NO770095L - Fremgangsm}te for stabilisering av forbindelser, s{rlig biologisk aktive forbindelser, og anordning for utf¦relse av fremgangsm}ten. - Google Patents

Description

"Fremgangsmåte for stabilisering av forbindelser,

særlig biologisk aktive forbindelser, og

anordning for utførelse av fremgangsmåten"

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for stabilisering av forbindelser, særlig biologisk aktive forbindelser, og eri anordning som er egnet for utførelse av fremgangsmåten og for å foreta biologiske undersøkelser.

For identifikasjon av mikroorganismer er det ofte nød-vendig å bestemme virkningen av forskjellige biologisk aktive stoffer på deres vekst* Dette er særlig viktig når det gjelder antibiotiske stoffer, hvor kjennskap til den mengde eom er nød-vendig for å hemme veksten, er av betydning for terapeutisk anvendelse. Den klassiske metode for bestemmelse av denne minimum hemmende konsentrasjon (MIC) er å gjøre i stand en serie rør inneholdende et flytende kulturmedium, med en forskjellig mengde antibiotisk stoff i hvert rør. Efter podning med mikro-organismen og inkubering kan MIC bestemmes fra det rør med den laveste antibiotlka-konsentrasjon hvor det ikke har funnet sted noen vekst.

Alternative metoder omfatter enten fremstilling av agarplater inneholdende en serie av antibiotika-konsentrasjoner eller rene agarplater på hvilke de antibiotiske stoffer får diffundere fra papirstykker impregnert med de antibiotiske stoffer. Alle tre metoder krever dyktighet og betydelig innsats for sin ut-førelse, og eftersom noen antibiotiske stoffer ikke er stabile

i kulturraediet, må mediene fremstilles umiddelbart før bruk. Forskjellige metoder er foreslått for å redusere arbeidet med å foreta antibiotiske følsomhetsprøver.

US-patent 3.416.998 beskriver en fremgangsmåte i henhold til hvilken flere prøveforbindelser så som kjemoterapeutiske midler, blandes med en 1,5% vandig oppløsning av agar. Den erholdte blanding helles på en plate for å danne et forholdsvis tytt lag som derefter tørres. De tørrede lag kan oppdeles i mindre stykker som inneholder en konstant mengde materiale pr. flate-enhet av laget. Små skiver av dette materiale kan tilføres til bakteriekulturer,, og den aktive bestanddel får diffundere inn i ; kulturraediet. Forbindelsens innvirkning på veksten av bakteriene

kah derefter målesi Denne metode er imidlertid brysom, og resultatene har en tendens til å variere betraktelig.

Nederlandsk patentahsøkning 6917655 beskriver en fremgangsmåte for å måle veksten og fysiologien av bakterier ved innføring av en kjemisk forbindelse så som aminosyrer eller andre forbindelser som fremmer veksten av bakterier, inn i en opp-løsning av et.inert, høymolekylært materiale og sette denne blanding til forskjellige rør for å oppnå lag av materiale. På

et senere trinn tilsettes et podestoff, og veksten måles der-ef ter. En vandig oppløsning av agar eller en 1% oppløsning av polyakrylamid anbefales som stabilisatorer for den kjemiske forbindelse.

En ulempe ved den ovenfor beskrevne metdde er at det av-satte lag av kjemisk forbindelse som er innført i stabilisatoren, er forholdsvis tykt og har utilstrekkelig mekanisk stabilitet.

En annen ulempe er at eh forholdsvis stor mengde stabilisator anvendes. I noen tilfeller påvirker denne store mengde stabilisator preparatet og egenskapene for vasken i røret.

En fremgangsmåte som omfatter anvendelse av papirstykker impregnert med antibiotika, er gjenstand for nederlandsk patent-ansøkning 7205619, som omfatter anvendelse av et papirstykke som en bærer som er impregnert med et antibiotisk stoff som anbringes på en agarplate. Det antibiotiske stoff diffunderer fra papiret til agaren og gir en konsentrasjonsgradient. Standardisering av denne metode medfører problemer, og de-oppnådde resultater varierer betraktelig fra en operatør til en annen.

Fransk patent 1.488.866 og nederlandsk patentansøkning 7211868 beskriver en anordning for bestemmelse av mikroorganismers følsomhet i nærvær av forskjellige antibiotiske stoffer. De kjemiske forbindelser og organismen som skal undersøkes, er til stede i lyofilisert form som gjør dem følsomme overfor mekanisk tap og fører til upålitelige resultater.

Det foreligger således et behov for en enkel. Økonomisk og effektiv metode for stabilisering av meget små mengder av nøyaktig forhåndsporsjonerte mengder av spesielle biologisk aktive stoffer i både mekanisk og kjmmisk stabil form.

Vi har nu funnet frem til en fremgangsmåte for stabilisering av små mengder av biologisk aktive stoffer, som unngår i stor utstrekning mange av de vanskeligheter man tidligere har støtt på ved fremstilling av egnede systemer for bestemmelse av deres virkninger på bakterievekst*og som er i overens-stemmelse med de kjente krav for tilfredsstillende mikroorganisme-kulturer.

Fremgangsmåten for stabilisering av forbindelser i henhold til oppfinnelsen omfatter: a) fremstilling av en blanding inneholdende minst én komponent som skal stabiliseres, et filmdannende stabiliseririgsmiddel og et oppløsningsmiddel; b) porsjonering av en liten mengde av blandingen på en fast overflate; og c) avdampning av oppløsningsmidlet for å danne en sammenhengende, tørret film som henger fast på nevnte faste

overflate og har en tykkelse på ikke over 50 mikron.

Med stabilisering menes her både en mekanisk stabilisering og en kjemisk stabilisering mot f.eks. hydrolyse, pH-variasjoner, ioniske variasjoner, høy temperatur osv.

Forbindelsen som skal stabiliseres, kan være en hvilken som helst forbindelse, særlig biologisk aktive forbindelser,

så som antibiotika, som er følsomme overfor varme, tilstede-værelse av fuktighet, ekstreme pH-betingelser osv.

Som stabilisator kan man anvende en rekke forskjellige materialer med filmdannende egenskaper, så som agar, cellulose-derivater eller fortrinnsvis proteinholdige materialer så som gelatin, kasein,eller storfe-albumin. For medisinske formål foretrekkes fortrinnsvis gelatin fordi

a) den er en amfolytt med god bufferkapasitet}

b) den er forholdsvis oppløselig i relativt kald oppløsning, hvilket er en stor fordel når termolabile forbindelser

skal innføres deri}

c) den er et generelt godtatt mikrobiologisk medium}

d) den er et godt filmdannende materiale.

Oppløsningsmidlet som anvendes, kan prinsipielt være et hvilket som helst oppløsningsmiddel. For medisinske formål foretrekkes vanligvis destillert vann for freastilling av vandige oppløsninger av stabiliseringsmidlet og forbindelsen som skal stabiliseres. Framstilling av slike oppløsninger og alle på-følgende trinn utføres fortrinnsvis under den temperatur ved hvilken noen av blandingens komponenter påvirkes.

Volumet og konsentrasjonen av de porsjoner av blandingen av stabilisator og forbindelse som skal stabiliseres, velges slik at materialet som avsettes på den faste overflate- gir efter tørring filmer med en tykkelse på ikke over 50 mikron. Egnede voluramengder og konsentrasjoner kan lett bestemmes i hvert enkelt tilfelle for å oppfylle kravene til filmtykkelse, sammenheng og vedheng til den faste overflate..

Egnede oppløsninger av stabiliseringsmidlet, f.eks. gelatin, inneholder stabiliseringsmidlet i en konsentrasjon som vanligvis ligger mellom 0,001 og 0,5% vekt/volum, fortrinnsvis mellom 0,01.og 0, 1% vekt/volum og særlig mellom 0,01 og 0,03% vekt/volum.

Ved anvendelse av en anordning som beskrevet nedenfor, utporsjoneres volummengder på 1 til 500 mikrollter, fortrinnsvis 10 tii 100 mikrollter av en oppløsning av blandingen av stabilisator og forbindelse som skal stabiliseres> på den faste overflate.

Oppløsningen som skal utporsjoneres*fremstilles vanligvis ved å blande passende volummengder av oppløsningene av

stabiliseringsmiddel og forbindelse som skal stabiliseres, eventuelt med regulering av pH-verdien til den ønskede verdi, og hvis nødvendig, sterilisering.

For å oppnå den nødvendige mekaniske stabilitet, dvs. godt vedheng til den faste overflate efter tørring, bør filmene ha en tykkelse fra 0,01 til 50 mikron, fortrinnsvis fra 0,01 til 5 mikron, og ideelt fra 0,3 til 1 mikron. Det er viktig at de tørrede filmer har en tykkelse innenfor det angitte område, eftersom sammentrekning av tykkere filmer under tørringen forårsaker løsning ved kantene og tap av mekanisk stabilitet.

Til en viss grad er filmens vedhengsevne avhengig av geometrien av den faste overflate som blandingen utporsjoneres på. '

Det synes å være liten eller ingen forskjell med hensyn til de erholdte tynne filmers oppførsel overfor forskjellige syntetiske plastmaterialer så som polyetylen, polystyren, polykarbonat, polyvinylklorid, polymetakrylat eller polytetra-fluoretylen.

Tørreprosessen krever også en viss"oppmerksomhet.

Nyttige, tørrede filmer dannes ved fjernelse av oppløsningsmidlet som kan være et hvilket som helst oppløsningsmiddel, men som vanligvis er vann, ved lufttørring eller fortrinnsvis under redusert trykk. Det foretrekkes at tørringen utføres under slike betingelser at væsken ikke koker eller fryser, eftersom koking kan medføre mekanisk svekkelse, og frysetørring gir ikke en sammenhengende film. Ved anvendelse av vann som oppløsningsmiddel holdes væsken fortrinnsvis mellom 5 og 30°C, og vakuumet er på ca. 20 Torr.

En meget nyttig anvendelse av den ovenfor beskrevne metode for stabilisering av forbindelser er fremstilling av en anordning som er nyttig for utførelse av biologiske undersøkelser,

særlig bestemmelse av minimum hemmende konsentrasjon av antibiotiske stoffer mot patogene mikroorganismer. En nyttig anordning som anvendes for slike bestemmelser,, består av en rekke av flere rader av fordypninger eller brønner inneholdende en sammenhengende, tørr film med en tykkelse på ikke over 50 mikron,

av minst én forbindelse som skal stabiliseres, innarbeides i et filmdannende stabiliseringsmiddel, som henger fast på brønnenes indre overflate..

Forbindelsen som skal stabiliseres, kan være en hvilken som helst forbindelse, særlig en biologisk aktiv: forbindelse så som et antibiotisk stoff.

Stabiliseringsmidlet kan være et hvilket som helst filmdannende stoff. Når det skal anvendes for medisinske formål, foretrekkes et protelnholdig materiale så som gelatin, eller serum-storfe-albumin.

Brønnene kan inneholde samme eller forskjellige forbindelser' i samme konsentrasjon eller i forhåndsbestemte'konsentrasjoner som varierer fra brønn til brønn.

Filmene fremstilles ved å følge fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Anordningen kan dekkes med en vedhengende folie og kan

lagres ved omgivelsestemperatur i flere måneder inntil den skal .brukes. •

Anordningen kan fremstilles av et hvilket som helst materiale. Et syntetisk materiale så som.polystyren er særlig .

egnet.

En særlig foretrukket utførelsesform a<y>anordningen består av rektangulære plater på ca. 12 x 8 x 1,5 cm, som hver inneholder et arrangement av 8 rader av 12 sirkelformige brønner,

0,5 cm i diameter og 1 cm dype, med halvkuleformet bunn (se fig. 1). Fortynninger av den kjemiske forbindelse som skal undersøkes,

i oppløsning med stabiliseringsmidlet utporsjoneres i de første 10 brønner i raden, mens de siste 2 brønner bare får porsjoner av stabiliseringsoppløsningen. Volum, konsentrasjon av stabiliseringsmidlet og den kjemiske forbindelse og overflatearealet som oppløsningen utporsjoneres på, velges slik at efter tørring

dannes filmer med en tykkelse fra 0,01 til 50 mikron, fortrinnsvis frå 0,01 til 5 mikron og ideelt fra 0,3 til 1 mikron, på bunnen

av brønnene.

Efter tilsetning av blandingen og stabilisator og den kjemiske forbindelse som skal undersøkes, og tørring med luft eller vakuum, kan anordningen dekkes med en vedhengende folie eller lamineres og lukkes for å beskytte den fra omgivelsene.

Det er her særlig beskrevet anvendelse av oppfinnelsen for stabilisering av biologisk aktive forbindelser. Det skal imidlertid forstås at oppfinnelsen også omfatter stabilisering av eventuelle andre stoffer ved åpenbare variasjoner av den beskrevne fremgangsmåte.

De følgende eksempler skal tjene til å illustrere oppfinnelsen ytterligere.

Eksempel I

Oppløsninger av de angitte antibiotiske stoffer, i de angitte konsentrasjoner, ble fremstilt i destillert vann ved romtemperatur:

Oppløsningene ble sterilisert i kald tilstand ved å bli ført gjennom et passende filter, og hver ble fortynnet med et likt volum av en 0,05% vekt/volum oppløsning av gelatin «v god kvalitet ("bloom^-tall 200) i destillert vann ved romtemperatur, som på forhånd var regulert til pH 7 og sterilisert i en autoklav i 15 minutter ved ét trykk på 1,05 kg/cm 2. Fra hver slik antlbiotika-oppløsning ble en ytterligere serie på ni dobbelte fortynninger fremstilt aseptisk ved suksessive fortynninger med like volummengder av en 0,025% vekt/volum oppløsning av gelatin, som på forhånd var regulert til pH 7 og sterilisert ved autoklavering.

Disse oppløsninger ble derefter overført til de sterile reservoirer i en anordning (britisk patentansøkning 44.493/74)

som kan utporsjonere 96 dråper, hver med et volum på 25 ul, i brønnene på en polystyrenplate. De anvendte plater hadde rektangulær form og mål på ca. 12 x 8 x 1,5 cm, hver inneholdende et arrangement av 8 rader av 12 sirkelformige brønner, 0,5 cm i diameter og 1 cm dype, med halvkuleformede bunner. Fortynningene av hvert antibiotisk stoff ble utporsjonert i de første 10 brønner i en rad, idet de siste 2 brønner mottok 25 yl porsjoner av bare 0,025% vekt/volum gelatinoppløsning.

De således fremstilte plater ble vakuumtørret ved å

sikre at vakuumet ikke sank under 20 Torr og at temperaturen ikke steg vesentlig, over omgivelsestemperatur. Tykkelsen på de oppnådde filmer var ca. 0*4 mikron. Platene ble lukket med et laminat av aluminiumfolie i en varmeforseglingsanordning (fra Sharp-Intermatic, Aylesham, Storbritannia).

De således fremstilte plater ble undersøkt med henyyn til antibiotiske egenskaper ved tilsetning av en 50 yl.porsjon av en egnet bakteriologisk kulturvæske inneholdende ca. 10 6 mikro- . organismer pr. ml. Forskjellige kulturvæsker er anvendt, men den som særlig anvendes, er hjerte-infusjonsvæsken (fra Difco Laboratories, Detroit, U.S.A.). To mikroorganismer har.vært mest anvendt ved forsøkene, nemlig Staph. aureus NCTG 6572 og E. coli NCTC 10418. Platene ble derefter lukket påny med en egnet vedhengende film (fra Cellotape Products UK, Middlesex, Storbritannia) og inkubert ved 37°C natten over. Minimum hemmende konsentrasjon (MIC) for hvert av de antibiotiske stoffer ble derefter bestemt ved å undersøke platene og notere den laveste konsentrasjon Sed hvilken' det ikke kunne iakttas noen vekst. Vekst viste seg ved en flekk av celler i bunnen av brønnene. For kontrollformål mottok den nest siste brønn i hver rad en 50 yl porsjon av kulturvæsken uten organismer og skulle holde seg fri for vekst efter inkubering, mens den siste brønn i hver rad,

som hadde mottatt et podestoff av organismer, men intet antibiotisk stoff* skulle gi en god vekst. Ingen svikt ved fremgangsmåten er fastslått ved disse to kontrollkolonner i noen av de undersøkte g>later.

Intet tap av aktivitet hos de undersøkte antibiotiske stoffer er iakttatt over en periode på 3 måneder ved lagring ved -20°C, 2°C eller 20°C, mens særlig penicilllner viser et raskt fall i aktivitet når de tørres uten stabiliseringsmiddel og lagres ved omgivelsestemperaturer.

Eksempel II

Fremgangsmåten ifølge eksempel I ble fulgt med unntagelse atr 25 yl av en vandig oppløsning av 0,075% vekt/volum gelatin ble anvendt. Tykkelsen av den oppnådde film var ca. 1 mikron.

Eksempel III

Fremgangsmåten ifølge eksempel I ble fulgt med den unntagelse at 25 yl av en vandig oppløsning av 0,0075% vekt/volum gelatin ble anvendt. Tykkelsen av den oppnådde film var ca.

0,1 mikron.

Eksempel IV

Fremgangsmåten ifølge eksempel I ble fulgt med den unntagelse at 25 yl av en vandig oppløsning av 0,025% vekt/volum storfe-serum-albumin ble anvendt. Tykkelsen av den oppnådde film var ca. 0,4 mikron.

Produktet fremstilt i henhold til eksemplene II - IV oppviste de samme gode egenskaper som produktet ifølge eksempel I.

Claims (23)

1. Fremgangsmåte for stabilisering av forbindelser, karakterisert ved at man a) fremstiller en blanding inneholdende minst én forbindelse som skal stabiliseres, et filmdannende stabiliseringsmiddel og et oppløsningsmiddel} b) utporsjonerer en liten mengde av blandingen på en fast overflate} og c) lar oppløsningsmidlet avdampe for å efterlate på den faste overflate den mengde materiale i fora av en sammenhengende, tørret film som henger fast på nevnte faste overflate og har en tykkelse på ikke over 50 mikron.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som forbindelsen som skal stabiliseres, anvendes en biologisk aktiv forbindelse.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som forbindelsen som skal stabiliseres, anvendes et antibiotikum,

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som stabiliserings middel, anvendes et filmdannende, proteinholdig materiale.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at det som stablliserings-middel, anvendes gelatin,

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at det som stabiliseringsmiddel anvendes storfeserum-albumin.

7. Fremgangsmåte som angitt 1 krav 1, karakterisert vedat det som oppløsningsmiddel anvendes vann*

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at en mengde på 1 til 500 yl av en blanding inneholdende 0,001 til 0,5% vekt/volum stabiliseringsmiddel utporsjoneres på den faste overflate.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakt e?rr i s e r t ved at 10 til 100 ul av en blanding inneholdende 0,01 til 0,1% vekt/volum stabiliseringsmiddel utporsjoneres på den faste overflate.

10. Fr<a3agangSmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at filmen fremstilles med en tykkelse fra 0,01 til 0,5 mikron.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav i, karakterisert ved at filmen fremstilles med en tykkelse fra 0,3 til 1 mikron.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at blandingen som utporsjoneres på. den faste overflate, tørres under slike betingelser at blandingen ikke koker eller fryser.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, k a, r ak't-e risert ved at tørringen utføres under redusert, trykk.

14. Fremgangsmåte som angttt i krav 12, karakterisert ved at lufttørring anvendes.

15. Apparat for utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 1, bestående av ©t arrangement av flere rader av brønner inneholdende en sammenhengende tørr film med en tykkelse på ikke over 50 mikron av minst en forbindelse som skal stabiliseres, innarbeidet i et filmdannende stabiliseringsmiddel, som henger fast på den indre overflate i brønnene.

16. Apparat som angitt 1 krav 15, karakterisert ved at filmens tykkelse varierer fra 0,01 til 5 mikron.

17. Apparat som angitt 1 krav 16, karakterisert ved at filmens tykkelse varierer fra 0,3 til 1 mikron.

18. Apparat som angitt i krav 15, karakterisert ved at stabiliseringsmidlet er et proteinholdig stoff.

19. Apparat som angitt i krav 18, karakterisert ved at stabiliseringsmidlet er gelatin.

20. Apparat som angitt i krav 18, karakterisert ved at stabiliseringsmidlet er storfeserum-albuain.

21. Apparat som angitt i krav 15, karakterisert ved at forbindelsen som skal stabiliseres, er et antibiotisk stoff.

22. Apparat soia angitt i krav 15, karakterisert ved at brønnene inneholder filmer inneholdende den samme eller forskjellige forbindelser som er til stede i samme eller i forhåndsbestemte konsentrasjoner som varierer fra brønn til brønn.

23. Apparat som angitt i krav 15, karakterisert ved at det er dekket med en vedhengende folie.