JPH0365189A - プラスミド、その製造方法及びこれをプラスミノ―ゲンアクチベーターの収得に使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はプラスミド、その製造方法及びこれをプラスミ
ノーゲンアクチベーターの収得に使用する方法に関する
。

〈従来の技術〉 フィブリンが原因する血管閉塞、たとえば心臓梗塞、肺
塞栓、四肢の動脈閉塞疾患等々の治療に。

ブラスミノーゲンアクチベーターが重要な役割を果して
いる。　１９５０年代の初めから、ヒトの尿中にタンパ
ク質分解酵素が含有され、この酵素はプラスミノーゲン
のプラスミンへの変換を生じさせる。

すなわちこの変換がフィブリンの可溶性ポリペプチド中
での分解及びそれを同時にフィブリンに起因する閉塞の
溶解を生じせしめる酵素中で行われることは公知である
。このプラスξノーゲンアクチベーターはウロキナーゼ
と呼ばれ、実際に種々のウロキナーゼ型が存在するのが
分った。しかしすべての型は、同一の前駆分子、　７０
年代の半ばから公知の酵素原プロウロキナーゼから導か
れる。

このプロウロキナーゼは、１本鎖構造を有することが明
らかになった後に、これをｓｃｕ−ＰＡ（ｓｉｎｇｌｅ
る。このｓｃｕ−ＰＡは４１１アミノ酸から戒り、アミ
ノ酸３０２の天然に存在する形でグリコシリル化される
。

種々の処理から、　ｓｃｕ−ＰＡの非グリコジル化され
たたん白質部分−これは“ｒｓｃｕ−ＰＡ”（＆Ｉｌ換
えｓｃｕ−ＰＡ）と呼ばれるか又は俗名“サルプラーゼ
”である□）の遺伝子工学上の製造は公知である。

ｒｓｃｕ−ＰＡを治療的に使用する場合、これは作用及
び相容性の点で市販のフィブリン溶解薬に比して優れて
いることが分った（Ｌａｎｃｅｔ　１９８９．第８６３
８６８頁参照）。

非グリコジル化プラスξノーゲンアクチベータ−ｒｓｃ
ｕ−ＰＡの製造に、原核生物を使用する。このことはす
でに文献中にいくつか記載されている。

従来公知のｒｓｃｕ−ＰＡに関する製造方法は、ヒトの
＆１１織から単離された。　ｓｃｕ−ＰＡの構造遺伝子
の発現に基づいている。その際残念ながらほんの僅かな
発現率しか得られず、これは比較的多量に目的生成物を
経済的に製造することができない。したがってたとえば
ヒビノ等、　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、５
２＋３２９−３３６　（１９８８）に、大腸菌中でのｒ
ｓｃｕ−ＰＡ−産生に関して細菌の全たん白質を測定し
て２％発現水準しか記載されていない、他方、ヨーロッ
パ特許第９２１８２Ａ２号並びにホームズ等後記文献（
１０）中に達成される発現率が正確に記載されていない
、しかしこの記載の補正に於て９種々の菌株中で２％よ
り少ないｒｓｃｕ−ＰＡの細菌たん白質が得られている
。

細菌中の真核たん白質の発現のほとんどの場合と同様に
、細胞中のｒｓｃｕ−ＰＡも変性封入体□以下これを“
初期たん白質”と呼ぶ□として存在し、これは中間単離
の後にたん白質化学でｒｓｃｕ−ＰＡの正確な三次構造
に逆もどりしなければならないことが言及されている。

次いでこの様にして得られた生成物を、形成されたｒｓ
ｃｕ−ＰＡ−量の測定のために、たとえばプラスミンの
添加によって２本鎖の非グリコジル化ウロキナーゼ（“
ｒｔｃｕ−ＰＡ″）に変えることができ、その酵素活性
を測定し、　ｒｓｃｕ−ＰＡの形成量に関する尺度とし
て使用することができる。しかし当然初期たん白質又は
ｒｓｃｕ−ＰＡの収量及び同時にまた発現率を、たとえ
ば全たん白質のゲル電気泳動分離のデンストメトリー評
価で検出することができる。

〈課題を解決するための手段〉 今や９本発明者は驚くべきことに９本発明によるプラス
ミドで形質転換された細菌は、従来技術から公知のプラ
スミドで形質転換された同一の宿主菌株に比してはるか
に高い発現率を提供することを見い出した０本発明によ
るプラスミドはそれに応じてすべての従来公知のプラス
５ドに比してｒｓｃｕ−ＰＡ又はその初期たん白質の収
得に一層良好に適する。念のために９本発明に基づいて
ｒｓｃｕ−ＰＡが良好に入手されるので、公知方法で上
記の１分析目的に関して述べたｒｓｃｕ−ＰＡの、たと
えばプラスミンでの分解によって、　ｒｔｃｕ−ＰＡも
工業的規模で得ることができるともいえる。

更に本発明によるプラスミドは、そのオペロンが調節可
能な、場合にまり台底のプロモーターリボソーム結合部
位として有効なｓｃｕ−ＰＡに関する合成構造遺伝子及
び構造遺伝子の下流に少なくとも１個のターミネータ−
を有する点で優れている。

２個の連続ター箋ネーターが存在するのが好ましく、こ
れは特にＴｎｌＯからのｔｒｐ　Ａターミネータ−及び
（又は）　ｔｅｔ　Ａ１０ｒｆ　Ｌターミネータ゛−〔
ショルマイヤー（Ｓｃｈｏｌｌｍｅｉｅｒ）等、後記文
献（６）参照〕である。

調節可能なプロモーターは、特にＴｒｐ−プロモーター
又はＴａｃ−プロモーターである。

本発明によるプラスミドの制御域中でＳＤ−配列と開始
コドンの間の距離は、　　６−１２．好ましくは８−１
０ヌクレオチドである。

本発明によるプラスミド中に挿入された構造遺伝子の構
成に於て、夫々のアミノ酸に関して暗号づけする９次表
に記載された塩基配列を組み込むのが好ましい。その際
構造遺伝子中ですべてがこの要件を同時に満たす必要は
ない。

１］ムυ衰　　　　　トリブレシト アルギニン　　　　　　ＣＧＴ ロイシン　　　　　　　ＣＴＧ バリン　　　　　　　ＧＴＴ プロリン　　　　　　　　ＣＣＧ グリシン　　　　　　　ＧＧＴ 他方で構造遺伝子の構成に於て１次のコドンの使用を夫
々記載のアミノ酸に関してできる限り回避するのが好都
合である　（この際またこの要件をすべてのアミノ酸に
関して同時に満たす必要はない）： ■ｆｉおＬ７　　　アミノ酸 ＡＴＡ　　　　　　　イソロイシン ＧＴＣバリン ＣＣＣプユリ。

へＡＧ　　　　　　　　リジン へＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ　　　　アルギニンＧ
ＧＡ、ＧＧＧ　　　　　　　　グリシン構造遺伝子中で
個々のアミノ酸に関するコドンの本発明による選択並び
に制御域の前記要件によって、構造遺伝子と制御域との
間の安定な二次構造の形成を著しく阻害する。

合成構造遺伝子の収得に、先ずオリゴヌクレオチドを４
０−８０塩基の断片で１本の鎖状に合成する。

これを１μＭｏ１−尺度でアダムス（＾ｄａｍｓ）等、
後記文献（７）の固相法に従ってＤＮＡ−シンセサイザ
ー（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ　Ｃｏ、社のモデルバイオサーチ８６００）を用いて
製造するのが好ましい。

その際モノマーサイソン（Ｓｙｎｔｈｏｎｅ）として、
夫々必要なデスオキシヌクレオシドの市販のβ−シアノ
エチル−保護されたジイソプロピルアミノ−ホスホルア
ミシトを使用する。担体の離脱後、末端でまだトリチル
保護された鎖を無菌条件下ゲル濾過によって脱塩し、前
もって精製し１次いで２回のうち最初の分離を“逆相”
−ＨＰＬＣによって行う。

夫々の主生成物を脱トリチル化し、２回別の“逆相”−
）ＩＰＬｃ−精製工程の後、所望のオリゴヌクレオチド
がゲル電気泳動分析（ＰＡＧＥ）に示した様な高純度で
得られる。

次いでこの１本鎖の４〜９のグループから、長さ約２０
０ヌクレオチドの２本鎖断片を次の様にして得る：非末
端１本鎖のオリゴヌクレオチドを５゛−末端でホスホリ
ル化し、夫々の補体鎖を末端オリゴヌクレオチドと共に
やきもどし、連結する。

次いで連結後、形成されたクローン化しうる２本鎖断片
を適する線状化されたベクター中に挿入する。他の処理
法は、下記の例から明らかである。

本発明中で使用される略号は２次の意味を有する： ｂｐ：　　　　　塩基対 ＤＥ５２：　　　ワットマン社のアニオン交換体ＥＤＴ
Ａ　：　　　　エチレンジアミンテトラ酢酸ＩＰＴＧ　
：　　　　イソプロピル−β−〇−チオガラクトピラノ
シド ＰＡＧＥ　：　　　　ボリアクリルアミドゲル電気泳動
Ｐｕ：　　　　　プラーク単位 ＳＤＳ　　：　　　　ナトリウムドデシルスルフアート
Ｓ、Ｏ，−配列：　Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ−配
列トリス−ＨＣｌ：）リスヒドロキシメチルア旦ノメタ
ンーヒドロクロリド トウーソー８０：ポリエチレンオキシド（２０）ソルビ
タンモノオレアート 本発明によるプラスミドの構成のために、市販のプラス
ミドｐＢＲ３２２（４３６３ｂｐ）から出発するのが好
ましい、これからｎｉｃ／ｂｏｍ−域及び（又は）テト
ラサイクリン耐性遺伝子を脱離するのが有利である。そ
の際テトラサイクリン耐性遺伝子を完全に除去する必要
はない。むしろこれは、プラスミドがこれを用いて形質
転換された細菌株にテトラサイクリン−耐性をもはや付
与しないことで十分である。この操作（ｎｉｃ／ｂｏｍ
−域及び少なくとも一部のテトラサイクリン耐性遺伝子
の除去）によって。

いわゆる“高度に安全なプラスミド“が得られる。

本発明によるプラスミドの構成に好ましいスターター−
これは前記修飾されたプラスミドｐＢＲ３２２（又は他
の、ここで挙げたすでに知られているプラスミド）から
出発するーは、最も近い間隔として合成“マルチ　クロ
ーニング　サイト”の組み入れを切断部位Ｅｃｏ　ＲＥ
及び１１ｔｎｄｌＩＩとの間に定める。このマルチ　ク
ローニング　サイト　（第２図参照）は、切断部位の固
定された配列順序を有し、その間に存在する塩基はＸｂ
ａ　　Ｉ及びＮｄｅ　Ｉの間の配列を除いて任意に選択
され、この配列はＢ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｘｙｌオペロン５’　−ＡＡＧＧＡ
Ｇ−３’　（４）から及びＳＪ、−配列と開始コドンの
面モ固定された距離から戒るリボソーム結合部位を含有
する。　Ｓ、Ｄ、−配列に続く塩基ＧＡＡＡＴは文献（
４）から引用され。

ＣＡＴＡＴＧ、すなわちＮｄｅ　Ｉ切断部位は結合する
。したがってＳ、Ｄ、−配列はＡＴＧの間の距離は８塩
基対にある。マルチ　クローニング　サイトの個々の切
断部位の間の距離は、クローン化技術の理由から長さ少
なくとも約２０のヌクレオチドでなければならず、それ
によって介在断片の除去を促進する。

このマルチ　クローニング　サイトを用いて。

プラスミド中に切断部位を挿入する。この切断部位は、
−好ましくは転写ターミネータ−の組み込みの後−ｓｃ
ｕ　ＰＡ−構造遺伝子の部分配列の連続して行われる組
み込みを、目的たん白質のＣ−末端から、したがって製
造すべき構造遺伝子のＤＮＡ−鎖の３゛−末端から開始
し、並びにたとえば合成又は他のプラスミドから単離さ
れた又は市販のＴｒｐ−ブロモターの組み込みも可能に
する。この様にして得られたｓｃｕ−ＰＡ−構造遺伝子
の完全なヌクレオチド配列を、第１５図中に記載した個
々のコドンに対応するアミノ酸で示す。

本発明によるプラスくドの他のものは、前記の様に構成
されたプラスミドから、たとえば次の様にして得ること
ができる：ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩＩＩで切断してすべ
ての調節単位を有する合成ｓｃｕＰＡ−構造が得られ９
次いで他の、腸内細菌中、好ましくは大腸菌中で自律的
増殖可能なプラスミド中に組み込む、このプラスミドを
Ｅｃｏ　Ｒ１及び旧ｎｄＩＩＩで切断して線状化し、短
縮する。原則的に同一方法で。

しかし切断部位ＥＣＱ　ＲＬ＆びＸｂａ　Ｔの利用下に
、たとえばＴｒｐ−プロモーターをＴａｃ−プロモータ
ーと（逆もまた同じ）本発明によるプラスミド中で交換
することもできる。

同様な方法で他の公知のプラスミド−これは単一のＥｃ
ｏ　Ｒ１−及びｌ１ｉｎす■−切断部位を有するーたと
えばｐＨｃ　９．　ｐＵｃ　１２．　ｐＵｃ　１３．　
ｐＬＩｃ　１８．　ｐＵｃ１９等からも出発することが
できる。

Ｓ、Ｄ、−配列と開始コドンＡＴＧとの間の伸長された
距離を有する本発明によるプラスミドを１次の様に得る
ことができる：上記の様に構成されたプラスミド−これ
中で′上記距離、たとえば８ヌクレオチドを有する□を
Ｎｄｅ　Ｉで切断し、生じる切断部位を補充し１次いで
生じる平滑−末端を連結する。それによってＳ、Ｄ、−
配列と開始コドンとの間の距離がたとえば１０ヌクレオ
チドである本発明によるプラスミドを形成する。

上述の様に１本発明によるプラスミドで形質転換された
細菌を用いて、従来技術から公知のプラス壽ドで形質転
換された発現率よりもほぼ数倍高い発現率がもたらされ
る。適当な受容プラスミドの形質転換は、公知方法で行
われる０本発明によるプラスミドの発現に関して、特に
適する宿主生物は大腸菌−及び使用される腸内細菌一種
の株。

たとえばシュードモナス、サルモネラ、エンテロバクタ
−、クレブシェラ又はセレイシアの菌株である。

好ましい宿主生物は、大腸菌一種、たとえば大腸菌ＧＲ
Ｔ−ｌ及び特に下部群に１２の大腸菌−株、たとえば大
腸菌［１２ＪＭ　１０１（ＡＴＣＣ３３８７６）、大腸
菌）［１２ＪＭ　１０３（ＡＴＣＣ３９４０３）、大腸
菌に１２　ＪＭ　１０５（ＤＳ１０５（ＤＳ。

大腸菌−に１２−株（ＡＴＣＣ３１４４６）又はまた大
腸菌に１２ＤＨＩ（ＡＴＣＣ３３８４９）である。

Ｔａｃ−プロモーターを含有する大腸菌−発現系での発
現開始を、たとえば乳糖添加又はブドウ糖添加によって
、好ましくはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシドの添加によって生じさせる。

しかしプラスミド中にＴｒｐ−プロモーターが存在する
場合、誘導をインドールアクリル−１−酢酸−又は−プ
ロピオン酸で行うのが好ましい、他の公知の誘導は、当
然同一方法で利用することができる。

誘導及び一定の、前もって与えられた細胞密度の達成の
後に、細胞を遠心分離し、遠心分離残渣を水性塩溶液中
に懸濁後たとえば均一機中に移し。

それ中で細胞を圧力差によって裂開する。新たな遠心分
離の後、残渣中にｒｓｃｕ−ＰＡの初期たん白質が水不
溶性細胞破片等々と共に得られる。グアニジンヒドロク
ロリド溶液で処理して、初期たん白質を熔解し９次いで
新たに遠心分離の後、上澄液をレドックス系（たとえば
還元及び酸化グルタチオンを含有する。）で処理する。

それによって天然構造の形成、すなわち目的のｒｓｃｕ
−ＰＡの形成を生じさせる。その時これは反応混合物中
に溶解された形で存在し９通常の精製工程（たとえばク
ロマトグラフィー分離１次いで凍結乾燥）によって純粋
な形で単離することができる。

分析目的で、試験すべきプラスミドを用いて形質転換さ
れた大腸菌−株を発酵し、前もって付与された。細胞懸
濁液の光学密度を適する誘導剤で達成した後、　ｒｓｃ
ｕ−ＰＡ−初期たん白質の発現を誘導する様にして行う
のが有利である。適当な発酵期間の後、一部を取り出し
９次いでこれから遠心分離された細胞を、リゾチーム（
ｐＨ８，０の５０ｒａＭトリスヒドロクロリド緩衝液、
　５０ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ及び１５％サン力ロースーあた
りｌａｇリゾチーム）で溶解する。

溶解された細胞の均−物を、４−５Ｍグアニジニウムヒ
ドロクロリド溶液中に溶解し、１２Ｍグアニジニウムヒ
ドロクロリドで希釈後、還元剤（グルタチオン、メルカ
プトエタノール又はシスティン）の添加下に２−５時間
逆戻り反応を行う　（たとえばヴインクラー（Ｗｉｎｋ
ｌｅｒ）等、後記文献（１工）参照）、得られた１本１
１ｒｓｃｕ−ＰＡを、プラスミンの添加によって２末鎖
ｒｔｃｕ−ＰＡに変え９次いでその活性を基質Ｓ　２４
４４（ｐｙｒｏＧＩｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロア
ニリド；　Ｋａｂｉ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ、スウェ
ーデン）−一これは２本鎖の活性ウロキナーゼによって
しか分離されない□で測定する。プラスミンでのｒｓｃ
ｕ−ＰＡのこの活性化は、　５０　ｍＭ　　トリス−緩
衝液。

１２ｍＭ塩化ナトリウム、　０．０２％トウィーン８０
中でｐｌ＋７．４及び３７℃で行われる＊　ｒｓｃｕ−
ＰＡとプラスミンの割合は２モル濃度あたり約１００〜
１５００：１．あるいは酵素単位あたり約８．０００〜
３６．０００　：　１である。テスト培養は、５０ｍＭ
）リス−緩衝液、　３８ｍＭ塩化ナトリウム中でｐＨ８
，８で０．３６μ門アプロチニン（プラスミン阻止のた
めに）及び０．２７ｍＭ　Ｓ　２４４４の存在下に３７
℃で行われる。試料のｒｓｃｕ−ＰＡ含有量に応じて反
応を、５〜６０分の培養後９０％酢酸の添加によって停
止し、吸光を４０５ｎｍで測定する。

基質Ｓ　２４４４の生産者の指令に従って、この処理法
で４０５０−で分あたり０．０５の吸光変化は、２５プ
ラーク−単位／−テスト溶液の活性を意味する。

種々の本発明によるプラスミドの使用下に種々の細菌中
に得られる初期たん白質から得られるｒｓｃｕ−ＰＡの
収量を、第１０．１２及び１４図中に表わす。

第１１図から並びに下記例−特に例２からの表１−の記
載から明らかな様に１本発明によるプラスミドが好まし
くは大腸菌の株中で形成された全たん白ｔｌｏ〜２５重
量％、特に１４〜２０重Ｆｊ）％の発現率を有するｒｓ
ｃｕ−ＰＡ−初期たん白質の形成を生じさせる。したが
って発現率は９本発明によるプラスミドの使用で公知の
プラスミド、たとえばｐＵＫ　５４ｔｒｐ２０？−１を
用いた発現率に比して少なくとも１０〜１５倍高く得る
ことができる。

添付の図面は１次のことを示す： 第１ａ図及び第１ｂ図：市販のプラスミドｐＢＲ３２２
からのプラスミドｐＢＦ　１５８の構造。その際連続し
てｎｉｃ／ｂｏ＋ｍ−域及びテトラサイクリン耐性遺伝
子を除去する。

第２図：台底“マルチ　クローニング　サイト”のヌク
レオチド配列。

第３図ニブラスミドｐＢＦ　１５８−０１の構造。プラ
スミドルＢ１！　１５Ｂ中の切断部位Ｅｃｏ　Ｒ１と旧
ｎｄＩＩ［との間に合成マルチ　クローニング　サイト
の組み込みを描く。

第４図ニブラスξドｐＢＦ　１５８−０１７の構造。断
片Ｃ１ａｌＸ旧ｎｄｌＩＩを、　Ｔｎ　１０（６）から
のｔｅｔ　Ａ１０ｒｆ　Ｌターミネータ−が存在するプ
ラスミドｐＲＴ　６Ｈ５）からの対応する断片“Ｔ″に
替える。

第５８図ないし第５ｇ図：ヒトｓｃｕ−ＰＡに関して暗
号づけする遺伝子に対する合成断片のヌクレオチド配列
（例１ｄ〜ｌｆ中に記載されかつ第６図、第７図及び第
９図中に図示されたプラスミドｐＢＰ　１５Ｂ−０１Ｔ
から出発して９本発明によるプラス亀ド中にｓｃｕ−Ｐ
Ａに対する構造遺伝子の形成下にこの配列を組み込む、
） 第６８図ないし第６ｃ図：オリゴヌクレオチド断片Ｍ４
〜Ｍ８を、プラスミドｐＢＦ　１５Ｂ−０１７で開始し
て目的のたん白質のＣ−末端（ＤＮＡ−１１の３°−末
端に対応）から組み込むことによるプラスミドｐＢＦ　
１５Ｂ−０２Ｔ〜ｐＢＰ　１５８−０６の構成。

第７８図ないし第７ｃ図ニブラスミドｐＵｃ　１９中で
補助構造を介するプラスミドｐＢＦ　１５Ｂ−０８７の
構造。

第８図二合或Ｔｒｐ−プロモーターのヌクレオチド配列
。

第９図：ヒ）　ｒｓｃｕ−ＰＡの初期たん白質に関する
発現プラスミドの構造、　ｐＢＦ　１６０ｓｃｕ−ＰＡ
に関する構造遺伝子を切断部位Ｎｄｅ　ＩとＣ１ａ　Ｉ
との間の黒色帯によって表わす。

第１０図：種々の、プラスミドｐＢＰ　１６０　（００
）で又はプラスミドｐＵＫ　ｔｒｐ　２０７−１（１０
）　（・−・）で形質転換された大腸菌−株に於て、０
時点を基準にしてインドールアクリル酸での誘導後の時
間に基づいてＴｒｐ−プロモーターの調節下に、ヒトｒ
ｓｃｕ−ＰＡの初期たん白質の発現率（逆戻り及び活性
後ｒｔｃｕ−ＰＡ−活性として測定）、基質Ｓ　２４４
４で決定されたｒｔｃｕ　ＰＡ−活性を、　５７８ｎｍ
で光学密度１の発酵培地−あたりプラーク−単位で記載
する。

第１１図：誘導剤としてインドールアクリル酸添加前（
Ａ）及び添加６時間後（Ｂ）の発酵の後に。

ｐＢＦ　１６１で形質転換された大腸菌に１２　ＪＭ１
０３−細胞からのたん白質の５Ｏ５−ＰＡＧｆ！のデン
ジドグラム。

第１２図：　ｐＢＦ１７１で形質転換された大ｌ！菌に
１２ＪＭ　１０３中で、すなわちＴａｃ−プロモーター
の調節下にヒトｒｓｃｕ−ＰＡの初期たん白質の発現率
（逆戻り及び活性化後ｒｔｃｕ−Ｐ＾−活性として測定
）、決定された基質Ｓ　２４４４に対するｒｔｃｕ−Ｐ
Ａ−活性を、　５７８ｎ＋＊で光学密度１を有する発酵
培地−あたりのプラーク−単位で記載する。

第１３図：ＳＤ−配列（ＳＤ）と開始コドンＡＴＧとの
間の距離を、　Ｎｄｅ　Ｉ−切断部位の補充及び生じる
平滑−末端の引き続きの連結反応によって８から１０の
塩基伸長する。

第１４図ニブラスミドｐＢＦ　１６１　（ｏ−ｏ）又は
ρＢＦ１６３（Δ−Δ）で形質転換された大腸菌ＧＲＴ
−１中でＴｒｐ−プロモーターの調節下にヒトｒｓｃｕ
−Ｐ＾の初期たん白質の発現率（逆戻り及び活性化後ｒ
ｔｃｕ−ＰＡ−活性として測定）、誘導は、０時点直後
にインドールアクリル酸で行われる。基質Ｓ　２４４４
で決定されたｒｔｃｕ　ＰＡ−活性を、　５７８ｎ＊で
光学密度ｌの発酵培地−あたりのプラーク−単位で記載
する。

第１５ａ図及び第１５ｂ図：個々のコドンに対応するア
ミノ酸の表示を有するｓｃｕ−ＰＡ−構造遺伝子の完全
なヌクレオチド配列。

例中で使用される制限酵素は、市販されている（たとえ
ばＮａｃｈｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｔｅｃｈｎ、　Ｌａｂ、
３５＋　９３９＋１９８７参照）。

クローンの選択に関する例中で使用される培地はｌあた
り次のものを含有する：肉からのペプトン７．８ｇ、カ
ゼインからのペプトン７．８ｇ、酵母抽出物１０ｇ、塩
化ナトリウム５．６ｇ及びグルコース１０ｇ　。

この培地に熱い状態でｌあたり寒天１０ｇを加え。

プレート中に注ぐ。

例Ｉ Ｔｒｐ−プロモーターの調節下で合成ｓｃｕ−Ｐ＾−構
造遺伝子を有するｒｓｃｕ−ＰＡの初期たん白質に関す
る発現プラスミドｐＢＰ　１６０の構成。

ａ）プラスミドｐＢＦ　１５Ｂの構成 ｌ）プラスミドｐＢＦ　３２２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、
　Ｎｏ、２７−４９０２゜４３６３ｂｐ）から、塩基２
２０７と２２６３の間に存在するｎｉｃ／ｂｏ−域を次
の様に除去する（１）（第１図も参照）：ｐＢＲ３２２
を、塩基２２９８でＮｄｅ　Ｉにより切断し、それによ
って線状となる。上方の末端を“ｆｌｌｌ　ｉｎ”反応
を介して補充し、それによって平滑−末端が得られる（
２）、その後塩基２０６８でＰｖｕ　ＩＩを用いて切断
し、　ｐＢＲ３２２の残った部分の２つの平滑末端を常
法に従ってＴ４−リガーゼで再び連結する０次いで連結
混合物をコムビテント大腸菌に１２　ＪＭ　１０３細胞
（＾ＴＣＣ３９４０３）中で形質転換する（３）、形質
転換された細胞を、培地上で１５０μｇアンピシリン／
−の添加下に培養する。得られたクローンから、プラス
ミドｐＢＦ１５７を含有するクローンを選択する。この
プラス果ドは、出発プラスミドｐＢＲ３２２と２２８ヌ
クレオチドだけ小さいａ）　Ｐｓｔ　Ｉ　ＸＢｓｐＭＩ
Ｉ−、ｂ）Ｐｓｔ　Ｉ　Ｘ　Ｂａｌ　Ｉ−、ｃ）　Ｐｓ
ｔ　Ｉ　ＸＡｖａ　　Ｉ−断片の点で異なる。　ｐＢＲ
３２２の２つの単一切断部位Ｐｖｕ　Ｉｆ及びＮｄｅ　
Ｉは、プラスミドルミル　１５？中にもはや在しない。

１ｉ）　ｐＢＦ　１５７から、テトラサイクリン耐性遺
伝子の大部分をＨｃｏＲＶ　Ｘ　Ｎｒｕ　Ｉでの切断９
次いで生じる平滑末端の連結によって除去する。大腸菌
に１２．　ＪＭ１０３中で形質転換し、１５０μｇアン
ピシリン／−を含有する培地上で培養した後、クローン
が得られ、このクローンからプラスミドｐＢＦ　１５Ｂ
を含有するプラスミドを選択する。これらはｐＢＦ　１
５７より７８７ヌクレオチド小さく。

その上Ｂａｇ旧−切断部位の欠落の点で異なる。

細菌株のｐＢＦ　１５Ｂでの形質転換は、細菌にテトラ
サイクリン耐性を付与しない。

ｂ）ｐＢＦ　１５８−０１の構成１合成マルチクローニ
ングサイトの組み込み。

ｐＢＦ　１５８から、　Ｅｃｏ　Ｒ１ｘ旧ｎｄｌｌｒで
の切断によって３１ヌクレオチド大きい断片を除去し、
裂は目に合成マルチクローニングサイトを連結する。

その配列を、第２図中に描写する。大腸菌に１２ＪＭ　
１０３中で連結混合物を形質転換し、１５０μｇアンピ
シリン／１＃１を有する培地上で培養した後。

プラスミドｐＢＦ１５８−０１を含有するクローンを選
択する。このクローンはｐＢＦ　１５８と付加的な単一
切断部位ＸｂａＩ、　Ｎｄｅ　Ｉ、　Ｓａｃ　１．　Ｅ
ａｇ　ＬＫｐｎ　Ｉ　、　Ｓｐｅ　Ｉ並びに第二Ｐｓｔ
　Ｉ−切断部位の点で異なる（第３図）。

ｃ　）　ｐＢＦ　１５Ｂ−０１Ｔの構成、転写ターξネ
ーターの組み込み。

ｐＢＢ　１５８−０１から、マルチ　クローニング　サ
イトのＣ１ａｌＸ旧ｎｄＩＩ［断片を除去し、　Ｔｎ　
１０からのｔｅｔ　Ａ１０ｒｆ　Ｌターミネータ−（６
）が存在するｐＲＴ　６１からのＣ１ａ　　Ｉ　×Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片（５）に替える。

菌株大１１ｊ＆菌に１２　ＪＭ１０３中で形質転換し、
１５０μｇアンピリジン／ｄを有する培地上で培養した
後、プラスミドｐＢＰ　１５８−０１Ｔを含有するクロ
ーンを選択する。このクローンはｐＢＦ１５Ｂ−０１と
２９７ヌクレオチドだけ大きいＣ１ａ　　Ｉ　ＸＨｉｎ
ｄｌｌｌ断片の点で異なる（第４図）。

ｄ　）　ｓｃｕ−ＰＡ−遺伝子に関する合成断片Ｍ４−
Ｍ８の組み込み、プラスミドｐＢＦ　１５８−０２Ｔ−
ｐＢＦ　１５Ｂ−０６７の構成。

すべての合成断片を、第５ａ　−５ｇ図中に記載する。

これらを長さ約２００ヌクレオチドの二本鎖断片として
当該ベクター中に使用する。更にベクターを、その都度
挙げた切断部位に相当する開銀酵素で切断し、アガロー
スゲル電気泳動。

電気溶離及び精製によってＤｌｌ！５２に経て除去すべ
き断片を分離する。その後付随する二本鎖合成断片との
連結は、　Ｔ４−リガーゼを用いて行われ。

形質転換は大腸菌に１２　ＪＭ１０３中で行われ（第６
ａ−６ｃ図）及び選択はアンピシリン−含有培地上で行
われる。

ｌ）プラスミドｐＢＦ　１５８−０１Ｔ中のＥａｇ旧と
Ｃ１ａ　　Ｉとの間の断片間の連結反応。

プラス藁ド１５８−０２７が生じる。オリゴヌクレオチ
ド０１９は、　ｓｃｕ−ＰＡのＣ−末端配列に関して暗
号化する。停止−コトンＴＡＡの後にＮｈｅ　Ｉ切断部
位が存在し、これは付加的な、　ＴｒｐＡターξネータ
ー（８）の転写ターミネータ−ないしＣ１ａ　Ｉを有す
る。

１０　プラスミドｐＢＦ１５８−０２Ｔ中でのＳｐｅ　
　ＩとＢａｍ　ＩＩとの間の断片Ｍ７の連結反応。

プラスもド１５Ｂ−０３７が生じる。

１１ｉ）　　プラスミドｐＢＦ１５８−０３Ｔ中でのに
ｐｎ　　ＩとＳｐｅ夏との間の断片Ｍｌの連結反応。

プラスミドｐＢＦ１５８−０４Ｔが生じる。

ｉｖ）プラスミドｐＢＦ　１５８−０４Ｔ中でのＢａｇ
　Ｉ及びＫｐｎ　　Ｉとの間の断片Ｍ５の連結反応。

プラスミドｐＢＦ　１５Ｂ−０５Ｔが生じる。

■）プラスミドｐＢＦ１５８−０５Ｔ中でのＳａｃ　　
ＩとＥａｇ　　１との断片Ｍ４の連結反応。

プラスミドｐＢＦ　１５８−０６Ｔが生じる。

得られたクローンミーｖから夫々次の様なりローンを選
択する。それは夫々調べられた正しい配列中に組み込ま
れた新規断片が存在する点で夫々前駆体と異っている。

ｅ　）　ｓｃｕ−ＰＡ−構造遺伝子に関する合成断片Ｍ
２及び旧の組み込み。

ｐＢＦ　１５８−０８Ｔの構成 断片Ｍ２及びＭ３の組み込みに関してＰｓｔ　Ｉ−切断
が必要であり、これまで使用されていたプラスミドｐＢ
Ｆ１５８上にまだＰｓｔ　　Ｉ切断部位（アンピシリン
耐性遺伝子中に）□これは次のクローニングで妨害する
□が存在するので１次の様に処理する　（第７ａ〜７０
図）： ｌ）市販の（たとえばＰｈａｒｍａｃｉａ−）プラス果
ドｐｕｃ１９から、マルチ　クローニング　サイト及び
付加的に２１２ヌクレオチドを下流にＮｄｅｌＸ旧ｎｄ
■断片として除去する０次いで生じる裂は口中にプラス
ミドｐＢｐ　１５Ｂ−０４−３Ｔからの台底マルチクロ
ーニング　サイトをＮｄｅｌＸ旧ｎｄｌＩＩ断片として
連結する。このプラス主ドｐＢＦ　１５Ｂ−０４−３７
が、プラスミドｐＢＦ１５８−０２−Ｔ（例１ｄｉ参照
）からオリゴヌクレオチド断片間の組み込みによって得
られ、断片ＭｌのないプラスミドｐＢＦ　１５８−０４
Ｔに相当する。大腸菌に１２　ＪＭ１０３細胞中で形質
転換し、１５０μｇアンピシリン／１１１を有する培地
上で培養した後、プラスミドｐＵｃ１９−０４−３を含
有するクローンを選択する。これはｐＵｃ１９と長さ７
１２ヌクレオチドのＮｄｅｌＸ旧ｎｄＩ［Ｉ断片の存在
の点で異なる。

ｉｔ）　ｐＵｃ１９−０４−３から、　Ｐｓｔ　Ｉ　Ｘ
５ａｃ　Ｉ断片を除去し、線状化されたベクターを単離
し、オリゴヌクレオチド断片Ｍ３と連結する。大腸菌に
１２　ＪＭ１０３中で形質転換し、　　１５０ＩＩｇア
ンピシリン／Ｍ１を有する培地上で培養した後、プラス
ミドｐＵＣ１９−０７を含有するクローンを選択する。

これはｐＵＣ１９−０４−３と、正しい配列を有する断
片Ｍ３を含有する。長さ１８９ヌクレオチドのＰｓｔｌ
ＸＳａｃ　　Ｉ断片の点で異なる。

ｆｉｔ）　　上記プラスミドｐＵｃ１９−０７から、Ｎ
ｄｅＩＸＰｓｔ　　Ｉ断片を除去し、裂は目に断片能を
連結する。大腸菌に１２　ＪＭ１０３中で形質転換し、
■５０μｇアンピシリン／−を有する培地上で培養した
後。

プラスミドｐＵｃ１９−０８を含有するクローンを選択
する。これは、　ｐＵｃ１９−０７と正しく調べられた
配列を有する長さ２４６ｂｐのＮｄｅ　Ｉ　ＸＰｓｔ　
　Ｉ断片Ｍ２の存在の点で異なる。

ｉｖ）プラスミドｐＵｃ１９−０８から、断片能及び旧
をＮｄｅ　Ｉ　Ｘ５ａｃ　Ｉ断片として除去し、Ｎｄｅ
ｌＸＳａｃ　Ｉで切断後に得られるｐＢＦ１５８−０６
Ｔのより一層大きい部分中で連結する。大Ｉｌｉ菌に１
２　ＪＭ１０３中で形質転換し、１５０μｇアンピシリ
ン／−を有する培地上で培養後、プラスミドｐＢＦ１５
Ｂ−０８Ｔを含有するクローンを選択する。これはｐＢ
Ｆ１５Ｂ−〇６Ｔと長さ４３５ヌクレオチドのＮｄｏ　
　Ｉ　Ｘ５ａｃ　　１断片の存在の点で異なる。

ｆ）ブーｙｘミドｐＢＦ１６０の構成１合成Ｔｒｐ−プ
ロモーターの組み込み。

Ｔｒｐ−プロモーターの（９〉に記載された配列をＸｄ
ａ　Ｉ−切断部位まで引き継ぎ、５°−末端で配列５′
−ＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴ−３’　によって伸長する。

それによってＦ！ｃｏ　Ｒ１−切断部位を構成する。　
（第８図、断片Ｍｌ）　、　１本鎖０２１と０２１Ａを
やきもどし。

Ｂｃｏ　ＲＩＸＸｄａ　　Ｉ中で切断されたプラスミド
ｐＢＦ　１５８−０８Ｔを連結する（第９図）。大腸菌
に１２　ＪＭ１０３中で形質転換し、１５０μｇアンピ
シリン／−を有する培地上で培養した後、　ｐＢＦ１６
０を含有するクローンを選択する。プラスミドｐＢＰ１
６０は、すべての上記前駆体と、これで形質転換された
大腸菌細菌株がインドールアクリル酸の添加でｒｓｃｕ
−ＰＡの初期たん白質を駆出する点で異なる。

ｇ）発現テスト ｌ）発酵 種々のプラスミドｐＢＦ１６０で形質転換された大腸菌
株、たとえば大腸菌ＧＲＴ−ｌ　、大腸菌に１２　ＪＭ
１０３並びに大腸菌に１２＾ＴＣＣ３１４４６を、夫々
同一条件下で３８ｍＭ硫酸アンモニウム、　５６ｍＭ’
Ｊン酸塩緩衝液ｐＨ７，０，１ｍＭ硫酸マグネシウム、
１％酵母抽出物、１％ブドウ糖から成る培地□これはｌ
ｊ！あたり１５０ｍｇアンピシリンを含有する□中で発
酵し、６２請ｇインドールアクリル酸／ｌを用いてｒｓ
ｃｕ−ＰＡの初期たん白質の発現を誘導する。比較とし
て前記プラスミド□これはアトロイト５６２−細胞−ｔ
ａ　ＲＮＡ（１０）から得られるｃＤＮＡ−Ｂａｎｋか
らヒトプロウロキナーゼに関する遺伝子を含有し、これ
は表示ｐｔｌＫ　５４　ｔｒｐ　２０７−１である□を
有する前記菌株を形質転換し１次いで同一条件下で発酵
し、誘導する。

誘導前及び全体の６時間の誘導後の毎時間。

５７８ｎ−で光学密度（００）　１を有する細胞Ｑ濁液
１−に相当する細胞を遠心分離し９発現率のテストに使
用する。

ｉｉ）　ｒｓｃｕ−ＰＡへの初期たんばく質の逆戻り、
そのたん白質のｒｔｃｕ−ＰＡへの分解及び活性測定。

遠心分離された細胞を、上述した様に、リゾチームで溶
解し９次いで溶解された細胞の均−物を活性測定のため
に上述の様に使用する。

ｒｓｃｕ−ＰＡ（初期たん白質から得られる）から形成
されたｒｔｃｕ−ＰＡの活性測定によって検出された発
現率を、第１０図に示す。これから、プラスミドｐＢＦ
　１６０で形質転換された大腸菌の菌株は。

文献上公知のプラスミドｐＵＫ５４　ｔｒｐ２０？−１
（１０）で形質転換された同一の大腸菌−株に比して１
０−１５倍高い発現収率を生じることが分る。更に発現
収率は、すべての菌株中で形質転換に利用されるブラξ
ストに依存してほぼ同一値であることが明らかである。

すなわち特にプラスミドｐＢＦ１６０で形質転換された
菌株（個々の大腸菌−株と無関係に）は、常に公知のプ
ラスミドｐＵＫ５４ｔｒｐ２０？−１で形質転換された
同一菌株に比して数倍だけ高い発現率をもたらすことが
明らかである。

例２ ａ）Ｔｒｐ−プロモーターの調節下に合成ｓｃｕ−ＰＡ
−遺伝子を有するｒｓｃｕ−ＰＡの初期たん白質に関し
て発現プラスミドの構成。

プラス亀ドｐＢＲ３２２を、　Ｅｃｏ　Ｒ１と旧ｎｄｌ
ｌｌで切断する。生じる長さ３１ヌクレオチドの断片を
１分取アガロースゲル電気泳動によって分離する。

ｐＢＲ３２２の残存する部分を電気溶離によってゲルか
ら溶離し、グロマトグラフィーによってＤＥ５２を介し
て精製する。

プラスミドｐＢＦ１６０　（例Ｉｆ）を、同様にＥｃｏ
　Ｒ１及び旧ｎｄｌｌｌで切断し、長さ１６８４ヌクレ
オチドのＢｃｏＲＩＸ旧ｎｄｌ［［断片□これはすべて
の調節単位（Ｔｒｐ−プロモーター）を有する合成ｓｃ
ｕ−ＰＡを含有する□をアガロースゲル電気泳動によっ
て分離し、上述の様に溶離し、精製する。

得られた断片を常法でＴ４−リガーゼで結合し。

次いで大腸菌に１２　ＪＭ１０３中で形質転換する。

１５０μｇアンピシリン／−を有する培地上で培養した
後、長さ１６８４ヌクレオチドのｌＥｃｏＲＩＸＢｉｎ
ｄｍ断片を含有し、インドールアクリル酸の添加後ｒｓ
ｃｕ−ＰＡ−初期たん白質を産生ずるクローンを選択す
る。このクローンは、プラスミドｐＢＦ　１６１を含有
する。

ｂ）発現テスト 大腸菌ＧＲＴ−ｌ　、大腸菌に１２　Ｊ？１１０３及び
大腸菌に１２　ＡＴＣＣ３１４４６を、ρＢＦ１６１で
形質転換し１次いで例１ｇ）に記載した様に発酵し９発
現結果をテストする。誘発後１〜６時間ｒｔｃｕ−ＰＡ
−活性として測定されるｒｓｃｕ−ＰＡ−初期たん白質
の収率は。

形質転換のためにプラスミドｐＢＦ１６０を使用する第
１０図中に示した収率値と同等である。

例１ｇ１）に準じて遠心分離によって得られた細胞−ペ
レットを、　０．２５Ｍ　　Ｉ−リスｌＩＣｌ−緩衝液
（ｐＨ８，０）中で４％ＳＤＳ、　１％メルカプトエタ
ノール及び２０％グリセリンと共に煮沸しても溶解する
ことができる。この様に溶解されたたん白質を、　５Ｏ
５−ＰＡＧＥによって分離し、　Ｃｏｏ−ｍａｓｉｅｂ
ｌｕｅ染色（１２）によって視覚化する。染色されたゲ
ルをデンシトメトリーで評価し、ピーク下の面積を積分
する。インドールアクリル酸で誘導された後に形成され
たｒｓｃｕ−ＰＡ−初期たん白質の割合を、誘導後の初
期たん白質として同定されるバンドの面積から誘導前の
面積の引き算によって検出する。第１１図中に、大腸菌
に１２　ＪＭ１０３　Ｈｉ胞から得られるたん白質に関
するデンストダラムを示す０本例中で誘導後のｒｓｃｕ
−ＰＡ−初期たん白質の割合は、細菌全たん白’ｆｆ１
７．９重量％である。

他の例は表１中に記載する。

表１ 全たん白質あたりｒｓｃｕ−ＰＡ−初期たん白質の割合
〈％で） 菌− Ｋ　１２　ＡＴＣＣ３１４４６ Ｋ　　１２　ＪＭ　　１０３ ＲＴ−１ 形質転換 ＢＦ　１６１　　ＵＫ５４　ｔｒ　２０７−１（１０）
１４　　　　　　１．５ １７．９　　　　　１．９ １７８　　　　　１７ 例３ テトラサイクリン耐性構造遺伝子中で欠失を有するｐＢ
Ｒ３２２に於て、　Ｔｒｐ−プロモーターの調節下に合
成ｓｃｕ−ＰＡ−遺伝子を有するｒｓｃｕ−ＰＡの初期
たん白質に関する発現プラスミドの構成。

ａ）プラスミドｐＢＲ３２２ｄｅｌの構成プラスミドｐ
ＢＲ３２２をＥｃｏＲＶとＮｒｕ　　Ｉで切断する。生
じる大きさ７８７ヌクレオチドの断片をアガロースゲル
電気泳動によって除去し、　ｐＢＲ３２２の残部を電気
溶離によってゲルから溶離し。

ＤＥ５２を介して精製する。ｐＢＲ３２２ｔ！ｃｏＲＶ
ＸＮｒｕ　　Ｉ　−残部の平滑−末端を常法で１４−リ
ガーゼと連結する。大腸菌に１２　ＪＭ　１０３中で形
質転換し、１５０μｇアンピシリン／Ｉ１１を有する培
地上で培養した後９次のクローンを選択する：これらの
うち一部分は、２５μｇテトラサイクリン／−を有する
培地上に移した後この培地上で増殖しない。

すなわちテトラサイクリン耐性を有しない。このクロー
ンは、プラスミドｐＢＲ３２２ｄｅｌを含有し、これは
ｐＢＲ３２２と、７８７ヌクレオチド小さいかつＥｃｏ
　ＲＶ及びＮｒｕ　Ｉによってもはや切断されない点で
異なる。

ｂ）プラスミドｐＢＦ　１６２の構成 ｐＢＲ３２２ｄｅｌをＢｃｏ　Ｒ１及び旧ｎｄＩ［Ｉで
切断する。

生じる長さ３１ヌクレオチドの断片を分取アガロースゲ
ル電気泳動によって分離し、　ｐＢＲ３２２ｄｅｌの残
部を電気溶離によってゲルから溶離し。

Ｄｌｌ！５２を介して精製する。

ｐＢＦ１６０から、　１６８４ヌクレオチド長いＥｃｏ
ＲＩＸ旧ｎｄｌ［［断片−これはすべての調節単位（Ｔ
ｒｐ−プロモーター〉を有する合成ｓｃｕ−ＰＡ−遺伝
子を含有するーが同一方法で得られる。

２つの断片を、常法でＴ４−リガーゼと連結し。

次いで大腸菌に１２　ＪＭ１０３細胞中で形質転換する
。

１５０μｇアンピシリン／−を有する培地上で培養後、
長さ１６８４ｂｐの［！ｃｏＲＩＸ旧ｎｄｌ［Ｉ断片を
含有し、６２μｇインドールアクリル酸／ｄの添加後ｒ
ｓｃｕ−ＰＡ−初期たん白質を産生ずるクローンを選択
する。このクローンは、プラスミドｐＢＦ１６２を含有
する。

Ｃ）発現テスト 大腸菌ＧＲＴ−ｌをｐＢＦ１６２で形質転換し１次いで
例１ｇ）に記載した様に発酵し１発現結果をテストする
＠　ｒｔｃｕ−ＰＡ−活性として誘導後６時間測定され
るｒｓｃｕ−ＰＡ−初期たん白質の収率は、光学密度１
を有する細胞懸濁液１３００ＰＵ／ｄであり、第１Ｏ図
中に大腸菌ＣＲＴ−ｌをプラスミドｐＢＦ１６０で形質
転換後の発現に関して示された収率値と同等である。

例４ ａ）Ｔａｃ−プロモーターの調節下に１合成ｓｃｕ−Ｐ
Ａ−遺伝子を有するｒｓｃｕ−ＰＡの初期たん白質に関
して発現プラスミドｐＢＰ１７１の構成。

プラスミドｐＢＦ１６１をＥｃｏ　Ｒ１とＸｂａ　　Ｉ
で切断する。生じる長さ７４ヌクレオチドの断片を分取
アガロースゲル電気泳動によって分離し、プラスミドの
残部を電気溶離によって溶離し３次いでＤＥ５２を介し
て精製する。

プラスミドｐｔａｃ　ＳＤＴ（ＤＳＭ　５０１Ｂ）から
、　Ｔａｃ−プロモーターを含有するＨｃｏ　ＲＩＸＸ
ｂａ　　Ｉ断片を単離する。更にｐｔａｃ　ＳＤＴをＥ
ｃｏ　ＲＩＸＸｂａ　　Ｉで切断し、断片を分取ＰＡＧ
Ｅによって分離する。断片を酢酸アンモニウム７ｓｏｓ
−緩衝液（ｐ）１８．０）中で６５℃に加熱して９機械
的に粉砕されたポリアクリルアミドから溶離し、ＩＭＩ
−リスー緩衝ン夜（ｐｌ（８）で飽和されたフェノール
で数回抽出して精製する。

２つのこの様にして得られた断片を、常法でＴ４−リガ
ーゼと連結し２次いで大腸菌に１２　Ｊｌ’１１０３中
で形質転換する。１５０μｇアンピシリン／−を有する
培地上で培養後、　ＩＰＴＧの添加後ｒｓｃｕ−ＰＡ−
初期たん白質を産生ずるクローンを選択する。このクロ
ーンは、プラスミドルＨＦ１フ１を含有する。

ｂ）発現テスト 大腸菌に１２　ＪＭ１０３をｐＢＦ１７１で形質転換し
１次いで例１ｇ）中に記載した様に発酵し９発現結果を
テストする。しかし誘導をＩ　ＰＴＧで行う　（最終濃
度０．５ｍＭ）。

誘発１ｓｔ１〜６時間のｒｔｃｕ−ＰＡ−活性として測
定されるｒｓｃｕ−ＰＡ−初期たん白質の収率を、第１
２図中に示す、これは、プラスミドｐＢＦ１６０を同一
の大腸菌株中に使用する第１０図中に示した収率値と同
等である。

例５ ａ）テトササイクリン耐性構造遺伝子に欠失を有するｐ
ＢＲ３２２中で、　Ｔａｃ−プロモーターの調節下に合
成ｓｃｕ−ＰＡ−遺伝子に関する発現プラスミドルＨＦ
１フ２の構成 プラスミドｐＢＲ３２２ｄｅｌ　（例３ａ参照）をＥｃ
ｏ　Ｒ１×旧ｎｄｌで切断する。生じる長さ３１ヌクレ
オチドの断片を分取アガロースゲル電気泳動によって分
離し、　ｐＢＲ３２２ｄｅｌ−残部を電気溶離によって
ゲルから溶離し９次いでＤＥ５２を介して精製する。

ｐＢＦ１７１　（例４ａ）から＋　Ｅｃｏ　ＲＩＸＨｉ
ｎｄＩ［ｌ断片−一これはすべての調節単位（Ｔａｃ−
プロモーター）を有する合成ｓｃｕ−ＰＡ−構造遺伝子
を含有するｍ−が、同一方法で得られる。

２つのこの様にして得られた断片を、常法でＴ４−リガ
ーゼと連結し２次いで大腸菌）［１２ＪＭ１０３細胞中
で形質転換する。１５０μｇアンピシリン／−を有する
培地上で培養後、　０．５ｍＭ　ＩＰＴＧｒｓｃｕ−Ｐ
Ａ−初期たん白質を産生ずるクローンを選択する。この
クローンは、プラスミドルＨＦ１フ２を含有する。

ｂ）発現テスト 大腸菌に１２　ＪＭ１０３を、　ｐＢＰ１７２で形１ｔ
ｌ云換し。

次いで例１ｇ）に記載した様に発酵し１発現結果をテス
トする。しかし誘導をＩＰＴＧ　（最終濃度０、５ｍＭ
）で行う。誘導後１〜６時間のｒｔｃｕ−ＰＡ−活性と
して測定されたｒｓｃｕ−ＰＡ−初期たん白質の収率は
、光学密度１の約１１００Ｐｔｌ／ｄｌｌｌｆ！！懸濁
液であり、プラスミドｐＢＦ１６０を同一大腸菌株中に
（吏用する第１０図中に示した収率値と同等である。

例６ ｒｓｃｕ−ＰＡ−初期たん白質に関する発現プラスミド
中で、　ＳＤ配列と開始コドンの間の距離の変イヒ例１
−５に記載した。すべての構造中での開始コドン＾ＴＧ
は、　Ｎｄｅ　Ｉ−切断部位−ＣＡＴＡＧ−の成分であ
る。Ｎｄｅｌは、ヘキサヌクレオチド配り１１の最初の
への後を切断し、２つの塩基だ番ナカベ突出する５“−
末端を生じる。３゛−末端を補充する。すなわち平滑末
端を構成し、その後再び連結した場合。

当該配列を２塩基対だけ伸長する。同時にＮｄｅ　１一
部位を除く、第１３図から明ら力）なイ渋に、そこに記
載された桐生でＳ、Ｄ、配列から開始コドンまでの距離
を８塩基対から１０塩基対に伸長する・下言己に実験に
よる実施を桐生で説明する： ａ）プラスミドｐＢＦ　１６３の構成 プラスミドｐＢＲ３２２をＮｄｅ　Ｉで切断し９次し）
で突出する末端をＤＮＡ−ポリメラーゼ■のクシノー断
片で補充する（２）、その後ＤＮＡを通常Ｔ４−ＩＪガ
ーゼで連結し１次いで大腸菌に１２　ＪＭ１０３中で形
質転換する。アンピシリン含有培地上で培養後、プラス
ミドｐＢＦ１６３を含有するクローンを選択する。これ
はｐＢＦ１６１とＮｄａ　Ｉ一部位の欠損及び先のＮｄ
ｅ　　ｌ一部位の範囲で付加的な塩基−ＴＡ−の点で異
なる（第１３図参照）。

ｂ）発現テスト 大腸菌ＧＲＴ−ｌを、プラスミドｐＢＦ１６３で形質転
換し１次いで例１ｇ）に記載した様に発酵し０発現結果
をテストする。逆戻りし、　６２ｍｇインドールアクリ
ル酸／１で誘導後１〜６時間光学密度１を有する細胞懸
濁液−あたりｒｔｃｕ−ＰＡ−活性として活性化した後
に測定されたｒｓｃｕ−ＰＡ−初期単白譬の収率を、第
１４図中に示す。これは、プラξストｐＢＦ１６０を大
腸菌の同−株中に使用する第１０図中に示した収率値と
同等である。

文献 （１）ヴインナカー（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ）、　Ｅ、Ｌ
、”遺伝子及びりｏ−ン”、　ＶＣ）Ｉ出版、　　ヴア
インハイム、　１９８５゜第２９８頁 （２）マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、　Ｔ、＋　フ
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　　レッニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）、　Ｗ、Ｓ、　
　：Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３８．７０５７１４　
　（１９７９） （６）ショルマイヤー（Ｓｃｈｏｌｌｍｅｉｅｒ）、　
Ｋ、、ゲルドナー（Ｇａｒｔｎｅｒ）、　ｏ、ｌヒレン
（旧１１ｅｎ）、　Ｗ、　：　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ、ｉｄｓ　Ｒｅｓ、１３．４２２７−４２３７　（
１９８５）（７）アダムス（Ａｄａｍｓ）＋　Ｓ、Ｐ、
カプヵ（Ｋａｖｋａ）　＋に、Ｓ、、ヴイケス（Ｗｙｋ
ｅｓ）、　Ｅ、１．ホルダー（Ｈｏｌｄｅｒ）、　Ｓ、
Ｂ、＋ガルピ（Ｇａｌｌｕｐｉ）、　Ｇ、Ｒ，：Ｊ、　
八−、Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、　　上０５．　６６１−
６６３　　（１９８３）（８）クリスティ（Ｃｈｒｉｓ
ｔｆｅ）、　Ｇ、Ｅ、、　ファルンハム（Ｐａｒｎｈａ
＊）、　ｐ、１１プラト（Ｐｌａｔｔ）、　Ｔ、　　：
　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７８．
４１８０−４１８４（１９８１）（９）デボ−エル（Ｄ
ａ　Ｂｏｅｒ）＋　Ｈ，Ａ、＋コムストク（Ｃｏｍｓｔ
ｏｃｋ）、　Ｌ、Ｊ、、バアサー（Ｖａｓｓｅｒ）＋　
Ｍ、　：Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＩＪＳＡ　　８０＋　２ｌ−２５（１９８３） （１０）ホームズ（Ｈｏｌｍｅｓ）、　Ｗ、Ｅ、、ペニ
ヵ（Ｐｅｎｎｉｃａ）　。

Ｄ、、ブラバー（Ｂｌａｂｅｒ）、　Ｍ、＋　　レイ（
Ｒｅｖ）　。

Ｍ、Ｗ、、ギュンツェラー（Ｇｕｎｚｌｅｒ）、　Ｗ、
Ａ、＋シュテフェンス（Ｓｔｅｆｆｅｎｓ）、　Ｇ、Ｊ
、、ヘイネッカー（Ｈｅｙｅｃｋｅｒ）、　ｎ、ｔ、、
　：　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　３＋　９２３−９２９
（１９８５） （ＩＩ）ヴインクラー（Ｗｉｎｋｌｅｒ）、　Ｍ、Ｉｌ
！、＋ブラバー（Ｂｌａｂｅｒ）、　Ｍ、　：　Ｂｉｏ
ｃｈｅｌｌ、２５．４０４１−４０４５（１９８６）（
１２）ブラケスレイ（Ｂｌａｋｅｓｌｅｙ）、　Ｒ，Ｗ
、＋ボエッ（Ｂｏｅｚｉ）、　Ｊ、Ａ、　　：　Ａｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、８２５８０−５８２（１９７７
）

【図面の簡単な説明】

本発明によるプラスミドを、第１図〜第１５図によって
示す： 第１ａ〜ｌｂ図は、市販のプラスミドｐＢＲ３２２から
のプラスミドｐＢＦ　１５Ｈの構造を示す。 第２図は９合成“マルチ　クローニング　サイトのヌク
レオチド配列を示す。 第３図は、プラスミドｐＢＦ１５８−０１の構造を示す
。 第４図は、プラスミドｐＢＦ１５Ｂ−０１７の構造を示
す。 第５ａ〜５ｇ図は、ヒトｓｃｕ−ＰＡに関して照号づけ
する遺伝子に対する合成断片のヌクレオチド配列を示す
。 第６ａ〜６ｃ図は、プラスミドｐＢＦ　１５Ｂ−０２７
−ｐＢＦ１５Ｂ−０６の構造を示す。 第７ａ〜７ｃ図は、プラス旦ドｐＢＦ　１５Ｂ−０８７
の構造を示す。 第８図は１合成Ｔｒｐ−プロモーターのヌクレオチド配
列を示す。 第９図は、ヒトｒｓｃｕ−Ｐ＾の初期たん白質に関する
発現プラスミドの構造ｐＢＦ　１６０を示す。 第１０図は、　Ｔｒｐ−プロモーターの調節下にヒトｒ
ｓｃｕ−ＰＡの初期たん白質の発現率を示す。 第１１図は、　ｐＢＦ　１６１で形質転換された大腸菌
に１２　ＪＭ１０３−細胞からのたん白質の５ＯＳ−Ｐ
ＡＧＥのデンジドグラムを示す。 第１２図は、　Ｔａｃ〜プロモーターの調節下にヒトｒ
ｓｃｕ−Ｐ＾の初期たん白質の発現率を示す。 第１３図は、　５０−配列と開始コドンＡＴＧとの間の
距離を８から１０塩基に伸長することを示す。 第１４図は、　Ｔｒｐ−プロモーターの調節下にヒトｒ
ｓｃｕ−ＰＡの初期たん白質の発現率を示す。 第１５ａ〜１５ｂ図は、　ｓｃｕ−ＰＡ−構造遺伝子の
完全なヌクレオチド配列を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）プラスミノーゲンアクチベーターを収得するのに使
   用するプラスミドに於て、そのオペロンは、調節可能な
   プロモーター、リボソーム結合部位として有効なＳＤ配
   列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ−Ｓｅｑｕｅｎｚ）
   、開始コドン、４１１アミノ酸残基を含有する１本鎖の
   ウリン−プラスミノーゲンアクチベーター“ｓｃｕ−Ｐ
   Ａ”に関する合成構造遺伝子及び構造遺伝子の下流に１
   〜２個のターミネーターを有し、かつこのプラスミドは
   腸内細菌中で、好ましくは大腸菌株中でのｒｓｃｕ−Ｐ
   Ａ−初期プロティン−発現に適することを特徴とする、
   上記プラスミド。 ２）ＳＤ配列と開始コドンの間の距離は、６−１２、好
   ましくは８−１０ヌクレオチドである請求項１記載のプ
   ラスミド。 ３）調節可能なプロモーターは、Ｔｒｐ−又はＴａｃ−
   プロモーターである請求項１又は２記載のプラスミド。 ４）調節可能なプロモーターは、第８図によるヌクレオ
   チド配列を有する合成Ｔｒｐ−プロモーターである請求
   項３記載のプラスミド。 ５）調節可能なプロモーターは、プラスミドｐｔａｃＳ
   ＤＴ（ＤＳＭ　５０１８）からのＴａｃ−プロモーター
   である請求項３記載のプラスミド。 ６）オベロン中の連続ターミネーターとしてＴｎ１０か
   らのｔｒｐＡターミネーター及び（又は）ｔｅｔＡ／ｏ
   ｒｆＬターミネーターが存在する請求項１ないし５のい
   ずれかに記載したプラスミド。 ７）構造遺伝子中でコドンとしてアルギニンに関しては
   トリプレットＣＧＴ、ロイシンに関してはトリプレット
   ＣＴＧ、バリンに介してはトリプレットＧＴＴ、プロリ
   ンに関してトリプレットＣＣＧ及び（又は）グリシンに
   関してはトリプレットＧＧＴを使用する請求項１ないし
   ６のいずれかに記載したプラスミド。 ８）構造遺伝子は第１５図によるヌクレオチド配列を有
   する請求項１ないし７のいずれかに記載したプラスミド
   。 ９）ｎｉｃ／ｂｏｍ−領域が除かれたプラスミドｐＢＫ
   ３２２中にオペロンを有する請求項１ないし８のいずれ
   かに記載したプラスミド。 １０）オペロンをプラスミドｐＢＫ３２２中に有し、こ
   のプラスミドからテトラサイクリン耐性遺伝子の全部又
   は一部は、このプラスミドがこれを用いて形質転換され
   る菌株にテトラサイクリン耐性を与える能力がない程度
   に除かれている請求項１ないし８のいずれかに記載した
   プラスミド。 １１）オペロンをプラスミドｐＢＲ３２２中に有し、こ
   のプラスミドからｎｉｃ／ｂｏｍ−領域は除かれ及びこ
   のプラスミドは、これを用いて形質転換される菌株にテ
   トラサイクリン耐性を与える能力のない、テトラサイク
   リン耐性遺伝子の少なくとも１個の部分が除かれている
   請求項１ないし９のいずれかに記載したプラスミド。 １２）合成Ｔｒｐ−プロモーターの調節下に合成ｓｃｕ
   −ＰＡ−遺伝子を有する、プラスミドｐＢＦ１６０ｐＢ
   Ｆ１６１、ｐＢＦ１６２及びｐＢＦ１６３である請求項
   １又は４記載のプラスミド。 １３）プラスミドｐｔａｃＳＤＴ（ＤＳＭ５０１８）か
   らのＴａｃ−プロモーターの調節下に合成ｓｃｕ−ＰＡ
   −遺伝子を有するプラスミドｐＢＦ１７１、ｐＢＦ１７
   ２及びｐＢＦ１７３である請求項１又は５記載のプラス
   ミド。 １４）制限酵素地図１ｔ（第９図）を有するプラスミド
   ｐＢＦ１６０である請求項１記載のプラスミド。 １５）大腸菌、好ましくは亜族大腸菌Ｋ１２の株中に、
   形成された全たん白質少なくとも１０重量％の発現率で
   ｒｓｃｕ−ＰＡ−初期たん白質の形成を生じさせる請求
   項１ないし１４のいずれかに記載したプラスミド。 １６）大腸菌、好ましくは亜族大腸菌Ｋ１２の株中に、
   形成された全たん白質少なくとも１４重量％の発現率を
   有するｒｓｃｕ−ＰＡ−初期たん白質の形成を生じさせ
   る請求項１２ないし１４のいずれかに記載したプラスミ
   ド。 １７）大腸菌、好ましくは亜族大腸菌Ｋ１２の株中で形
   成された全たん白質１０〜２５重量％、特に１４〜２０
   重量％の発現率を有するｒｓｃｕ−ＰＡ−初期たん白質
   の形成を生じさせる請求項１ないし１６のいずれかに記
   載したプラスミド。 １８）ｎｉｃ／ｂｏｍ−領域及び（又は）少なくとも１
   個のテトラサイクリン耐性遺伝子の部分が除かれたプラ
   スミドｐＢＲ３２２中に、切断部位ＥｃｏＲ I とＨｉ
   ｎｄIIIとの間に第２図に記載したヌクレオチド配列を
   有する“マルチクローニングサイド” を挿入し、これを用いて公知の方法で転写ターミネータ
   ー、ｓｃｕ−ＰＡ−構造遺伝子の合成部位配列、好まし
   くは構造遺伝子の３′Ｃ−終点から開始する配列、並び
   に合成Ｔｒｐ−プロモーターを組み込むことを特徴とす
   る、請求項１記載のプラスミドの製造方法。１９）請求
   項１８に従って得られたプラスミドからのＥｃｏＲ I
   ×ＨｉｎｄIII断片を、発現カセットとして他の、腸内
   細菌中、好ましくは大腸菌中で自律的増殖可能なプラス
   ミド中に公知の方法で挿入する請求項１記載のプラスミ
   ドの製造方法。 ２０）請求項１８又は１９に従って得られたプラスミド
   をＮｄｅ I で切断し、生じる切断部位を補充し、次い
   で生じる平滑末端を連結する、ＳＤ−配列と開始コドン
   との間の伸長された距離を有する、請求項１記載のプラ
   スミドの製造方法。 ２１）プラスミドを用いて腸内細菌−株、好ましくは大
   腸菌株を公知方法で形質転換し、ｓｃｕ−ＰＡ−構造遺
   伝子の発現を誘導し、形成されたｓｃｕ−ＰＡ−初期た
   ん白質から培地及び溶解された細菌細胞を分離し、初期
   たん白質を溶解し、次いでレドックス−系の作用によっ
   てｒｓｃｕ−ＰＡに逆戻りすることを特徴とする、プラ
   スミノーゲンアクチベーターの収得で請求項１記載のプ
   ラスミドを使用する方法。 ２２）プラスミドを用いて大腸菌−種、好ましくは大腸
   菌−Ｋ１２−株を形質転換し、次いで請求項２１に従っ
   て処理する請求項２１記載の使用方法。