridiseringen til mRNA sterkt nedsatt. Videre opptar alt etter celletype og foreliggende betingelser bare en bestemt fraksjon av cellene oligonukleotidet. På grunn av dette blir for effektiv anvendelse av antisensoligonukleotider det generelt anvendte blandinger med penetrasjonsforsterkere som for eksempel kationiske lipider (Bennett et al, Mol. Pharmacol. 41(1992) 1023).
WO 95/06659 Al beskriver konjugater med et oligonukleotid og dipivaloylfluorescein for bedre gjennomtrengning til celler eller gjennom en membran, jfr. eksempel 14-16.
En oppgave for den foreliggende oppfinnelse består deri å forbedre det cellulære opptak av molekyler, spesielt makromolekyler som for eksempel oligonukleotider.
Undersøkelsen av det cellulære opptak av oligonukleotider skjer generelt enten ved hjelp av radioaktivt merkede eller fluorescensmerkede oligonukleotider. Fluorescensmerkingen av en oligonukleotid skjer for eksempel ved omsetning av aminofunksjonen av et oligonukleotid med fluoresceinisotiocyanat (FITC). For eksempel kan fluoresceinet innføres på 3'-enden av et oligonukleotid ved hjelp av en fluoresceinderivatisert fastfasebærer som kan fås i hendelen eller på 5'-enden ved hjelp av et fluoresceinfosfityleringsreagens som kan fås i handelen. I alle tilfeller foreligger det til oligonukleotidet bundne fluorescein på grunn av karboksylsyrefunksjonen som negativt ladet strukturelement som er stert fluorescerende.
I motsetning til fluorescein er fluoresceindiacetat (FDA) et nøytralt vitalfargestoff som først etter spalting av de estergruppene og åpning av laktonringen går over i det fluorescerende fluorescein, som imidlertid i form av laktonet ennå ikke viser noen fluorescens.
Det er kjent at FDA (i det følgende også betegnet som "F3") som nøytralt ikke-fluorescerende molekyl opptas av levende celler ved passiv diffusjon og intracellulært spaltes av esteraser i det fluorescerende fluorescein (Breeuwer et al., Appl. Environ. Microbiol. (1995) 61, 1614; Maeda et al, Cell Struct. Funct. (1982) 7, 177). Tidligere ble bare FDA-derivater som inneholder en aminreaktiv gruppe som for eksempel isotiocyanat beskrevet; disse FDA-derivater anvendes for farging av intracellulære proteiner eller cellekomponenter. Ut over dette er det hittil ikke beskrevet noen konjugater av FDA med andre molekyler; tilsvarende ble heller ikke tidligere FDA-markerte oligonukleotider (konjugater av FDA og oligonukleotid) beskrevet.
I cytoplasma spaltes FDA ved hjelp av esteraser; ved en FDA-markering av et oligonukleotid er det derfor mulig å bestemme andelen av "fritt" oligonukletid, dvs. så mye oligonukleotid som foreligger i cytoplasma - og som står til disposisjon for hybridiseringen - i forhold til den andel av oligonukleotidet som foreligger i vesiklene ("fanget" oligonukleotid) - og som derfor ikke står til disposisjon for hybridiseringen. Betinget ved et totalt høyt antall negative ladninger i et oligonukleotid og det faktum at FDA-markerte og fluoresceinmarkerte oligonukleotider (for det tilfellet at oligonukleotidet er det samme) bare skiller seg fra hverandre ved en nettoladning, var det å vente at FDA-markerte og fluoresceinmarkerte oligonukleotider ville fremvise et meget likt cellulært opptak og fordeling.
Overraskende ble det imidlertid funnet at FDA-markerte og fluoresceinmarkerte oligonukleotider tydelig er forskjellige med hensyn til deres opptak i celler og da både med hensyn til varigheten som også effektiviteten av opptaket av oligonukleotider, og utover dette også med hensyn til lokalisasjonen av de opptatte oligonukleotider i cellen. Et med FDA-markert oligonukleotid opptas meget hurtigere av cellene enn det tilsvarende fluoresceinmarkerte oligonukleotid. Mens opptaket av radiomarkerte og fluoresceinmarkerte oligonukleotider krever flere timer, kunne FDA-markerte oligonukleotider etter enkel inkubasjon, for eksempel med humane celler, påvises intracellulært allerede etter 5 minutter. Overraskende var det også at de FDA-markerte oligonukleotider ble opptatt i nesten alle celler (>90% av cellene), mens opptaksgraden ved de hittil beskrevne metoder for å innføre oligonukleotider, henholdsvis polynukleotider i celler i det vesentlige lavere resultat; ofte lades da bare omtrent 30 til 60% av cellene med oligonukleotider. Fordelaktig er også den intracellulære fordeling av de FDA-markerte oligonukleotider, som er mye mer ensartet. Denne mer ensartede fordeling tyder på at oligonukleotidene ikke - som ovenfor beskrevet - for den største del foreligger innesluttet i vesikler (f. eks. endosomer, lysosomer), men er fordelt i den totale celle - dvs. i cytosol og i kjernen; dette et indisium for at en stor andel foreligger som "fritt" oligonukleotid. Bare dette "frie" oligonukleotid står til disposisjon for bindingen til målet (målmolekyl, målnukleinsyre) eller som virkestoff. Fordelaktig er det også at med de FDA-markerte oligonukleotider ikke kunne iakttas noen skader på cellene; i motsetning til dette fører anvendelsen av lipokationiske penetrasjonsforsterkere ofte til skader på cellemembranen. Betinget ved disse uventede egenskaper har de FDA-markerte oligonukleotider i forhold til de tidligere beskrevne metoder med å innbringe oligonukleotider, henholdsvis polynukleotider i celler den avgjørende fordel at de mer effektivt kan innføres i cellene og der også være mer disponible. Av denne grunn fremviser de FDA-markerte oligonukleotider en tydelig forbedret biologisk virkning. På grunn av den forbedrede biologiske virkning må det anvendes mindre oligonukleotid. Derved og på grunn av den kjensgjerning at et FDA-markert oligonukleotid mer effektivt - både mengdemessig som også tidsmessig - opptas i cellen, reduseres (giftige) bivirkninger.
Overraskende ble det nå funnet at de fordelaktige egenskaper ikke er begrenset til FDA-markerte oligonukleotider, men at praktisk ethvert molekyl ved hjelp av en FDA-markering - dvs. derved at et molekyl som skal transporteres kobles, henholdsvis konjugeres, til FDA ("FDA-konjugat") - effektivt kan innføres i en celle, henholdsvis kan transporteres gjennom en biologisk membran. Videre ble det funnet at dette prinsipp ikke er begrenset til FDA-konjugater, men strekker seg til alle arylesterkonjugater som fremviser en bestemt kjemisk struktur. Den foreliggende oppfinnelse utgjør derved et nytt prinsipp for transport av molekyler gjennom biologiske membraner.
Tidligere er bioreversible O-acylaryl-konjugater kjent som foreslått som forløperlegemidler av oligonukleotider (lyer et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 7
(1997) 871-876). Disse forbindelser likner - for det tilfellet at arylresten er en aromatisk 6-ring - i sin kjemiske struktur, konjugatene. Ved de bioreversible O-acylaryl-konjugater, bevirker hydrolysen av esteren imidlertid en destabilisering av bindingen mellom arylresten og fosfotriesteren av oligonukleotidet, slik at det bioreversible O-acylaryl-konjugat splates i sine bestanddeler, dvs. i det frie oligonukleotid og O-acylaryl-resten. Dette forløperlegemiddelkonsept tjener til å maskere den negative ladning av internukleotidfosfatbroen, og derved å lette opptaket av oligonukleotidet i cellen. I motsetning til konjugatene ble det ved disse forløperlegemidler imidlertid ikke konstatert noe påskyndet opptak av oligonukleotidet i cellene, og heller ikke noen endret intracellulær fordeling av oligonukleotidene. Videre ble det ikke nevnt noe om et opptak av oligonukleotidene i andre organismer. I motsetning til dette forblir ved konjugatene den kovalente binding mellom arylresten og oligonukleotidet ved opptaket i cellen bibeholdt; bibeholdelsen av den kovalente binding mellom arylrest og oligonukleotid kan lett konstateres fluorescensmikroskopisk i den utstrekning den aromatiske enhet, som for eksempel ved FDA, først etter spalting av esteren fremviser en fluorescens.
Foreliggende oppfinnelse omfatter en anvendelse av et aryl radikal med formel Fl og F3 til Fil til hvilke et molekyl som skal transporteres, valgt fra gruppen bestående av et polynukleotid, et oligonukleotid og et mononukleotid er festet, for å transportere dette molekylet over en biologisk membran in vitro.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av et aryl radikal med formelen Fl og F3 til Fil til hvilke et molekyl som skal transporteres, valgt fra gruppen bestående av et polynukleotid, et oligonukleotid og et mononukleotid er festet, for fremstilling av et medikament for forebygging og/eller behandling av sykdommer assosiert med ekspresjon eller overekspresjon av visse gener og/eller et diagnostisk middel for diagnose eller tidlig identifikasjon av slike sykdommer.
Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også fremgangsmåte for å transportere et molekyl over en membran in vitro, kjennetegnet ved at et aryl radikal er beskrevet i et hvilket som helst av kravene 1-3, til hvilke et molekyl som skal transporteres, valgt fra gruppen bestående av et polynukleotid, et oligonukleotid eller et mononukleotid er festet, blir inkubert med membranen.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåte for transport av et molekyl inn i en celle in vitro, kjennetegnet ved at aryl radikal er beskrevet i et hvilket som helst av kravene 1-3, til hvilke et molekyl som skal transporteres, valgt fra gruppen bestående av et polynukleotid, et oligonukleotid eller et mononukleotid er festet, blir inkubert med cellen, hvoretter konjugatet blir transportert inn i cellen uten at aryl radikalet blir kuttet av.
Et mulig konjugat kan være et som består av i det minste et molekyl som skal transporteres, og minst en arylrest med formel (I)
idet
Aryl er en gruppe inneholdende minst en ring som har aromatisk karakter;
X er O eller N; foretrukket er X = O;
Y er O, S eller NH-R<2>; foretrukket er Y = O;
R<1>er en substituert eller usubstituert C1-C23alkylrest som er rett eller forgrenet, og
som kan inneholde dobbel- og/eller trippelbindinger; f.eks. en arylalkylrest;
R<2>er en substituert eller usubstituert Ci-ds alkylrest som er rett eller forgrenet, og
som kan inneholde dobbel- og/eller trippelbindinger; og
n er et helt tall større eller lik 1.
idet arylresten enten er bundet direkte over en kjemisk binding eller indirekte over en kjemisk gruppe til det molekyl som skal transporteres, idet den kjemiske gruppe ikke er noen CH2-S-gruppe, når bindingen skjer ved hjelp av en
internukleotidfosfodiesterbinding til det molekyl som skal transporteres.
Det molekyl som skal transporteres kan være et hvilket som helst vilkårlig molekyl. Foretrukket har det molekyl som skal transporteres en molekylvekt på > 350 dalton. En utførelsesform av oppfinnelsen vedrører konjugater hvor det molekyl som skal transporteres er et makromolekyl, dvs. med en molekylvekt > 500 dalton, f.eks. > 1000 dalton, spesielt foretrukket > 2000 dalton eller større. Det molekyl som skal transporteres kan også være en lavmolekylær forbindelse, f.eks. med en molekylvekt < 500 dalton, foretrukket med en molekylvekt på 350-500 dalton. Den lavmolekylære forbindelse kan være et mononukleotid.
Det molekyl som skal transporteres kan tilhøre forskjellige kjemiske substansklasser, f.eks. kan det være en biopolymer, f.eks. et polynukleotid, foretrukket et oligonukleotid, et polypeptid, foretrukket et peptid eller protein, en peptidnukleinsyre (PNA) eller et polyamid som inneholder de tre aromatiske ringer imidazol, pyrol og hydroksypyrol
(Kielkopf et al, Science 282,111-115 (1998)) eller et polysakkarid, foretrukket et oligosakkarid eller et av derivatene av de nevnte forbindelser. Det molekyl som skal transporteres kan være et peptidmimetikum.
Polynukleotider, oligonukleotider og mononukleotider er enten naturlig forekommende nukleinsyrer eller kjente derivater derav. Med derivater forstår man bl.a. salter av det molekyl, henholdsvis konjugat som skal transporteres, spesielt deres fysiologisk tålbare salter og også f.eks. modifiserte, henholdsvis stabiliserte nukleinsyrer.
Det molekyl som skal transporteres kan være en inhibitor av transkripsjonsfaktorer som f.eks. NF-kB, c-fos eller c-jun, cellesyklusproteiner som f.eks. cyklin D, kinaser som c-Src-, Tyrosin- eller MAP-kinaser, intracellulære ionekanaler, immunofiliner som f.eks. de FK506-bindende proteiner, prolyl-4-hydroksylase, topoisomerase, virale proteaser, "Multiple Drug Resistance"-proteiner, fosfataser som f.eks. proteintyrosinfosfatase. Det molekyl som skal transporteres kan være konjugert til en eller flere arylrester, f.eks. to, tre, fire, fem, seks, syv, åtte, ni, ti, femten, tyve eller flere arylrester.
Arylresten ("arylrest" står spesielt for en arylrest med formel I og/eller en arylrest med formel II) kan være bundet enkelt eller flere ganger til det molekyl som skal transporteres, idet bindingene kan være lokalisert på forskjellige posisjoner av arylresten. Er flere arylrester bundet til det molekyl som skal transporteres, så kan disse være like eller forskjellige.
Arylresten inneholder en arylgruppe (i formler I og II betegnet som "aryl"); arylgruppen kan bestå av en eller flere ringer, idet imidlertid minst en av ringene har aromatisk karakter. Arylgruppen kan også inneholde heterosykliske ringer som eventuelt har aromatisk karakter. Arylgruppen inneholder f.eks. 1-8 eller flere ringer (også "ringsystemer") foretrukket 1,2, 3,4, 5, 6, 7 eller 8 ringer. De enkelte ringer har en størrelse med fra 3 til 7 ringatomer, foretrukket 5 til 6 ringatomer. Eksempler på ringsystemer er fenylringer, pyridinylringer, pyrimidinylringer, pyrrolylringer, furanylringer, tiofenylringer, 5-ringlaktoner, 6-ringlaktoner, spirolaktoner, benzokinoner, sykloheksadienylringer og sykloheksenylringer. Disse ringsystemer, arylgruppen, henholdsvis enkelte ringer i arylgruppen, kan være substituert en eller flere ganger. For eksempel kan minst en av ringene i arylgruppen være bundet en acylrest.
Arylgruppen kan f.eks. være gruppe med en av formlene Fl', F3', F4', F6', F7', F8', F9', F10', Fl 1'. Disse formler er avbildet i figur 1.
Arylresten kan være bundet direkte til det molekyl som skal transporteres, eller over en kjemisk gruppe. Gjenstand for oppfinnelsen er anvendelse av et konjugat. Den kjemiske gruppe sammen med arylresten kan også ha formel II.
hvori aryl, X, Y og R<1>er som definert ovenfor, og
R<3>betyr den kjemiske gruppe, idet R<3>f.eks. er en -C(=0)-gruppe eller -NH-C(=S)-gruppe.
Eksempler på arylrester med formel II, er arylrestene med formelen Fl, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 og Fl 1; disse formler er avbildet i Figur 2a og Figur 2b.
I en spesiell utførelsesform er det molekyl som skal transporteres et oligonukleotid. Et oligonukleotid kan f.eks. være oppbygget i sin helhet fra nukleotidene adenosinfosfat, guanosinfosfat, inosinfosfat, cytidinfosfat, uridinfosfat og tymidinfosfat. I andre utførelsesformer av oppfinnelsen kan et oligonukleotid eventuelt inneholde en eller flere modifikasjoner, f.eks. kjemiske modifikasjoner. Et oligonukleotid kan fremvise flere like og/eller forskjellige modifikasjoner.
Eksempler på kjemiske modifikasjoner er kjent for den fagkyndige og f.eks. beskrevet i E. Uhlmann og A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 og "Protocols for Oligonukleotides and Analogs" Sunthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed. Humana Press, Totowa, USA 1993 og J. Hunziker og C. Leumann "Nucleic Acid Analogs: Synthesis and Properties" in Modern Synthetic Methods (utg. Beat Ernst og C. Leumann) Verlag Helvetica Chimica Acata, Basel, s. 331-417.
Den kjemiske modifikasjon av et oligonukleotid kan f.eks. omfatte
a) den fullstendige eller delvise erstatning av fosfosyrediesterbroene, f.eks. med fosforotioat-, fosforoditioat-, NR]R] "fosforamidat-, boranofosfat-, fosfat-(Ci-
C2i)-0-alkylester,fosfat-[(C6-Ci2)aryl-(Ci-C2i)-0-alkyl]ester, (Ci-Cg)alkylfosfonat- og/eller (C6-Ci2)-arylfosfonatbroer,
idet
R<1>og R<1>, uavhengig av hverandre, står for hydrogen, (Ci-Cig)-alkyl, (C6-C20)-aryl, (C6-Ci4)-aryl-(Ci-Cg)-alkyl, foretrukket for hydrogen, (Ci-Cg)-alkyl og/eller metoksyetyl, spesielt foretrukket for hydrogen, (Ci-C4)-alkyl og/eller metoksyetyl.
eller
R<1>ogRr sammen med det nitrogen som bærer dem danner en 5-6-leddet heterosyklisk ring, som ytterligere kan inneholde et heteroatom fra rekken O, S,
N;
b) den fullstendige eller delvise erstatning av 3'- og/eller 5'-fosfosyrediesterbroene med "defosfo"-broer (beskrevet f.eks. i Uhlmann, E. og Peyman, A. i "Methods
in Molecular Biology", vol., 20, "Protocols for Oligonukleotides and Analogs", S. Agrawal, utg. Humana Press, Totowa 1993, kap. 16, 355ff), f.eks. med formacetal, 3'-tiofomacetal, metylhydroksylamin, oksim, metylendimetylhydrazo, dimetylensulfon og/eller silylgrupper;
c) den fullstendige eller delvis erstatning av sukkerfosfatskjelettet, f.eks. med "morfolino"-oligomerer (f.eks. beskrevet i E.P. Stirchak et al, Nucleic Acids
Res. 17 (1989) 6129 og i J. Summerton og D. Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 7 (1997) 187-195) og/eller med polyamidnukleinsyre ("PNA")
(f. eks .beskrevet i P.E. Nielsen et al., Bioconj. Chem. 5 (1994) 3) og/eller fosfomonosyreester nukleinsyrer ("PHONA") (beskrevet f.eks. i Peymann et al., Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 35 (1996) 2632-2638);
d) den fullstendige og/eller delvise erstatning av p-D-2'-desoksyriboseenheter, for eksempel med a-D-2'-desoksyribose, L-2'-desoksyribose, 2'-F-2'-desoksyribose, 2'-0-(CrC6)alkylribose, 2'-0-(C2-C6)alkenylribose, 2'-[0(Ci-C6)alkyl]-ribose, 2'-NH2-2'-desoksyribose, p-D-xylofuranose, a-arabinofuranose, 2,4-dideoksy-p-D-erytroheksopyranose, konformativt begrensede sukkernaloger som LNA ("Locked nucleic acids"; Singh et al, Chem. Commun. 4 (1998) 455; Singh et al, Chem. Commun 12 (1998) 1247) og karbosykliske (beskrevet f.eks. i Froehler, J.Am. Chem. Soc. 114 (1992) 8329) og/eller åpenkjedede sukkeranaloger (beskrevet f.eks. i Vandendriessche et al, Tetrahedron 49 (1993) 7223) og/eller bisyklosukkeranaloger (for eksempel beskrevet i M. Tarkov et al, Heiv. Chim. Actaaa 76 (1993) 481); e) modifikasjonen med den fullstendige eller delvise erstatning av de naturlige nukleosidbaser, for eksempel med 5-(hydroksymetyl)uracil, 5-aminouracil,
fseudouracil, pseudoisocytosin, dihydrouracil, 5-(Ci-C6)-alkyluracil, 5-(C2-Ce)-alkenyluracil, 5-(C2-C6)-alkinyluracil, 5-(Ci-C6)-alkylcytosin, 5-(C2-Ce)-alkenylcytosin, 5-(C2-C6)-alkinylcytosin, 5-fluoruracil, 5-fluorcytosin, 5-kloruracil, 5-klorcytosin, 5-bromuracil, 5-bromcytosin eller 7-deaza-7-substituerte puriner.
Den kjemiske modifikasjon av et oligonukleotid omfatter videre bindingen av et oligonukleotid til et eller flere ytterligere molekyler som gunstig påvirker de spesielle egenskaper av oligonukleotidet, for eksempel nukleasestabilitet, affinitet til målsekvensen og farmkokinetikken, for eksempel ved hybridiseringen av det modifiserte oligonukleotid angriper dette ved dets målsekvens under binding og/eller tverrbinding. Eksempler på slike ytterligere molekyler er polylysin, interkalatoren som pyren, akridin, fenazin og fenantridin, fluoreserende forbindelser som fluorescein, kryssbindingsmidler som psoraler og azidoproflavin, lipofile molekyler som (C12-C20)-alkylgrupper, foretrukket (Ci2-C2o)-alkylgrupper, lipider som 1,2-diheksadecylrac-glyserol, steroider som kolesterol eller testosteron, vitaminer som Vitamin E, poly-, henholdsvis oligoetylenglykol, (Ci2-Cig)-alkylfosfatdiester, foretrukket (Cn-Cig)-alkylfosfatdiestere og 0-CH2-CH(OH)-0-(Ci2-Ci8)-alkylgruper, foretrukket 0-CH2-CH(OH)-0-(Ci2-Ci6)-alkylgruppe. Disse ytterligere molkeyler kan være konjugert ved et 5'- og/eller på 3'-enden og/eller inne i sekvensen, f.eks. til en nukleobase. Fremgangsmåtene for fremstilling av slike modifiserte oligonukleotider er kjent for den fagkyndige og f.eks. beskrevet i Uhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543 og/eller M.Manoharan i "Antisense Research and Applications", Crooke og Lebleu, utg. CRC Press, Boca Raton, 1993, kap. 17, s. 303ff. og/eller EP-A 0 552 766.
I ytterligere spesielle utførelsesformer av oppfinnelsen kan oligonukleotidet på 3' og/eller på 5'-enden fremvise 3'-3'- og/eller 5'-5'-inversjoner. Denne type av kjemisk modifikasjon er kjent for den fagkyndige og for eksempel beskrevet i M. Koga et al., J. Org. Chem. 56 (1991) 3757.
Ved et konjugat bestående av et eller flere oligonukleotider og en eller flere arylrester, foretrukket med formel I eller II, kan tilbindingen (konjugasjonen) av arylrester til et oligonukleotid skje for eksempel på 5'-enden (A), på 3'-enden (F), på den heterosykliske base (E og G), til sukkeret (C) eller til internukleosidbroen (B) av oligonukleotidet. Tilbidingen kan imidlertid også for eksempel skje over ikke-nukleotidiske komponenter, for eksempel i tilfellet (D). Disse eksempler er illustrert i figur 3.
De nevnte modifikasjoner kan tilsvarende selvfølgelig også anvendes på lengre polynukleotider og såfremt egnet også for mono-, henholdsvis dinukleotider, henholdsvis -nukleosider.
Oligonukleotidene har for eksempel en lengde på 8 til 50 nukleotider, for eksempel 10-20 nukleotider. Egnet er imidlertid også oligonukleotider av lengre oligo-, henholdsvis polynukleotider, for eksempel med en lengde på 50 til 10000 nukleotider, foretrukket 100 til 1000 nukleotider, som eventuelt også kan foreligge i dobbelttrådet form. Oligonukleotidene kan ha en hvilken som helst vilkårlig sekvens. Avhengig av det utvalgte mål, dvs. hvis målet er en nukleinsyre, i avhengighet av dets sekvens eller hvis målet er et protein, i avhengighet av nukleinsyresekvensen som koder for dette målprotein, blir sekvensen av oligonukleotidet utvalgt henholdsvis konstruert. Er for eksempel målet et virus, for eksempel CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, influensa, VS V, Hepatitt B eller papilloma virus, kan oligonukleotidet for eksempel ha en av de følgende sekvenser:
Målet kan f.eks. være et protein som deltar i kreftdannelsen, henholdsvis er ansvarlig for kreftveksten. Eksempler på slike mål er:
1) Nukleære onkoproteiner som f.eks. c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, s. 120. 2) Cytoplasmiske/membranassosierte okoproteiner som f.eks. EJ-ras, C-Haraqs, N-ras, rrg, bcl2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets; 3) Cellulære reseptorer som f.eks. EGF-reseptor, Her-2, c-erbA, VEGF-reseptor (KDR-1), retinoidreseptor, proteinkinase regulatoris underenhet, c-fms, Tie-2, c-raf-l-kinase, PKC-alfa, proteinkinase A (RI alfa); 4) Cytokiner, vekstfaktorer, ekstracellulær matriks som f.eks. CSF-1, IL-6, IL-la, IL-lb, IL2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, myeloblastin, fibronektin,
Oligonukleotider rettet mot slike mål som for eksempel kan ha følgende basesekvens:
er målet et integrin eller en celle-celle-adhesjonsreseptor som for eksempel VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM eller ELAM kan da oligonukleotidet for eksempel ha en av de følgende sekvenser:
Er målet et protein som er ansvarlig for formering eller migrasjon, henholdsvis deltar i denne /disse prosesser som f.eks.: 1) Nukleære transaktivatorproteiner og cykliner som for eksempel c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, cyklin og cdc2-kinase; 2) Mitogener eller vekstfaktorer som for eksempel PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF og TGF-p; 3) Cellulære reseptorer som for eksempel bFGF-reseptor, EGF-reseptor og PDGF-reseptor;
Da kan oligonukleotidet ha en av de følgende basesekvenser:
Er målet f.eks. med en adenosin-Al-reseptor, adenosin-A3-reseptor, bradykininreseptor eller IL-13, er for eksempel basesekvensen.
mulig.
Følgende oligonukleotider (5'—3') ble fremstilt:
idet<*>angir de posisjoner hvor en fosfodiesterbro er blitt erstattet med en fosforotioatinternukleosidbro.
Disse sekvenser ble omvandlet til de følgende konjugater (KO):
idet
"Fl, F3 til Fil" betyr arylrester med formler Fl, F3 til Fl 1 (se figur 2);
"Lii" er en 6-aminoheksylfosfatrest som er bundet til 5'-enden av oligonukleotidet (f.eks. vist i bilag 4);
"ON1 til ON11" betyr de beskrevne oligonukleotider med sekvensene SEQ ID NR. 1 TIL SEQ ID NR. 11;
og "rodamin" er en, ved siden av fluorescein, påvisbar rodamin-markering på 3'-enden av oligonukleotidet.
Det er også mulig å skaffe tilveie en fremgangsmåte for fremstilling av konjugatene som anvendes ifølge oppfinnelsen. Dette kan for eksempel være fremgangsmåter for fremstilling av et konjugat som inneholder det molekyl som skal transporteres og minst en arylrest foretrukket med formler I eller II, idet a) et molekyl som skal transporteres og som inneholder en reaktiv funksjon ved den posisjon hvorpå arylresten skal bindes, fremstilles;
b) en arylrest fremstilles og
c) molekylet som skal transporteres, omsettes til konjugat med arylresten.
Foretrukket er den reaktive funksjon en aminogruppe, merkaptogruppe,
kloracetylgruppe, isocyanatgruppe, isotiocyanatgruppe, karboksylsyregruppe, N-hydroksysuksinimidgruppe eller en karboksylsyrekloridgruppe. Omsetningen av det molekyl som skal transporteres med arylresten gjennomføres ved en pH-verdi < 7,5; foretrukket ved en pH-verdi <_7,3, foretrukket ved en pH-verdi på 7,0 eller en lavere pH-verdi, f.eks. en pH-verdi < 7, foretrukket pH-verdi < 6,5. Ved disse
koblingsreaksjoner må alle andre reaktive grupper før reaksjonen beskyttes med for den fagkyndige kjente beskyttelsesgrupper.
I en spesiell utførelsesform av fremgangsmåten er det molekyl som skal transportere et polynukleotid, et oligonukleotid eller et mononukleotid.
Fremgangsmåtene for fremstilling kan omfatte at det i et første trinn fremstilles det molekyl som skal transporteres. Oligonukleotidene kan fremstilles ved hjelp av forskjellige kjente, kjemiske prosesser, som f.eks. beskrevet i Eckstein, F. (1991) "Oligonykleotides and Analogues, A Practical Approach", IRL Press, Oxford. Oligonukleotidene kan også fremstilles ved hjelp av metoder som eventuelt inneholder et eller flere enzymatiske trinn. Fremstillingen av oligonukleotidkonjugater er i prisippet beskrevet i litteraturen (J. Goodchild, Bioconjugate Cchem. 1 (1990) 165; S. Beaucage og R. lyer, Tetrahedron 49 (1993) 1925; S. Agrawal Methods in Molekular Biology vol.
26 "Protocols for oligonucleotide Conjufates" (1994) Humana Press).
Ved syntesen av oligonukleotidkonjugatene med formel I må det imidlertid påses at disse kan spaltes i alkalisk medium. Følgelig er det f.eks. ved hjelp av de vanlige metoder ikke mulig med noen syntese av FDA-merkede oligonukleotider på en oligonukleotidsyntetisator, da estergruppene i FDA-gruppen ved ammoniakk-behandlingen, som er nødvendig for avspaltingen av oligonukleotidet fra bæreren, og avspaltingen av aminobeskyttelsesgrupper, fordi heterosykliske baser allerede hydrolyseres. Følgelig fremstilles oligonukleotidet først i beskyttet form som fortrinn og i det siste trinn kondenseres med gruppen med formel I (Figur 5). Fortrinnet for oligonukleotidet har en reaktiv, henholdsvis aktiverbar funksjon som deretter ved hjelp av for den fagkyndige kjente metoder derivatiseres med et reagens som inneholder gruppen ifølge oppfinnelsen med formel I. Som reaktiv, henholdsvis aktiverbare funksjoner, kommer f.eks. amino-, merkapto-, kloracetyl-, isotiocyanat- og karboksylsyrefunksjoner i betraktning. Særlig lett er det å innføre såkalte aminolinkere ved hjelp av kommersielt erholdbare reagenser i oligonukleotider. Aminolinker, oligonukleotidene omsettes så f.eks. med reaktive reagenser som inneholder en gruppe med formel I. Slike reaktive reagenser er for eksempel de tilsvarende isotiocyanater. Gruppene med formel I er i dette tilfellet tilknyttet over en tioureafunksjon (Bilag 4). Andre reaktive reagenser er for eksempel karboksylsyrekloridene. Milde reaktive reagenser er for eksempel N-hydroksysuksinimidene av de tilsvarende karboksylsyrer. Aktiverbare reagenser er for eksempel tilsvarende karboksylsyrer, som lar seg koble med peptidkoblingsreagenser som HBTU, TBTU eller TOTU. I dette tilfellet er gruppen ifølge formel I tilknyttet over en amidfunksjon. I prinsippet kan innføringen av gruppen med formel I skje på vilkårlige posisjoner av oligonukleotidet. Foretrukket er de i figur 3 viste posisjoner.
Syntesen av de modifiserte oligonukleotider skjedde ved oppbygging av oligonukleotidkjeden etter standardmetoder, som fastfasesyntesen ifølge fosforamidittmetoden, og derivatisering av 5'-enden med det kommersielt tilgjengelige 5'-aminomodifiserende middel C6 (f.eks. firma Eurogentec, Seraing, Belgia).
5'-aminomodifiserende middel C6 (Mmt = 4-monometoksytrityi)
Etter avspalting av oligonukleotidderivatet fra bæreren og avbeskyttelse av alle baselabile beskyttelsesgrupper ved behandling med ammoniakk, avspaltes monometoksytritylgruppen ved behandling med 80% eddiksyre med omgivelsenes temperatur. Man erholder et 5'-aminoheksylfosfatmodifisert oligonukleotid. Aminofunksjonen av dette oligonukleotid-derivat omsettes så med FDA-isotiocyanat i 0,2M trietylammoniumbikarbonatbuffer (TBK-buffer) pH 7/DMF. Allerede etter omtrent 2 til 3 timer var aminolinker oligonukleotidet fullstendig omsatt til det ønskede FDA-derivat (Figur 4). Omsetninger med fluoresceinisotiocyanat gjennomføres normalt ved pH 8. Ved denne pH-verdi hydrolyseres diacetatet av FDA-gruppen.
Selvfølgelig kan også andre aminolinkerreagenser anvendes som for eksempel "5'-Amino-Modifier" C3, "5'-Amino-Modifier" C12, "5'-Amino-Modifier" 5 eller "5'-Thiol-Modifier" C6 (alle fra firmaet Eurogentec).
Ved anvendelse av 3'-amino-modifier-fastfaser, som f.eks. "3'-Amino-Modifier" C3 CPG (Firma Eurogentec) kan oligonukleotid-derivater med en 3'-aminoalkylgruppe fremstilles og som deretter bringes til reaksjon med FDA-isotiocyanat. Man erholdet er oligonukleotid-derivat som på 3'-enden bundet holder gruppen som tidligere nevnt med formel I.
"3'-Amino-Modifier" C3 CPG (Fmoc = fluorenylmetoksykarbonyl).
For innføring av konjugatet på den heterosykliska base av nukleosidet kan man i syntesen i stedet for en normal fosforamiditt-komponent anvende et tilsvarende "Amino-Modifier" C6 dT (Firma Eurogentec) avledet fra tymidin. På slutten av oligonukleotidsyntesen avsplates trifluoracetylbeskyttelsegruppen ved ammoniakbehandling og den frie aminofunksjon bringes til reaksjon i løsning med FDA-isotiocyanat.
"Amino-Modifier" C6 dT
På lignende måte kan gruppene med formel I innføres i vilkårlige posisjoner av oligonukleotidene. Det sees lett at det også er mulig med en flere gangers innføring av like eller forskjellige grupper.
I metode for fremstilling av konjugater, hvori det molekyl som skal transporteres er en peptidnukleinsyre (PNAs), kan f.eks. den primære aminofunksjonen i aminoetylgruppen omsettes med FDA isotiocyanat. I metode for fremstilling av konjugater, hvori det molekyl som skal transporteres er et polypeptid, kan f.eks. aminoenden av polypeptidet eller aminofunksjonen av lysin sidekjeden anvendes for en omsetning av FDA-isotiocyanat.
Gjenstand for den foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av konjugatene, spesielt anvendelser som er begrunnet ved de beskrevne fordelaktige egenskaper av konjugatene. En spesiell utførelsesform av oppfinnelsen vedrører anvendelsen av konjugatene og en transport av et molekyl gjennom en biologisk membran. Oppfinnelsen vedrører også anvendelsen av arylrester, foretrukket med formler I eller II, for transport av et molekyl, hvortil denne arylrest er bundet, for transport av dette molekyl gjennom en biologisk membran. Foretrukket er den biologiske membran bestanddel av en celle, en vesikkel eller en organelle.
Gjenstand for den foreliggende oppfinnelse er også fremgangsmåte for transport av et molekyl gjennom en membran, idet a) det fremstilles et konjugat hvor det molekyl som skal transporteres er bundet i det minste til en aryl-rest med formel I eller II, og
b) konjugatet inkuberes med membranen.
Spesielt vedrører dette fremgangsmåter for transport av et molekyl i en celle, idet
a) et konjugat fremstilles hvor det molekyl som skal transporteres er bundet til minst en arylrest med formel I eller II, og
b) dette konjugat inkuberes med cellen, hvoretter
c) konjugatet transporteres inn i cellen uten at aryl-resten avspaltes.
Dette vedrører spesielt fremgangsmåter hvori cellen er en eukaryotisk eller en
prokariotisk celle, for eksempel en bakteriecelle, en gjærcelle eller en pattedyrcelle, foretrukket en human celle. I spesielle utførelsesformer er cellen en patologisk forandret celle, for eksempel en tumorcelle.
Det forbedrede cellulære opptak av konjugatet iaktas ikke bare ved celler fira pattedyr, men også for andre eukaryoter og endog for prokaryoter.
Konjugatene ble mikroskopisk undersøkt på opptak i levende celler. Først ble de FDA-merkede oligonukleotider undersøkt på KO_l og KO_3 brukbar cellebeskaffenhet. Fra teknikkens stand kjente forbindelser ble de tilsvarende fluorescein-merkede oligonukleotider KO_2 og KO_4 anvendt. Alle undersøkte vitale dyriske cellekulturer opptok KO_l og KO_3 (FDA-konjugater) i løpet av 5 til 10 minutter, mens KO_2 og KO_4 (fluoresceinkonjugatet) ikke kunne påvises i vitale celler (Tabell 1).
Selv om opptaket i bakterier og gjær skjer mye langsomere enn i pattedyrceller, har det likevel etter 2 timer runnet sted et opptak av oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen i en del av cellene, mens de normale fluoresceinmerkede oligonukleotider under disse betingelser ikke opptas. Det er overraskende at i prinsippet alle hittil undersøkte organismer har opptatt oligonukleotidene bedre enn de kjente oligonukleotid-derivater. Organismene omfatter blant annet dyreceller, flagellater, gjær, sopp og bakterier (Tabell 3).
Det viste seg videre at kreftceller særlig godt opptar oligonukleotidene. Følgelig er anvendelsen av oligonukleotidene ifølge oppfinnelsen særlig egnet for tumorterapi. Det FDA-merkede antisensoligonukleotid KO_l, som er rettet på eg5, hemmet formeringen av A549-celler allerede ved tilsetning i medium, mens det tilsvarende umodifiserte antisenseoligonukleotid ON1 og det fluoresceinmerkede oligonukleotid KO_2 bare etter sammensetning med penetrasjonsforbedrende midler som CellFektin hemmet formeringen av kreftceller.
Oppfinnelsen vedrører anvendelsen av konjugater hvori det molekyl som skal transporteres er et oligonukleotid, for hybridisering med enkelttrådede og/eller dobbelttrådede nukleinsyrer, for eksempel DNA (gen, cDNA) og/eller RNA (f.eks. pre-mRNA, mRNA). Disse konjugater kan også sekvensspesifikt bindes til intracellulære proteiner som enzymer, f.eks. polymeraser eller telomeraser, eller til transkripsjonsfaktorer. Slike konjugater kan anvendes for modulasjon så vel som fullstendig eller delvis inhibering av ekspresjon av bestemte målgener, f.eks. for fullstendig eller delvis inhibering av transkripsjon og/eller translasjon. Konjugatene kan også anvendes som antisensoligonukleotider, ribozymer, senseoligonukleotider, trippelheliks-dannende oligonukleotider, kimeraplaster og/eller narre-("decoy")oligonukleotider. Utover dette kan disse konjugater anvendes som hjelpemiddel innen molekylærbiologien.
Videre kan oligonukleotidene anvendes i følge foreliggende oppfinnelse som legemiddel og/eller diagnostikum, henholdsvis anvendelsen av oligonukleotidene for fremstilling av legemidler og/eller diagnostika. Særlig kan oligonukleotidene anvendes i legemidler som inngår for forebygging og/eller behandling av legemidler forbundet med ekspresjon, henholdsvis overekspresjon av bestemte gener. Videre kan oligonukleotidene anvendes for diagnose, henholdsvis tidlig påvisning av slike sykdommer. Da cellebrukbarheten for oligonukleotidene er meget god, kan disse anvendes for in vivo diagnostisering, f.eks. for in situ hybridisering i hele organer eller på intakt organisme.
Legemidler kan inneholde en eller flere av nevnte konjugater. Et diagnostikum kan inneholde et eller flere av nevnte konjugater. Det også mulig å skaffe tilveie et testsett som inneholder ett eller flere av nevnter konjugater.
Nevnte oligonukleotider kan også anvendes for påvisning, seperasjon og amplifikasjon av nukleinsyrer og deres analoger. Konjugatene egner seg særlig for påvisning av nukleinsyre i celler, spesielt i levende celler. Disse celler kan ha humant eller animalsk opprinnelse. Særlig egner seg konjugatene også for de i Tabell 3 oppførte organismer, spesielt for påvisning av patogene organismer. Oligonukleotidene kan anvendes i kjente tekniske varianter av amplifikasjon av nukleinsyrer, spesielt i den LMPCR (ligasjonsmedierte polymerasekjedereaksjon - "ligation-mediated Polymerase Chain Reaction"), i "Invader Assay" (Third Wave technologies, Inc. Wisconsin) i "TaqMan" systemet og i multipleks genotypering. Fordelaktig er også anvendelsen av oligonukleotidene for amplifikasjon av nukleinsyrer ved hjelp av "Light-Cyclers" som tillater en ekthets-bestemmelse av amplifikasjon. Påvisningen etter prinsippet med den molekylære "Beacon", hvor fluorescensfargestoffet ikke fluorescerer i ubundet tilstand, da det ved hjelp av en andre gruppe i oligomeren deaktiveres, er en ytterligere anvendelsesmulighet for oligonukleiden. For eksempel kan et FDA-derivat (f.eks. på 5'-enden av oligonukleotidet) kombineres med en dabcylrest (f.eks. konjugert på 3'-enden) og som etter omvandlingen av FDA-derivatet i fluorescein-derivatet deaktiverer fluorescenssignalet i ubundet tilstand. Denne FDA-modifiserte "Beacon" ville først utsende et fluorescens signal etter opptak i cellen og hybridisering til celle mRNA. Oligonukleotidene, henholdsvis legemidler som inneholder disse oligonukleotidene kan anvendes for behandling av sykdommer, hvor definerte gener ved overekspresjon er årsaken eller deltar. Legemidlene kan f.eks. anvendes for behandling av sykdommer som skylles vira f.eks., CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, influensa, VS V, hepatitt B eller papillomvirus. Nevnte legemidler egner seg f.eks. også for behandling av kreft. Legemidlene egner seg f.eks. videre for behandling av sykdommer som påvirkes ved integrinet eller celle-celle-adhesjonsreseptorer, f.eks. VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM eller ELAM. Legemidlene egner seg f.eks. også for forebygging av restenose, for behandling av vitiligo og andre depigmenteringssykdommer, henholdsvis depigmenteringsforstyrrelser (f.eks. på hud, hår, øyne), f.eks. albinisme og psoriasis, og av astma.
Legemidlene kan vedrøre f.eks. farmasøytiske preparater som kan tilføres
a) oralt, f.eks. i form av tabletter, drageer, hard- eller mykgelatinkapsler, løsninger, emulsjoner eller suspensjoner,
b) rektalt, f.eks. i form av stikkpiller, eller
c) parenteralt, f.eks. i form av injeksjonsløsninger.
For fremstilling av legemidlene kan konjugatene for eksempel forarbeides i terapeutisk
inerte, organiske og/eller uorganiske bærere; f.eks. kan det som bærer for tabletter, drageer og hardgelatinkapsler anvendes laktose, maisstivelse eller derivater derav, talg og stearinsyre så vel som salter derav. Som bærer for løsninger er vann, polyoloer, sakkarose, invert sukker og glukose egnet for injeksjonsløsninger er vann, alkohol, polyoler, glyserol og plateolje egnet, for stikkpiller er planteoljer og herdede oljer, voksarter, fett og halvflytende polyoler egnet. Legemidlene kan videre inneholde konserveringsmidler, løsningsmidler, stabiliseringsmidler, fuktemidler, emulgeringsmidler, søtningsstoffer, fargestoffer, smaksstoffer, salter for å endre det osmotiske trykk, buffere, overtrekksmidler, anti-oksidanter, så vel som eventuelt andre terapeutiske virkestoffer. Legemidlene kan påføres topisk eller lokalt som for eksempel ved hjelp av et kateter eller inhaleres, eller tilføres ved injeksjoner, henholdsvis infusjoner. For injeksjon sammensettes konjugatet i en flytende løsning, foretrukket i en fysiologisk tålbar buffer, som for eksempel Hanks løsning eller Ringers løsning. Konjugatet kan imidlertid også sammensettes i fast form og oppløses eller suspenderes før bruken. De for den systematiske tilførsel foretrukne doseringer utgjør ca. 0,01 mg/kg til ca. 50 mg/kg kroppsvekt og dag.
Konjugatene og/eller deres fysiologisk tålbare salter tilføres dyret, foretrukket er pattedyr, og spesielt mennesker som legemiddel alene, i blandinger seg imellom eller i form av farmasøytiske preparater som tillater en topisk, perkutan, parenteral eller enteral anvendelse og som aktiv bestanddel inneholder en virksom dose av minst et konjugat ved siden av vanlige farmasøytisk tålbare bærere- og tilsetningsstoffer. Preparatene inneholder normalt omtrent 0,1 til 90 vekt% av den terapeutisk virksomme forbindelse. For behandling av hudsykdommer, som f.eks. psoriasis eller vitiligo foretrekkes en topisk anvendelse, f.eks. i form av salver, lotion eller tinktur, emulsjon eller suspensjon. Fremstillingen av legemiddelet skjer på i og for seg kjent måte (se f.eks. Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Pbl., Col, Easton, PA.), idet farmasøytisk interte og uorganiske og/eller organiske bærerstoffer anvendes. For fremstilling av piller, tabletter, drageer og hardgelatinkapsler kan f.eks. laktose, maisstivelse og/eller derivater derav, talkum, stearinsyre og/eller dens salter etc. anvendes. Bærestoffer for mykgelatinkaplser og/eller stikkpiller er f.eks. fett, voks, halvfeste og flytende polyoler, naturlige og/eller herdede oljer etc. Som bærestoffer for fremstillingen av løsninger og/eller siruper egner f.eks. vann, sakkarose, invert sukker, glukose, polyoler etc. seg. Som bærestoffer for fremstilling av injeksjonsløsninger egner vann, alkohol, glyserin, polyoler, planteoljer etc. seg. Som bærestoffer for mikrokapsler, inmplantater og/eller stikkpiller egner blandingspolymerisater av glykolsyre og melkesyre seg. Utover dette er liposomsammensetninger som er kjent for den fagkyndige egnet (N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523; "Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992), f.eks. HVJ-liposomer (Hayashi, Gene Therapy 3
(1996) 878).
Et legemiddel kan ved siden av virke- og bærestoffer ytterligere inneholde tilsetningstoffer som f.eks. fyllstoffer, strekk-, spreng-, binde-, glide-, fukte-, stabiliserings-, emulgerings-, konserverings-, søtnings-, farge-, smaks-, aromatiserings-, fortyknings- og fortynningsmidler, buffersubstanser, videre løsningsmidler og/eller løsningsformidlere og/eller midler for oppnåelse av en depotvirkning, så vel som salter for endring av det osmotiske trykk, overtrekksmidler og/eller antioksidanter. Legemidlene kan også inneholde to eller flere forskjellige oligonukleotider og/eller deres fysiologisk tålbare salter så vel som videre i tillegg til minst et oligonukleotid, et eller flere andre terapeutisk virksomme stoffer. Dosen kan varieres innenfor vide grenser og skal ved hvert enkelt tilfelle tilpasses de individuelle forhold.
FIGURER
Figur 1: Viser eksempler på arylrester med formel (I).
Figurene 2a og b: Viser eksempler på arylrester med formel (II).
Figur 3: Viser forskjellige eksempler (A, B, C, D, E, F, G) på en konjugasjon mellom et molekyl som skal transporteres (et oligonukleotid) og arylrester med formel (I). "R" står for en rest med formel (I); "B" står for en rest i den heterosykliske basis. Figur 4: Viser en mulighet til å fremstille et konjugat ifølge oppfinnelsen (her bestående av FDA-isotiocyanat og oligonukleotid). Figur 5: Viser tidsforløpet for opptaket av konjugatet KO_5 i REH-celler fra mediet idet det anvendes medium uten serum(4) og en gang medium med serum (□). Celleopptaket ble bestemt ved hjelp av
FACS.
Figur 6: Viser bestemmelse av celleopptak av KO_l (FDA-konjugat; ♦) og KO_2 (FITC-oligomer; A) ved hjelp av FACS-måling. Begynnelseskonsentrasjonen av ekstracellulært oligonukleotidkonjugat var 1 pM; O og □ er kontroller. Figur 7: Viser lengdeavhengighet av transfeksjonen av FDA-konjugert
polyA-nukleotider i REH-celler.
Figur 8: Viser en sammenligning ved celleopptaket av fluoresceindiacetat og fluoresceindipivalat oligonukleotidkonjugater.
K39: Karboksyfluoresceindiacetat (F3 = FDA) fra Eksempel 15
Figur 9: Viser fluorescensmikroskopisk undersøkelse av celleopptak av det to ganger merkede Cy3-oligonukleotid-F3-konjugat (1^iM) ved inkubasjon med REH-celler. Opptak etter 4 timer: venstre: fluorescensmerking;
mitten: cyaninfargestoff;
høyre: fasekontrasopptak;
over: oligonukleotid K33;
under: oligonukleotid K34.
EKSEMPLER
Eksempel 1: Oligonukleotidsyntese
Oligonukleotidet ble syntetisert på en automatisk DNA-syntetisator (Applied Biosystems Model 380B eller 394) under anvendelse av standard fosforamidittkjemi og oksidasjon med jod (F. Eckstein, utg. "Oligonukleotides and Analogues, A Practical Approach"" IRL Press, Oxford, 1991). For innføring av fosfortioatbroer i blandede fosforotioater og fosfordiesteroligonukleotider ble det i stedet for jod oksidert med TETD (tetraetyltiuramdisulfid) eller ved hjelp av Beaucages reagens. Etter avspalting av fast bærer (CPG eller "Tentagel") og fjerning av beskyttelsesgrupper med konsentrert NH3ved 55°C i 18 timer, ble oligonukleotidene først renset ved butanolfelling (Sawadogo, Van Dyke, Nucl. Acids Res. 19 (1991) 674). Oligonukleotidene ble renset ved preparativ gelelektroforese eller FPLC. Deretter ble natriumsaltet erholdt ved utfelling fra en 0,5M NaCl-løsning med 2,5 volumdeler etanol.
Analysen av oligonukleotidene skjedde ved
a) Analyttisk gelelektroforese i 20% akrylamid, 8M urea, 454M tris-boratbuffer, pH 7,0 og/eller b) HPLC-analyse: Waters GenPak FAX, gradient CH3CN (400 ml), H20 (1,6 1), NaH2P04(3,1 g), NaCl (11,7 g), pH 6,8 (0,1M og NaCl) deretter CH3CN
(400 ml), H20 (1,6 1), NaH2P04 (3,1 g), NaCl (175,3 g), pH 6,8 (1,5M og NaCl) og/eller
c) Kapillærgelelektroforese Beckmann Kapillar "eCAP", Ul 00P gelkolonne, 65 cm lengde, 100 med mer I.D., vindu 15 cm fra en ende, buffer 140^iM
tris, 360 mM borsyre, 7M urea og/eller
d) Elektrospraymassespektroskopi
Analysen av oligonukleotidet viste at det i det de enkelte tilfeller forelå i en
renhet på mer enn 90%, for det meste dog mer enn 95%.
Eksempel 2: Innføring av en 5-'aminolinker i et oligonukleotid Oligonukleotidet ble oppbygget som beskrevet i Eksempel 1. Etter kobling av det siste nukleotid, ble dimetoksytritylgruppen på 5'-enden avspaltet. Den frie hydroksylgruppe ble under tetrazolkatalyse omsatt med det kommersielt erholdbare "5'-Amino-Modifier" C6 (Firma Eurogentec, Seraing, Belgia), og oksidert med jodvann. Deretter ble oligonukleotidet avspaltet fra bæreren ved hjelp av kons. ammoniakk ved 50°C over natten og alle baselabile beskyttelsesgrupper på internukleosidgruppene og aminiofunksjonene av de heterosykliske baser ble avspaltet. I det siste trinn ble monometoksytritryl beskyttelsegrupen avspaltet ved 3 timer behandler med 80% eddiksyre ved omgivelsestemperatur. Det resulterende oligonukleotid ble analysert som beskrevet i Eksempel 1.
Eksempel 3: Konjugasjon av aminolinker oligonukleotidet med FDA-isotiocyanat 10 OD (260) av 5'-aminolinker oligonukleotidet fra Eksempel 2 ble oppløst i 16 (il 0,2M trietylammoniumbikarbonat (TBK) buffer og tilsatt 125 pl dimetylformamid (DMF). Til denne blanding ble det tilført 1,5 mg FDA isotiocyanat og blandingen ble satt under omristing i 3 timer under utelukkelse av lys. Omsetningsprosessen ble overvåket ved hjelp av HPLC. Deretter ble blandingen tilsatt 2 ul kons. eddiksyre og konsentrert i vakuum. Deretter ble produktet renset ved hjelp av en butanolfelling. Ved hjelp av ESI-massespektroskopi ble den riktige massevekt fastslått. Prøvene ble hele tiden holdt ved pH under 7, slik at det ikke fant sted noen hydrolyse av den aromatiske ester.
Eksempel 4: Syntese av KO_l (5'-F3-G<*>CGAC<*>GC<*>CAT<*>GAC<*>G<*>G-3'; F3 =
FDA)
Oligonukleotidet ble oppbygget ved å gå ut fra et CPG-T som over 3'-enden holdt et 1 pmol desoksyguansoin bundet, som beskrevet i Eksempel 1. På de med<*>merkede posisjoner ble oksidasjonen med Beaucage reagenset gjennomført for å innføre en fosforotiotatbro. Deretter ble "5'-Amino-Modifier" C6 tilkoblet som beskrevet i Eksempel 2. Etter avbeskyttelsen med kons. Ammoniakk og 80% eddiksyre erholdt man 96 OD (260) av 5'-aminolinker-G<*>CGAC<*>GC<*>CAT<*>GAC<*>G<*>G-3'. 10 OD (260) av 5'-aminolinker oligonukleotidet ble så, som beskrevet i Eksempel 3, omsatt med FDA-isotiocyanat. Etter butanolfellingen erholdes 8,4 OD (260) av det ønskede FDA-merkede oligonukleotid. ESI-MS for di-Na-saltet: 5395,93 (beregnet for di-Na: 5395,09).
Eksempel 5: Syntese av KO_13 (5'-F3-TATTCCGTCAT-3') Oligonukleotidet ble oppbygget ved å gå ut ifra en CPG-bærer som holdt 1 pinol tymidin bundet ved 3'-enden, som beskrevet i Eksempel 1. Alle oksidasjoner ble gjennomført med jodvann. Deretter ble "5'-Amino-Modifier" C6 som beskrevet i Eksempel 2, påkoblet. Etter avbeskyttelsen med konsentrert ammoniakk og 80% eddiksyre erholdes 72 OD (260) 5'-aminolinker-TATTCCGTACAT-3'. Etter rensing over en preparativ polyakrylamidgel erholdes 43 OD (260). 10 OD (260) av 5'-aminolinker oligonukleotidet ble så omsatt med FDA-isotiocyanat som beskrevet i Eksempel 3. Etter butanolfellingen erholdes 9,1 OD (260) av det ønskede FDA-merkede oligonukleotid. ESI-MS: 3934,1 (beregnet MV 3933,8).
Eksempel 6: Syntese av KO_21 (5'-F7-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C)
Oligonukleotidet ble oppbygget ved å gå ut ifra en CPG-bærer som holdt 1 pmol N6-benzoylcytidin bundet over 3'-enden, som beskrevet i Eksempel 1. Alle oksidasjoner ble gjennomført med jodvann. Deretter ble "5'-Amino-Modifier" C6 som beskrevet i Eksempel 2 påkoblet. Etter avbeskyttelsen med konsentrert ammoniakk og 80% eddiksyre erholdes 145 OD (260) av 5'-aminolinker A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-3'. 10 OD (260) av 5'-aminolinker oligonukleotidet ble løst i 16 ul 0,2 M TBK-buffer, 95 (il DMF og omsatt med 30 (il av den på forhånd fremstilte aktive ester av p-acetoksybenzosyre. Fremstillingen av aktiv-esteren skjedde ved blanding av 50 \ il 0,2 M p-acetoksybenzosyre med 50 (il 0,3 M TBTU, henholdsvis i DMF, og 1 times omsetning ved omgivelsenes temperatur. Etter 4 timers reaksjon av aminolinker-oligonukleotidet med aktiv-esteren, tilsettes 2 (il halvkonsentrert eddiksyre og blandingen konsentreres i vakuum. Overskytende reagens ble fjernet ved hjelp av en butanolfelling. Man erholder 10,7 OD (260) av det ønskede oligonukleotidkonjugat. ESI-MS: 4109,2 (beregnet MV 4108,2).
Eksempel 7: Undersøkelse av cellulært opptak av oligonukleotidkonjugater: For undersøkelse av opptaket i cellene, ble 1 ml cellesuspensjon i et oppvarmingskammer i dyrkingsmedium (eller etter spyling i PBS ved medier med egen fluorescens) under mikroskopkontroll, tilsatt 1 ml av 1 (imolar løsning av oligonukleotidkonjugatet, idet gjennomblandingen skjedde ved hjelp av pipetten og risting av kammeret. Mikroskopien ble gjennomført ved hjelp av Zeiss Axiovert 135 TV apparat (100 x plan-neofluar) i fasekontrast modus. Som fluorescensfilter tjente 09 (450-490/ FT 510/ LP 520) /HBO 59W filter. Som referanse ble det anvendt en 2,4^M løsning av FDA (Aldrich Chem. Co., FW 416,39) i aceton/PBS-buffer (1:1000, v:v). I tilfellet av FDA-konjugater kan, etter opptak, egenfluorescensen av de ved esterspalting oppståtte fluoresceinligander følges. I tillfellet av ikke-fluorescerende ligander som acetoksynaftalenkarboksylsyre ble det i tillegg på oligonukleotidet anbrakt en egnet fluorescensmerking (FITC, rogamin, cyaninfargestoff Dy 3 eller Dy 5). En dobbeltmerking som i KO_9 tjente dertil til å vise at FDA ikke avspaltes fra oligonukleotidet. De enkelte prøver ble behandlet i 2 til 120 minutter etter tilsetning av oligonukleotidkonjugatet. Ved Reh-celler var fluorescensen etter 5 til 10 minutter tydelig å se, ved K562 og tilstøtende celler, så vel som insektceller skjedde en viss økning ennå i opptil 60 min etter tilsetning. Ved frittlevende protozoer varte opptaket i opptil 1 time. Ved gjær skjedde opptaket først etter lengre tid, og ikke homogent i alle celler. Soppsporer opptok FDA-oligonukleotid-konjugatene bedre enn hyfeceller. Resultatene er sammenfattet i tabellene 1 til 3.
Eksempel 8: Undersøkelse av den antiformerende virkning av oligonukleotid-konjugatene
REH-celler (human pre-B-celle-leukemi, DSM ACC 22) eller A549 tumorceller ble dyrket i OptiMEM med 10% fetalt kalveserum (FKS; GIBCO-BRL) ved 37°C under 5% CO2. Dagen før forsøksbegynnelsen ble cellene således omsatt at det etter 24 timer kunne oppnås en cellekonsentrasjon på omtrent 1 x IO<6>/ ml. Oligonukleotidene, henholdsvis deres konjugater ble løst i destillert vann som 1 mM stamløsninger og oppbevart i fryser ved -20°C. Celleinokkulat: (1 x IO<6>celler /ml i OptiMEM med 10% FKS) foregikk i 24-brønners plater. For undersøkelse ble oligonukleotid-derivatene fortynnet til 2 pM (i OptiMEM uten FKS). Per brønn ble 100 \ il oligonukleotidløsning og 100 pl cellesuspensjon blandet (totalvolum 200 pl/brønn) oligokonsentrasjon 1 (iM, serumkonsentrasjon 5% FKS, cellekonsentrasjon 0,5 x IO<6>celler/ml). Etter 4 timer inkubasjon ved 37°C og 5% C02ble det pr. brønn tilsatt 800 ^1 OptiMEM med 11% FKS (cellekonsentrasjon nå 1 x 10<5>celler/ml, serumkonsentrasjon nå 10% FKS) og inkubert videre. Etter 90 timer ved 37°C og 5% C02, skjedde målingen av cellekonsentrasjonen på Casy 1 (Fa. Schårfe). For dette ble cellene i hver brønn ved 10 gangers oppsuging og utblåsing med pipette nr. 100 blandet og med en gang fortynnet 1:100 (ved sterkere cellevekst 1:200) med Casyton. Det skjedde en middelverdibestemmelse av celledensiteten fra henholdsvis 3 identisk igangsatte prøver i et forsøksopplegg.
Eksempel 9: Syntese av 5'-F4'(CO-NH)-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C Oligonukleotidet ble oppbygget ved å gå ut fra en CPG-bærer som over 3-'enden og holdt 1 pmol N4-benzoylcytidin bundet, som beskrevet i Eksempel 1. Oksidasjonen ble gjennomført med jodvann, henholdsvis Beaucage reagens for innføring av en fosforotioatrest (når<*>i sekvensen). Deretter ble "5'Amino-Modifier" C6 påkoblet som beskrevet i Eksempel 2. Etter avbeskyttelse med konsentrert ammoniakk og 80% eddiksyre erholdes 145 OD (260) 5'-aminolinker-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-3'. 10 OD (260) av 5'-aminolinker-oligonukleotidet ble oppløst i 16 ul 0,2M TBK-buffer, 95 \ il DMF og omsatt med 12,5 \ il diklorfluoresceindiacetathydroksysuksinimid (MV: 626,36). Etter 3 timer reaksjon av aminolinker-oligonukleotidet med hydroksysuksinimidet, tilsetter man 2 (il halvkonsentrert eddiksyre og konsentrer i vakuum. Etter avsalting over en "NAP"-kolonne (Pharmacia) ble det gjennomført en butanolfelling. Man erholder 2,8 OD (260) av det ønskede oligonukleotiddiklorfiuresceindiacetat-konjugat. ESI-MS: 4403,3 (beregnet MV 4403,2).
Eksempel 11: Syntese av 5'-F9-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C 5'-aminolinker-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-3' oligomer ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 9. 10 OD (260) av 5'-aminolinker-oligonukleotidetble løst i 16 pl 0,2M TBK-buffer, 95[il DMF og omsatt med 25 (il aktiv ester av acetoksynaftylkarboksylsyre. Fremstillingen av aktiv-esteren skjedde ved blanding av 12,5 pl 0,2M acetoksynaftylkarboksylsyre (2,5 mg i 50 ^1 DMF) med 12,5^1TBTU (4 mg i 50 ^1 DMF) og en times reaksjon ved omgivelsestemperatur. Etter 17 timers reaksjon av aminolinker-oligonukleotidet med aktiv-esteren, tilsettes 2 (il halvkonsentrert eddiksyre og blandingen konsentreres i vakuum. Etter avsalting gjennom en "NAP"-kolonne (Pharmacia) ble det gjennomført en butanolfelling. Man erholdt 8,5 OD (260) av det ønskede oligonukleotidacetoksynaftyl-konjugat. ESI-MS: 4158,2 (beregnet MV: 4157,2).
Eksempel 12: Syntese av 5'-F8-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C 5'-aminolinker-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-3' oligomeren ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 9. 10 OD (260) av 5'aminolinker-oligonukleotidet ble løst i 16 (il 0,2M TBK-buffer, 95 ul DMF og omsatt med 25 ul av aktivesteren av acetoksykumarinkarboksylsyre. Fremstillingen av aktivesteren skjedde ved blanding av 12,5 ul 0,2M acetoksykumarinkarboksylsyre (2,7 mg i 50 ^1 DMF) ved 12,5^1 TBTU (4 mg i 50 (il DMF) og en times reaksjon ved omgivelsestemperatur. Etter 17 timers reaksjon av aminolinker-oligonukleotidet med aktivesteren, tilsettes 2 (il halvkonsentrert eddiksyre og blandingen konsentreres i vakuum. Etter avsalting over en "NAP"-kolonne (Pharmacia) ble det gjennomført en butanolfelling. Man erholder 8,0 OD (260) av det ønskede oligonukleotidacetoksykumarin-konjugat. ESI-MS: 4178,5 (beregnet MV 4175,2).
Eksempel 13: Syntese av 5'-F3-(dA)ndA<*>dA<*>dA (N= 17,47 og 77; F3 = FDA) Oligonukleotidene ble oppbygget som beskrevet i Eksempel 1 ved å gå ut fra en CPG-bærer som over 3'-enden var derivatisert med N6-benzoyl-2'-deoksyadenosin. Oksidasjonen etter de første to koblinger ble gjennomført med Beaucage-reagens for innføring av fosforotioatresten (i sekvensen betegnet med<*>), idet alle øvrige oksidasjoner ble gjennomført med jodvann. Deretter ble "5'-Amino-Modifier" C6 påkoblet som beskrevet i Eksempel 2. Etter avbeskyttelse med konsentrert ammoniakk og 80% eddiksyre og rensing over en preparativ polyakrylamidgel erholdt man 2,95 OD
(260) 5'-aminolinker-(dA)i7dA<*>dA<*>dA, 4,9 OD (260) av 5'-aminolinker-(dA)47dA<*>dA<*>dA og 5 OD (260) av 5'-aminolinker-(dA)77 dA*dA*dA. 5'-aminolinker-oligonukleotidene ble hver oppløst i 0,8\il 0,2M TBK-buffer, 62 \ il DMF og omsatt med 1,6 (imol FDA-isotiocyanat. Etter 3 timers reaksjon tilføres ytterligere FDA-isotiocyanat og blandingen får reagere videre i 2 timer. Deretter tilsettes 2 (il
halvkonsentrert eddiksyre og blandingen konsentreres i vakuum. Etter avsalting over en "NAP"-kolonne (Pharmacia) ble det gjennomført en butanolfelling. Man erholdt 1,5 OD
(260) av 5'-F3-(dA)17 dA*dA*dA, 2,2 OD (260) av 5'-F3-(dA)47 dA*dA*dA og 0,9 OD
(260) av 5'-F3-(dA)77 dA*dA*dA.
Eksempel 14: Syntese av det dobbeltmerkede oligonukleotid 5'-Cy3-A<*>T<*>G
A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-C6-F3; F3 = FDA
Oligonukleotidet ble oppbygget som beskrevet i Eksempel 1 ved å gå ut fra en CPG-bærer, som tillater innføringen av en C6-aminolinker for 3'-enden (Petrie et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3, 85-87). Oksidasjonen ble gjennomført med jodvann, henholdsvis Beaucage reagens for innføring av en fosforotioatrest (når<*>i sekvensen). Etter avspalting av den siste dimetoksytrityl-beskyttelsegruppe ble 5'-enden av oligonukleotidet omsatt med en Cy3-CE fosforamiditt (Firma Glen Research, Sterlin, VA; Katalog nr. 10-5913-xx) og oksidert med jodvann. Etter avbeskyttelse med konsentrert ammoniakk (2 timer ved 70°C) erholder man 64 OD (260) av råproduktet. Etter rensing over en preparativ polyakrylamidgel erholder man 3,8 OD 5'-Cy3-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-C6-aminolink-3'. Derav ble 3,5 OD (260) oppløst i 8^10,2M TBK-buffer, 62 (il DMF og omsatt med 1,6 (imol FDA-isotiocyanat. Etter 3,5 timers reaksjon av aminolinker-oligonukleotidet med hydroksysuksinimidet tilsettes 1 (il halvkonsentrert eddiksyre og blandingen konsentreres i vakuum. Etter avsalting over en "NAP"-kolonne (Pharmacia) ble det gjennomført en butanolfelling. Man erholdt 3,5 OD
(260) av det ønskede dobbeltmerkede oligonukleotid 5-'Cy3-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-C6-F3. ESI-MS: 4926,2 (beregnet MV: 4927,1).
Eksempel 15: Syntese av 5'-F3-A<*>T<*>G A C<*>G G A Aa<*>T<*>T<*>C; F3 = FDA 5'-aminolinker-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-3' oligomeren ble fremstilt som beskrevet i Eksempel 9. 10 OD (260) av 5'-aminolinker-oligonukleotidet ble løst i 16 \ il 0,2 M TBK-buffer, 95 ul DMF og omsatt med 25 ul FDA-isotiocyanat (5 mg i 100 ul DMF). Etter 3 timers reaksjon av aminolinker-oligonukleotidet med isotiocyanatet tilsettes ytterligere 5 (il isotiocyanat og blandingen får reagere videre i 2 timer. Deretter tilsettes 2 (jl halvkonsentrert eddiksyre og blandingen konsentreres i vakuum. Etter avsalting over 1 "NAP"-kolonne (Pharmacia) ble det gjennomført en butanolfelling. Man erholdt 8,5 OD (260) av det ønskede oligonukleotidfluoresceindiacetat-konjugat. ESI-MS: 4418,4 (beregnet MV 4418,5).
Eksempel 16: Sammenligning av det cellulære opptak av oligonukleotidkonjugater med forskjellig lengde 5'-F3-(dA)„ dA<*>dA<*>dA (N =
17,47 og 77; F3 = FDA)
Bestemmelsen av det cellulære opptak av konjugatet med forskjellig lengde og molekylvekt fra Eksempel 12 ble i prinsippet gjennomført som beskrevet i Eksempel 7 med REH-celler. Kvantifiseringen skjedde ved hjelp av et gjennomstrømnings cytometer. Etter 60 minutter er de relative fluorescenssignaler for 5'-F3-(dA)i7dA<*>dA<*>dA ("A20") lik 49, for 5'-F3-(dA)47 dA*dA*dA ("A50") lik 34 og 5'-F3-(dA)77dA<*>dA<*>dA ("A80") lik 91. FDA-konjugatet med den største oligonukleotiddel, bestående av totalt 80 nukleotider, ble overraskende lett opptatt av REH-cellene.
Eksempel 17: Sammenligning av det cellulære opptak av oligonukleotidkonjugater med forskjellig derivatisering
En med fluoresceindiacetat (FDA) beslektet forbindelse er fluoresceindipivalatet som utmerker seg ved en forhøyet stabilitet av estergruppene. De tilsvarende oligonukleotidkonjugater ble ved hjelp av gjennomstrømnings cytometeret undersøkt med hensyn til opptak. Den høyere stabilitet av pivalatet overfor alkali og esteraser fører til et mindre opptak av det tilsvarende oligonukleotid-konjugat. Således er den målte relative fluorescens for fluoresceindiacetat-konjugatet etter 60 minutter lik 195, mens den for det tilsarende fluoresceindipivilat-konjugat bare utgjør 55.
Eksempel 18: Undersøkelse av det cellulære opptak av det dobbeltmerkede oligonukleotid-konjugat 5'-Cy3-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-C6-FDA fra Eksempel 13
På "FACScan" viste Cy3-oligonukleotid-F3-konjugatet et hurtig opptak i REH-celle. Behandlingen av cellene med et oligonukleotid-konjugat / cellfektinkompleks gir et lignende, men lydelig mer uensartet opptak. Derved overlagrer virkningen av FDA-konjugatet seg tydelig på effekten av cellfektinoligonukleotidkomplekset.
Videre burde Ko-lokalisasjonen av de to forskjellige markørgrupper på oligonukleotidet ved inkubasjonen med cellene undersøkes for å utelukke at den målte fluorescens bare beror på avspaltet FDA, henholdsvis fluorescein. Cy3-oligonukleotid-F3-konjugatet inneholdt cyaninfargestoffet kovalent bundet på 5'-enden og FDA på 3'-enden. Figur 9 viser grønn- og rødfluorescensen etter 4 timers inkubasjon av REH-cellene med Cy3- oligonukleotid-F3-konjugatet. Da en kolokalisasjon av de to markører i cellene kan iaktas må man gå ut fra at oligonukleotidet ble opptatt i intakt form. Bare acetylgruppene i FDA-delen ble hydrolysert, antagelig av esteraser, da den ikke-fluoreserende FDA-rest åpenbart ble overført i den fluorescerende fluoresceinrest. Opptaket av Cy3/FDA-konjugatet skjedde meget hurtig, da de to markører allerede etter 7 minutter etter tilførselen kunne påvises.
Oligonukleotid-FDA-konjugatet KO_l fra Eksempel 4 ble testet ved 4 konsentrasjoner på den antiformerende virkning på A549-tumorceller. Konjugatet hemmet formeringen uten tilsetning av en penetrasjonsforsterker. Det tilsvarende oligonukleotid uten F3-konjugat (ON1) hemmet formeringen bare etter kompleksdannelse med en penetrasjonsforsterker (CellFectin, Fa. Gibco-BRL). Resultatene er vist i Tabell 4.

Claims (9)

1. Anvendelse av et aryl radikal med formel Fl og F3 til Fl 1
til hvilke et molekyl som skal transporteres, valgt fra gruppen bestående av et polynukleotid, et oligonukleotid og et mononukleotid er festet, for å transportere dette molekylet over en biologisk membran in vitro.
2. Anvendelse av et aryl radikal med formelen Fl og F3 til Fl 1
til hvilke et molekyl som skal transporteres, valgt fra gruppen bestående av et polynukleotid, et oligonukleotid og et mononukleotid er festet, for fremstilling av et medikament for forebygging og/eller behandling av sykdommer assosiert med ekspresjon eller overekspresjon av visse gener og/eller et diagnostisk middel for diagnose eller tidlig identifikasjon av slike sykdommer.
3. Anvendelse i følge krave 1 eller 2, hvor aryl radikalet (ene) er festet til 5' -terminalen, 3'-terminalen, heterosykliske basen, sukkeret eller internukleosid bindingen (bridge) og kan også være festet til ikke-nukleotid byggestener.
4. Fremgangsmåte for å transportere et molekyl over en membran in vitro,karakterisert vedat et aryl radikal er beskrevet i et hvilket som helst av kravene 1-3, til hvilke et molekyl som skal transporteres, valgt fra gruppen bestående av et polynukleotid, et oligonukleotid eller et mononukleotid er festet, blir inkubert med membranen.
5. Fremgangsmåte for transport av et molekyl inn i en celle in vitro,karakterisert vedat aryl radikal er beskrevet i et hvilket som helst av kravene 1-3, til hvilke et molekyl som skal transporteres, valgt fra gruppen bestående av et polynukleotid, et oligonukleotid eller et mononukleotid er festet, blir inkubert med cellen, hvoretter konjugatet blir transportert inn i cellen uten at aryl radikalet blir spaltet av.
6. Fremgangsmåte i følge krav 5,karakterisert vedat cellen er en eukaryot eller en prokaryot celle.
7. Fremgangsmåte i følge krav 5 eller 6,karakterisertv e d at cellen er en bakteriecelle, gjærcelle eller en pattedyrscelle.
8. Fremgangsmåte i følge ett eller flere av kravene 5 til 7,karakterisert vedat cellen er en human celle.
9. Fremgangsmåte i følge ett eller flere av kravene 5 til 8,karakterisert vedat cellen er en tumor celle.
NO20020367A 1999-07-28 2002-01-23 Anvendelse av konjugater, for transportering av molekyler via bisykliske membraner og for fremstilling av et medikament og/eller diagnostisk middel samt fremgangsmåte for transport in vitro NO334155B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19935302A DE19935302A1 (de) 1999-07-28 1999-07-28 Konjugate und Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zum Transport von Molekülen über biologische Membranen
PCT/EP2000/006936 WO2001008707A2 (de) 1999-07-28 2000-07-20 Konjugate und verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zum transport von molekülen über biologische membranen

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20020367D0 NO20020367D0 (no) 2002-01-23
NO20020367L NO20020367L (no) 2002-03-26
NO334155B1 true NO334155B1 (no) 2013-12-23

Family

ID=7916258

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20020367A NO334155B1 (no) 1999-07-28 2002-01-23 Anvendelse av konjugater, for transportering av molekyler via bisykliske membraner og for fremstilling av et medikament og/eller diagnostisk middel samt fremgangsmåte for transport in vitro

Country Status (32)

Country Link
US (1) US8420396B2 (no)
EP (1) EP1204430B1 (no)
JP (1) JP4791665B2 (no)
KR (1) KR100721696B1 (no)
CN (1) CN1227035C (no)
AR (1) AR029385A1 (no)
AT (1) ATE447413T1 (no)
AU (1) AU776114B2 (no)
BR (1) BR0012757A (no)
CA (1) CA2377977C (no)
CY (1) CY1109744T1 (no)
CZ (1) CZ2002300A3 (no)
DE (2) DE19935302A1 (no)
DK (1) DK1204430T3 (no)
EE (1) EE05303B1 (no)
ES (1) ES2335741T3 (no)
HR (1) HRP20020074B1 (no)
HU (1) HUP0201995A3 (no)
IL (2) IL147527A0 (no)
ME (1) MEP56408A (no)
MX (1) MXPA01013114A (no)
NO (1) NO334155B1 (no)
NZ (1) NZ516838A (no)
PL (1) PL202881B1 (no)
PT (1) PT1204430E (no)
RS (2) RS51447B (no)
RU (1) RU2275936C2 (no)
SI (1) SI1204430T1 (no)
SK (1) SK287654B6 (no)
TR (4) TR200200222T2 (no)
WO (1) WO2001008707A2 (no)
ZA (1) ZA200200657B (no)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US7026166B2 (en) * 2002-01-22 2006-04-11 Chiron Corporation Fluorogenic dyes
US7704756B2 (en) 2003-01-21 2010-04-27 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Fluorogenic dyes
US20070167388A1 (en) * 2003-09-11 2007-07-19 Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Campus Lübeck Nucleotide sequences promoting the trans-membrane transport of nucleic acids
CA2536139A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
EP1645288A1 (en) * 2004-10-07 2006-04-12 CTG Pharma S.r.l. New nuclear transcription factors regulators
KR100690199B1 (ko) * 2006-04-20 2007-03-12 이화여자대학교 산학협력단 구리 이온 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체, 이의제조방법 및 이를 이용한 생체 내 구리 이온 검출방법
RU2010112771A (ru) * 2007-10-09 2011-11-20 Коули Фармасьютикал ГмбХ (DE) Иммуностимулирующие аналоги олигонуклеотидов, содержащие модифицированные сахарные группировки
ES2605990T3 (es) 2010-12-29 2017-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de molécula pequeña para la administración intracelular de ácidos nucleicos
BR112016027236A2 (pt) * 2014-05-23 2017-10-17 Genzyme Corp porções de múltiplos oligonucleotídeos em veículo de peptídeo
EP3493855A4 (en) * 2016-08-02 2020-04-01 ISI Life Sciences, Inc. COMPOSITIONS AND METHOD FOR DETECTING CANCER CELLS IN A TISSUE SAMPLE
US20180036312A1 (en) * 2016-08-02 2018-02-08 ISI Life Sciences Inc. Novel Scaffolds for Intracellular Compound Delivery for the Detection of Cancer Cells
US10753942B2 (en) 2017-05-15 2020-08-25 Indicator Systems International, Inc. Methods to detect remnant cancer cells
US10539567B2 (en) * 2017-05-15 2020-01-21 Indicator Systems International, Inc. Biopsy methods and devices
KR20230096856A (ko) 2021-12-22 2023-06-30 한국과학기술연구원 신규 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 및 이의 용도

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8801070D0 (sv) 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
WO1995006659A1 (en) * 1992-07-01 1995-03-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6228982B1 (en) 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
FI115214B (fi) 1992-01-22 2005-03-31 Hoechst Ag Menetelmä oligonukleotidianalogien valmistamiseksi ja niiden käyttö
US6033909A (en) 1992-01-22 2000-03-07 Hoechst Aktiengesellschaft Oligonucleotide analogs, their preparation and use
US5633360A (en) * 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
RU2094059C1 (ru) * 1993-08-30 1997-10-27 Московский государственный университет, химический факультет Способ транспорта нейротропных препаратов в мозг
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
RU2127606C1 (ru) * 1994-12-23 1999-03-20 Санкт-Петербургский государственный университет Способ получения растворимых ковалентных конъюгатов
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5698411A (en) 1995-05-18 1997-12-16 Coulter Corporation Method for determining activity of enzymes in metabolically active whole cells
AU7737196A (en) * 1996-11-14 1998-06-03 Brigham And Women's Hospital Polyphosphoinositide binding peptides for intracellular drug delivery
GB9809084D0 (en) 1998-04-28 1998-06-24 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
DE19824535A1 (de) 1998-06-03 1999-12-09 Roche Diagnostics Gmbh Neue Rhodamin-Derivate und deren Verwendung
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
US6080580A (en) 1998-10-05 2000-06-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide modulation of tumor necrosis factor-α (TNF-α) expression
WO2000078791A2 (en) 1999-06-17 2000-12-28 Universiteit Gent FUNCTIONAL POLY-α-AMINOACID DERIVATIVES USEFUL FOR THE MODIFICATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MATERIALS AND THEIR APPLICATION

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20020074B1 (en) 2011-01-31
HUP0201995A2 (en) 2002-10-28
CA2377977A1 (en) 2001-02-08
ES2335741T3 (es) 2010-04-05
ATE447413T1 (de) 2009-11-15
EP1204430B1 (de) 2009-11-04
DE50015781D1 (de) 2009-12-17
NO20020367L (no) 2002-03-26
TR200200222T2 (tr) 2002-07-22
WO2001008707A3 (de) 2001-11-08
HRP20020074A2 (en) 2005-10-31
CN1360507A (zh) 2002-07-24
AU776114B2 (en) 2004-08-26
KR100721696B1 (ko) 2007-05-28
PL202881B1 (pl) 2009-07-31
NZ516838A (en) 2004-07-30
PT1204430E (pt) 2010-01-26
CN1227035C (zh) 2005-11-16
EE200200035A (et) 2003-04-15
YU90301A (sh) 2004-05-12
US8420396B2 (en) 2013-04-16
JP2003505517A (ja) 2003-02-12
DK1204430T3 (da) 2010-03-29
BR0012757A (pt) 2002-04-02
RU2275936C2 (ru) 2006-05-10
ZA200200657B (en) 2003-09-23
RS20100249A (sr) 2011-02-28
PL353069A1 (en) 2003-10-06
TR201109493T2 (tr) 2012-03-21
IL147527A (en) 2006-08-01
SK1172002A3 (en) 2002-08-06
DE19935302A1 (de) 2001-02-08
JP4791665B2 (ja) 2011-10-12
TR200706709T2 (tr) 2008-02-21
CY1109744T1 (el) 2014-09-10
SI1204430T1 (sl) 2010-03-31
AR029385A1 (es) 2003-06-25
TR201109491T2 (tr) 2012-02-21
CZ2002300A3 (cs) 2002-05-15
SK287654B6 (sk) 2011-05-06
NO20020367D0 (no) 2002-01-23
EE05303B1 (et) 2010-06-15
MEP56408A (en) 2011-05-10
WO2001008707A2 (de) 2001-02-08
IL147527A0 (en) 2002-08-14
KR20020031392A (ko) 2002-05-01
MXPA01013114A (es) 2002-06-04
EP1204430A2 (de) 2002-05-15
AU6825200A (en) 2001-02-19
US20080071069A1 (en) 2008-03-20
CA2377977C (en) 2011-09-20
RS51447B (sr) 2011-04-30
HK1047042A1 (en) 2003-02-07
HUP0201995A3 (en) 2005-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8420396B2 (en) Conjugates and processes for their preparation and their use for transporting molecules across biological membranes
US7897346B2 (en) Polyamide nucleic acid derivatives and agents, and processes for preparing them
ES2246318T3 (es) Derivados de acido peptidonucleico con carga negativa, agentes y procedimiento para su preparacion.

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees