NO336392B1

NO336392B1 - Middel for å forbedre immunologisk funksjon

Info

Publication number: NO336392B1
Application number: NO20071165A
Authority: NO
Inventors: Tohru Tanaka; Masao Kondo; Naomi Aiba; Setsuko Miyanari; Takaya Suzuki; Masahiro Ishizuka
Original assignee: Cosmo Oil Co Ltd; Sbi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-09-02
Filing date: 2007-03-01
Publication date: 2015-08-10
Also published as: CA2579032C; KR20070058583A; KR20100016341A; US20080026075A1; WO2006025286A1; CN101822661A; AU2005278649A1; CN101010076A; US8790712B2; CA2752569C; CN101010076B; EP2727589A1; EP1785132B1; EP1785132A1; EP1785132A4; EP2727589B1; CA2579032A1; AU2005278649B2; AU2005278649B8; NO20071165L

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et immunologisk funksjon-forbedrende middel som er istand til å øke resistens mot infeksjon og aldring, som er anvendbart for å forebygge eller behandle livsstilsykdommer slik som arteriosklerose, cancer og diabetes mellitus, abnorm pigmentering slik som flekker og fregner, inflammasjon i huden, begynnende aldring av huden og liknende.

Immunfunksjon er en grunnleggende funksjon som dyr innehar for å holde seg i live, ved selektivt å ekskludere et slikt tilfelle at et patogen eller liknende som er skadelig for deres eksistens invaderer kroppen eller at en cancer eller liknende genereres deri. Den immunologiske funksjonen gjennomføres ved gjensidig samarbeid og regulering hos forskjellige lymfocytter, makrofager, leukocytter og liknende som hovedsakelig er fordelt i tymus og også i milt, lymfe-knute, benmarg og liknende.

Et legemiddel som forbedrer den immunologiske funksjonen er anvendbart som et forebyggende eller terapeutisk middel for cancere, et terapeutisk middel for forskjellige autoimmune sykdommer og liknende, så vel som en medisin eller næringsmiddel for å øke resistens mot forskjellige infeksjoner og liknende. Det er slik at blant et stort antall aminosyrer, har glutamin og arginin virkningen med å forbedre immunologisk funksjon (patentreferanse 1).

I tillegg er det generelt kjent at aktive oksygener som er eksemplifisert ved superoksidradikal og hydrogenperoksid har cytotoksisitet og er årsaken til cancer, reumatisme, flekker, rynker og liknende. Det er også kjent at LDL som bærer kolesterol forandres til oksidert LDL ved hjelp av aktivt oksygen, og det forandrede oksiderte LDL blir en årsak til arteriosklerose.

Således, da det er ment at et farmasøytisk middel med antioksidasjonsvirkninger er anvendbart for å forebygge eller behandle livsstilsykdommer slik som ateriosklerose, cancer og diabetes mellitus, abnorm pigmentering slik som flekker og fregner, inflammasjon i huden, begynnende aldring av huden og liknende, har forskjellige komponenter med antioksidasjonsvirkning blitt funnet. Det er for eksempel kjent at antioksidasjonsvirkning kan bli funnet i naturlige substanser slik som vitamin E og vitamin C, syntetiske substanser slik som BHT (3,5-tert-butyl-4-hydroksytoluen) og BHA (2,3-tert-butyl-hydroksyanisol), rå-legemidler og liknende (patentreferanse 2).

På den annen side, blir helsefunksjon hos mennesker og dyr redusert ved utmattelse, sykdom, graviditet, aldring, ernæringsforstyrrelse eller dårlig ernæring. Denne utmattelse inkluderer fysisk utmattelse og mental utmattelse, og ikke bare fysisk utmattelse, men også mental utmattelse er i stor grad involvert i forbindelse med utmattelse hos nåtidens mennesker.

Blant disse anvendes et komplekst karbohydrat av sakkarider og stivelse og liknende som næring som er effektivt for den fysiske utmattelse. Også medikamenter anvendes og en vitamin B-gruppe, slik som vitamin Bi, vitamin B2og nikotinsyre, melantonin, vitamin C, vitamin E, magnesium og liknende.

I tillegg er det nylig blitt rapportert at aminosyrer med en spesifikk sammensetning inneholdende essensielle aminosyrer og ikke-essensielle aminosyrer har en virkning til å forbedre bevegelighetsfunksjon på utmattelsestidspunktet (patentreferanse 3). De essensielle aminosyrer inkluderer valin, leucin, isoleucin, lysin, treonin, metionin og liknende, og de ikke-essensielle aminosyrene inkluderer arginin, glutamin, prolin og liknende.

Patentreferanse 1: JP-A-2002-3372

Patentreferanse 2: JP-A-10-139678

Patentreferanse 3: JP-A-9-249556

Blant de aminosyrer som betraktes til å ha immunologisk funksjonsforbedrende virkning har imidlertid glutamin et problem ved at den har lav solubilitet og er ustabil, slik at den nedbrytes til glutaminsyre og ammoniakk i kroppen, og det er kjent at arginin har bivirkninger som å bevirke sår/sprukken hud, fortykning av huden, svelling av ledd og misdannelse av ben, slik at det er nødvendig å være forsiktig i forbindelse med inntak derav.

I tillegg er det problemer ved at vitamin E og vitamin C er sikre som naturlige substanser, men deres effekt som et antioksidasjonsmiddel er ikke tilstrekkelig, og BHT og BHA har en mulig fare med karsinogen egenskap, og liknende. Med hensyn til dem avledet fra rå-legemidler, er heller ikke deres effekt som et antioksidasjonsmiddel tilstrekkelig.

Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et middel for å forbedre immunologisk funksjon i dyr og mennesker og som kan tas i en lengre tidsperiode.

De foreliggende oppfinnere har således undersøkt de farmakologiske virkninger av forskjellige aminosyrer og funnet at 5-aminosyrer som eksemplifisert ved 5-aminolevulinsyre har utmerket immunologisk funksjonsforbedrende virkning, ved å øke vekten til tymus som er viktig som et vev som rommer immunologisk funksjon, og ved å fremme vekst av tymuscelle og cytotoksisk T-celle.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således de etter-følgende punkter (1) til (7).

1. Middel som omfatter en forbindelse representert ved den følgende formel (I)

hvori R<1>representerer et hydrogenatom, og

R2 representerer et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1 til 7 karbonatomer, eller et salt derav, for å forbedre immunologisk funksjon i dyr og mennesker med nedsatt immunologisk funksjon som skyldes fremskreden alder. 2. Middel ifølge punkt 1, hvori middelet er for å forbedre tymuscellevekst. 3. Middel ifølge punkt 1 eller 2, hvori middelet er et middel for å innta oralt, ved injeksjon, oftalmisk, som stikkpiller, varme omslag, plaster, aerosol, ved sonde eller enteralt. 4. Middel ifølge punkt 1, hvori middelet er et næringsmiddel eller en drikkevare. 5. Middel ifølge punkt 1, hvori middelet inntas i en mengde på fra 0,001 til 1000 mg per kg kroppsvekt per døgn. 6. Middel ifølge hvilket som helst av punktene 1 og 5, hvori middelet omfatter minst ett mineral. 7. Middel ifølge punkt 6, hvori det minst ene mineral er valgt fra gruppen som består av jern, kopper, selen, sink og mangan.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse, kan den immunologiske funksjonen til et dyr eller menneske hvis immunologiske funksjon er blitt redusert i forbindelse med aldring, forbedres slik at motstand mot infeksjon og liknende kan økes.

Kort beskrivelse av tegninger

Figur 1 er et bilde som viser fotografier av tymus hos en gruppe som har fått administrert 5-aminolevulinsyre og en gruppe som ikke har fått administrert 5-aminolevulinsyre. Figur 2 er et diagram som viser vekstkurven til en mus. Figur 3 er et diagram som viser vekstkurven til et svin som er alet opp.

En effektiv komponent i middelet for å forbedre immunologisk funksjon ifølge oppfinnelsen er en 5-aminosyre, et derivat derav eller et salt derav (heretter omtalt som "5-aminosyrer"). Eksempler på 5-aminosyrer inkluderer en 5-aminolevulinsyre som er representert ved den etterfølgende formel (I):

(i formelen representerer R<1>et hydrogenatom, og R<2>representerer et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1 til 7 karbonatomer, eller et salt derav (heretter også omtalt som "5-aminolevulinsyrer").

Det er kjent at 5-aminosyrer slik som 5-aminolevulinsyrer er anvendbare som fotosensibilisator i den fotodynamiske terapi (JP-T-2004-505105), som plantevekstregulator (JP-A-07-53487), et herbicid (JP-A-05-117110), en terapi for infeksjon med patogene mikroorganismer og parasitter i fisk (JP-A-2001-316255), en akselerator for vekst av svin (JP-A-2003-40770) og liknende.

Eksempler på alkylgruppen med fra 1 til 7 karbonatomer inkluderer en metylgruppe, en etylgruppe, en n-propylgruppe, en isopropylgruppe, en n-butylgruppe, en isobutylgruppe, en tert-butylgruppe, en n-pentylgruppe, en isopentylgruppe, en neopentylgruppe, en tert-pentylgruppe, en 2-metylbutylgruppe, en n-heksylgruppe, en isoheksylgruppe, en 3-metylpentyl-gruppe, en etylbutylgruppe, en n-heptylgruppe og en 2-metylheksylgruppe.

Eksempler på saltet av en 5-aminosyre eller et derivat derav inkluderer syreaddisjonssalter slik som hydroklorid, hydrobromid, hydrojodid, fosfat, metylfosfat, etylfosfat, fosfitt, hypofosfitt, nitratsulfat, acetat, propionat, toluensulfonat, suksinat, oksalat, laktat, tartrat, glykolat, metansulfonat, butyrat, valerat, citrat, fumarat, maleat og malat, metallsalter slik som et natriumsalt og et kalsium-salt, et ammoniumsalt, et alkylammoniumsalt og liknende. I denne forbindelse anvendes disse salter som en oppløsning eller et pulver ved bruk.

Den ovennevnte 5-aminosyre, eller salt derav kan danne et hydrat eller solvat, og kan anvendes alene eller som en eventuell kombinasjon av to eller flere.

5-Aminosyrene kan fremstilles ved hjelp av hvilke som helst av metodene for kjemisk syntese, mikrobiell fremstilling og enzymatisk fremstilling. I tillegg, blant de ovenfor angitte 5-aminosyrer, kan 5-aminolevulinsyrer fremstilles i henhold til metodene som er beskrevet i JP-A-48-92328, JP-A-62-111954, JP-A-2-76841, JP-A-6-172281. JP-A-7-188133, JP-A-11-42083 og liknende. 5-Aminosyrene fremstilt på den ovennevnte måten og de kjemiske reaksjonsoppløsninger eller fermenteringsoppløsninger kan, før deres rensing, anvendes som sådan uten at det gjennomføres separering og rensing, med den betingelse at de ikke inneholder skadelige substanser. I tillegg kan kommersielle gjenstander og liknende også anvendes.

Middelet ifølge oppfinnelsen er et middel for å forbedre immunologisk funksjon.

Spesifikt, som beskrevet senere i eksemplene, har de ovenfor angitte 5-aminosyrer virkningen med å forbedre den nedsatte immunologiske funksjon, ved å øke tymusvekt i en mus hvis immunologiske funksjon var nedsatt på grunn av fremskreden alder. Således er de ovenfor angitte 5-aminosyrer anvendbare som et immunforbedrende middel for dyr og mennesker som har nedsatt immunologisk funksjon på grunn av fremskreden alder. Som beskrevet over vedrører den foreliggende oppfinnelse et middel for å forbedre immunologisk funksjon, men i en snevrere betydning, er middelet for å forbedre den immunologiske funksjonen ifølge oppfinnelsen et tymuscellevekst-middel som er istand til å utvikle tymusceller i mus ved oral administrering derav til musen som vist i de senere eksempler. Også, i en enda snevrere betydning, er dette et cellulær T-celle vekstmiddel som gjør det mulig å utvikle cellulære T-celler i en mus ved oral administrering derav til musen som vist senere i eksemplene. En slik funksjon av 5-aminosyren i in vivo-legemet kan ikke forutsies og er derfor en anvendbar oppfinnelse for de kommende eldre i samfunnet.

Følgelig er de ovenfor angitte 5-aminosyrer anvendbare som et middel for å forbedre immunologisk funksjon i dyr og mennesker hvis helsefunksjon er nedsatt på grunn av aldring.

Også, med hensyn til middelet for å forbedre immunologisk funksjon ifølge oppfinnelsen, kan dets effekt videre forbedres når et mineral er inneholdt deri eller inntas samtidig dermed. Eksempler på et mineral inkluderer jern, sink, kobber, fosfor, kalsium, magnesium, kalium, selen, krom, mangan, jod, bor, silisium, vanadium, molybden, kobolt og liknende. Disse mineraler kan anvendes alene eller i kombinasjon av to eller flere. En hvilken som helst kjemisk egenskap hos mineralene kan anvendes så lenge den ikke skader organismen.

Om nødvendig, kan andre næringsstoffer, antioksidasjonsmidler og liknende tilsettes til det middelet for å forbedre immunologisk funksjon ifølge oppfinnelsen. Eksempler på næringsstoffene er essensielle aminosyrer, ikke-essensielle aminosyrer, vitaminer, interne faktorer slik som taurin, koenzym Q10 og a-lipoinsyre, urter, protein og forskjellige enzymer. Eksempler på antioksidantene inkluderer polyfenoler slik som ubikinon og ferulinsyre, flavonoider slik som N-acetylcystein, cystein, katekol, tokoferol, katekin og quercetin.

Middelet for å forbedre immunologisk funksjon ifølge oppfinnelsen kan også anvendes ved å la en bærer slik som en eksipiens få adsorbere et pulver av 5-aminosyrer, en vandig oppløsning fremstilt for å oppløse et pulver av 5-aminosyrer i vann, eller en 5-aminosyreinneholdende fermenterings-oppløsning fremstilt ved hjelp av den ovenfor angitte metoden. Typen av bærer kan være en vanlig substans og eksempler inkluderer krystallinsk cellulose, gelatin, stivelse, dekstrin, oljekake, bakegjær, ølgjær, sake-gjær, vingjær, skummet melkepulver, laktose, animalsk fett og plantefett og oljer, vannfritt kalsiumfosfat, kalsiumkarbonat, magnesiumstearat, aluminiummagnesiumsilikat og aluminiummagnesiummetasilikat.

Doseringsformene for middelet for å forbedre immunologisk funksjon ifølge oppfinnelsen inkluderer injeksjoner,

tabletter, kapsler, fine subtiler, siruper, stikkpiller,

oftalmiske oppløsninger, varme omslag, plastere og aerosoler. De kan fremstilles i overensstemmelse med de vanlige metodene ved eventuelt å anvende farmasøytisk aksepterbare bærere slik som et løsningsmiddel, et dispergeringsmedium, et fyllstoff

og en eksipiens. I tillegg kan disse inntas i form av et næringsmiddel og en drikkevare.

Når middelet for å forbedre immunologisk funksjon ifølge oppfinnelsen fremstilles som en vandig oppløsning, og når 5-aminosyren er 5-aminolevulinsyrer, er det nødvendig å ta en slik forholdsregel at den vandige oppløsning ikke blir alkalisk for det formål å forhindre nedbrytning av den aktive bestanddelen, 5-aminolevulinsyre. Når den blir alkalisk, kan nedbrytning av den aktive bestanddel forhindres ved å fjerne oksygen.

Middelet for å forbedre immunologisk funksjon ifølge oppfinnelsen kan være tilstrekkelig når den immunologiske funksjon kan forbedres ved å innta dette middel. Foretrukne betingelser er vist i det etterfølgende.

Skjønt dyret som er et formål for middelet for å forbedre immunologisk funksjon ifølge oppfinnelsen ikke er spesielt begrenset, er virveldyr slik som pattedyr, reptiler, fugler, amfibier og fisk foretrukket. Eksempler inkluderer mennesker, kveg, svin, sau, geit, mus, rotte, kanin, hund, katt, fjærfe, fasan, ferskvannsfisk slik som regnbueørret, karpe, ål, fjellørret, havfisker slik som sølvlaks, gulhale, flekkpagell, makrell og tunfisk, og organismer for fremvisning slik som tropiske fisker og reptiler.

Anvendelse av middelet for å forbedre immunologisk funksjon er mulig i et dyr ved fremskreden alder, men det anvendes foretrukket etter at økning av vekten av tymusvevet er opphørt. Det er foretrukket å anvende middelet for å forbedre immunologisk funksjon ved eller etter 15-års alderen, særlig foretrukket ved eller etter 30-års alderen, når det gjelder mennesker.

Skjønt metoden for å innta middelet for å forbedre immunologisk funksjon ifølge oppfinnelsen ikke er spesielt begrenset, vil eksempler inkludere oralt inntak, ved injeksjon, oftalmisk, ved stikkpiller, varme omslag, plaster, aerosol, ved sonde og ved enteralt inntak, og oralt inntak er særlig foretrukket.

Skjønt middelet viser tilstrekkelig effekt ved ett inntak, kan det inntas to eller flere ganger for ytterligere å forbedre effekten. De to eller flere gangene med inntak er effektive hva angår effekten per middel som skal inntas, og det er effektivt å anvende metoden for å innta i små porsjoner hvert døgn.

Inntaksmengden av middelet per en gang per 1 kg av dyret som skal behandles er foretrukket fra 0,001 mg til 1000 mg, mer foretrukket fra 0,001 mg til 100 mg og mest foretrukket fra 0,001 mg til 50 mg. Som den mengden av middel som inntas, kreves en større mengde når veksten er kraftig eller inntakshyppigheten er lav. Inntak som overskrider et passende område er ikke foretrukket, fordi det er uøkonomisk og har en mulighet for å bevirke sollysskade.

I tillegg, når mineraler anvendes sammen, kan de anvendes samtidig eller anvendes separat. Typen av mineral for anvendelse, en anvendelsesmetode derav og en anvendelses-mengde derav kan være de samme som dem for mineralene som generelt er i handelen. Bruksmengden er f.eks. fra 1 til 45 mg, foretrukket fra 5 til 20 mg pr døgn per voksen hannperson i tilfellet av jern. I tilfellet av kobber er den fra 0,5 til 10 mg, foretrukket fra 1 til 5 mg per døgn per voksen hannperson. I tilfellet av sink, er den fra 1 til 40 mg, foretrukket fra 5 til 20 mg. I tilfellet av mangan, er den fra 0,1 til 11 mg, foretrukket fra 2 til 8 mg. I tilfellet av selen, er den fra 10 til 250 ug, foretrukket fra 20 til 100 ug. I tilfellet av magnesium, er den fra 50 mg til 700 mg, foretrukket fra 100 til 500 mg.

Eksempler

Foreliggende oppfinnelse er beskrevet mer detaljert i de etterfølgende eksempler 1 og 2. De øvrige eksempler er angitt som referanseeksempler.

% betyr også vekt% dersom annet ikke er angitt.

Eksempel 1

Mus (35 til 45 uker gamle, BALB/cAJcl) som først var alet opp i 1 uke fikk injisert 10 mg 5-aminolevulinsyre (heretter omtalt som "ALA") hydroklorid per kg musevekt en gang per døgn og kontinuerlig i 7 døgn. ALA-hydroklorid ble innstilt i en konsentrasjon på 0,5 g/ml med destillert vann og ble administrert oralt til musen. Etter testen ble hver mus avlivet og vekten av dens tymus ble målt. Testen ble gjennomført ved å anvende 5 mus per 1 plott, og deres verdier er vist ved gjennomsnittsverdien. Resultatene er vist i tabell 1. I plottet behandlet med ALA-hydroklorid ble tymusvekten, som i stor grad har del i den immunologiske funksjon, signifikant økt i tilfellene i både hanndyr og hunndyr, og det ble bekreftet at effekten var påfallende uttrykt i spesielt hanndyr.

Eksempel 2

Mus (35 til 45 uker gamle, BALB/cAJcl) som først var blitt alet opp i 1 uke, fikk injisert 10 mg ALA-hydroklorid per 1 kg musekroppsvekt en gang per døgn i 7 døgn kontinuerlig. ALA-hydroklorid ble innstilt til en konsentrasjon på 0,5 g/ml med destillert vann og administrert oralt til musen. Etter testen ble hver mus avlivet og vekten av dens tymus og antall celler ble målt. I tillegg ble en subgruppe-test av lymfocytter gjennomført ved å anvende de oppnådde celler. Resultatene er vist i tabell 2 og tabell 3. Testen ble gjennomført ved å anvende 5 mus per 1 plott, og deres verdier er vist ved gjennomsnittsverdien. I plottet behandlet med ALA-hydroklorid ble tymusvekten, som i stor grad har del i den immunologiske funksjonen, økt både i tilfellene med hannmus og hunnmus, og antallet celler økte også signifikant sammenlignet med det ubehandlede plott (tabell 2). Også, da cellen CD4-CD8+ økte i det ALA-behandlede plott basert på undergruppe-testen, ble det bekreftet at den cytotoksiske T-celle øker etter dens fremtidige differensiering, slik at dens evne til å forbedre immunologisk funksjon ble vist (tabell 3). I tillegg er fotografier av tymusen i ubehandlet plott (ikke-administrert gruppe) og tymusen i ALA-behandlet plott (ALA-behandlet gruppe) vist i figur 1.

Eksempel 3

Mus (35 til 45 uker gamle, BALB/cAJcl) som på forhånd var

alet opp i 1 uke fikk injisert 10 mg AlA-hydroklorid per 1 kg musekroppsvekt en gang per døgn i 7 dager kontinuerlig. ALA-hydroklorid ble innstilt til en konsentrasjon på 0,5 g/ml med destillert vann og administrert oralt til musen. Etter

testen ble hver mus avlivet og musens tymus ble samlet for å måle superoksiddismutase (SOD)-aktivitet i vevet. Til den samlede tymus ble 1,0 ml 0,25 M sukkroseoppløsning tilsatt og blandingen ble homogenisert og deretter sentrifugert ved 10 000 g i 10 minutter og den oppnådde supernatantoppløsning ble anvendt som enzymoppløsning. Målingen ble gjennomført ved å anvende et emisjonsreagens for å måle antioksidantevne, MPEC (2-metyl-6-p-metoksyfenyletynylimidazopyrazinon)

(produsert av Atto Corp). Det vil si at 250 ul av en reak-sjonsoppløsning inneholdende 125 ul 0,1 M kaliumfosfatbuffer (pH 7,5), 10 ul av enzymvæsken, 60 ul 0,1 enhet/ml xantin-

oksidase, 45 ul destillert vann og 10 ul 0,3 itiM MPEC ble fordelt i Luminescencer-PSN (produsert av Atto Corp.), og 50 ul 0,72 itiM hypoksantin (pH 7,5) ble tilsatt for emisjon. For å beregne emisjonsinhiberingsforholdet, ble bufferen anvendt i stedet for enzymvæsken. For beregningen ble en kalibreringskurve fremstilt ved å anvende standard SOD, og konsentrasjonsberegningen ble gjennomført ved å anvende denne.

I tillegg ble glutationperoksidase (GPx)-aktivitet også målt. Etter at 0,6 ml av en reaksjonsblanding (inneholdende 0,05 M K-fosfatbuffer (pH 7,0), 1 mM NaN3, 1 mM EDTA og 4 mM GSH) var holdt ved holdt ved 37°C, ble 0,1 ml av 2 mM H202og 50 ul av enzymoppløsningen tilsatt i cellen til et spektrofotometer og det totale volumet ble innstilt til 1 ml, og scanningen ble gjennomført direkte ved hjelp av spektrofotometeret i 2 minutter (20 mm/min) ved en bølgelengde på 340 nm (OD ved 340 nm).

Beregning ble gjennomført ved hjelp av den etterfølgende formel ved å anvende den molekylære ekstinksjonskoeffisienten for NADPH på a = 6,3 cm2/umol, ved å beregne stigningen til den rette linjen AOD (AOD = Acm (størrelsen på forandring av y-akse) x OD Maks/full cm) fra diagrammet.

(V er et volum av reaksjonsoppløsningen, d = lysvei = 1 cm, v = mengde av enzymet, At = størrelsen på tidsforandring i min) .

Testen ble gjennomført ved å anvende 5 hannmus og 5 hunnmus, totalt 10 dyr, i hvert plott og verdiene ble vist som gjennomsnittsverdien. Resultatene er vist i Tabell 4. Det ble bekreftet at SOD-aktiviteten eller GPx-aktiviteten er forbedret både hos hannmus og hunnmus i det ALA-behandlede plottet.

Eksempel 4

Mus (35 til 45 uker gamle, BALB/cAJcl) som først var alet opp i 1 uke fikk injisert 10 mg ALA-hydroklorid per 1 kg musekroppsvekt en gang per døgn i 7 døgn kontinuerlig. ALA-hydroklorid ble innstilt i en konsentrasjon på 0,5 g/ml med destillert vann og administrert oralt til musene. Etter testen ble musene anbrakt i et bur på 20 cm x 20 cm gulv-areal, og dens bevegelsesavstand ble målt i 5 minutter. Testen ble gjennomført ved å anvende 5 hannmus og 5 hunnmus, totalt 10 dyr, for hvert plott, og verdiene ble vist ved gjennomsnittsverdi. Resultatene er vist i Tabell 5. Det ble bekreftet at bevegelsesavstanden er lang og forflytnings-kapasiteten er forbedret både hos hannmus og hunnmus i det ALA-behandlede plott. I tillegg, ble symptomer slik som abnorm stimulering og virkning ikke observert på de ALA-behandlede mus under testen.

Eksempel 5

Mus (35 til 45 uker gamle, BALB/cAJcl) som først var alet opp i 1 uke fikk injisert 10 mg ALA-hydroklorid per 1 kg musekroppsvekt en gang per døgn i 7 døgn kontinuerlig. ALA-hydroklorid ble innstilt i en konsentrasjon på 0,5 g/ml med destillert vann og administrert oralt til musene. Etter testen ble hver mus avlivet for å samle museblod, og ALA-dehydrase (ALAD)-aktivitet (den aktivitet av ALA hvori den dimeriseres og danner derved porfobilinogen (hetter omtalt som "PBG") som et molekylpyrrolsubstans) og porfobilinogen-deaminase (PBGD)-aktivitet (aktiviteten for å omdanne fra PGB til hydroksymetylbilan) per 1 ml av blodet måles. Sporet hvori ALA danner PBG og sporet hvori PBG omdannes til hydroksymetylbilan er en del av det viktige sporet i hemesyntese. Til 0,02 ml heparinbehandlet helblod fra mus ble 0,33 ml destillert vann tilsatt, blandingen ble innstilt til et totalt volum på 0,5 ml ved å tilsette 0,05 ml av 0,5 M Na-fosfatbuffer (pH 6,4), 0,05 ml av 0,1 M DTT (inneholdende 1 mM ZnS04) og 0,05 ml av 50 mM ALA-hydroklorid dertil og blandingen ble holdt ved 37°C i 30 minutter, reaksjonen ble stanset ved å tilsette 0,5 ml IM trikloreddiksyre og deretter ble Ehrlich-reagens tilsatt til en supernatant etter sentrifugering ved 3000 opm i det samme volum, og nøyaktig 10 minutter deretter ble absorbansen ved 553 nm, som er en karakteristisk absorbans for forbindelsen dannet ved reaksjonen av Ehrlich-reagensen med PBG, målt (OD) ved å anvende et spektrofotometer.

Beregning ble gjennomført på den følgende måte ved å anvende den molare ekstinksjonskoeffeisient 61000 for reaksjonsproduktet PBG oppnådd ved ALAD-aktiviteten. Reaksjonstiden ved 0 minutt ble anvendt som blindprøve (OD0) .

ALAD-aktivitet

= 1 M x (OD - OD0)/61000 x 2/1000 x 1/0,02 x 1 mol PBG/Ht/t

= 1,639 x (OD - OD0)/Ht umol PBG/ml RBC/t

(Ht representerer hematokrittverdi, RBC representerer erytrocytt og t representerer tid).

I tillegg ble RBGD-aktiviteten målt på følgende måte. Til 0,02 ml heparinbehandlet fullblod fra mus ble 0,38 ml destillert vann tilsatt, 0,05 ml av 0,6 mM PBG (inneholdende 0,38 M Na-fosfatbuffer (pH 7,8)) ble videre tilsatt dertil og blandingen ble holdt ved 37°C i 30 minutter. Reaksjonen ble stanset ved å tilsette 0,05 ml 5M trikloreddiksyre (inneholdende 0,8% jod) og deretter ble supernatanten, etter sentrifugering med 3000 opm i 5 minutter, direkte underkastet en måling av fluorescensintensitet ved en ekstinksjons-bølgelengde på 405 nm og en fluorescensbølgelengde på 597 nm, ved å anvende et spektrofluorometer.

Beregningen ble gjennomført ved proporsjonal beregning ved å anvende uroporfyrin I (URO) type isomer som er en standardsubstans av oksidasjonstypen uroporfyrinogen I.

Det vil si at,

FU (fluorescensintensitet for Em = 597 nm)

= 139 når standardsubstansen er 0,536 nmol URO/ml, følgelig blir

RBGD-aktivitet

= 0,536/139 x 0,5/0,02 x 2 x FU/Ht/t

= 0,192 x FU/Ht nmol URO/ml RBC/t

Testen ble gjennomført ved å anvende 5 hannmus per plott, verdiene er vist som gjennomsnittsverdi. Resultatene er vist i tabell 6. Det ble bekreftet at ALAD-aktivteten og PBGD-aktiviteten er forbedret i det ALA-behandlede plott.

Som beskrevet i det foregående, ble det funnet at aktivitetene for heme-syntesesporet (ALAD-aktivitet og PBGD-aktivitet) som utgjør hemeproteiner som viktige faktorer i det respiratoriske elektrontransportsystem er forbedret når ALA behandles. Det ble således ment at sitronsyresyklusen (TCA-syklus) som gjennomfører energimetabolisme i dyrekroppen blir aktivert ved aktiveringen av dette spor, og bevegelighetsfunksjonen ble forbedret derved.

Eksempel 6

Mus (35 til 45 uker gamle, BALB/cAJcl) som på forhånd var alet opp i 1 uke fikk injisert 10 mg ALA-hydroklorid per 1 kg musekroppsvekt en gang per døgn i 7 døgn kontinuerlig. ALA-hydroklorid ble innstilt i en konsentrasjon på 0,5 g/ml med destillert vann og administrert oralt til musene. Musen ble anbrakt i en roterende anordning for å måle bevegelighetsmengde (roterende kurv: 200 mm i diameter x 50 mm i bredde, "raising basket": W 90 mm x D 220 mm x H 90 mm, produsert av Shinano Seisakusho) og antallet rotasjoner i løpet av 16 timer ble målt før og etter testen. Testen ble gjennomført ved å anvende 1 mus per 1 roterende anordning for måling av bevegelighetsmengde, og ble gjennomført på hunnmus ved å anvende 5 ubehandlede dyr og 5 ALA-behandlede dyr som et plott, og verdiene er vist ved gjennomsnittsverdien. Resultatene er vist i Tabell 7. Det ble bekreftet at rotasjonsmengden var stor og bevegelighetskapasiteten ble forbedret i plottet behandlet med ALA.

Eksempel 7

Totalt 120 dyr (60 dyr for hver av hanndyr og hunndyr) som var omtrent 4 uker gamle av ddY-N-mus produsert av Nippon Ikagaku Dobutsu Shizai Kenhyusho Co., Ltd. ble fremskaffet og underkastet 1 ukes medisinsk undersøkelse for å bekrefte at deres helsetilstand er normal, og de ble deretter anvendt i testen. Testplottene ble fastsatt til totalt 4 plott av et kontrollplott hvori destillert vann for injeksjon administre-res inn i magen ved å anvende en magesonde i et forhold på 10 ml per 1 kg kroppsvekt til musen som skal testes i 28 kontinuerlige døgn, og 3 testplott hvori ALA-hydroklorid ble administrert på samme måte i forhold på henholdsvis 5 mg, 10 mg og 25 mg per 1 kg kroppsvekt til musen som behandles. Musene som skulle testes ble oppdelt i 12 grupper, 1 gruppe som inkluderer 5 hannmus eller hunnmus, på en slik måte at den gjennomsnittlige kroppsvekten i hver gruppe ble nesten homogen, og 3 grupper av hannmus eller hunnmus ble fordelt til hvert plott og alet opp i 28 døgn. Musene som skulle testes ble alet opp i hver gruppe ved å anvende en serie på 5 bur av rustfritt stål som var oppstilt i et oppalingsrom som var innstil til en romtemperatur på 23,0 + 2,0°C og en bestrålingstid på 12 timer/døgn. Økning i kroppsvekt ble beregnet ved å måle individuell kroppsvekt ved intervaller på 1 uke fra testens begynnelse.

Som et resultat, som vist ved vekstkurvene (gjennomsnitt av hannmus og hunnmus, figur 2) under testperioden, viste 10 mg/kg administreringsplottet overlegen vekst i forhold til 3 andre plott, og når kombinert med resultatene i Eksempel 6, ble bevegelighetsfunksjonen forbedret og vektøkningseffekt ble også funnet, slik at det ble funnet at dette er anvendbart som et helsefunksjonsforbedrende middel.

I denne forbindelse ble abnorm helsetilstand ikke funnet i de ALA-behandlede gruppene.

Eksempel 8

LW -D grisunger produsert på den samme dagen i en grisefarm ble innkjøpt tre ganger, hver gang av 14 dyr (7 dyr var kastrater og 7 hunndyr), og ble først alet opp i 9-12 døgn for å bekrefte at deres helse er normal, deretter ble 12 dyr (6 dyr hver av kastrater og hunndyr) valgt hver gang og anvendt i testen. Testplottene ble fastsatt til totalt 3 plott av et kontrollplott hvori et kontrollfor (tabell 8) uten tilsetning av ALA-hydroklorid tilveiebringes, og 2 testplott hvori 10 ppm eller 50 ppm ALA-hydroklorid er tilsatt til foret som tilveiebringes. Grisungene som ble testet ble oppdelt i 3 grupper, hver gruppe inkluderte 4 dyr (2 dyr var kastrater og 2 dyr hunndyr), på en slik måte at fordelingen av kroppsvekt ble nesten homogen, og en gruppe ble fordelt til hvert plott og alet opp i 6 uker. Svine-farmen som ble anvendt i denne testen var en svinefarm av åpen type hvori en grisebinge med 1,8 x 2,7 m betonggulv var ordnet i en rad på 14 binger, og gruppeforing ble gjennomført ved å anvende 3 tilgrensende grisebinger i hver blokk. Rishalm ble anvendt som underlag. En varmekasse anbringes i hver grisebinge i 3 uker etter testens begynnelse. For og drikkevann ble tilveiebrakt kontinuerlig. Kroppsvektøkning ble beregnet ved å måle individuell kroppsvekt ved intervaller på 1 uke fra testens begynnelse. Resultatene er vist i Tabell 8.

Som et resultat, som vist ved vekstkurvene (gjennomsnitt av kastrerte dyr eller hunndyr, figur 3) under testperioden, viste 10 ppm og 50 ppm tilsetningsplottene overlegen vekst i forhold til kontrollplottet, og når kombinert med resultatene i eksempel 6, ble bevegelighetsfunksjonen forbedret og vektøkningseffekt ble også funnet, slik at det ble funnet at det er anvendbart som et helsefunksjonforbedrende middel.

Note 3) I 1 kg, Mn 50 g, Fe 50 g, Cu 10 g, Zn 60 g, I 1 g Note 4) Komponentsammensetning er beregnet verdi

Eksempel 9

Totalt 300 kyllinger, henholdsvis 150 hannkyllinger og 150 hunkyllinger, av "broiler primary chicks" (Chunky) ble innkjøpt. Etter innkjøp ble kyllinger med unormalheter (svakheter eller svært små) ble ekskludert, resten ble utstyrt med vingebelter for individuell identifikasjon og deres kroppsvekter ble målt individuelt. Som vist i Tabell 10 ble hanner og hunner oppdelt i 3 grupper (45 kyllinger eller flere per 1 gruppe) basert på deres kroppsvekter, og ble fordelt til 3 grupper, hver på 15 kyllinger, som var vilkårlig i hver gruppe. Ved å anvende 15 hunnkyllinger eller hannkyllinger (30 kyllinger totalt) som en gruppe, ble de anbrakt i et "Chick Gird" oppstilt i en låve av lukket type, og oppvarmet ved å anvende en infrarød lampe for dyrebruk. Kyllinginnhegningen ble utvidet sammen med kyllingenens vekst. For og drikkevann ble tilveiebrakt kontinuerlig. Testgruppene ble fastsatt til totalt 3 grupper som inneholdt en kontrollgruppe hvori et kontrollfor (et standard forsøksfor SDB nr. 1 ble anvendt fra neonatal alder til 3 uker gamle, eller et standard forsøksfor SDB nr. 2 fra 3 uker gamle til 7 uker gamle, begge produsert av Nippon Formula Feed Mfg Co., Ltd., Tabell 9) uten tilsatt ALA-hydroklorid tilveiebringes, og 2 testgrupper av ALA-10 ppm-behandlet gruppe og ALA-50 ppm-behandlet gruppe hvori 10 ppm eller 50 ppm ALA-hydroklorid er tilsatt til foret tilveiebringes, og 3 repetisjonsplott ble oppstilt for hver gruppe. Antallet kyllinger for testing i hver testgruppe er som vist i Tabell 10. Testperioden ble fastsatt til 7 uker (7 uker gamle) fra nyfødtstadiet (starten på tilveiebringelse av for med tilsetning), og den totale kroppsvekten til hunner eller hanner ble målt for hvert repetisjonsplott på neonataltids-punktet og i intervaller på 1 uke i det etterfølgende. I tillegg ble omtrent 2 ml blod samlet fra en brakial-vene (vena basilica) hos hver av 18 kyllinger (3 hunnkyllinger eller hannkyllinger/repetisjon) i hver gruppe på 3 uker gamle og 7 uker gamle kyllinger, og omtrent 1,5 ml derav ble underkastet en behandling for å forhindre koagulasjon ved å anvende heparin-litiumsalt og deretter ble blodplasmaet separert for å inspisere bestanddelene LDH, GOT (AST), y-GTP, ALP, totalt protein, albumin, globulin, totalt kolesterol, triglyserid, glukose, urinsyre, totalt bilirubin, kreatinin, kalsium og uorganisk fosfor. Resultatene er vist i tabell 11 og 12. Som et resultat, med hensyn til kroppsvekt (gjennomsnitt av hunner eller hanner) under testperioden, ble forskjell i kroppsvekt hos nyfødte til 3 uker gamle kyllinger ikke funnet mellom testgruppen som vist i Tabell 11, men kroppsvekten ved og etter 3 uker i ALA-10 ppm-behandlet gruppe og ALA-50 ppm-behandlet gruppe ble større enn for kontrollgruppen. I tillegg, som et resultat av blodprøven, som vist i tabell 12, ble det funnet at y~GTP (gamma-glutamyltranspeptidase) avtok i ALA-10 ppm-behandlet gruppe og ALA-50 ppm-behandlet gruppe sammenlignet med kontrollgruppen, slik at det ble funnet at ALA har en effekt til å forbedre leverfunksjon og er derfor anvendbar som helsefunksjonsforbedrende middel.

I denne forbindelse, ble det i ALA-behandlede grupper heller ikke funnet unormalheter ved de generelle betingelser som ble anvendt under testperioden, og en unormalhet på grunn av tilsetning derav ble ikke funnet med hensyn til oppalings-forhold og funn ved patologisk autopsi.

Industriell anvendbarhet

I henhold til oppfinnelsen kan helsefunksjonen til et dyr eller menneske hvis helsefunksjon er redusert i forbindelse med aldring, forbedres.

Claims

1. Middel som omfatter en forbindelse representert ved den følgende formel (I)

hvori R<1>representerer et hydrogenatom, og R2 representerer et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1 til 7 karbonatomer, eller et salt derav, for å forbedre immunologisk funksjon i dyr og mennesker med nedsatt immunologisk funksjon som skyldes fremskreden alder.

2. Middel ifølge krav 1, hvori middelet er for å forbedre tymuscellevekst.

3. Middel ifølge krav 1 eller 2, hvori middelet er et middel for å innta oralt, ved injeksjon, oftalmisk, som stikkpiller, varme omslag, plaster, aerosol, ved sonde eller enteralt.

4. Middel ifølge krav 1, hvori middelet er et næringsmiddel eller en drikkevare.

5. Middel ifølge krav 1, hvori middelet inntas i en mengde på fra 0,001 til 1000 mg per kg kroppsvekt per døgn.

6. Middel ifølge hvilket som helst av kravene 1 og 5, hvori middelet omfatter minst ett mineral.

7. Middel ifølge krav 6, hvori det minst ene mineral er valgt fra gruppen som består av jern, kopper, selen, sink og mangan.