NO842662L - Fosforyleringsreagens, fremgangsmaate ved fremstilling og anvendelse derav - Google Patents

Fosforyleringsreagens, fremgangsmaate ved fremstilling og anvendelse derav

Info

Publication number
NO842662L
NO842662L NO842662A NO842662A NO842662L NO 842662 L NO842662 L NO 842662L NO 842662 A NO842662 A NO 842662A NO 842662 A NO842662 A NO 842662A NO 842662 L NO842662 L NO 842662L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
group
mse
formula
hydroxyl group
solution
Prior art date
Application number
NO842662A
Other languages
English (en)
Inventor
Godefridus Ignatius Tesser
Christianus Adrianus A Claesen
Original Assignee
Stichting Katholieke Univ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Stichting Katholieke Univ filed Critical Stichting Katholieke Univ
Publication of NO842662L publication Critical patent/NO842662L/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof
    • C07H11/04—Phosphates; Phosphites; Polyphosphates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/091—Esters of phosphoric acids with hydroxyalkyl compounds with further substituents on alkyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/094—Esters of phosphoric acids with arylalkanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/12—Esters of phosphoric acids with hydroxyaryl compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/14—Esters of phosphoric acids containing P(=O)-halide groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/141—Esters of phosphorous acids
    • C07F9/146—Esters of phosphorous acids containing P-halide groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6527—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6533—Six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6564—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6571—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6574—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/65744—Esters of oxyacids of phosphorus condensed with carbocyclic or heterocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fosforyleringsreagens som inneholder minst en beskyttet hydroksylgruppe og minst en avspaltbar gruppe. Foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte ved fremstilling av en slik fosforyleringsreagens og en fremgangsmåte for fosforylering av en organisk hydroksyl- eller aminoforbindelse.
En viktig anvendelse av fosforyleringsreagenser er syntese av DNA- og RNA-fragmenter som kan anvendes i biologisk forskning. En oversikt over fremgangsmåtene for fremstilling av slike fragmenter er gitt i Tetrahedron 34, 3143-3179 (1978). Slike fragmenter kalles oligonukleotider. De er polyfosforsyreestere, i hvilke 3<1->hydroksylgruppen til en nukleosidrest er forbundet med 5'-hydroksylgruppen til en annen nukleosidrest via en fosforsyrediesterforbindelse. Det vanlige når to nukleosidrester er bundet sammen er at 3'hydroksylgruppen til en rest er fosforylert under dannelse av en fosforsyreester som kan danne en esterforbind-else med 5'-hydroksylgruppen til den andre rest.
Denne synteseteknikken, som er innført av Eckstein og Riszk i Angew.Chemie 79, 684-685 (1976), er kjent som fosfotri-esterprinsippet. Fosforyleringsstrategien som her brukes er vist i reaksjonsskjerna A på det vedlagte formelark. Her betyr Pr og Pr' hydroksylbeskyttende grupper, L betyr en avspaltbar gruppe, og R-OH betyr et énverdig nukleosidderivat, nukleotidderivat eller polynukleotidderivat.
Ettersom synteseteknikken ikke er særlig effektiv ved fremstilling av langkjedede polynukleotider p.g.a. den relativt langsomme reaksjonen til aktiverte fosfater med hydroksylgrupper, har Letsinger, Finnan og Lunsford i J.A.C.S. 97, 3278-3279 (1975) foreslått den syntesestrategi som er vist
i reaksjonsskjerna B på formelskjemaet. Her betyr Pr en hydroksylbeskyttende gruppe, L og L' betyr avspaltbare grupper, og R 1 -0H og R 2-0H betyr nukleosidderivater, nukleotidderivater eller polynukleotidderivater som skal
. knyttes sammen. I dette tilfellet er fosforyleringsrea- . gensen en aktivert fosfittriester. Produktet etter kob-lingen av hydroksylf orbindelsene er en f osf i ttriester som i meget høyt utbytte kan oksyderes med en jod-vannblanding under dannelse av en fosfattriester. Denne syntesemetode er kjent som fosfittriestermetoden. I nukleosidrestene bør alle andre reaktive grupper generelt beskyttes, dvs. i én nukleosidrest alle reaktive grupper bortsett fra 3<1->hydroksylgruppen, og i nukleosidresten alle reaktive grupper bortsett fra 5'-hydroksylgruppen. Fosfor-yleringsmiddelet som brukes bør fortrinnsvis være en slik fosforsyreester eller fosforsyrlingderivat at etter avslut-tet diesterbinding mellom to nukleosider er den tredje hydroksylgruppen til fosforsyren eller fosforsyrlingen beskyttet. Den hovedsakelige innvending ved en ikke-beskyttet fosforbundet hydroksylgruppe er faktisk at under en • neste fosforylering kan den reagere med fosforyleringsmid-delet (se ovennevnte artikkel i "Tetrahedron"). Det må imidlertid være mulig å fjerne beskyttelsesgruppen ved • slutten av syntesen uten å skade internukleotidbindingene og uten at purin- eller pyrimidinbaser spaltes av.
De hydroksylbeskyttende grupper som brukes for fosforyleringsreagensen er generelt grupper som kan fjernes i et basisk medium, såsom fenylgruppen, o-klorfenylgruppen, 2,4-diklorfenylgruppen, 2,2,2-trikloretylgruppen og -cyano-etylgruppen i tilfelle av fosfattriesterfosforyleringsrea-genser, og o-klorfenylgruppen, 2,2,2-trikloretylgruppen og metylgruppen i tilfelle av fosfittriesterfosforyleringsrea-genser. Generelt sagt er fjerningen av disse grupper i basisk medium som her kalles avbeskyttelse, en brysom eller tidkrevende sak. I tilfelle fenyl er beskyttelsesgruppen krever avbeskyttelse således en 8-timers behandling ved 20°C med en 4:1 blanding av 0,125 N NaOH/dioksan; i tilfelle o-klorfenyl en behandling med 0,1-0,125 N NaOH over noen timer; i tilfelle 2,4-diklorfenyl en behandling med 5 ekvivalenter oksimat i Et^N/dioksan H^ O i 1-10 timer;
og i tilfelle 2 , 2 , 2-trikloretyl en behandling med sinkstøv i kokende pyridin i en halv time.
Man har nå funnet at metylsulfonyletylgruppen CH^-SO^-CH^-CH^- (her kalt Mse) er en meget velegnet hydroksyl-besky ttelsesgruppe for fosforyleringsreagenser, hvilken er meget stabil under sure betingelser, og kan fjernes tem-melig raskt under basiske betingelser og med letthet, og om ønsket selektivt.
Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig en fosforyleringsreagens av den beskrevne art som erkarakterisert vedat den inneholder minst én hydroksylgruppe som er beskyttet av metylsulfonyletyl.
Nærmere bestemt tilveiebringer oppfinnelsen en fosforyleringsreagens som tilfredsstiller alle formlene 1-4, i hvilken Mse betyr metylsulf onyletylgruppen CH^-SC^-CF^-
C^- og L og L' betyr avspaltbare grupper.
Prinsippielt er alle konvensjonelle avspaltbare grupper egnet som avspaltbare grupper L eller L', men foretrukne •grupper er klor, 1,2,4-triazolyl, tetrazolyl, ftalimidooksy, succinimido- og benzotriazolooksy.
Sterkest foretrukket er en fosforyleringsreagens som faller under formel 5 (fosfattriester-fosforyleringsmiddel) og et fosforyleringsmiddel som faller under formel 6 (fosfittriester-fosforyleringsreagens).
Selv om oppfinnelsen i de følgende eksempler vil bli illu-strert under henvisning til disse to spesifikke fosforyleringsreagenser, vil det være åpenbart at oppfinnelsen ikke er begrenset til disse to foretrukne utførelsesformer, og at under visse omstendigheter foretrekkes bruken av f.eks. andre avspaltbare grupper enn klor. Spesielt når en fosfittriester anvendes, kan det være ønskelig å erstatte kloret, som er meget reaktivt, men samtidig lite selektivt, med en avspaltbar gruppe, såsom en trilazolyl eller en tetrazolyl-gruppe, hvorved en selektivitet (0-fosforylering av nukleo-sidsukkeret i stedet for N-fosforylering av nukleosidbasen) av fosforyleringsreagensen forbedres.
Mse-gruppen er ikke tidligere foreslått som beskyttelsesgruppe. Fra peptidkjemien er imidlertid metylsulfonyletyl-oksykarbonylgruppen CH3-S02-CH2-CH2-OCO(Mse-gruppe)
kjent som en aminobeskyttelsesgruppe (Tesser og Balvert-Geers i Int.J.Peptide Protein Res. 7, 295-305 (1975). Forbindelser som inneholder denne Msc-gruppe syntetiseres ut fra 2-metylsulfonyletylalkohol, som i seg selv kan fremstilles ved katalytisk oksydasjon av 2-metylmerkaptoetanol med hydrogenperoksyd og natriumwolframat. Msc-funksjonen er en ekstremt syrestabil beskyttelsesgruppe som raskt kan fjernes under basiske betingelser.
Fosforyleringsreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles på en måte som er kjent for analoge forbindelser. En fagmann vil generelt kunne avgjøre hvilke syn-tesemetoder som er hensiktsmessige, og hvilke av disse som ■ er spesielt egnet for syntesen av en bestemt fosforyleringsreagens ifølge foreliggende oppfinnelse. ■ En spesiell fremgangsmåte for fremstilling av en fosf.oryl-eringsreagens med formel 5 er ett hvori 2-metylsulfonyletylalkohol i et inert løsningsmiddel, fortrinnsvis tørr tetrahydrofuran, i rekkefølge omsettes med PCI3og Cl^-Fortrinnsvis utføres behandlingen med PCl^ved en lav temperatur på 0-10°C, helst ca. 5°C, og den etterføl-gende behandling med Cl2utføres ved en temperatur på 15-30°C, helst 20-25°C.
I reaksjonsskjerna C på det vedlagte formelark er det vist reaksjoner som finner sted ved denne syntesemetode. I det første trinn dannes et to-fasesystem mellom tetrahydrofuran og en olje, som kan bestå av tris-(Mse)fosfit eller bis-(Mse)fosfit. Dertil kan den førstnevnte substans ha reagert med HCl under dannelse av den andre. Fosfitmellomproduktets sanne natur er ennå ikke fastlagt med sikkerhet. Ved å behandle to-fasesystemet som dannes i det første trinn med Cl2, kan forbindelsen med formel 5 fremstilles i høyt utbytte på ca. 90 %.
En spesiell metode for å fremstille et fosforyleringsmiddel med formel 6 er en hvori 2-metylsulfonyletylalkohol, under utelukkelse av vann, tilbakeløpskokes under røring i overskudd PCl^ inntil det ikke lenger unnslipper noe HCl, hvoretter overskuddet av PCI3avdestilleres og den gjenværende oljeaktige væske destilleres ved redusert trykk. Fortrinnsvis tilbakeløpskokes 2-metylsulfonyletylalkohol ved 90-100°C i et 4-8-gangers overskudd, helst i et 6-gangers overskudd av PCl^- 2-metylsulfonyletylalkoholen tilsettes f.eks. dråpevis i ren form under fullstendig vannfrie betingelser og ved romtemperatur til et 6-gangers overskudd av PCl^, hvoretter blandingen tilbakeløpskokes ved 90-100°C uten løsningsmiddel eller base og under kraftig røring. Når ikke mere HCl går vekk, avdestilleres overskuddet av PCl^. Resten er en meget hygroskopisk oljeaktig væske som reagerer voldsomt med vann, og i tillegg til det ønskede reaksjonsprodukt inneholder én eller flere ukjente kontaminanter. Når denne væske destilleres i et "kulerør" ved redusert trykk, destilleres en klar oljeaktig væske ved 0,1 mm Hg og 160°C, som i tillegg til det ønskede reaksjonsprodukt inneholder en meget liten mengde forurensninger. Under de samme betingelser, men ved 200°C destilleres en klar oljeaktig væske som inneholder enda mindre forurensninger. Utbyttet av den ønskede forbindelse med formel 6 er etter destillering ca. 56 % beregnet på grunnlag av 2-metylsulfonyletylalkoholen som brukes som utgangsmateriale. Selvfølgelig kan forbindelsen med formel 6 isoleres i enda renere form ved bruk av kjente teknikker.
Fosforyleringsreagensen ifølge oppfinnelsen kan brukes for fosforylering av organiske hydroksyl- og aminforbindelser. Eksempler- er sukkere, f.eks. glykose og myoinositol; alko-holer, såsom p-nitrobenzylalkohol og pyrokatekol; og sekun-dære aminer, såsom morfolin. Alkoholater, såsom natriumparanitrofenolat kan også fosforyleres ved bruk av de foreliggende fosforyleringsreagenser. Når fosforyleringsreagenser som brukes er en fosfittriester, kan det fosfory-lerte produkt oksyderes på kjent måte til en fosfattriester, f.eks. ved hjelp av jod i vann. Fosf oryler ingsreagensene ifølge foreliggende oppfinnelse' er ment spesielt og er egnet for fosforylering av nukleosidderivater, nukleotidderivater og polynukleotidderivater med en fri 3'-hydroksylgruppe eller en fri 5'-hydroksylgruppe, og hvori de andre reaktive grupper, f.eks. hydroksylgrupper og amingrupper er beskyttet om de foreligger.
For avbeskyttelse er to spesielt velegnede metoder utvik-let. Den første metode anvender en avbeskyttelsesblanding inneholdende NaOH og metanol, spesielt 14:5:1-blanding (volumforhold) av dioksan/metanol/4N NaOH. Denne blanding inneholder 5 volum-"/ vann og har en NaOH-konsentrasjon på 0,2 M. Ved hjelp av et egnet valg av antall ekvivalenter base med hvilke forbindelsene som skal beskyttes bringes i kontakt, er det mulig å.fjerne Mse-gruppen eller Mse-gruppene fullstendig i løpet av kort tid, eller hvis forbind-• eisen inneholder to Mse-grupper, om ønskes fjernes selektivt bare én av disse Mse-grupper. Således vil det ofte være mulig ved bare å bruke 1,1 ekvivalenter base for å selektivt fjerne bare én av Mse-gruppene, mens når f .eks. 3 ekvivalenter base brukes, fjernes begge Mse-grupper fullstendig. Avbeskyttelse krever generelt en behandlingstid på størrelsesorden noen få sekunder til noen få minutter, f.eks. 10 sekunder når 3 ekvivalenter base brukes, og 2 minutter i tilfelle 1,1 ekvivalenter base.
Den andre avbeskyttelsesmetode anvender ammoniakk, enten
. som en konsentrert løsning av ammoniakk i metanol, eller som ammoniakkgass som føres gjennom en løsning av forbindelsen som skal avbeskyttes i acetonitril eller tetrahydrofuran. Ved denne metode er også selektiv avbeskyttelse mulig. Ved å bruke en konsentrert (1:1) løsning av ammoniakk i metanol, kan en selektiv fjerning av bare én Mse-gruppe oppnås ved 21°C i løpet av ca. 1-2 minutter, og fullstendig fjerning av begge Mse-grupper krever mer enn 30 minutter. Når ammoniakkgass føres gjennom en løsning av forbindelsen som skal avbeskyttes i acetonitril eller tetrahydrofuran, krever en selektiv avspaltning av én Mse-gruppe ved 21°C ca. 1-1,5 timer. Denne avspaltning kan
sterkt påskyndes imidlertid ved å utføre reaksjonen i nær-vær av vann. Når, f.eks. 2 volum-% vann settes til løs-ningen, finner man at den selektive avbeskyttelse er fullstendig i løpet av ca. 30 minutter.
Oppfinnelsen illustreres ved den følgende eksperimentelle del.
1. Generelle forholdsregler
Reaksjoner som gjør bruk av fosfoklorida ter eller fosfodi-kloriditter bør utføres under fullstendig tørre betingelser. I disse tilfeller anvendte man derfor glassapparatur som var tørket ved 100°C i noen timer eller natten over og deretter avkjølt i eksikatorer over P2°5eller NaOH-stykker. Løsningsmidler som ble brukt i de ovennevnte reaksjoner ble tørket som følger: Tetrahydrofuran, THF. Den absolutte kvalitet ble tørket og gjort peroksydfri ved destillasjon fra kalsiumhydrid (CaF^) rett før bruk, bortsett fra i reaksjoner hvori man anvendte metylsulfonyletyl-fosfodikloriditt med formel 6, hvor absolutt THF først ble ført over en kolonne av aktivert aluminiumoksyd (Alumina-Woelm B- Super I, 04571-bll59), etterfulgt av tørking over Na-metall over et tidsrom på 4 timer, og fritt for dagslys.
Acetonitril, CH^CN. Teknisk kvalitet ble destillert fra P205rett før bruk.
Pyridin, C^H^N. Pyridin ble holdt i en helt tett flaske
på CaH2og destillert fra CaH2helt fritt for fuktighet rett før bruk.
Reagenser ble gjort vannfrie som følger: Metylsulfonyletylalkohol, Mse-OH, ble oppløst (60° w/v) i absolutt etanol (Baker), hvoretter etanolen ble fjernet ved
. redusert trykk på en roterende fordamper (badtempera tur
40-50°C). Behandlingen ble gjentatt tre ganger. Spor av etanol ble fjernet natten over i et frysetørkeapparatur.
Fosfortriklorid, PCl^, ble destillert under utelukkelse
av fuktighet rett før bruk.
Videre er forsiktighet her på sin plass med hensyn til mulig neurotoksisitet av de syntetiserte fosfatestere. Di-alkoksyfosfokloridater er notorisk neurotoksiske materi-aler, mens mange av de nøytrale fosforsyreestere som her er beskrevet viser strukturelle likheter med jordbrukspestici-dene paration (formel 7) og spesielt paraokson (formel 8).
Videre er mange fosfiter notorisk toksiske substanser.
2. Analytiske teknikker
a) Tynnsjiktskromatogråfi (TLC):
■ TLC ble utført på kiselgelark med UV-indikator. I hvert
tilfelle ble 2^av prøven som skal analyseres satt på. (1 Y er 1 ul av en 1 % løsning). Påvisning ble foretatt med 254 nm UV-lys.
Kodingen av den mobile fase som brukes er som følger.
b) NMR- spektere
1H-NMR-spektere ble tatt opp på et Hitachi 60 MHz eller
et Bruker 100 MHz apparat.
<31>P-NMR-spektere ble også utført ved bruk av sistnevnte maskin.
c) IR- spektere
Infrarøde spektere ble tatt opp med en Perkin-Elmer (KBr-skiver). Hygroskopiske faste stoffer ble gnidd på en KBr-skive og deretter lagt imellom med en andre KBr-skive.
d) Påvisning av hydrolyserbart klor
Reagenser:
Isopropylalkohol p.a.; 0,1 % bromfenolblått i abs. etanol;
2N HClC^-løsning ; difenylkarbazon, 0,5 % i abs. etanol;
0,01M Hg (N03)2-løsning.
Fremgangsmåte:
10-40 mg av substansen som skal bestemmes ble veiet med stor nøyaktighet og deretter tatt opp i 50 ml isopropylalkohol p.a.. Ved meget reaktive substanser var man forsiktig med at ikke noe HCl-gass unnslapp under denne behandling. 10 ml destillert vann ble tilsatt, og deretter ble 0,2 ml bromfenolblåløsning tilsatt. En dråpe 2N HClO^-løsning ga nå en forandring til gult. Deretter ble 0,2 ml difenylkarbazonløsning tilsatt og veggen i titreringsbeholderen renset med 30 ml isopropylalkohol p.a.. Løsningen ble titrert med 0,01 M .Hg(N03)2-løsning i destillert vann inntil en fargeforandring til fiolett.
Styrkebestemmelsen av Hg(NO^)2~løsningen ble utført med p.a. -kvalitet KC1.
3. Syntese av bis-( Mse)- fosfokloridat (formel 5)
I en 250 ml's trehalskolbe utstyrt med et termometer, et kalsiumkloridrør, en 50 ml's dråpetrakt og en rører på toppen med en gasstett parafinsmurt rørerlås ble 24,83 g (0,200 mol) Mse-OH i 50 ml tetrahydrofuran innført. Til denne løsning satte man 9,16 g (0,0667 mol) PCl^i 25 ml tetrahydrofuran dråpevis under kraftig røring. Tildryp-pingshastigheten var ca. 1 dråpe pr. 1,5 sekunder, og temperaturen i reaksjonsblåndingen ble holdt på 5°C ved hjelp av en is- og saltblanding.
Etter tilsetning av halvparten PCl^, oppsto et to-fasesystem. Når alt PCl^var tilsatt, fortsatte man å røre ytterligere én time, hvoretter to-fasesystemet fikk stå natten over ved 21°C. (For dette formål ble trehalskolben ' beskyttet mot dagslys med aluminiumfolie . )
Deretter ble, under kraftig røring og gjennom to vaske-flasker med 98 % H2SO^ gassformig klor ført inn i to-fasesystemet. Kombinasjonen av kjøling med is og hastig-heten av klorgassinnføring under den eksoterme reaksjon ble valgt slik at temperaturen forble mellom 20 og 25°C.
Etter ca. 1"3 minutters klorgassinnf ør ing, forsvant to-f ase-systemet, og en klar løsning med lysegul farge av klorgass oppsto. Etter klorgassinnføring i ca. 80 minutter, ble løs-ningen plutselig uklar ved krystallisering av bis-(Mse)-fosfokloridat. I løpet av de neste 5 minutter krystalliserte mer og mer av produktet, mens systemets eksoterm-iske reaksjon tydelig avtok. Det sistnevnte ble kompensert for ved å redusere kjølingen. Etter 90 minutters klorgassinnføring, forsvant den gule farge av klor fra løsningen i løpet av to ytterligere minutter.
Etter 120 minutter var reaksjonen praktisk talt fullsten-■ . d.ig, og fargen av klorgass trengte ca. 5 minutter mer for å. forsvinne. På dette tidspunkt ble kloreringen avbrutt. "Overklorering" fører ofte til et produkt med dårlig kvalitet.
Etter påfølgende gjennomføring av tørr ^-gass gjennom blandingen i én time for å fjerne HCl-gass, ble produktet samlet på et G-3 glassfilter. Deretter ble det vasket på filteret med tørr tetrahydrofuran, og så rørt to ganger med 80 ml tetrahydrofuran og refiltrert.
Deretter ble produktet utsatt for oljepumpevakuum i en eksikator over P2^5i 3-4 timer for å fjerne HCl og tetrahydrofuran. Deretter fikk man 19,24 g av løst, kompakt hvitt pulver. Substansen ble holdt i porsjoner på 2 g i preparatflasker vunnet med parafilm. Disse flasker ble plassert i potter med kalsinert kalsiumklorid, som igjen, godt innpakket i parafilm, ble lagret ved 4°C.
bis-( Mse)- fosfokloridat (molekylvekt: 328,75):
- Utbytte 19,24 g (0,0585 mol) dvs. 88 % (PC13) eller
59 % (Mse-OH).
- Smelteområde: 92- 94°C.
- Hydrolyserbart klor: 98 mol -% (teoretisk: 100 mol-%).
- H-NMR:
£Mult. står for multiplisitet av signalet S: singlett,
D: dublett; T: triplett; osv.
4. Syntese av bis-( Mse.)- paranitrof enylf osf at (formel 9)
Til en løsning av 3,616 g (0,011 mol) bis-(Mse)-fosfokloridat i 110 ml acetonitril i en 250 ml's rundkolbe satte man 1,777 g (0,011 mol) natriumparanitrofenolat (tørket over ?2^5vakuum ved 60°C, inntil orangerød farge uten spor av gult), hvoretter flasken umiddelbart ble lukket tett igjen. Det orangerøde natriumparanitrofenolatet opp-løstes gradvis under røring ved romtemperatur, og en felling av NaCl ble skilt fra.
Etter røring i ca. 20 minutter, ble alt natriumparanitrofenolat oppløst, og det resulterende NaCl- ble filtrert fra.
Etter fordampning av filtratet dannedes en gul olje, fra hvilke restene av acetonitril ble fjernet ved hjelp av en oljepumpe.
Etter skraping på kolbeveggen med en spatel krystalliserte oljen spontant.
Omkrystallisering fra metanol ga 4,07 g hvite krystaller.
bis-( Mse) paranitrofenylfosfat (molekylvekt: 431,4)
- Utbytte 4,07 g (0,0094 mol), 85, 5 %.
- Smelteområde: 107- 108°C .
- Rf verdi i mobil fase A: 0, 78.
- Elementanalyse: C: 33,20-33,21; H: 4,11-4,16; N: 3,12-3 , 12
teoretisk: C: 33,41; H: 4,21; N: 3,25
1H-NMR:
£ relative styrker: W: svak; M: medium; S: sterk.
5. Kinetikk for avbeskyttelse av bis-( Mse)- paranitrofenylfosfat med NaOH/ metanol.
86.3 mg (200 umol) bis-(Mse)-paranitrofenylfosfat ble opp-løst under oppvarming i 2 ml dioksan. Fra denne løsning ble 50 ul porsjoner (total: 5 umol ester) pipettert i Eppendorf sentrifugebeholdere. Avbeskyttelsesblåndingen besto av 0,25 ml dioksan i 1,875 ml metanol som var tilsatt:
0,375 ml 4N NaOH (løsning A) eller:
2,67 N NaOH (løsning B) eller:
2,0 N " (løsning C) eller:
1,47 N " (løsning D).
Tilsetningen av 25 ul av den ovenfor nevnte avbeskyttelsesblanding A, B, C eller D til beholderen inneholdende 5 umol ester i 50 pl dioksan førte til en blanding av dioksan:metanol:NaOH/H^O på 14:5:1 med en relativ basekonsentrasjon på: 3 ekvivalenter (A), 2 ekvivalenter (B), 1,5 ekvivalenter (C) eller 1,1 ekvivalenter (C). Avbeskyttelsesbland-ingen ble satt til esterløsningen med en Hamilton mikroin-jeksjonssprøyte umiddelbart etterfulgt av en Vortexmikser. Etter den foreskrevne reaksjonstid ble basen øyeblikkelig nøytralisert med 0,1 ml 0,2 M eddiksyre i metanol. Tynn-sjiktskromatografi ble utført med 2 ul av den resulterende løsning på kiselgelplater med UV-indikator i mobil fase A, R^-verdier: paranitrof enylf osf at, bis-Na salt (formel 11): 0; mono-(Mse)-paranitrofenylfosfat, Na<+>salt (formel 10): 0, 24; bis-(Mse)-paranitrofenylfosfat (formel 9): 0, 78.
Tynnsjiktskromatogrammene viste at når 1,1 ekvivalenter base ble brukt, erholdtes forbindelsen med formel 10 selektivt etter 120 sekunder; når 3 ekvivalenter base ble brukt kunne bare forbindelsen med formel 11 påvises etter et så kort tidsrom som 10 sekunder. Når 1,5 og 2 ekvivalenter base ble brukt, erholdtes en blanding av to forbindelser, hvori forbindelsen med formel 11 var dominerende etter hen-holdsvis 300 og 120 sekunder.
6. Avbeskyttelse av bis-( Mse)- paranitrofenylfosfat til mono-( Mse)- paranitrofenylfosfat, Na<+>salt
a) Mono-( Mse )- paranitrof enylfosf at, Na" 1" salt (formel 10)
Til en løsning.av 2,66 g (0,0062 mol) bis-(Mse)-paranitrofenylfosfat i 61,25 ml dioksan satte man langsomt dråpevis 92,75 ml avbeskyttelsesblanding (dioksan:metanol:1,4 N NaOH/H20 = 14:5:1) ved romtemperatur under kraftig rør- . ing. Etter 8 minutter var tilsetningen ferdig, og mengden tilsatt base var 1,05 ekvivalenter. Deretter ble blandingen behandlet med 3 dråper eddiksyre til fargeforandring av frigjort spor av paranitrofenyl (gul -> fargeløs). Fordampning av reaksjonsblandingen i en rotasjonsfordamper ga en gul olje som etter tilsetning og ny fordampning av destillert vann ble krystallinsk. De gule krystaller ble avfarget ved gjentatt vask med tetrahydrofuran.
Mono-( Mse)- paranitrofenylfosfat, Na+ salt. (molekyl vekt: 347,21):
- Utbytte 1,95 g (0,0562 mol), 91 %.
- Kromatografisk rent, mobil fase A: Rf: 0, 24.
■ b) Paranitrofenylfosfat, bis- Na+ salt (formel 11)
Til en løsning av 380 mg (0,00088 mol) bis-(Mse)-paranitro-■ fenylfosfat i 8,75 ml dioksan satte man dråpevis ved romtemperatur under kraftig røring 13,25 ml avbeskyttelsesblanding (dioksan:metanol:4N NaOH/H20 = 14:5:1). En felling oppsto nesten umiddelbart. Tilsetningen tok 15 sekunder, og etter omsetning i et totalt tidsrom på 20 sekunder ble blandingen behandlet med ca. 0,15 ml eddiksyre til fargeforandring for paranitrofenol. Utfellingen ble filtrert og vasket med dioksan, hvoretter den ble plassert i en vakuum-eksikator med 1 mm Hg i én time for å fjerne dioksan og all eddiksyre.
Paranitrofenylfosfat, bis- Na+ salt
- Utbytte 0,260 g (0,00099 mol), 112 % (vann fra krystallisering:)
- Rf-verdi i mobil fase A: 0.
- IR:
For karakterisering ble ovennevnte bis-Na<+>salt overført
i bis- cykloheksylammoniumsaltet av paranitrofenylfosfat. Cykloheksylammoniumklorid ble fremstilt ved at man dråpevis til en løsning av cykloheksylamin i dietyleter satte en vannfri løsning av HCl i etylacetat inntil en tykk pasta-lignende felling oppsto, og krystallisering fra etanol ga
• rent cykloheksylammoniumklorid.
En løsning av 0,261 g (0,00194 mol) cykloheksylammonium-' klorid i 2,3 ml destillert vann ble satt til en løsning av 0,230 g (0,00097 mol) paranitrofenylfosfat, bis-Na<+>salt i 2,3 ml destillert vann, hvorved bis-cykloheksylammoniumsaltet av paranitrofenylfosfat utfeltes øyeblikkelig; utfellingen ble vasket noen få ganger med destillert vann.
Utbyttet var 0,312 g (0,000747 mol), hvilket er 77 % på basis av bis-Na<+>saltet. Dette gir et faktisk utbytte av bis-Na<+>salt på 77 % x 112 % + 86 %.
Paranitrofenylfosfat, bis- cykloheksylammonjumsalt
- Smelteområde 199- 201°C (teoretisk: 199-200°C).
- Element analyse: C: 51,37-51,50; H: 7,61-7,70; N: 9,76-9,85.
teoretisk: C: 51,79; H: 7,73; N: 10,07.
IR:
7. Enzymatisk hydrolyse av paranitrofenylfosfat, bis- Na+ salt, med sur fosfatase.
For en kvalitativ karakterisering av bis-Na<+>saltet av paranitrofenylfosfat ble dette salt hydrolysert enzymatisk med en sur fosfatase isolert fra poteter.
Fremstilling av sur fosfatase:
En potet ble malt og den resulterende masse sentrifugert i en Labofuge 6000 ved 3000 opm i 5 minutter. Til 15 ml av supernatanten satte man 0,1 g kalsiumacetat for å felle ut alt fosfat, etterfulgt av resentrifugering ved 3000 opm, denne gang i 20 minutter. Den resulterende supernatant kalles "sur fosfataseløsning".
Enzymatisk hydrolyse:
60 mg paranitrofenylfosfat, bis-Na<+>salt ble oppløst i 50
ml natriumacetatpuffer, pH 5,0 (3 ml eddiksyre i 1 liter destillert vann, justert med 4N NaOH). I fire prøverør inn-førte man 5 ml 1s porsjoner av den ovennevnte puffrede løs-ning, hvoretter 0,2, 0,4 og 0,8 ml sur fosfataseløsning ble tilsatt til tre av disse rør. Til ett av rørene satte man 0,8 ml forutkokt sur fosfataseløsning (kontroll).
Alle rør ble deretter inkubert ved 37°C i 30 minutter. Etter dette tidsrom hadde alle løsninger, bortsett fra kon-. trollen, klar gul farge som resultat av frigjort paranitrofenol.
8. Avbeskyttelse av bis-( Mse)- paranitrofenylfosfat med
NH^-gass til mono-( Mse)- paranitrofenylfosfat, NH<*>salt (formel 12)
Gjennom en løsning av 1,92 g (0,00445 mol) bis-(Mse)-paranitrof enylf osf at i 50 ml acetonitril teknisk kvalitet i en 100 ml's rundkolbe innførte man langsomt NH^-gass ved
hjelp av en Pasteur-pipette ved romtemperatur. Etter ca. 30 minutter begynte et fast stoff å krystallisere fra løs-ningen. Etter 45 minutter ble gjennomblåsning av NH^-gass avbrutt, og kolben med reaksjonsblanding ble lukket. Etter ytterligere 45 minutters henstand ved romtemperatur ble utfellingen samlet på et G-3 glassfilter og vasket med aceto-■ nitril avkjølt til 0°C. Omkrystallisering fra acetonitril ga 1,22 g nåleformede, hvite krystaller.
■ Mono -( Mse)- parani trofenylfosfat, NH<*>salt, '( molekylvekt: 341, 25 )
- Utbytte: 1,22 g (0,00358 mol), 81 %
- Smelteområde: 142- 143°C
- Rf-verdi i mobil fase A: 0, 24
- Element analyse: C: 31,51-31,66; H.: 4,39-4,39; N: 8,01-8 , 06
teoretisk: C: 31,58; H_: 4,42; N: 8,18.
<1>H-NMR:
9. Måling av den katalytiske aktiviteten til vann i avbeskyttelse med NH^- gass ( kromatografisk)
Bestanddeler:
Ammoniakkgass, NH^ble tørket, ved kondensasjon av gassen i en tre-halskolbe avkjølt til -78°C (aceton/tørris), og deretter forsiktig tilsatt biter av natriummetall inntil væsken hadde helt mørkeblå farge.
Fremgangsmåte:
I fire adskilte eksperimenter ble 12 ml av en 1 % løsning av bis-(Mse)-paranitrofenylfosfat i tørt acetonitril inn-ført i en 50 ml tre-halskolbe. Denne kolbe var utstyrt med et gassinnløpsrør og et kalsiumkloridrør. Deretter ble gassformig ammoniakk ledet gjennom løsningen ved å la en bestemt mengde kondensert gass fordampe.
Før innføringen av gassen startet var imidlertid 0,01 % vann satt til acetonitrilløsningen i det første eksperi-ment, 0,2 % vann i det andre, og 2 % vann i det tredje (volum-%).
Kontrolleksperimentet ble utført under fullstendig tørre betingelser.
Forløpet av avbeskyttelsen ble kontrollert ved å,ta 2 pl prøver ved 0, 1,5, 5, 10, 15 og 30 minutter, målt etter
■ reaksjonens begynnelse, og overføring av disse til en kiselgelplate.
Mobil fase A: Rf-verdier: bis-(Mse)-paranitrofenylfosfat: 0, 78,
mono-(Mse)-paranitrofenylfosfat, NH^salt: 0,24.
Tynnsjiktskromatogrammene viser at tilsetningen av større mengder vann forårsaket raskere avbeskyttelse. Når 2 volum-% vann ble anvendt, fikk man en signifikant selektiv avbeskyttelse etter et så kort tidsrom som 5 minutter, mens etter 30 minutter fant man nesten ikke lenger noe bis-(Mse)-paranitrofenylfosfat. 10. Syntese av bis-( Mse)- paranitrobenzylfosfat (formel 13).
Bestanddeler:
Paranitrobenzylalkohol, molekylvekt: 153,13 ble renset som følger:
20 g av materialet ble oppløst ved 80°C i 500 ml av en
9:1 blanding av vann og metanol, hvoretter 20 g noritt (aktivert karbon.) ble tilsatt og blandingen ble rørt i ytterligere 30 minutter ved 80°C. Deretter ble noritt filtrert fra over cellitt (Hyflo). Fra det klare, lysegule filtrat, krystalliserte paranitrobenzylalkohol i lysegule nåler. Før bruk ble materialet tørket over ?2°5i vakuum ved romtemperatur (man var forsiktig med at ingen sublimasjon fant sted). Smelteområde etter tørking: 96-97°C.
Fremgangsmåte:
Til en løsning av 0,750 g (0,0049 mol) paranitrobenzylalkohol i 4 ml tørr pyridin i en 50 ml rundkolbe satte man meget raskt under røring ved romtemperatur 1,838 g (0,0056 mol) bis-(Mse)-fosfokloridat, hvoretter kolben raskt ble lukket. Reaksjonen ble styrt kromatografisk ved meget rask uttagning av en 50 ul prøve fra løsningen med en Hamilton mikrosprøyte ved bestemte intervaller, og etter fortynning med 1 ml metanol, overføring av denne prøve til en kiselgelplate. (Mobil fase C: paranitrobenzylalkohol: R^= 0,76; bis-(Mse)-paran itrobenzylfosfat: R^= 0,44.)
Etter 20 minutters røring var reaksjonen fullstendig, og pyridinet ble fjernet på en rotasjonsfordamper, etterfulgt av et oljepumpevakuum (0,1 mm Hg) i én time. Resten, en gul olje, ble bragt til krystallisering ved skraping med en spatel. Omkrystallisering fra vann/metanol, 9:1, ga store, meget lysegule nåleformede krystaller.
Bis-( Mse)- paranitrobenzylfosfat (molekyl vekt: 445,4)
- Utbytte: 2,13 g (0,00483 mol), 90 % (på basis av p-nitrobenzylalkohol )
- Smelteområde: 84-88°C.
- Rf-verdi i mobil fase: B: 0, 31; C: 0, 44.
- Element analyse: C: 35,17-35,27; H_: 4,41-4,53; N: 3,13-3,15.
teoretisk: C: 35,06; H: 4,53; N: 3,14.
-<1>H-NMR:
-<31>P-NMR: - IR:
11. Syntese av bis-( Mse)- fosfomorfolidat (formel 14)
Bes tanddeler:
Morfolin ble tørket over NaOH-stykker.
Fremgangsmåte:
Til -en løsning av 1,644 g (0,0050 mol)
bis-(Mse)-fosfokloridat i 12,8 ml tørt acetonitril satte man dråpevis en løsning av 0,957 g (0,011 mol) tørt morfolin i 5 ml tørr tetrahydrofuran under magnetrøring ved romtemperatur. Etter halvferdig tilsetning utfeltes en hvit felling av morfolin-HCl fra denne løsningen. Etter tilsetningen av alt morfolinet i løpet av 10 minutter ble blandingen rørt i ytterligere 10 minutter ved romtemperatur. Filtrering av morfolin-HCl-utfelling og fordampning av det resulterende filtrat ga 2,05 g gul olje som etter å ha vært holdt ved 4°C en stund krystalliserte spontant. Omkrystallisering fra absolutt etanol ga 1,68 g hvite nåleformede krystaller.
Bis-( Mse)- fosfomorfolidat: (molekylvekt 379,4).
- Utbytte: 1,68 g (0,00443 mol), 89 % (på basis av forbindelsen med formel 5).
- Smelteområde: 63- 67°C.
- Element analyse: C: 31,67-31,74; H: 5,86-5,87; N: 3,60-3,71
teoretisk: C: 31,66; H: 5,85; N: 3,69.
-<1>H-NMR:
• - IR:
12. Syntese av 2, 3- 0- isopropyliden- adenosin- 5'- monofosfat, bis- NH* salt (formel 15)
Rekvisita:
- 2,3-O-isopropyliden-adenosin, molekylvekt: 307,24, hand elsvare, ble tørket i vakuum ved 110°C over P-O,- i
— 2 D
3 timer rett før bruk.
- Kiselgelkolonne: 160 g kiselgel (70-230 mesh, Merck) ble
rørt i mobil fase A og etter luftavgang pakket i en kolonne med diameter 6 cm. Søylehøyden var deretter 20 cm. Før bruk ble kolonnen renset med et kolonnevolum av A (700 ml ) . - Trietylammoniumbikarbonat (TEAB) puffer: 40,48 g (0,40 mol) nydestillert trietylamin (Baker) ble innført i 1 liter destillert vann, og blandingen ble justert til pH 8,0 ved å føre CC^gjennom den. (Pufferen ble fremstilt rett før bruk og bare brukt én gang.) - DEAE-A25 kolonne: DEAE-A25 (Sephadex) ble plassert i 0,40M TEAB puffer og pakket i en kolonne med diamenter 3 cm og en endelig søylehøyde på 30 cm. Deretter ble kolonnen renset i 24 timer med 0, 01M TEAB puffer, pH 8,0, strømningshastighet 20 ml/t. - Dowex-50W-X2 kolonne: Dowex-50W-X2 (200-400 mesh) ble ekvilibrert på et G-3 glassfilter noen få ganger og vasket med: 1) 2H HCl; 2) destillert vann; 3) 2N NaOH; 4) destillert
vann. Deretter ble ionebytteren bragt i NH+ ^ form ved ao vaske og ekvilibrere den noen få ganger med en 2N NH^-løsning. Deretter ble den vasket flere ganger med destillert vann, hvoretter ionebytteren ble pakket i en kolonne med en diameter på 3 cm og en endelig søylehøyde på 20 cm .
Fremgangsmå te:
Til en løsning av 1,536 g (0,0050 mol) 2,3-O-isopropyliden-adenosin i 20 ml tørt pyridin satte man 1,80 g (0,0055 mol) bis-(Mse)-fosfokloridat ved romtemperatur under magnetrør-ing. Etter røring i 20 minutter ble pyridin fjernet på rotasjonsfordamper ved 40-50°C, hvoretter resten, en vis-køs klar olje, ble forbundet med oljepumpevakuum i ytterligere 2,5 timer for å fjerne de siste rester av pyridin. Tynnsjiktkromatografisk kontroll av oljen i blanding A viste: 1) pyridin- HCl: R =0-0,3; 2) 2, 3- O- isopropyliden-adenosin- 5'- bis-( Mse)- monfosfat (formel 16): R =0,37; 2, 3- O- isoprpyliden- adenosin (utgangsmateriale): R^.=0,57. Oljen ble renset ved kolonnekromatografi på kiselgelkolonne i element A. Ved en strømningshastighet på 4-5 ml/minutt samlet man fraksjoner på ca. 12 ml. Etter å ha eluert 240 ml fra kolonnen, fant man en liten mengde utgangsmateriale, og etter 400 ml's eluering fant man kromatografisk ren 2,3-O-isopropyliden-adenosin-5<1->bis-(Mse)-fosfat (formel 16) i et totalvolum på 300 ml A. Fordampning av dette eluat ga 2,62 g (0,00435 mol) krystallinsk forbindelse med formel 16, 87 %. Den ble avbeskyttet som følger: 2,61 g (0,00435 mol) av materialet ble oppløst i 40 ml ■ metanol, hvoretter 6 ml 4N NaOH-løsning (4,5 ekvivalenter base) ble tilsatt under røring ved romtemperatur. Etter røring i 1 minutt ble løsningen justert til pH 6 med eddik- ■ syre. Fordampning av løsningen ga en viskøs olje som etter gjentatt vasking med isopropylalkohol og isopropyleter ble krystallinsk. Det resulterende 2, 3- O- isopropyliden- adenosin- 5'- monofosfat, bis Na<+>salt (formel 17) hadde en Rf-verdi på 0,48 g i eluent D. Utbyttet var 2,25 g (0,00522 mol), dvs. 120 % på basis av forbindelsen med formel 16. Dette kan forklares ved at det er'natriumacetat tilstede i materialet. Den videre rensemetode for forbindelsen med formel 17 var som følger: Den totale materialmengde, 2,25 g, ble oppløst i 0,01M TEAB-puffer, pH 8,0, og overført til en DEAE-A25-kolonne, hvoretter sistnevnte ble renset i 3 timer med sistnevnte puffer ved en strømningshastighet på 20 ml/time. Eluering av kolonnen ble foretatt med en 300 ml/300 ml lineær grad-ient av 0,01 ->0,4M TEAB, pH 8,0 ved en strømningshastighet på 30 ml/time; 6 ml's fraksjoner ble samlet og elueringen av kolonnen ble kontrollert med et UV-påvisningssett. Når ca. 320 ml av gradienten hadde gått gjennom kolonnen, var gradientens styrke 0,2M TEAB, og en UV-absorberende sub stans ble påvist. Etter fullstendig eluering var substansen i 300 ml TEAB-puffer. Denne ble fordampet og TEAB fjernet ved gjentatt oppløsning av resten i vann og fjerning av vannet i rotasjonsfordamper. Den endelige rest, en mengde hvite krystaller, ble oppløst igjen i 50 ml destillert vann og frysetørket. De resulterende hvite krystaller besto av trietylammoniumsaltet av forbindelsen med formel 17, og var kromatografisk rene.
Etter oppløsning i destillert vann ble substansen ført gjennom en kolonne av Dowex 50W-X2, ammonium form, og frysetørket.
2, 3- O- isopropyliden- adenosin- 5'- monofosfat, bis- NH^ salt, (molekylvekt: 421,36): Utbytte: 1,454 g (0,00345 mol), 69 % (basis: beskyttet
adenosin)
<1>H-NMR:
13. Syntese av fl- D- glukose- 6- f osf at, bis-" 1" salt (formel 18 )
Rekvisita:
- 1,2,3,4-tetraacetyl-Æ-D-glukose, molekylvekt: 348, handelsvare, ble tørket i vakuum over ?2(-)5 ve<^ 60°C
i 3 timer rett før bruk.
Fremgangsmåte:
Til en løsning av 0,612 g (0,00176 mol) 1,2,3,4-tetraacetyl-ft-D-glukose i 5 ml tørt pyridin satte man 0,678 (0,00206 mol) bis-(Mse)-fosfokloridat ved romtemperatur under røring. Etter røring i 30 minutter ble pyridinet fjernet i rotasjonsfordamperen ved 40-50°C. Deretter ble råoljen oppløst i 50 ml metanol og plassert i et sentri-fugerør, hvoretter 3,6 ml 4N KOH-løsning (9 ekvivalenter base) ble tilsatt under magnetrøring, hvorved en utfelling umiddelbart oppsto. Etter 20 sekunder ble basen behandlet med 3 ekvivalenter eddiksyre, og utfellingen ble sentrifugert fra, 2 minutter, 3000 opm (Labofuge 6000).
Etter fjerning av supernatanten ble klumpen vasket to ganger med metanol.
B- D- glukose- 6- fosfat, bis- K+ salt (molekylvekt: 351,3)
Utbytte: 0,470 g (0,00135 mol), 76 %. - r Hygroskopisk substans, helt lik handelsvaren bis-Na+ fra SIGMA.
- ^H-NMR: Identisk med den for bis-Na<+>salt fra SIGMA.
- IR: Identisk med den for bis-Na<+>salt fra SIGMA.
14. Syntese av Mse- fosfodikloriditt (formel 6)
Til 66,3 g (0,483 mol) nydestillert PC13i en 500 ml 1s tre-halskolbe utstyrt med gasstett glidelås og tilbakeløps-kjøler med uttappingsutstyr, satte man 10 g (0,0805 mol) Mse-OH dråpevis ved romtemperatur og kraftig røring i løpet av 2 timer. Ettersom Mse-OH ikke straks oppløses i PCl^, oppsto et to-fasesystem. Etter halvferdig tilsetning (ca. 1 time) begynte noe HCl å unnvike fra løsningen.
Etter tilsetningen av alt Mse-OH, ble blandingen tilbake- løpskokt på et parafinbad ved 90-100°C under kraftig røring, inntil ikke mer HCl unnvek (ca. 3-3,5 timer). Deretter ble temperaturen i parafinbadet hevet til en maksi-mumsverdi på 120°C, hvoretter (fortsatt under røring) overskuddet av PCl^ble fjernet fra tilbakeløpskjøleren (dette PC13ble tatt vare på).
Den uklare resten i kolben ble raskt overført til en 250 ml's kolbe,•hvoretter rester av PCI3og HCl ble fjernet i en rotasjonsfordamper ved hjelp av oljepumoevakuum. Deretter ble den uklare olje som ga en fiolett reaksjon med vann overført i porsjoner på 3 g til ml's rundkolber, som ble godt tettet igjen og lagret ved -18°C. Rett før bruk ble en 3 g's porsjon destillert i vakuum i en "kulerør"-destillasjonsenhet. Dette ga to fraksjoner: fraksjon 1 som destillerte ved 160°C og 0,1 mm Hg, og fraksjon 2,
200°C og 0,1 mm Hg. Utfra "'"H-NMR-spekteret inneholder fraksjon 1 mere forurensninger enn fraksjon 2, og sistnevnte fraksjon ble brukt i videre reaksjoner.
Mse- fosfodikloriditt (molekyl vekt: 225,12)
- Utbytte etter destillasjon, fraksjon 2: 94 % x 60 %, 56 %
-<1>H-NMR, fraksjon 2:
15. Syntese av o- fenylen- Mse- fosfitt (formel 19)
Pyrokatekol(1,2-dihydroksybenzen), molekylvekt: 110,11, ble tørket ved romtemperatur i vakuum over Pz .Oor rett før bruk .
Til en løsning av 1,59 g (0,00706 mol) Mse-fosfodikloriditt i 25 ml tørr tetrahydrofuran, avkjølt til -78°C, ble en løsning av 0,78 g (0,00708 mol) pyrokatekol og 1,15 ml (0,0142 mol) pyridin i 80 ml tørr tetrahydrofuran tilsatt langsomt under magnetrøring, hvorved en viskøs, hvit felling øyeblikkelig oppsto. Etter 15 minutter var all pyro-katekolløsning tilsatt, og blandingen ble oppvarmet ved romtemperatur over et tidsrom på en halv time.
Deretter ble 250 ml etylacetat etterfulgt av 100 ml destillert vann satt til blandingen. Etter rysting i en skilletrakt, ble etylacetatsjiktet behandlet og inndampet til en hvit krystallmasse. Omkrystallisering av denne rest fra
■toluen ga 1,72 g hvite krystaller.
O- fenylen- Mse- fosfit
- Utbytte: 1,72 g (0,00656 mol), 93 %
- Smelteområde: 97- 104°C.
-<1>H-NMR:
16. Syntese av bis-( Mse)- paranitrobenzylfosfat (formel 13), via Mse- fosfodikloriditt 2,80 g (0,0124 mol) nydestillert Mse-fosfodikloriditt opp-løst i 15 ml tørr tetrahydrofuran ble innført i en 500 ml's tre-halskolbe utstyrt med tre 50 ml's dråpetrakter. Etter avkjøling av denne løsning til -78°C tilsatte man dråpevis en løsning av 1,29 g (0,0104 mol) Mse-OH og 0,85 g (0,0104 mol) pyridin i 30 ml tørr tetrahydrofuran under kraftig røring over et tidsrom på 5 minutter, hvoretter røringen fortsatte i ytterligere 10 minutter. Deretter ble en løsning av 1,59 g (0,0104 mol) paranitrobenzylalkohol og 0,85 ml (0,0104 mol) pyridin i 30 ml tetrahydrofuran tilsatt dråpevis til den resulterende blanding over et tidsrom på 8 minutter. Etter røring i ytterligere 20 minutter ble løsningen oppvarmet til romtemperatur, hvoretter 200 ml • etylacetat og 50 ml 0,5 NaHCO^-løsning ble satt til løs-ningen. Mens det således resulterende to-fasesystem ble rørt kraftig ved romtemperatur, tilsatte man langsomt • dråpevis en løsning av.3,12 g (0,0124 mol) jod i etylacetat. Reduksjonen av jod med de tilstedeværende fosfiter i løsningen ser man umiddelbart ved at den mørkebrune jod-fargen raskt forsvinner i to-fasesystemet. etter 15 minutter var oksydasjonsreaksjonen fullstendig, og kolbeinn-holdet ble overført i en skilletrakt, hvoretter etylacetatsjiktet og vannsjiktet ble skilt fra hverandre.
Deretter ble det mørkebrune etylacetatsjikt befridd for jod ved rysting med vandig NaHSO^-løsning inntil avfarging. Ytterligere behandling og fordampning av etylacetatsjiktet ga 2,8 g gul olje. En kromatografisk kontroll av denne olje i eluent B ga 2 UV-positive fraksjoner som kan skilles fra hverandre: én fraksjon med R = 0,310 (lik Rf-verdien til bis-(Mse)-paranitrobenzy1fosfat i dette elueringssys-tem), og én fraksjon med R^-verdi 0,46 (hvilket er lik R_£-verdien for paranitrobenzylalkohol).
Oljen ble oppløst i eluent B og ført gjennom en kiselgelkolonne (diameter 6 cm, søylehøyde 20 cm, strømningshastig- . het 4-5 ml/minutt, fraksjon sstørrelse 8-12 ml). Fraksjonene 24-34 inneholdt substansen med høyere R^-verdi, og fraksjonene 36-54 den med lavere verdi. Inndampning av den sistnevne serie fraksjoner ga 1,20 g gul olje som etter vask med vann størknet. Omkrystallisering fra metanol ga 1,10 g meget lysegule krystaller av bis-(Mse)-paranitrobenzylfosfat.
Bis-( Mse)- paranitrobenzylfosfat.
- Utbytte: 1,10 g (0,00247 mol), 20 % (på basis av forbindelsen med formel 6).
- Smelteområde: 85- 86, 5°C.
- Blandingssmelteområdet for en 1:1 blanding av den her syntetiserte substans og paranitrofenylesteren som er syntetisert tidligere via forbindelsen med formel 5, som hadde et smelteområde på 85-88°C, var 85-87°C.
<1>H-NMR:
Fordampning av den første fraksjonsserie ga 0,9 g gul olje som etter- tilsetning av vann ble krystallinsk. Omkrystallisering fra isopropylalkohol ga 0,33 g meget lysegule krystaller av Mse-bis-(paran itrobenzyl)fosfat.
Mse- bis-( paranitrobenzyl) fosfat
- Utbytte: 0,33 g (0,00069 mol), 5, 6 % (på basis av forbindelsen med formel 6 ) .
- Smelteområde: 77- 78°C
- R^-verdi i eluent B: 0,46.
1H-NMR:

Claims (10)

1. Fosforyleringsreagens inneholdende minst en beskyttet hydroksylgruppe og minst en avspaltbar gruppe, karakterisert ved at den inneholder minst en hydroksylgruppe beskyttet med metylsulfonyletyl.
2. Fosforyleringsreagens ifølge krav 1, karakterisert ved at den tilfredsstiller en av formlene 1-4 hvori Mse betyr metylsulfonyletylgruppen CH-^SC^Cr^Cr^- og L og L' er avspaltbare grupper.
3. Fosforyleringsreagens ifølge krav 2, karakterisert ved atL og/eller L' er klor; 1,2,4-triazolyl; tetrazolyl; ftalimidooksy; succinimidooksy eller ■ benzotriazoloksy.
4. Fosforyleringsreagens ifølge krav 3, karakterisert ved at det har formel 5 eller formel 6.
5. Fremgangsmåte ved fremstilling av en fosforyleringsreagens inneholdende minst en beskyttet hydroksylgruppe og minst en avspaltbar gruppe, karakterisert ved at man fremstiller en forbindelse med formel 5 ved å omsette 2-metylsulfonyletylalkohol i et inert løsnings-middel, fortrinnsvis tørr tetrahydrofuran, i rekkefølge med PC13 og Cl2 .
6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at omsetningen med PCl^ utføres ved en temperatur på 0-10°C, og omsetningen med Cl^ ved en temperatur på 15-30°C.
7. Fremgangsmåte ved fremstilling av en fosforyleringsreagens inneholdende minst en beskyttet hydroksylgruppe og minst en avspaltbar gruppe, karakterisert ved at man fremstiller en forbindelse med formel 6 ved tilbakelø pskoking av 2-metylsulfonyletylalkohol under ute lukkelse av vann i et overskudd av PCl^ under røring inntil HCl ikke lenger unnviker, hvoretter man destillerer vekk overskuddet av PCl^ og destillerer den gjenværende oljeaktige væske ved et redusert trykk.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at 2-metylsulfonyletylalkoholen tilbakeløpskokes i et 4-8 gangers overskudd av PCl^ ved en temperatur på 90- 100°C.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at den oljeaktige rest som er tilbake etter avdestillasjon av overskudd PCl^ destilleres ved redusert trykk i et kulerør.
10. Fremgangsmåte ved fosforylering av en organisk hydrok- ■ syl- eller aminforbindelse, såsom et nukleosidderivat, nukleotidderivat eller polynukleotidderivat inneholdende en fri 3'-hydroksylgrupoe eller en fri 5'-hydroksylgruppe, og i hvilken den andre reaktive gruppe, hvis sådan foreligger, er beskyttet, ved å omsette denne forbindelse med et fosforyleringsreagens inneholdende minst en beskyttet hydroksylgruppe og minst en avspaltbar gruppe, og fosforylerings-produktet, hvis det er en fosfittriester, eventuelt er oksydert til en fosfattriester, karakterisert ved at man anvender en fosforyleringsreagens inneholdende minst en hydroksylgruppe som er beskyttet med metylsulfonyletyl som angitt i kravene 1-4.
NO842662A 1983-07-01 1984-06-29 Fosforyleringsreagens, fremgangsmaate ved fremstilling og anvendelse derav NO842662L (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8302353A NL8302353A (nl) 1983-07-01 1983-07-01 Fosforyleringsmiddel; werkwijze voor het bereiden daarvan; werkwijze voor het fosforyleren van een organische hydroxyl- of amineverbinding.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NO842662L true NO842662L (no) 1985-01-02

Family

ID=19842103

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO842662A NO842662L (no) 1983-07-01 1984-06-29 Fosforyleringsreagens, fremgangsmaate ved fremstilling og anvendelse derav

Country Status (10)

Country Link
US (1) US4692542A (no)
EP (1) EP0131993B1 (no)
JP (1) JPS6069087A (no)
AT (1) ATE34577T1 (no)
AU (1) AU572158B2 (no)
CA (1) CA1224165A (no)
DE (1) DE3471484D1 (no)
DK (1) DK312784A (no)
NL (1) NL8302353A (no)
NO (1) NO842662L (no)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8302353A (nl) * 1983-07-01 1985-02-01 Stichting Katholieke Univ Fosforyleringsmiddel; werkwijze voor het bereiden daarvan; werkwijze voor het fosforyleren van een organische hydroxyl- of amineverbinding.
USRE34069E (en) * 1983-08-18 1992-09-15 Biosyntech Gmbh Process for the preparation of oligonucleotides
DE3329892A1 (de) * 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
DE3507881A1 (de) 1985-03-06 1986-09-11 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren und mittel zur phosphorylierung
US5332845A (en) * 1985-03-28 1994-07-26 Chiron Corporation Phosphorylating reagents
US5252760A (en) * 1985-03-28 1993-10-12 Chiron Corporation Method of using colored phosphorylating reagents
JPH0291088A (ja) * 1988-09-29 1990-03-30 Central Glass Co Ltd ホスファイトおよびヌクレオシド‐３’‐ホスファイト誘導体およびこれを用いるオリゴヌクレオチドの合成法
ES2019839A6 (es) * 1990-05-10 1991-07-01 Europharma Sa Procedimiento de obtencion de derivados polifosforilados de galactosa con actividad insulinica.
JPWO2015037587A1 (ja) * 2013-09-11 2017-03-02 株式会社ＰＲＩＳＭ Ｐｈａｒｍａ ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン化合物の製造方法
CN110627830A (zh) * 2019-10-15 2019-12-31 安徽昊帆生物有限公司 对硝基苯磷酸二钠及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8302353A (nl) * 1983-07-01 1985-02-01 Stichting Katholieke Univ Fosforyleringsmiddel; werkwijze voor het bereiden daarvan; werkwijze voor het fosforyleren van een organische hydroxyl- of amineverbinding.

Also Published As

Publication number Publication date
DK312784A (da) 1985-01-02
EP0131993A3 (en) 1985-05-15
CA1224165A (en) 1987-07-14
DE3471484D1 (en) 1988-06-30
US4692542A (en) 1987-09-08
JPS6069087A (ja) 1985-04-19
DK312784D0 (da) 1984-06-27
EP0131993B1 (en) 1988-05-25
AU572158B2 (en) 1988-05-05
EP0131993A2 (en) 1985-01-23
AU2978784A (en) 1985-01-03
ATE34577T1 (de) 1988-06-15
NL8302353A (nl) 1985-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Eckstein et al. Synthesis and properties of diastereoisomers of adenosine 5'-(O-1-thiotriphosphate) and adenosine 5'-(O-2-thiotriphosphate)
US5264566A (en) Method for in vitro oligonucleotide synthesis using H-phosphonates
Misiura et al. Biotinyl and phosphotyrosinyl phosphoramidite derivatives useful in the incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
CA3185450A1 (en) Remdesivir intermediates
JPH035495A (ja) 修飾された核酸を製造するための修飾されたホスホルアミダイト法
NO842662L (no) Fosforyleringsreagens, fremgangsmaate ved fremstilling og anvendelse derav
WO1990008153A1 (en) Reagents for the preparation of 5&#39;-biotinylated oligonucleotides
BURGERS et al. Crystal and Molecular Structure of Adenosine 5′‐O‐Phosphorothioate O‐p‐Nitrophenyl Ester (Sp Diastereomer) Substrate Stereospecificity of Snake Venom Phosphodiesterase
Anjaneyulu et al. Click chemistry: In vitro evaluation of glycosyl hybrid phosphorylated/thiophosphorylated 1, 2, 3-triazole derivatives as irreversible acetyl cholinesterase (AChE) inhibitors
Lee et al. Stereochemical probe for the mechanism of phosphorus-carbon bond cleavage catalyzed by the Bacillus cereus phosphonoacetaldehyde hydrolase
EP0198207B1 (en) Specific iodination of nucleic acid
Ripp et al. Rapid synthesis of nucleoside triphosphates and analogues
US5714361A (en) Phosphatase/phosphodiesterase enzyme inhibitors and methods
US4282352A (en) Adenosine triphosphate derivative
Lewis et al. An improved synthesis of diammonium acetyl phosphate
Richard et al. Stereochemical course of phosphoanhydride synthesis
Sarac et al. Solid‐phase synthesis of DNA and RNA 5′‐O‐triphosphates using cycloSal chemistry
US3575958A (en) Preparation of nucleoside-5&#39;-phosphoramidates
Lowe et al. A synthesis of adenosine 5′-[β-18 O 2] triphosphate
Collins et al. Organophosphorus compounds. XXI. Solvolysis and C3-substitution reactions of some 2, 3-Dihydro-1H-1, 2-benzazaphosphole 2-oxides and 2-sulfides
Cummins et al. On the mechanism of action of bovine intestinal mucosa 5′‐nucleotide phosphodiesterase: Stereochemical evidence for a nucleotidyl‐enzyme intermediate
CN107814673A (zh) 具有同位素的磷酸化合物的制造方法
Stawinski et al. Deoxyribo‐and Ribonucleoside H‐Phosphonates
Dbkowski et al. Highly efficient synthesis of phosphorodithioates derived from 3′-thiothymidine by anhydro-ring opening of 2, 3′-anhydro-5′-O-tritylthymidine with O, O-disubstituted phosphorodithioic acids
Shepard et al. Supporting Information for Nucleoside Tetra-and Pentaphosphates Prepared Using a Tetraphosphorylation Reagent are Potent Inhibitors of Ribonuclease A