NO841811L - Nye vektorer for interferonekspersjon - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte ved fremstilling av interferon med transformerte gjærorganismer hvori ekspresjon av interferongener reguleres med konsentrasjonen av uorganisk fosfat i vekstmediet eller med tempe-raturen.

Description

Nye fremskritt innen molekylar biologi har gjort det mulig å. innføre DNA sekvenser som koder for spesifikke proteiner, fra-'høyere organismer i gjærceller. Rekombinant DNA teknologi har faktisk blitt brukt for å uttrykke eukaryotiske proteiner hvis gener har vært klonet i vektorer såsom plasmider, gjærceller, typisk Saccharomyces cerevisiae som er blitt transformert med disse vektorer. Se Hitzeman, R. A., et al.,

(1981) Nature '293, 717-722; Valenzuela, P., et al., (1982)

Nature 298, 347-350; Tuite, 'm. F.,et al., (1982) EMBO Journal 1, '603-608. -

Ekspresjonen av heterologe gener i S. cerevisiae oppnådd av Hitzeman et al. og Valenzuela et al. var konstitutiv. (eller kontinuerlig) fordi genene ble knyttét til promotorområdet fra den uregulerte,alkohol dehydrogenase (ADH) I gen. Tuite et al.

og Hitzeman et al.,. (1983) Science 219, 620^-625 brukte promotoren fra fosfoglycerat kinasegenet for ekspresjon av humane interferongener.

Det- ble allerede tidligere kjent at regulert syntese av et fremmed gen ville være ønskelig fordi overproduksjon av selv normalt ikke-toksiske geneprodukter kan være skadelige for vertsceller og føre til øket stabilitet av spesielle vert-vek-torsystemér. En god ekspresjonskontrollsekvens bør derfor i

tillegg til å forbedre effektiviteten av transkripsjon og translasjon av konede gener være.kontrollerbar, slik at ekspresjon under vertscelleveksten moduleres.'Ønskede ekspresjonskontroll-sekvenser er slike som kan kobles ut for å gjøre vertscellen i stand til å forplante seg uten oppbygning av de ønskede frem-"mede geneprodukter og deretter kobles på for å gi ekspresjon av store mengder av de ønskede proteinprodukter. Tuite et al., kontrollerer ved bruk av PGK genpromotoren graden av interferonekspresjon ved karbonkilden. Skjønt det "induserte" nivå

for interferonekspresjon var høyt, var det "ikke-induserte" nivå. bare moderat høyt, hvilket førte, til en induksjon -på mindre

enn 20 ganger. Miyanohara, A. et al., (1983) Proe. Nati. Acad. Sei..USA 8_0, 1-5, har rapportert regulert ekspresjon av hepa-titt B virus overflateantigen i gjær med gjærsyrefosfatasegen

■ (PH05) promotoren.

Tidligere manglet man imidlertid et strengt regulert kontrollelement for ekspresjon av interferongener i gjærceller,

i hvilke det "ikke-induserte" nivå av fremmed interf eronpro--teinekspresjon var lavt og det "induserte" nivå var høyt. Det • er derfor et formål for foreliggende oppfinnelse å tilveie-bringe et regulerende kontrollelement av denne type' som ville muliggjøre vekst av gjærceller opptil en høy- populasjons-tetthet uten samtidig å risikere en skadelig oppbygning av interferon inntil det faktisk ønskes å få gjærcellene til å indusere og uttrykke interféronproteinet.

Foreliggende oppfinnelse gir en forbedret ekspresjonsvektor som er i stand til å regulere ekspresjonen av heterologe gener i en transformert gjærstamme. Nærmere bestemt innebe-fatter denne forbedrede ekspresjonsvektoren promotor/regulator DNA området fra gjærens repressib.le syrefosfatasegen og regulerer ekspresjonen av genet for human leukocytt interferon.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også gjærceller transformert med den forbedrede ekspresjonsvektor. Disse transfor- : merte gjærceller produserer betydelige mengder' av interferon. bare nar de dyrkes i et medium som mangler uorganisk fosfat

<-.>(<P>i).'

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre transformerte gjærceller som også er mutanter i to syrefosfataseregulerings-gener (som koder .'for en defektiv repressor og en temperatursensitiv positiv regulator) som vokser godt ved høy temperatur (30-35°C), men produserer fremmede proteiner, dvs. interferon, men bare ved lav temperatur (20-30°C), uavhengig av fosfatkonsentrasjonen.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig..1 er et kart av PH05 promotorens 5'-f lankerende område.'RNA 5<1->endeposisjonen og translasjonsbegynnelseskodonet

samt relevante restriksjbnspun-kter for PH05 genet er vist.

Taq I punktet (ved posisjon -11 fra ATG) mellom RNA 5'-enden og ATGet ble overført til et EcoRI punkt for ekspresjons vektoren. Hoved RNA 5'-endene for PH05 transkriberer kart ved posisjpnene -41 og -35.

Figur 2A illustrerer pYE4 ekspresjonsvektoren. Clal til EcoRI fragmentet med PH05 transkripsjonsstartpunktet ble innsatt

i gjæren/E. coli shuttle vector YRp7 (11) som hadde EcoRi punktet i parenteser deletert. I tillegg ble 1,1 Kb Clal fragmentet fra PH05 promotoren (fig. 1) og sekvenser fra gjær 2 mikron plasmidet tilsatt. Genet som skulle uttrykkes under PH05 type reguleringen er innsatt i det gjenværende EcoRI punkt., (r ,) = PBR3 2 2 DNA, = gjær DNA, & ZZZZ22>. = 2 mikron plasmid DNA) Figur 2B illustrerer nukleotidsekvensen som går forut for tran-slasjonsinitieringskodonet ATG i det opprinnelige PH05 genet og i PH05/rIFN-aD sammensmeltningen.

Figur 3 illustrerer skjematisk konstruksjonen av pYE4.

Figur 4 illustrerer skjematisk konstruksjonen av et plasmid brukt for å konstruere pYE4. Figur 5 illustrerer plasmidet pYE4 med de relevante restrik-sjonspunkter angitt. Figur 6 illustrerer plasmidet pYE7 med de relevante restrik-sjonspunkter angitt. Figur 7 illustrerer grafisk-den .regulerte ekspresjon, av r.IFN-a-D i gjær. Transformanter med pYE4-D ble dyrket i høy-P^ medium (tette symboler) eller ikke-Pi medium (åpne symboler).. Celle-veksten (•,0) , APase (syrefosfatase) aktivitet ( ■ ,0 ) og interf eronaktivitet i ekstrakter (A, A) ble styrt. T = 0 er den tid da startkulturen ble oppdelt i høy-P^ og ikke-P^ medium. Figur 8 illustrerer interferon RNA nivåer. RNA prøvene ble fremstilt fra cellene beskrevet i figur 3 (+ - høy-P^, - = ikke-P^) på de angitte tider og analysert ved gelblotteanalyse: .(17)

Figur 9 illustrerer grafisk temperaturreguleringen av inter-ts

feronsyntesen. pho80 pho4 stammen 29B5 transformert med pYE4-D."ble dyrket ved 35°C til en O'DgQ0nmpå 1, ved hvilken tid (t = 0) halvparten av kulturen ble forandret til 23°C

(åpne symboler) og den andre halvparten ble holdt ved 35°C (lukkede symboler) . Cellevekst (t,0) , A Phase aktivitet (».,□)

og interferonaktivitet (A,A) ble styrt.

Vektorsystemet ifølge foreliggende oppfinnelse som nøyaktig regulerer ekspresjon av fremmede gener i gjær anvender 5'-flank-er ingsområdet fra gjærens repressible syrefosfatse (APase) gen, forøvrig kjent som PH05 genet. Transkripsjon av PH05 genet i gjærcellen represséres når uorganisk fosfat (P^) er tilstede i vekstmediet, men induseres på et høyt nivå når P^ mangler.

Et enkelt restriksjonsenzympunkt ble innført nedstrøms for transkripsjonsstartpunktet men oppstrøms fra ATG initiator-kodonet på et DNA fragment med det antatte promotor/regulator DNA området fra PH05 genet.. Et strukturelt gen innsatt i dette punkt vil ha translasjon startet ved sitt eget initiatorkodon, hvilket fører til et autentisk eller fullstendig i stedet for et fusjonsprotein. Det strukturelle gen som brukes i denne oppfinnelsen er fortrinnsvis et eukaryotisk gen som koder for et protein som er fremmed for gjærvertscellen. De spesielle eukaryotiske gener som brukes i foreliggende oppfinnelse er slike som koder for fullstendig human leukocyttinterferoner, spesielt A og D arter, (IFN-aA og IFN-aD).' Genesekvensene som koder for disse proteiner og deres tilsvarende aminosyresekvenser er kjente og er beskrevet i forskjellige trykte publikasjoner. Se Pestka, "The Human Interferons - From Protein Purification ånd Sequence to Cloning and Expression in Bacteria: Before, Between and Beyond", • Archives of Biochemistry and Biophysics, 221, No. 1, 1-37 (1983). Selv om human eukaryotiske gener ble brukt i foreliggende oppfinnelse, hevdes det at gen fra en hvilket som helst eukaryotisk art (f.eks. bovin, murin og porcin) kunne brukes.med PH05 genpromotor/regulatorsystemet.

Som imidlertid beskrevet i eksempler og beskrivelse som følger ble PH05 genpromotor ekspresjonssystemet i foreliggende oppfinnelse prøvet ved innsetning av klonede gener for human leukocyttinterferon rIFN-aD og rIFN-aA i en ekspresjonsvektor. En annen virkningsfull og foretrukket induksjonsmetode, spesielt for vekst i stor skala, anvender en stamme av Saccharomyces cerevisiae APase regulatormutanter (8) for å utvikle en gjærstamme som induserer APase og derfor gener i PH05 promotor ekspresjonsvektoren (hvilken vektor inneholder regulator-og strukturgener) bare som reakssjon på temperatur. Ved den . ikke-tillatelige temperatur (ca. 30-35°C) vokser cellene godt., men produserer ikke APase, selv i lav-P^. medium, mens ved den tillatelige temperatur (ca. 20-30°C, fortrinnsvis 23°C) synte-, tiseres APase med eller uten P^i mediet. Denne stamme- som inneholder PH05 promotor ekspresjonsvektoren er også blitt brukt for å demonstrere, temperaturregulert ekspresjon av fremmede gener, spesifikt rIFN-aD genet i gjær.. Produksjonen av leukocyttinterferon induseres ved de lavere temperaturer, fortrinnsvis 23°C..

Materialene som brukes i de forskjellige utførelsesformer i foreliggende oppfinnelse er beskrevet nedenunder. Henvis-ningstallene i parenteser gjennom hele beskrivelsen tilsvarer henvisningene som er oppført i den vedlagte bibliografi.

Gjærstammer og medier: W301-18A (ctade2-l leu2-3, 112 trp-1 canl-100 ura3-l his3-11,15)- erholdtes ..fra R. Rothstein, A138 (a PH05-2 pho80-2)

ts

erholdtes fra P. Hansche (9) og R6-3A (cxpho4 . ) var fra A. Toh-e (Tohe et al., (1981) J. Bact, 145, 221-232). Stammer

fra dette arbeidet er Pl-22 (a pho8 0 trpl ade2 his3 leu2),

29B5 (a pho80 pho4<ts>trpl ade2 his3 leu2) og 29A21 (a pho80 trpl ade2 leu2). En fagmann ville under utførelsen av denne oppfinnelse kunne anvende ekvivalente gjærstammer. I tilfelle W301-18A kan en annen gjærstamme brukes som har trpl markøren, Enhver pho4 ts eller pho80 mutant gjærstamme kan også brukes ved utførelse av oppfinnelsen.

Høy P± medium var YNB+CAA ("YNB" - gjærnitrogenbase; "CAÅ" - casaminosyrer) (1) med tilsatt adenin og uracil når nødvendig. Ikke-P^medium var UMD (6) pluss uracil når nødvendig uten tilsatt uorganisk fosfat. Begge medier manglet tryptofan .for.

.seleksjon av transformanter.

DNA og plasmider: PH05 genet erholdtes fra et 8 kilobase (kb) EcoRI restriksjonsfragment vist å inneholde dette.gen (7,10) . Gjær/ E. coli skiftevektoren, YRpl2, var fra. R. Davis (Scherer og Davis. [1979] Proe. Nat. Acad.. Sei. 7_6, 4951-4955). 0,56 kb EcoRI' fragmentet med rIFN-aD erholdtes fra Genentech, Inc., på pias-, midet pFRS36 (1). Gjærgenet for glyceraldehyd 3-fosfatdehyd-rogenase. erholdtes ved undersøkelse av ' en gjær DNA sammen-

lignet med det klonede kyllinggéh.

Konstruksjonen av rekombinantplasmider:

Restriksjonsendonukleaser var fra New England Biolabs og

Boehringer-Mannheim Biochemical, og T^. DNA, ligase var fra

.New England Biolabs. Enzymene ble brukt som anbefalt av leverandørene. Syntetisk BamHI og EcoRI bihdere var fra

■.Collaborative Research. •

I allminnelighet ble for å konstruere PH05 promotorekspresjons-vektor et enkelt restriksjonsenzympunkt innført i DNA området mellom stillingen til 5'-enden av PH05 transkriptet (18) og initiatoren ATG ved overføring av Taql punktet, vist i fig.-

1 til et EcoRI punkt med en syntetisk oligonukleotidbinder.

Det resulterende Clal til EcoRI fragment med transkripsj.ons-.startpunktet ble innsatt i vektoren pBR322 (6) sammen med gjær TRPl genet på en 1,4 kb EcoRI restriksjonsfragment som-

ble dannet i et plasmid lignende YRp7 (11) med PH05 pro-

motoren. Fordi DNA sekvenser oppstrøms for Clal punktet kreves

for fullekspresjon og regulering av PH05 genet, ble det ytter-ligere Clal fragment (figur 1) innsatt, og et segment av DNA

fira det naturlig forekommende gjær 2 mikron plasmid (20). ble tilsatt for å øke.kopiantall-og stabilitet hos vektoren. Til slutt ble et EcoRI punkt-, (angi Lt • på fig . 1) fjernet.... ■'.

Det resulterende plasmid, pYF.4, er skjematisk vist i- figur

2A. Et' klonet gen med e-t ATG . begynnelseskodon-ble ..innsatt' i. det-'eneste EcoRI punkt i pYE4 . Fosfat-reg.ulert transkrip- .sjon påbegynt i PH05 promotoren, forløp gjennom det innsatte gen og sluttet enten i det 3' ikke-translaterte området av det innsatte DNA eller på sluttpunktet for TRPl genet.

Et annet plasmid, pYE7, ble konstruert på en lignende måte (figur 6). I dette tilfellet ble 2 mikron DNAet innsatt mellom PH05 promotoren og TRPl fragmentet,, og EcoRI punktet fjernt fra promotoren ble igjen deletert. I tillegg ble pBR322 sekvensene frå BamHI punktet til PvUII punktet (1690 basepar) fjernet.

Mere spesifikt ble PH05 promotorekspresjonsvektorenkonstru-ert som beskrevet nedenunder. BamHI til Sali fragmentet med PH05 promotoren'(7,8) ble fremstilt fra et 8 kb EcoRI fragment'isolert tidligere (7) (figur 3).

BamHI til Sali fragment ble delvis brutt med Taql og et .. 540 bp BamHI./Taql fragment ble isolert (trinn 1, figur 3) .

Den Taql "klebrige ende" ble fyllt opp med E. coli DNA polymerase stort fragment (Klenow fragment) og dCTP og dGTP (trinn 2,. figur 3).. Dette fragment ble så ligert med BamHI binder . (CCGGAATTCCGG) og kappet med BamHI og. Clal (trinn 3, figur 3). 270 bp Clal/BamHi fragmentet ble så ligert i et BamHI/Clal kappet plasmid YRpl2 (Scherer og Davis [1979]

Proe. Nat. Acad. Sei. 7_6, 4951-4955) (trinn 4, figur 3).'"

Deretter ble DNA fra pYEl kappet med BamHI, behandlet med SI nuklease for å fjerne BamHI "klebrige ender" og en EcoRI binder (GGAATTCC) ble ligert på. DNAet ble så kappet med Clal og EcoRI og det resulterende 270 bp fragment med PH05 promotoren ble ligert i pBR3 22 (19) kappet med Clal og EcoRI.

Det resulterende plasmid (figur 4) ble så kappet med EcoRI

og 1,4 kb EcoRI fra YRpl2 (med gjær TRPl genet og en ARS (replikasjonsopprinnelse) ble ligert i (trinn 1, figur 4) .

Det resulterende plasmid ble så delvis brutt med.EcoRI og plasmider hvori bare et EcoRI punkt var blitt kappet, ble .isolert. De. EsoRI festende ender, ble fylt i med DNA polymerase Klenow fragment og dATP og dTTP. Etter ligering av DNAet, ble plasmider som manglet EcoRI punktet vist i () Selektert (trinn 2, figur 4)..

Deretter ble plasmid DNAet kappet med PVUII og Nrul og

et 187 5 bp Nrul til HincII fragment på gjær 2 mikron plasmidet .(20) fra YEp24 (Botstein et al. (1979) Gene 8, 17-24) ble innsatt. Det resulterende plasmid ble kappet med Clalbg 1,1 kb Clal fragmentet fra oppstrømsområdet fra PH05 promotoren (13,18) ble innsatt for å rekonstruere hele PH05 promotor/ reguleringsområdet. Det resulterende plasmid var pYE4 (figur -Jo.

Vektoren pYE7 ble konstruert på en lignende måte som pYE4 bortsett fra at 2 mikron DNA var et 2,2 kb EcoRI. fragment innsatt i EcoRI punktet. ' Det promotorfjerne EcoRI punkt ble fjernet som for pYE4• Plasmidet ble så kappet med BamHI og. de festende ender fylt i med DNA polymerase. Klenow fragment. Etter kapping med PvuII, ble det gjenværende plasmid ligert under dannelse av pYE7 vist i figur. 6. Bemerk at ligeringen av et innfylt BamHI punkt og et PvuII.punkt gjenskapte BamHI erkjennelsespunktet.

For å prøve disse vektorer ble 560 bp EcoRI fragmentet med rIFN-aD (1) først innsatt i riktig orientering ved det eneste EcoRI punkt av pYE4, og et plasmid med rIFN-aD genet i d.en riktige orientering for ekspresjon fra PH05 promotoren kalt pYE4-D erholdtes. Figur 2B sammenligner nukleotidsekvensené

for 5'-ikke-kodende områder av det opprinnelige PH05 gen og av PH05/rIFN-aD fusjonen i pYE4-D. Den ekstra CCGG sekvens i pYE4-D mellom det tidligere Taql punkt (TCGA) og EcoRI punkt (GAATTC) er fra de syntetiske bindere.

Gjærceller ble så transformert med pYE4-D ved for fagmannen kjente metoder for transformering av gjærceller med plasmider.

Generelt omfatter derfor den foretrukne metode for produksjon av interferon:

a) transformering av en gjærorganisme med en ekspresjons-

vektor inneholdende det strukturelle gen for et human interferon/ fortrinnsvis et leukocyttinterferon, operabelt bundet til en PH05 promotor/regulator;

b) kloning av den transformerte organisme i et kulturmedium inneholdende uorganisk fosfat og essensielle næringsmidler

for vekt av. organismen;

c) reduksjon av nivåene av uorganisk fosfat tilstede i kultur-mediet inntil den transformerte organisme induseres til å

produsere' interferon;

d) lysing av den transformerte- organisme, og

e) isolering av interferon fra det resulterende lysat.

Som det skal beskrives nærmere i eksemplene ble gjærtransfor-mantene dyrket ved 30°C i høy-P. medium til en densitet på

ca..3 x 10 celler/ml (OD60Q^ =0,5) ved hvilket tidspunkt halvparten av kulturen ble fjernet og disse celler ble isolert ved sentrifugering, vasket med sterilt H^O og resuspendert i ikke-P^medium. Vekst ble fortsatt ved ca. 3 0 C og.

prøver ble fjernet med ca. 3 timers mellomrom for måling av celledensitet (OD^qq ^) og APase aktivitet (13) uttrykt

som A,^ n enheter fra en 30.minutters måling pr. 1 OD,nn

420 nm ■ 3 ^ 600 nm enhet av celler. Celleekstrakter for RNA (14) og interferon ble også fremstilt.

En alternativ foretrukket metode for fremstilling av interferon omfatter: a) transformering av en temperatursensitiv gjærorganisme med en ekspresjonsvektor inneholdende det strukturelle gen for et human interferon, fortrinnsvis et leukocyttinterferon, operabelt bundet til en PH05 promotor/regulator; b) kloning av den transformerte organisme i et:kulturmedium ved en temperatur på ca. 30 til 35°C; 4 .c) reduksjon av organismens temperatur til ca. 20—30°C, hvorved interferonproduksjonen induseres;

d) lysing av den transformerte organisme, og

e) isolering av interferon fra det resulterende lysat..

Det foretrekkes at den temperatursensitive gjærorganisme

er en sur fosfataseregulerende mutantstamme av Saccharomyces cerevisiae.

Som det skal beskrives nærmere i eksemplene, ble temperatur-vekseltransformanter i foreliggende oppfinnelse dyrket i høy-Pi . medium ved ca. 35°C til en 0Dc6n00 „ nm -p£å ca. 1. Kulturen ble så oppdelt i to deler. En alikvot fortsatte ved 35°C, mens den andre ble dyrket ved 23°C. Prøver ble tatt ut på forskjellige tidspunkter og klargjort for analyse.

For hvert tidspunkt ble. ca. 10 8 celler isolert .ved sentrifugering og resuspendert i 1 ml 7M guanidin-HCl, 1 mM ditiotrei-tol og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid. Et likt volum syre-vaskede glasskuler ble tilsatt, og prøvene ble utsatt for fire 30 sekunders virvlinger. Etter 30 minutter på is ble 'celleavfa.il og glasskuler fjernet ved sentrifugering, og prøvene ble lagret ved -20°C. For interferonmåling ble prøvene enten fortynnet 1:100 i 0,15M NaCl, 20 mM NaP04, pH'7,9 (PBS) eller dialysert i PBS. Interferonaktivitet ble påvist ved reduksjon av cytopatisk effektmåling (15). Aktiviteter uttrykkes i enheter pr. liter av kulturer av en OD,~-pa 1.

L600 nm *

Total RNA fra hvert tidspunkt ble underkastet elektroforese

i 1,4% agarosegeler etter denaturer ing med glyoksal (16); og overført til nitrocellulose (17). Hybridiseringer ble utført 3 2 som beskrevet i (13) med P-merkede prøver.

Eksempel 1

Regulering av interferonsyntese med fosfatkonsentrasjon

Trp<+>transformanter av W301-18A bærende pYE4-Dble dyrket.

i høy-P. medium ved. 3 0°C til en 0<D,nM>på ca. 0,5 ved

J i ■ 600 nm.

hvilket tidspunkt halvparten av kulturen ble overført til ikke-P^ medium. Ved ca. 3 timers intervaller ble alikvoter av hver kultur fjernet og målt med hensyn til APase aktivitet, og ekstrakter ble klargjort"'for interferonmåling. Figur 7

viser at nivået for interferonaktivitet begynte og øke raskt mellom 3 og 6 timer etter overføring til ikke-P^ medium og nådde toppen ved ca.. 9 timer. Denne induksjon tilsvarte den APase induksjon som ble observert for kulturen og utgjorde

en 100- til 200-gangers økning over interferonaktiviteten påvist i celler dyrket i høye-P^ medium..

■RNA prøver ble fremstilt fra begge kulturer på samme tidspunkter som interferonekstraktene ble foretatt. Etter denatur-eringen med glyoksal (16) ble RNA fraksjonert på en agarose-gel og så overført til nitrocellulose (17). Figur 8 viser res-ultatene av hybridisering av RNA flekken med markert.rIFN-aD prøve. Opptreden av rIFN-aD spesifikk transkripsjon tilsvarer opptreden av interferonaktivitet observert i ekstraktene.'Således er reguleringen av interferonsyntesen man her ser på det transkripsjonsnivå som reguleringen av APase (6,7) . Dertil er størrelsen av det rIFN-aD spesifikke RNA ca. 1,5 kb, den forventede størrelse for en transkripsjon som starter i PH05 promotoren, går gjennom rIFN-aD genet og slutter ved enden av TRPl genet.

Nivåer opptil 2 til 3 x 10 7 enheter interferonaktivitet pr. liter kultur erholdtes ved en OD^nA på. 1.

600 nmL

Eksempel 2

Regulering av interferonsyntese ved temperatur

For å konstruere en gjærstamme i stand til temperaturregulert APase. induksjon, var det først ønskelig å bli kvitt behovet

for induksjon ved lav-P^. Gjærmutanter i PHO80 (tidligere

nevnt som PHOR) genet, en repressor for APase syntese, produsere APase konstitutivt (9,21). Derfor ble en pho80' stamm.é (A138) krysset med trpl stammen (W301-18A) . brukt i eksempel 1. En pho80 trpl stamme (Pl-22) erholdtes og ble vist å produsere APase i høy-P^ medium. Pl-22 ble så krysset med en stamme med en temperatursensitiv mutasjon i PH04 (tidligere PHOD) genet (R6-3A). PH04 koder for en positiv regulator av APase syntese (21) og, derfor, er pho4 stammer ikke i stand til å produsere APase selv i lav-P^.. En temperatur sensitiv pho4 stamme kan induseres for APase bare ved den tillatende temperatur.

ts

.En pho4 vert (29B5) ble transformert med pYE4-D, og transformanter ble prøvet på temperaturregulert interferonsyntese. Celler ble dyrket ved 35°C til en 0D,„o på ca. 1 og J 600 nm r r kulturen ble spaltet i to deler. En' fortsatte å vokse ved 3.5 C mens den andre ble skiftet til den tillatende temperatur (2'3°C) . Ved ca. 2 timers mellomrom ble alikvoter tatt ut og forberedt for'interferonmåling. Figur 9 viser' at interferonaktiviteten var minst 50 ganger høyere i cellene dyrket ved 23°C.

Signifikant interferonaktivitet observeres bare ved den tillatende.temperatur og det induserte nivå når et maksimum ca. 2 ganger høyere enn sluttpunktet i figur 4, dvs. 3 x 10^ enheter pr. liter 0D,n„

c600 nm

Eksempel 3

Syntese av interferon i gjær med pYE7

Et 560 bp EcoRI fragment med rIFN-aD genet ble innsatt i EcoRI punktet til pYE7 i riktig orientering for å" danne pYE7-D. Alternativt ble rIFN-aA, genet (Goeddel et al.,

(1980) Nature 287, 411-415) på et.865 bp EcoRI/Pstl fragment

innsatt i EcoRI punktet i pYE7 etter overføring av. Pstl punktet til et. EcoRI punkt med en syntetisk oligonukleotidbinder. Det resulterende plasmid med rIFN-aA genet i riktig orientering i forhold til promotoren ble kalt pYE7-A.

Plasmidene pYE7-A og pYE7-D ble transformert i gjærstamme

W301-18A, og Trp<+>transformanter av hver ble Indusert som

i eksempel 1. Prøver ble målt med hensyn til IFN aktivitet vedr ca. 8 timer etter ove7 rføring til ikke-P1. medium. Nivåer på 5 til 7,5 x 10 enheter aktivitet pr. liter pr. ODr6A00 n nm enheter erholdtes for ^ pYE7-D og J 1,0 til 1,5 •x 10g enheter/liter/OD600 nm for pYE7-A. Det noe høyere nivå av rIFN-aA skyldes sannsynligvis den litt høyere spesifikke aktiviteten til rIFN-aA i målesystemet.

BIBLIOGRAFI

1. Hitzeman. R. A. , Hagie,, F. E. , Levine, H. L. , Goeddel. D. V., Ammerer, G., and Hall. B. D. (1981) Nature 293. 717-722. 2. Valenzuela. P.. Medina, A.. Rutter. W.J., Ammerer. G. and Hall. B. D. (1982) Nature 298, 347-350. 3. Tuite. M. F., Dobson, M. J.. Roberts. N. A., King. R. M. , Burke, D. C... Kingsman. S. M. and Kingsman,

A. J. (1982) EMBO Journal 1. 603-608.

4. Sc hu r r , A. arid Yagil, E. (1971) J..Gen. Microbiol. 65.. 291-303. 5. Toh-e, A.. Kakimoto. S. and Oshima. Y. (1975) Molec. • Gen. Genet. 14 3 . 65-70. 6. Bostian, K. A.. Lemire, J. M., Cannon, L. E. and Halvorson, H. 0. (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77. 4504-4508. 7. Kramer, R. A. and Andersen. N. (1980) Proe. Nati. Acad.

Sei: USA 72. 6541-6545.

8. Toh-e..A., Ueda. Y., Kakimoto. S. and Oshima, Y. (1973)

J. Bacteriol. 113. 727-738.

9. Lange, P. and Hansche. P.E. (1980) Molec. Gen. Genet. 180, 605-607. 10. Rogers. D. T.. Lemire. J. M. and Bostian. K. A. (1982)

Proe. Nati. Acad. Sei. USA 7_9. 2157-2161.

11. Stinchcomb. D. T.. Struhl. K. and Davis. R. W. (1979)

Nature 282.. 39-43 . v

12. Hinnen. A., Hicks, J. B. and Fink. G. R. (1978) Proe.

Nati. Acad. Sei. USA 75, 1929-1933.

13. Andersen. N., Thill, G. P. and Kramer, R. A. (1983)

Molec. Cellular Biol. 3_. 562-569.

14. Bostian, K.A.. Hopper. J. E., Rogers. D. T. and Tipper. D. J. ( 1980) Cell 19_. 403-414.

15. Familletti, P. C. Rubinstein. S. and Pestka. S. (1981)

Methods in Enz. 78, 387-395.

16. McMaster. G. K. and Carmichael. G. G. (1977) Proe.

Nati. Acad. Sei. USA 74, 4835-4838.

17. Thomas. P. S. (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77. 5201-5205. 18. Thill. G. P., Kramer. R. A.. Turner. K. J. and Bostian.

K. A. (1983) Molec. Cellular Biol. 3_. 570-579.

19. Bolivar. F.. Rodriguez. R. L., Greene. P. L., Betlach, M. D.. Heyneker, H. L., Boyer. H. W.. Crosa, J. H. and

Falkow, S. ( 1977 ) Gene 2, 9.5-113.

20. Broach. J: R. ( 1980). in. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. ed. Strathern, J. N.. Jones. E. W. and Broach. J. R. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. NY) pp. 445-470. 21. Ueda, Y., Toh-e. A. and Oshima, Y. (1975) J. Bacteriol. 122. 911-922. 22. Holland, M. J. and Holland. J. P. (1978) Biochemistry 17, 4900-4907. 23..Ammerer, G., Hitzeman, R., Hagie, F., Barta, A. and Hall, B. D. (1981) in Recombinant DNA, Proceedings of the Third Cleveland Symposium on Macromolecules, ed.

Walton, A. G. (Elsevier, Amsterdam) pp. 185-197.

■24. Miyanohara, A., Toh-e. A.. Nozaki. C, Hamada, F., Ohtomo, N. and Matsub.ara. K. ( 1983 ) Proe. Nati. Acad. Sei . USA 8_g. 1-5 . 25. Hitzeman. R. A.. Leung, D. W., Perry, L. J.. Kohr, W.J.. Levine. H. L. and Goeddel, D. V. ( 1983 ) Science 219. 620-625.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av interferon, karakterisert ved at man a) transformerer en gjærorganisme med en ekspresjons-, vektor inneholdende det strukturelle gen for et humaninterferon operabelt knyttet-til-.en PH05 promotor/regulator; b) klone den transformerte organisme i en kultur inneholdende uorganisk fosfat og vesentlige vekstbestanddeler for organismen; c) reduserer nivåene av uorganisk fosfat tilstede i kultur-mediet inntil den transformerte organisme induseres til å .danne interferon; d) lyser den transformerte organisme, og e) utvinner interferon fra det resulterende lysat.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved. at man som gjærorganisme anvender Saccharomyces cerevisiae.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som interferon fremstiller et human leukocyttinterferon.

4. Fremgangsmåte ved fremstilling av interferon, karakterisert ved at man a) transformerer en temperatursensitiv gjærorganisme med en ekspresjonsvektor inneholdende det strukturelle gen for et humaninterferon operabelt knyttet til en PH05 promotor/ operator; b) kloner den transformerte organisme i en kultur ved en temperatur på ca. 30-35°C;. ' c) reduserer organismens temperatur til ca. 20-30°C, hvorved interferonproduksjonen induseres; d) lyser vertsorganismen, og e) utvinner interferon fra det resulterende lysat.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at man som temperatursensitiv vertsorganisme anvender, en sur fosfatasegenregulerende mutantstamme av Saccharomyces cerevisiae.. .

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, k a rm k t e r i s e r t ved at man som interferon fremstiller humanleukocytt-interferon.

7. Fremgangsmåte ved fremstilling av interferon, karakterisert ved 'at det er som forut beskrevet, spesielt under henvisning til eksemplene.