NO831010L - Diagnostisk preparat. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår preparater som er anvendbare for terapeutisk behandling av infeksjoner såvel som profylakse og diagnose i forbindelse med slike. Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for terapeutisk behand-

ling av pattedyr, innbefattet mennesket.

Teknikken ifølge oppfinnelsen er anvendbar på mikrooranismer av forskjellig type som fremkaller sykdom,

i særdeleshet pathogene bakterier, slik at grainpositive kokker, for eksempel streptococci, pneumococci og staphylo-cocci. I særdeleshet angår oppfinnelsen anvendelser rettet mot stafylokokker, slik som Stafylococcus saprophyticus, og bakterier fra slekten Bordetella pertussis som er årsaken til kikhoste. Ennvidere har preparatene ifølge oppfinnelsen evne til å inhibere aktiviteten av såkalte naturlige drepe-celler ((NK-celler).

Anvendt i denne beskrivelse er uttrykket "mikro-organisme" beregnet på å dekke bakterier, virus, dyreceller og planteceller.

Et stort antall bakterieinfeksjoner oppstår ved bakterieangrep på slimhinnen. I begynnelsestrinnet ved infeksjonsforløpet er det vesentlig for bakterien å ha evne til å bindes til epithelceller. Bakteriens infiserende evne er ofte direkte tilknyttet bakteriens evne til å addere til epithelceller. Stafylococcus saprophyticus er en bakterie som hyppig fremkaller urinveisinfeksjoner (UTI) hovedsakelig i yngre kvinner og eldre menn. Bakterien er til stede på

huden av forskjellige dyr og er en hyppig forurensning på kjøttprodukter. Stafylococcus saprophyticus er også blitt sammenkoblet med mastitis.

Undersøkelser har vist at adhesjonen av Stafylococcus saprophyticus til periurethrale celler bevirkes av en carbohydratkomponent og at den samme carbohydratkomponent finnes i erythrocytmembranene i sauer. Dette forklarer også det faktum hvorfor Stafylococcus saprophyticus agglutinerer saueerythrocyter.

Et mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe et preparat eller substans som har evne til å erstatte den normale receptorfunksjon in vivo og in vitro med hensyn til pathogene bakterier som er tilbøyelige til å fremkalle infeksjoner i mennesker og dyr.

Et annet mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe et slikt preparat eller substans som kan anvendes for å fjerne bakterier fra slakteriprodukter, forurensede overflater, for eksempel hud, og bygninger.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe et preparat eller substans som kan anvendes for diagnose av bakterier.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe et preparat eller substans som kan danne basis for en fremgangsmåte for terapeutisk eller profylaktisk behandling av pattedyr, innbefattet mennesket.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for identifisering og/eller kvantifi-sering av receptorstrukturer, i biologisk materiale fra pattedyr, innbefattet mennesket.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for isolering og rensing av bakterier eller receptorstrukturer i bakterier.

Oppfinnelsen er særlig rettet mot receptorstrukturer av Stafylococcus saprophyticus, men det skal bemerkes at oppfinnelsen ikke er begrenset til denne bestemte bakterie.

Gjennom studier og forsøk er det blitt funnet at receptoren for Stafylococcus saprophyticus på membraner fra saueerythrocyter og urinveisepithel inneholder strukturelementet av formelen:

hvori R-^, 1^og R-, er lik eller forskjellig og er hydrogen elleren organisk rest, for eksempel lavere alkyl, lavere acyl eller en carbohydratrest, eller en uorganisk rest slik som sulfat eller fosfat, og hvori OR-^er i a- eller 3~konfigurasjon.

I denne strukturformel er R2og R^ i en foretrukket utførelsesform begge hydrogen. Det foretrekkes også at gruppen OR-^er tilstede i 3-konf iguras jon .

Med hensyn til substituenten R-^ kan denne være av en hvilken som helst type så lenge den ikke negativt påvirker tilstanden med hensyn til anvendelsen ifølge oppfinnelsen. Foretrukne verdier for R^er methyl, eller en gruppe av formel : eller en gruppe av formel:

R-^ kan selvsagt også være hydrogen.

Andre foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen fremgår fra de medfølgende patentkrav og fra forbindelser med den ønskede receptorfunksjon som angitt i det etterføl-gende i foreliggende beskrivelse.

De aktive bestanddeler kan ifølge oppfinnelsen formuleres for bruk "innen human- eller veterinærmedisin for terapeutisk, profylaktisk eller diagnostisk bruk.. I klinisk praksis vil de aktive bestanddeler normalt bli administrert topisk, oralt eller ved rektal administrering eller ved injeksjon, i form av et farmasøytisk preparat omfattende de aktive bestanddeler, i forbindelse med en farmasøytisk akseptabel bærer som kan være fast, halvfast eller flytende fortynningsmiddel eller en fordøybar kapsel, og slike preparater utgjør et ytterligere trekk ved oppfinnelsen. Forbindelsene kan også anvendes uten bærermateriale og i løsninger for nedsvelging. Som eksempler på farmasøytiske preparater kan nevnes tabletter, drops, stikkpiller, preparater for topisk administrering slik som salver, geleer, kremer, pulvere, dråper og suspensjoner. Vanligvis vil den aktive substans omfatte fra 0,05 til 99 vekt% av preparatet, for eksempel fra 0,1 til 50 % for preparater beregnet for oral administrering, og fra 0,5 til 80 % for preparater beregnet for topisk administrering. For topisk administrering, spesi-elt for påføring på urinrøråpningen, er preparatene hensiktsmessig i form av en salve, gel, suspensjon eller krem. Mengden av aktiv substans kan variere, for eksempel fra 0,5 - 80 vekt% av den aktive substans. Slike preparater for topisk administrering kan fremstilles på kjent måte ved å blande den aktive substans med kjente bærermaterialer slik som isopropa-nol, glycerol, paraffin, stearylalkohol og polyethylenglycol.

For å fremstille farmasøytiske preparater i form

av doseringsenheter for oral administrering inneholdende en forbindelse ifølge oppfinnelsen, kan de aktive bestanddeler blandes med en fast, pulverformet bærer, for eksempel lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, en stivelse slik som potetstivelse, maisstivelse, amylopectin, laminariapulver eller sitrusmassepulver, et cellulosederivat eller gelatin, og også innbefatte smøremidler slik som magnesium eller calsium-stearat eller carbovoks eller andre polyethylenglycolvokser og kan sammenpresses under dannelse av tabletter eller kjerner for dragéer. Hvis dragéer ønskes, kan kjernene belegges for eksempel med konsentrerte sukkerløsninger som

kan inneholde gummi >arabicum, talkum og/eller titandioxyd, eller alternativt med et filmdannende middel oppløst i lett flyktige organiske løsningsmidler eller blandinger av organiske løsningsmidler. Farvestoffer kan tilsettes til disse b&legg for å skille mellom forskjellige innhold av aktiv substans. For fremstilling av myke gelatinkapsler bestående av gelatin og for eksempel glycerol som mykner, eller lignende lukkede kapsler, kan den aktive substans blandes med en carbovoks eller en egnet olje som for eksempel sesamolje, oliven-olje eller arachisolje. Harde gelatinkapsler kan inneholde granulater av den aktive substans med faste, pulverformige bærere slik som lactose, saccharose, sorbitol, mannitol,"stivelse (f.eks. potetstivelse, maisstivelse eller amylopectin), cellulosederivater eller gelatin, og kan også innbefatte magnesiumstearat eller stearinsyre som smøremidler.

Ved anvendelse av flere lag av det aktive legemiddel, adskilt av langsomt oppløsnende belegg erholdes tabletter med forlenget frigivelse. En annen måte å fremstille tabletter med forlenget frigivelse er å oppdele dosen av det aktive legemiddel i granuler med belegg av forskjellig tyk-kelse og presse granulene til tabletter sammen med bærersub-stansen. Den aktive substans kan også innarbeides i langsomt oppløsnende tabletter fremstilt for eksempel av fett eller vokssubstanser og fordeles jevnt i en tablett av et uløselig materiale slik som en fysiologisk inert.plastsubstans.

For å oppnå doseringsenheter for orale preparater -

tabletter og kapsler - som er beregnet for å forhindre frigivelse av og mulig spaltning av den aktive substans i magesaften, kan tablettene og dragéene være enterisk belagt,

dvs. utstyrt med et lag av en magesaft-resistent enterisk film eller belegg som har slike egenskaper at det ikke opp-løses ved den sure pH i magesaften. Således vil den aktive substans ikke frigis før preparatet når tarmene. Som eksempler på slike kjente enteriske belegningsmaterialer kan nevnes celluloseacetatfthalat, hydroxypropylmethylcellulosefthala-ter slik som de som selges under varemerkene HP 55 og HP 50, og Eudragit L og Eudratit S.

Brusende pulvere kan fremstilles ved å blande den aktive bestanddel med ikke-toksiske carbonater eller hydrogen-carbonater av for eksempel natrium, kalium eller calsium,

slik som calsiumcarbonat, kaliumcarbonat og kaliumhydrogen-carbonat, og faste, ikke-toksiske syrer slik som vinsyre, ascorbinsyre og sitronsyre, og for eksempel aromastoffer.

Væskeformige preparater for oral administrering

kan være i form av eliksirer, syruper eller suspensjoner,

for eksempel løsninger inneholdende fra.0,1 til 20 vekt% aktiv substans, sukker og en blanding av ethanol, vann, glycerol, propylenglycol og eventuelt aromastoffer, saccharin og/eller carboxymethylcellulose som et dispergerende middel.

Den dose ved hvilken de aktive bestanddeler administreres kan variere innen et vidt område og vil avhenge av forskjellige faktorer slik som for eksempel strengheten av sykdommen, alder og vekt på pasienten, og vil måtte kunne justeres individuelt. Som et mulig område for mengden av aktive bestanddeler som kan administreres pr. dag kan nevnes fra 0,1 mg til 5000 mg eller fra 1 mg til 2000 mg.

De farmasøytiske preparater inneholdende de aktive bestanddeler kan hensiktsmessig formuleres slik at de til-veiebringer doser innen disse områder enten som en enkel doseringsenhet eller som multippeldoseringsenheter.

De spesifikke forbindelser beskrevet i det etter-følgende er alle kjente som sådanne og kan fremstilles etter kjente fremgangsmåter. Imidlertid har forbindelsene ikke tidligere vært beskrevet å ha egenskaper som gjør dem egnet for medisinsk bruk.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for terapeutisk behandling av pattedyr innbefattet menneske, ved at en aktiv mengde av et preparat ifølge oppfinnelsen administreres til pattedyret.

Ifølge en annen side ved oppfinnelsen er det til-veiebragt et preparat som anvendes for identifisering og/eller kvaitifisering av angitte receptorstruktur i biologisk materiale eller for å rense bakterier eller deres akseptorstrukturer. Preparatet inneholder én eller flere strukturelementer ifølge oppfinnelsen som ovenfor beskrevet eller som angitt i patentkravene, kovalent eller på annen måte forbundet til for eksempel en makromolekylær bærer, eventuelt gjennom en koblingsarm. Anvendbare bærere kan være syntetiske eller naturlig forekommende polypeptider, polysaccharider eller andre typer på polymerer eller partikler. Dette er vel kjent innen faget, se for eksempel referanse 6-10.

Koblingsarmen mellom strukturelementet og en makromolekylær bærer kan være en hvilken som helst av følgende:

I de ovenfor angitte eksempler kan n variere mellom log 15. Foretrukne strukturelementer av denne type er angitt i de medfølgende patentkrav.

Hemmagglutinasjonsreaksjon av saueerythrocyter som fremkalt av S. saprophyticus skyldes sannsynligvis interaksjon mellom en viss membranstruktur på overflaten av bakterien og receptorer på overflaten av saueerythrocytten inneholdende det angitte strukturelement.

Adhesjonen av S. saprophyticus til urinveisepithel-celler skyldes sannsynligvis interaksjon mellom en viss membranstruktur på overflaten av bakterien og receptorer på overflaten av epithelcellene inneholdende det ovenfor angitte strukturelement. Oppfinnelsen er imidlertid ikke bundet til disse teorier.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere i de etter-følgende ikke-begrensende eksempler.

E ksempel 1

Inhibering av hemagglutinasjon av saueerythrocyter med Stafylococcus saprophyticus ved tilsetning av oligosaccha-

r ider

I testen ble det anvendt bakterien S. saprophyticus stammer som var isolert fra urin fra pasienter med urinveis-infeksjon. Bakterien ble dyrket i tryptonbuljong over natten, ble pelletisert ved hjelp av sentrifugering og ble vasket to ganger med PBS, pH 7,2. Hemagglutinasjon ble utført under anvendelse av etythrocyter fra sauer erholdt fra saueblod og vasket to ganger med 0,85 % saltvann.

I hemagglutinasjons-indikasjonsforsøkene ble det anvendt mikrotitreringsplater (Limbo Sc. Comp. Inc.). 25 yl^bakteriesuspensjon ble titrert i PBS ved to-trinns titrerings-trinn og 25 yl 1 %-ig erythrocytsuspensjon ble deretter tilsatt. Hemagglutinasjonstiteret ble bestemt etter inkubering av platene i 2 - 4 timer ved romtemperatur.

I inhiberingsforsøkene ble det anvendt en serie fortynninger av den relevante inhibitor (50 yl/brønn) og 25 yl bakteriesuspensjon fortynnet til å inneholde 2 HU hemagglu-tineringsenheter av. bakterien. Platene ble inkubert i 30 minutter ved 37° C, og 25 yl av erythrocytsuspensjonen ble deretter tilsatt til hver brønn.

Resulatene er angitt i Tabell 1.

Eksempel 2

Fremstilling av oligosaccharider fra saueerythrocyter som inhiberer hemagglutinasjon av saue-erythrocyter med S. saprophyticus-bakterier

Med det formål å undersøke hvorvidt strukturelementet testet i Eksempel 1 kunne finnes i saue erythrocytmem-braner ble erythrocyter fra saueblod lysert og membranene ble isolert ved sentrifugering (ref. 4). Fra 1 liter blod ble det erholdt 8 g membraner.

Til 100 g lyofiliserte membraner ble det tilsatt

1 liter trifluoreddiksyreanhydrid og 1 liter trifluoreddik-syre, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 100° C i et rør av syreresistent rustfritt stål ved et overtrykk på ca.

4 atm. i et tidsrom på 4 8 timer.

Etter denne behandling ble reaksjonsblandingen avkjølt og fordampet til tørrhet, og et mørkt residuum ble erholdt. Til residuet ble tilsatt 1 liter methanol, og etter 30 minutter ble det utført en fordampning til tørrhet. Residuet ble deretter fortynnet med 1 liter 50 %-ig vandig løsning av eddiksyre, og den resulterende blanding fikk stå ved romtemperatur i 1 time. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert og fordampet til tørrhet.

Det erholdte residuum ble fordelt mellom vann og diethylether. Etherfasen ble vasket med vann fire ganger,

og de kombinerte vannfaser ble vasket med diethylether fire ganger. Den erholdte vandige fase inneholder de frigitte oligosaccharider.

Oligosaccharidblandingen ble redusert med natrium-borhydrid i vann i overskudd og N-acetylert. Den erholdte oligosaccharidblanding ble fraksjonert på en Sephadex C-25-kolonne i tre forskjellige fraksjoner. Fraksjon III inneholdende mono- og di-saccharider og fraksjon II inneholdende trisaccharider (hovedsakelig carbohydratfraksjonen av asialo-GM2) utviste ingen inhiberende evne på hemagglutinasjons-systemet saueerythrocyter og S. saprophyticus. Fraksjon I inneholdende oligosaccharider større enn trisaccharider utviste inhiberende evne og kjemisk analyse indikerte at denne fraksjon inneholdt blant annet strukturelementet (3-Galp- (1-4) - 3-GNAcp-(1-0)- som endeenheter i større oligosaccharid-strukturer. Ennvidere kunne et forgrenende sete påvises bestående av en Galp-rest substituert i 3- og 4-stilling.

Eksempel 3

Inhibering av adhesjon av S., saprophyticus til urinveis-epithelceller ved tilsetning av oligosaccharider

Celler fra urinveisepithe1 ble suspendert i celle-dyrkningsmedium RPMI 1640 (Flow Ltd) til en.konsentrasjon på IO<5>celle/ml.

Mikroorganismer av typen S. Saprophyticus ble suspendert i RPMI 1640 til. en konsentrasjon på 10 bakterie/ml. Oligosaccharider som var testet med hensyn til deres evne

til å forhindre adhesjon av S. saprophyticus til urinveis-epithelceller ble oppløst i RPMI 1640 til en konsentrasjon på 5 mg/ml. I forsøkene ble 1 ml av oligosaccharidløsningen inkubert med 0,1 ml bakteriesuspensjon ved 3 7° C i 30 minutter. Urinveis epithelceller ble inkubert med bakteriesuspen-

sjonen inkubert på forhånd som ovenfor beskrevet med oligo-saccharidløsning i 45 minutter ved 37° C. Som en kontroll ble det anvendt en bakteriesuspensjon preinkubert med 1 ml RPMI 164 0.

Inkuberte prøver ble filtrert gjennom en 12 y

filter og ble vasket tre ganger med PBS. Filteret ble pres-set mot mikroskopglass i noen få sekunder, glassene ble deretter fiksert i methanol i 10 minutter. Glassene ble tørket i luft og farget med acridin oransje i 2 minutter. Glassene ble vasket, tørket i luft og studert i fluorescensmikroskop. Antallet bakterier pr. celle ble tellet. I hvert forsøk ble det tellet 50 celler.

I disse tester ble det funnet av 3-Galp-(1-4)-GNAc, 3-Gal-(l-4).=-3-GNAc-(1-0)-CH3 og 3-Gal- (1-4) -3-GNAc-(1-4)-3-Gal-(1-4)-Gle reduserte antall av adherende bakterier med 85 %, 95 %, og 96 %, mens 3-Galp-(1-4)-Gle ikke reduserte antallet av adherende bakterier sammenlignet med kontroll-testen uten oligosaccharider.

Eksempel 4

Fremstilling av preparater inneholdende strukturelementet i minst bivalent tilstand og kovalent bundet til en makromolekylær bærer

Preparatet ble fremstilt ut fra oligosaccharider med en fri reduserende ende. De anvendte reaksjoner er vel kjent og de er derfor bare diagrammatisk illustrert (i reak-sjons skjemaet betegner SR strukturelementet uten sukkerrest som utgjør den reduserende ende, og MB betegner en makromolekylær bærer).

Eksempel 5

Fremstilling av preparater inneholdende strukturelemtet ifølge oppfinnelsen i minst bivalent forbindelse uten kovalent binding

Et glycolipid inneholdende det angitte strukturelement ble kjedet ved hydrofob interaksjon til lipofile (hydro-fobe) geler, polymerer eller partikler, for eksempel octyl-sepharose, plaster og latexoverflater.

Eksempel 6

Fremstilling av antistoffer med spesifisitet overfor det angitte strukturelement

a. Fremstilling av monoclonale antistoffer ved

hybridomateknikk

I. Balb/c-mus ble immunisert med et preparat ifølge oppfinnelsen. Milten fra hyperimmuniserte dyr ble høstet,

og en cellesuspensjon.ble fremstilt ved mekanisk, findeling av vevet. Etter gradient sentrifugering under dannelse av et rent cellepreparat ble cellene kondensert ved hjelp av polyethylenglycol (PEG, midlere molekylvekt 1500) med etab-lerte B-myeloma cellelinjer fra Balb/c-mus ifølge kjent tek-nikk. Etter cloning av hybridoma-cellene som.utvikler det ønskede antistoff, ble cellene formert i stor skala, dyrk-ningsmediets overliggende væske ble høstet og antistoffene

derav ble renset på vanlig måte. For identifisering av de antistoff-utviklende cloner ble det anvendt den såkalte enzym-kjedede immunosorbent bestemmelse (ELISA) (Ref. 5). II. Pattedyr ble immunisert med et oligosaccharid-protein eller polymert preparat ifølge oppfinnelsen. Antistoffer ble isolert fra det hyperimmune serum fra pattedyret og renset etter kjente teknikker.

Eksempel 7

D iagnostisk test for, identifisering av bakterier med akseptorstrukturer som utviser spesifisitet overfor strukturelementet ifølge oppfinnelsen

a. Bakterier ble inkubert med saue erythrocyter for å agglutinere disse. I en parallell test ble bakterier inkubert med saue erythrocyter sammen med strukturelementet iføl-ge oppfinnelsen i en slik konsentrasjon at de totalt inhi-berte hemagglutinasjon. Hemagglutinasjon og inhibering av hemagglutinasjon utføres som beskrevet, i Eksempel 1. Positiv hemagglutinasjon av saue erythrocyter og fullstendig inhibering av hemagglutinasjon etter tilsetning av oligosaccharid bekrefter det faktum at bakterien utviser akseptor-struktur. b. Bakterier ble inkubert med et preparat hvori det angitte strukturelement er. covalent eller i annen forbindelse i multivalent form kjedet til en bestemt matrise ifølge Eksempel 4 eller 5.Inkubering utføres på mikroskopglass i 10 - 15 minutter, og preparatet studeres deretter i et mikro-skop. Hvis bakterien utviser akseptorstruktur er partiklene dekket med bakterie. Hvor reaksjonen er negativ, er partiklene fri for bakterier. c. Bakterier ble blandet med et preparat ifølge Eksempel 4 eller 5 på mikroskopglass og positiv reaksjon førte til agglutinering av partikler dekket med angitte strukturelement.

Eksempel 8

Rensing av bakterier eller akseptorstrukturer

a. Et preparat ifølge Eksempel 4 eller 5 ble anordnet i form av en kolonne. En blanding av bakteriene ble deretter ført gjennom kolonnen og bakterier som utviser akseptorstrukturer ble holdt tilbake ved interaksjon med reseptor-

strukturene i kolonnen. Etter skylling kunne kolonnen elue-res med buffer inneholdende et reseptoraktivt strukturelement ifølge oppfinnelsen, og dette resulterer i eluering av bakterier med akseptorstrukturer i en ren form.,

b. Ved en fremgangsmåte fullstendig analog med a. kan akseptorstrukturen erholdes i ren form.

Bakterier eller akseptorstrukturen kan anvendes for fremstilling av vaksiner eller for påvisning av antistoff i for eksempel kroppsvæsker slik som blod, urin eller morsmelk.

Eksempel 9

Preparat for anvendelse for desinfeksjon

Ved desinfeksjon menes her primært fjerning av bakterier fra en overflate, f.eks. et sår.

En 0,1 vekt% vandig løsning av forbindelsen 3-g-Galp-(1-4)-g-GNAc ble fremstilt og påført under anvendelse av en bomullspute på en overflate infisert med S. saprophyticus. Lsøningen resulterer i en effektiv fjerning av bakterien fra overflaten.

Eksempel 10

Inhibering av hemagglutinasjon av gåse erythrocyter med Bordetella Pertussis ved tilsetning av oligosaccharider

I testen ble det anvendt bakterier av typen Bordetella pertussis nylig samlet fra.et individ som led av kikhoste. Bakteriene ble dyrket på CFA-medium ved +37° C i 18 timer. Bakterieveksten ble oppslemmet i PBS, pH 7,2 til en densitet på 1 x 10 ^ bakrerie/ml. Fimbriae fra bakterien ble erholdt på følgende måte: Bakterien ble dyrket på Roux-kolber med CFA-agar. Etter inkubering ved 3 7° C i 24 timer ble bakterien høstet ved tilsetning av 10 ml PBS/kolbe og sterile glasskuler. Kolbene ble ristet og bakteriesuspensjonen fjernet. Bakteriene ble pelletisert ved sentrifugering (3000 x g, +4°, 30 minutter). Supernatanten ble fjernet ved sug. Bakteriene ble resuspendert.i 10 ml PBS og suspensjonen ble behandlet i en Waring-blander i 2 x 20 sekunder. Suspensjonen ble sentrifugert (5000 x g, +4°, 30 min.) for å. pelletisere bakteriene. Supernatanten inneholdende fimbriae ble fjernet med sug. Bakteriepelletene ble resuspendert, behandlet i en Waring-blander og etter sentrifugering ble supernatanten igjen gjenvunnet. De to supernatanter ble oppsamlet og ammoniumsulfat ble.tilsatt til en konsentrasjon på 30 %. Etter omrøring fikk supernatantene stå ved +4° C i 18 timer, og ble deretter sentrifugert ved 5000 x. g. Supernatantene ble fraskilt og bunnfallet ble dialysert mot PBS. Den opp-løseliggjorte fimbriae fraksjon ble utfelt med ammoniumsulfat én gang til og ble dialysert.

Hemagglutinasjon ble utført under anvendelse av erythrocyter fra gjess (GRBC) suspendert i en konsentrasjon på 3 % v/w i PBS. Agglutinasjonstestene ble utført slik at 50 yl GRBC ble blandet med en 2-trinns fortynning av antigen 50 yl bakteriesuspensjon eller 50 1 fimbriae suspensjon og 50 yl PBS i mikrotitreringsplater. Platene ble forseglet med parafilm inkubert ved +44° C i 4. timer og ble deretter avløst. Den siste brønn hvori agglutinasjonen kunne avleses ved hjelp av øyet ble betraktet som 1 hemagglutieringsenhe-(1 HU).

I inhiberingsforsøkene ble det tilsatt i stedet for PBS 50 yl av en oligosaccharidløsning og den inhiberende kapasitet ble.undersøkt. Oligosaccharidet ble testet fra konsentrasjonen 200 yg/50 1 ved 2-trinns fortynning. I tes-tene ble det anvendt konsentrasjoner av bakterier og fimbriae som ved 3 % GRBC resulterte i 2 - 4 HU. Resultatene er opp-ført i Tabell II.

Eksempel 11

Inhibering av NK- celleaktivitet under anvendelse av oligo-s accharider

Lymfocyter isolert fra perifert blod trukket ut fra normale givere har evnen til å utvise en cytotoksisk, dvs. celledrepende aktivitet, overfor visse typer av celler i kultur. I foreliggende eksempel ble det anvendt en human leukemicellelinje kalt K-562 som en målcelle for slik cyto-lytisk aktivitet.

Metode: K-562-celler intracellulært merket med radioaktivt krom ble inkubert med effektorceller (lymbocyter) i 4 timer ved 37° C. Den cytotoksiske effekt måles som mengden av isotop som frigis i forhold til gjenværende isotop i målcellene. For detaljer henvises det til Malmstrom,

P., Jonsson, A., og Sjogren, H.O. "Countercurrent distri-bution of lymphocytes from human peripheral blood in an aqueous two-phase system. II. Separation into subsets of lymphocytes with distinctive functions". Cell Immunol. 53:51-64, 1980. For å.studere inhiberende substanser ble effektorceller (6 x 10 celler/ml) preinkubert med de respek-tive oligosaccharider fortynnet i dyrkningsmedium i 1/2 time ved 37° C. Etter vasking med sentrifugering ble effektor-cellene overført direkte til målcéllene.

De erholdte resultater er oppført i Tabell III.

a) For strukturer se tabell I.

I tabellen er angitt resultatene fra to separate forsøk

(1 og 2).

Som det klart fremgår fra resultatene presentert i Tabell III inhiberes den cytolytiske effekt etter pre-inkubering med oligosaccharidene GM-^-penta, GM-^-octa og Asialofetuin i konsentrasjoner ned til 0,3 mg/ml.

Forkortelser

Referanser

Ref. 1. Gibbons, R.J. and Houte, Ann. Rev. Microbiol. 29.

(1975) 19-44.

Ref. 2 Hovelius, B. Stafylococcus saprophyticus Characteristics, Laboratory diagnosis and involvement in urinary tract infections Dissertation, Lunds Universitet, 1975, Lund, Sverige.

Ref. 3. Mårdh, P.-A., Hovelius, B., Hovelius, K., og

Nilsson, P.O. Acta vet, scand. 19 (1978) 243-253. Ref. 4. Dodge, J.T., Mitchell, C., and Hanahan, D.J. Arch.

Biochem. Biophys. 100 (1963) 119-130.

Ref. 5. Svenson, S.B. and K. Larsen (1977)

J. Immunol. L, del C, 1955.

Ref. 6. Svenson, S.B. and A.A. Lindberg (1979)

J.Immunol. Meth. 25, 323

Ref. 7. Zopf. D. et al (1978) Immunol. Meth. enzymol.

L. del C, 163.

Ref. 8. Lonngren, J. et al (1976) Arch.Biochem.

Biophys. 175, 661.

Ref. 9. Gray, G.R. (1978). In Meth.enzymol.L,

del C, 155.

Ref. 10. McBroom, C.R., Samanen, C.H., Goldstein, I.J.

In: Methods in Enzymology, Vol.28B, ed. V. Ginsburg, s. 212. Academic Press, Nev/ York (1972)

Claims (10)

1. Preparat for diagnostisk bruk i forbindelse med pathogene mikroorganismer, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel inneholder et strukturelement av formelen:

hvori R-j y R2/ R3 og R^ er lik eller forskjellig og er hydrogen eller en organisk rest, for eksempel lavere alkyl, lavere acyl eller en carbohydratrest eller en uorganisk rest, slik som sulfat eller fosfat, og hvori OR-^ er i a- eller 3-konfigurasjon, eventuelt i forbindelse med en farmasøytisk akseptabel bærer.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at R2 og R^ begge er hydrogen.

3. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at R-^ er hydrogen, lavere alkyl, lavere acyl eller en carbohydratrest eller en uorganisk rest, slik som fosfat eller sulfat.

4. Preparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at OR-^ er i 3_konfigurasjon.

5. Preparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at R^ er methyl.

6. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at R-^ er en gruppe av formel:

7. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, karaiterisert ved at R^ er en gruppe av formel:

8. Preparat ifølge krav 2, karakterisert ved at R^ er hydrogen.

9. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at det inneholder angitte strukturelement covalent bundet til en makromolekylær bærer, fortrinnsvis et. syntetisk eller naturlig. forekommende peptid, polysaccharid, annen polymer eller en partikkel, fortrinnsvis gjennom en koblingsarm.

10. Preparat ifølge krav 9, karakterisert ved at koblingsarmen mellom strukturelementet og den makro-molekylære bærer utgjøres av: strukturelement

makromolekylær bærer strukturelement

makromolekylær bærer strukturelement - NH - (CH0) 2' n

■makromolekylær bærer strukturelement - NH - (CH^ 0)n bærer

makromolekylær strukturelement - (Cr^ ^ - CO - NH - makromolekylær bærer strukturelement - NH - makromolekylær bærer eller strukturelement - NH(CH^ ~>) n - CO - NH - makromolekylær bærer hvori n kan variere fra 1 til 15.