JPS58501227A - ヒトインシユリンを生産するプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインシュリンを生産するプラスミド本発明は分子生物学、より詳しくはいわ ゆる組換えＤＮＡの技術に関する。特に、本発明はヒトインシュリンを生産する 組換えプラスミド９に関する。

本発明はヒトプロインシュリンについての遺伝子コーディングを有する新里な遺 伝子工学的に処理されたプラスミドについて記載している。代表的プラスミドで あるｐｒｗ　２１７２は本発明を具体的に説明するものであって、メ’）−ラン ド州２０８５２０ツクビルのアメリカン・タイプ・コレクションに寄託されてお り、ＡＴＣＣＡ３１８９１という番号が与えられている。

周知の如く、インシュリンは種々の生体代謝を絶妙に調節するイプチドホルモン である。殆んどの動物においてインシュリンは単一の大きな先駆体ポリはプチド 、すなわちプレプロインシュリンとして合成される。生合成の間にプレプロイン シュリンから輸送配列および内部ペプチド配列が切除されてジサルファイド結合 によって互いに結合された２本のペプチド鎖からなる生物活性を有する分子を生 成する。輸送配列のみ切除するとプロインシュリンとして知られるペプチド分子 を生成する。プロインシュリンは多くの動物から単離されており特性について調 べられている。５ｔｅｉｎｅｒ、　Ｄ、、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ 。

Ｐａｒｓｏｎｓ、　Ｊ、　Ａ、　Ｅｄｉｔｏｒ、　ＭｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｒｅｓ ｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ。

Ｌｏｎｄｏｎ　（１９７６）　ｐ４９−６４　”Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｈｏｒｍｏｎ ｅ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ＋参照。

ランゲル・・ンス島のβ細胞は生体内でインシュリンを生産する。まずインシュ リンはプロインシュリン配列十輸送またはシグナル配列として知られるプレ配列 からなる縮合ポリペプチドとして発現される。この輸送配列はインシュリン分子 が細胞膜を通過するのを容易にする。

より高等な真核細胞においてはプレプロインシュリンは粗面小胞体に結合してい るリボゾーム上で合成される。

Ｐｅｒｍｕｔｔ、　Ｍ、　ａｍ　Ｋｉｐｎｉｓ、　Ｄ−Ｍ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔ＋Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、６９：５０６−５０９（１９７２）参照。生体内で生成した場合、新し く複製された投ゾチドはまず細胞内へ輸送されゴルジ体に到達し、そこで新しく 形成しつつある分泌グラヌール内に入る。正確にどのようにして細胞がプロイン シュリンをインシュリンに転化するかは知られていないが、転化はゴルジ体ある いは新しく形成した分泌グラヌールの何れかで開始されるものと信じられている 。

該分泌グラヌールは亜鉛および該転化機構に関係すると信じられている膜に結合 したプロテアーゼを含んでいる。

プロテアーゼのタイプは種によって変って恐らくはインシュリンＲプチドにおけ る種に特異的なアミノ酸を置換するのを助けることができる。５ｔｅｉｎｅｒの 上記文献５４頁参照。

インシュリンの生体内生産は輸送配列とＣ鎖の両方が取り除かれている完成した インシュリン分子の分泌を最ば　終的にもたらす。インシュリンは分泌グラター ル中でプ３ ０インシユリンから遊離され、インシュリン輸送配列が該ペプチドが細胞膜を通 過して輸送される際にとり込まれることは知られているが輸送機構も処理機構も よくわかっていない。

ある人々はインシュリンを全熱生産できないか、あるいは自分自身の必要に見合 うだけ充分な量生産できないので、これらの人々に投与するインシュリンの補充 源を見出す必要があった。インシュリン欠乏患者を治療するのに使用される補充 インシュリンの殆んどは畜殺場で殺された動物から得られた牛や豚の膵臓に由来 してきた。

不幸なことに、この動物インシュリンはある患者にとって免疫原性である。従っ て、ヒトのインシュリンを必要としているヒト患者にはヒトインシュリンを投与 するのが好ましいであろう。しかし、極く最近までそれを必要とするこれらの患 者の必要を満すに充分なヒトインシュリンを得る実際の方法はなかった。ヒトイ ンシュリンを化学的に合成することは可能であるが、商業規模ではそのような生 産のコストは非常に高い。

幸運なことに、今や組換えＤＮＡ技術の最近の進歩によって細菌を遺伝子工学的 に処理してインシュリンのような真核生物の蛋白質を生産させることができるよ うになった。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌｌ、　ｎ、　Ｖ、、ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔ。

Ａｃａａ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ７６：１０６−１１０　（１９７７）はヒトＡ゛　 およびＢインシュリン鎖をコーディングしたＤＮＡ配列を化学的に合成した。次 いで組換え技術を使用して大腸４　特表昭５８−５（１１２２７（３）菌（Ｅ、 　Ｃｏ１１　）β−ガラクトシダーゼ遺伝子の６′末端に各配列を別々に結合さ せた。予想した通り、２つのハイブリッド蛋白質が得られた。各々上記細菌のβ −ガラクトシダーゼに縮合したヒトＡまたはＢ鎖の何Ｉ原らなる。

上記ＡおよびＢ鎖は化学的分解により上記縮合ペプチドから遊離された。これら の鎖は別々に精製され、次いで再び結合されて生物活性を有するインシュリンを 形成した。Ｃｈａｎｃｅ、　Ｒ，Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａ ｒｅ　４　：　ｉ　４７−１５４（１９８１）参照。

ＧＯｅｄｅｌｌ等の技術はヒトインシュリンを生産する１つの方法を提供するが 、もつと自然な方法はインシュリンの直前の先駆体であるプロインシュリンの生 合成である。

プロインシュリンからインシュリンを生産する有利性は１つの組換え微生物を発 酵し処理するだけという経済性である。Ｇｏｅｄｄｅｌｌ等の技術は２つの組換 え微生物を使用しなげればならない。多数の研究によりプロインシュリンが自然 に酸化して正しいジスルフィド結合を形成し、トリプシンおよびカルボキシイプ チダーゼ已によるコントロールされた分解によりインシュリンに定量的に転化で きることがわかった。５ｔｅｉｎｅｒ、　Ｄ　ａｎｄ　Ｃ１ａｒｋ、　Ｊ、　Ｐ ｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　６０　：　６２２−６２９　（１ ９６８）　：およびＫｅｍｍｌｅｒ、　ｗ−ｅｔ　ａｌ、　Ｊ−Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ−、２４６：　６７Ｂ６−６７９１（１９７１）参照。Ｇ１１ｂｅｒｔと その共同研究者はラットゾレプロインシュリンのコーディング配列の殆んどがベ ニシリナーゼのプレイプチド領域の部分に縮合されたプラスミドゝをつくればプ ロインシュリンを生産することが容易であることを示した。大腸菌（Ｅ、　ｃｏ ｌｉ　）に形質転換される場合、これらのプラスミドのいくつかは正しく開裂さ れてう°ットプロインシュリンになった融合プレプロティンを生産し、宿主微生 物の外質空間に分離する。ギルバー）　（Ｇｉｌｂθｒｔ）プラスミド９を分析 したところ一二シリナーゼとプーレプロインシュリンリーダー配列の両方の部分 を包含する融合物を含んでいることがわかりた。これらは通常は構成過程で得ら れた短い挿入された配列によって連結されておりどちらのプレ配列にも関係がな かった。Ｔａｌｍａｄｇｅ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａ ｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　：３９８８−３９９２（１９８０）参照。

Ｇ１１ｂｅｒｔ等の実験は真核生物ラットのインシュリンの発現、を達成するた めにプレプロインシュリンを手引とすると容易であることを示したが、発現でき る形のヒトプロインシュリン遺伝子を有する組換えプラスミドをどのように創製 するかは教示していない。Ｂｅ−ｃｌ、　Ｇ、、ｅｔ　ａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ　２８２　：　５２５−５２７（１９７９）はヒトプレプロインシ ュリン遺伝子をうまくクローン化し、配列させている。しかし、彼等の研究では ヒト遺伝子の発現に成功していない。カリフォルニア大学の評議員によって出願 されたヨーロッパ特許出願８０３０３１９５，４はＢｅ’ｌＬ１等の上記文献に 開示された研究のいく分かをとり入れている。

上記出願自体はヒトインシュリン遺伝子を有するプラスミドを構成してヒト遺伝 子が発現するようにする方法を示唆している。しかし、該出願はヒト遺伝子の実 際の発現を開示せずどのようにしてプラスミドの試料を得るかも示していない。

更に、上記出願は形質転換細菌宿主によってヒトプレプロインシュリン遺伝子生 産物が適当に処理されることも開示していない。従って、ヒトプロインシュリン のための遺伝子を有する組換えプラスミドゝを発現できる形で創製するのが本発 明の目的である。

本発明の他の目的は、宿主微生物を形質転換して、ヒトプロインシュリンを、該 宿主によってヒトプロインシュリンへと処理され該宿主の細胞膜を通して輸送さ れるであろうヒトプレゾロインシュリンとして発現させることができる組換えプ ラスミドを創製することである。

本発明の他の目的は、ヒトプロインシュリンのための遺伝子を有する組換えプラ スミドによって形質転換された宿主微生物によってプレプロインシュリンが実際 に発現することを示すことである。

本発明のもう１つの目的はヒトプロインシュリンのための遺伝子を有する組換え プラスミドによって形質転換された宿主微生物によって発現されたプレプロイン シュリン生産物が該宿主内で処理されてヒトプロインシュリンとなり宿主の細胞 膜を通って輸送されることを示すことである。

本発明の他の目的も下記記載を添付図面と組合せて読めば当業者には明らかとな ろう： 第１図はプラスミドｐＪＶＩ　２１７２を含む細菌培養物が７ ら浸透してくるものをゲル濾過した後の免疫反応性の分布を示す。標準的蛋白質 の溶出位置も示されている。

第２図は１２５工標識免疫沈澱プラスミ）゛ｐＪＷ２１７２生産物の１部のチュ ーブゲルＳＤＳ電気泳動から得られた各スライスの放射能の分布を示す。

第３図はプラスミドｐＪＷ２１７２の１２５工標識プロインシユリン生産物の自 動化連続エドマン（Ｅｃｌｍａｎ　）分解法で得られた放射能の分布を示す。

第４図はプラスミドｐＪＷ２１７２の３５Ｓ−標識プロインシュリン生産物の自 動化連続エドマン分解法で得られた放射能の分布を示す。

第５図は１２５ニー標識プラスミドｐＪＷ２１７２免疫沈澱プロインシュリンの ヒ）Ｃ−＜プチド抗血清に対する結合を示す。各試料を正常ウサギ血清（Ｎ）お よびヒトーハプチトゝ抗血清（Ｃ）について試験した。

非常に一般的には、本発明はヒトプロインシュリン構造遺伝子を発現可能な形で 有する新規な組換えプラスミドの形成からなる。プラスミドに真核生物のプロイ ンシュリン構造遺伝子の直ぐ前に置くのは機能性輸送プレ配列である。該プレ配 列は原核生物である細菌の輸送プレ配列、真核生物の輸送プレ配列、あるいは上 記２つのゾ壷 し配列タイプのいかなる機能性組合せから構成されることができる。真核生物の プロインシュリン構造遺伝子配列はプラスミド９の中で機能性輸送プレ配列の開 始コドンに関して該構造遺伝子配列が正しい翻訳読み取り枠にあ８　特表昭５８ −５０１２２７（４） るように方向付けられている。そのような方向付げによってプレプロインシュリ ン生産物を形質転換宿主微生物を活発に代謝させることによって合成できる。該 プレプロインシュリン生産物は形質転換された宿主微生物によって正しく処理さ れてヒトプロインシュリンになり、次いで該宿主は該ヒトハプチドを細胞膜を横 切って輸送する。形質転換された大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主において、ヒト プロインシュリンは細菌の性質空間に蓄積する。回収後、インビトロでの方法を 使用してヒトプロインシュリンをヒトインシュリンに転化することができる。５ ｔｅｉｎｅｒａｎｄ　Ｃ１ａｒｋの前出文献ならびにＫｅｍｍｌｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、前出文献参照。

別法として、組換えプラスミドを使用して、プレプロインシュリンを生体内でヒ トプロインシュリンへト正しく処理することができない宿主微生物を形質転換す ることができた。その場合、プレプロインシュリンペプチドは形質転換宿主細胞 壁を破ることによって回収する。プレプロインシュリンペプチドの輸送配列部分 は酵素によって除去できた。一般的にはＺｗｉｚｉｎｓｋｉ、　Ｃ，およびＷｉ ｃｋｎｅｒ、　Ｗ、、　Ｊ−Ｂｉｏｌ、　Ｇｈｅｍ、ｙ　２５５　：　７９７３ −７９７７（１９８０）参照。次いでインビトロでの方法を使用してヒトプロイ ンシュリンをヒトインシュリンに転化できた。

５ｔｅｉｎｅｒおよびＣ１ａｒｋの前出文献およびＫｅｍｍｌｅｒ等の前出文献 参照。

本発明をもつと効果的に説明するために、代表的組換えプラスミドの形成を開示 する。このプラスミド、すなワチフラスミドｐＪＷ２１７２と命名されたものは 米国メリーランド州２０８５２０ツクビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクションに寄託されている。プラスミドｐＪＷ２１７２はよく特性が調べら れているプラスミドｐＢｆ１３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）から得られた親プラ スミド、すなわちプラスミーｌ−″’ｐＨｎ６７７を修飾することによって形成 された。シラスミドｐＢＲ３２２のアンピシリナーゼ遺伝子のＰｓｔ　Ｉ位にク ローン化されたヒトプレプロインシュリンｃＤＮＡを含有する親プラスミ）”ｐ Ｈｎ６７７は制限エンド９スクレアーゼおよび二本鎖エキソヌクレアーゼによっ て修飾された。アンピシリナーゼコーディング領域の大部分はこれらの酵素によ って切断され、種々の融合遺伝子断片が生成する。これらの生成した蛋白質の多 くはインシュリンまたはＣ−ペプチド抗血清で検出できた。これらの検出できる 蛋白質を生成するそのような融合遺伝子断片の１つはプラスミドｐＪＷ　２１７ ２によって担持されている。プラスミド″ｐＪＷ２１７２は残基−１６で開始す る真核生物ヒトプレプロインシュリンプレはプチドに融合した原核生物アンビシ リナーゼ（残基−２３ないし−１２）のリーダー配列の半分をコーディングする アミノターミナルからなる完全な融合ハイブリット８遺伝子断片を含んでいる。

この融合断片の発現によってプレプロインシュリン生成物の合成、該プレプロイ ンシュリン生成物のインビボでの処理および最終的にプラスミ）ｐＪＷ２１７２ によって形質転換された大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ　）宿主微生物の性質空間へのヒトプロインシュリンの分泌が生じる。

回収されたヒトプロインシュリン生成物の特性を調べた結果、該生成物はインシ ュリンのＡおよびＢ鎖領域ならびに特異的Ｃ−ｚプチド免疫決定因子を含んでい ることがわかった。トリプシンによる消化を使用してインビトロでプロインシュ リンをインシュリンに転化できる。５ｔｅｉｎｅｒ　ａｎｄ　Ｃ１ａｒｌｃ＋前 出文献およびＫｅｍ＋ｎ１ｅｒ等前出文献参照。

親プラスミド８、ｐＨｎ６７７は本来ヒト島細胞腫から単離されたｍＲＮＡのｃ 　ＤＮＡクローニングによって得られた。

ｃ　ＤＮＡはｐＢＲ３２２のＰｓｔ位にａＣ−ａＧティリングによって挿入され た。プラスミ）”ｐＨｎ６７７はプロインシュリン配列のすべてとそのプレ配列 の１６個のアミノ酸のためのコーディング配列を含んでいる。親プラスミド中の ＤＮＡ配列はβ−ラクタマーゼプロモーターに関して右の方向にあるが、それは β−ラクタマーゼ遺伝子の開始コドンに関してまちがった読み取り枠の中にある 。その結果として、ヒトプロインシュリン遺伝子のためのＤＮＡ配列コーディン グの発現が何ら見られなかった。

従って、正しい読み取り枠中のｃ　ＤＮＡ配列を有する発現プラスミドを形成す るために、制限エンドヌクレアーゼおよび二本鎖エキソヌクレアーゼを使用して プレプロインシュリンｃＤＮＡ配列より上流のアンピシリナーゼ遺伝子の殆んど を取除かなければならなかった。これを達１１ 成するために、親プラスミドｐＨｎ６７７および先祖プラスミ）゛ｐＢＲ３２２ ０両者を酵素によって消化しなければならなかった。

プラスミ）ＳｐＨｎ６７７は制限エンド９ヌクレアーゼＰｖｕ工によって消化さ れた。次いでこのＩ）ＮＡを二本鎖エキソヌクレアーゼより６１で処理して各々 の末端から約１５０岡のヌクレオチド９を消化した。このＤＮＡをさらに制限エ ンドヌクレアーゼ）（ｉｎａ　［１で処理した。得られたＤＮＡをアガロースゲ ル上でゲル電気泳動にかけた後、ＤＮＡ断片のもつと大きい一組が電気溶出によ ってゲルから単離された。

並行して、ＨｌｎｃｌＩで消化したプラスミ）ｌ”ＰＢＲ３２２ＤＮＡを印す６ １で消化して線状化したプラスミドの各末端から約１８０個のヌクレオチドを分 解した。このＤＮＡを次いでさらにＨｉｎｃｌ　ＩｌｌとＢａｍ　ＨＩで消化し た。最後にβ−ラクタマーゼプロモーター領域を含むフライメントをアクリルア ミドゲルから単離した。このフラグメントをＰｖｕ　■／Ｂａｄ　３１／Ｈｉｎ ｄ　ｍで処理した大きなフラグメントに結合させた。この結合混合物を使用して 大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２菌株Ｃ８４１２を形質転換した。

形質転換体をまずテトラサイクリン耐性についてスクリーニングした。そのよう な耐性を示す約３５０クローンヲサラニソノ場でＢｒｏｏｍ、　５−ａｎａ　Ｇ １１ｂｅｒｔ　Ｗ、、　Ｐｒｏｃ。

紗す、耐些、旦懸、ＵＳＡ７５：２７４９（１９７Ｂ）によって記載された放射 免疫測定法によってインシュリン発現について調べた。この方法によって上記６ ５０クローンのうち１１８クローンがインシュリンを発現する可能性があること がわかった。従ってこれらの１１８クローンを更に抗インシュリン抗体と抗Ｃ− ペプチド抗体の両方を使用した放射免疫測定法によって試験した。この放射免ロ ーンは有意の、すなわち１μ単位／７！より大のインク。

ニリン活性を示すことがわかった。

ヒトプロインシュリン配列に付加された種々のハイブリッド細菌真核生物輸送配 列を含む全てのプラスミドを更に研究してプラスミ）ｌ’１）ＪＷ２１７２と命 名された１つのプラスミドが選ばれた。Ｃｈａｎ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ７８　：　５４０１−５４０５（１９８１）に記載 され上記第１図に示される如く、プラスミ）ｐＪＷ２１７２を含む形質転換され た細菌の培養物から浸透してきたものの濃縮物をゲール濾過するとＣ−−＜プチ ドとインシュリンの免疫反応性の単一の均一なピークとなり、これはプロインシ ュリン標準物質の位置で一緒に溶出した。さらに、この成分のＣ−，２プチトゝ 対インシユリンの免疫反応性の比、すなわち約１：１５はＦａｂｄｒ、　Ｏ，Ｋ 、。

ｅｔａｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ２７　：　１７０−１７７（１９７８）によって記 載された高度に特異的なヒ）Ｃ−ｅプチド免疫検定におけるヒトプロインシュリ ンの既知交叉反応性とよく一致した。

これらの発見はプラスミドｐＪＷ２１７２の融合領域の３ ＤＮＡ配列についての分析によって容易に説明される。

Ｃｈａｎ　ｅｔ　ａｌの前出文献においてもつと充分に記載されている通り、こ れらの研究は細菌のアンピシリナーゼリーダーにプチド配列の残基−１２とヒト プレ配列の残基−１６との間に融合が生じて何ら置換や修飾を伴なわずに各プレ 配列の約半分ずつを含む完全なハイズリッドリーダー配列を創製したことを示し た。この融合されたリーダー配列は輸出および開裂に必要なことが知られている 構造上の特徴のすべてを備えている。Ｆａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ前出文献参照。

下記実施例に記載された実験はプラスミ）’ｐＪＷ２１７２が正しく開裂され分 泌されたインシュリン生成物を生産することを示している。

例Ｉ−プラスミド″″ｐＪＷ２１７２によって分泌された蛋白質生成物の特性 Ｃｈａｎ等の前出文献に記載されているように、プラスミドゝｐＪＷ　２１７２ によって生成されたプロインシュリン物質を下記方法によって特性を調べた。プ ラスミ）’ｐＪＷ２１７２によって形質転換された細菌の培養物の浸透圧ショッ クによって得られた試料（約０．０５ｎＭのにプチドを含有）を酸エタノールで 抽出した。次いで抽出物をバイオゲ／ｌ／　（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ｐ　６０のカラ ム上でゲル濾過し、２．５Ｍプロピオン酸で溶出した。一般的には５ｔｅｉｎθ ｒ、Ｉ）、。

ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｃｌｃｇｙ　：　Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖ ｅ　Ｔｒｅａｔｉｓｏ　４　：１７５−２０１（１９８０）参照。インシュリン 免疫反応性の４ ピーク、すなわち約０．’０１　ｎＭを含有する試験管を真空乾燥して等分した ２つのアリコートにした。

一方のアリコートをオディネーション（ｏｄｉｎ、ａｔｉｏｎ　）によって標識 をつけ次いでインクュリ／抗血清で免疫沈澱させた。得られた免疫沈澱物はバイ オゲルＰ３０カラムでクロマトグラフィーＬ３Ｍ酢酸で溶出したところプロイン シュリンの位置で単一のピークを示した。第２図に示されるように、チューズゲ ルＳＤＳ電気泳動を行なったところ上記免疫沈澱物は牛のプロインシュリン標準 物と同じ流動性を有する単一成分として移動した。

他方のアリコートを使用してプレ配列の開裂がヒトプロインシュリンの第一残基 で生じたか否かを決定した。

上記免疫沈澱物の０．５ｐＭアリコートをまず還元し、カルボキシメチル化し、 次いで自動化エドマン分解に付した。

Ｃｈａｎ等の前出文献参照。結果は第６図に示されている。

該結果によれば、放射能標識したチロシンの有意量はヒトゾロインシュリンにつ いて予想された如くポジション１６および２６にのみ認められた。Ｎ−末端にお ける異質性を何ら示さなかった。更に、３５Ｓ０４の存在下に生育させた培養物 を浸透圧ショックにかけて得たものを同様に免疫沈澱させ、ゲル濾過し、還元し 、カルボキシメチル化し、次いで配列させたところ、上記点についての確証が得 られた。これらの結果は第４図に示されており、硫黄標識Ｂ７およびＢ１９Ｓ− カルボキシメチル−システィン残基が正しい位置に存在することを示している。

１５ 例１１−プロインシュリン様（ゾチト９の特性再びＣｈａｎ等の前出文献により 充分に記載されているように、プロインシュリン様投プチドの特性を調べるため に更に３つの実験を行なった。最初に、還元されカルボキシメチル化されヨウ素 化された免疫沈澱物をトリプシンで消化して自動化エドマン分解に付した。これ らの結果は第６図に示されている。これらの結果はこの蛋白質が１４および１９ 位にチロシンを有する正常ヒトインシュリンＡ鎖を含んでいることをあいまいな がら示している。さらに、これらの結果は、トリプシンがアミノ酸位２２にある アルギニンで上記Ｂ鎖領域を開裂し４位のＢ２６チロシン残基を今や含んでいる ヘプタペプチドを生成したことを示している。

第二の実験において、インシュリン抗血清による免疫沈澱によってもとから得ら れている上記アリコート物質中のＣ−ペプチド免疫決定因子の存在がヒ、）Ｃ− ペプチドに対する抗血清への結合によって検定された。これらの結果は第５図に 示されている。これらの結果は上記カルボキシメチル化蛋白質が標準のヨウ素化 ヒトＣ−投プチドと同じ位よく反応したことを示している。ブタプロインシュリ ンはこの抗血清に有意には結合しなかった。

第三の実験において、プラスミｒｐＪＷ２１７２ブロイ／シュリン生成物はトリ プシンおよびカルボキシヘプタダーゼＢによって処理された。この処理によって 該生成物をゲル濾過においてインシュリンの位置で溶出する−１６　特表昭’、 ）８−５０１２２７（６）成分に転化せしめた。遊離のＡまたはＢ鎖物質の遊離 は認められなかった。

例ＩおよびＨにおいて議論された証拠にもとづいて、プラスミドｐＪＷ２１７２ によって形質転換された宿主細菌によって生成された最終蛋白質生成物が完全無 欠のヒトプロインシュリンであることがはっきりしている。当業者に周知の技術 を使用してヒトプロインシュリンをインビトロでヒトインシュリンに転化するこ とが可能である。３ｔｅｉｎｅｒ　ａｎｄ　Ｇｌａｒｋ前出文献およびＫｅｍｍ ｌｅｒ等前出文献参照。

従って、本発明はヒトプロインシュリン構造遺伝子を発現できる形で有する新規 な組換えプラスミドの形成からなる。各プラスミドの真核生物構造遺伝子の直前 に機能性輸送プレ配列を置く。このプレ配列は全面的に原核生物細菌輸送プレ配 列、全面的に真核生物輸送プレ配列あるいはこれら２つの機能性組合せからなる ことができ、る。岱表飽プ？スミ、ドｐＪＷ２１７２は機能性融合ハイブリッド 輸送プレ配列に付加じたヒトプロインシュリン構造遺伝子を有する。該ハイブリ ッド輸送プレ配列は真核生物ヒトプレ配列の約半分に融合した原核生物細菌プレ 配列の約半分からなる。この細菌プレ配列はハイブリッド輸送ペプチド８のアミ ノ−ターミナル末端をコードし：上記ヒトプレ配列はカルボキシ−ターミナル末 端をコードしている。プラスミ）’ｐＪＷ２１７２によって形質転換された大腸 菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主細菌は該細菌によって正し７ く処理されてヒトプロインシュリンにされるプレプロインシュリンはプチド生成 物を発現する。このヒトプロインシュリンは該細菌によって細胞膜を横切って性 質空間に輸送され、そこに蓄積する。この回収後、トリプシンによる消化のよう なインビトロでの方法を使用してヒトプロインシュリンをヒトインシュリンに転 化できる。

本明細書に示され記載された以外に本発明の種々の変化が上記記載および添付図 面から当業者に明らかとなろう。そのような変化も添付の請求の範囲内にあるも のと考えられる。

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ＵＳＡ　６９：５０６−５０９　（１９７２）。

１９ Ｓｔｅｉｎｅｒ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｃ１ａｒｋ、Ｊ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａ ｃｌ　Ｓｃｉ、、ＵＳＡ６０：６２２−６２９　（１９６８） Ｓｔｅｉｎｅｒ、Ｄ、Ｆ、、Ｑｕｉｎｎ、Ｐ、Ｓ、、Ｐａｔｚｅｌｔ、Ｃ＋、Ｃ ｈａｎ、Ｓ、Ｊ、。

Ｍａｒｓｈ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｔａｇｅｒ、Ｈ，Ｓ、、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏ　： 　ａ　Ｃｏｍ　ｒｅ−ｈｅｎｓｉｖｅ　Ｔｒｅａｔｉｓｅ　４＋１７５−２０１ 　（１９８０）。

５ｔｅｉｎｅｒ、　Ｄ、、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏ ｒｓ”、　肱用士トＨｏｒｍｏｎｅｓ、Ｐａｒｓｏｎｓ、Ｊ、Ａ、、Ｅｄｉｔｏ ｒ、ＭｃＭｉｌｌａｎ　ＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　ｐｐ、 　４９−６４　（１９７６）。

Ｔａｌｍａｄｇｅ、に−、Ｋａｕｆｍａｎ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ 、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　７７：３９８８−３９９３　（１９８０）。

Ｚｗｔｚｉｎｓｋｉ、ｃ、、　ａｎｄ　Ｗｉｃｋｎｅｒ、　ｗ＋、　Ｊ−Ｂｔｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ−ｔ　２５５ニア９７３−７９７７　（１９８０）。

特表昭５８−５（１１２２７（７） 浄書（内容に変更なし） フッフシ藝ソ　ＮＯ。

ゲＩＩ／　スライス 第３図 自動化創４ン介Ｍす久 サイフルＮＱ。

ｉｒイクノνＮＯ０ 特許庁長官　若杉和夫殿 １．事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８２１００８５８ ヒトインシュリンを生産するプラスミド３、補正をする者 事件との関係　出　願人 住所 名　称　シータス・コーポレーション 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、宿主微生物を形質転換でき、プレプロインシュリンコーディングＤＮＡ配列 を有するプラスミドからなる、形質転換された宿主微生物によるＤＮＡの発現に よってヒトプロインシュリンを生産するためのクローニングはフタ−であって： 該プレプロインシュリンコーディングＤＮＡ配列はさラニヒトプロインシュリン のための構造遺伝子コーディングに融合した機能性輸送コーディングＤＮＡプレ 配列からなり、該プレプロインシュリンコーディングＤＮＡ配列はオイレーター 、プロモーターおよびリボゾーム結合位配列のコントロール下にあり、さらに該 ベクター中で該機能性輸送コーディングＤＮＡプレ配列のための開始コト９ンに 関して正しい読み取り枠中に置かれて、該クローニングベクターによる形質転換 宿主微生物によってプレプロインシュリン生成物が発現されるようにしたクロー ニングベクター。 ２、　プラスミド”ｐＪＷ２１７２　（ＡＴＣＣ３１８９１）からなる形質転換 宿主微生物およびその子孫によるＤＮＡの発現によってヒトプロインクニリンを 生産するためのクローニングベクター。 ３、請求の範囲第１項または第２項のクローニングベクターによって形質転換さ れた宿主微生物。 ４、宿主微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）である請求の 範囲第３項の宿主微生物。 ５、宿主微生物が大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２、特許請求の範囲第４項 の宿主微生物。 ６、請求の範囲第６項の宿主微生物によって生産されルフレプロインシュリン。 Ｚ　請求の範囲第６項の１つまたはそれより多くの宿主微生物からクローン化さ れた形質転換体培養物。 ８、請求の範囲第３項の形質転換体培養物によって生産されたプレプロインシュ リン。 ９　上記宿主がさらに、発現されたプレプロインシュリンをインビボで正しく処 理してヒトプロインシュリンとし、該ヒトプロインシュリンを該宿主の細胞膜を 横切って輸送することができる微生物からなる請求の範囲第３項の宿主微生物。 １０、請求の範囲第９項の宿主微生物によって生産されたヒトプロインシュリン 。 １１゜上記ヒトゾロインシュリンがインビトロでヒトインシュリンに転化される 請求の範囲第１０項の生産されたヒトプロインシュリン。 １２、請求の範囲第９項の宿主微生物の１つまたはそれより多くの微生物からク ローン化された形質転換体培養物。 １３、請求の範囲第１２項の形質転換体培養物によって生産されるヒトプロイン シュリン。 １４、上記ヒトゾロインシュリンがインビトロでヒトインシュリンに転化される 請求の範囲第１３項の生産され２ま たヒトプロインシュリン。　。 １５、ヒトインシュリンを生産する方法であって：宿主微生物を形質転換でき、 プレプロインシュリンコーディングＤＮＡ配列を有するプラスミドからなる、形 質転換された宿主微生物によるＤＮＡの発現によってヒトプロインシュリンを生 産するためのクローニングベクターであって、該プレプロインシュリンコーディ ングＤＮＡ配列はさらにヒトゾロインシュリンのための構造遺伝子コーディング に融合した機能性輸送コーディングＤＮＡプレ配列からなり、該プレプロインシ ュリンコーディングＤＮＡ配列はオＲレータ−、プロモーターおよびリボゾーム 結合位配列のコントロール下にあり、さらに該ベクター中で該機能性輸送コーデ ィングＤＮＡプレ配列のための開始コドンに関して正しい読み取り枠中に置かれ て、該クローニングベクターによる形質転換宿主微生物によってプレゾロインシ ュリン生成物が発現されるようにしたクローニングベクターをつくり；発現され たプレプロインシュリンをインビボで正しく処理してヒトプロインシュリンとし 該宿主の細胞膜を横切ってこのヒトプロインシュリンを輸送することができる宿 主微生物を上記クローニングベクターによって形質転換し； 該形質転換された宿主微生物を、プレプロインシュリンペプチド９生成物をコー ディングしたＤＮＡ配列の発現に適した条件下に生育せしめ； 該形質転換された宿主微生物に上記発現されたプレプロインシュリンペプチド９ をインビボで処理させてヒトプロインシュリンにせしめ且つ該ヒトプロインシュ １ノンを上記宿主の細胞膜の外に蓄積せしめ； 該蓄積されたヒトプロインシュリンを回収し；該回収されたヒトゾロインシュリ ンをインビトロでヒトインシュリンに転化し；そして 段階６で生産された上記ヒトインシュリンを精製することからなる方法。 １６、請求の範囲第１５項の方法によって生産されたヒトインシュリン。