NO784096L - Framgangsmaate for diagnose av malignomer - Google Patents

Description

. Framgangsmåte for diagnose av jna li gnome r*

Oppfinnelsen gjelder en testmetode in vitro for diagnose av ondartede svulster (tumor), fortrinnsvis hos mennesker, hvor man bestemmer bevegelighetsforandringen til celleformede blodbestanddeler, som kommer i berøring med en bevegelsehemningsfaktor (MIF), og hvor nevnte faktor separeres fra lymfosytter som sensibiliseres mot svulstvev. En slik bevegelsehemningsfaktor blir ikke separert når lymfosyttene stammer fra pasienter som ikke har noen ondartet svulst, fordi disse iymfosyttene ikke er sensibilisert og følgelig ikke frigjør noen bevegelsehemningsfaktor ved berøring med tumor-antigenet.

Det er kjent fra litteraturen (Douwes, F.R. m.fl., Verh. Deutsche Ges. inn;., Med., 82. bind, J.F. Bergmann-Verlag, Miinchen 1976; jfr. litteraturlisten) at det er mulig å identi-fisere ondartede svulster på et tidlig stadium ved hjelp av den såkalte elektroforese-bevegelighetstesten (EMT). Prinsippet for denne testen (EMT) baserer seg på det faktum at bevegelseshastigheten (bevegeligheten) til bestemte legemer (makrofager, granulocytter, andre blodlegemer), som er synlige i det elektriske feltet til et spesialmikroskop (cytoferimeter), bare forandrer seg når legemene kommer i berøring med lymfokiner fra sensibiliserte lymfosytter. Det forutsettes herved at lymfosyttene, som er sensibilisert mot et bestemt antigen (såkalte T-lymfosytter), frigjør en rekke oppløselige faktorer, de såkalte lymfokiner. Til disse faktorer regnes bevegelseshemnings-faktoren (MIF). Den påvirker bevegelsesevnen til blodlegemene, spesielt makrofager og granulocytter og sørger for at disse stanser opp og akkumulerer seg på det sted, der det antigenet befinner seg, som utløser sensibiliseringen. In VIVO betyr dette tumorens ødeleggelsesmulighet.

Lymfosytter hos pasienter, som lider av ondartede svulster, reagerer spesifikt med frigjøringen av de såkalte oppløselige faktorer når de kommer i berøring med et basisk protein, som på den ene side kan tas fra hjernemassen eller på den annen side fra kreftvevet. Basisk protein, som framhever de spesifikke reaksjonene med lymfosyttene, betegnes innen litteratoren som den eneefalittogene faktor (EF) og basisk protein fra kreftvev (CaBP). Utvinningen skjer i samsvar med en i og for seg kjent framgangsmåte (Caspary, E.A. m.fl., Brit. Med. 1971, side 613-617, og andre publikasjoner, se Douwes,F.R. foran).

De resultater fra blodundersøkelser med elektro-foresebevégelighetstesten som er beskrevet i litteraturen, viser at man ved hjelp av denne test kan oppnå praktisk talt 100% differensiering av prøvene og på dette grunnlag bestemme om de ihneholdér h.h.v. en organisme med ondartede sykdommer (tumor), en frisk organisme eller en organisme med såkalt god-artede sykdommer. Samtlige undersøkte pasienter med (ondartede) svulster viste en positiv lymfosyttreaksjon, dvs. lymfosyttene avga én faktor, som forårsaket en målbar og karakteristisk for-andring i indikatorcellenes bevegelighet (jfr. Douwes, F.R., foran). Kontrollundersøkelser av pasienter med ikke-ondartede sykdommer viste ikke noen slik lymfosyttreaksjon. Falske resultater skulle kunne stamme fra bestemte årsaker. Elektro-foresebevegelighetstesten kan således betraktes som den mest følsomme krefttesten fram til i dag.

Den praktiske utnyttelse av den foran beskrevne testen forutsetter imidlertid at man behersker bruken av et relativt komplisert instrument, nemlig cytoferometeret, og dette er avgjort en ulempe. Det personale, som overvåker og måler den nevnte bevegelseshastighet, må gis nitid utdannelse og opp-læring og må dessuten selv overvåkes. På grunn av minskende oppmerksomhet (som funksjon av tiden), er bare en begrenset arbeidsinnsats mulig. Bruken av elektroforesetesten innskrenk-er seg derfor til spesialiserte institutter. Vurderingen av prøvningen skjer mens blodlegemene er i bevegelse, dvs. dyna-misk.<M>Avbrytelse" av testen er således ikke mulig, og følgelig kan det heller ikke gjennomføres noen etterbestemmelse.

Formålet med oppfinnelsen er å anvise en testmetode for diagnose av ondartede svulster, hvilken metode i størst mulig utstrekning på en generell og uspesifikk måte m.h.t. arten av den ondartede svulsten med større nøyaktighet angir nærværet av ondartede svulster, men som i prinsippet kan gjen-nomføres i ethvert legelaboratorium, samt som er spesielt velegnet for masseundersøkelser på kreftklinikker. Resultatet av testen skal uten videre kunne måles på ny. Testen skal kunne utnyttes statistisk og arkiveres uten me11omkommende protokoll-skriving.

Disse formål oppnås ved en testmetode av den inn-ledningsvis angitte art, hvor de lymfosytter, som skal under-søkes som celleformede blodbestanddeler, og som en del av en leukocyttsuspensjon, underkastes en i og for seg kjent bevegel-sehemningstest, idet leukocyttene etter dennes forløp bringes i berøring med et antigen, som stimulerer dannelsen av bevegelsehemningsfaktor, og tilslutt inkuberes, og at leukocyttbevegelsen etter et bestemt tidsintervall hemmes og fikseres.

Det er kjent forskjellige bevegelsehemningstester, som egner seg for undersøkelser m.h.t. det forannevnte formål, bl.a. den såkalte kapillarteknikk etter Søborg og Bendixen. For å realisere oppfinnelsen er det nødvendig å måle bevegeligheten til indikatorcellene ved "frysing" aV en bevegelsestil-stand oppnådd etter en bestemt tid.

I samsvar med oppfinnelsen måles fortrinnsvis ut-bredelsen og bevegelighetsforandringen av leukocyttene inne i et meget fint, omtrent 10 ym tykt, "åpent" kapillarsjikt. En testanordning, som har vist seg særlig hensiktsmessig, består av et tosjiktselement, nærmere bestemt en bærer av et inert medium, eksempelvis glass, og en agar, som er anriket med næringsstoffer for blodcellene. En spesielt velegnet agar, som finnes på markedet, går under benevnelsen "agarose" og produ-seres av Behring-Werke.

Mellomsjiktet mellom agaren og bæreren er fortrinnsvis delvis fylt med en væske. Dette sjikt har en tykkelse av ca. 1-20 ym. Ved bevegelseshemningstesten velges fortrinnsvis en inkubasjonstid av mellom 10 og 30 timer. Testen gjennomfør-es med en prøve av leukocyttirik "moderlut" ("buffycoat"), utvunnet fra menneskeblod, og med et konstant antall leukocytter som utgjør mellom 10 4 og 10 7 per prøve. Ved disse standard- vérdier dreier det seg om prøvede verdier, som ikke krever ho-en overdreven blodtapping av pasientene.

Prøven tilsettes en antigenoppløsning i forholdet 1:50 - 1:10. I denne forbindelse kan man benytte antigenoppløs-ningén utvunnet i samsvar med en framgangsmåte beskrevet av Caspary og' Field, eller utvunnet ved hjelp av en 3 m KC1-ekstråksjon i henhold til Meltzer. Som utgangsmateriale benyt- , tes vev fra ondartede svulster som stammer fra mennesker som har blitt operert, eller hjernemasse fra mennesker. Det er imidlertid også mulig å utvinne ahtigenoppløsninger fra tumor-celler som er odlet in vitro.

Testmetoden ifølge oppfinnelsen kan ikke bare benyttes ved en uspesifikk undersøkelse av ondartede svulster, idet den også kan "utvides" til å gjelde en organ-spesifikk undersøkelse. Hvis det benyttes antigener, som er utvunnet fra carcinomvev eller kreftsvulstveV fra spesielle organer, vil lymfosytter til pasienter* som er angrepet av samme organ-eårcinom, reagere på den beskrevne måten,I litteraturen er beskrevet åt eksempelvis antigenoppløsninger, som er utvunnet fra brystkreftsvulster som angitt hos Caspary og Field eller Meltzer gir en spesifikk reaksjon utelukkende for pasienter med brystkreftsvulster.

Når mån får en positiv immunreaksjon, dvs. ved mis-tanke om kreftsvulst, er det også mulig å gjennomføre en sétlé. tester med organspesifikke antigener og dermed innenfor en relativt kort tidsperiode få rede på hvilke organer, som skulle kunne være angrepet åv en kreftsvulst.

Det er også av stor viktighet at den såkalte immunreaksjon, dvs. frambringelsen av retardasjonséffekten ved indikatorcellenes bevegelse i denne test, på en overraskende måte kan forsterkes ved at prøveoppløsningen tilføres en opp* løsning med såkalt overføringsfaktor. Denne faktor er kjent innén immuhitetsiæren (jfr. eksempelvis M. Roserithal: "Der Transferfaktor und seine therapeutische Anwendung"; Sveits, md. Wschr. Bd. 104, 1974, side 1501-1506). Overføringsfaktoren kan framstilles med utgangspunkt i normale blodleukocytter. Faktoren utgjør en subcellular, dialyserbar, ikke-immunogen leukocyttfaktor, som er ansvarlig for den reaksjon som skyldes T-lymfosyttene. Det finnes på markedet overføringsfaktorprepa-rater, (Schura, Krefeld), som er framstilt ved fraksjonering i flytende oksygengass med etterfølgende trinnvis ultrafraksjo-nering. En enhet, som forekommer i handelen, inneholder over-føringsfaktor fra ca. 5«IO<10>leukocytter. Preparatet er stabi-lisert med 1% human-albubinoppløsning.

Det har vist seg at det ved tilsetning av overfør-ings faktor oppnås en forsterkning av immunreaksjonen. Ved over-føringsfaktor-tilsetningen blir derved diskrimineringen eller undertrykkelsen av den enkelte test vesentlig forbedret.

Oppfinnelsen gjelder også en testplate for gjennom-føring av framgangsmåten. Denne består av en plan bæreplate av inert materiale, eksempelvis glass, der det er påført et 0,5-5 mm tykt, stivnet agarsjikt, som har to stort sett sirkelform-ede, utstansede hull med en diameter av mellom 0,5 og 5 mm (fortrinnsvis 2,2-3,0 mm). Hvert hull har et slikt volum at det kan opptas ca. 5-20 p£, fortrinnsvis 8 testmasse. Det er viktig at de utstansede hullene er slik utformet at det kapillare bevegelsessjiktet blir ensartet også innenfor over-gangsområdet mellom hull og sjikt.

Oppfinnelsen vil bli nærmere belyst i tilknytning til etterfølgende eksempler.

Dessuten henvises det til tegningsfigurene, der fig. 1 viser et grunnriss av en testplate ifølge oppfinnelsen, mens fig. 2 viser platen i tverrsnitt.

Eksempel 1

A. Utvinning av leukocyttsuspensjon

30 ml humanblod (blod fra pasient) hepariniseres med 300 USP-enheter natriumheparinat. Det hepariniserte blodet undersjiktes i et lite plastrør med 8 ml 6 vektprosents deks-. tranoppløsning i fysiologisk koksaltoppløsning (dekstranets molekylvekt 75.000). Deretter lar man erytrocyttene sedimente-re ved 37°C i et varmeskap i ca. 45 min. Den leukocytt-rike del ("buffycoat") tas opp med en hevert pg blandes med like volumdeler av en 0,9 vektprosents NaCl-oppløsning, og sentrifugeres deretter i 15 min. med en akselerasjon av 750 g. Det kuleformede materiale som separeres fra ved sentriguferingen, vaskes på ny to ganger i en 10 ml Hank's oppløsning (pH 7,2) og suspenderes i et Te 199-medium (produsent: Serva, Heidelberg). Ved vaskingen og.suspenderingen hvirVles cellene opp med en pipette, inntil man makroskopisk ikke kan oppdage noen celle-klumper. Leukocyttene telles etter farging med tyrkisk oppløs-ning i et kammer i overensstemmelse med Neubauer, med antallet innstilt på. 2xl05 celler/viS. i Te 199-medium. I gjennomsnitt forelå i prøvene,25% énkjernede celler (lymfosytter og mono-cytter) samt 7.5% granulocytter. Erytrocyttkontaminasjoneh var mindre enn 1:1.

B. Framstilling av antigenoppløsning

For framstilling av antigenoppløsningen skal den éncefalittogene faktoren (EF) eller det basiske proteinet fra carcinomvey (CaBP) isoleres. Tumoren resp. hjernen bearbeides under sterile betingelser så hurtig som mulig etter at de er fjernet operativt. Bindevev og frisk vev fjernes fra svulsten. Deretter findeles svulsten resp. hjernevevet med en steril skalpell (operasjonskniv) og findeles ytterligere i en homogenisator i isbad. Svulstvevet opphetes ikke ved denne behand-ling. Homogenisatet suspenderes i et fire ganger så stort volum destillert vann og sentrifugeres deretter ved 23ooo g.

Det dannede, faste materialet suspenderes på ny i et fire ganger så stort volum 0,9 prosents NaCl-oppløsning, homogeniseres og sentrifugeres ved 23 000 gi 30 min. Det igjen med en fire ganger så stor volummengde destillert vann resuspenderte materialet (kulen) frysetørkes. Det frysetørkede pulveret tilsettes en blanding av kloroform/metanol (2:1) i forholdet 1:10 og omrøres i 30 min. Blandingen sentrifugeres i 10 min. ved 600 g. Den ovenfor beliggende væsken kastes.

Denne prosess gjentas to ganger. Kulen lufttørkes.

Den tørkede kulen resuspenderes i en fem ganger så stor volummengde av en 5 prosents NaCl-oppløsning i vann og sentrifugeres i 30 min. ved 23 000 g. Den ovenfor beliggende væsken kastes. Under tilsetning av n/100 NaCl innstilles den igjen i en fem ganger større volummengde destillert vann resuspenderte kulen på en pH av 3,5. Suspensjonen rystes lett i 30 min. og sentrifugeres deretter på ny i 30 min. ved 23 000 g. Den ovenfor beliggende væsken kastes. Enda en gang resuspenderes kulen i den fem ganger større mengden destillert vann*som med n/100 HC1 innstilles på en pH-verdi av 2,6 og får stå i 3-18 timer. pH-verdien forandres ikke i denne tidsperiode. Suspensjonen sentrifugeres i 30 min. ved 23 000 g. Den ovenfor beliggende væsken tas vare på, kulen vaskes på ny i n/100 NåCl ved pH 2,6 og sentrifugeres. Den her dannede, ovenfor beliggende væsken tas vare på. De to sistnevnte væskene blandes og dialyseres deretter mot destillert vann. Derettér skjer en frysetørking.

Det oppnås en antigen-testoppløsning ved oppløsning av 0,1 mg/ml av den frysetørkede substansen i destillert vann. For en oppløsning av det basiske proteinet fra svulstvev (CaBP) gjelder en i prinsippet lik framstillingsprosess.

C. Framstilling av testplaten ( jfr, også fig.' 1 og 2)

0,5 g av en spesiell kulturagar ("Agarose"; produsent: Behring-Wérke, Marburg) veies i en 50 ml Erlenmeyerkolbe. Dertil settes 22,5 ml sterilt destillert vann.

Til en annen Erlenmeyerkolbe settes'22,5 ml av det dobbelkonsentrerte Tc 199-mediet og 5 ml plasma utvunnet fra humanblod. Med Erlenmeyerkolben fastspent i et stativ oppløses agarosen under lett rysting i et kokende vannbad. Kolben lukkes med en folie eller en propp, da vannet ellers kan fordampe.

Etter fullstendig oppløsning av agarosen lar man denne avkjøles i et vannbad ved 47°C. I samme bad forvarmes deretter blandingen av medium og plasma samt tilsettes agarosen

under rysting, slik at det nå foreligger 50 ml av en 1 prosents agaroseoppløsning i enkelt Tc 199-medium med 10% plasma.

Ved hjelp av en utporsjoneringspipette, som er opp-varmet på forhånd, påfylles 5 ml av agaren i runde vevkultur-' skåler (Petriskåler) 10 med en diameter av 50 mm, slik det framgår av fig. 1. Etter at agaren er stivnet, utstanses det i agaren ved hjelp av en teleskopstansekanyle (Behring-Werke, Marburg) og en sjablon hull 11 med en diameter av 2,5 mm. Ved utstansingen skal det tas hensyn til at agarsjiktet ved stan-seområdet ikke oppløses av glassjiktet, for ikke å utvide kapillarsjiktet og følgelig ikke garantere leukocyttenes bevegelse.

Anordningen av hullene 11 framgår av fig. 1. Selv-sagt er også andre utførelsesformer mulige. Fig. 2 viser et forstørret tverrsnittsriss gjennom den nedre delen av skålen 10. Det er antydet i fig. 2 at agarsjiktet 1 er atskilt fra skål-ens 10 glassjikt, Ved et tynt kapillarsjikt 3. De ulike hull-rekkene er eksempelvis beregnet for:

A. Kontrollprøve (standard)

B. Testsuspensjon med allmenngyldig antigen.

C. Testsuspensjon med organ-spesifikt antigen.

D. Testsuspensjon med organisk antigen og over-føringsfaktor.

D. Reaksjon, inkubasjon og fiksering

For en test ble følgende tilsetninger framstilt:

1. Med 100 ] xl leukocyttsuspensjon i samsvar med A og 8 u& antigensuspensjon i samsvar med B, 2. med 100 u& leukocyttsuspensjon og 8 uJl n/100 NaCl-oppløsning (for referanseverdien).

De blandede tilsetningene 1 og 2 inkuberes i 60 min. ved 37°C i varmeskap ved en luftfuktighet av 100%. Deretter påfylles det fra den inkuberte oppløsningen i hvert hull 8 uA leukocytt- og antigenholdig substans resp. standardsubstans. For bestemmelsen av leukocyttbevegelsen og innvirkningen av de av lymfocyttene produserte, bevegelsehemmedde faktorene står det til rådighet 2-5 måleresultater likesom 2-5 referanseverd-ier, dette i overensstemmelse med antall hull i testplaten. De celler som inngår i suspensjonen og som ble innført i hullene i begynnelsen av forsøket, beveger seg inn i mellomsjiktet 3 mellom agaren og skålflaten. Ved en inkubasjon av platene ved 37°C i varmeskap i 18 timer opprettholdes denne bevegelse i et visst tidsrom. Leukocyttene beveger seg ikke inn i agaren, men trekker bare næringsstoffene ut av denne. Inkubasjonen gjennom-føres ved en relativ fuktighet av 100% i et fuktkammer.

Etter inkubasjonen oversjiktes platene i 15 min. med metanol og tilslutt i 10 min. med formalinoppløsning (37 vektprosent metanol). Til sist trekkes agaren forsiktig av som et sjikt fra bunnen av skålen. De cellene som er forflyttet i mellomsjiktet, fikseres nå ved skålflaten. Etter tørkingen inn-farges cellene ifølge Pappenheim, hvorved mørkfiolette ringer 4 (vandringsringer) viser seg på platens flate (jfr. fig. 1). E. Bestemmelse og beregning av resultatene. Med et måleforstørrelsesglass (Bausch & Lomb) be stemmes diameteren for vandringsringen. Derved må også medtas de i periferien sporadisk forekommende cellene med polymorfe kjerner. Fra flere bestemmelser oppnås den aritmetiske middelverdi.

Kvotienten mellom (migreringsflaten) vandringsflaten F^med antigen og vandringsflaten F2uten antigen gir en "migreringsindeks<M>; MI:

MI = F^/F2

En migreringsindeks (vandringsindeks, bevegelsesindeks) som

er 0,85 betyr hemning av leukocyttene i betydelig omfang og dermed en positiv cellereaksjon. I etterfølgende tabell angis et måleeksempel:

Rekke Ø(mm) Flate (mm<2>) MI

B 6,75 Fx» 35,8 0,80

A 7,55 F2»44,75 (1)

Førstegangs undersøkelsen med totalt 97 pasienter skulle kunne gi effekten av migrerings- eller bevegelseshemningstesten ved brystkreft. 27 av 47 undersøkte pasienter med brystkreft viser en hemning, som er større enn 15% (»58-7%), dvs. en migreringsindeks MI som underskrider 0,85. Når det gjelder de 23 undersøkte pasientene med sykelige forandringer i brystet viser bare fire (av 23) en slik hemning (= 17%);

m.h.t. pasienter med fibroadenom viste én pasient av fem (= 20%) hemning. Følgende tabell gir en totaloversikt:

Eksempel 2

Utnyttelse av overføringsfaktoren for forsterkning av immunreaksjonen.

Det skal påpekes at det kan oppnås en forsterkning av immunreaksjonen ved tilsetning av en oppløsning med over- føringsfaktor (produsent: Schura, Krefeld). Det viser seg at migreringsfaktoren,, ved tilsetning av denne faktor, blir ster-kere utpreget enn i forhold til testeksempel i.

Følgende testtilsetninger ble framstilt:

1. 100 ufi. leukocyttsuspensjon + 8 uAantigenoppløs-ning. 2. 100 u£ leukocyttsuspensjon ♦ 8u£ antigenoppløs-ning 20 u& oppløsning av overføringsfaktor (preparat Schura, 1 u£ tilsvarer omtrent overføringsfaktoren fra 5xl05 leukocytter) .

3. 100 u£ leukocyttsuspensjon

4. 100 u£ leukocyttsuspensjon 20 uA overførings-faktoroppløsning som ved tilsetning 2.

Inkubasjon og preparering av skålene skjer som angitt i eksempel, 1, Man framstiller en skål med 4x5 hull (diameter 2,5 mm). En rekke med 5 hull ble fylt med 10 uÅ av test-tilsetningene 1-4.

Følgende resultater ble oppnådd (middelverdi fra fem forsøk):

Den lave MI-verdien for rekkene B/C tyder på et til-felle av ondartet svulst.

Resultater fra bevegelsehemningstesten (migrerings'-inhiberingstesten) ved bruk av overføringsfaktor ved bestemmelse av gastro-intestinale svulster: Det ble gjennomført målinger ved hjelp av metodik-ken ifølge eksempel 2. I en (frisk) kontrollgruppe av pasienter fikk man ingen nevneverdig hemning: migreringsindeksen lå ved 1,02 - 0,1. Overføringsfaktoren påvirket ikke disse resultater. I en gruppe av pasienter, som led av svulster på tykk-tarmen, lå migreringsindeksen på 0,65 0,2. Av de 15 undersøk-te tilfellene viste 11 en migreringsindeks som var lavere enn 0.85. Etter tilsetning av overføringsfaktor lå migreringsindeksen ved 0,61 - 0,09. Dessuten lå migreringsindeksen under 0,85 etter tilsetning av overføringsfaktor hos 14 av 16 pasienter, slik at det også her ble oppnådd en markant forbedring av for-søksresultatene. I andre undersøkte grupper kunne det ikke på-vises noen nevneverdig hemning.

Eksempel 3

Det kan også ekstraheres en antigenoppløsning fra svulstceller, som er vasket i en fermentasjonskultur in vitro, med en nøytral buffer under gjentatt oppdeling av vevet. Hjernetumorcellene odles på følgende måte in vitro: Mån må i denne forbindelse se nøye til at det opprettholdes sterile ar-beidsforhold. Cellene vaskes fortrinnsvis i en homogeniserings-oppløsning av typen Hank<1>senen i 30 sekunder. Omrøring bør forhindres. Samtlige vegger og flater av kolben, fortrinnsvis en glasskolbe med et volum av 250 ml, vaskes omsorgsfullt i Oppløs-ningen renses fra cellene ved sentrifugering i kulde i en tid av 10 min. Mediet helles i et glassbeger. Man tilsetter en liten mengde bufret proteinas-enzymoppløsning, og det foretas en hurtig spyling for å forhindre en nedbrytning av cellene.

I samsvar med den foretrukne metoden tilsettes opp til 2 ml trypsinoppløsning (EDTA) i en kolbe. Trypsinoppløsningen av-helles etter spyling i 10 sek.

Deretter tilsettes en tilsvarende volummengde av en fersk trypsinoppløsning. Denne inkuberes inntil man ved ob-servasjon i mikroskop konstaterer at cellene separeres fra kammerets vegger. Dette tar vanligvis 5-10 min. Man tilsetter et hensiktsmessig tilvekstmedium, eksempelvis 50 ml av en opp-løsning av en 7-10 prosents oppløsning av serumet fra kalver i 100 ml næringsmedium av typen "F-10". 25 ml av det ferske mediet med cellene overføres til et nytt tilvekstkammer (kolbe) for forplantningen. Begge kammere anbringes i omtrent 7 døgn i en inkubator ved 35°C. I samsvar med dette eksempel, fram til dette punkt, deles en kultur av de kunstige svulstcellene i tp friske kulturer i omtrent samtlige 7 døgn. Framgangsmåten kan gjentas i intervaller på 7 døgn. Antallet in feitro voksende celler fordobles i samtlige 7 døgn.

Mediet med cellene overføres til et sentrifugerings-rør og sentrifugeres i kulde i 10 min. med en hastighet av 3000 r/min (omtrent 2200 g). Mediet kastes. De celler, som er igjen i tilvekstkammeret, avskrapes frå kammerveggene og ned-vaskes i sentrifugeringsrøret med en nøytral bufferoppløsning* Cellene vaskes te ganger med én nøytral bufferoppløsning og sentrifugeres på ny i kulde med en hastighet av 3000 r/min (omtrent 2200 g). Mediet kastes. De tilvokste cellene suspenderes i 10 ml nøytral fosfatbuffer, inntil de er klare for ekstraksjon. Deretter behandles de utvokste cellene i kulde i 20 sek. med en lydanordning for å bryte cellene i stykker. I hvilket som helst av tilfellene må denatureringen av proteinet forhindres i størst mulig grad. Etter den forannevnte be-handlingen sentrifugeres cellene i 30 min. ved 30.000 r/min (omtrent 220 000 g). Det produkt som befinner seg øverst i sentrifugeringsrøret dekanteres. 10 ml av bufferoppløsningen nyttes for å vaske de gjenværende cellerestene. Oppløsningen behandles igjen med lyd og sentrifugeres * og det produkt som befinner seg øverst i sentrifugeringsrøret slås sammen med det dekanterte produktet. Denne prosess gjentas enda en gang. De sammenførte produktene fordampes for å redusere volumet fra ca. 30 ml til ca. 6-7 ml. En tilsvarende del uttas for bestemmelse av totalt protein.

Ved hjelp av en væskekromatografikolonne og féltre-ring gjennom et filter med meget fine porer befris preparatet deretter for forurensninger. De ulike detaljer ved denne framgangsmåte er beskrevet i tysk offentlighetsskrift nr. 2.606.257, Eksempel 2. Man utvinner et polypetid med en molfekylvekt av ca. 10.000. Man framstiller en antigenoppløsning, som har en konsentrasjon av omtrent 100 mg antigen per liter.

Forsøkene ifølge eksemplene 1 og 2 gjennomføres med det antigenet som er utvunnet på kunstig måte. Det viser seg at det kunstig frambragte antigenet medfører samme virkning som det antigenet, som ble utvunnet fra kroppsvev.

Eksempel 4

Anvendelse av et organispesifikt antigen.

A. Utvinningen av leukocyttsuspensjonen skjedde som beskrevet i Eksempel 1-A.

B. Framstilling av en organspesifikk antigenoppløs-ning.

Så ferskt som mulig utvunnet svulstvev fra en bryst- tumor befris for blod, fett- og bindevev samt oppskjæres i små terninger eller strimler. Samtlige etterfølgende trinn gjennom-føres ved 4°C. Dé små vevstykkene findeles i en kaliumklorid-oppløsning (konsentrasjon 3 mol/liter) til omtrent ert-store stykker. pH-verdi for denne råsuspensjon innstilles på 7,4. Deretter findeles vevet ved hjelp av en homogenisator av typen Ultraturrax (20 000 r/min). Homogenisatet oppbevares i 24 timer, hvoretter det sentrifugeres. Det materialet, som utvinnes etter 60 min. sentrifugering ved 4000 g (hvilket materiale befinner seg øverst i sentrifugeringsrøret), dialyséres i 2 timer mot en 10 ganger større vblummengdé destillert vann bg deretter i ytterligere 24 timer mot en 50 ganger større volummengde av en 0,9 prosents NaCl-oppløsning. Fra dialysatet utfelles proteinene ved tilsetning av 2-molar ammuniumsulfat i en tid av 1 time og separeres ved 20 minutters sentrifugering ved 4000 g. Etter suspensjon av proteinene i en 0,9 prosents HaCl-oppløsning gjennomføres en 1 times dialyse mot den 5 ganger større volummengde destillert vann og en ytterligere dialyse mot den 50 ganger større volumraengden 0,9 prosents NaCl-oppløs-ningen. Etter steril-filtrering gjennom et 0,45 millipor-mikropor-filter påfylles antigenekstrakten små ampuller og oppbevares ved -20°C. Før anvendelse bestemmes proteininnholdet i en slik tilsetning ved Biuretmetoden etter den foran beskrevne TCA-felling.

C. Samme testpiate som i eksempel 1 benyttes.

For testen framstilles tre tilsetninger:

1. med 100 uA leukocyttsuspensjon fra pasientblod ifølge eksempel 1-A ♦ 8 yt n/100 NaCl-oppløsning (for rekken A^standardvérdi), 2. med lOOOuA leukocyttsuspensjon + 8 yi antigensuspensjon ifølge Eksempel 4-B. 3. med 100 uA leukocyttsuspensjon + 8 uA antigensuspensjon ifølge Eksempel 4-B ♦ 15 uA overføringsfåktoropp-løsning.

Testplaten som har en hulldiameter av 2,5 mm sjiktes med 8 uA av den ifølge Eksempel 1 inkuberte testsubstansen 1-3. Resultatene gjenfinnes nedenfor, idet verdiene representerer middelverdier fra fem beregninger.

Resultatene peker i retning av en brysttumorsvulst, fordi migreringsindeksen ligger klart under 0,8, og resultatene ved bruk av overføringsfaktor er ytterligere forsterket.

Ytterligere undersøkelser viser at resultatene fra pasienter, som angitt i Eksempel 1, forandres på en enda mer betegnende måte.. Blant pasientene med brystsvulster viser ved anvendelse av metoden og ved hjelp av overføringsfaktoren mer enn 90% en migreringsindeks, som er mindre enn 0.80. Bare hos 10% av pasientene med brystsvulster er migreringsindeksen større enn 0.85.

Eksempel 5

Bevegelighetsforandringen hos lymfocytter, fremmede makrofager og andre indikatorceller ble bestemt ved hjelp av

en kapillartest ifølge SØborg og Bendixen, Man benyttet seg av en 10 m tykk, åpen kapillar. Resultatene tilsvarte de som ble oppnådd i Eksempel 1 og 2, idet prinsippet m.h.t. like tilsetninger anvendes,

Sluttbemerkninger

Testmetoden skal ikke benyttes for spesielle syk-domsbildet. Falske, negative resultater fås ved samtlige såkalte leukoser. En forklaring på dette kan for nærværende ikke gis, da nettopp leukemi-angrepne celler har meget høyt innhold av basiske proteiner. Dessuten forstyrres ikke den cellulære immuniteten hos disse pasienter på en så påfallende måte at dette resultat skulle kunne forklares med en forstyrrelse av immunsystemet. Dessuten er det i denne sammenheng iøynefallende at den kroniske, lymfatiske leukemi, likesom den akutte, lymfatiske leukemi, ikke viser noen reaksjon, mens lymfosarkomet og lymfogranulematosene oppfører seg som andre ondartede svulster. Før kemoterapien viser pasientene en tydelig hemming. Allerede etter den første kemoterapisyklus oppheves imidlertid denne hemning og i den andre syklus forvandles den til en falsk, positiv verdi. Dessuten fås det falske resultater Eos pasienter i tumorkakeksi. Pasienter med hurtig-voksende svulster eller pasienter i tumorkakeksi gir delvis falske resultater når det her foreligger en forstyrrelse av den cellulære immuniteten.

Det pågår forsøk for å få svar på disse spørsmål,

Falske, positive resultater støter man først og

fremst på ved inflammatoriske og degenerative neurologiske syk-

dommer, eksempelvis multiple sklerose. Ifølge Vaspary og Field ligger forklaringen i en kryssreaksjon mellom faktoren EF og sensibiliseringen av lymfosyttene med hjernevev.

De falske resultater kan imidlertid lett skilles

fra ved en forundersøkelse, og de angitte sykdommer byr derfor ikke på noen hindringer for bruken av testen.

Claims (12)

1. Testmetode in vitro for diagnose av ondartede

svulster, fortrinnsvis hos mennesker, hvor man bestemmer bevegelighetsforandringen til celleformede blodbestanddeler, som kommer i berøring med en bevegélse-hémningsfaktor (MIF), og hvor nevnte faktor separeres fra lymfocytter som sensibiliseres mot svulstvev, karakterisert ved at som celleformede blodbestanddeler de lymfocytter, som skal under-søkes som en del av en leukocyttsuspensjon underkastes en i og for seg kjent migrerings- eller bevegelse-hemningstest, i løpet av hvilken lymfocyttene bringes i berøring med et antigen, som stimulerer dannelsen av MIF, og deretter inkuberes, og at leuko-cyttbevegeisen etter en viss bestemt tidsperiode hemmes og fikseres.

2. Testmetode som angitt i krav 1, karakterisert ved at bevegelseshastigheten for leukocyttene bestemmes i et kapillart mellomsjikt, som er 1-20 ym tykt og som i det minste delvis er fylt med væske.

3. Testmetode som angitt i krav 2, karakterisert ved at mellomsjiktet på den ene side begrenses av et inert medium (eksempelvis glass) og på den annen side begrenset av et agarsjikt som er anriket med næringsstoffer.

4. Testmetode som angitt i et av kravene 1-3, karakterisert ved at testen gjennomføres med en prøve med leukocyttrikt materiale ("buffyeoat"), som er utvunnet fra menneskeblod og med et konstant antall leukocytter som utgjør mellom 10 5 og 10 7 per prøve.

5. Testmetode som angitt i krav 4, karakterisert ved at prøven tilsettes en antigenoppløsning ifølge Caspary og Field eller en 3 m KCl-ekstrakt fra tomorvev ifølge Meltzer i forholdet (volum prøve til antigenoppløsning) av 1:60 - 1:10.

6. Testmetode som angitt i krav 5, karakterisert ved at prøven tilsettes en organ-spesifikk antigenoppløsning.

7. Testmetode som angitt i krav 4, karakterisert ved at prøven tilføres en antigenoppløsning, som er utvunnet ved odling av svulstceller in vitro, hvilken oppløsning inneholder mellom 50 og 200 mg svulstantigen per 1000 ml av et passende, vannholdig oppløsningsmiddel.

8. Testmetode som angitt i ét av kravene 4-7, karakterisert ved at prøven foruten antigen-oppløsningen tilsettes overføringsfaktoroppløsning.

9. Testmetode som angitt i krav 8, karakterisert ved at antallet leukocytter, fra hvilke den tilførte overføringsfaktormengden utvinnes, forholder seg til antallet leukocytter, som foreligger i prøven, som 1:1 - 1:100.

10. Testmetode som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at inkubasjonstiden ved migrerings-hemningstesten utgjør mellom 10 og 30 timer ved en temperatur av 35-37,5°C ved en relativ luftfuktighet av 90-100%.

11. Testplate for gjennomføring av metoden som angitt i et av kravene 1-10, karakterisert ved en plan bæreplate eller -skål (10) av inert materiale (eksempelvis glass), på hvilken det er anbragt et 2-5 mm tykt, stivnet agarsjikt, idet det mellom bæreplaten eller -skålen (10) og agarsjiktet finnes et kapillart vandringssjikt med en tyk kelse av 1-iO ym, og at agarsjiktet har i det minste to stort f. sett sirkelrunde hull (11) med en diameter av mellom 0,5, mm og 5 mm,, fortrinnsvis 2,5 mm.

12. Testplate som angitt i krav 11, karakterisert ved at Jjiullene er således utformet at det oppnås ensartethet for det kapillare vandringssjiktet også i nær-heten av overgangen fra hullene til kapillarsjiktet.