DD139903A5

DD139903A5 - Testverfahren zur diagnose von malignomen

Info

Publication number: DD139903A5
Application number: DD78209631A
Authority: DD
Inventors: Friedrich Douwes
Original assignee: R & Z Vermoegensverw Gmbh
Priority date: 1977-12-12
Filing date: 1978-12-08
Publication date: 1980-01-23
Also published as: JPS54100176A; DK532678A; PT68891A; IL56152A0; AR220356A1; CA1129319A; SE432157B; PL112675B1; ES475905A1; IT1160323B; GB2009927B; FR2411412A1; DE2755363B2; AT360178B; RO75333A; ES243564Y; IT7830722A0; FI783782A7; CH646793A5; BE872651A

Description

Testverfahren sur Diagnose von malignen Tumoren

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Testverfahren zur Diagnose von malignen Tumoren sowie eine Testplatte zur Ausführung des Verfahrens·

Das erfindungsgemäße Verfahren wird angewandt in der Medizin zur Krebsfrüherkennung beim Menschen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein In-vitro-Testverfahren zur Diagnose von malignen Tumoren, vorzugsweise beim Menschen, bei welchem Verfahren die MoMlitätsänderung zellenförmiger Blutbestandteile, die mit einem Migrations-Inhibitions-Faktor (IvIIF) in Kontakt kommen, bestimmt wird, wobei der MIF von Lymphozyten ausgeschieden wird, welche gegen Tumorgewebe sensibilisiert sind. Ein derartiger MIF wird nicht ausgeschieden, wenn die Lymphozyten von Patienten stammen, die keinen bösartigen Tumor haben (Malignom), da diese Lymphozyten nicht sensibilisiert sind und demnach beim Kontakt mit. Tumorantigen kein MIF freisetzen.

Aus der Literatur (Douwes, F» R. et al; Verh. Deutsche Ges« inn» Medo« 82· Band, J_e F» Bergmann-Verlag, München 1976; dort weitere Nachweise) ist bekannt, daß mit Hilfe des sog. Elektrophorese-Mobilitäts-Testes (EMT) eine Früherkennung von bösartigen Erkrankungen möglich ist.

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Das Prinzip des EMT beruht darauf, daß sich die Wanderungsgeschwindigkeit (Mobilität) von bestimmten, im elektrischen Feld eines Spezialmikroskopes (Zytopherometer) sichtbaren Körpern (Makrophagen, Granulozyten_s andere Blutkörperchen) nur dann ändert_s wenn sie mit Lymphokineη aus sensibilxsierten Lymphozyten in Kontakt kommen» Dabei wird vorausgesetzts ·

daß Lymphozyten; die gegen ein bestimmtes Antigen sensibilisiert sind (sog. T-Lymphozyten), eine Reihe von löslichen Faktoren, die sog. Lymphokine, freisetzen. Ein wichtiger unter diesen Faktoren ist der Migrations-Inhibitions-Faktor (MIF). Er beeinflußt die Wanderungsfähigkeit von Blutkörperchen, insbesonderen Makrophagen und Granulozyten, und sorgt für deren Arretierung und Akkumulierung am Ort des Vorhandenseins des die Sensibilisierung auslösenden Antigens. In vivo bedeutet das die Zerstörungsmöglichkeit des Tumors.

Lymphozyten von Malignompatienten reagieren spezifisch mit der Freisetzung der sogenannten löslichen Faktoren, wenn sie in Kontakt kommen mit einem basischen Protein, das aus der Gehirnsubstanz einerseits oder aus einem Carcinomgewebe andererseits genommen wird. Die basisehen Proteine, die die spezifischen Reaktionen der Lymphozyten hervorrufen, werden in der Literatur encephalitogener Faktor (EF) und basisches Protein aus Carcinomgewebe (Cq₁BP) genannt. Die Gewinnung erfolgt nach an sich bekannten Verfahren (Caspary, E. A. et al., Brit. Med. 1971, Seite 613 - 617 und weitere Veröffentlichungen; siehe Douwes, F. R. a. a. Ö.).

Die in der Literatur beschriebenen Ergebnisse von

Blutuntersuchungen mit dem EMT zeigen, daß mit Hilfe des Tests eine nahezu 100 %ige Differenzierung der Proben dahingehend erfolgen kann, ob sie einem Organismus mit malignen (Tumor-) Erkrankungen oder einem gesunden Organismus bzw. einem Organismus mit nichtmalignen Erkrankungen entnommen worden sind. Alle untersuchten Patienten mit (malignen) Tumoren zeigten eine positive Lymphozyten-Antwort, d. h. es wurde von den Lymphozyten ein Faktor abgegeben, der zu einer meßbaren und charakteristischen Änderung der Mobilität von Indikatorzellen führt (vgl. Douwes, F. R., a„ a„ 0.) Kontrolluntersuchungen an Patienten mit nichtmalignen Erkrankungen zeigten keine solche Lymphozytenantwort. Falsche Resultate konnten auf bestimmte Ursachen zurückgeführt werden. Demnach kann der EMT als derzeit empfindlichster Krebstest angesehen werden.

Als nachteilig bei der Anwendung des Tests wird empfunden, daß die Beherrschung eines relativ kompliziert zu bedienenden Instrumentes, nämlich des Zytopherometers, vorausgesetzt wird. Das die Wanderungsgeschwindigkeit beobachtende und messende Personal ist sehr sorgfältig auszubilden und zu überwachen. Aufgrund der nachlassenden Aufmerksamkeit ist nur ein beschränkter Arbeitseinsatz möglich. Die Anwendung des EMT beschränkt sich

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daher auf spezialisierte Institute. Die Auswertung des . Tests erfolgt während der Bewegung der Blutkörperchen, als'o dynamisch»- Ein "Anhalten" des Experimentes ist nicht möglich, demnach ist auch kein Nachmessen durchzuführen.

Ziel der Erfindung ~

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Testverfahrens zur Diagnose von Malignomen, das möglichst allgemein und unspezifisch in bezug auf die Art der Malignome mit hoher Genauigkeit das Vorhandensein von Malignomen signalisiert, jedoch vom Prinzip her in jedem Arzt-Labor angesetzt bzw. durchgeführt werden kann und sich insbesondere für Massenuntersuchungen bei der Krebsvorsorge eigiEb. Das Ergebnis des Tests soll ohne weiteres nachmeßbar sein. Der Test soll statistisch auswertbar und ohne zwischengeschaltete Protokollierung archiviert werden können»

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den an sich bekannten Migrations-Inhibitioris-Test so abzuwandeln, daß das Ergebnis des Tesbes nachmeßbar ist.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein In-vitro-Testverfahren zur Diagnose von malignen Tumoren, bei welchem Test die Mobilitätsänderung von zellenförmigen Blutbestandteilen t die mit einem Migrations-Inhibitions-Faktor

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(MIF) in Kontakt kommen, bestimmt wird, wobei der von Lymphozyten ausgeschieden wird,, welche gegen Tumorgewebe sensibilisiert sind, bei dem als zellenförmige Blutbestandteile die zu untersuchenden Lymphozyten als Teil, einer Leukozyten-Suspension einem an sich bekannten Migrätions-Inhibrbions-Test unterzogen werden, in dessen Verlauf die Lymphozyten mit einem zur Bildung von MIF anregenden Antigenen in Kontakt gebracht und anschließend inkubiert

werden, und nach'einer festliegenden Zeitspanne die LeuKozytenwanderung inhibiert und fixiert wird.

Es sind verschiedene Migrations-Inhibitions-Tests bekannt, die sich grundsätzlich für die Untersuchung gemäß der Aufgabenstellung eignen. Bekannt ist unter anderem die sog. Kapillartechnik nach S0BORG und BENDIXEN. Zur Realisierung des Erfindungsgedankens ist es erforderlich, die Mobilität der Indikatorzellen durch "Einfrieren" eines nach einer bestimmten Zeit erreichten Wanderungszustandes zu messen.

Gemäß Erfindung wird vorzugsweise die Ausbreitung bzw. Mobilitätsänderung der L«oK.ozyten innerhalb einer sehr feinen,etwa 10,Um dicken "offenen" Kapillarschicht gemessen. Als besonders geeignet hat sich eine Testanordnung erwiesen, die aus einem Zweischichtenelement besteht, nämlich aus einem Träger aus einem inerten Medium, z. B. Glas, und einem Agar, der mit Nährstoffen für Blutzellen angereichert ist. Als Agar eignet sich insbesondere ein unter dem Namen Agarose im Handel befindlicher Agar, der von der Firma Behring-Werke, Marburg, hergestellt wird.

Die Zwischenschicht zwischen Agar und Trägerschicht

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ist vorzugsweise teilweise flüssigkeitsgefüllt. Sie weist eine Dicke von etwa 1 - 20 um auf« Vorzugsweise wird eine Inkubationszeit beim MIT zwischen 10 und 30 Sekunden gewählt bei einer Temperatur von 37 bis 37,5 und einer relativen Luftfeuchte von 90 bis 100 ^/0.

Der Test wird mit einer Probe mit aus Humanblut gewonnenem s leukozytenreichem Überstand ("buffycoat") mit einer festliegenden Anzahl von Leukozyten zwischen 10 und 10' pro Probe durchgeführt* Bei diesen Standard- vierten handelt es sich um erprobte Werte, die eine übermäßige Blutentnahme bei den Patienten nicht erfordern«

Der buffycoat»Probe wird eine Antigenlösung im Verhältnis 1 : 50 bis 1 % 10 hinzugegeben· Dabei können Antigonlösungen benutzt werden, die nach einem von CASPAR! und FIELD angegebenen Verfahren gewonnen werden oder mit Hilfe einer 3 m KOl»Extraktion nach MELTZER gewonnen wurden* Als Ausgangsmaterial dienen menschliches Malignomgewebe aus Operationen oder menschliche Hirnsubstanz ο Es ist ,jedoch auch möglich^ Antigenlösung aus in vitro gezüchteten Tumorzellen zu gewinnen«. Eine solche Lösung enthält zwischen 50 bis 200 mg Tumorantigen pro I₀OOO ml eines geeigneten wäßrigen Lösungsmittels»

Die Testmethode gemäß Erfindung läßt sich nicht nur auf eine unspezifische Malignom-Untersuchung anwenden, sondern auch erweitern auf eine organspezifische Untersuchung * l/erden Antigene verwendet, die aus Carcinomgewebe bestimmter Organe gewonnen worden sindj so reagieren Lymphozyten von Patienten, die von den gleichen

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Organ-Carcinomen befallen sind, in der beschriebenen V/eise. In der Literatur wird beschrieben, daß ζ.B, aus Mammacarcinom nach CASPAR! und FIELD oder MELTZER gewonnene Antigen* lösung eine spezifische Reaktion ausschließlich für Lymphozyten ergeben, die von Kranken mit Mammacar ζ inom stammen.

Es ist auch möglich, bei Vorliegen einer positiven Immunantwort bei einem allgemeinen Test, d.h. bei Verdacht auf ein Carcinom, eine Serie von Tests mit organspezifischen Antigenen durchzuführen und damit in relativ kurzer Zeit herauszufinden, welche Organe von einem Carcinom befallen sein könnten.

Sehr wesentlich ist, daß die sog. Immunantwort, d.h. das Hervorrufen des Verlangsamungseffektes, bei der Bewegung der Indikatorzellen in vorliegenden Tests überraschenderweise dadurch verstärkt werden kann, daß der Probenlösung eine Lösung mit sogenanntem Transferfaktor beigeführt wird. Die Zahl an Leukozyten, aus denen die zugefügte Transferfaktor-Menge gewonnen wird, verhält sich zu der Zahl der Leukozyten, die in der Probe vorhanden sind, wie 1 ί 1 bis 1 ι 100» Dieser Transferfaktor ist aus

der Immunologie bekannt (siehe ζ. B. M. Rosenthal; Der Transferfaktor und seine therapeutische Anwendung; Schweiz, md. Wschr., Bd. 104, 1974; S. 1501 ... 1506). Der Transferfaktor kann aus normalen Blutleukozyten hergestellt werden. Er stellt einen subzellulären, dialysierbaren, nichtxmmunogenen Leukozytenfaktor dar, der für die T-lymphozytenabhängige Reaktion verantwortlich ist. Es werden Transfer-Faktor-Präpesrate angeboten (SCHURA, Krefeld), die mittels Fraktion in flüssigem Sauerstoff und nachfolgender stufenweisen Ultrafraktionierung hergestellt sind. Eine im Handel befindliche Einheit enthält Transferfaktor von ca. 5 . 10 Leukozyten« Das Präparat ist mit 1 %iger Hunianalbuminlösung stabilisiert.

Es zeigt sich, daß bei Zugabe von Transferfaktor eine Verstärkung der Immunantwort zu erreichen ist. Durch die Zugabe des Transferfaktors wird daher die Diskriminierung der einzelnen Probetests noch wesentlich verbessert.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine Testplatte zur Durchführung des Verfahrens, die aus einer flachen Trägerplatte aus inertem Material, z. B. Glas, besteht, auf das eine 0,5 ... 5 mm dicke erstarrte

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Agar-Schicht von 1 - 20 um Dicke aufgebracht ist, die wenigstens zwei im wesentlichen kreisrunde Stanzlöcher mit einem Durchmesser zwischen 0,5 und 5 mm (vorzugsweise 2,2 bis 3»0 mm) aufweist. Jedes Stanzloch hat etwa ein Fassungsvermögen von 5 ··· 20, vorzugsweise 8 ul Testsubstanz.

Wichtig ist, daß die Stanzlöcher so geschnitten sind, daß die Uniformität der kapillaren Wanderungsschicht auch im Bereich des Überganges vom Stanzloch zur Schicht gegeben ist.

.Ausführungsbeispiel ...

Die Erfindung wird anhand von Beispielen erläutert. In der beiliegenden Zeichnung zeigen?

Figo 1: zeigt eine Testplatte gemäß der Erfindung in Draufsicht,

Fig. 2: zeigt eine Testplatte im Schnitte

Beispiel 1

A Geginriung der Leukozytensuspension

30 ml Humanblut werden mit 300 USP~Einheiten ITa-

Heparinat heparinisiert. Das heparinisierte Humanblut (Patientenblut) wird in einem Kunststoffröhrchen mit 8 ml 6 Gew.-% Dextranlösung in physiologischer Kochsalzlösung (Molekulargewicht des Dextrans: 75.000) unterschichtet. Danach läßt man die Erythrozyten bei 37 C im Wärmeschrank für etwa 45 min sedimentieren. Der leukozytenreiche Überstand (buffycoat) wird abgehebert und mit gleichem Volumen 0,9 Gew.-%iger NaCl-Lösung gemischt, danach 15 min zentrifugiert mit einer Beschleunigung vo_n 750 g. Das sich in der Zentrifuge abscheidende Pellet wird erneut noch zweimal in jeweils 10 ml Hank's-Lösung (pH 7,2) gewaschen und in einem Tc 199-Medium (Herst.: Ser^a, Heidelberg) suspendiert. Beim Waschen und Suspendieren werden die Zellen mit einer Pipette aufgewirbelt, bis makroskopisch keine Zellklumpen mehr zu erkennen sind. Die Leukozyten werden nach Färbung mit Türkscher Lösung in der Neubauerkammer gezählt und auf 2 . 1Q Zellen/μΐ in Tc 199-Medium eingestellt. Im Mittel ergeben sich für axe Probe 25 % mononucleäre Zellen (Lymphozyten und Monozyten) sowie 75 % Granulozyten. Die Erythrozytenkontamination ist geringer als 1 zu 1.

B Herstellung der Antigenlösung

Zur Herstellung der Antigenlösung ist der encepha-Ütogene Faktor (EF) oder das basische Protein aus Karzinomgewebe (CaBP) zu isolieren.

Der Tumor bzw. das Gehirn werden unter sterilen Bedingungen so schnell wie möglich nach der operativen Entfernung bearbeitet. Bindegewebe und gesundes Gewebe werden vom Tumor entfernt. Danach wird das Tumor- bzw. Hirngewebe mit einer sterilen Schere (Skalpell) in kleine Stücke zerschnitten und im Homogenisator im Eisbad weiter zerkleinert. Das Tumorgewebe darf sich bei diesem Vorgang nicht

erwärmen. Das Homogenat wird im vierfachen Volumen destillierten Wassers suspendiert und danach bei 23.000 g zentrifugiert. Das entstehende Pellet wird erneut in dem vierfachen Volumen 0,9%iger NaCL-Lösung suspendiert, homogenisiert und 30 min bei 2 3.000 g zentrifugiert. Das wiederum um vierfachen Volumen destillierten Wassers resuspendierte Pellet wird gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wird im Verhältnis 1 : 10 mit einem Chlorroform/Methanol-Gemisch (2 : 1) versetzt und 30 min gerührt. Das Gemisch wird bei 600 g 10 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.

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Dieser Arbeitsgang wird zweimal wiederholt. Das Pellet wird luftgetrocknet. Das trockene Pellet wird im fünffachen Volumen einer 5%igen NaCl-Lösung in Wasser resuspendiert und 30 min bei 23.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Unter Zugabe von n/100 NaCl wird das wiederum in dem fünffachen Volumen destillierten Wassers resuspendierte Pellet auf einen pH von 3,5 eingestellt. Die Suspension wird 30 min leicht geschüttelt, dann erneut 30 min zentrifugiert bei 23.000 g. Der Überstand wird verworfen. Nochmals wird das Pellet resuspendiert in der fünffachen Menge destillierten Wassers, welches mit n/100 HCl auf einen pH von 2,6 eingestellt wird und für 3 bis 18 Stunden stehengelassen wird. Der pH-Wert darf sich während dieser Zeit nicht verändern. Die Suspension wird bei 23.000 g 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird aufbewahrt, das Pellet wird erneut in n/100 NaCl bei pH 2,6 gewaschen, zentrifugiert. Der hier entstehende überstand wird aufgehoben. Die beiden letztgenannten Überstände werden zusammengebracht und dann gegen destilliertes Wasser dialysiert. Danach erfolgt eine Gefriertrocknung.

Eine Antigen-Testlösung wird durch Auflösen von

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0/1 mg/ml der gefriergetrockneten Substanz in destilliertem Wasser erhalten. Das im Prinzip gleiche Herstellungsverfahren gilt auch für eine Lösung des basischen Proteins aus Tumprgewebe (CaBP).

C Herstellung der Testplatte (Vergl. auch Fig. 1 und 2)

0,5 g eines speziellen KuItür-Agars (Agarose; Hersteller Behring-Werke, Marburg) werden in 50 ml Erlenmeyerkolben eingewogen. Hierzu werden 22,5 ml steriles aqua bidestillata zugegeben.

In einen zweiten Erlenmeyerkolben werden 22,5 ml des doppelt konzentrierten Tc 199-Medium und 5 ml aus Humanblut gewonnenes Plasma gegeben. In einer Halterung wird die Agarose unter leichtem kreisenden Schütteln im siedenden Wasserbad gelöst. Der Erlenmeyerkolben wird dabei mit einer Folie oder einem Stopfen verschlossen, da sonst ein Teil des Wassers verdampfen würde.

Nach vollständiger Lösung der Agarose läßt man sie im Wasserbad auf 47° C abkühlen. Im gleichen Bad

wird dann das Medium-Plasma-Gemisch vorgewärmt und unter Schütteln der Agarose zugesetzt, so daß jetzt 50 ml einer 1 %igen Agarose in einfachem Tc 199-Medium mit 10 % Plasma vorliegen.

Mit einer vorgewärmten Auslaufpipette werden jeweils 5 ml des Agars in runde Gewebekulturschalen (Petrischalen) 10 mit 50 mm Durchmesser gefüllt, die in Fig. 1 in Draufsicht dargestellt sind. Nach Erstarren des Agars werden mit einer Teleskopstanzkanüle (Behring-Werke, Marburg) unter Zuhilfenahme einer Schablone Löcher 11 mit 2,5 mm Durchmesser in den Agar gestanzt. Dabei ist bei dem Ausstanzen darauf zu achten, daß im Stanzbereich die Agarschicht nicht von der Glasschicht abgelöst wird, damit sich die Kapillarschicht nicht vergrößert und so die Wanderung der LeuK<ozyten nicht mehr gewährleistet ist.

Die Anordnung der Löcher 11 ergibt sich aus der Fig. 1. Selbstverständlich sind weitere Figurationen denkbar. Die Figur 2 zeigt einen vergrößerten Schnitt durch den unteren Teil der Schale 10. Es ist angedeutet, daß die Agarschicht 1 von der Glasschicht der Schale 10 durch eine dünne Kapillarschicht 3

getrennt ist. Die einzelnen Reihen der Löcher sind beispielsweise vorgesehen für: A Kontrolle (Standard) B Testsuspension mit allgemeinem Antigen C Testsuspension mit organspezifischem Antigen

D Testsuspension mit organischem Antigen und Transferfaktor.

Reaktion, Inkubation und Fixierung

Für einen Test werden folgende Ansätze gemacht:

1. mit je 100 μΐ Leukozytensuspension nach A und 8 ul Antigensuspension nach B;

2. mit je 100 ul Leukozytensuspension und 8 μΐ η/100 NaCl-Lösung (für den Bezugswert).

Die gemischten Ansätze 1 und 2 werden für 60 min bei 37° C im Wärmeschrank bei 100 % Luftfeuchte inkubiert. Dann.wird von der inkubierten Lösung in jedes Stanzloch 8 μΐ leukozyten- und antigenhaltige Substanz bzw. Standardsubstanz eingefüllt. Für die Auswertung der Leukozytanmigration und der Beeinflussung durch die von den Lymphozyten produzierten, die Migration verlangsamenden Faktoren stehen je nach Konfiguration

der Testplatte (Anzahl der Stanzlöcher) 2-5 Meßergebnisse sowie 2-5 Bezugswerte zur Verfügung. Die in der Suspension enthaltenen Zellen, die zu Versuchsbeginn in die Stanzlöcher eingeführt sind, wandern in die Zwischenschicht 3 zwischen Agar und Oberfläche der Schale. Durch eine Inkubation der Platten bei 37 . C im Wärmeschrank über 18 Stunden wird diese Wanderung über eine definierte Spanne aufrechterhalten. Die Leukozyten wandern nicht in den Agar hinein, sondern beziehen aus ihm lediglich die Nährstoffe. Die Inkubation wird bei einer relativen Luftfeuchte von 100 % in einem Feuchteschrank durchgeführt.

Nach der Inkubation werden die Platten 15 min lang mit Methanol und anschließend 10 min mit Formalinlösung (37 Gew.-% Methanal) überschichtet. Anschließend wird der Agar vorsichtig als Haut vom Schalen-.boden abgezogen. Die in der Zwischenschicht 'gewanderten Zellen sind jetzt an der Oberfläche der Schale fixiert. Nach dem Trocknen werden die Zellen nach Pappenheim eingefärbt, wobei sich dunkelviolette Halos f (Wanderungshöfe) auf der Plattenoberfläche ergeben (vgl. Fig. 1).

E Ausmessen und' Ermitteln der Ergebnisse

Mit einer Meßlupe (Bausch & Lomb) wird der Durchmesser des Wanderungshalo gemessen. Dabei sind die in der Peripherie vereinzelt liegenden polymorphkernigen Zellen rn.it zu erfassen. Aus jeweils mehreren Messungen wird das arithmetische Mittel gebildet.

Der Quotient aus der Migrationsfläche F₁ mit Antigen und der Migrationsfläche F₂ ohne Antigen ergibt einen "Migrationsindex" MI:

mi = F₁Zf₂.

Ein Migrationsindex < 0,85 bedeutet Hemmung der Leukozyten in signifikantem Maße und somit eine positive Zellantwort. Die folgende Tabelle zeigt ein Meßbeispiel:

Reihe 0 (mm) F (mm') MI

ß 6,75 F, = 35,8 0,80

A 7,55 F₂ = 44,75 (1)

Erste Untersuchungen bei insgesamt 97 Patientinnen sollten die Wirksamkeit des Migrations-Inhibitions-

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Testes beim Mammacarzinom ergeben. 27 von 46 untersuchten Patientinnen mit Mammacarzinom zeigen eine Hemmung, die stärker als 15 % ist (= 58,7 %), d. h. der Migrationsindex MI liegt unter 0,85. Bei den 23 untersuchten Patientinnen mit Mastopathie zeigen nur vier von 23 eine solche Hemmung.(= 17 %), bei Patientinnen mit Fibroadenom zeigte eine Patientin von fünf (= 20 %) eine Hemmung. Die folgende Tabelle gibt eine Gesamtübersicht:

Diagnose

Pat.-Zahl (n)

Migrationsindex (gehemmt) (normal)

Kontrollen 20 Mastopathia cystica 23

Fibroadenom 5

Mammazysten 4

andere maligne

Erkrankungen 9

Mammakarzinom 46

0 (0 %) 4 (17 %)

1 (20 %) 0 (0 %)

20 (100%)

19 (83 %)

4 (80 %)

4 (100%)

3 (33 %) 6 (67 %) (58,7 %) 19 (41,3 %)

Beispiel 2

Verwendung des Transferfaktors zur Verstärkung der Immunantwort.

Es wurde bereits darauf hingewiesen, daß durch Zugabe einer Lösung mit Transferfaktor (Hersteller: SCHURA, Krefeld) eine Verstärkung der Immunantwort hervorgerufen werden kann. Es zeigt sich, daß bei Zugabe der Faktor ΜΪ stärker ausgeprägt ist als gegenüber dem Testbeispiel 1.

Es werden folgende Testansätze gemacht:

1. 100 μΐ Leukozytensuspension + 8 μΐ Antigenlösung

2. 100 μΐ Leukozytensuspension + 8 μΐ Antigenlösung + 20 μΐ Lösung Transfer-Faktor (Präparat SCHURA; 1 μΐ entspricht etwa dem Transfer-Faktor von 5 . 10 Leukozyten)

3. 100 μΐ Leukozytensuspension

4. 100 μΐ Leukozytensuspension 4· 20 μΐ Transferfaktorlösung wie bei Ansatz 2.

Inkubation und Präparation der Schale erfolgen wie im Beispiel 1. Es wird eine Schale mit vier mal fünf Stanzlöchern (2,5 mm 0) hergestellt. Je eine Reihe mit 5 Löchern wird mit 10 μΐ der Testansätze 1 bis 4 beschickt.

Ergebnisse (jeweils aus fünf Werten gemittelt):

- 20 9 631

Ansatz	Reihe	0 (mm)	F (mm²)	. MI
1	B	6,90	37,4	0,79
2	C	6,05	28,7	0,61 (einschl. Transferfaktor)
3	A	7,75	47,2	1,0 Standard!
4	D	7,70	46,6	0,99

Der niedrige MI der Reihen B/C deutet auf einen Malignomfall.

Ergebnisse mit dem Migrations-Inhibitions-Test unter Verwendung des Transferfaktors bei der Bestimmung von gastro-intestinalen Tumoren:

Es wurden Messungen mit der Meßvorschrift gemäß Beispiel 2 durchgeführt. In einer (gesunden) Patienten-Kontrollgruppe gab es keine nennenswerte Hemmung, der Migrationsindex lag bei 1,02 + 0,1. Der Transferfaktor beeinflußte diese Ergebnisse nicht. In der Gruppe der an Colon-Karzinomen erkrankten Patienten lag der Migrationsindex bei 0,6 5 + 0,2. Von den 15 untersuchten Fällen zeigten immerhin 11 einen Migrationsindex, der kleiner als 0,85 war. Nach Zugabe von Transferfaktor lag der Migrationsindex bei 0,61 + 0,09. Darüberhinaus

lag bei 14 von 15 Patienten der MI nach Zugabe von Transferfaktor unter 0,85, so daß auch hier eine signifikante Verbesserung des Versuchsergebnisses erreicht worden war. In anderen untersuchten Gruppen konnte keine nennenswerte Hemmung gefunden werden.

Beispiel 3

Eine Antigen-Lösung kann auch aus Tumorzellen, die in einer Fermentationskultur in vitro gewachsen sind, mit einem neutralen Puffer unter wiederholter Aufbrechung der Gewebe extrahiert werden.

Zellen des Gehirntumors werden wie folgt in vitro gezüchtet: Es ist sorgfältig darauf zu achten, daß eine sterile Arbeitsweise angewandt wird. Die Zellen werden vorzugsweise in einer Hank'sehen Ausgleichslösung etwa 30 see lang gewaschen. Rühren ist zu vermeiden. Alle Wände und Oberflächen des Kolbens, vorzugsweise 250 ml-Kolben aus Glas, werden sorgfältig gewaschen. Die Lösung wird von den Zellen durch Zentrifugieren in der Kälte über einen Zeitraum von 10 rain geklärt. Das Medium wird in ein Becherglas gegossen» Es wird eine geringe Menge gepufferter Proteinase-EnzymlÖsung zugesetzt

und rasch gespült, um einen Abbau der Zellen zu vermeiden. Bei der bevorzugten Methode wird in einem Kolben bis zwei ml Trypsin-Lösung zugesetzt (EDTA). Die Trypsin-Lösung wird abgegossen nach Spülung von 10 see.

Anschließend wird ein gleiches Volumen einer frischen Trypsin-Lösung zugesetzt. Es wird inkubiert, bis durch mikroskopische Beobachtungen ersichtlich ist, daß sich die Zellen von den Wänden der Kammer abtrennen. Dies erfordert gewöhnlich 5-10 Minuten. Es wird ein geeignetes Wachstumsmedium, z. B. 50 ml einer Lösung einer 7-10 %igen Lösung des Serums von Kalbsföten in 100 ml F-10-Nährmedium zugesetzt.

25 ml des frischen Mediums mit den Zellen werden in eine neue Wachstumskammer (Kolben) für die Fortpflanzung überführt. Beide Kammern werden ungefähr 7 Tage lang in einen Inkubator von 35 C gegeben. Nach der Arbeitsweise dieses Beispiels bis zu diesem Punkt wird eine Kultur der künstlichen Tumorzellen in zwei frische Kulturen ungefähr alle 7 Tage geteilt. Die Verfahrensweise kann in siebentägigen Intervallen wiederholt werden. Die Anzahl der in vitro wachsenden Zellen verdoppelt

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sich demnach alle sieben Tage.

Das Medium mit den Zellen wird in ein Zentrifugenrohr überführt und in der Kälte 10 min lang bei 3.000 U/min (— ca. 2200 g) zentrifugiert. Das Medium wird verworfen. Die in der Wachstumskammer zurückbleibenden Zellen werden von den Kammerwänden abgekratzt und mit einer neutralen Pufferlösung in die Zentrifugenrohre hineingewaschen. Die Zellen werden zweimal mit einer neutralen Pufferlösung gewaschen, erneut in der Kälte bei 3.000 ü/min (= ca. 2200 g) zentrifugiert. Das Medium wird verworfen. Die gewaschenen Zellen werden in 10 ml neutralem Phosphatpuffer suspendiert, bis sie für die Extraktion bereit sind. Anschließend werden die gewaschenen Zellen in der Kälte 20 see lang mit einer Schallvorrichtung behandelt, um sie zu zerbrechen. Allerdings muß die Denaturierung der Proteine möglichst vermieden werden. Nach der Beschallung werden die Zellreste 30 min bei 30.000 U/min (= ca. 220 000 g) zentrifugiert. Das überstehende Produkt wird dekantiert. 10 ml der Pufferlösung werden zum'Waschen der zurückgebliebenen Zellreste verwendet. Es wird nochmals beschallt und zentrifugiert und d ie überstehenden Produkte werden kombiniert. Dieses Verfahren wird einmal wiederholt. Das kombinierte

überstehende Produkt wird vorverdampft,mn das Volumen von ungefähr 30 ml auf etwa 6 - 7 ml zu verhindern. Ein entsprechender Teil wird zur Gesamtproteinanalyse abgenommen.

Mit Hilfe eines Flüssigkeits-Säulen-Chromatographen und Filtrierung durch Millipore-Filter wird das Präparat dann von Verunreinigungen befreit. Einzelheiten dieses Verfahrens sind aus der DT-OS 26 06 257, Beispiel 2, zu ersehen. Es läßt sich ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10.000 gewinnen. Es wird eine Antigenlösung hergestellt, die etwa eine Konzentration von 100 mg des Antigens im Liter enthält.

Die Experimente gemäß Beispielen 1 und 2 werden mit dem künstlich gewonnenen Antigen durchgeführt. Es zeigt sich, daß das künstlich gewonnene Antigen die gleiche Wirkung hervorruft wie das aus Körpergewebe gewonnene.

Beispiel 4

Verwendung eines organspezifischen Antigens^

A Die Gewinnung der Leukozytensuspension erfolgt wie in Beispiel 1 - A.

B Herstellung einer organspezifischen Antigenlösung

Möglichst frisch gewonnenes Tumorgewebe eines Mammakarzinoms wird vom Blut, Fettgewebe und Binde- gewebe befreit und in kleine Würfel oder Streifen zerschnitten. Alle nachfolgenden Schritte werden bei 4 C durchgeführt. Die GewebsStückchen werden in einem dreifachen Volumen einer 3-molaren-Kaliumchloridlösung in ca. erbsgroße Stücke zerkleinert. Der pH-Wert dieser groben Suspension wird auf 7,4 eingestellt. Anschließend wird das Gewebe mit einem Ultraturrax®-Homogenisator (20.000 Uprn) zerkleinert. Das Homogenisat wird für 24 Stunden stehen gelassen. Anschließend wird es zentrifugiert. Den nach 60-minütiger Zentrifugation bei 4.000 g gewonnene Überstand wird für 2 Stunden gegen ein 1Ofaches Volumen Aqua destillata und dann für weitere 24 Stunden gegen das 5Ofache Volumen 0,9 %iger NaCl-Lösung dialysiert. Aus dem Dialysat werden durch Zugabe von 2 molarem Ammoniumsulfat über einen Zeitraum von 1 Stunde die Proteine ausgefällt und durch 20-minütige Zentrifugation bei 4,000 g abgetrennt. Nach Suspansion

der Proteine in einer· 0,9 %igen NaCl-Lösung erfolgt eine einstündige Dialyse gegen das 5fache.Volumen Agua destillata und eine weitere Dialyse gegen das 50fache Volumen 0,3 %iger NaCl. Nach Sterilfiltration durch einen 0,45 Milipore-Micropore-Filter wird der Antigenextrakt in kleine Ampullen abge-. füllt und bei -20° C gelagert. Vor Gebrauch wird der Proteingehalt einer jeden Charge mit der Biuretmethode nach vorangegangener TCA-Fällung bestimmt.

C Es wird die gleiche Testplatte wie bei Beispiel 1 verwendet.

Für den Test werden drei Ansätze hergestellt:

1. mit je 100 uil Leukozytensuspension aus Patientenblut gemäß Beispiel 1 - A + 8 μΐ n/100 NaCl-Lösung (für Reihe A, Standardwert)

2. mit je 100 μΐ Leukozytensuspension + 8 μΐ Antigensuspension nach Beispiel 4 - B,

3. mit je 100 μΐ Leukozytensuspension + 8 μΐ Antigensuspension gemäß Beispiel 4 - B + 15 μΐ Transferfaktor-Lösung.

Die Testplatte mit einem Lochdurchmesser von 2,5 mm

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wird mit je 8 μΐ der gemäß Beispiel 1 inkubierten Testsubstanz 1-3 beschickt. Die Ergebnisse', jeweils aus fünf Werten ermittelt, sind:

Ansatz	Reihe	7	0	F (mm )	MI
1	A	7	,70	46,5	1,0
2	C	6	,00	38,1	0,82
3	D	,10	29,3	0,63.

Das Ergebnis deutet auf ein Mammakarzinom hin, da der MI deutlich unter 0,8 liegt und das Er-^ gebnis bei Anwendung des Transferfaktors noch verstärkt wird.

Weitere Untersuchungen zeigen, daß die Ergebnisse von Patientinnen, wie bei Beispiel 1 genannt, sich noch wesentlich signifikanter verändern. Patientinnen mit Mammakarzinom zeigen bei Anwendung der Methode unter Zuhilfenahme des Transferfaktors bei über 90 % einen Migrationsindex, der kleiner ist als 0,80. Nur bei 10 % der Patientinnen mit Mammakarzinom ist der Migrationsindex größer als 0,85.

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Es wird die Mobilitätsänderung von Lymphozyten, Fremdmakrophagen und anderen Indikatorzellen in einem Kapillartest nach S0BORG und BENDIXEN gemessen. Es wird hierbei eine 10 um dicke offene Kapillare benutzt. Die Ergebnisse entsprechen denen der Beispiele 1 und 2, wobei im Prinzip gleiche Ansätze verwendet werden.

Schlußbemerkungen

Das Testverfahren ist für bestimmte Krankheitsbilder nicht anzuwenden. Falsch negative Ergebnisse ergaben sich bei allen sogenannten Leukosen. Eine Erklärung kann hierfür zur Zeit nicht gegeben werden, da gerade leukämisehe Zellen sehr reichlich basische Proteine enthalten. Auch ist die zelluläre Immunität bei diesen Patienten nicht so auffällig gestört, daß dies Ergebnis mit einer Störung des Immunsystems zu erklären wäre. Auffällig ist daher auch, daß die chronische lymphatische Leukämie, ebenso wie die akute lymphatische leukämie keine Reaktion zeigen, während die Lymphosarkome und die Lymphogranulomatosen sich verhalten wie die anderen Malignome auch. Vor der Chemotherapie wiesen jedoch

Patienten eine deutliche Hemmung auf. Bereits nach dem ersten Chemotherapie-Zyklus wird diese Hemmung jedoch aufgehoben und im zweiten Zyklus in einen falsch positiven Wert verwandelt. Weiterhin ergeben sich falsche Ergebnisse bei Patienten in Tumorkachexie. Patienten mit rasch progredient wachsen-, den Tumoren oder Patienten in der Tumorkachexie zeigen zum Teil falsche Ergebnisse, da hier eine Störung der zellulären Immunität vorliegt. Versuche zur Beantwortung dieser Frage sind noch im Gange.

Falsch positive Ergebnisse wurden in erster 'Linie bei entzündlichen und degenerativen neurologischen Erkrankungen, beispielsweise multiple Sklerose gefunden. Die Erklärung hierfür wurde von Caspary und Field in einer Kreuzreaktion zwischen dem EF und der Sensibilisierung der Lymphozyten mit Hirngewebe gesehen.

Die falschen Ergebnisse sind jedoch leicht durch eine Voruntersuchung auszuscheiden, so daß die genannten Krankheiten keinen Hinderungsgrund für die Anwendung des Tests bieten.

Claims

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Erfindungs anspr uch

In-vitro-Testverfahren zur Diagnose von malignen Tumorens vorzugsweise beim Menschen, bei welchem Test die Mobilitätsänderung von zellenförmigen Blutbestandteilen, die mit einem. Migrations-Inhi- ; bitions-Faktor (MIF) in Kontakt kommen, bestimmt wird, wobei der MIF von Lymphozyten ausgeschieden wird, welche gegen Tumorgewebe sensibilisiert sind, gekennzeichnet dadurch, daß als zellenförmige Blutbestandteile die zu untersuchenden Lymphozyten als Teil einer Leukozyten-Suspension einem an sich bekannten Migrations-Inhibitions-Test unterzogen werden, in dessen Verlauf die Lymphozyten mit einem zur Bildung von MTF anregenden Antigen in Kontakt gebracht und anschließend inkubiert werden, und nach einer festliegenden Zeitspanne die Leukozytenwanderung inhibiert und fixiert wird?

Testverfahren nach Punkt 1_S gekennzeichnet d_adurch, daß die Wanderungsgeschwindigkeitcer Leukozyten in einer kapillaren Zwischenschicht von 1-20 um Dickej. die wenigstens teilweise flüssigkeitsgefüllt ist, gemessen wird₀

Testverfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Zwischenschicht einerseits von einem iner-

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ten Medium (z.B_e Glas) und andererseits von einer mit 'Nährstoffen angereicherten Agar-Schicht begrenzt ist*

Testverfahren nach einem der Punkte 1 bis 3» gekennzeichnet dadurchs daß der Test mit einer Probe mit aus Humanblut gewonnenem leukozytischem Überstand ("buffycoat') mit einer festliegenden Anzahl von Leukozyten zwischen 10^ und 10' pro Probe erfolgt«

5c Testverfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß der Probe eine Antigenlösung nach CASPAEX und FISLD oder ein 3 m KCl-Extrakt aus Tumorgewebe nach MELTZER im Verhältnis (Volumenprobe zu Antigenlösung) von 1 % 60 bis 1 s 10 hinzugegeben wird»

Testverfahren nach Punkt 5s gekennzeichnet dadurch, daß der Probe eine organspezifische Antigenlösung zugegeben wird.

7* Testverfahren nach Punkt'4, gekennzeichnet dadurch^ daß der Probe eine aus in-vitro~gezüchteten Tumorzellen gewonnene Antigenlösung hinzugefügt wird, ν; el ehe zwischen 50 bis 200 mg Tumorantigen pro 1,000 ml eines geeigneten wäßrigen Lösungsmittels enthalte

8c. Testverfahren nach einem der Punkte ¹A- bis 7» gekennzeichnet dadurch _f daß der Probe neben der Antigenlösung zusätzliche Transfer-'.?aktor-Lösung hinzugesetzt wird.

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9_β Testverfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch_s daß die Zahl an Leukozyten, aus denen die zugefügte Transferfaktor-Menge gewonnen wird, sich zu der Zahl der Leukozyten, die in der Probe vorhanden sind, wie 1 ;1 bis 1 % 100' verhalte .

Testverfahren nach einem der vorhergehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß die Inkubationszeit beim Migrations-Inhibitions-Test zwischen 10 und 30 Stunden bei einer Temperatur von 35 bis 37>5 ⁰C bei einer relativen Luftfeuchte von 90 bis 100% liegt«

11« Testplatte zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Punkte 1 bis 10, gekennzeichnet durch eine flache Trägerplatte oder -schale (10) aus inertem Material (z,B, Glas), auf das eine 2 - 5 ™ dicke, erstarrte Agar-Schicht aufgebracht ist, wobei sich zwischen der Trägerplatte oder -schale (10) und. der Agar-Schicht eine kapillare Wanderungsschicht von 1-20 um Dicke befindet und die Agar-Schicht wenigstens zwei im wesentlichen kreisrunde .Stanzlöcher (11) mit einem Durchmesser zwischen 0,5 und 5 nun, vorzugsweise 2,5 nun, aufweist»

12® Testplatte.nach Punkt 11, gekennzeichnet dadurch, daß die Stanzlöcher so geschnitten sind, daß die Uniformität der kapillaren Wanderungsschicht auch im Bereich des Übergangs vom Stanzloch zur Kapillarschicht gegeben ist«

Hierzu /f. Seite Zeichnung