NO830682L - Rekombinant plasmid for fremstilling av humaninsulin - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse védrører molekylær-biologi og mer spesielt den såkalte teknikk med rekombinant DNA og oppfinnelsen ved-rører spesielt rekombinante plasmider for fremstilling av humaninsulin.

Oppfinnelsen beskriver nye genetisk oppbygde plasminder som bærer et gen som koder for human-proinsulin. Det tepresen-tative plasmid, pJW2172, illustrerer oppfinnelsen og er blitt deponert i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852, og er der tildelt ATCC nummer 31891.

Som det er vel kjent er insulin er peptid hormon som finregu-lerer en rekke vitale metabolske fenomener. I de fleste dyr syntetiseres insulin som et enkelt stort forløper-polypeptid, nemlig preproinsulin. En transportsekvens<q>g en intern peptidsekvens kuttes ut fra preproinsulinet under biosyntese •og gir et biologisk aktivt molekyl bestående av to peptidkjeder knyttet sammen ved hjelp av disulfidbindinger. Bortkutting av bare transportsekvensen gir et peptid-molekyl kjent som proinsulin. Proinsuliner er nå isolert ogkarakterisertfra et antall dyr, See Steiner D, "Peptide Hormone Precursors" i Peptide Hormones, Parsons, J.A. utgiver, McMillan Press Limited, London (1976) på sidene 49-64.

Betacellene i de såkalte Langerhans øyer frembringer insulin in vivo. Initialt blir det git ekspresjon for insulin som et sammensatt polypeptid bestående av proinsulinsekvensen pluss en pre-sekvens kjent som transport -eller signal-sekvensen. Denne transportsekvens letter passeringen av insulinmolekylet gjennom cellemembranene. I de høyere eukaryoter syntetiseres preproinsulinet på ribosomer som er forbundet med det ru endeplasmiske retikulum. See Permutt, M. og Kipnis, D.M., Proe.Nat. Acad. Sei., USA, 69,506-509

(1972). Når det produseres in vivo blir det nylig transla-terte peptid først transportert intracellulært til Golgi-apparatet hvor det innlemmes i de nylig l.danniéde ! sekresjonsgranuler. Nøyaktig hvorledes cellen omdanner proinsulin til insulin er ikke kjent, men omdannelsen antas å bli initiert enten i Golgi-apparatet .eller i de nydannede sekresjonsgranuler. Sekresjonsgranulene inneholder sink og membran bundne proteaser som antas å delta i omdannelses-mekanismen. Typene av proteaser kan variere fra species til species, kanskje for å akkomodere species-spesifikke aminosyresubstitusjoner i insulinpeptidet, See Steiner, supra ved 54.

In vivo produksjon av insulin resulterer til slutt i sekresjon av modne insulinmolekyler hvorfra både transportsekvensen og C-kjedene er blitt fjernet. Selv om det er kjent at insulin frigis fra proinsulinet i sekresjonsgranulene og at insulin transport-sekvensen er involvert i transport av peptidet gjennom cellemembranene er hverken transportmekanisr men eller prosessmekanismen godt forstått.

På grunn av at enkelt mennekser ikke klarer å fremstille insulin over hodet eller ikke klarer å fremstille det i mengder tilstrekkelig til å møte deres egne individuelle behov, har det lenge vært nødvendig å finne suplerende kild->. er for insulin for tilførsel til disse mennesker. Det meste av det supplerende insulin anvendt for behandling av insulin-defisiente individer har kommet fra bovin- og porcin-pankreata oppnådd fra dyr drept i slaktehusene. Uheldigvis er dette animalinsulin immunogent i enkelte pasienter. Det ville derfor være foretrukket å ha human insulin for tilførsel til de human-pasienter som trenger det. Inntil ganske nylig var der imidlertid ingen praktisk måte til å oppnå nok human insulin for å tilfredsstille behovene til de pasienter som trenger det. Selv om det er mulig kjemisk å syntetisere human insulin er omkostningene ved slik produksjon i kommersiell skala nesten prohibitive.

Heldigvis har nylige fremskritt i rekombinant DNA-teknologi nå gjort det.mulig genetisk å bygge om bakterier slik at de kan frembringe eukaryotiske proteiner som insulin. F.eks.

syntetiserte Goeddell, D.V., et al. Proe. Nat. Acad. Sei., USA 76;106-11 (1979) kjemisk de DNA-sekvenser som koder

for human A og B insulin kjeder. Rekombinant-teknikk ble så anvendt for separat å ligere hver sekvens til 3 ienden av et E. coli beta-galaktosidase-gen. Som forventet ble det oppnådd to hybridproteiner som hver besto av enten human A eller B kjede kondensert til bakterie-beta-galakto-sidasen. A og B-kjedene ble frigitt fra de sammensatte peptider ved kjemisk nedbrytning. Kjedene ble ..renset individuelt og deretter rekombinert til å danne biologisk aktivt insulin, See Chane, R.E. et al. Diabetes Care 4:1147-154 (1981).

Selvom teknikken til Goedell et al tilveiebringer en metode for fremstilling av human insulin involverer et mer naturlig forsøk biosyntese av proinsulin som er den umiddelbare forløper for insulin. En fordel med å fremstille insulin fra proinsulin er økonomien ved gjæring og behandling av bare en rekombinant-organisme. Teknikken til Goeddell et al krever bruk av to rekombinant-organismer. Tallrike forsøk har vist at proinsulin vil oksyderes spontant til å danne de korrekte disulfidbindinger og kan kvantitativt omdannes til insulin ved kontrollert behandling med trypsin og karboksypeptidase B. See Steiner, D. og Clark, J. Proe. Nat. Acad. Sei., USA 60:622-629 (1968) og Kemmler, W. et al, J. Biol. Chem. 246:6786-6791 (1971). Gilbert og medarbeid-ere demonstrerte muligheten for proinsulin-forsøket når de bygget opp plasmider hvori det meste av kodesekvensene i rotte-preproinsulin ble kondensert til porsjoner av prepeptid regionen i penicillinase. Ved transformering inn i E. coli, produserte noen av disse oppbyggede organismer kondenserte preproteiner som ble korrekt spaltet til rotte-proinsulin og segregerte inn i det periplasmiske rom i vert i organismen. Ananlyse av Gilbert-plasmidene viser at de inneholdt fusjoner som involverte partier av både penicillinase- og preproinsulin-ledersekvenser. Disse var vanligvis forbundet med korte innskutte sekvenser avledet fra kon- :' <: struksjonsprosessen og ikke relert til noen av presekvensene,. See Talmådge, K. et al, Proe. Nat. Acad. Sei., USA 77:3988-3992 (1980).

Selvom forsøkene til Gilbert et al viser mulighetene av å anvende preproinsulin-forsøket for å oppnå ekspresjon av eukaryotisk rotte-insulin lærer de ikke hvorledes man skal skape et rekombinant plasmid som bærer human-proinsulin-genet i ekspresibel form. Bell G. et al, Nature 282: 525-527 (1979) klonet og sekvensbehandlet human-preproinsulin genet med hell. Deres arbeid viser imidlertid ikke heldig ekspresjon av human genet. Europeisk patentansøkning 80303195.4 inngitt av Regents of the University of i California, innlemmer noe av det arbeid som er vist i publikasjonen til Bell et al supra. Selve ansøkningen fore-slår måter for oppbygging av plasmider som bærer human-insulingenet slik at det gis ekspresjon for humangenet. Ansøkningen viser imidlertid ikke faktisk ekspresjon av humangenet og indikerer ikke hvorledes man skal oppnå prøver av plasmidet. Videre viser den ikke at human-preproinsulin-genproduktet blir behandlet av den transformerte bakterie-vert på riktig måte.

Det er derfor et formål for den foreliggende oppfinnelse

å skape et rekombinant plasmid som bærer genet for human proinsulin i ekspresibel form.

Et ytterligere formål for oppfinnelsen er å skape et rekombinant plasmid som er i stand til å transformere en vert-organisme slik at verten vil gi ekspresjon for human-proinsulin som er preproinsulinprodukt som vil bli behandlet til human-proinsulin av verten og deretter transport gjennom vertens cellemembran.

En ytterligere formål for oppfinnelsen er å demonstrere faktisk ekspresjon av preproinsulinproduktet av en vert-organisme transformert av et rekombinant-plasmid som bærer genet for human-proinsulin.

Et annet formål for oppfinnelsen er å demonstrere at preproinsulin-produktet som det er gitt ekspresjon for av en vert-organisme transformert av et rekombinant plasmid som bærer genet for human-proinsulin behandles til human-proinsulin inne i verten og transporteres deretter gjennom vertens cellemembran.

Andre formål for oppfinnelsen vil fremgå for den fagkyndige fra den etterfølgende beskrivelse tatt i forbindelse med de vedføyde tegninger hvori: Fig. 1 viser fordelingen av immunoreaktivitet etter gelfiltrering av osmotiske prøver fra bakteriekulturer av inneholdende plasmid pJW2172. Elueringsposisjoner av standard proteiner er også indikert. Fig. 2 viser fordelingen av radioaktivitet målt i skiver oppnådd fra rørgel SDS elektroforese av en prøve.>av 125 I-merket immunoprecipitert plasmid pJW2172 produkt. Den vertikale streng indikerer posisjonen av det fargede bånd i bovin-proinsulin. Fig. 3 viser fordelingen av radioaktivitet oppnådd fra auto-matisk sekvensmessig Edamn-degradering av 125 I- merket ; . proinsul ihprodukt "av p JV72 T 72 .: • Fig. 4 viser fordelingen av radioaktivitet oppnådd fra automatisert sekvensmessig Edman-degradering av 35 S-merket proinsulinprodukt fra plasmid pJW2172. Fig. 5 viser bindingen av 125 I-merket plasmid pJW2172 immunoprecepitert proinsulin til et human C-peptid antiserum. Prøver ble testet med normal kannin serum (N) og human C-peptid antiserum (C).

Meget generelt involverer oppfinnelsen konstruksjon av nye rekombinant plasmider som bærer human-proinsulin strukturgenet i ekspresibel form. Umiddelbart foran det eukaryotiske proinsulin-strukturgen på plasmidet er en funksjonell transport-presekvens. Denne presekvens kan fullstendig om-fattes av en prokaryotisk bakterie-transport-presekvens, fullstendig av en eukaryotisk transport-presekvens eller av en hvilken som helst funksjonell kombinasjon av de to pre-sekvens-typer. Den eukaryotiske proinsulin-strukturgen-sekvens er orientert i plasmidet slik at det er i en korrekt translasjons-ulesningsramme i forhold til inne i initier- . ingskodonet av den funksjonelle transport-presekvens. En slik orientering tillater at et preproinsulin-produkt kan blir syntetisert av aktivt metaboliserende transformerte vertsorganismer. Preproinsulin-produktet blir korrekt behandlet til human proinsulin av de transformerte vert-organismer som så transporterer human peptidet gjennom celle-membranen. I en'tranformert E. Coli vert akkumulerer human-proinsulinet i bakteriens periplasmiske rom. Etter utvinning kan in vitro metode anvendes for å omdanne human proinsulinet til human insulin. See Steiner og Clark, supra,

og Kemmler et al, supra. Alternativt kan de rekombinante plasmider anvendes for å transformere vert organismer som ikke er i stand til korrekt å behandle preproinsulin til human proinsulin in vivo. I dette tilfellet vil preproinsulin-peptidet utvinnes ved å rive i stykker celleveggene av den transformerte vert. Transport-sékvensdélen av pre- ( proinsulin-peptidet kan fjernes enzymatisk. Se generelt Zwizinski, C. og Wickner, W., J. Bial. Chem. 255:7973 -

977 (1980). In vitro metoder kan så anvendes for å omdanne human proinsulin til human insulin. See Steiner og Clark, supra og Kemmler et al, supra.

Mer spesifikt, for å illustrere oppfinnelsen, vises kon-i struksjon av et representativt rekombinant plasmid. Dette plasmid, betegnet plasmid pJW2172, er deponert i American Type Culture Collectio, Rockville, Maryland, 20852, USA.

Det er meddelt ATCC nummer 31891. Plasmidet pJW2172 ble konstruert ved å modifisere et parentalt plasmid, plasmid pHn677, som i sin tur ble avledet fra det vellkårakteri-serte plasmid pBR322 (ATCC 37017). Parentalt plasmid pHn6 77, som inneholder human preproinsulin cDNA klonet inn i Pst I stedet for ampicillinase-gen i plasmid pBR322, ble modifisert ved hjelp av en restriksjons-endonuklease og en dobbelt—trådet eksonuklease. Store deler av ampicillinase-kodeområdet ble kuttet bort av disse enzymer og resul-

terte i fremstilling av en lang rekke kondenserte genseg-

menter. Mande av disse genererte proteiner kunne detekteres med insulin eller C-peptid-antisera. Et slikt kondensert gensegment som genererte disse détekterbare proteiner bæres av plasmidet pJW2172. Plasmidet pJW2172 inneholder et perfekt kondensert hybrid gensegment bestående av den aminoterminale kodende halvdel av ledersegkvensen av den prokaryotiske ampicillinase (rester -23 til -12) kondensert til det eurokaryotiske human preproinsulin prepeptid som begynner ved resten -13. Ekspresjon av det kondenserte segment resulterer i syntese av et preproinsulin-produkt in vivo behandling av preproinsulin-produktet og endelig sekresjon av human-proinsulin inn i det periplasmiske rom av E- Coli vert-organismer transformert av plasmidet pJW2172. Karakterisering av det utvundne human-proinsulinprodukt viser at det inneholder A og B kjede regionene av insulin såvel som spesifikke C-peptid immunoterminanter. Tryptisk behandling kan anvendes in vitro for å omdanne proinsulin til insulin.

See Steiner og Clark, supra, og Kemmler et al, supra.

Parenteralt plasmid pHn677 ble oppnådd opprinnelig ved

cDNA kloning av mRNA isolert fra human-irasulinoma. cDNA

ble innført i Pst stedet av pBR322 ved hjelp av dC-dG-metod-

en. Plasmidet pHn677 inneholder alle proinsulinsekvenser pluss kodesekvensen for 16 aminosyrer i presekvensen. Selv om det DNA sekvensen i det pairentrale plasmid var i den rette orientering med hensyn til betalaktamase-promotoren var det i den gale utiesningsramme med hensyn til initieringskodonet av betalaktamase-genet. Som en ; følge 'røar der ingen ekspresjon av den DNA sekvøns som koder for det humane pro-insulingen.

For derfor å konstruere ekspresjonsplasmider med cDNA-sekven-

sen i den rette utlesningsramme måtte en restriksjons-endonuklease og en dobbelt-trådet eksonuklease anvendes for å fjerne det meste av ampicillinasegenet oppstrøms fra preproinsulin cDNA-sekvensen. For å oppnå dette måtte både

det parenterale plasmid pHn6 77 og progenitor-plasmidet pBR322 underkasetes enzymatisk behandling.

Plasmidet pHn677 ble behandlet med restriksjons-endonuklease Pvu I. DNA ble så behandlet med dobbelt-trådet eksonuklease Bal 31 for oppslutning av omtrent 150 nukleotider fra hver ende. Dette DNA ble ytterligere behandlet med rest-riks jons-endunuklease Hind III. Etter å ha underkastet det resulterende DNA for gel-elektroforese på agarose-

geler ble det større sett av DNA-fragmenter isolert fra gel-ene ved hjelp av elektroeluering.

Ved den parallelle metode ble Hine II behandlet plasmid pBR322 DNA underkastet Bal 31 for oppslutning av omtrent 180 nukleotider "fra hver ende av det lineariserte plasmid. Dette DNA ble så ytterligere behandlet med Hind II og

Bam H1. Endelig ble fragmentet inneholdende betalaktamase-promotor-regionen isolert fra en akrylamidgel. Dette fragment ble ligert til det Pvu 1/Bal 3 T/Hind III behandlede store fragment'. Ligasjonsblandingen ble anvendt for transformering av E. Coli K12 stammen CS412.

Transformantene ble først selektert for tetracyklin-resi- ..: stens. Omtrent 350 kloner som fremviste slik resistens ble ytterligere undersøkt for insuling-ekspresjon under anvendelse av den in situ..radioimmuno-prøvemetode som er beskrevet av Broom, S. og Gilbert W., Proe. Nat. Acad.

Sei-, USA 75:2749 (1978). Denne metode .viser at 118 av

de 350 kloner muligens kunne gi ekspresjon for insulin. Derfor ble disse 118 kloner ytterligere bedømt ved hjelp av en radioimmuno-prøve som anvendte både antiinsulin og anti-C-pépfid-antistoffer. Radioimmuno-prøven viste at minst 23 av disse kloner viste tydelig, dvs. større enn 1 mikro-enhet pr. mål insulinaktivitet.

Fra de totale serier av plasmider inneholdende ien rekke hydride bakterie-eukaryotiske transportsekvenser knyttet til human-proinsulin-sekvensen ble et plasmid, betegnet som plasmid pJW2172, selektert for ytterligere studium. Som beskrevet i Chan. S. et al Proe. Nat. Acad. Sei., USA 78:5401-5405 (1981) og illustrert her i fig. 1 ga gelfiltrering av en konsentrert osmotisk prøve fra kulturer av transformerte bakterier inneholdende plasmid pJW 2172 anledning til en enkel homogen topp av C-peptid og insulin-immunoreaktivitet som koeluerte ved posisjonen for proinsulin-standard. Videre tilsvarer forholdet mellom C-peptid og insulin-immunoreaktivitet av denne komponent, nemlig omtrent 1:15, godt til den kjente kryss-reaktivitet av human-proinsulin i høyt spesifik human-C-peptid immuno-prøve beskrevet av Faber, O.K., et al. Diabetes 27:170-177

(1978) .

Disse funn forklares lett ved hjelp av DNA sekvensanalyse

av den kondenserte region av plasmid pJW2172. Som beskrevet mer fullstendig i Chan et al, supra, viste disse studier at kondensering hadde foregått mellom resten -12 av den bakteri-elle anticillinase-leder-peptidsekvens og resten -13 av human-presekvensen.slik at det skapes en perfekt hybrid lederåekvens inneholdende omtrent halvparten av hver pre-sekvens uten noen substitusjon eller modifikasjoner. Denne kondenserte ledersekvens preserverer alle de strukturmessige trekk kjent å være nødvendige for eksport og spaltning.

See Faber, et al, supra.

Forsøkene skissert i de etterfølgende eksempler viser at plasmid piTW2172 genererer et korrekt spaltet sekretert in-sulinprodukt.

Eksempel 1 - Karakterisering av proteinproduktet sekretert av plasmid pJW2172.

Som beskrevet i Chan et al, supra, ble proinsulin-material-et generert av plasmidet pJW2172karakterisertpå følgende måte. En prøve av et osmotisk produkt fra kulturer av bakterier transformert av plasmid pJV-721 72, inneholdende omtrent 0,0 5 nM av peptidet, ble ekstrahert med sur etanol. Ekstraktet ble så underkastet gelfiltrering på en kolonne av "Biogel P60" elluert bed 2,5 M propionsyre. Se generelt Steiner, D., et al, i Cell Biology, A Comprehensive Treatise 4:175-201 (1980). Røret inneholdende toppen av insulin-immunoreaktivitet, dvs. omtrent 0,01 nM, ble tørket i vakuum og delt i to like store porsjoner.

En porsjon ble merket ved odinasjon og deretter immunoprecipitert med insulin antiserum. Det resulterende immunoprecipitat ga en enkelt topp ved posisjonen for proinsulin ved undersøkelse på en "Biogel P30" kolonne elluert med 3 "M edikksyre. Som vist i fig. 2, ved gjennomføring av rørgel SDS elektroforese, migrerte immunoprecipitatet som en enkelt komponent med samme mobilitet som bovin-proinsul- ■ in-standard.

Den annen porsjon ble anvendt for å bestemme hvorvidt spaltning av presekvensen hadde foregått ved den første rest av human-proinsulin. 0,5 pM prøven av immunoprecipitatet ble først redusert og karboksymetylert og deretter underkastet automatisert Edman-degradasjonen. Se Chan et al, supra. Resultatene er vist i fig. 3. De viser at vesentlige mengder av radiaktivt merket tyrosin ble funnet

bare ved posisjonene 16 og 26 som forventet for human-proinsulin. Der var ingen indikasjon på heterogenitet ved N-terminus. Ytterligere bekreftelse på dette punkt ble oppnådd når den osmotiske prøve fra en kultur dyrket i nærvær av 35 SO? ble liknende immunoprecipitet, gelfiltrert, redusert, karboksymetylert og deretter sekvensbehandlet. Disse resultater er vist i fig. 4. De viser at nærværet av de svovelmerkede B7 og B18 S-karboksymetyl-cysteinrester i korrekt overensstemmelse.

Eksempel II - Karakterisering av det proinsulin-liknende peptid.

På nytt, som mer fullstendig beskrevet i Chan et al, supra, for ytterligere å karakterisere det proinsulinliknende peptid, ble det gjennomført tre ytterligere forsøk. I det første ble en porsjon av det reduserte og karboksymetylerte inderte immunoprecipitat behandlet med trypsin og deretter underkastet automatisert Edman-degradering. Disse resultater er vist i fig. 3. De viser entydig at proteinet inneholdende den normale human-insulin A kjede med tyro-siner i stillinger 14 og 19. I tillegg viser de at trypsin har spaltet B kjederegionen ved argininét lokalisert ved aminosyreposisjon 22 og skaper således et heptapeptid som nå inneholdt B26 tyrosinresten i posisjon 4.

I det annet forsøk ble nærværet av C-peptid immunodeter-minanter i porsjonsmaterialet, som opprinnelig var blitt oppnådd "ved immunoprecipitering med et insulin-antiserum, bedømt ved binding til et antiserum mot human C-peptid. Disse resultater er vist i fig. 5. De viser at det karboksymetylerte protein reagerte like godt som autentisk iodert human C-peptid. Porcin-proinsulin bandt seg ikke tydelig til dette antiserum.

I ét tredje forsøk ble plasmidet pJW2172 proinsulin produkt behandlet med trypsin og karboksypepsidase B. Denne behandling omdannet produktet til en komponent som eluerte ved posisjonen til insulin ved gelfiltrering. Der var ingen indikasjon av frigivelse av fritt A eller B kjede-material.

På basis av drøftelsen av det som vises i eksemplene I og II er det klart at det endelige proteinprodukt som genereres av vert bakterien transformert av plasmidet pJW2172 er intakt human-proinsulin. Under anvendelse av metoder som er vel kjent for den fagkyndige på området er det mulig å omdanne human-proinsulin til human-insulin in vitro. Se Steiner og Clark, supra og Kemmler et al, supra.

Det kan derfor sees at oppfinnelsen involverer oppbygning av nye rekombinante plasmider som bærer human-proinsulin strukturgenet i ekspresibel form. Umiddelbart foran det eukaryotiske strukturgen på hvert plasmid er en funksjonell transport-presekvens. Denne presekvens kan fullstendig bestå av en prokaryotisk bakterie-transportspresekvens,

jfullstendig av en eukaryotisk transport-presekvens eller

en hvilken som' helst funksjonell kombinasjon av disse to. Representativt plasmid pJW2172 bærer human-proinsulin strukturgenet knyttet til en funksjonell kondensert hybrid transport-presekvens. Hybrid-transport-presekvensen består av omtrent halvparten av den prokaryotiske bakterie-presekvens kondensert til omtrent halvparten av den eukaryotiske human-presekvens. Bakterie - presekvensen koder for den aminoterminale ende av hybrid-transport peptidet, og human-presekvensen koder for karboksy-termiale ende. E. Coli vert bakterier transformert av plasmid pJW2172 i anledning til ekspresjon av et preproinsulin-peptidprodukt som behandles tilsvarende human-proinsulin av bakteriene. Dette human-proinsulin transporteres av bakterien gjennom celleveggen til det periplasmiske rom hvor det akkumuleres. Etter dets utvinning kan in vitro metoder som f.eks. trypcin-behandling anvendes for å omdanne human-proinsulinet til humaninsulin.

Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til den som er vist og beskrevet heri vil fremgå for den fagkyndige på området av den foregående beskrivelse og de wdføyde tegninger og slike modifikasjoner er ment å falle innenfor rammen av de vedføyde patentkrav.

LITTERATURHENVISNINGER

Bell, G.I., Swain, W.F., Pietet, R.,Cordell, B., Goodman, H.M., og Ruttes W.J., Nature 282:525-527

(1979).

Broom, S., Gilber, W., Pmr. Nat. Arad. Sei.. USA 75:2746-2749 (1978).

Chan, S.J., Weiss, J., Konrad, M., White, T.(, Bahl, C,

Yu, S-D, Marks, D., og Steiner, D.F., Proe. Nat. Acad. Sei., USA 78:5401-5405 (1981).

Chance, R.E., Kroeff, E.P., Hoffmann, F.A., og" Frank, B.H., Diabetes Care 4:147-154 (1981)

c

Faber, O.K., Binder, C, Markussen, J., Heding, L.G.,

^Naithani, V.K., Kuzuya, H., Blix, P., og Rubenstein, A.H., Diabetes 27:170-177 (1978).

Goeddel, D.V., Kleid,. G.G., Bolivar, F,., Heyneker, H.L., Yansura, D.G., Crea, R.,, Hirose, T.,, Kraszewski, A., Itakura, K., og Riggs, A.D., Proe. Nat. 1- Acad. Sei., USA .76:106-110.(1979)

Kemmler, W., Peterson, J.D., og Steiner, D^F., LJ. Biol. Chem.. 246:6786-6791 (1971).

Permutt, M. og~L Kipnis, D.M., Proct. Nat. Acad. Sci^, USA 69:506-509 (1972)/.

Steiner, D., og Clark, J., Proe., Nat. Acad. v Sei . x, USA 60)622-629 (1968)

Steiner, D. F., Quinn, P..S., Patzelt, C>., Chan, S.J., Marsh, J., og Tager, H.S., Cell Biology: a Comprehensive Treatise 4:175-201 (1980).

Steiner, D., "Peptide Hormone Precursors", Eeeliåfi. Hnrmnnes. Parsons, J.A., Editor, McMillan Press Limited, London, pp. 49-64 (1976).

Talmadge, K., Kaufman, J., og Gilbert, W., Proe. Nat. Acad. Sei., USA 77:3988-3993 (1980).

Zwizinski, C, og Wickner, W., J. Biol. Chem.. 255: 7973-7977 (1980).

Claims (16)

1. Kloningsvektor for fremstilling av human-proinsulin ved ekspresjon av DNA ved hjelp av en transformert vert organisme, karakterisert ved at den omfatter et plasmid som er i stand til transformering av en vert organisme og har en preproinsulin kodende DNA sekvens deri, idet den kodende preproinsulin DNA sekvens ytterligere omfatter en funksjonell transport-kodende DNA presekvens kondensert til et strukturmessig gen som koder for human proinsulin, idet den preproinsulinkodende DNA sekvens er under konstroll av én operatot-promotor^ og ribosonf-bindestedsekvens og ytterligere er posisjonert i vektoren i korrekt utlesningsramme i forhold til initieringskodonet for den funksjonelle transport-kodende DNA presekvens slik at det blir gitt ekspresjon for et preproinsulinprodukt ved hjelp av en vert organisme transformert med den nevnte kloningsvektor.

2. Kloningsvektor for fremstilling av human-proinsulin ved ekspresjon av DNA ved hjelp av en transformert vert organisme, karakterisert ved at den omfatter plasmidet pJW2172 (ATCC 31891) og dens progeny.

3. Vert organisme, karakterisert ved at den er transformert ved hjelp av kloningsvektoren i krav 1 eller 2.

4. Vert" organisme som angitt i krav 3, karakterisert ved at vert organismen er Escherichia coli.

5. Vert organisme som angitt i krav 4, karakterisert ved at vert organismen er E. Coli K12.

6. Preproinsulin prbdusert ved hjelp av vert organismen i henhold til krav 3.

7. En transformant kultur, karakterisert ved at den er klonet fra en eller flere vert organismer i samsvar med krav 3.'

8. Preproinsulin, karakterisert ved at det er fremstilt av en tranformant kultur i samsvar med krav 3.

9. Vert organisme som angitt i krav 3, karakterisert ved at verten ytterligere omfatter en organisme som er i stand til korrekt behandling av preproinsulin som det er gitt ekspresjon for til human proinsulin iv vivo og transport av human-proinsulinet gjennom vertens cellemembran.

10. Human proinsulin, karakterisert ved at det er fremstilt av en vert organisme i samsvar med krav 9.

11. Human-proinsulin fremstilt i samsvar med krav 10, karakterisert ved " at human-proinsulinet omdannes til human insulin in vitro.

12. Transformant kultur, karakterisert ved at den er klonet fra en eller flere vert-organismer i samsvar med krav 9.

13. Human-proinsulin fremstilt av en transformant: kultur som er angitt i krav 12.

14. Human-proinsulin, karakterisert ved at det er fremstilt i samsvar med krav 13 hvori human-proinsulinet omdannes til human-insulin in vitro.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av human-insulin, karakterisert ved å tilveiebringe en kloningsvektor med en preproinsulin-sekvens deri idet preproinsulin-sekvensen ytterligere omfatter en funksjonell transport-presekvens kondensert til et strukturelt gen som koder for human proinsulin, idet preproinsulin-sekvensen er under kontroll av en operator-, promotor- og ribosom-bindesteds-sekvens og ytterligere er posisjonert i vektoren i korrekt utlesningsramme i forhold til initieringskodonet for den funksjonelle transport presekvens slik at et preproinsulin produkt blir gitt ekspresjon for av en vert organisme transformert av kloningsvektoren idet en vert organsime i stand til korrekt behandling av preproinsulin som det er gitt ekspresjon for til human proinsulin in vivo transformeres ved hjelp av kloningsvektoren og human-proinsulinet transporteres gjennom vertens cellemembran, den transformerte vert organisme dyrkes under betingelser egnet for ekspresjon av en DNA sekvens som koder for et preproinsulin-peptdi produkt, den transformerte vert organisme for behandle den nevnte preproinsulin-peptid som det er gitt ekspresjon for til human proinsulin in vivo og det nevnte human proinsulin for akkumulere utenfor vertens cellemembran, den nevnte akkumulerte human-proinsulin isoleres og det isolerte human proinsulin omdannes til human insulin in vitro og human insulinet frembrakt i trinn 6 renses.

16. Humaninsulin fremstilt i samsvar med fremgangsmåten angitt i krav 15.