NO742545L - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av methyl-

cobalamin fra cyanocobalamin

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av methylcobalamin i industriell målestokk ut fra cyano-coba lamin. Methylcobalamin er en kjent forbindelse, og det er kjent at dette produkt avledes fra cyanocobalamin ved erstatning av cyano-gruppen (CN) med en methylgruppe (CH3). Methylcobalamin og cyanocobalamin anvendes innen medisinen ved behandlinger hvor der admini-streres vitamin B^^.

Tilpasning av methylcobalamin i form av injiserbare am-puller er imidlertid betydelig mere fordelaktig enn cyanocobalamin på grunn av methylcobalaminets méget storre opploselighet i vann.

Der er kjent en fremgangsmåte ved fremstilling av methylcobalamin. Ved den kjente fremgangsmåte reduseres cyanocobalamin (vitamin B12) under dannelse av redusert cobalamin (Bi2s)« Denne reduksjon utfores med natriurnborhydrid (NaBH^) i en atmosfære som ikke<i>nneholder oxygen, hvorefter dette réduserte cobalamin (B12s) omsettes med methyloxalat eller methyljodid for å feste methylgruppen til cobolt i det reduserte cobalamin v (B1, 2s)'.

På grunn av den dårlige stabilitet er det reduserte cobalamin B12stilboyelig til under reduksjonen, og særlig for festing av methylgruppen, å overfores delvis til cobalaminB12r, som er et mindre redusert cobalamin enn cobala<min>B s, og som er mindre istand ti 1 å feste methylgruppen.

For å unngå denne alvorlige ulempe som påvirker utbyttet av methylcobalamin, er det nddvendig å anvende overskudd av reduksjons-midlet. Dette forer til en annen ulempe, da man risikerer å angripe cobalaminmolekylet irreversibelt under dannelse av spaltningsprodukter som er til skade for enheten og utbyttet av methylcobalamin.

For å unngå overforing av cobalamin B^2g er der likeledes foreslått å utfore reaksjonen i nærvær av en inert gass, slik som argon. Imidlertid vil anvendelse av en slik gass komplisere betydelig operasjonene og oke prisen kraftig.

Foreliggende fremgangsmåte er ikke beheftet med disse ulem-per og gjor det mulig å overfore cyanocobalamin til methylcobalamin under betingelser slik at man betydelig begrenser risikoen for dannelse av redusert cobalamin som ikke er istand til å feste methylgruppen, eller for spaltningsprOdukter-av cobalamin.

Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen ved fremstilling av methylcobalamin ved hvilken, man utforer methylering av redusert cobalamin er kjennetegnet ved at man anvender en oppldsning inneholdende minst 40 g pr. liter cyanocobalamin i en blanding av methanol og vann, og at der til denne blanding tilsettes oxalsyremonomethylester og et metallpulver som ér istand til å frigi hydrogen ved innvirkning på oxalsyre-monomethylestere i den hensikt å samtidig utfore en reduksjon av cyanocobalamin og methylering av det reduserte cobalamin-ethyImethylcobalamin.

Den kjennsgjerning at reduksjon og methylering av cyanoco-ba lamin utfores samtidig ved hjelp av oxalsyre-monomethylester begrenser betydelig eksistensvarigheten av det reduserte cobalamin (B-^^s) som erholdes ved innvirkning av nascerende hydrogen som dannes ved reaksjonen mellom oxalsyre-monomethylesteren og metallpulveret, fordi det reduserte cobalamin methyleres efterhvert som det dannes. Fremgangsmåten kan utfores i nærvær av luft.

Reduksjons- og methyleringsreaksjonen kan illustreres ved folgende skjema:

hvor (1) betegner cyanocobalamin, (2) nascerende hydrogen dannet ved reaksjon av den frie syregruppe i oxalsyre-monomethylesteren og meta llpulveret, (3) betegner redusert cobalamin (B^g) sora straks methyleres av CH^-gruppen, (4) som stammer fra oxalsyre-monomethy1-esteren, under dannelse av methylcobalamin (5).

Samtidig med de ovenfor angitte reaksjoner hydrogeneres

CN gruppen fra cyanocobalamin (1) til methylamin ved folgende reaks j on:

Det fremgår efter skjemaet for denne reaksjon at det teo-retisk er tilstrekkelig ved reaksjonen mellom oxalsyre-monomethy1-esteren og metallpulveret å frigi 5 gramatomer nascerende hydrogen pr. grammolekyl cyanocobalamin. Imidlertid foretrekkes der å anvende overskudd av oxalsyre-monomethylester og metallpuIver.

Det under reduksjonen dannede methylamin forblir i reak-sjonsmi1joet, og dets methylgruppe innvirker overhodet ikke på methyleringsreaksjonen.

Man vil imidlertid på den annen side kunne frykte at CN-gruppen som frigis under reduksjonen,, skulle innvirke på methy ler-ingsreaks jonen.

Blant de metallpulvere som er istand til å frigi hydrogen ved innvirkning på oxalsyre-monomethyles ter foretrekkes der å anvende zinkpulver.

Man har konstatert at for å utfore reduksjonen og methyleringen av cyanocobalamin er det nodvendig at konsentrasjonen av cyanocobalamin i reaksjonsmediet må være over 40 g/l. En slik konsentrasjon er det umulig å oppnå i ren methanol eller vann, da opploseligheten av cyanocobalamin i de to opplosningsmidler er hen-holdsvis 20 og 13 g/l. Man har ikke desto mindre konstatert den overraskende effekt at opploseligheten av cyanocobalamin oker i en blanding av methanol og vann og når et maksimum når mengden av vann i methanol er lik 8 volum% og når opp til 160 g/l for denne mengde.

Det er imidlertid uhensiktsmessig å operere med en slik konsentrasjon av cyanocobalamin, idet de gunstige betingelser for opp løseligheten, reduksjonen og methyleringen oppfylles når den an-vendte blanding av methanol og vann inneholder mellom 7 og 15 % vann.

Ifolge en foretrukken utforelsesform av fremgangsmåten opprettholdes reaksjonsmiljoet ved en temperatur mellom 28 og 32°C.

Det er et foretrukket trekk å holde reaksjonsmi1joet mellom de angitte temperaturgrenser. Hvis temperaturen er over 32°C, vil reduksjonsreaksjonen være tilboyelig til å forlope for fort, slik at man risikerer å spalte cobalaminmolekylet.

Hvis på den annen side temperaturen er lavere enn 28°C, forloper reduksjonen og methyleringen for sakte*og ufullstendig, hvilket er uheldig for utbyttet av sluttproduktet.

Ifolge et annet foretrukket trekk ved fremgangsmåten til-, settes reaksjonsmiljoet coboltsalter.

Slike coboltsalter kan f.eks. være coboltklorid, ■ cobolt ni-trat eller coboltoxalat, som katalyserer reduksjonsreaksjonen og re-gulerer pH i reaksjonsmiljoet.

Ved å anvende de angitte betingelser kan man nesten kvanti-tativt overfore cyanocobalamin til methylcobalamin. Man kan folge

reaksjonsforlopet visuelt ved hjelp av et spektrofotometer. Oppløs-ningen av cyanocobalamin som i begynnelsen er rod, går over til fio-lett og derefter til kastanjebrun eftersom cyanocobalamin overfores til methylcobalamin.

Den blå-gronne farve som er beskrevet i litteraturen, og som tilskrives dannelse av redusert cobalamin Bn12„ s fremkom ikke, hvilket utgjor et bevis på at denne forbindelse ved foreliggende fremgangsmåte har ,en meget kort levetid på grunn av at den methyleres umiddelbart efter sin dannelse.

Når reaksjonen er avsluttet, filtreres reaksjonsmiljoet for å fjerne overskudd av zink og dannede uopploselige zinksalter.

Man utfeller derefter methylcobalamin i filtratet med fire volum aceton, filtrerer og opploser det utfeldte methylcobalamin på-nytt i en blanding av like mengder aceton og vann.

Den erholdte opplosning kan derefter krystalliseres direkte, men renses forst fortrinnsvis ved passering gjennom hensikts-messige kromatigrafiske kolonner.

Ifolge en variant av fremgangsmåten fores oppløsningen av cyanocobalamin, vann, methanol og oxalxyre-monomethylester gjennom en kolonne inneholdende metallpulver,og hydroxocobalamin separeres fra oppløsningen som gjenvinnes ved utlopet av kolonnen.

Omdannelsen av cyanocobalamin til methylcobalamin utfores således kontinuerlig i kolonnen i kontakt med metallpulveret som frigir nascerende hydrogen, idet det reagerer med oxalsyre-monomethylesteren.

Denne kontinuerlige operasjonsmetode gjor det mulig å hoyne utbyttet av methylcobalamin, og tillater likeledes anvendelse av en stdrre mengde cyanocobalamin i hver operasjon.

Ved endt reaksjon er det ikke nødvendig å filtrere oppløs-ningen som gjenvinnes ved utlopet av kolonnen.. Denne kan direkte anvendes ved separasjonsoperasjonene og rensningen av methylcobalamin.

Som ved den fdrste utforelsesform inneholder blandingen av methanol og vann fortrinnsvis mellom 7 og 15 % vann, idet opplosningen av cyanocobalamin tilsettes salter av cobolt, slik som coboltklorid, coboltnitrat eller coboltoxalat.

De efterfolgende to eksempler illustrerer fremgangsmåten ved fremstilling av methylcobalamin ut fra cyanocobalamin.

Ekse mpel 1

100 g cyanocobalamin oppløses i 2 liter methanol og 200 ml vann. Oppløsningen er fullstendig klar med en karakteristisk rod farve.

Til denne opplosning tilsettes 200 g oxalsyre-monomethylester, 30 g coboltklorid, hvorefter den erholdte blanding bringes til 28°C og holdes ved denne temperatur. Der tilsettes derefter 300 g zinkpulver.

Reduksjons- og methyleringsreaksjonene starter. Reaksjonene er eksoterme, og reaks jonsmi ljoet avkjoles .for å holde dette på

en temperatur under 32°C. Man lar reaksjonene forlope i 1 time,,

mens reaksjonsmiljoet holdes under omroring. Dette reaksjonsmiljo får efter endt reaksjon en kastanjebrun farvNe. Den resulterende blanding filtreres for å fjerne zink eller dannede zinksalter som er uopploselige i reaksjonsmiljoet. Til filtratet tilsettes 4 volumer aceton for å utfelle methylcobalamin. Blandingen filtreres, og. det utfeldte methylcobalamin oppldses i. en blanding av like mengder vann og aceton.

Den resulterende opplosning fores derefter gjennom en kolonne inneholdende en harpiks .sammensatt av kuleformige polymerperler inneholdende utvekslingsplasser for kationer og anioner, slik som harpiksen med varemerke "Retardion AG 11 A8" som markedsføres av-Bio-Rad,for å fjerne zinkionene, coboltionene etc. fra opplosningen, og derefter gjennom en kolonne med blandede skikt sammensatt av 3 volumer av en sterkt basisk [N^CH^) 3+ anionbytterharpiks, slik som harpiks IRA 400 fra Rohm & Haas, og T volum av en sulfonsyreharpiks, kationbytter, slik som '!Amberlite IRC 120"fra Rohm & Haas, for å fjerne ikke overfort cyanocobalamin eller- de for meget reduserte cobalaminer.

Efter rensning får opplosningen krystallisere efter til-setning av aceton. Der erholdes således 65 g methylcobalamin.

Absorpsjonsspektret til en fortynnet opplosning inneholdende methylcobalamin utviser maksima ved 267, 343 og 520 millimicron, tilsvarende det som erholdes med rent methylcobalamin.

Den spesifikke motstand til en opplosning i demineralisert vann med en konsentrasjon på 5 microgram pr. cm 3 methylcobalami. n erholdt ifolge dette eksempel er over 10.000 ohm/cm, som viser at det erholdte methylcobalamin ikke bibeholder ioner som skriver seg fra det zink og cobolt som tilfores reaksjonsmiljoet.

Som dette eksempel viser er fremgangsmåten ved fremstil-

ling av■methylcobalamin ut fra cyanocobalamin en meget bekvem frem-stillingsmåte.

Der erholdes et methylcobalamin som er helt rent som folge

av en regulert reduksjon av cyanocobalamin ved hjelp av en forbindelse, oxalsyre- monomethylester, som spiller en dobbeltrolle, idet den på samme- tid er en. syre som er istand til å frigi nascerende

o

hydrogen ved omsetning med zinkpulver, og et middel istand til å sikre methylering av redusert cobalamin.

Det meget gode utbytte av methylcobalamin forklares på den annen side av det faktum at opplosningen inneholder ved starten en betydelig konsentrasjon av cyanocobalamin, hvilket muliggjores tak-ket være et klokt valg av opplosningsmidde1 som utgjores av en blanding av methanol og vann.

Eksempel 2

200 g cyanocobalamin oppldses i 4 liter methanol og 400 cm 3 destillert vann. Når opplosningen er fullstendig, tilsettes 400 g oxalsyre-monomethyleiter og 100 g coboltklorid, og der omrores inntil der erholdes en klar opplosning."

Man fyller en kolonne, anbragt vertikalt, med en hoyde på

1 m og en diameter på 3 cm med zinkpulver til en hoyde på 80 cm.

For å vaske og preparere kolonnen sirkuleres forst gjennom denne fra bunnen, mot topp 1 liter av en opplosning av methanol inneholdende 10 volum% vann. Derefter sirkuleres gjennom kolonnen fra bunnen mot topp opplosningen av cyanocobalamin med en hastighet på ca. 1 liter pr. time.

Ved kolonnens utldp oppsamles opplosningen i en beholder-anbragt beskyttet mot lys.

Hele den fremstillede opplosning fores gjennom kolonnen, og man kan gjenta operasjonen ved anvendelse av en opplosning iden-tisk med den foregående.,

Spektrofotometriske analyser-utfort på den oppsamlede opplosning efter passasje gjennom kolonnen viser at man erholder 175 g methylcobalamin ut fra 200 g cyanocobalamin, hvilket er et utbytte lik 87,5 %.

For å separere methylcobalaminet fra den oppsamlede opplosning og for å rense produktet går man frem som folger: Opplosningen fores gjennom en kolonne inneholdende en harpiks med betegnelsen<u>Retardion AG 11 AS", markedsfort av firmaet Bio-Rad, sammensatt av polymerperler inneholdende utvekslingsplasser for kationer og anioner for å fjerne zinkioner og coboltioner fra opplosningen.

o

Opplosningen fores derefter gjennom en kolonne med sammen-satte skikt bestående av 3 volumer av en sterkt basisk anionisk xonebytterharpiks inneholdende gruppene N(CH3) 3+, slik som harpiks IRA 400 fra firmaet Rohm & Haas, og 1:. volum av en sulfonsyreharpiks, kationbytter, slik som harpiksen "Amberlite IRC 120" fra firmaet Rohm & Haas, for å fjerne ikke omdannet cyanocobalamin eller de for sterkt reduserte cobalaminer.

Efter rensning får opplosningen krystallisere efter tilset-ning av aceton.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av methylcobalamin ut fra cyanocobalamin, ved hvilken der utfores en methylering av redusert cobalamin, karakterisert ved at der anvendes en opplosning inneholdende minst 40 g pr. liter cyanocobalamin i en blanding av methanol og vann, og at der til denne opplosning tilsettes oxalsyre-monomethylester og et metallpulver som er istand til å frigi hydrogen ved innvirkning på oxalsyre-monomethylesteren for således å samtidig bevirke en reduksjon av cyanocobalamin og en methylering av det reduserte cobalamin til methylcobalamin.

2. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at der anvendes en blanding av methanol og vann inneholdende mellom 7 og 15 % vann.

3. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at reaksjonsmiljoet opprettholdes ved en temperatur mellom 28 og 32°C.

4. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at der til reaksjonsmiljoet tilsettes coboltsalter valgt fra oxalatet, klori-det, og nitratet av cobolt.

5. Fremgangsmåte ifolge krav 1,' karakterisert ved at der som metallpulver anvendes zinkpulver.

6. Fremgangsmåte ifolge krav 1 eller. 2, karakterisert ved at opplosningen av cyanocobalamin, vann, methanol og oxalsyre-monomethylester fores gjennom en kolonne inneholdende metallpulveret, og at methylcobalaminet separeres fra opplosningen som oppsamles ved kolonnens utlop.