NO844099L - Syntetiske polypeptider fra virale oncogener - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår kjemisk syntetiserte polypeptider og deres konjugater bundet til en bærer, og nærmere bestemt antigeniske, syntetiske polypeptider og deres konjugater som hovedsakelig svarer til en determinantdel av et protein kodet av begge av to oncogener.

Bakgrunn

Oncornavirus er en familie av virus som kan fremkalle forskjellige typer av neoplasia (f.eks. leukemi, lymphomas, sarcomas og lignende) i fugler og laverestående dyr slik som mus og katter. Størstedelen av oncornavirus er retrovirus som inneholder en enkel streng av RNA som det genomiske materiale istedenfor DNA.

Det enkeltstrengede RNA-genom i hvert av disse virus

gir opphav til et dobbeltstrenget DNA-molekyl etter at viruset infiserer en mottakelig vert. Denne DNA-kopi av det virale genom innfører deretter seg selv permanent inn i et kromosom av den infiserte celle og mangfoldiggjøres i dette vert-kromosom.

Enkelte medlemmer av retrovirusfamilien er sterkt oncogene som bedømt ved deres evne til å fremkalle dannelse av faste tumorer i løpet av et kort tidsrom etter at de er inokulert i verten. Disse virus kan også fremkalle "cancer-øse" forandringer i cellevekst i kultur i laboratoriet, og slike forandringer kalles "transformasjon" og gir en på-litelig in vitro biologisk bestemmelse for oncogene virus. Flere slike virus er blitt isolert fra kyllinger, kalkuner, mus, rotter, katter og aper.

Et enkelt gen, oncogenet, lokalisert på genomet av

disse sterkt oncogene virus, er ansvarlig for virusets tumorgene styrke. Når det gjelder flere virus, er proteinproduktene fra deres oncogener, angitt her som oncoproteiner, blitt immunologisk identifisert ved å trekke fordel av det faktum at serum fra et dyr som bærer en virus-fremkalt tumor, inneholder antistoffer rettet mot oncoproteinet som er kodet av viruset oncogen.

En hurtig økende mengde av bevis indikerer at oncogenene av retrovirus er nært beslektet med og avledet fra spesifikke genetiske loci (lokaliseringer) i den normale, cellulære genetiske informasjon i alle hvirveldyr. Mole-kylære hybridiseringsstudier under anvendelse av spesifikke nucleinsyreprøver i løpet av midten av 1970-årene, etterfulgt av genetisk kloning av virale oncogener og deres cellulære slektninger ved rekombinant DNA-teknologi har fastslått slektsskapet mellom retrovirale oncogener (v-onc) og cellulære oncogener (c-onc) som finnes i alle normale hvirvel-dyrceller.

De cellulære oncogener er tilstede i mange arter som er utviklingsmessig beslektet, mens de virale oncogener er van-ligvis spesifikke som isolert fra bestemte arter. Ennvidere er homologien mellom v-onc og det cellulære DNA antatt å være størst for opprinnelsesarter av et bestemt virus. Disse observasjoner antyder av retrovirale oncogener representerer forsvundne og/eller delvis omvandlede cellulære gener som er inkorporert i genomene av overførbare, infektiøse midler, retrovirusene.

Molekylæranalyse av nesten to dusin retrovirus som hittil er blitt isolert, har fastslått mere enn et dusin forskjellige oncogener som hver er særpreget ved dets nucleotidsekvens, og hver med en tilsvarende cellulær oncogen homolog. Selv om antallet av slike virale oncogener nærmest synes å øke parallelt med isoleringen av nye oncogene retrovirus, kan det endelige antall ikke være meget stort. Eksempelvis er det samme v-onc for et c-onc angitt som fps av fugleopprinnelse, representert minst to ganger blant et begrenset antall av fugle-retrovirusisolater; og dets pattedyr-kognat angitt fes i kattearter, er funnet i to forskjellige stammer av katte-sarcomavirus.

Uten hensyn til det totale antall som endelig finnes, kan c-onc-gener utgjøre en multigen familie, hvilket er tilfelle for gener av mange polypeptidhormoner, immunglobulinene, histoforenelige antigener og lignende. Den tilsynelatende strukturelle individualitet av medlemmer av den oncogene familie, slik som uttrykt ved nucleotidsekvensen, kan skjule felles opprinnelse og beslektede funksjoner.

Oncoproteiner kodet av minst 8 forskjellige medlemmer av en familie på bare ca. to dusin forskjellige virale oncogener, utviser en felles funksjon. Disse har nemlig evnen til å katalysere en fosfo-overføringsreaksjon, fosforylering av selektive proteiner, i særdeleshet ved amino-syren tyrosin. Disse fosforyleringsreaksjoner innbefatter autofosforylering.

Oncoproteiner fra andre oncovirus er blitt vist å

ta del i ytterligere reaksjonstyper. Eksempelvis er produktet av et ras-gen blitt vist å binde et nucleosid-trifosfat, GTP. Produktet av oncogenet mye er blitt funnet å binde DNA i cellekjernen. [Donner et al., Nature, 296, 262-266 (1982); Abrams et al. Cell, 29, 427-439 (1982).]

Det faktum at normale celler inneholder en familie

av oncogener (c-onc) i deres kromosomer, understøtter klart en mekanisme forskjellig fra infeksjon med oncogene virus som årsaken til neoplasia i dyr og mennesker. Denne mekanisme kan innbefatte "aktivering av ett eller flere cellulære oncogener av miljømessige carcinogener og av andre muta-sjonstilfeller. Eksperimentelle bevis understøtter klart den teori at aktivering av allerede karakteriserte og ennå uidentifiserte cellulære oncogener kan forbindes med en neoplastisk tilstand i pattedyr og fugleceller.

Ved en nærmere undersøkelse av retrovirus observeres at disse omfattes primært av en enkelstrenget RNA omgitt av et proteinbelegg. Ved infeksjon av en vertcelle avskrives det virale RNA "bakover" til DNA av et enzym kalt revers trans.criptase. Det således fremstilte DNA integreres der-efter i den infiserte celles genom med det resultat at de virale gener replikeres sammen med cellulære gener, og proteinproduktene som er kodet av det virale gen, produseres av vertcellen. Det bemerkes at proteinet kodet av det virale oncogen og som har et tilsvarende, homologt gen innen vertcellen, generelt ikke er tilstede i den viruspartikkel som infiserer cellen, men bare uttrykkes etter infeksjon.

Omformingen av celler i kultur gir bevis for at et virus inneholder et oncogen, og at oncoviruset kan fremkalle neoplasia in vivo i enkelte celler av en dyrevert. Virusets evne til å omdanne en dyrket celle, anvendes her som et karakteristikon på et oncogent virus. Virus som ikke omdanner celler i kultur, er blitt funnet å mangle oncogener og fremkaller tumorer ved en forskjellige mekanisme.

Således oppstår det et bilde på hvordan et oncogent virus som bærer et uutrykt gen for et protein, infiserer cellen og forårsaker at cellen produserer bl.a. oncoproteinet som var uutrykt i viruset. Den infiserte celle inneholder også et normalt tilstedeværende gen for et oncoprotein. Ved et gitt tidspunkt i dens eksistens kan cellen produsere et oncoprotein som er homologt med det oncoprotein som er kodet av det infiserende oncovirus. Nylige arbeider har illustrert at proteinet kodet av det cellulære oncogen, c-onc, kan finnes i små mengder i friske celler, og at cellulært protein også angis som et oncoprotein.

En nylig teori fremholder at forskjellen mellom en normal celle og en oncogent omformet eller neoplastisk celle ligger i effekten bevirket av den økede mengde av naturlig forekommende oncoprotein som er kodet av både det virale oncogen og det cellulære oncogen. Hvis således produksjonen av oncoproteinet kunne reduseres eller hvis dets effekt på cellen, f.eks. fosforylering, kunne reduseres mot det normale nivå, kunne neoplasia av den infiserte celle reduseres eller elimineres.

Diskusjoner angående teknikkens stand vedrørende oncogene retrovirus kan finnes i følgende artikler: Bishop,

Cell, 23, 5-6 (1981); Bishop, Scientific American, mars, 81-92

(1982); Cooper, Science, 218, 801-806 (1982); og Weiss, Nature, 299, 9-10 (1982) .

Virale og cellulære oncogener er av vitenskapelig interesse, men er av liten verdi i seg selv når det gjelder behandling og diagnostiske reagenser for neoplastiske til-stander. Oncoproteinet kodet av et cellulært eller viralt oncogen, er også av interesse, men det er vanskelig å frem-stille i anvendbare mengder, og slik fremstilling - selv når denne utføres under anvendelse av avanserte teknikker innen genetisk konstruksjon - kan føre til proteiner som er foru-renset med produkter fra den cellulære fremstilling av dette protein.

På den annen side er det nylig funnet at et patogen-beslektet protein kan immunologisk etterlignes ved fremstilling av et syntetisk polypeptid hvis sekvens svarer til den av et determinantområde av det patogen-beslektede protein. Slike observasjoner er rapportert av Sutcliffe et al.,

Nature, 287, 801-805 (1980); Doolittle et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., TT_, 5197-5201 (1980); Lerner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 78, 340-347 (1981) og Baltimore et al., Cell, 28, 395-404 (1982). Slike syntetiske antigener er også beskrevet i US patentsøknad 24 8 059, Lerner et al., inn-levert 27. mars 1981.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot visse syntetiske polypeptider som har spesielle karakteristika og egenskaper,

og mot produkter som gjør bruk av disse syntetiske polypeptider. Selv om foreliggende syntetiske polypeptider og de nye produkter fremstilt derfra kan fremstilles under anvendelse av den generelle teknologi som er beskrevet i de ovenfor angitte publikasjoner, er de syntetiske polypeptider i seg selv, deres særpregede egenskaper, produkter fremstilt fra og med disse og metoder for anvendelse av disse, hverken beskrevet eller forslått i de ovenfor angitte publikasjoner.

Kort sammendag av oppfinnelsen

Et syntetisk polypeptid ifølge oppfinnelsen har en aminosyrerestsekvens svarende hovedsakelig til en aminosyresekvens av et determinantområde av et oncoprotein kodet av et oncogent virus. Determinantområdet, innbefattende den aminosyresekvens som er blitt valgt til å bli syntetisert, er tilstøtende til, men uten et aktivt sete av oncoproteinet. Dette polypeptid er i sin helhet fritt for en aminosyrerestsekvens som tilsvarer dette oncoproteins aktive sete, men er enten alene eller som et konjugat bundet til en bærer, i stand til å fremkalle produksjonen av antistoffer når det injiseres i en vert.

De således dannede antistoffer, som også omfattes av oppfinnelsen, og som er små deler inneholdende idiotypiske regioner, inhiberer en reaksjon ved dette oncoproteins aktive sete slik som katalysen av fosforoverføring. Disse antistoffer er også i stand til immunoutfelling av oncoproteinet når de blandes med dette. I tillegg kan disse antistoffer reagere konkurrerende med en blanding inneholdende det syntetiske polypeptid eller dets konjugat og et annet oncoprotein med et homologt determinantområde tilstedeværende i en kroppskomponent av et tumor-bærende dyr, hvor tumoren er forskjellig fra den som fremkalles av det oncogene virus.

Det ovenfor angitte polypeptid kan også anvendes som

en del av et diagnostisk preparat for påvisning av nærvær av neoplastisk sykdom, såvel som ved en metode for inhibering av veksten av neoplastiske celler og ved vaksinering av celler mot neoplastisk vekst.

Et diagnostisk reagenssystem ifølge oppfinnelsen er anvendbart for påvisning av nærvær av en forøket mengde av oncoprotein sammenlignet med den mengde av dette oncoprotein som normalt er tilstede. Dette system omfatter i separate beholdere (a) et første reagens og (b) et andre reagens,

begge i biologisk aktiv form, sammen med indikerende grupper.

Det første reagens inneholder det ovenfor beskrevne syntetiske polypeptid, eller et konjugat fremstilt derfra.

Det andre reagens innbefatter polyamider inneholdende idiotypiske regioner av antistoff dannet mot det syntetiske polypeptid eller dets konjugat. Indikerende grupper er også tilveiebrakt til systemet og kan i begynnelsen være bundet til eller være fri fra det ene eller andre av de to reagenser.

Blanding av på forhånd bestemte mengder av det første

og andre reagens i nærvær av en på forhånd bestemt mengde av en kroppskomponent som skal bestemmes, resulterer i en grad av immunoreaksjon. Graden av den således dannede immunoreaksjon, er forskjellig fra en kjent immunoreaksjonsgrad når en forøket mengde av oncoprotein er tilstede i kroppskomponenten. Graden av immunoreaksjon nedsettes typisk når en forøket mengde av oncoproteinet er tilstede i kroppskomponenten, sammenlignet med den vanlige tilstedeværende mengde. Eksempler på diagnostiske reagenssystemer innbefatter enzym-kjedet immunosorbentbestemmelser (ELISA) hvori indikatorgruppen er et enzym slik som pepperrot-peroxydase som er bundet til det oven-nevnte antistoff eller et annet antistoff, og radioimmuno-

bestemmelser hvori den indikerende gruppe er et radioaktivt

125

element slik som I tilstedeværende enten i det syntetiske polypeptid eller i antistoffet dannet dertil.

En særlig fordel ved oppfinnelsen er at dens produkter og metoder kan anvendes for å inhibere veksten av neoplastiske celler. Således kan veksten av neoplastiske celler med cellulære eller virale oncoproteiner på deres overflater inhiberes ved at de neoplastiske celler bringes i kontakt med en effektiv mengde av de ovenfor beskrevne antistoffer, og at denne kontakt opprettholdes under dannelse av immunkomplekser mellom antistoffene og oncoproteinmolekylene.

En annen fordel ved oppfinnelsen er at dens produkter

og metoder kan anvendes for å vaksinere dyr mot neoplastisk cellevekst. Her tilveiebringes en vaksine inneholdende det ovenfor beskrevne syntetiske polypeptid eller et konjugat fremstilt fra polypeptidetri en fysiologisk akseptabel bærer. Vaksinen injiseres deretter i en effektiv mengde i blod-strømmen på det dyr som skal immuniseres.

Oppfinnelsen gir flere ytterligere fordeler. En fordel ved oppfinnelsen er at bruk av de syntetiske polypeptider fore-bygger behov for nærvær av dets tilsvarende intakte oncoprotein. Følgelig vil forurensninger slik som cellulære nedbrytnings-produkter og toksiner som er forbundet med produksjonen av anvendbare mengder av virale proteiner fra bakterier, ikke være tilstede i produktet ifølge oppfinnelsen.

Andre fordeler ved oppfinnelsen er at dens produkter og metoder kan anvendes for å påvise nærvær av neoplastiske celler i en vert.

Ytterligere fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå fra den etterfølgende detaljerte beskrivelse, eksempler og patentkrav.

Kort beskrivelse av tegningene

I tegningene som utgjør en del av foreliggende beskrivelse, er fig.l et foto av et autoradiogram som illustrerer en polyacrylamidgel-elektroforese i nærvær av natriumdodecyl-sulfat-(SDS-PAGE) analyse av immunoutfellinger av metabolisk merkede ekstrakter av FeSV-overførte celler. Uinfiserte normale celler og FeLV-(type B) infiserte eller FeSV-omdannede 35

minkceller ble merket i 2 timer med D-methionin, og celle-ekstrakter ble forbehandlet med preimmun-kaninserum. lOCyul av forbehandlet lysat fra hver cellelinje ble inkubert med enten preimmunserum (søyle 1, 6, 11 og 15), antiserum 5014 rettet mot det 30-mere syntetiske polypeptid I (søyle 2, 7,

12 og 16), antiserum 5016 rettet mot det 12-mere syntetiske polypeptid II (søyle 3, 8, 13 og 17), antiserum mot FeLVpl5 (søyle 4 og 9), eller et antiserum rettet mot FeLVp27

(søyle 5, 10, 14 og 18). Antistoff-antigenkomplekser dannet under inkuberingen, ble utfelt under anvendelse av Staphylococcus A-bakterier. De således dannede, utfelte komplekser ble vasket og ble deretter dissosiert i deres kom-ponentdeler. Proteinene ble deretter analysert under reduserende-denaturerende elektroforese gjennom en polyacrylamidgel-matrise.

De merkede ekstrakter ble fremstilt fra: felt A)

normal mink CCL64-linje, felt B) ST-FeSV-omformet FeLV type B-produsent minklinje, felt C) GA-FeSV-omdannet ikke-produsent minklinje og felt D) FeLV type B-infisert ikke-omformet minklinje. Immunkompleksene ble elektroforesebehandlet på en 20 cm lang 10% laemmli-gel. [Laemmli, Nature, 227, 680-685

(1970).]

Vandringen av standard molekylvektmarkører indikert ved pilene på høyre side, er (fra topp til bunn): fosforylase A (95 Kd), kanin-immunoglobulin G tung kjede (55 Kd) og ovalbumin (44 Kd). Bare de 12 øverste cm av gelen er vist idet det ikke var noen signifikante merkede proteinbånd under denne del av gelen. Pilene på venstre side indikerer stillingen av 108 Kd GA-FeSV-polyproteinet (øvre pil; søyle 13 og 14), 85 Kd ST-FeSV-polyprotein (midtre pil; søyle 7, 8, 9 og 10) og en 65 Kd FeLV gag-forløper (nedre pil; søyle 9, 10 og 18) .

Fig. 2A er et foto av et autoradiogram som illustrerer SDS-PAGE-analyse av produkter fosforylert ved inkubering av immunkomplekser med y- 32P-merket ATP. Immunkomplekser ble fremstilt fra umerkedelysater av normale minkceller

(søyle 1-4), ST-FeSV-omdannede FeLV-produsent minkceller (søyle 5-8), FeLV-infiserte uomformede minkceller (søyle 9-11)

og Ga-FeSV-omformede ikke-produsent minkceller (søyle 12-15) . Immunkomplekser bundet til formalinbehandlet Staphylococcus A, ble inkubert med 2 mikrocurie y- 3 2P-ATP (ca. 3000 curie/mikro-mol) i 10 millimolar tris-HCl (pH 7,4)/5 millimolar MgCl2 i 20 minutter ved 22°C. De fosforylerte proteiner ble dissosiert ved kokning i SDS-PAGE-prøvebuffer og elektroforesebehandlet på en 10 cm lang 10%-ig acrylamidgel. De anvendte

sera ved immunoutfellingen var som følger: preimmun-kaninserum, søyle 1, 5, 9 og 12; antiserum 5014 mot det 30-mere syntetiske polypeptid I, søyle 2, 6 og 13; antiserum 5016 mot det 12-mere syntetiske polypeptid II, søyle 3, 7, 10 og 14; antiserum mot FeLVp27, søyle 4, 8, 11 og 15. (Immunkompleks-kinaseaktiviteten fra GA-FeSV-ikke-produsenten var meget høyere enn innarbeidelsen i de tilstøtende søyler; således var søyle 15 i denne gel avdekket separat, og autoradiogrammet var innrettet etter utvikling av røntgenfilmen). Pilene på høyre side indikerer stillingene av GA-FeSV pl08 (topp, søyle 15)

og ST-FeSV p85 (bunn, søyle 8).

Fig. 2B er et foto av et autoradiogram som illustrerer SDS-PAGE-analyse av produktene av in vitro-fosforylering i immune komplekser fremstilt under anvendelse av varierende mengder av anti-FeLVp27 og antipolypeptid II-serum. Lysater fra ST-FeSV-omdannede celler ble forbehandlet med preimmun-kaninserum. 50^,ul aliquoter (ekvivalent med ca. 2 x 10<4>celler) ble inkubert med følgende serumblandinger:

1. 5yul 1:25 fortynnet anti-FeLVp27 + 15^ul preimmunserum; 2. 5^ul 1:25 fortynnet anti-FeLVp27 + 12,5yUl preimmunserum + 2,5yUl antiserum 5016; 3. 5yUl 1:25 fortynnet anti-FeLV-27 + 10,0^,ul preimmunserum + 5,0yul antiserum 5016; 4. 5^ul 1:25 fortynnet anti-FeLVp27 + 7,5^ul preimmunserum + 7,5^ul 5016; 5. 5yUl 1:25 fortynnet anti-FeLVp27 + 5,0^ul preimmunserum + 10,0^ul 5016; og 6. 10,0^ul preimmunserum + 10,0^ul 5016.

Immunkompleksene ble vasket og inkubert med 3 "9'P-ATP som 3 ~>

tidligere beskrevet. De "P-merkede produkter som ble dannet etter 20 minutters inkubering ved 22°C, ble analysert på en 10%-ig diskontinuerlig Laemmli-gel.

Fig. 3A er et foto av et autoradiogram som illustrerer SDS-PAGE-analyse av immunoutfellinger fra metabolisk merkede Fujinami sarcoma-virus-(FSV) omdannede rottenyre-(NRK) celler

35

og uomdannede NRK-celler. S-methionin-merkede celleeks-trakter fra FSV-omdannede NRK-celler (søyle 1-3) og den normale moder-NRK-linje (søyle 4-6) ble immunoutfelt med preimmun-kaninserum (søyle 1 og 4); antiserum 5016 mot v-fes syntetisk polypeptid II (søyle 2 og 5); eller antiserum 5014 mot v-fes syntetisk polypeptid I (søyle 3 og 6). Immunoutfellingene ble analysert på en 10 cm lang 10%-ig Laemmli-gel. Figuren viser bare den øvre halvdel av gelen. Pilen til venstre indikerer den forventede stilling av fps pl30 oncoprotein.

Fig. 3B er et foto av et autoradiogram som illustrerer SDS-PAGE-analyse av produkter fosforylert in vitro i immunkomplekser fremstilt med anti-v-fes syntetiske polypeptidsera og ekstrakter fra NRK-eller FSV-omdannede NRK-celler. Immunkomplekser ble fremstilt med umerkede ekstrakter fra FSV-omdannede celler (søyle 1-3) eller normale NRK-moderceller (søyle 4-6) og inkubert med 3 "7P-ATP som ovenfor diskutert.

De anvendte sera i disse studier var: preimmun-kaninserum - søyle 1 og 4; serum 5016 mot v-fes syntetisk polypeptid II - søyle 3 og 6; et RSV tumorbærende kaninserum (en gave fra dr. Joan Brugge, State University of New York, New York)

som kryssreagerer med Fujinami-fps oncoprotein - søyle 2 og 5. Pilene på venstre side indikerer stillingen av v-fps pl30 (topp) og immunoglobulin H-kjede (bunn). Den del av gelen som inneholder prøver fra normal NRK-linje, ble eksponert 5 ganger så lenge som den andre halvdel inneholdende omdannede celleprøver. Selv ved lengre eksponering kunne et svakt bånd av radioaktivitet i immunoglobulin H-kjedeområdet sees i søyle 5 som sannsynligvis gjenspeiler kinaseaktiviteten av det cellulære oncoprotein kodet av cellulært src oncogen (c-src).

Fig. 4 illustrerer måling av anti-polypeptid-antistofftiter i kaninsera ved en enzym-kjedet immunosorbentbestemmelse (ELISA).

Ca. 10 picomol av det 12-mere polypeptid II ble absorbert på faste bærere anordnet på hver brønn av en 96-brønns Falcon mikrotiterplate. Seriefortynninger av forskjellige testsera fra immuniserte og kontrollkaniner fikk bindes til disse brønner. Etter vasking av ubundet materiale ble et peroxydasekonjugat av geite-antiserum overfor kanin-immunoglobulin tilsatt til brønnene. Etter vasking av ubundet materiale ble mengden av peroxydase bundet til hver brønn målt ved en kolometrisk bestemmelse under anvendelse av o-fenylendiamin og hydrogenperoxyd. Resultatene ble nedtegnet som serumfortynning (horisontal akse) mot farveintensitet (vertikalakse). Symbolene er som følger: Preimmun-kaninserum (kontroll);

Serum fra en kanin immunisert med et hetero-logt peptid (kontroll);

Serum fra kanin 5 uker etter immunisering med

12-mer;

Serum fra kanin 7 uker etter immunisering med

12-mer; og

Serum fra kanin 9 uker etter immunisering med 12-mer.

Fig. 5 er et foto av et autoradiogram som illustrerer identifisering av et 40 Kd protein i humane tumorceller ved immunoutfelling under anvendelse av antisera overfor syntetisk polypeptid II konjugert til et nøkkelhulls-hemocyanin (KLH) (keyhole limpet hemocyanin) . Dyrkede cellelinjer erholdt fra 3 forskjellige humane tumorer, et carcinoma (felt A),

et rhabdomyosarcoma (felt B) og et fibrosarcoma (felt C), ble metabolisk merket med radioaktiv aminosyre, L-methionin

35

( S-merket). Analyse av immunoutfellingen er som angitt i fig. 1. Søyle 1, 4 og 7 illustrerer immunoutfellinger erholdt med preimmunt kaninserum. Søyle 2, 5 og 8 illustrerer immunoutfellinger erholdt med antiserum overfor det 12-mere polypeptid II. Søyle 3, 6 og 9 illustrerer immunoutfellinger erholdt med antiserum overfor et ubeslektet polypeptid konju-

gert til KLH. Pilene angir stillingen av 40 Kd-proteinet.

Fig. 6 illustrerer utviklingen av en konkurranse-ELISA for kvalitativ påvisning og kvantitativ måling av mengden av oncoprotein i en prøve som analyseæs under anvendelse av syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen og antisera rettet mot disse, eller deres konjugater med KLH. Antiseraene inne-holdt pepperrot-peroxydase bundet til antistoffmolekylene. Absorbansavlesningene ble erholdt som beskrevet ovenfor.

A. ELlSA-avlesninger med seriefortynninger på en 25-dobbelt ( A—A ) , 500-dobbelt ( A—A ) og 2000-dobbelt (A—A ) fortynnet lagerløsning av kanin-antiserum overfor syntetisk polypeptid II under anvendelse av dette polypeptid som et immobilisert antigen som beskrevet for fig. 4.

B. 500 ganger fortynnet lagerløsning av anti-polypeptidserum ble inkubert med null ( til økende mengder (©,3 og O) av ekstrakter fra celler som var blitt gjort cancerøse med FeSV. De inkuberte serumprøver ble deretter underkastet ELISA-analyse i nærvær av polypeptid II som immobilisert antigen. Resultatene viser en nedsettelse av den tilsynelatende antipolypeptid-antistofftiter i serumet som et resultat av inkubering med ekstrakter inneholdende det naturlige FeSV-oncoprotein. Denne nedsettelse skyldes bindingen av antipolypeptid-antistof f molekylene til det naturlige antigen, og som sådan ble nivåene av tilgjengelige antipolypeptid-anti-stof fmolekyler for binding til det syntetiske polypeptid på ELlSA-platene nedsatt.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I. Introduksjon

Oncogene virus omfatter en klasse av virus hvor mange av disse er retrovirus med en enkel streng av RNA som deres genomiske materiale. Oncogene virus er klassifisert som så-danne ved at deres genom koder for et oncoprotein som ikke representerer en hovedstrukturen komponent av viruspar-tikkelen og uttrykkes i en infisert vertcelle. Genet som koder for oncoproteinet, er definert som oncogenet. Proteiner beslektet med de virale oncoproteiner, kodes av gener tilstedeværende i vertcellenes naturlige genomer før infek sjon. Disse cellulære oncoproteiner er uttrykt, i det minste i enkelte tilfeller,, i mindre grad i den normale voksende celle. Tilkjennegivelse av oncogenene i de infiserte vert-celler for å danne oncoproteinene gir de infiserte celler et forøket nivå av oncoproteinet i forhold til det som normalt er tilstede.

Oncogene virus kan ytterligere karakteriseres ved det faktum at oncoproteinet inneholder et aktivt sete gjennom hvilket det reagerer med kroppskomponenter slik som ved binding til DNA, binding og splitting av annet protein, fosfo-omforming og lignende. Uttrykket "aktivt sete" anvendes her for å innbefatte både bindingsområdene og virkningen av oncoproteinet .

Et oncoproteins aktive sete kan innbefatte bare en

s rc

aminosyre slik som tyrosin-419 av pp60oncoprotein eller flere aminosyrer. Når flere aminosyrer omfatter et oncoproteins aktive sete, bestemmes avstanden fra et determinantområde til det aktive sete fra den nærmeste aminosyre av determinantområdet til tilnærmet midten av det aktive sete.

Flere velstuderte oncoproteiner er blitt funnet å katalysere en fosfo-overføringsreaksjon, typisk fra ATP, som derved klassifiserer disse oncoproteiner enzymatisk som kinaser. I tillegg er oncoproteiner fra forskjellige oncovirus blitt funnet å ha homologe antigeniske determinantområder. Som en konsekvens av homologien mellom antigeniske determinantområder kan antistoffer overfor et første oncoprotein anvendes for å immunoreagere med et annet oncoprotein kodet av et gen av et forskjellig oncovirus eller av et cellulært oncogen.

Foreliggende oppfinnelse gjør særlig bruk av homologien mellom antigeniske determinanter på forskjellige oncoproteiner såvel som det faktum at mange oncoproteiner har et aktivt sete relativt nær de homologe antigeniske determinanter. Denne umiddelbare nærhet kan enten være i den primære onco-proteinsekvens eller via mellomrom på grunn av den tertiære, foldede struktur av oncoproteinet.

Ved foreliggende homologi når det gjelder determinanter av oncoproteiner og de homologe determinanters umiddelbare nærhet til oncoproteinets aktive sete er denne av betydning til forskjell fra en homologi når det gjelder aktive seter på oncoproteinene. Denne forskjell er av betydning fordi antistoffer dannet mot et oncoproteins aktive seteområde, også kan fremkalle immunoreaksjoner slik som immunoutfelling av ikke-oncoproteiner som inneholder et homologt, aktivt sete. En slik ikke-skjelnende immunoutfelling og reaksjon med ikke-oncoproteiner kan føre til ødeleggelse av ønskelige cellefunksjoner i tillegg til ødeleggelse av neoplastiske cellefunksjoner.

Et eksempel på ikke-skjelnende immunoutfelling fremkalt av antistoffer overfor et oncoproteins aktive sete, kan finnes i publikasjonen av Wong og Goldberg, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 7412-7416 (1981). Disse forfattere fremkalte antistoffer overfor det fosfo-overføringsaktive sete av pp60s rc oncoproteinet av Rous sarcomavirus ved å anvende et konjugat fremstilt fra keyhole limpet hemocyanin og et decapeptid som innbefattet tyrosin-419, aminosyreresten ved det aktive sete av pp60 s r c oncoproteinet som autofosforyleres, såvel som en polypeptidsekvens på hver side av tyrosin-419.

Wong og Goldberg rapporterte at antistoffer fremstilt mot decapeptidkonjugatet immunoutfelte pp60<Src>oncoproteinet, men fremkalte også utfelling av et utall ikke-oncoproteiner fra både infiserte og uinfiserte celler. Slik bred kryss-reaktivitet av antistoffer med både oncogen-kodede og ikke-oncogen-kodede proteiner er ikke ønskelig som ovenfor angitt, og er antatt å stamme fra anvendelse av en konjugert polypeptidsekvens som innbefatter oncoproteinets aktive sete, eller en del derav, hvilket sete er homologt med setene av andre utfelte proteiner.

Wong og Goldberg rapporterte også at interaksjonen mellom antipeptidets antistoffer og oncoproteinet var svak. Den angitte svake interaksjon ble tilskrevet den korte lengde av det syntetiske polypeptid, eller alternativt at determin-antens aktive sete ikke var lett tilgjengelig i det naturlige oncoprotein. Den etterfølgende diskusjon angir at valg av

en hydrofil determinantregion av et oncoprotein med 10 til 40 aminosyrer kan gi en tilsvarende sekvens for et syntetisk

polypeptid som fremkaller produksjon av antistoffer som fremkaller sterke, skjelnende immunoreaksjoner med det opprinnelige oncoprotein, såvel som med oncoproteiner fra andre virale eller cellulære oncogener.

Det tidligere publiserte arbeide av Sen et al., Abstract, s. 94, RNA Tumor Virus Meeting, (mai 1981), Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, angikk fremstilling av antistoffer overfor en lignende polypeptidsekvens innbefattende en på hver side av tyrosin-419

av pp60 src, og anvendelse av disse antistoffer for å danne et immunkompleks med pp60 srconcoproteinet blant andre proteiner, innbefattende proteiner fra ikke-infiserte celler.

Arbeider publisert av Papkoff et al., Cell, 21_, 109-119 (1981) og 28, 417-426 (1982) indikerte en lignende vanskelighet med ikke-spesifikke antistoffer. Disse forskere konjugerte de carboxy-terminale 12 aminosyrer av et oncoprotein kodet av det M-MuSV-omdannende gen v-mos til okseserumalbumin og dannet deretter antistoffer overfor dette konjugat. De således fremstilte antisera immunoutfelte mange hovedbånd fra både uinfiserte og MuSV-omdannede celler som ikke ble funnet i utfellinger dannet med preimmunserum.

II. Oversikt over anvendbare teknikker

A« Syntetiske polypeptider

Valget av det syntetiske polypeptid som skal anvendes, starter med aminosyresekvensen av et oncoprotein. Denne sekvens kan bestemmes ved hjelp av flere teknikker kjent innen faget, og innbefatter den klassiske våtkjemiteknikk med partiell hydrolyse og sekvensdannelse av de individuelle produkter. De nyere teknikker når det gjelder sekvensdannelse av genomet fra enten viruset eller en infisert vert som koder oncoproteinet, og oversettelse av denne genomiske sekvens til dets tilsvarende proteinsekvens, kan også anvendes.

Et antigenisk område som er 10 til 40 aminosyrerester langt, velges deretter fra den totale proteinsekvens. Et syntetisk polypeptid hovedsakelig svarende til det valgte 10 til 40 aminosyrerest lange område/ syntetiseres deretter ved vanlige fastfase-syntetiske metoder. [Houghten et al.,

Int. J. Pept. Prot. Res., 16:337-340 (1981); Merrifield,

J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. Lengre polypeptid-sekvenser kan syntetiseres og anvendes. Sjansen for å finne en ønsket homolog sekvens på mer enn ca. 40 fortløpende aminosyrerester i to ubeslektede oncoproteinmolekyler er i praksis ikke tilstede, og følgelig kan antistoffer dannet mot et lengre syntetisk polypeptid ikke immunoreagere godt med et andre oncoprotein. Således er syntetiske polypeptider inneholdende 40 aminosyrerester eller mer, mest egnet for å fremkalle antistoffer som ikke kryssreagerer med et område av et andre oncoprotein. Slike antistoffer immunoreagerer med oncoproteinet overfor hvis determinantområde de er blitt dannet, og inhiberer en reaksjon ved et aktivt sete av dette oncoprotein. Fortrinnsvis inneholder det syntetiske polypeptid en sekvens på 10 til 25 aminosyrerester.

Det er sannsynlig at hydrofile områder av oncoproteinet eksponeres på den cellevæske-holdige del av det naturlige molekyl og muliggjør derved god kontakt mellom et fremkalt antistoff og oncoproteinet. Det er derfor fordelaktig at oncoprotein-polypeptidsekvensen valgt for syntesen inneholder hydrofile aminosyrerester slik som Arg, Lys, Asp, Glu og His. Valg av et hydrofilt oncoprotein-polypeptidområde gir også et syntetisk polypeptid som er vannløselig. En slik løse-lighet er ønskelig.

Det foretrekkes også å velge en determinantområde-sekvens mellom hydrofobe rester og/eller prolinrester. Disse rester er ofte begravet i det naturlige oncoprotein mens det valgte, hydrofile determinantområde derimellom er avdekket .

Et determinantområde som er mindre enn 200 aminosyrerester bort fra et oncoproteins aktive sete slik som tyrosin-419 av pp60 src oncoproteinet, velges fortrinnsvis for syntesen slik at et immunoglobulinmolekyl kan bindes til determinantområdet av oncoproteinet og under denne binding fysikalsk blokkere det aktive sete. Fortrinnsvis er det område som velges til å syntetiseres, mindre enn 150 aminosyrerester fra oncoproteinets aktive sete. Oncoprotein-determinanten er fortrinnsvis mindre enn 100 aminosyrerester fra oncoproteinets aktive sete. Ettersom et oncoprotein kan inneholde 1000 eller flere aminosyrerester, er det foretrukne oncogeniske område "tilstøtende" til oncoproteinets aktive sete slik som dette uttrykk anvendes her og i de etterfølgende patentkrav.

Det er hyppig hensiktsmessig å tilsette én eller flere ytterligere aminosyrer til amino- eller carboxy-endene av det syntetiske polypeptid for å medhjelpe til binding av det syntetiske polypeptid til en bærer under dannelse av et konjugat. Cysteinrester tilsatt ved carboxyenden av det syntetiske polypeptid, er blitt funnet å være særlig egnet for dannelse av konjugater via disulfidbindinger, men andre metoder som er velkjente innen faget for fremstilling av konjugater, kan anvendes. Eksempler på bindingsprosedyrer innbefatter anvendelse av dialdehyder slik som glutaraldehyd og lignende, eller anvendelse av carbodiimid-teknologien slik som ved anvendelse av et vannløselig carbodiimid, f.eks.

l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid.

Anvendbare bærere er velkjente innen faget og er generelt proteiner i seg selv. Eksempler på slike bærere er keyhole limpet hemocyanin (KLH), albuminer slik som okseserumalbumin eller humant serumalbumin (BSA eller HSA), røde blodceller slik som saueerythrocytter (SRBC), tetanus toxoid, såvel som polyaminosyrer slik som poly-(D-lysin:D-glutamin-syre) og lignende.

Som kjent innen faget, er det ofte gunstig å binde det syntetiske polypeptid til dets bærer ved hjelp av en inter-mediær, kjedende gruppe. Som ovenfor angitt, er glutaraldehyd en slik kjedende gruppe, men når cystein anvendes, er den intermediære, kjedende gruppe en m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS). MBS tilsettes typisk først til bæreren ved en ester-amid-ombytningsreaksjon, etterfulgt av tilsetning av en blokkert mercaptogruppe slik som thio-eddiksyre over maleimido-dobbeltbindingen. Splitting av den blokkerende gruppe skjer deretter, og disulfidbindingen dannes deretter mellom det avblokkerte, kjedende mercaptan og mercaptanet av den tilsatte cysteinrest av det syntetiske

polypeptid.

B. Immunisering og antistoffrespons overfor valgte syntetiske polypeptider

De syntetiserte polypeptider eller deres konjugater anvendes for immunisering av testdyr slik som kaniner etter vanlige prosedyrer som diskutert i det etterfølgende. Blod-prøver taes deretter fra dyrene ved å starte rundt den 5. uke etter første immunisering, og serumprøver fra blodprøvene undersøkes med hensyn til utvikling av anti-syntetisk polypeptid-antistofftiter ved standard enzymkjedet immunosorbentbestemmelse (ELISA)-prosedyrer. ELISA-bestemmelsene er diskutert i Maggio, Enzyme-Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fl., 1981.

Eksempelvis immobiliseres en konstant mengde på 5 til

15 picomol av det ukonjugerte syntetiske polypeptid i hver brønn av en mikrotiter plastplate. Den frie plastoverflate av platen blokkeres mot ikke-spesifikk binding av antistoffmolekyler av et protein. Hvor et polypeptidkonjugat anvendes, anvendes et protein som ikke anvendes som bærerprotein ved immuniseringsprosedyren som det blokkerende protein.

Seriefortynninger av test-antisera tillates å inter-reagere med den på forhånd bestemte, konstante mengde av syntetisk polypeptid tilstedeværende i hver av en serie av brønner. Mengden av antipeptid-antistoff tilstedeværende i fortynningene i serumprøven bestemmes ved å måle den mengde av et enzymkonjugat av et andre antistoff rettet mot immuno-globulinene av det immuniserte testdyr, f.eks. kanin, som er bundet til polypeptid - antipolypeptidkomplekset. Denne blanding av plast-bundet syntetisk polypeptid, antistoff overfor dette syntetiske polypeptid, og antistoffer dannet mot de første antistoffer, resulterer i et kompleks som kan illustreres skjematisk som: bundet polypeptid/kanin-antipolypeptid-antistoff/geite-anti-kaninimmunoglobulin-enzym

for den situasjon hvori en kanin immuniseres til å produsere det første antistoff og geite-anti-kanin-antistoff omfatter det andre antistoff.

Eksempler på anvendbare enzymer som kan bindes til

det andre antistoff, innbefatter pepperrot-peroxydase, alkalisk fosfatase og glucoseoxydase.

Da et overskudd av syntetisk polypeptid immobiliseres

i brønnene, vil mengden av enzym bundet i hver brønn,

direkte gjenspeile mengden av antistoffmolekyler i antipolypeptid-serumløsningen i de respektive brønner. Resultatene nedtegnes som enzymaktivitet mot serumfortynning. En typisk nedtegning for et spesifikt antiserum dannet mot et dodecapeptid, er illustrert i fig. 4.

En lignende bestemmelse kan deretter utføres med hensyn til hvilke av de syntetiske polypeptider eller konjugater som fremkalte produksjon av antistoffer som også erkjenner og immunoreagerer med oncoproteinet, slik som ved immunoutfelling. De således dannede antistoffer testes også med hensyn til deres evne til å inhibere en reaksjon ved et oncoproteins aktive sete og med hensyn til deres kryss-reaktivitet med oncoproteiner fra andre virale stammer og/eller neoplastiske celler.

Ytterligere mengder av antistoffene overfor dette syntetiske polypeptid eller dets konjugat dannes i antisera, og de antistoff-holdige antisera oppsamles så snart det bestemmes hvilke syntetiske polypeptider eller konjugater som utviser en høy antistofftiter ved immunisering. Særlig foretrukne antistoffer (1) immunoreagerer med oncoproteinet hvis antigeniske aminosyre-restsekvensområde tilsvarer det syntetiske polypeptid, (2) inhiberer en reaksjon ved et oncoproteins aktive sete, og (3) kryssreagerer med et oncoprotein fra en annen viral stamme eller neoplastiske celler.

Idiotype-holdige relativt små deler av antistoffmolekyler er også anvendbare her. Slike antistoffdeler innbefatter de velkjente Fab og F(ab')2fragment-deler. Disse antistoffdeler kan fremstilles ved proteolytisk splitting av antistoffmolekylet av enzymene papain og pepsin, etterfulgt av rensing under anvendelse av velkjente teknikker.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen, sammen med deres mindre deler som innbefatter antistoff-idiotypiske regioner slik som Fab og F(ab')2 fragmentene o.l., angis her kollek-tivt som idiotype-holdige polyamider. De idiotype-holdige polyamider erkjenner og binder til det antigeniske determinantområde av oncoproteinet til hvis aminosyre-restsekvens de ble dannet (første oncoprotein). Idiotype-holdige polyamider dannes til aminosyre-restsekvensen av determinantområdet av det første oncoprotein ved vanlige immuniserings-teknikker under anvendelse av et syntetisk polypeptid eller dets konjugat ifølge oppfinnelsen som det immuniserende antigen.

De idiotype-holdige polyamider kan også immunoreagere med et andre oncoprotein som har et antigenisk determinantområde som er homologt med det ovenfor angitte område av første oncoprotein. Enkelte idiotype-holdige polyamider slik som intakte eller hovedsakelig intakte antistoffer, kan også inhibere en reaksjon ved et aktivt sete av et oncoprotein, avhengig bl.a. av lengden av det idiotype-holdige polyamid og den umiddelbare nærhet av oncoproteinområdet bundet av det idiotype-holdige polyamid til et aktivt sete av dette oncoprotein.

C. Inhibering av reaksjoner ved et oncoproteins aktive sete

Oncoproteiner er reaktive med andre komponenter tilstedeværende i cellen via oncoproteinets aktive sete. Disse reaksjoner innbefatter katalyse slik som fosfor-overføring. Antistoffer dannet overfor foreliggende syntetiske polypeptider, binder til oncoproteinet og inhiberer en reaksjon ved oncoproteinets aktive sete.

Oncoproteiner fra minst 6 oncogener (v-src, v-fps, v-yes, v-ros, v-abl og v-fes) er blitt funnet å katalysere fosfor-overføringsreaksjoner. Inhibering av fosfor-overfør-ingsreaksjonen av antistoffer overfor det syntetiske polypeptid eller dets konjugat viser et eksempel på det mere generelle fenomen på inhibering av en reaksjon ved et aktivt sete av et oncoprotein som er karakteristisk for antistoffene

ifølge oppfinnelsen.

Således kan immunkomplekser fremstilles fra (a) de relativt lengre idiotype-holdige polyamider eller fortrinnsvis intakte antistoffer dannet mot et syntetisk polypeptid eller konjugat ifølge oppfinnelsen kombinert med (b) umerkede cellelysater fra celler inneholdende oncoproteinet hvis determinant-aminosyre-restsekvensområde var syntetisert i det syntetiske polypeptid. Etter egnet rensing slik som vasking av immunkomplekset, inkuberes dette i en egnet buffer inneholdende gamma- 32 P-ATP i en på forhånd bestemt tid. Komplekset vaskes deretter igjen, dissosieres og underkastes deretter gel-elektroforese under anvendelse av vanlige teknikker. Gelene tørkes, og autoradiogrammene fremstilles deretter .

Resultater av en inhibering av en reaksjon ved det aktive sete av et oncoprotein er illustrert i fig. 2A. Foto-grafiene av autoradiogrammene vist i fig. 2A, illustrerer at immunkomplekser dannet med antisera inneholdende antistoffer dannet overfor de 12 og 30 rest-polypeptider hvis synteser er diskutert i det etterfølgende, ikke overfører en fosfat-gruppe fra det merkede ATP-molekyl til v-fes-oncoproteinet. Resultatene vist i søyle 8 og 15 i fig. 2A, illustrerer at immunkomplekser dannet under anvendelse av anti-gag antiserum og enten ST-FeSV- eller GA-FeSV-omdannede cellelysater fosforylerte gag-fes-polyproteinet.

Resultatene i fig. 2A viser også betydningen av å velge et determinantområde av oncoproteinet som er tilstøtende til det aktive sete. Således fremkalte de ST-FeSV-omdannede FeLV produsent-minkceller (søyle 5 - 8) og GA-FeSV-omformede ikke-produsent-minkceller (søyle 12 - 15) et kondensert gag-fes polyprotein. Fosfor-overføring fant sted når anti-gag-antiserumet ble anvendt som kilde for antistoffer (søyle 8 og 15), mens antistoffer overfor fes-oncoproteindelen av det kondenserte polyprotein dannet ved immunisering med poly-peptidkonjugatene ifølge oppfinnelsen, inhiberte fosforyler-ingsreakjonen (søyle 6, 7, 13 og 14).

Disse resultater viser at antistoffer dannet overfor syntetiske polypeptider fra en del av oncoproteinet tilstøt-ende det aktive sete, inhiberte fosfor-overføringsreaksjonen, mens antistoffer dannet overfor gag-delen av det kondenserte protein, bandt seg til determinantområder for langt bort fra det reaksjonsrelaterte aktive sete til å inhibere fosfor-overføringsreaksjonen.

D. Immunoutfelling av oncoproteiner

Oncoproteinet kodet av det virale oncogen, uttrykkes stabilt i omdannede, dyrkede celler. Således merkes normale dyrkede celler og celler omdannet av det oncovirus som koder oncoproteinet hvis determinantområde hovedsakelig tilsvarer aminosyresekvensen av det syntetiske polypeptid, f.eks. felint sarcomavirus metabolisk med en radioaktiv aminosyre slik som methionin eller leucin. Cellene lyseres åpne, og lysatet bringes i kontakt med det ovenfor fremstilte anti-syntetiske polypeptidserum.

Proteiner fra cellelysatene bundet til de anti-syntetiske polypeptid-antistoffer i serumet, separeres deretter ved antistoffenes evne til å bindes til bakterien Staphylococcus A. De bundne proteinmolekyler således isolert fra de normale og omdannede celler, dissosieres deretter fra komplekset og oppløses ved elektroforetiske teknikker som separerer proteinmolekyler basert på deres størrelse.

Autoradiografi av elektroforesegelene identifiserer proteinene fra de lyserte celler som binder til de anti-syntetiske polypeptid-antistoffer. Resultatene av en typisk bestemmelse er vist i fig. 1.

Som det fremgår fra en undersøkelse av fig. 1, binder antistoffene fra de anti-syntetiske polypeptidsera store mengder av spesifikke proteiner fra omdannede celler (85 Kd protein i søyle 7 og 8 og et 108 Kd protein i søyle 13) og binder hovedsakelig ikke proteiner fra de normale moder-cellelinjer (søyle 2 og 3). Denne type av immunoutfellings-elektroforeseundersøkelse gjøres rutinemessig for hvert anti-syntetisk polypeptid-antiserum under anvendelse av celler omdannet med virusene fra hvilke oncogenet var identifisert.

Resultatene illustrert i fig. 1, viser spesifisiteten av antistoffer dannet overfor syntetiske polypeptider svarende til et determinantområde av det oncoprotein som er til-støtende til, men ikke inneholder et aktivt sete av onco proteinet. Således ble hovedsakelig bare oncoproteinene immunoutfelt med de anti-syntetiske polypeptid-antistoffer fra omdannede celler mens hovedsakelig ingenting ble immunoutfelt fra de ikke-omdannede celler. Dette står i motsetning til de resultater som er rapportert i den ovenfor angitte publikasjon av Wong og Goldberg hvori antistoffene dannet overfor det aktive sete av oncoproteinet, immunoutfelte betydelige mengder av proteiner i både omdannede og ikke-omdannede celler.

På grunn av antistoffenes determinantområde-spesifisitet kan den ovenfor angitte immunoutfellings-elektroforeseteknikk også anvendes for å identifisere oncoproteiner som har beslektede eller homologe determinantområder, men som produseres i celler omdannet av en forskjellig oncovirus eller som produseres i neoplastiske celler fra dyr slik som mennesker hvori neoplastisiteten ikke behøver å være blitt fremkalt av en kjent viral infeksjon. Således viser resultatene illustrert i fig. 3, at antistoffer dannet overfor et konjugat inneholdende det senere diskuterte dodecapeptid (avsnitt III) som tilsvarer et determinantområde av oncoproteinet kodet av v-fes-genet, også utfeller et oncoprotein kodet av v-fps-genet, oncogenet av Fujinami-stammen av fugle-sarcomavirus. Fig. 5 illustrerer også at de samme antistoffer overfor dette dodeca-peptidkonjugat utfeller et 40 Kd oncoprotein i cellelinjer avledet fra forskjellige humane tumorer.

Transkripsjonen av v-onc-beslektede nucleinsyrer i humane tumorer er illustrert i publikasjonen av Eva et al., Nature, 295, 116-119 (1982) . Disse forskere påviste polyadenylerte RNA-transkripsjoner beslektet med sis-, mye-, abl- og bas-oncogenene i praktisk talt alle av de analyserte tumorceller. Imidlertid fant de også slike RNA-transkripsjoner i normale humane fibroblaster.

III. Ilustrative eksempler på oppfinnelsen

Forskjellige sider ved foreliggende oppfinnelse illustreres i dette avsnitt med hensyn til oncoproteinet kodet av oncogenet v-fes av felint sarcomavirus. Det skal imidlertid forståes at de her illustrerte prinsipper er generelle og ikke må betraktes som å være begrenset bare til det her beskrevne oncogen og oncoproteiner. Detaljer ved forsøks-prosedyrene er angitt i Materialer og metode, avsnitt (IV), som følger denne diskusjon.

To syntetiske polypeptider som hovedsakelig tilsvarer et antigenisk område nær carboxyenden av oncoproteinet kodet av v-fes-genet, ble fremstilt. Sekvenser av de to syntetiske polypeptider, angitt som polypeptid I og polypeptid II, er vist i det etterfølgende, skrevet fra venstre mot høyre i retning fra aminoenden til carboxyenden:

Polypeptid I:

Polypeptid II

SerProTyrProAsnLeuSerAsnGlnGlnThrArgCys.

Under anvendelse av de velkjente enkeltbokstavsforkortelser for aminosyrerester har 30 rests polypeptid I-sekvensen, skrevet fra venstre mot høyre i retning fra amino-enden til carboxy-enden: og dodecapeptidet, polypeptid II, har sekvensen skrevet på samme måte:

Den understrekece cystein- (Cys eller C) rest ved carboxy-enden i hvert av de ovenfor angitte peptider er ikke tilstede i oncoprotein-aminosyre-restsekvensen, men ble tilsatt for å medhjelpe til konjugasjon via en disulfidbinding til bæreren.

For å lette forståelsen er forbindelsen mellom den tre-bokstavs og en-bokstavs kode for de 20 vanlig fundne aminosyrer gitt i det etterfølgende:

Oncoprotein-determinantområdet representert ved den ovenfor angitte 30-restsekvens, har flere interessante trekk. For det første er det lokalisert tilstøtende til det aktive sete som inneholder den tyrosinrest som fosforyleres i reaksjoner katalysert i et immunkompleks inneholdende gag-fes-polyproteinet. For det andre er området hovedsakelig identisk mellom oncoproteinene kodet av v-fes-oncogenet av Snyder-Theilen og Gardner-Arnstein-stammene av felinet sarcomavirus. For det tredje inneholder det utstrakt homologitet med et område i det oncogene v-fps av Fujinami av fugle-sarcomavirus.

[Hampe et al., Cell, 30, 775-785 (1982); og Shibuya og Hanafusa, Cell, 30, 787-795 (1982].

Homologe regioner av oncoproteinene kodet av v-fes- og v-fps-oncogenene, er illustrert i det etterfølgende, fra venstre til høyre i retning fra amino-enden til carboxy-enden, med klammer som omgir dodecapeptidet av polypeptid II såvel som dets homologe region i v-fps-oncoproteinet:

De homologe regioner av dodecapeptider kodet av v-fes-og v-fps-genene, kan skrives sammen fra venstre mot høyre i retning fra amino-enden til carboxy-enden som:

hvori hver av aminosyrerestene i parentes er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest.

Det bemerkes at for den ovenfor angitte aminosyresekvens og de som er angitt i det etterfølgende, behøver ikke hver alternative aminosyrerest være erstattet i et individuelt syntetisk polypeptid ifølge oppfinnelsen. De i parentes angitte aminosyrerester er heller uavhengige alternative. Således omfatter den ovenfor angitte sekvens innbefattende parenteser, aminosyre-restsekvensen av de 4 dodecapeptider som er vist i det etterfølgende, skrevet på samme måte:

Hvert av polypeptid I og II ble koblet til KLH og anvendt til å immunisere kaniner som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Utviklingen av en antistofftiter mot de to peptider ble overvåket ved den ELISA-prosedyre som også er beskrevet i dette avsnitt.

Antistofftitere var påvisbare innen 5 uker etter immunisering. Disse antisera utviste en betydelig grad av kryss-reaktivitet, hvilket kan sees fra dataene i etterfølgende tabell 1.

En titer på mer enn 1:10.000 ble erholdt innen 7 uker under anvendelse av konjugatet av syntetisk polypeptid II. Under anvendelse av det lengre syntetiske polypeptid, polypeptid I, ble en titer på ca. 1:5.000 observert innen 7 uker. Antisera fra dyr immunisert med syntetisk polypeptid I, utviste bare en meget svak kryss-reaktivitet overfor syntetisk polypeptid II (tabell 1) .

Det bemerkes at så snart dyrene var immunisert med KLH-koblet konjugat, er det syntetiske polypeptid I tilstrekkelig immunogent til å utvise en sekundær immunrespons. Titrene av anti-syntetisk polypeptid-antistoffer var stabile i de immuniserte kaniner i 6 til 8 uker selv om dyrene ikke ble gitt boostere.

Nucleotidsekvensanalyse av Gardner-Arnstein- (GA) og Snyder-Theilen- (ST) stammene av det feline sarcoma (FeSV) forutsier at v-fes-genet av GA-FeSV kan kode et 957 aminosyre-restprotein mens det av ST-FeSV har en kodingskapasitet på

774 aminosyrer (Hampe et al., supra). Immunoutfellingsunder-søkelser av andre forskere under anvendelse av antisera rettet mot determinantene til proteiner kodet av felint leukemiavirus (FeLV-GAG, f.eks. anti-FeLVpl5 eller anti-FeLVp27) viste påvisning av et 108 Kd protein fra GA-FeSV-omformede celler og et 85 Kd protein fra ST-FeSV-omformede celler.

[Se Barbacid et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77, 5158-5162 (1980); Ruscetti et al., J. Virol. , 3_5, 259-264

(1980) og Van de Ven, et al., Virology, 101, 185-197 (1980)]. Disse proteiner ble også påvist ved immunoutfelling av metabolisk merkede proteiner under anvendelse av antisera fra rotter som bærer FeSV-fremkalte tumorer. Nærvær av 85 Kd- proteinet i ST-FeSV-omformede celler og nærvær av 108 Kd-proteinet i GA-FeSV-omformede celler er i god overensstemmelse med molekylvektene av det protein som kan forutsies ved en kombinert nucleotidsekvens av gag- og fes-genene med de tilsvarende virus.

Antisera mot begge av de syntetiske polyepptider ble anvendt for å immunoutfelle metabolisk merkede proteiner fra GA- og ST-FeSV-omdannede minkceller. SDS-PAGE-analyse av immunoutfellingene er vist i fig. 1.

Ved å velge polypeptider for syntesen som tilsvarer et determinantområde av fes-oncoproteinet som er tilstøtende til, men ikke inneholder et aktivt sete av oncoproteinet, ble ikke noe spesifikt radioaktivt bånd immunoutfelt med noen av de immune sera fra normale minkceller (søyle 1-5). Antiserumet

(5016) rettet mot syntetisk polypeptid II erkjente gag-fes-polyproteinet på ca. 108 Kd i de GA-FeSV-omdannede ikke-produsentceller (søyle 13) og 85 Kd-polyproteinet i de ST-FeSV-omdannede produsentceller (søyle 8). Dette serum utfelte ikke gag-polyproteinet hverken i de produsentomdannede celler (søyle 8) eller fra FeLV-infiserte, ikke-omdannede celler (søyle 17).

Antiserumet (5014) mot syntetisk polypeptid I, det større syntetiske polypeptid, immunoutfelte ST-FeSV-polyproteinet (søyle 7), men erkjente ikke GA-FeSV-polyproteinet (søyle 12). Anti-FeLVp27-antiserumet erkjente et tilnærmet 108 Kd-protein i den GA-FeSV-omdannede ikke-produsent-cellelinje 64F3C17 (søyle 13). Som forventet i FeLV-infiserte ikke-omdannede minkceller, utfelte anti-p27-serumet 65 Kd gag-polyprotein, Pr6 5gag (søyle 18). I den ST-FeSV-omdannede FeLV-produsent-minkcellelinje, MSTF, utfelte antiserumet både 65 Kd-polyproteinet og det ST-FeSV-spesifikke gag-fes-polyprotein på tilnærmet 85 Kd (søyle 10). Et antiserum mot FeLV-15 slik som anti-p27, erkjente både gag-fes-polyproteinet og gag-polyproteinet fra ST-FeSV-omdannede produsentceller (søyle 9).

En sammenligning mellom den relative immunoutfellings-evne av gag-fes-polyproteinet fra de to omdannede cellelinjer under anvendelse av anti-gag-antisera og antisera rettet mot syntetisk polypeptid II, viste en forskjell. De anti-syntetiske polypeptidsera syntes å erkjenne ST-FeSV-polyproteinet mere effektivt enn GA-FeSV-polyproteinet.

Det skal bemerkes at det anti-syntetiske polypeptid II erkjente et mindre bånd ved tilnærmet 100 Kd i alle celler innbefattende den normale minkcelle. Opprinnelsen av dette protein er ikke klar på dette tidspunkt. Immunoutfelling av bare ett mindre proteinbånd i tillegg til oncoproteinet av antiseraene overfor de syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen, er imidlertid en betydelig forbedring i forhold til de resultater som er rapportert av Wong og Goldberg. Ennvidere finnes det indikasjoner på at c-fes-genet koder for et tilnærmet 95 Kd-protein i enkelte normale pattedyr og fugleceller [Barbacid et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77, 5158-5162 (1980) og Mathey-Prevot et al., Cell, 28, 897-906 (19 28)]. Det observerte mindre bånd kan derfor være produktet kodet av c-fes-genet som normalt er tilstede.

Disse immunoutfellingsstudier beviser at v-fes-gen-produktet er uttrykt i form av et 85 Kd protein i de ST-FeSV-omdannede celler og som et 108 Kd protein i de GA-FeSV-omdannede celler. Før tilgjengeligheten av antisera fremstilt ifølge oppfinnelsen, er disse proteiner blitt identifisert bare indirekte ved immunoutfelling med anti-FeLV-gag antisera fra FeSV-omdannede celler.

Antisera dannet mot amino-ende-determinantene (pl5) av GAG-genet og de syntetiske polypeptid-antistoff-holdige sera rettet mot polypeptider avledet fra 3<1->enden av den fes-kodende sekvens ble vist å erkjenne polyprotein-kandidat-molekylene fra to beslektede, men distinkte FeSV-isolater. Dataene fastslo således også cotranslasjon av GAG og fes-genene fra avlesningssystemet som forutsies av nucleotid-sekvensene av GA- og ST-stammene av FeSV. 85 Kd-proteinet av ST-FeSV og 108 Kd-proteinet av GA-FeSV kan således angis som p85gag-fes(S<T>)Qg pl08<gag-f>es(GA)_

Det korte dodecapeptid, syntetisk polypeptid II, har produsert høytiter-antisera. Området på oncoproteinet som svarer til det syntetiske polypeptid, er lokalisert tilstøt-ende til det aktive sete for tyrosinfosforylering av v-fes- proteinet, og som kompleksdannes med anti-syntetiske polypeptid-antistoffer som binder til determinantområdet til-støtende dette aktive sete, inhiberte autofosforylerings-reaksjonen av dette oncoprotein som diskutert i det etterfølg-ende .

Andre forskere har vist at oncoproteinet av v-fes har en tyrosin-kinaseaktivitet forbundet med dette. [Se Hunter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 7_7, 1311-1315 (1980);

Van de Ven et al., supra; og Reynolds et al., J. Virol., 37, 643-653 (1981)] . Immunkomplekser dannet mellom gag-fes-polyproteinet og antisera rettet mot FeLV-gag-determinanter, er blitt funnet å katalysere en autofosforyleringsreaksjon

32

som fører til omdannelsen av 'P-radioaktivitet fra gamma-

32

P-merket ATP til en særpreget tyrosinrest på v-fes-oncoproteinet. [Hampe et al., supra; og Neil et al., Virology, 109, 223-228 (1981)] .

Immunkomplekser ble dannet som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder fra GA-FeSV-omdannede cellelysater under anvendelse av anti-syntetisk polypeptid-antiserum og anti-gag-antiserumet og ble testet med hensyn til deres evne til å katalysere fosforylering in vitro. Resultatene av disse fosfor-overføringsreaksjoner er illustrert i fig. 2A.

Immunkomplekser under anvendelse av anti-gag-antiserum med enten ST-FeSV- eller GA-FeSV-omformet cellelysat katalyserte fosforylering av de respektive gag-fes-polyproteiner (søyle 8 og 15). Derimot katalyserte ikke immunkompleksene dannet under anvendelse av antisera dannet overfor hverken syntetisk polypeptid I og II, en fosforyleringsreaksjon (søyle 6, 7, 13 og 14). Dette var tilfellet selv under de betingelser som ble anvendt for dannelse av immunkompleksene hvor antisera mot peptid II klart utfelte gag-fes-polyproteinet i mengder som var sammenlignbare med hva som ble erholdt med anti-gag-serum.

Årsaken til disse resultater er antatt å ligge i det faktum at oncoproteinområdet som svarer til syntetisk polypeptid II, er lokalisert tilstøtende til (ca. 45 aminosyrerester vekk fra) det aktive tyrosin-fosforyleringssete på ve-fes-oncoproteinet som bestemt ifølge Blomberg et al.,

J. Virol., 38, 886-894 (1981). Det er således antatt at det anti-syntetiske polypeptid-antistoff bindes til dette oncoprotein tilstøtende til setet for fosforylering og fysikalsk blokkerer fosforoverføringsreaksjonen, mens anti-gag-antistoffet bindes fjernt fra dette aktive sete og muliggjør at fosforylering kan finne sted.

Denne hypotese når det gjelder de forskjellige bind-ingsseter for anti-gag og anti-syntetisk polypeptid-antistoffer ble undersøkt under anvendelse av aliquoter av et lysat fra ST-FeSV-omdannede celler som ble inkubert parallelt med varierende forhold av anti-gag til anti-syntetisk polypeptid-antistof f, mens den totale mengde av antistoff ble holdt konstant. Immunkompleks-kinasebestemmelser ble utført med de forskjellige immunoutfellinger.

Resultatene av denne bestemmelse er illustrert i

fig. 2B og viser at ettersom forholdet mellom anti-syntetiske polypeptid-antistoffer og anti-gag-antistoffer øket, ble graden av fosforylering av 85 Kd-polyproteinet redusert. Ved et forhold mellom anti-syntetisk polypeptidantisera og anti-gag-antisera på 25:1 var tyrosinfosforylering av 85 Kd-polyproteinet ikke lenger påvisbar. I et parallellforsøk ble lignende blandinger av antistoffer funnet å være i mettende konsentrasjoner for den mengde av lysat som ble anvendt og utfelte således identiske mengder av ST-FeSV-polyproteinet for metabolisk merkede celler.

Denne type av nøytralisering av fosforylering av polyproteinet med økende mengder av anti-syntetisk polypeptidserum er i overensstemmelse med den ovenfor angitte hypotese at den enzymatiske fosforoverføring blokkeres av bindingen av de anti-syntetiske polypeptid-immunoglobulinmolekyler tilstøtende til det aktive sete for fosforylering av v-fes-oncoproteinet.

Det anti-v-fes-syntetiske polypeptidserums evne til

å erkjenne v-fps-oncoproteinet fra stabile, omformede NRK-celler ble bestemt. Resultatene av immunoutfelling under anvendelse av metabolisk merkede celleproteiner og antistoffer mot syntetisk polypeptid I og mot syntetisk poly-

peptid II er vist i fig. 3A, mens forsøksprosedyrer er diskutert i avsnittet Materialer og metoder. Antisera mot syntetisk polypeptid II immunoutfelte 130 Kd gag-fps-oncoproteinet fra de omdannede NRK-celler (søyle 2). Antiserum mot det større polypeptid, syntetisk polypeptid I, erkjente ikke proteinet (søyle 3).

Da v-fes og v-fps er sterkt beslektede og begge inneholder lignende tyrosinkinaseaktiviteter [Barbacid et al., supra; og Beemon, Cell, 24, 145-153 (1981)], ble immunkomplekser fremstilt fra lysater av FSV-omformede og normale NRK-cellelinjer under anvendelse av normalt kaninserum, tumorbærende kaninserum (TBR) fra Rous sarcomavirus (RSV) som kryssreagerer med Fujinami-fps-proteinet, eller antiserumet rettet mot syntetisk polypeptid II. Kompleksene ble inkubert med gamma- 32P-ATP, og inkubasjonsproduktene ble analysert ved diskontinuerlig SDS gelelektroforese. Disse resultater er illustrert i fig. 3B.

Immunoutfellingene fremstilt under anvendelse av anti-syntetisk polypeptidserum og FSV-omformede celler, fosforylerte ikke fps pl30-oncoproteinet eller lg H-kjeden (søyle 3). Immunkomplekser fremstilt med TBR-serumet, katalyserte fos-foryleringen av det virale pl30 oncoprotein og lg H-kjeden (søyle 2). Med normale NRK-cellelysater katalyserte anti-syntetiske polypeptid-antistoff-immunofellingen igjen ikke noen fosforylering (søyle 6), men TBR-immunoutfellingene fosforylerte lg H-kjedene i en meget lav grad (søyle 5), sannsynligvis katalysert av den endogene, cellulære c-src kinase.

Bare et begrenset antall av aminosyrerestene deles mellom v-fes- og v-src-oncoproteinene. [Hampe et al. supra; Shibuya et al., supra og Czernilofsky et al., Nature, 287, 198-203 (1980)]. Det er således en liten homologi i antigeniske områder mellom disse oncoproteiner. Det var derfor ikke overraskende at antistoffer dannet mot polypeptid II, ikke immunoutfelte pp60 src-oncoproteinet fra RSV-omdannede rotteceller.

Resultatene erholdt med feline sarcomavirus (FeSV)- omdannede celler, viste igjen at bindingen av de anti-syntetiske polypeptid-antistoffer tilstøtende til det aktive tyrosin-fosforyleringssete på oncoproteinet inhiberer tyrosin-kinaseaktiviteten. I dette tilfelle ble både autofosforyler-ings- og substrat- (lg H-kjede) fosforyleringsreaksjonene inhibert av de anti-syntetiske polypeptid-antistoffmolekyler. Således har et definert antiserum mot kjemisk syntetiserte polypeptider svarende til et spesifikt område av et oncoprotein kodet av et viralt oncogen, muliggjort en demonstrasjon av kryssreaktivitet mot produkter av et annet retroviralt oncogen. Et syntetisk polypeptid som i realiteten er identisk mellom oncoproteinene kodet for av v-fes- og v-fps-genene, har således tilveiebragt antisera som vil immunoutfelle produkter fra begge omformede celler.

I tillegg ble proteinkinaseaktiviteten av både v-fes-

og v-fps-oncogenproduktene inhibert når antistoffene bandt seg til området tilstøtende de aktive seter. Hverken auto-fosforyleringen av det v-fes-kodede oncoprotein eller autofosforylering eller immunoglobulinfosforylering-katalysert av v-fps-oncoproteinet ble observert når disse proteiner var bundet til antisera dannet overfor syntetisk polypeptid II. Disse data antyder også at områdene rundt det aktive sete i disse to beslektede proteiner har lignende struktur.

IV. Metoder og materialer

A. Celler og virus

Den normale minkcellelinje CCL64 (American Type Culture Collection) ble anvendt for å oppnå en ikke-produsent-cellelinje omdannet med Gardner-Arnstein-stammen av felint (fugle) sarcomavirus (FeSV), 64F3C17 og en ikke-omdannet cellelinje som kronisk produserer felint leukemiavirus

(FeLV), subgruppe B. Den omdannede produsentkultur, MSTF,

gir høye nivåer av Snyder-Theilen-stammen av FeSV med en subgruppe B-hjelper [Robbins et al., Virology, 91_, 1-11 (1979)]. Fujinami sarcomavirus omdannet rottecellelinje, [Hanafusa

et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77, 3009-3013 (1980)] var avledet fra den normale rotte-nyrelinje, NRK [Duc-Nguyen et

al., J. Bacteriol., 92, 1133-1140 (1966)]. En annen ikke-produsentlinje av omdannet NRK-linje inneholdende Rous-stammen av katte-sarcomavirus (RSV), ble erholdt fra dr. Peter Vogt fra University of Southern California.

Alle celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifikasjon av Eagles medium med høyt glucosenivå (4 500 mg/l) supplert med 10% kalvefosterserum.

B. Polypeptidsyntese

Polypeptidene ble syntetisert ved fastfasemetoden [Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 8J5, 2149-2154 (1980)] under anvendelse av en cysteinharpiks i henhold til den tidligere beskrevne metodikk [Houghten et al., Int. J. Pep. Prot. Res., 16, 311-320 (1980)]. De individuelle aminosyrer hadde sine sidekjeder beskyttet som følger: Arg-tosyl, Ser, Thr, Glu og Asp-0-benzyl; Tyr-O-brombenzyloxycarbamyl; Trp-N-formyl. N-formylgruppen på Trp-restene ble fjernet etter splitting av peptidet fra harpiksbæreren ved behandling med 1,0 molar ammoniumbicarbonat til en peptidkonsentrasjon på 1,0 mg/ml i 16 timer ved romtemperatur. [Yamashiro et al., J. Org. Chem., 38, 2594-2597 (1973)]. Effektiviteten ved kobling ved hvert trinn ble overvåket med ninhydrin [Kaiser, Anal. Biochem., 34.'595-598 (1980)] og/eller picrinsyre [Gisin, Anal. Chem. Acta, 5_8, 248-249 (1972)] og var mere enn 99% i alle tilfeller. En aminosyreanalyse av det komplette peptid ga de korrekte verdier (- 5% av forutsatte verdier).

C. Polypeptldkonjugasjon, immunisering og bestemmelse av antiserumtitere

Hvert peptid ble redusert med dithiothreitol umiddelbart før dets konjugasjon med friskt aktivert keyhole limpet hemocyanin (Calbiochem-Behring, La Jolla, CA) under anvendelse av tidligere beskrevne prosedyrer [Sutcliffe et al., supra]. Voksne New Zealand hvite hannkaniner ble hver injisert med ca. 200^ug av peptid-KLH-konjugat i Freunds fullstendige adjuvans (en fysiologisk akseptabel bærer) på dag 1; de ble gitt en booster med 200^ug av konj ugatet i Freunds ufullstendige adjuvans på dag 14, og igjen med lOO^ug konjugat blandet med aluminiumhydroxyd på dag 21. Blodprøver ble oppsamlet ukentlig etter siste immunisering. Preimmun-sera og blodprøver ble alle delvis fraksjonert ved tilsetning av ammoniumsulfat til en 40%-ig sluttmetning, og det utfelte protein oppløst i startserumvolumet av PBS, ble anvendt som kilde for antistoffer i alle forsøk.

Antistofftitere mot peptidene ble målt ved en enzym-kjedet immunosorbentbestemmelse (ELISA) under anvendelse av 5 picomol peptid immobilisert i hver brønn av en 9 6 brønns mikrotiterplate (Falcon Plastics), og et glucoseoxydase-konjugat av beslektede rensede geite-anti-kanin immunoglobuliner ble anvendt som forsøksenzym [Niman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77, 4524-4528 (1980)]. Etter utvikling av forsøksinkuberinger ble absorbansen nedtegnet mot seriefortynninger for hvert serum. Den antiserumfortynning som ga halvparten av den maksimale farge ved enden av det lineære område av kurven, ble tatt som titer på antiserumet.

D. Metabolisk merking, immunoutfellinger og immunkompleks - kinasebestemmelser

Celler ble dyrket til tilnærmet 80% sammenflytning i

6 brønners Falcon vevdyrkningsplater (Falcon 3046) i normalt serum-supplert DMEM. Monolaget ble skylt med l^ul methionin-fritt DMEM og ble deretter inkubert i 2 timer i methionfritt medium.

Cellene ble deretter merket i 2-4 timer med 50 mikrocurie 35S-methionin (ca. 1000 curie/millimol, New England Nuclear, Boston, MA) i methionfritt medium under anvendelse av 0,5 ml pr. brønn. Etter endt merkningsperiode ble det merkende medium fjernet, og cellemonolaget ble lysert med 0,4 ml IPB (immunoutfellingsbuffer som inneholder 20 millimolar Tris-HCl, pH 7,2, 1% NP40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 2 millimolar natriumazid, 2 millimolar fenylmethyl-sulfonylfluorid, 2% aprotinin og 1 molar natriumklorid).

Lysatet ble klaret ved 12.000 x g i en mikrofuge i 15-20 minutter ved 4°C. Hvert lysat ble deretter forbehandlet ved inkubering i 2 timer ved 4°C med lOOyUl preimmunt kaninsera. Immunkompleksene ble fjernet ved inkubering med lOO^ul av formaldehyd-fiksert Staphylococcus A. til gjengelig kommersielt under betegnelsen Pansorbin fra Calbiochem-Behring, La Jolla, CA.

Aliquoter av de forklarede lysater ble inkubert med ønskede mengder av forskjellige testsera ved 4°C i 2 timer. Immunkomplekser ble oppsamlet under anvendelse av Pansorbin og ble vasket tre ganger med IPB etterfulgt av en vaskning med 0,1 molar Tris-HCl (pH 8,5) inneholdende 0,5 molar lithiumklorid og en sluttelig vaskning med fosfat-bufret saltvann. De vaskede immunkomplekser ble oppløst direkte i Laemmli prøvebuffer (Laemmli, supra), kokt og klaret ved sentrifugering. Supernatantene ble analysert ved diskontinuerlig acrylamidelektroforese (Laemmli, supra). Gelene ble behandlet med Enhance (New England Nuclear, Boston, MA), ble deretter tørket og eksponert til Kodak XRP-5 film.

For immunkompleks-kinasebestemmelsene ble immunkomplekser fremstilt fra umerkede cellelysater som ovenfor beskrevet. Det sluttelige kompleks ble vasket en gang i 10 millimolar Tris-HCl (pH 7,4) inneholdende 5 millimolar magnesiumklorid.

Hver vasket pellett ble deretter inkubert i 25^ul av den ovenfor angitte Tris-MgCl^ buffer inneholdende 1-2 mikrocurie gamma- 32-P-ATP (ca. 3000 curie/millimol) i 20 minutter ved 22°C. Etter endt inkubering ble pellettene vasket en gang med PBS, ble deretter dissosiert med Laemmli SDS-PAGE prøve-buffer og elektroforesebehandlet som ovenfor angitt. Gelene ble tørket og eksponert på KodakXRP-5 filmer.

V. Vertbeskyttelse

3 unge, voksne katter ble immunisert med det ovenfor beskrevne polypeptid II-KLH-konjugat (avsnitt III og IV). Immuniseringene ble utført med to doser hver på 0,5 mg av konjugatet i Freunds ufullstendige adjuvans ved to ukers inter-valler. 3 parallelle katter ble anvendt som ubehandlede kon-troller .

En måned etter første immunisering ble hver av de seks katter utfordret ved en injeksjon på ca. 1 x 10 feline tumorceller som produserer relativt høye nivåer av både FeSV og FeLV. Antistofftitere under anvendelse av den ovenfor angitte ELISA-metode ble bestemt for hver katt før utfordring. Resultatene av immunisering og beskyttelse av de immuniserte katter med polypeptid II-konjugat er illustrert i etterfølg-ende tabell 2.

Som det fremgår fra de ovenfor angitte resultater, var de immuniserte katter beskyttet i forhold til kontrollkattene. Det er viktig å merke seg at beskyttelsen ble tilveiebrakt selv om en meget stor dose av celler inneholdende virus ble anvendt heller enn et preparat av viruspartiklene alene, hvilket ville ha vært en mer vanlig prosedyre. Således ble en beskyttelse av kattevertene demonstrert selv under særlig stringente betingelser.

VI. Antigener relatert til fes- og fps-oncoproteiner i human neoplasia

A. Diagnose

Som en demonstrasjon på forholdet mellom virale oncoproteiner og oncoproteiner produsert i humane tumorer, ble cellelysater fra humane cellelinjer screenet med kanin-antisera dannet mot polypeptid II-KLH-konjugatet som ovenfor beskrevet. Et 40 Kd oncoprotein ble immunoutfelt under disse screeninger fra cellelysater av human lungecarcinoma, human malign melanoma, human epidermal carcinoma, human rhabdomyosarcoma og human fibrosarcoma. 40 Kd oncoprotein ble ikke immunoutfelt fra lysater av friske, humane, perifere blodmonocytter, friske, humane, perifere blodlymfocytter eller en etablert, dyrket linje av humane lymfocytter.

Som et ytterligere bevis for kryssreaktiviteten av antistoffer overfor de syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen overfor oncoproteiner produsert under neoplastiske betingelser, ble antisera dannet mot polypeptid II-KLH-konjugatet individuelt bragt i kontakt med sera fra 48 humane pasienter med forskjellige neoplastiske sykdommer. De neoplastiske sykdommer i disse pasienter innbefattet forskjellige carcinoma, multiple myeloma, sarcomas i forskjellige vev, lymfosarcomas, kronisk leucocyttisk og akutt myelogenøs leukemi og melanomas.

Konkurrerende ELISA-bestemmelser (se fig. 6) med de ovenfor angitte sera viste nærvær av et kryssreagerende antigen i ca. 70% av de undersøkte humane sera. Det kryssreagerende antigen ble ikke identifisert. Sera fra tre normale individer, dvs. individer som ikke hadde noen diagnostisert neoplastisk sykdom, viste ingen tegn på kryssreagerende antigen.

De ovenfor angitte resultater illustrerer flere punkter. For det første viser de det faktum at antistoffer overfor

de syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen erkjenner et oncoprotein-beslektet produkt forskjellig fra det oncoprotein som kodes av det virale oncogen hvis antigeniske område var basis for det syntetiske polypeptid.

For det andre er antistoffene dannet mot det syntetiske polypeptid, relativt spesifikke ved at de ikke immunoutfeller proteiner tilstedeværende i normale celler eller sera. Dette står i motsetning til det arbeide som er rapportert av Wong og Goldberg, supra, og Papkoff et al., supra.

De ovenfor angitte resultater bringer også det arbeide som er utført av Eva et al., supra, til en meget anvendbar, praktisk og uventet ytterligere utførelsesform. Således kan en kroppskomponent slik som serum, urin eller en lysert vev-prøve, nå lett bestemmes og anvendes for å diagnostisere nærvær av neoplastisk sykdom ved å blande denne kroppskomponent med antistoffer dannet mot de syntetiske polypeptider eller deres konjugater og analysere blandingen for nærvær av en immunologisk reaksjon mellom kroppskomponenten og de således dannede antistoffer. Flere slike immunologiske reaksjoner er diskutert i det etterfølgende.

Den ovenfor angitte diagnose av neoplastisk sykdom er mer praktisk enn hva som er beskrevet av Eva et al. av flere grunner. For det første behøves ikke den relative uhensikts-messige isolering av poly(A)-holdige RNA som beskrevet av Eva et al. For det andre er fremstilling av antisera og syntetiske polypeptider og deres konjugater anvendt i foreliggende oppfinnelse, kjente standardprosedyrer. For det tredje er lagring og bruk av foreliggende antistoffpreparater også kjente standardteknikker. For det fjerde er komplisert teknologi innbefattende spesialiserte reagenser for nucleinsyre-hybridisering ikke nødvendig. Således kan diagnosen være et hensiktsmessig laboratorieverktøy.

Den ovenfor angitte diagnosemetode må også betraktes som uventet ut fra hva som er angitt av Eva et al. Disse forfattere identifiserte bare poly(A)-holdige RNA, ikke proteiner. Selv om de neoplastiske celler transkriberte oncogen-relaterte DNA til poly(A)-holdige RNA, var det således ikke kjent eller kunne forutsies hvilke av disse RNA som ble translatert til oncoproteiner i de cellelinjer som ble studert av Eva et al. Iverksettelsen av en genfunksjon krever i praktisk talt alle tilfeller ekspresjon av proteinproduktet kodet i gensekvensen. Som sådan gir påvisning av oncogenproteinprodukter i celler eller vev en mer direkte diagnostisk markør for virkningen av et oncogen. Med foreliggende diagnostiske teknikk unngås alt ukjent fra artikkelen ifølge Eva et al., og gir et diagnostisk verktøy for påvisning av nærvær av et oncogent trans-cript som er kjent for å være av betydning i neoplastiske sykdommer, oncoproteinet.

B. Neoplasia og ytterligere syntetiske polypeptider

Selv om de ovenfor angitte resultater ble erholdt under anvendelse av antistoffer overfor det fes-relaterte poly peptid II-KLH-konjugat, kan påvisning av et bredere område av neoplastiske sykdommer oppnåes ved anvendelse av spesifikke antistoffer dannet mot ytterligere antigeniske polypeptider eller deres konjugater. Eksempler på slike antigeniske polypeptider til hvilke antistoffene kan dannes, innbefatter de som er angitt i etterfølgende tabell 3, som syntetiseres under anvendelse av den tidligere beskrevne metode for å svare til antigeniske områder på oncoproteinene kodet av fes, fps, ras, src, yes, myb, sis og mos virale oncogener. Polypeptidene er angitt i tabell 3 ved den oncogene familie hvor de forskjellige polypeptider er parret med et tilsvarende polypeptid fra et homologt, antigenisk område av et beslektet oncoprotein hvor dette er hensiktsmessig.

Syntetiske, antigeniske polypeptider

De ovenfor angitte polypeptider er nedtegnet fra venstre mot høyre i retning fra amino-enden til carboxy-enden. En skråstrek (/) som separerer to gennavn, indikerer et slektskap eller homologi mellom determinantområder av oncoproteinene kodet av disse gener, såvel som likhet mellom typene av neoplasia fremkalt i deres naturlige verter ved infeksjon med de egnede vira. Understrekede Cys-rester (C) som finnes ved enten amino- eller carboxy-enden av de ovenfor angitte polypeptider, er ikke tilstede i de antigeniske områder av naturlig forekommende oncoproteiner, og er tilsatt under syntesen til de ovenfor angitte polypeptider for å lette binding av polypeptidet til et bærermolekyl.

De ovenfor angitte syntetiske polypeptider svarende til fes/fps og src/yes-familiene av oncoproteiner, kan også skrives på en alternativ måte med parenteser som enkle sekvenser. Slike sekvenser av disse to grupper av polypeptider er oppført i tabell 4 hvor de tilsatte terminale cysteinrester (C) som er anvendbare for binding til bæreren, er fjernet av praktiske grunner. De syntetiske polypeptider i tabell 4

er skrevet i samme rekkefølge fra amino-enden til carboxy-enden og bærer tilsvarende tall som de som er angitt i tabell 3.

C. Forbedret område for neoplasia-diagnose, forebyggelse og behandling

Det ovenfor angitte område for kryssreaktivitet vist for antistoffer dannet mot polypeptid II-KLH-konjugatet, kan utvides for diagnose, forebyggelse, behandling og andre formål ved blanding av antistoffer eller andre, relativt mindre idiotype-holdige polyamider dannet mot et flertall av forskjellige syntetiske polypeptider. Intakte antistoffer er de foretrukne idiotype-holdige polyamider og anvendes illustrativt i det etterfølgende i foreliggende avsnitt.

Først dannes antistoffer mot et første polypeptid eller dets konjugat hvis aminosyre-restsekvens svarer til et determinantområde av et første oncoprotein. Minst en andre gruppe av antistoffer dannes deretter mot et andre syntetisk polypeptid hvis aminosyre-restsekvens svarer hovedsakelig til et determinantområde av: (i) et andre oncoprotein som er ubeslektet med det første oncoprotein, eller (ii) et område av det første oncoprotein som er forskjellig fra området av det første polypeptid, eller (iii) et andre oncoprotein som er beslektet med første oncoprotein, men hvori determinantområdet av det andre oncoprotein svarende til det andre syntetiske polypeptid, ikke er homologt med determinantområdet av det første oncoprotein.

Eksempelvis gir en blanding av antistoffer dannet mot syntetiske polypeptider svarende til antigeniske områder av oncoproteiner kodet av fps-og src-genene, et bredere område for kryssreaktiviteter enn antistoffene dannet mot fps alene. Eksempler på forskjellige antigeniske områder av enkle oncoproteiner, f.eks. ras-beslektede polypeptider 10-15, er vist i tabell 3 i det etterfølgende slik som eksempler på parrede antigeniske områder av beslektede oncoproteiner, f.eks. src-og yes-beslektede polypeptider 16-22 i tabell 3.

Området for kryssreaktivitet kan utvides ytterligere

ved anvendelse av blandingen av antistoffer dannet mot syntetiske polypeptider svarende til oncoproteiner kodet av virale gener som fremkaller forskjellige typer av neoplasia i deres verter. En slik blanding av et flertall av antistofftyper er en blanding av antistoffer dannet mot syntetisk polypeptid II

(fps-beslektet) og de som dannes mot et av de syntetiske polypeptider i tabell 3 dannet mot det myb-kodede oncoprotein. Således er antistoffer dannet mot et sarcoma-beslektet viralt oncoprotein kodet av fps-genet, tilstede sammen med spesifikke antistoffer dannet mot et leukemia-beslektet, viralt oncoprotein.

D. Diagnostiske systemer

De ovenfor diskuterte antistoff-oncoproteinreaktiviteter og kryssreaktiviteter gir basis for et diagnostisk system for bestemmelse av nærværet av neoplasia i et dyr ved påvisning av en forøket mengde av et oncoprotein kodet av et oncogen som normalt er tilstede i celler, sammenlignet med mengden av dette oncoprotein som normalt uttrykkes.

Et diagnostisk system inneholder minst to reagenser i biologisk aktiv form tilstedeværende i separate beholdere.

Det første reagens er et syntetisk polypeptid ifølge oppfinnelsen hvis aminosyre-restsekvens svarer til et determinantområde av et første oncoprotein produsert av celler omdannet av et oncogent virus. Det andre reagens innbefatter idiotype-holdige polyamider ifølge oppfinnelsen dannet mot det syntetiske polypeptid. En indikerende gruppe er også tilstede.

I enkelte diagnostiske systemer ifølge oppfinnelsen hvori indikerende grupper er bundet eller på annen måte bundet til idiotype-holdige polyamider, er molekyler som er relativt mindre enn intakte antistoffer, tilstrekkelig for slik anvendelse. Imidlertid foretrekkes det å anvende intakte antistoffmolekyler i andre diagnostiske systemer. Eksempler på slike sistnevnte systemer er (1) de hvori indikerende grupper er bundet til andre antistoffer dannet i et andre dyr mot de første antistoffer slik som hvor geite-anti-kanin-antistoffer inneholder den indikerende gruppe, og (2) de hvori protein A alene eller sammen med en ytterligere indikerende gruppe anvendes. Uttrykket "antistoff" i dets forskjellige grammatikalske former vil bli anvendt i avsnitt E og F i det etterfølgende som eksempler på et idiotype-holdig polyamid.

Blanding av på forhånd bestemte mengder av de første og andre reagenser gir en på forhånd bestemt grad av immuno-reaks jon. Blanding av på forhånd bestemte mengder av de første og andre reagenser i nærvær av en på forhånd bestemt mengde av den kroppskomponent som skal undersøkes, gir en annen grad av immunoreaksjon. Graden av den sistnevnte immunoreaksjon, er forskjellig når kroppskomponenten inneholder et andre oncoprotein med et antigenisk område som er homologt med det av det første oncoprotein som er tilstede i en for-øket mengde, sammenlignet med en kjent immunoreaksjonsgrad for det normale nivå av dette oncoprotein i kroppskomponenten, eller med denne grad dannet ved blanding av det første og andre reagens alene.

E. Immunoreaksjoner

De immunoreaksjoner som gjør bruk av spesifikke antistoffer dannet mot de ovenfor angitte polypeptider eller deres konjugater, varieres vidt. Flere anvendbare immunoreaksjoner for det ovenfor angitte diagnostiske system, er diskutert i det etterfølgende.

1. ELISA

Blant de anvendbare immunoreaksjoner er en av de best kjente og letteste å utføre, den velkjente teknikk med konkurrerende enzym-kjedet immunosorbentbestemmelse eller ELISA. Et eksempel på ELISA er blitt beskrevet tidligere i avsnitt III og IV.

Kort angitt ble mikrotiter-testbrønner belagt med en på forhånd bestemt mengde av et syntetisk polypeptid. Antistoffer slik som godt karakteriserte kanin-immunoglobuliner rettet mot polypeptidet, tjener som det spesifikke antiserum. Et enzym slik som pepperrot-peroxydase, alkalisk fosfatase eller lignende, ble bundet til antistoffmolekylene etter vanlige prosedyrer for å tjene som den indikerende gruppe.

En fortynning av serumet som ga ca. 30-50% av mettet ELISA-avlesning (fig. 6A) , ble deretter fremstilt. lO^ul av det fortynnede antiserum ble brakt i kontakt og inkubert med 90^ul av prøven av den kroppskomponent som skulle undersøkes, f.eks. pasientserum, vevekstrakt, lyofilisert og avsaltet urin eller lignende. En blindprøve ble tilveiebrakt med lOyUl av det fortynnede serum brakt i kontakt og inkubert med 90^,ul av en 3%-ig løsning av okseserumalbumin.

Nærværet av oncoproteinet til hvilket det opprinnelige polypeptid er beslektet, ble gjenspeilt ved en forandring i ELISA-kurven for standard antiserum etter at det var blitt inkubert med en testprøve. Et eksempel på en bestemmelse er vist under anvendelse av det syntetiske polypeptid II, antiserum dannet mot dets KLH-konjugat og ekstrakter fra FeSV-infiserte celler i fig. 6B. Mengden av oncoprotein i prøven kan beregnes ut fra mengden av inhibering av den observerte polypeptid-antistoffreaksjon, og denne mengde av tilstedeværende oncoprotein i kroppskomponenten i forhold til den vanlig tilstedeværende mengde, kan beregnes deretter.

Den ovenfor angitte bestemmelse er relativt hurtig å utføre idet den tar mindre enn 8 timer og krever ikke bruk av radioisotoper. Den er også relativt følsom, idet den påviser så lite som ca. 10 til 50 nanogram av oncoprotein pr. ml serum, urin, vevekstrakt eller annen kroppskomponent. I tillegg påvirkes ikke denne bestemmelse i overveiende grad av nærvær av proteolyttiske, nedbrytende enzymer som er tilstede i serum, vevekstrakt eller urinprøver da det selv etter delvis nedbrytning av det naturlige oncoprotein er tilbake tilstrekkelig store antigeniske områder til at disse kan bli påvist.

Den ovenfor angitte bestemmelse ble anvendt for å gi de ovenfor beskrevne resultater hvori antistoffer overfor syntetisk dodecapeptid II viste nærvær av et kryssreagerende antigen i 70% av sera fra pasienter som var kjent for å ha forskjellige neoplastiske sykdommer. Bredden av kryssreaktiviteter erholdt ved anvendelse av blandinger av antistoffer dannet mot et flertall av forskjellige antigeniske områder av oncoproteiner, kan igjen benyttes for å tilveie-bringe en bredere kvalitativ analyse med hensyn til nærvær av forskjellige oncoproteiner.

2. Radioimmunobestemmelse

Radioimmunobestemmelser kan også anvendes kvalitativt og kvantitativt for å påvise nærvær av forøkede nivåer av oncoproteiner i kroppskomponenter. Her tilveiebringes et valgt, syntetisk oncoproteinbeslektet polypeptid slik som et av de som er oppført i tabell 3. Antistoffer dannes mot dette polypeptid eller dets konjugat og samles. Det syntetiske polypeptid er radiomerket slik som ved metoden ifølge Hunter et al., Nature, 194, 495-496 (1962).

Mengdene av radiomerket polypeptid og antistoff justeres slik at antistoffene i antiserum utfeller ca. 30-50%

av den radioaktivitet som er tilgjengelig fra det merkede syntetiske polypeptid. Ca. 10 nanogram av syntetisk polypeptid merket til å inneholde ca. 10.000 disintegrasjoner pr. minutt (dmp) av radioaktivitet og som har en spesifikk aktivitet på 1.000.000 dpm pr.^ug, anvendes typisk. Mengden av antistoffer justeres typisk ved seriefortynninger fra standard antiserum i bufret saltvann. En hensiktsmessig mengde av utfelt radioaktivitet er 3000 til 5000 dpm.

En på forhånd bestemt mengde av antistoff blandes og inkuberes i en på forhånd bestemt tid med en på forhånd bestemt mengde av den kroppskomponent som skal undersøkes. Det radiomerkede syntetiske polypeptid overfor hvilket antistoffene dannes, blandes deretter med antistoff-kroppsblandingen. Reduksjon i mengden av radioaktivt polypeptid utfelt fra den på forhånd bestemte mengde (f.eks. 30-50% av 10.000 dpm) gir et mål for mengden av oncoprotein som har et homologt antigenisk område med det polypeptid som ble anvendt for å danne antistoffene som var tilstede i kroppskomponenten. Anvendelse av blandede antistofftyper slik som ovenfor diskutert, kan gi en større bredde for kvalitative bestemmelser for nærvær av oncoproteiner.

3. Flekkanalyse

Kroppskomponenter slik som urin eller serumprøver,

eller vevpreparater, kan også underkastes polyacrylamidgel-elektroforese under denaturerende, reduserende betingelser.

De separerte proteiner overføres deretter til en nitro-cellulosemembran ved påtrykning av et elektrisk felt.

[Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 7(6:4 350-4 354

(1979) ] .

Antistoffer dannet mot syntetiske polypeptider slik som de som er angitt i tabell 3, bringes deretter i kontakt og inkuberes med nitrocellulosearkene. Nærvær av et oncoprotein i kroppskomponenten påvises ved å bringe kroppskomponent-antistoffinkubert nitrocelluloseark i kontakt med et preparat av radiomerket protein A, kommersielt tilgjengelig i renset form avledet fra Staphylococcus aureus. Protein A binder til kroppskomponent-antistoffkomplekset, hvilket er velkjent. Kromofor-bundet protein A kan anvendes istedenfor det radiomerkede protein for å gi en farvebasert bestemmelse heller enn en bestemmelse basert på radioaktivitet.

De ovenfor angitte teknikker gir en kvalitativ bestemmelse for nærvær eller fravær av et oncoprotein beslektet med det syntetiske polypeptid. Den gir også informasjon med hensyn til størrelsen av oncoproteinmolekylet fra dets relative stilling etter elektroforesen. Slik som tilfellet er for ELISA og radioimmunobestemmelser, gir anvendelse av antistoffer dannet mot et flertall av syntetiske polypeptider, et bredere område for kryssreaktiviteter og derfor et bredere spekter for mulige positive, kvalitative resultater.

F. Neoplastisk cellelokalisering

Oncoproteiner slik som pp60 , finnes på celleoverflater. Anvendelse av dette faktum kan dras nytte av ved å danne antistoffer mot de syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen svarende til antigeniske områder av slike oncoproteiner eller homologe områder av andre oncoproteiner, eller konjugater dannet med disse, og å merke disse antistoffer eller deres Fab eller F(ab')2fragmentdeler (idiotype-holdige polyamider) passende. De merkede antistoffer kan deretter anvendes for å lokalisere celler inneholdende oncoproteiner med antigeniske områder som er kryssreaktive med de således dannede antistoffer.

1. In vitro- analyse

I en in vitro-analyse ble antisera dannet i kaniner mot et syntetisk polypeptidkonjugat ifølge oppfinnelsen, det polypeptid II-KLH-preparat som er diskutert tidligere. Som et eksempelvis system ble dyrkede celler, en kroppskomponent, gjort cancerøs ved infeksjon med FeSV og normale celler dyrket på separate mikroskop-dekkglass som celleutspredninger. Disse celler ble deretter brakt i kontakt og inkubert med det ovenfor angitte kanin-anti-syntetisk polypeptid-antiserum. Tidligere fremstilt geite-anti-kanin-antiserum bundet til fluorescein ved kjente teknikker, ble erholdt fra kommersi-elle kilder og ble inkubert med hvertcelleutsprednings-kanin-antiseruminkubat. Bestråling med lys med egnet bølge-lengde under anvendelse av et farvefilter i et fluorescens-mikroskop synliggjorde fluorescente områder på og/eller i infiserte celler hvori oncoproteinet dannet et kompleks med kanin-antistoffene, og det således dannede kompleks bandt de fluorescein-merkede geite-anti-kanin-antistoffer, og derved lokaliserte det cellulære kryssreaktive oncoprotein. Således ble den cellulære lokalisering av oncoproteinet erholdt ved den teknikk som angis som "fluorescensmikroskopi". Fluorescensmikroskopi kan også anvendes for å identifisere og lokalisere kryssreaktive oncoproteiner kodet av beslektede virale gener eller av cellulære oncogener i tumorarter.

2. In vivo- analyse

Flere in vivo-metoder er også tilgjengelige for lokalisering av nærværet av celler inneholdende et forøket nivå av oncoproteiner. I en slik metode ble antistoffer dannet mot ett eller et flertall av syntetiske polypeptider. De således dannede antistoffer ble merket med en indikerende gruppe.

Et eksempel på en indikerende gruppe er et radioaktivt element som produserer gammastråleemisjon. Elementer som i

125

seg selv sender ut gammastråler slik som I, representerer en klasse av gammastråle-emisjons-produserende radioaktive elementindikerende grupper. En annen klasse av anvendbare indikerende grupper er slike elementer som ^C, "^F, "*"^0 og<13>N som i seg selv sender ut positroner. De således utsendte positroner gir gammastråler når de støter an mot elektroner tilstedeværende i dyrets kropp.

De radiomerkede antistoffer injiseres deretter i blod-strømmen på et dyr med en neoplastisk sykdom, spesielt en tumor. Etter en egnet, på forhånd bestemt tid, danner de merkede antistoffer komplekser med de beslektede oncoproteiner på tumoroverflaten. Dyret avsøkes med en gammastråle-emisjonstellende maskin slik som den aksialtomografiske scanner som er kommersielt tilgjengelig under betegnelsen

CT (80-800 CT/T) fra General Electric Company, Milwaukee, WI, eller med en positronemisjons-transaksialtomografiscanner slik som den som betegnes Pett VI lokalisert ved Brookhaven National Laboratory. En slik avsøkning kan gi informasjon med hensyn til lokalisering, størrelse og form på tumoren på grunn av spesifisiteten av de anvendte radiomerkede antistoffer .

I en annen utførelsesform dannes igjen antistoffer mot de syntetiske polypeptider eller deres konjugater. Her merkes antistoffene med en indikerende gruppe inneholdende et element som er aktivt i kjernemagnetisk resonanssspektro-skopi (NMR), dvs. et NMR-aktivt element. Mange slike elementer er kommersielt tilgjengelige i tillegg til de mer vanlige

15„T , . ,

C, N og lignende.

Det er spesielt fordelaktig å anvende en indikerende gruppe inneholdende det NMR-aktive atom, eller et flertall av slike atomer ettersom (i) hovedsakelig alle av de naturlige tallrike fluoratomer er<19>F-isotopen slik at således hovedsakelig alle fluor-holdige forbindelser er NMR-aktive; (ii) mange kjemisk aktive polyfluorerte forbindelser slik som trifluoreddiksyreanhydrid, er kommersielt tilgjengelige til en relativt lav pris, og (iii) mange fluorerte forbindelser er blitt funnet å være medisinsk akseptable for anvendelse i mennesker slik som de perfluorerte polyethere som anvendes for å bære oxygen som hemoglobin-erstattere.

En annen særlig fordel med anvendelse av fluor-holdige NMR-aktive indikerende grupper, er at kroppen inneholder

meget lite fluor under normale betingelser. Ved anvendelse av et NMR-aktivt element som ellers er hovedsakelig fraværende i dyret, vil følgelig bakgrunnssignaler på grunn av fluoratomer i kroppen være hovedsakelig fraværende. Således skyldes de observerte prinsipale signaler de merkede antipolypeptid-neoplastiske cellekomplekser.

I denne utførelsesform er antistoffene fortrinnsvis merket med et fluor-holdig materiale slik som trifluoreddiksyreanhydrid eller hexafluorethanol under dannelse av et fluorert amid eller esterderivat. Deretter injiseres de fluorerte antistoffer i blodstrømmen til et tumor-holdig dyr. Etter en på forhånd bestemt inkubasjonstid for at de merkede antistoffer skal kompleksdannes med det beslektede oncoprotein på tumorcelleoverflaten, utføres en såkalt "helkropps" NMR-bestemmelse under anvendelse av en apparatur slik som en av de som er beskrevet av Pykett, Scientific American, 246, 78-88 (1982), for å lokalisere tumoren.

De ovenfor angitte metoder for lokalisering av en neoplastisk tumor in vivo i et dyr innbefatter således følgende trinn: (a) tilveiebringelse av et preparat omfattende idiotype-holdige polyamider slik som antistoffer dannet mot de syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen, eller deres konjugater bundet til en bærer, hvori de idiotype-holdige polyamider er bundet individuelt til indikerende grupper. De anvendbare, indikerende grupper innbefatter gammastråle-emiserende elementer, NMR-aktive elementer og lignende. (b) Preparatet injiseres i blodstrømmen til et neoplastisk tumor-bærende dyr. (c) Det således injiserte dyr inkuberes i en på forhånd bestemt tid som er tilstrekkelig til at anti-polypeptidet med bundet indikerende gruppe skal danne et kompleks på overflaten av tumoren. (d) Dyret avsøkes deretter med midler for å påvise lokaliseringen av den kompleksdannede indikerende gruppe. Typiske påvisningsanordninger innbefatter vanlig anvendte gammastråle-emisjonsdetektorer, de apparater som anvendes i positronemisjonstomografi og såkalt "helkropps" NMR-spektro-metere som i praksis bare avsøker en del av kroppen på ethvert tidspunkt.

VII. Behandling av neoplastiske sykdommer

Den ovenfor angitte diskusjon i avsnitt V angikk bruk av idiotype-holdige polyamider slik som antistoffer dannet mot et polypeptid II-KLH-konjugat for å immunisere og be-skytte en vert (katter) mot etterfølgende infeksjon av FeSV-holdige celler som ble injisert i dyrene. Foreliggende diskusjon angår anvendelse av idiotype-holdige polyamider og i sær deleshet antistoffer dannet mot de syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen eller deres konjugater for å behandle neoplasia som er kjent for å være tilstede i celler. Her igjen anvendes den selektive kryssreaktivitet av de idiotype-holdige polyamider til oncoproteiner som er forskjellige fra, men beslektet med de oncoproteinområder til hvilke de ble dannet. Spesifisiteten av antistoffene ifølge oppfinnelsen overfor områder tilstøtende det aktive sete av oncoproteinet, kan også anvendes. Antistoffer anvendes igjen som eksempler på idiotype-holdige polyamider i avsnitt A og B i det etter-følgende .

A. Antistoff- cellereaksjoner

Antistoffer dannet mot et polypeptid ifølge oppfinnelsen eller dets konjugat, tilveiebringes, såvel som neoplastiske celler, enten in vivo eller in vitro. Antistoffene og de neoplastiske celler blandes for å bringe cellene i kontakt med antistoffene. En slik kontakt forårsaker dannelse av et immunkompleks mellom antistoffene og det beslektede, cellulære oncoprotein som har et homologt antigenisk område, og kan blokkere et aktivt sete av det cellulære oncoprotein.

Blokkering av et cellulært oncoproteins aktive sete motvirker eller retarderer dets funksjon i oncogenese og gir derved en reduksjon av den oncogene effekt på cellene. En slik reduksjon av funksjonen gir en stase i den oncogene tilstand for cellene in vitro og inhiberer derved veksten av neoplastiske celler.

Dannelsen av immunkomplekser på celleoverflater in vivo eller in vitro hvor medlemmene av det komplemente banesystem er tilgjengelig, fører til lyse av de neoplastiske celler inneholdende immunkomplekser på deres overflater. Denne lyse finner sted på samme måte som medlemmene av det komplemente banesystem lyserer invaderende celler under vanlige immun-system-reaksjonsbetingelser og er velkjente innen faget.

B. Antistoffer kjedet til cytotoksiske midler

I en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen kjedes et cytotoksisk middel til antistoffene ifølge oppfinnelsen. Det cytotoksiske middel virker til å drepe de neoplastiske celler i tillegg til enhver virkning tilveiebrakt av antistoffene eller deres idiotype-holdige fragmenter. Således anvendes igjen antistoffenes spesifisitet for å lokalisere og bindes til neoplastiske celler inneholdende kryssreaktive oncoproteiner.

Det anvendte cytotoksiske middel kan være et legemiddel slik som adriamycin, G-418-varianten av neomycin eller lignende. Det er særlig foretrukket at det cytotoksiske middel virker i det minste delvis ved kontakt med de neoplastiske cellemembraner.

Adriamycin er eksempel på et særlig foretrukket cytotoksisk middel. Adriamycin bindes til et antistoff gjennom dets sukkerring-aminogruppe via et dialdehyd slik som glutaraldehyd, med et vannløselig carbodiimid eller annet velkjent bindende middel. Tritton et al., Science, 217, 248-249

(1982), har beskrevet binding av adriamycin til agarosekuler.

Disse forfattere bandt legemidlet til agarosekulene som et middel for å kontakte neoplastiske cellemembraner, men man unngikk den generelle utbredelse av legemidlet gjennom kropps-vevet da adriamycin er kjent for å ha toksisk virkning på cancerpasienters hjerter. De således kontaktede cancer-celler etter Tritton et al.-metoden døde.

Det ble antatt i en artikkel på side 69 i Science News: 31. juli 1982, at et middel forskjellig fra agarosekuler ville være nødvendig for in vivo-anvendelse på humane pasienter. Imidlertid var denne antagelse begrenset til et spesifikt materiale, plasmamembranproteiner, og innbefattet ikke bruk av de spesifikke antistoffer som dannes mot foreliggende syntetiske polypeptider eller deres konjugater, ettersom antistoffer slik som de her beskrevne, tidligere ikke har vært tilgjengelige.

VIII. Monoklonale idiotype- holdige polyamider

Den ovenfor angitte diskusjon har tatt for seg idiotype-holdige polyamider slik som antistoffer som har spesifikk aktivitet mot et determinantområde i et oncoprotein såvel som aktiviteter mot homologe områder i andre oncoproteiner. Hvor imidlertid et syntetisk polypeptid konjugeres til en bærer, kan antistoffer mot bæreren også dannes. I tillegg kan de individuelle antistoffmolekyler som dannes mot de syntetiske polypeptiddeler av konjugatet, ha varierende immunoreaktiviteter med det syntetiske polypeptid og/eller oncoprotein.

Nærvær av anti-bærer-antistoffer og antistoffer som har varierende reaktiviteter med det syntetiske polypeptid og/eller oncoprotein i antisera som også inneholder de sterkt immunoreagerende spesifikke antistoffer overfor syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen, er tilbøyelig til å for-tynne aktiviteten av de sistnevnte antistoffer og de relativt mindre idiotype-holdige polyamiddeler, basert på det totale antall av idiotype-holdige molekyler som er tilstede. Monoklonale idiotype-holdige polyamider ble derfor fremstilt for å heve immunoreaktiviteten av de ønskede idiotype-holdige polyamider pr. molekyl. Intakte antistoffer ble igjen anvendt som eksempler på idiotype-holdige polyamider.

Mus ble immunisert med polypeptid II-KLH-konjugatet som tidligere diskutert under anvendelse av 5Cyug av konjugat i Freunds fullstendige adjuvans pr. dyr. 1 uke etter første immunisering ble hvert dyr gitt en booster-immunisering inneholdende ytterligere 5Cyug av konjugatet i Freunds ufullstendige adjuvans.

Antistofftitere ble fulgt med blodprøver under anvendelse av den tidligere beskrevne ELISA-teknikk inntil titeren nådde en verdi på minst 1:1000 til 1:5000. Så snart titrene nådde de ønskede 1:1000-5000 nivåer, fikk dyrene hvile i 3 til 4 uker.

Deretter ble hvert dyr igjen gitt en booster med en tredje immunisering. Den tredje immuniseringsløsning inne-holdt 500^ug konjugat i enten vann eller vann inneholdende 10% alum.

Dyrene ble avlivet 72-120 timer etter den tredje immunisering, og deres milt ble fjernet. De således erholdte miltceller ble kondensert, og monoklonale antistoffer ble fremstilt under anvendelse av vel karakteriserte prosedyrer. Se US patentskrift 4 172 124.

De således fremstilte monoklonale antistoffer ble screenet med ELISA med hensyn til deres immunoreaktiviteter med polypeptid II under anvendelse av supernatant fra de dyrkede celler som antistoffkilden. De monoklonale antistoffer som utviste sterk immunoreaktivitet, ble deretter testet med hensyn til deres evne til å immunoutfelle fes-oncoproteinet. Cellelinjene som ga monoklonale antistoffer som immunoreagerte sterkt med det syntetiske polypeptid og immunoutfelte dets tilsvarende oncoprotein, ble deretter formert, og deres monoklonale antistoffer ble oppsamlet for bruk.

Den foregående beskrivelse er beregnet på å illustrere oppfinnelsen uten å begrense denne. Utallige variasjoner og modifikasjoner kan utføres uten å avvike fra oppfinnelsens ramme. Det skal forståes at ingen begrensning med hensyn til de spesifikke polypeptider, antistoffer, deres preparater og anvendelser som her illustrert, er tatt i betraktning. Oppfinnelsen er definert ved de etterfølgende krav.

Claims (15)

1. Syntetisk polypeptid, karakterisert ved at det har en aminosyre-restsekvens svarende hovedsakelig til en aminosyre-restsekvens av et determinantområde av et oncoprotein kodet av et oncogent virus, hvilket determinantområde er tilstøtende, men uten et aktivt sete av angitte oncoprotein, og hvilket syntetiske polypeptid har kapasitet, alene eller som et konjugat av angitte polypeptid bundet til en bærer, til å fremkalle dannelse av antistoffer når det injiseres i en vert, hvilke antistoffer inhiberer en reaksjon ved angitte oncoproteins aktive sete.

2. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det inneholder 10 til 40 aminosyrerester.

3. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at angitte sekvens inneholder 10 til 25 aminosyrerester.

4. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det har en aminosyresekvens inneholdende 10 til 25 aminosyrerester og svarende hovedsakelig til en aminosyre-restsekvens av et første determinantområde av et første oncoprotein dannet av celler omdannet av et oncogent virus, hvilket første determinantområde er tilstøtende, men uten et fosfor-overførings-katalysesete av angitte oncoprotein, og at angitte syntetiske polypeptid har kapasitet, alene eller som et konjugat av angitte polypeptid bundet til en bærer, til å fremkalle produksjon av antistoffer når de injiseres i et vertsdyr, hvori angitte antistoffer: (a) immunoutfeller angitte oncoprotein; (b) inhiberer en fosfor-overføringsreaksjon katalysert av angitte oncoprotein ved angitte fosfor-overføringssete; og (c) reagerer konkurrerende med en blanding inneholdende angitte polypeptid eller angitte konjugat og et andre oncoprotein tilstedeværende i en kroppskomponent av et tumor-bærende dyr, hvilke andre oncoprotein har et determinantområde homologt med angitte første område, og hvor tumoren i angitte dyr er forskjellig fra den som fremkalles av angitte oncogene virus.

5. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det er bundet til et bærermolekyl.

6. Antistoff dannet mot et syntetisk antigen, hvilket syntetiske antigen omfatter et syntetisk polypeptid ifølge krav 1 eller et konjugat av angitte polypeptid bundet til en bærer.

7. Antistoff ifølge krav 6, karakterisert ved at dette: (a) inhiberer en fosfor-overføringsreaksjon ved angitte første oncoproteins aktive sete, (b) er i stand til å utfelle angitte første oncoprotein, og (c) immunoreagerer med et andre oncoprotein som har et determinantområde homologt med angitte første område.

8. Diagnostisk reagenssystem for bestemmelse av nærvær av en forøket mengde av et første oncoprotein kodet av et oncogen som normalt er tilstede i celler sammenlignet med mengden av angitte første oncoprotein som normalt er tilstede, karakterisert ved at det omfatter i separate beholdere: (a) et første reagens som inneholder i biologisk aktiv form et syntetisk polypeptid ifølge krav 1, og (b) et andre reagens i biologisk aktiv form innbefattende idiotype-holdige polyamider dannet mot angitte syntetiske polypeptid eller dets konjugat, sammen med indikerende grupper; hvor angitte første og andre reagens når disse er blandet i på forhånd bestemte mengder i nærvær av en på forhånd bestemt mengde av en kroppskomponent som skal bestemmes, gir en grad av immunoreaksjon, hvilken grad av immunoreaksjon er forskjellig fra en kjent grad av immunoreaksjon når en forø ket mengde av angitte første oncoprotein er tilstede i angitte kroppskomponent.

9. Diagnostisk reagens omfattende idiotype-holdige polyamider som individuelt er bundet til indikerende grupper, karakterisert ved at angitte idiotype-holdige polyamider (a) er dannet mot et syntetisk polypeptid ifølge krav 1, eller mot et konjugat av angitte syntetiske polypeptid bundet til en bærer; og (b) immunoreagerer med et andre oncoprotein som har et antigenisk område homologt med angitte determinantområde av angitte første oncoprotein.

10. Fremgangsmåte for inhibering av vekst av neoplastiske celler, karakterisert ved den omfatter følgende trinn: (a) tilveiebringelse av neoplastiske celler med oncoproteiner på deres overflater; (b) angitte celler bringes i kontakt med en effektiv mengde av idiotype-holdige polyamider dannet mot et syntetisk polypeptid ifølge krav 1 eller et konjugat av angitte polypeptid bundet til en bærer, hvilket syntetiske polypeptid har en aminosyresekvens som er homolog med et determinantområde av angitte oncoproteiner dannet av angitte neoplastiske celler; og opprettholdelse av angitte kontakt under dannelse av immunkomplekser mellom angitte oncoproteiner på de neoplastiske celleoverflater og angitte idiotype-holdige polyamider.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at angitte idiotype- holdige polyamider innbefatter et cytotoksisk legemiddel bundet dertil.

12. Fremgangsmåte for påvisning av nærvær av neoplastisk sykdom i et dyr, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) tilveiebringelse av en kroppskomponent fra angitte dyr; (b) angitte kroppskomponent blandes med et preparat innbefattende idiotype-holdige polyamider dannet mot et syntetisk polypeptid ifølge krav 1 eller mot et konjugat av angitte polypeptid bundet til en bærer; og (c) bestemmelse av nærvær i angitte blanding av en immunologisk reaksjon mellom angitte kroppskomponent og angitte idiotype-holdige polyamider.

13. Fremgangsmåte for immunisering av et dyr mot neoplastisk vekst, karakterisert ved de følgende trinn: (a) tilveiebringelse av et syntetisk polypeptid ifølge krav 1 eller et konjugat av angitte polypeptid bundet til en bærer; (b) dispergering av angitte polypeptid eller konjugat i en fysiologisk akseptabel bærer under dannelse av en vaksine; og (c) injisering av en effektiv mengde av angitte vaksine i blodstrømmen på angitte dyr som skal immuniseres.

14. Fremgangsmåte for lokalisering av en neoplastisk tumor i et dyr in vivo, karakterisert ved følgende trinn: (a) tilveiebringelse av et preparat omfattende idiotype-holdige polyamider som individuelt er bundet til indikerende grupper, hvori angitte idiotype-holdige polyamider (i) dannes mot et syntetisk polypeptid ifølge krav 1 eller mot et konjugat av angitte syntetiske polypeptid bundet til en bærer; (ii) inhiberer en reaksjon ved et aktivt sete av angitte oncoprotein; og (iii) immunoreagerer med et andre oncoprotein med et antigenisk determinantområde homologt med angitte område av første oncoprotein; (b) injisering av angitte preparat i blodstrømmen på et neoplastisk tumor-bærende dyr; (c) inkubering av dyret i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig til at det indikerende gruppe-bundne polypeptid kan danne et kompleks på overflaten av angitte tumor; og (d) avsøkning av dyret med en anordning for påvisning av lokaliseringen av angitte kompleksdannende, indikerende grupper.

15. Vaksine til beskyttelse av et dyr mot neoplastisk sykdom, karakterisert ved at det omfatter en effektiv mengde av et syntetisk polypeptid ifølge krav 1 eller et konjugat av angitte polypeptid bundet til en bærer dispergert i en fysiologisk akseptabel bærer.