NO831011L - Diagnostisk preparat. - Google Patents

Abstract

Preparat for diagnostisk bruk i forbindelse med sykdomsfremkallende mikroorganismer, hvor preparatet inneholder sora aktiv bestanddel et strukturelement av formelen:. hvori R-y RRog Rer like eller forskjellige og er hydrogen eller en organisk rest, for eksempel lavere alkyl, lavere acyl eller en carbohydratrest, eller en uorganisk rest slik som sulfat eller fosfat, forutsatt at når Rer forskjellig fra hydrogen er ORi alfa-konfigurasjon, er bekrevet. En fremgangsmåte for identifisering eller kvantifisering av strukturelementet, en fremgangsmåte for rensing av akseptorstrukturen i bakterier og en fremgangsmåte for desinfisering er også beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår preparater som kan anvendes for terapeutisk behandling av infeksjoner fremkalt av sykdoms-fremkallende mikroorganismer, i særdeleshet pathogene bakterier slik som grannegative kokker, i særdeleshet gonokokker og meningokokker, fortrinnsvis av slekten Meisseria, slik som N. gonorrhoeae og N. meningitidis. Preparatene kan også anvendes ved profylaktiske og diagnostiske fremgangsmåter. Ennvidere angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for terapeutisk behandling av pattedyr, innbefattet mennesket.

Mange bakterielle infeksjonsforløp innledes på grunn av det faktum at bakterien har evne til å adhere til epithel. Denne adherende egenskap er spesifikk ved at forskjellige bakterier adherer preferensielt til forskjellige typer av epithelvev. Således har undersøkelser vist at bakterien N. gonorrhoeae utviser adherende spesifisitet overfor vaginalceller (ref. 1). Det er også blitt vist at den adherende evne til bakterien ( N. gonorrhoeae) avhenger av pili (fimre) (ref. 2). Pili utgjøres av proteinstrukturer med evne til å erkjenne en viss receptorstruktur på overflaten av epitelcellen. I tillegg til det faktum at N- gonorrhoeae adherer til vaginalceller kan den også agglutinere humane erythrocyter uavhengig av blodgruppe.

Et formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et preparat eller substans med evne til å erstatte den normale receptor in vivo med hensyn til pathogene bakterier som er tilbøyelige til å fremkalle infeksjoner i mennesker og dyr.

Et annet mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe

et slikt preparat eller substans som i tillegg til den terapeutiske anvendelse også kan anvendes diagnostisk.

Et ytterligere mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for identifisering og/eller kvantifisering av receptorstrukturen i naturlige biologiske materialer fra pattedyr, innbefattet mennesket. ' Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for rensing av bakterier eller akseptorstrukturen i bakterien.

Oppfinnelsen er særlig rettet mot receptorstrukturen av N. gonorrhoeae og N. meningitidis, men det skal bemerkes at oppfinnelsen ikke er begrenset til disse bestemte bakterier.

I forbindelse med studer og forsøk som har ført til foreliggende oppfinnelse, er det blitt funnet at.receptoren for N. gonorrhoeae og N. meningitidis funnet på overflaten av epithelceller og erythrocyter inneholder et strukturelement av formelen:

hvori R^,<R>2,R 3 ogR^er like eller forskjellige og er hydrogen eller en organisk rest, for eksempel lavere alkyl, lavere acyl eller en carbohydratrest, eller en uorganisk rest slik som sulfat eller fosfat, forutsatt at når R-^er forskjellig fra hydrogen er OR-^i alfa-konfigurasjon og når R2<=R>3<=>R4=H, er R-,^forskjellig fra -(CH2)nCOR, hvori n=3-19 og R er en alkoxy, aryloxy, NHNH2/OH eller N^-gruppe.

I denne strukturformel er R2, R-j og R^fortrinnsvis alle hydrogen, og et særlig foretrukket strukturelement er således formelen:

P - D - Galp - (1-3) - a - D~GalNAcp.

R^er hensiktsmessig en aminosyre eller en poly-peptidrest. Ifølge en annen utførelsesform kan R^være lavere alkyl, for eksempel methyl.

Den aktive komponent i preparatet ifølge oppfinnelsen inneholder således som en aktiv bestanddel et strukturelement hensiktsmessig av formelen:

- D - Galp - (1-3) -a-g~GalNAcp - (1-0) - R

I denne formel angir symbolet R en organisk eller uorganisk rest som er bundet i a-konfigurasjon og som er av vilkårlig type så lenge den ikke ugunstig påvirker omstendig-hetene i forbindelse med anvendelse av preparatet.

Strukturelementet med den ovenfor angitte formel er fortrinnsvis anordnet i endestilling, dvs. med den vens-tre ende av formelen i fri eksponert tilstand.

Andre foretrukne strukturelementer vil klart frem-gå fra de etterfølgende angitte forbindelser som utviser den ønskede receptoraktivitet som beskrevet i foreliggende beskrivelse.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for terapeutisk behandling av pattedyr, innbefattet mennesket, hvor en aktiv mengde av preparatet ifølge oppfinnelsen admini-streres til pattedyret.

Ifølge en annen side ved oppfinnelsen er det til-veiebragt et preparat som kan anvendes for identifisering og/eller kvantifisering av angitte receptorstrukturer i biologisk materiale eller for å rense bakterier eller deres receptorstrukturer. Preparatet inneholder én eller flere strukturelementer som ovenfor angitt, kovalent eller på annen måte kjedet til for eksempel en makromolekylær bærer, eventuelt via en koblingsarm. Anvendbare bærere kan være synte-tiske eller naturlig forekommende polypeptider, polysacchari-der eller andre typer av polymerer eller partikler. Dette er vel kjent innen faget, se for eksempel referanse 4-8.

Foretrukne strukturelementer av denne type av preparatet ifølge oppfinnelsen er definert ovenfor.

De aktive bestanddeler ifølge oppfinnelsen kan i henhold til tradisjonell farmasøytisk praksis formuleres for bruk innen humanmedisinen for terapeutiske, profylaktiske eller diagnostiske formål. Slike farmasøytiske preparater innbefatter den aktive bestanddel i kombinasjon med en farma-søytisk akseptabel bærer som kan være fast, halvfast eller væskeformig, og i enkelte tilfeller kan den aktive bestanddel ifølge oppfinnelsen anvendes som sådan uten fortynning.

Preparatene ifølge oppfinnelsen innbefatter de i en form tilpasset for oral eller parenteral bruk som kan anvendes for behandling av pattedyr, innbefattet mennesker.

Egnede former for preparatene innbefatter tabletter, kapsler, syruper, suspensjoner, løsninger, rekonstituerbare pulvere og sterile former egnet for injeksjon eller infusjon. Slike preparater kan inneholde konvensjonelle farmasøytiske akseptable materialer slik som fortynningsmidler, bindemid-ler, farvestoffer, smaksgivende stoffer, konserveringsmidler, oppbrytende midler og lignende i henhold til konvensjonell farmasøytisk praksis som er vel kjent for fagmannen når det gjelder formulering av legemidler.

Injiserbare eller infuserbare preparater av et strukturelement ifølge oppfinnelsen er særlig egnet da nyttige blodnivåer av strukturelementet kan finne sted etter administrering ved injeksjon eller infusjon.

Flere av de aktive strukturer ifølge oppfinnelsen er tidligere kjent fra litteraturen, men det har ikke tidligere vært beskrevet at de utviser medisinsk nyttige egen-skaper. I den grad forbindelsene -beskrevet i det etterføl-gende er nye er fremgangsmåten for fremstilling av disse beskrevet. Slike i og for seg kjente forbindelser utgjør et særlig trekk ved oppfinnelsen.

Hemagglutinasjonsreaksjonen av saue erythrocyter og humane celler uavhengig av AO-status som frynsede stammer av N. gonorrhoeae fremkaller, skyldes sannsynligvis interaksjon mellom bakteriens frynser og receptorer i erythrocyter fra sauer eller mennesker innbefattende det ovenfor angitte strukturelement.

Adhesjonen av N. gonorrhoeae til vaginalceller skyldes sannsynligvis interaksjon mellom bakteriets frynser og receptorer på overflaten av epithelcellene inneholdende de ovenfor angitte strukturelementer.

Oppfinnelsen beskrives ytterligere i de etterføl-gende eksempler.

Eksempel 1

I nhibering av hemagglutinasjon av erythrocyter fra sau og mennesker med fimbrierte stammer av N. gonorrhoeae ved tilsetning av oligosaccharider

I testen ble det anvendt en stamme av N. gonoor-hoeae (internasjonal referansestamme 3 fra Neisseriaavd. Statens seruminstitutt, Køpenhavn, Danmark og en frisk stamme av samme art isolert ved det bakteriologiske sen.trallabo-ratorium, Lunds Hospital, Lund, Sverige). Bakteriene ble dyrket på et spesielt gonokokkrnedium, se Mårdh, P.A., Mårtensson, D, Soltesz, L.V. "An effective, simplified medium for the culture of N. gonorrhoeae". Sex.Trans.Dis. Vol. 5,

s. 10-13, 1978, ved +37° C i 18 timer. Bakteriekulturen ble oppslemmet i PBS, pH 7,2 til en densitet på 10 9 bakterie/ml.

Hemagglutinasjon ble utført under anvendelse av erythrocyter fra sau eller menneske (O^Rh+) som var vasket med PBS og suspendert til en konsentrasjon på 1 % v/w i PBS, pH 7,2. Agglutinasjonstestene ble utført slik at 25 yl av bakteriesuspensjonen ble titrert i PBS under anvendelse av doble titreringstrinn. Deretter ble 25 yl av erythrocyt-suspensjonen på 1 % tilsatt. Hemagglutinasjonstiteren (Hu) ble bestemt etter inkubering av platene (mikrotitrerings-plater, Limbo Sc. Comp. Inc.) i 2 - 4 timer ved romtemperatur.

I hemagglutinasjons-inhiberingstestene ble det anvendt seriefortynninger med den relevante inhibitor (50 yl/brønn) og 25 yl bakteriesuspensjon fortynnet til å inneholde det dobbelte, av. den laveste hemagglutinasjbnstiter. Platene ble inkubert i 30 minutter ved +37° C, og 25 yl erythrocytsuspensjon ble deretter tilsatt til hver brønn. Resultatet ble avlest etter 2.-4 timers inkubering ved romtemperatur .

Resultatene er angitt i Tabell I og II.

Eksempel 2

Adhesjonsstudier med N. gonorrhoeae og vaginalceller og inhibering med oligosaccharider

Materialer:

Celler: Vaginalceller fra friske kvinner i fertil alder som ikke hadde anvendt hormonpreparater og hvori formeringsfasen var testet. Celler ble oppsamlet fra bakre skjedehvelvning med en trespatel og suspendert i RPMI 1640 i en konsentrasjon på 10<5>

celle/ml.

Gonococcir International referansestamme 3 fra Neisseriavd.

Statens Seruminstitut, København, Danmark, suspendert i celledyrkningsmediet RPMI 1640 (Flow Ltd.)

Q

i en konsentrasjon på 10 bakterie/ml.

Oliaosac-

Prosedyre: 1 ml RPMI 2640 inneholdende 0 av (1), 5 mg/ml av (1) og 0,5 mg/ml av (1) og 5 mg/ml av (2), ble

inkubert med 0,5 ml bakteriesuspensjon ved 37° C i 30 minutter. Vaginalceller (1 ral) ble inkubert med de ovenfor preinkuberte bakteriesuspensjoner ved 37° C i 45 minutter. De inkuberte suspensjoner ble filtrert gjennom et filter (porestørrelse 12 u) og ble vasket tre ganger med PBS. Filteret

ble presset mot mikroskopglass i noen få sekunder, og mikroskopglassene ble deretter fiksert i methanol i 10 minutter. Mikroskopglassene ble tørket i luft og farvet med.acridinoransje i 2 minutter. Etter vasking og tørking i luft ble glassene studert ved hjelp av fluorescensmikro-skopi. Antallet av bakterier som adherte, til hver cellé- ble tellet. I hver test ble det tellet 50 vaginalceller. Det ble funnet at 0,5 mg/ml av (1) og 5 mg/ml av (2) ikke signifikant påvirket

adhesjon, mens 5 mg/ml av (1) reduserte antallet

av adherende bakterier med 87 %.

Eksempel 3

Fremstilling av preparater inneholdende strukturelementet i minst bivalent tilstand og kovalent bundet til en makromolekylær bærer a) Glycoprotein-inneholdende strukturelementet kovalent bundet til serin eller treonin og glycoproteiner inneholdende strukturelementet kovalent bundet til serin eller treonin men hvori strukturelementet er substituert med én eller flere N-acetyl eller N-glycolyl-neuramininsyre-estere,

for eksempel k-casein, underkjeve muciner, fetuin, M-substans, N-substans, frysepunktnedsettende glycoproteiner i slim fra artiske fisker og glycoproteiner i urin ble desialylert under anvendelse av mild syrehydrolyse eller neuraminidasebehandling. De resulterende glycoproteiner hadde strukturelementet

3-g-Galp- (1-3) -D-GalNAcp-a-gly.cosidisk kjedet til seg selv.

b. De desialylerte glycoproteiner fra a. ble behandlet kraftig med pronas og/eller papin, og glyco-pepsider ble erholdt. Ved anvendelse av kjente teknikker, for eksempel DCC-kobling, kan disse festes til forskjellige andre makromolekylære bærere.

Eksempel 4

Fremstilling av preparater inneholdende strukturelement ifølge oppfinnelsen i minst bivalent tilstand i forbindelse med andre materialer

Desialylerte glycoproteiner ifølge Eksempel 3 ble fremstilt under anvendelse av hydrofob interaksjon til lipo-file geler, polymerer eller partikler, for eksempel.octyl-sepharose, plaster, og latexoverflater.

Eksempel 5

Fremstilling av antistoffer som utviser spesifisitet overfor angitte strukturelement

a. Fremstilling av monoclonale antistoffer ved hybri-doraa teknikken. I. Balb/c-mus ble immunisert med et preparat ifølge oppfinnelsen. Milten fra hyperimmuniserte dyr ble høstet og en cellesuspensjon ble fremstilt ved mekanisk findeling av vevet. Etter gradienssentrifugering under dannelse av et rent cellepreparat ble cellene kondensert ved hjelp av poly-ethylenglycol (PEG med midlere molekylvekt 1500) med etab-lerte B-myeloma cellelinjer fra Balb/c mus i henhold til kjent teknikk. Etter cloning av hybridomacellene som utviser det ønskede antistoff, ble cellene formert i stor skala, dyrkningsmediets supernatanter ble høstet og antistoffene ble renset på kjent måte. For identifisering av antistoff-utviklende cloner ble det anvendt den såkalte enzym-kjedede immunosorbentbestemmelse (ELISA) (ref. 5). II. Pattedyr ble immunisert med et oligosaccharid-protein eller polymerpreparat ifølge oppfinnelsen. Antistoffer ble isolert fra huperimmunserumet fra pattedyr og renset etter konvensjonelle teknikker.

Eksempel 6

Diagnostisk test for identifisering av batierier med akseptorstrukturer som utviser spesifisitet overfor strukturelementet ifølge oppfinnelsen.

a. Bakterier ble inkubert med saue erythrocyter og human erythrocyter som fremkaller agglutinasjon. I et parallellforsøk ble bakterier inkubert med saue erythrocyter sammen med strukturelementet ifølge oppfinnelsen i en slik konsentrasjon at hemagglutinasjon ble fullstendig inhibert. Hemagglutinasjon og inhibering av hemagglutinasjon utføres som angitt i Eksempel 1. Positiv hemagglutinasjon av saue erythrocyter og fullstendig inhibering av hemagglutinasjon etter tilsetning av oligosaccharid bekrefter det faktum at bakteriene utviser akseptorstruktur.

b. Bakterier ble inkubert med e.t preparat hvor det angjeldende strukturelement er covalent eller på annen måte i multivalent form kjedet til en bestemt matrise ifølge Eksempel 3 eller 4. Inkuberingen ble utført på mikroskopglass i 10 - 15 minutter og preparatet ble studert i mikro-skop. Hvis bakterien utviste akseptorstruktur var partik-lene dekket med bakterier. Med negativ reaksjon er partik-lene fri for bakterie. c. Bakterier ble blandet med et preparat ifølge Eksempel 3 eller 4 på mikroskopglass, og en positiv reaksjon resulterte i agglamerasjon av partikler dekket med angitte strukturelement.

Eksempel 7

Rensing av bakterier eller akseptorstrukturer

a. Et preparat ifølge Eksempel 4 eller 5 ble anordnet i form av en kolonne. En blanding av bakteriene ble deretter ført gjennom kolonnen, bakterier som utviste akseptorstrukturer ble holdt tilbake i kolonnen ved interaksjon med reseptorstrukturene i kolonnen. Etter skylling kan kolonnen elueres med buffer inneholdende et reseptor-aktivt strukturelement ifølge oppfinnelsen, og dette bevirker den effekt at bakteriene med akseptorstrukturer elueres i ren form.

b. Ved en fremgangsmåte fullsteridig analog til a. kan akseptorstrukturen erholdes i ren form.

Bakterier eller akseptorstrukturer kan anvendes

for fremstilling av vaksiner eller for antistoff analyser i for eksempel kroppsvæsker, som blod, urin eller mors-melk .

Eksempel 8

Preparat for anvendelse for desinfeksjonsformål

Ved desinfeksjon menes her primært fjerning av bakterier fra en overflate, f.eks. et sår.

En 0,1 vekt% vandig løsning av forbindelsen £-p-Galp-(1-4)-g<->GNAc ble fremstilt og påført ved hjelp av en bomullspute på en overflate infisert med N-gonorrhoeae. Løs-ningen bevirket effektiv fjerning av bakteriene fra overflaten.

Eksempel 9

Prosedyren ifølge Eksempel 2 ble gjentatt men i dette tilfelle ble celler oppsamlet fra unge friske kvinner ved skraping av Buccal Mucosae med en trespatel. Den anvendte bakterie var N.meningitidis, internasjonal teststamme 3K, Statens Seruminsti.tutt, København, Danmark.

I forsøkene ble det funnet at 0,5 mg/ml av oligosaccharid nummerert (1) i. Eksempel 2 reduserte antallet av adherende bakterier med 15 %, mens 5 mg/ml (1) bevirket en reduksjon på 90 %.

Bilag 1 Reaksjonsskjeraa I Tsyntese av g- OMe disaccharid (3}

Reaksjonssk jerna 2 ( syntese av g- OJle disaccharid (6)

Methyl- 2- acetamido- 2- deoxy- 3- 0-( g- D- galactopyranosyl)-g- D- galactopyranosid (3_)

Fra en blanding av 646 mg (2,00 mmol) methyl-2-acetamido-2-deoxy-4,6-O-benzyliden-a-D-galactopyranosid,

35 ml benzen og 35 ml nitromethan ble ca. 25 ml av løsnings-midlet destillert fra for azeotropisk å fjerne fuktighet. Etter avkjøling ble 820 mg (2,00 mmol) acetobromgalactose sammen med 505 mg (2,00 mmol) kvikksølvcyanid og 72 mg

(0,20 mmol) kvikksølvbromid tilsatt, og reaksjonsblandingen ble omrørt ved 60° C over natten (15 timer). Deretter ble en ytterligere porsjon av 820 mg (2,00 mmol) acetonbrom-galactose og 505 mg (2,00 mmol) kvikksølvcyanid tilsatt.

(Ref. 2). Analysen (Si02, ethylacetaltmethanol 85:15) 3 timer etter denne tilsetning viste at alt av aminosukker aglyconet var forbrukt og en hoved, hurtigere løpende flekk var til stede. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med 100 ml methylenklorid og den organiske løsning ble vasket med 3 x 25 ml vann. Etter tørking (riatriumsulfat) og fjerning av løsningsmidlet ble det erholdt 2,08 g urent produkt som ble.oppløst i 100 ml 60 %'ig eddiksyre og løs-ningen ble behandlet ved 100° C i 45 minutter. Løsningsmid-let ble fjernet i vakuum og residuet.ble tørket over fosfor-pentoxyd og natriumhydroxyd under vakuum. Det tørkede produkt ble acetylert med 20 ml pyridin og 10 ml eddiksyre-anhydrid i 6 timer ved romtemperatur. Reagensene ble fjernet ved azeotrop destillasjon med toluen (gjentagende ganger) under vakuum. Residuet ble tatt opp i methylenklorid og vasket med 0,5N HCl, mettet natriumbicarbonat og ble tørket. Etter fjerning av løsningsmidlet i vakuum ble det urene per-acylerte disaccharid kromatografert (Si02, ethylacetat:1-butanol, 95:5) og omkrystallisert fra ethanol under dannelse av 505 mg (39 %) av den per-acetylerte titelforbindelse 2, som var ren ved (Si02løsningsmiddel som ovenfor) og NMR (CDC13) standarder - sm.p. 97° C. [a]<23>+ 69° (C 0,54, CHC<I>3).<*>H NMR(C0C13), 6 1/96, 1,99, 2,05, 2,06, 2,07, 2,12, 2,16 (COOCH3, 21H) , 3,41 (S, 3H, OCH3), 3,84 - 4,24 ;(m, 7H, H-5, H-5', H-6', H-3), 4,54 (m, 1H, H-2), 4,61 ;(d, 1H, H,l', Jllf2, 7,9Hz), 4,83 (d, 1H, H-l,23,5 Hz), ;5,16 (dd, 1H, H-2'), 5,39 (bd, 2H, H-4, H-4<1>), 5,64 (d, 1H, N-H).<13>C NMR (CDC13) 6C_1 98,7. (Jc_Hag1744Hz), ;6 100,7 (J_ u<1>51 1Hz). Den peracetylerte titelfor-;(_ —I o—riax;bindelse (179 mg, 0,262 mmol) ble deacetylert med en kata-lytisk mengde av natriummethoxyd i methanol (25 - 50 ml). Etter 4 -timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen nøy-tralisert med methanol og vasket og tørket med Duolite-H+ ionebytterharpiks. Etter filtrering og fordampning av løs-ningsmidlét ble det erholdt 100 mg (96 %) av titelforbindel-sen (3), ren ifølge (Si02, kloroform:methanol:vann 65:35:10) og NMR standarder. ;■HNMR (D20) 6 2,00 (s, 3H, N-COCH3), 3,39 (s, 3H, OCH3),;4,46 (d, 1H, H-l', Jlt 2, 7,5Hz), 4,78 (d, 1H, H-l, ^ 2 3,6Hz). 13CNMR (D20) 6 24 ,8 (CO-CH3) , 51,4 (C-2), 57,9 (OCH3) 63,8, 64,0 (C-6, C-6'), 71,4, 71,6, 73,3, 73,4, ;75,4, 77,8, 80,1 (C-H av ringene), 101,1 (C-l), 107,5 (C-l<1>). Methyl- 2- acetamido- 2- deoxy- 4, 6- O- benzyliden- g- D- galacto-pyranosid (4) ;Til en blanding av 1,2 g (5,1 mmol) rnethyl-2-acetamido-2-deoxy-P-D-galactopyranosid og 1,20 ml (11,8 mmol) benzaldehyd ble 1,20 ml (9,40 mmol) bortrifluorid-etherat tilsatt ved 0° C. Reaksjonsblandingen mørknet og ble omrørt i 60 minutter. Den ble helt over i vandig natriumcarbonat og 30 ml ethylacetat ble tilsatt. Krystaller ble dannet som ble oppsamlet og vasket med en liten mengde ethylacetat. Etter tørkning var utbyttet av.titelforbindel-sen 0,60 g (38 %) av rent materiale (Si02,. ethylacetat: methanol 85:15) 'HNMR (CD3OD) 6 1,98 (s, 3H, NAc), 3,49 ;(s, 3H OCH3), 3,54 (m, 1H, H-5), 3,74 (dd, 1H, H-3, J3 4 = 3,49 Hz, J23= 108 Hz), 4,01 (dd, 1H, H-z), 4,15 (dd, ;HA-6) 4,24 (dd, HA-6), 4,20 (bs, H-4), 4,39 (d, 1H, H-l, J, „ = 8,36 Hz), 5,62 (s, 1H, benzyliden), 7,34 (m, 3H aromatisk), 7,56 (m, 2H, aromatisk). [a]^ + 9,6° (c 1,1, CH3OH), sm.p. 258° C. ;Methyl-2-acetamido-2-deoxy-3-0-( g- D- galactopyranosyl)-3- D- galactopyranosid (f) ;Ved å følge samme prosedyre som for syntesen av 2-methylglycosidisomeren ble 297 mg (37 %) av .titelforbindel- sehneholdt fra 646 mg (2,00 mmol) methyl-2-acetamido-2-deoxy-4,6-O-benzyliden-g-D-galactopyranosid.<r>HNMR;(D20, +2o° ) 6 2,00 (s, 3H,NHAc), 3,51 (s, OCH3), 3,51 (H-2'<a>), 4,00 (dq, IH, H-2, J23=10,6 Hz, J 2=8'2 Hz)';4,17 (bd, IH, H-4 eller H-4'), 4,43 (bd, 2H, H-l og H-l' Jl'2'= 7,1 Hzb) ;Methyl- 2- acetamido- 4, 6- di- Q- acetyl- 2- deoxy- 3- 0-( 2', 3', 4', 6'-tetra- O- acetyl- fi- D- galactopyranosyl)- g- D- galactopyranosid (5_) ble isolert (500 mg, 3 9 %) og anvendt som en forløper for § ;i det foregående forsøk. 'HNMR (CDCI3) 6 1,96, 1,97, 2,05, 2,10, 2,13 (21 H, OAc og NHAc), 3,33 (m, IH, H-2), 3,50 ;(s, 3H, OCH3), 4,62 (d, H-l', J1, 2, = 7,6 Hz), 4,68 (dd, H-3) 4,94 (d, H-l, J±2= 8,2 Hz), 4,97 (dd, H-3<1>, J3, 4,= 3,1 Hz, J2, 3,= 10,2 Hz/, 7,48 (dd, IH, H-2<1>), 5,43 (d, IH, ;H-4), 5,42 (d, IH, H-4), 5,97 (d, IH, N-H, J.. „ _ * 6,8 Hz).

N —n ,Z

a) Funnet ved dobbel'resonans, b) ved +50° ble resonansen av H-l og H-l<1>separert. Ved uttrykket mikrooranisme som anvendt i denne beskrivelse menes bakterier, vira, dyreceller og planteceller. Referanser 1. P.J. Stoffyn og R.W. Jeanloz, J. Am. Chem. Soc. 1954å 76, 561. 2.

Claims (7)

1. Preparat for diagnostisk bruk i forbindelse med pathogene mikroorganismer, karakterisert ved at det som aktiv bestanddel inneholder et strukturelement av formelen:

hvori R-^, R2 , R3 og R^ er like eller forskjellige og er hydrogen eller en organisk rest, for eksempel lavere alkyl, lavere acyl eller en carbohydratrest, eller en uorganisk rest slik som sulfat eller fosfat, forutsatt at når R-^ er forskjellig fra hydrogen er OR^ i alfa-konfigurasjon, og når <R>2<=R>3<=R>4 =H er R-^ forskjellig, fra -(CH2 )n COR, hvori n = 3 - 19 og R er en alkoxy, aryloxy, NHNH2 , OH eller N^ -gruppe, eventuelt i forbindelse med en farmasøytisk akseptabel bærer.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at R2 , R3 og R4 alle er hydrogen.

3. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at R^ er en aminosyre eller en polypeptid-rest.

4. Preparat ifølge krav 1 eller 2, kk a r a k t e - r i s e r t ved at R1 er lavere alkyl, for eksempel methyl.

5. Preparat ifølge krav 1, k.ar akteriser-ved at det inneholder angitte strukturelement kovalent bundet til en makromolekylær bærer, eventuelt via en koblingsarm.

6. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at det som makromolekylær bærer anvendes et syntetisk eller naturlig forekommende polypeptid, polysaccharid eller polymer eller partikkel.

7. Preparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at koblingsarmen mellom strukturelementet og den mairkomolekylære bærer er: strukturelement - 1 - 0

-NHCSNH-makromolekylær bærer, strukturelement -1-0

-N=N - makrimolekylær bærer strukturelement - NH-(CH2 )n -CH2 bærer

NHCSNH-mairkomolekylær strukturelement - NH-(CH2)n <-C> H2

-N=N-maikromolekylær bærer strukturelement-NH-(CH2)n~C0-NH-makromolekylær bærer, strukturelement-NH-makromolekylær bærer eller s trukturelement-NH(CH2 )n -CO-NH-makromolekylær bærer hvori n kan variere mellom 1 og 15.