NO822677L - Markert immunologisk aktivt middel. - Google Patents

Description

f- Ioreliggende oppfinnelse vedrører et.markert, immunologisk aktivt middel, en fremgangsmåte ved fremstilling av dette midlet, en immunologisk fremgangsmåte for påvisning hhv. ;

bestemmelse av en substans med dette middel samt anvendelse av dette middel i en immunologisk påvisningsmetode.

Det er kjent at mange immunologisk aktive stoffer så som f. eks. antistoffer, ikke kan markeres med f. eks. J eljler j med peroksidase uten tap av deres immunologiske aktivitdt. Dette gjelder særlig for de monoklonale antistoffer som fremstilles etter den kjente metoden til. Kohler og Milstiein (Nature, _256, 495. f, 1975).

Det foreligger følgelig et behov for å finne en universell metode ifølge hvilken immunologisk aktive materialer kan markeres uten tap av deres immunologiske aktivitet.

i Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse har man nå fun-

ni et at man kan binde biotin kovalent til immunologisk i aktive materialer, og at man dertil kan binde avidin som j e! t e-nzym er 'bundet kovalent til.

F1 oreliggende opp" finnelse vedrører følg' elig et kompleks siom i bestar av et immunologisk aktivt materiale hvortil biotin er bundet kovalent og avidin, hvortil et enzym er bundet kovalent. i

Spesielt egnede immunologiske aktive materialer er antistof-r

i ii fer eller antigener. Særlig egnet er monoklonale museanti-

stoffer. Blant de monoklonale museantistoffer har spesielt

i

d' e vist seg egnet som er rettet mot heptatitt B virus ovi e■ r-'i flateantigen og de som er rettet mot det carcinoembryonale<1>antigen (CEA).. j i ! !

innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse kommer alle ei nzymer på tale som anvendes ved i■ mmunolo■ giske metoder, dvs;I. f.eks. alkalisk fosfatase, malat-dehydrogenase, glukose--6- j f osf at-dehydrogenase , glukose-oksidase , glukoamylase , galac^to-

sidase, acetylcholinesterase og peroksidase. Særlig fore-I • I

tjrukket har peroksidase vist seg å være. Spesielt egnet er peroksidase fra pepperrot.

fremgangsmåte ved fremstilling av komplekset Ifølge oppfinnelsen består.i at man binder biotin kovalent til et immunologisk aktivt materiale, binder avidin kovalent til et enzym cjg blander de to fremstilte produkter med hverandre. Det erholdte kompleks kan deretter lyofiliseres på i og for seg. kjent måte.

Den kovalente binding av biotin til det immunologisk aktive materiale kan skje på i og .for seg kjent måte idet man i tllander det immunologisk aktive materiale i svak basisk | puffet løsning med en løsning av biotin-succinimidester i ; dimetylsulfoksid. For a rense produktet kan man deretter'dialysere mot fosfatpuffer koksaltløsning. Den fosfatpufjredé koksaltløsning kan inneholde desinfeksjonsmidler så som 1 "Thimerosal" (Fluka) eller merfen.

D!a forholdet mellom det immunologisk aktive materiale og biotin-succinimidesteren er kritisk for en vellykket reak-I i sjon, må dette forholdet bestemmes spesielt for hvert immunologisk aktivt materiale.

i

■ ki oplingen av enzymet, spesielt av pepperrotpe' roksidasen tI il avidinet kan skje ved kjente metoder, f.eks. etter metod!e<n>til Wilson og Nakane i "Immunfluorescence and Related Stjainy ilng Techniques , " 19 78 , side 215 ff. j

For å fremstille komplekset ifølge oppfinnelsen kan en løs-, ning av det immunologisk aktive materiale til hvilket biotin ei r bundet kovalent, blandes med en løsning av avidin tilli hvi veid lkreomt teemnpzyemraett uerr .. Fbounr deå t sktoabvailleinster. e Omdeset tndainnngeedn e kkan ompfolerkejtsas

kan dette lyofiliseres på i og for seg kjent måte. i i Komplekset ifølge oppfinnelsen kan anvendes i alle immuno-

siieg giå skve æpre åvdiesn ninsgåksmaelttoe desrån. dwEn ichsp-meestioedlt e.egnet metode har vist

Oppfinnelsen vedrører følgelig en sandwich-metode for påvisning hhv. bestemmelse av et substans som erkarakterisertved at substansen som skal bestemmes inkuberes med en immunologisk aktiv reaksjonspartner, som er eller blir bundet lii en vannuløslig bærer, og et kompleks bestående av et immunologisk aktivt materiale hvortil biotinet er.bundet, og avidin, hvortil et enzym er bundet kovalent, og at den enzymmatiske aktivitet etter adskillelse av fast og flytende ::ase enten måles i den faste eller i den flytende fase, og derav tilstedeværelsen, hhv. mengden av substansen som skal bestemmes konkluderes. -VeI d denne sandwichmetode kommer sp" esielt antiqener på tal!esom substanser som skal bestemmes. Spesielt foretrukne antigener har vist seg å være hepatittvins B overflateaktig gen samt det carcinoembryonale antigen (CEA).

V^d denne sandwichmetoden anvendes fortrinnsvis to forskjellige antistoffer som immunologisk aktive reaksjonspartnere, hvilke er rettet mot det samme antigen, men forskjellige epitoper av dette antigen. For dette formål, kommer speiélt to

i •• I forskjellige monoklonale museantistoffer på tale. De etter-følgende eksempler anskueliggjør oppfinnelsen.

Det monoklonale antihepatitt B virus overflate antihepatLtt"B virus overflateantigen-antistoff (anti HBs) som anvendes i eksemplene får man ved metoden til Fazekas et al. i Journal of. Immunological Methods, 35, 1-21 (1980) idet musene immuniseres med he<p>atitt B virus overflateantigen. For fusjonen anvendes den av Fazekas (loe.eit) beskrevne myelomlinje

i J Fp. De erholdte hybridomer sprøytes på i og for seg kjent måte. i.p. i BALB/c mus, og den dannede aszites-væske an<y>end-es for frembringelse av antistoffene. For eksemplene anvendes to antistoffer som er rettet mot forskjellige epitoper av hjepatitt B virus. overf lateantigen, og som kalles anti-HBs-1

hhIv<.>anti-HBs-2-. LgG-fraksjonen av antistoffene utvinnes ved ammoniumsulfatfelling og kromatografi på dietylaminoetyl-

Dcee lmlounlooks■e lonav ale asmzuitseens-anvtæiskCEeA.-antistoffer som anvendes i eksemplene får man likeledes anologt med den i Journal of Immunological Methods, 32 (1980) 297-304 beskrevne metode, hvorunder imidlertid myelomlinjen Sp 2/01-Åg anvendes som u^gangscellelinje for fusjonen, hvilke er innsendt under njr.- CRL 8006 til ATCC den 25 .5 .1979 og ble gjort ubegrenset offentlig tilgjengelig den 24.11.1981. Fusjonen skjer med miltceller fra mus som ble immunisert med CEA. ImmuniserjLng av musene skjedde analogt med den nevnte publikassjon i tabell 1, "hvorunder de første to immuniseringer skjedde med 50 |ig CEA, immuniseringene 3 og 4 ble utelatt, immunisering 5 med -50 ug CEA og immuniseringene 6-8 med 200 ug CEA. Det anvendes to forskjelligeregnede monoklonale antistoffer, som er rettet mot forskjellige epitoper av CEA antigen og som -kalles anti-CEA' (C-3) hhv. anti-CEA(C-19).

EKSEMPLER

Eksempel 1

■ IjgG-f raks jonen av anti-HBs-1 hhv. anti-CEA (C^3)antistoffer djialyseres natten over ved 2-8°C mot 0,1 mol/l natriumbi-karbonatløsning (pH 8,2-8,5) og innstilles på en protein-konsentrasjon på 1 mg/ml. Dertil blandes.pr. ml protein-løsning 120 pl av en helt friskt fremstilt biotin-succinimic-ester-løsning (1 mg/ml i dimetylsulfoksyd) og inkuberes 4 timer ved romtemperatur. Deretter dialyseres biotin-anti-S|toffkonjugatet ved 2-8°C mot fosfatpufret fysiologisk kpk-saltløsning med 0,66 mg/l merfen.. Som proteinstabilisator tilsettes 10 mg/ml storfeserumalbumin.

"For koplingen av peroksidase til avidin oppløses 5 mg avidir. i 2,5 ml av en 0,1 mol/l natriumbikarbonatløsning (pH 9,5) ojg dialyseres natten over ved 2-8°C mot den samme løsnihg.

10 mg peroksidase fra pepperrot oppløses i 3,0 ml dest. vann, får stå en time ved romtemperatur, blandes med så medl 0jI ,5 ml av en vandig frisk fremstilt 0,1 mol/l natriumperri joda't-løsning og inkuberes nøyaktig 20 min. ved romtemperatur.. j De' retter befris peroksidasen ved ultrafiltrering for ovet; - ii skudd av natriumperjodad og konsentreres til det opprinnelige vjolum. Etter ultrafiltreringen blandes peroksidaseløsninjgen j med avidinløsning, hvorpå man inkuberer -2 timer ved romtemperatur. For reduksjon av schiffske baser og dermed for stabil

; • ■ 'i Tisering av den kovalente binding tilblandes avidin-peroksi-daseløsningen 0,5 ml av en friskt fremstilt, vandig 0,1 mol/l natriumborhydridløsning, hvorpå man inkuberer minst 2 timer- j ved 2-8°C. Deretter dialyseres avidin-peroksidase-konjugatet mot fosfatpufret fysiologisk koksaltløsning med 0,66 mg/;l merfen og stabiliseres med 10 mg/ml storfeserumalbumin. j

For a danne komplekset blandes 55 ,ul anti-HBs-l-antistof,f-b' iotin-konjugat hhv. 55 ul anti-CEA (C-3) antistoff-biotjI in- ;i konj ug a-t med 4 8 ul avidin-peroksidase-kon jugat og inkuberes .15 min. ved romtemperatur. Dannelsesforløpet a<y>komplekset

kan kontrolleres idet man inkuberer en del av løsningen j-etter passende fortynning med fosfatpufferet, fysiologisk koksaltløsning, med antimus IgG-antistoffer, som er bundet tii l en uløselig bærer. Når dannelsen av komplekset har fuInnet sted, kan enzymaktiviteten etter separasjon av den flytende fase påvises på kjent måte i den faste fase.

Komplekset kan lyofiliseres på vanlig måte.

:For anvendelsen ifølge oppfinnelsen fortynnes komplekset i

tilfelle ahti-HBs-l-antistoff med en løsning som inneholder CP, 25 mol/l natriumdihydrogenf osf at, 10 g/l storf eserumalbu-'min og 0,66 mg/l merfen og 0,04 g/l 4-amino-antipyrin, og

j<i>nnstilles på pH 7,0 og i tilfelle anti-CEA (C-3) antistoff , fortynnes med en løsning som inneholder 0,20 mol/l natriumdi-j-hydrogenf osf at, 2 g/l storf eserumalbumin , 20% geiteserumj,0 ,|5 g|/l "Thimerosal" og 0,1 g/l 4-amino-antipyrin og innstilles på pH 6,5. !

li ,. EK■SEMPLER

For å påvise hepatitt B virus overflateantigen i human sera | ' el' ler plasma inkuberes 0,0 5-0,15 ml av prøven i en rundbuInnet:mikrotiterplate med polystyrenkuler med 3,2 mm tverrsnitt, som er forsynt med IgG-fraksjonen av anti-HBs-2-antistoffer ! og 1 0,0o 5 ml av det i eksempel 1 beskrevne kompleks i en tiijme ved 4 5 . Komplekset fortynnes med den i eksempel 1 beskrevne

I

fortynningsløsning 1/500 fortynnet og anvendes i denne forjtyn-ning. Etter inkuberingen vaskes polystyrenkulene i titer-j platen med dest. vann, hvorpå peroksidaseaktiviteten på den i faste fase måles ved inkubering av polystyrenkulene i 0,ll ml o-fenylendiamin (4 mg/ml i 0,1 mol/l kaliumcitratpuffer, jpH 5,0 med 6 mmol/1 vannstoffperoksyd). Enzymreaksjonen stopi-pes etter 30 min. ved tilsetning av 0,1 ml 4N svovelsyre jOg 2,5 mol/l koksalt og fargereaksjonen avleses for øye eller med et egnet fotometer for mikrotiterplater. Ved sammenligning med positive eller negative prøver avgjøres om prøven som - Ii skal undersøkes har hepatitt B virus overflateantigen.

i i Eksempel 3 |

' I •

For å påvise CEA i human sera eller plasma pipetteres i hvert av de nødvendige prøverør (10x75 mm) 0,2 ml prøveløsning 1 (0,2 mol/l natriumfosfatpuffer med pH 6,5 med 2 g/l storfe- , serumalbumih, 20% normalt geiteserum, 0,1 g/l 4-amino-antipyrin og 0,5 g/l "Thimerosal" og 480 ng/ml monoklonalt mus anti-CEA-(C-3)-biotin/avidin-peroksidase), 0,050 ml av pasient-prøven som skal analyseres, hhv. CEA-standarden (0 ng/ml ;CEA, 5,0 ng/ml CEA, 10 ng/ml CEA og 20 ng/ml CEA) og CEA-kontroll-serumet (5,0 ng/ml CEA) tilblandes, hvert tilføres en poly- , styrenkule (0 = 6,5 mm) sensibilisert med monoklonalt muse-anti-CEA-(C-19) og inkuberes ved 37° i 16 timer. Deretter vaskes polystyrenkulene 3 ganger med 2-5 ml dest. vann, over-j-Iføres i 0,,5 ml substatpuf f er (0,1 mol/l kaliumcitrat med IpH J<!>5,0 med 6 mmol/1 f^C^°9^ mmo^-/^ L o-f enylendiamin) for akti-p 1 ■ . 1 Ivitetsbestemmelsen av peroksidasen som er immunologisk bundet

i 1 ■ o '-li til kulen og inkuberes 30 min. ved 18-36 . For å avbryte jperoksi-|daseaktiviteten samt for økning av fargeintensiteten tilblandes 2,0 ml 1 N HC1 og ekstinksjonen måles i løpet av 30 min. fotometrisk ved bølgelengden 492 nm. I tabellen er tallene for en CEA-bestemmelse oppført og sammenlignet med

iidseé n tatlil l mROan CHEfi.kk med den radiologisk-immunologiske bestemmel-

: i

Claims (1)

1! . Komp' leks karakterisert ved ajit d,et består av et immunologisk aktivt materiale til' hvilket biotin er bundet kovalent og avidin-til - hvilket et enzym <j> e;r bundet kovalent.

2\! . Komp* leks ifølge kr-av 1, karakterisert vi e d at det immunologisk aktive materiale er et antistoff eller et antigen. ; l ! '! ! 3. Kompleks ifølge krav 2, karakt e. riser !t I v e d at antistoffet .er et monoklonalt museantistoff. > 1 i i i ii 4. Kompleks ifølge krav 3, karakterisert , |-V| e d at det monoklonale museantistof f er et museantistpf f mot .hepatitt B virus overf lateantigen.

;-5. Kompleks ifølge ett av kravene 1-4, k a r a k-i t! e r i s e r t ved at enzymet er peroksidase-. i

,6. Kompleks ifølge ett av kravene 1-5, k a r a k-;terisert ved at peroksidasen er pepperrotperoksi^ . dase. - I i ■ ' < -i

7. Kompleks ifølge ett av kravene.1-6, k a r a k- j 'terisert ved at komplekset foreligger i lyofili- sert form; j 8,. Fremgangsmåte ved fremstilling av et kompleks', karakterisert ved at man binder biotin kovalent til et immunologisk aktivt materiale, binder avidin !kovalent til et enzym og blander de to erholdte produkter. '. med hverandre.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, k a r a k t e ri i- i sert ved at man lyofiliserer det erholdte kompleks, i i i i i ■ 10'. Sandwich-fremgangsmåte ved påvisning hhv. besjtem-j-melse av en substans, karakterisert v'e d at substansen som skal bestemmes inkuberes med en immunologisk aktiv reaksjonspartner til hvilken en vannuløselig bærer er bundet eller bindes, og et kompleks bestående av et I immunologisk aktivt materiale til hvilket biotin er bundet kovalent og avidin til hvilket et enzym er bundet kovalent, og at etter adskillelse av fast og flytende fase måles den enzymmatiske aktiviteten enten i den faste eller i den flytende fase, og derav nærvær hhv. mengden av substansen! som skal bestemmes avgjø res. I i i 11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, k a r a k t e jr i-s e r t ved at man som substans som skal bestemmes anvender et antigen. | <1> !

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, k a r a k t e jr i-j-sert ved at man som antigen anvender hepatitt B j i i1 i virus overflateantigen.

13. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 10-12, karakterisert , ved at man som immunologisk aktive reaksjons <p> artnere velger forskjellige antistoffer li som er rettet mot det samme antigen men forskjellige epitoper av dette antigen. <!>

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at man som antistoffer anvender to forskjellige monoklonale museantistoffer.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakte <i> ri-sert ved at man som monoklonalt museantistoff anvender anti-hepatitt B virus overflateantigen antistoff.

16. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 10-15, i I karakterisert ved at man som enzym anvender: peroksidase. J! -'li i17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakter ij-isje r t ved at man som peroksidase anvender pepperrot • . ipéroksidase. I ! 18. Anvendelse av et kompleks ifølge krav 1 i en <I>s andwich -^ f rem <g> an <g> småte <.>