NO850975L - Renininhibitorer inneholdende statin eller derivater derav - Google Patents

Description

Det proteolytiske enzym renin, som har en molekylvekt på

ca. 40.000, produseres i nyrene og utskilles i blodet. Det er kjent som aktivt in vivo ved å spalte det naturlig fore-

kommende plasma glykoprotein angiotensinogen, for det humane angiotensinogens vedkommende i bindingen mellom leucine- (10.)

og valin- (11.) aminosyreresten i den N-terminale ende av angiotensinogenet:

Det sirkulerende N-terminale dekapeptid (angiotensin I) som

dannes ved den ovennevnte spaltende virkning av renin, ned-

brytes deretter av kroppen til et oktapeptid, kjent som angiotensin II. Angiotensin II er kjent som en potent pressor-

substans, dvs. en substans som er i stand til å indusere en signifikant blodtrykksøkning, og antas å virke ved å forårsake sammentrekning av blodkarene og frigjøring av det natrium-tilbakeholdende hormon aldosteron, fra binyrebarken. Det renin-angiotensinogene system har derfor vært sett på som en med-virkende faktor i visse former av hypertensjon.

En måte for å lette de uheldige effekter av virkningen

av det renin-angiotensinogene system, består i administrasjon av en substans som kan inhibere den angiotensinogen-spaltende virkning av renin. En rekke sådanne substanser er kjent, her-under antirenin-antilegemer, pepstatin og naturlig forekommende fosfolipider. Europeisk patentsøknad nr. 45.665 (publisert 2. feb. 1982) beskriver en serie renin-inhiberende polypeptid-derivater med formelen

hvor X kan være hydrogen eller en amino-beskyttende gruppe,

Y kan mangle, B er en lipofil aminosyrerest, Z er en aromatisk aminosyrerest, W kan være hydroksyl og A kan bl.a. være

hvor hver av R 1 og R 2 er en lipofil eller aromatisk sidekjede.

I henhold til definisjonene gitt i denne publiserte patent-søknad, inngår ikke at A eller Z kan være statin eller at B kan være lycin.

Europeisk patentsøknad nr. 77.028 (publisert 20. apr., 1983) beskriver en rekke renin-inhiberende polypeptid-forbindelser som har en ikke-terminal statin- eller statin-derivatrest. Disse innbefatter forbindelser med en fenylalanin-histidin-statin sekvens. Den publiserte patentsøknad beskriver imidlertid ikke plassering av lycin umiddelbart etter Phe-His-Sta-sekvensen.

Vi har nå oppdaget at visse nye forbindelser er nyttige renin-inhiberende midler. Denne serie av nye forbindelser består av polypeptider og polypeptid-derivater med formelen

og de farmasøytisk akseptable salter derav,

hvor

W er fenylalanin, histidin, leucin, tyrosin, 1-naftyl-alanin eller 2-fenylmetyl-propionylen;

W er fenylalanin, histidin, leucin, tyrosin eller norleucin, hvor peptidbindingen mellom W og W i eventuelt er erstattet med -CH(alkyl med 1-4 karbonatomer)-NH- når W er fenylalanin og W 1 er histidin;

R er hydrogen, en amino-beskyttende acyldel med en molekylvekt på mindre enn 500, prolin, amino-beskyttet prolin, pyroglutaminsyre eller amino-beskyttet pyroglutaminsyre;

R 2 er hydrogen, alkyl med 1-6 karbonatomer, fenyl, cykloalkyl med 4-7 karbonatomer, fenylalkyl med 7-9 karbonatomer eller cykloalkyl(alkylen) med 5-10 karbonatomer;

R3 er hydroksyl, amino, -NHR<9>, -NHCOR<9>, -OR<9>eller

9 9

-OCOR , hvor R er alkyl med 1-4 karbonatomer; og

R<1>er

(a) -A-E-B,

hvor A er lysin eller prolin, eller dessuten, bare når R 3 er amino, isoleucin, E kan være fenylalanin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, lysin, ornitin, arginin, asparagin-

syre, gamma-forestret asparaginsyre, glutaminsyre eller

4 4 5 delta-forestret glutaminsyre, B kan være -OR , -NR R , 4 4 4 5

-glutaminsyre(OR ) ~ , -glutaminsyre(-OR )(NR R ) eller

4 5 4 5

-glutaminsyre(-NR R)2, og R og R hver kan være hydrogen, alkyl med 1-4 karbonatomer, fenylalkyl med 7-9 karbonatomer eller cykloalkyl(alkyl) med 5-10 karbonatomer,

hvor X kan mangle eller være alanin, isoleucin, lysin, prolin, ornitin, arginin, N-(alkyl med 1-4 karbonatomer)-lysin, N,N-di(alkyl med 1-4 karbonatomer)-lysin, N-(alkyl med 1-4 karbonatomer)-ornitin eller N,N-di(alkyl med 1-4 karbonatomer)-ornitin, Z og Z i hver er hydrogen, alkyl med 1-6 karbonatomer, cykloalkyl med 4-7 karbonatomer, cykloalkyl(alkylen) med 5-10 karbonatomer eller fenylalkyl med 7-9 karbonatomer, n og m begge er heltall fra 0 til 6, Q er

fi 6 7

Y er metyl, fenyl, -COOR , -CONR R , -NH~, (benzyloksy)-karbonylamino, -CO-glutaminsyre(-OR 6)„, -CO-glutaminsyre-

a cl ~i c "7 (OR )(-NR R ) eller -CO-glutaminsyre(-NR R )2, og R og R hver er hydrogen, alkyl med 1-4 karbonatomer, fenylalkyl med 7-9 karbonatomer eller cykloalkyl(alkylen) med 5-10 karbonatomer,

(c) -NH2,

(d) -alkoksy med 1-4 karbonatomer,

(e) 4-benzylpiperazin-1-yl,

(f) 1,2,3,4-tetrahydrokinolin-1-yl,

(g) 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-2-yl,

(h) 1,2,3,4-tetrahydro-3-aminokarbonylisokinolin-2-yl, (i) 1,2,3,4-tetrahydro-3-metoksykarbonylisokinolin-2-yl,

(j) 1,2,3,4,5,6,7,8-dekahydro-3-metoksykarbonyl-isokinolin-2-yl,

(k) 2-metoksykarbonyl-pyrrolidin-1-yl,

(1) 2-aminokarbonyl-pyrrolidin-1-yl,

(m) 4-fenylmetyl-piperidin-1-yl,

(n) -prolin-B, hvor B er som ovenfor angitt, eller (o) -lysin-B, hvor B er som ovenfor angitt.

Av spesiell interesse er de forbindelsene hvor R er en amino-beskyttende acyldel eller amino-beskyttet prolin, W er fenylalanin, W i er histidin bundet til W gjennom en peptid-2 3

binding, R er isobutyl eller cykloheksyl(metylen), R er hydroksy og R i er (a), (b) eller (n), som definert ovenfor, idet A er lysin når R 1 er (a) og X er lysin eller prolin når R1 er (b) .

Forbindelsene fremstillet i henhold til oppfinnelsen oppviser antihypertensiv virkning ved in vivo forsøk i patte-dyr, innbefattet mennesket. Dette skyldes i vesentlig grad deres evne til å inhibere reninets spaltning av angiotensinogen. Mekanismen for denne renin-inhiberende virkning av forbindelsene med formel I, kan for eksempel bero på selektiv binding (sammenlignet med angiotensinogen) til renin. Som følge av deres lave molekylvekt, har forbindelsene I fordel-aktige løselighetsforhold i vandige media. Dette muliggjør peroral administrasjon, og syntetisering til rimelige økono-miske omkostninger. Forbindelsene fremstillet i henhold til oppfinnelsen kan dessuten benyttes som diuretika.

Med "farmasøytisk akseptable" salter er det her ment salter som er ugiftige i de gitte doseringer. I og med at forbindelsene med formel I kan inneholde både basiske og sure grupper, er både syreaddisjons- og baseaddisjonssalter mulige. Farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter innbefatter f.eks. hydroklorider, hydrobromider, hydrojodider, sulfater, bisulfater, fosfater, sure fosfater, acetater, laktater, maleater, mesylater, fumarater, citrater, sure citrater, tartrater, bitartrater, succinater, glukonater og sakkarater. Farmasøytisk akseptable baseaddisjonssalter innbefatter f.eks. natrium, kalium, kalsium og magnesiumsalter. Konvensjonelle fremgangsmåter for å danne syreaddisjons- og baseaddisjons-saltene kan benyttes.

Gruppen R i den N-terminale ende av formel I, som er bundet til alfa-nitrogenet i resten W, er valgt fra hydrogen, amino-beskyttende acylgrupper med molekylvekt på mindre enn 500, prolin, amino-beskyttet prolin, pyroglutaminsyre og amino-beskyttet pyroglutaminsyre. Den amino-beskyttende gruppe av amino-beskyttet prolin eller amino-beskyttet pyroglutaminsyre er også en amino-beskyttende acyldel med en molekylvekt på mindre enn 500. Uttrykket "amino-beskyttende acyldel" står for acylgrupper som kan gi en betydelig in vivo inhibering av reaksjonen i alfa-nitrogenet av W (eller prolin eller pyroglutaminsyre) etter peroral administrasjon. R har en molekylvekt på mindre enn 500 for å hindre ugunstige løselighets-forhold. Eksempler på egnede amino-beskyttende acyldeler er vel kjent, således kan f.eks. nevnes t-butyloksykarbonyl, t-butylacetyl, benzyl-oksykarbonyl, t-butylureido, (tris-hydroksy)-(t-butylureido) og fenoksyacetylgrupper. Gruppen R er fortrinnsvis av typen

hvor M er -O-, -CH2", -NH- eller -S02NH- og

R^er alkyl med 1-6 karbonatomer, fenyl, fenylalkyl med 7-9 karbonatomer eller cykloalkyl(alkylen) med 5-10 karbonatomer.

4 4 5

Uttrykkene glutaminsyre-(OR )(-NR R ) og -CO-glutamin-

6 6 7 syre(-OR )(NR R ) viser her både til C-terminale grupper som er amidert i glutaminsyrens deltakarbon og C-terminale grupper som er forestret i glutaminsyrens deltakarbon. Som tidligere angitt består en foretrukket gruppe av forbindelser med formel I, av slike hvor R 3 er hydroksyl og R 2 er isobutyl eller cykloheksyl(metylen), helst sistnevnte, slik at

blir -statin- eller -cyklostatin-, R er en amino-beskyttende acyldel med molekylvekt på mindre enn 500 eller amino-beskyttet prolin, W er fenylalanin, W1 er histidin bundet til W gjennom en peptidbinding og R^ er -Lys-E-B, -Pro-B, eller -(Lys eller

Plasseringen av en lysinrest (i stedet for eksempelvis en leucin-, isoleucin-, valin- eller alaninrest) umiddelbart etter -fenylalanin-histidin-(statin eller cyklostatin)- gir en markert og overraskende økning av varigheten av den renin-inhiberende virkning in vivo. En annen foretrukket gruppe av forbindelser med formel I består av forbindelser hvor R er en amino-beskyttende acyldel med molekylvekt på mindre enn 500 eller amino-beskyttet prolin, W er fenylalanin, W 1 er histidin bundet til W gjennom en peptidbinding, R 3 er hydroksyl, R 2 er isobutyl eller cyklo-heksyl(metylen), helst sistnevnte, og R i er

Reduksjon av peptidkarakteren av molekylstrukturen nærmest C-terminalen synes å forbedre absorbsjonen i blod-strømmen etter peroral administrasjon.

Det skal bemerkes at når n og m begge er null, Z er

OH

isobutyl, Q er -C' H-, Z 2 er hydrogen og Y er karboksyl, blir R<1>-X-statin.

Spesielt verdifulle er følgende forbindelser og deres farmasøytisk akseptable salter: [N-(t-butyloksykarbonyl)-prolin]-fenylalanin-histidin-cyklostatin-lysin-fenylalanin;

[N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-cyklostatin-lysin-fenylalanin;

[N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-lysin-fenylalanin;

[N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-alanin-statin-glutaminsyre;

[N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-isoleucin-[amino(n-smørsyre)];

[N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-cyklostatin-[amino(2-sek-butyl-etylen)]-fenylalanin;

[N-(t-butyloksykarbonyl)fenylalanin]-histidin-statin-[amino(2-sek-butyl-etylen)]-fenylalanin;

[N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-cyklostatin-1,2,3,4-tetrahydro-2-isokinolin;

[N-(t-butyloksykarbonyl)-prolin]-fenylalanin-histidin-cyklostatin-1,2,3,4-tetrahydro-2-isokinolin;

[N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-cyklostatin-prolin-[amino(n-pentylen)amin];

[N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-cyklostatin-prolin-metylester;

[N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-cyklostatin-etylester;

[N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-cyklostatin-prolin-NH2;

[N(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-cyklostatin-Nt^;°^

[N(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-cyklostatin-lysin-statin.

Forbindelsene med formel I kan fremstilles etter vel-kjente metoder. Den grunnleggende del av den foretrukne syntese består i acyleringen av den ubeskyttede alfa-amino-gruppen i en aminosyrerest med en aminosyre som har en aktivert (for acyleringsformål) karboksylfunksjon og en passende beskyttende gruppe bundet til sitt eget alfa-nitrogen, slik at det dannes en peptidbinding mellom de to aminosyrerestene, hvorpå beskyttelsesgruppen fjernes. Denne syntesedel bestående av en kobling-deblokkering, foretas gjentatte ganger for å bygge opp polypeptidet ved å starte fra molekylstrukturens C-terminal og arbeide seg frem til N-terminalen. Alfa-amino-syrer for syntese av forbindelser med formel I er kommersielt tilgjengelige (som fri syrer, salter, estere, etc.) både i alfa-amino-beskyttet og alfa-amino-ubeskyttet form. Statin er kommersielt tilgjengelig som N-(t-butyloksykarbonyl)-statin og kan dessuten fremstilles (som fri syre eller ester) både i den gamma-amino-beskyttede og gamma-amino-ubeskyttede form etter fremgangsmåter beskrevet i litteraturen (se f.eks. US-patent 4.397.786 og Rich, D. H. et al., Jour, Org. Chem., 43, s. 3624 (1978). Om ønskes, benyttes en passende N-ubeskyttet aminosyreanalog (fri syre, salt, ester, etc.)

så som 4-aminosmørsyre, 4-amino-valeriansyre eller 4-amino-

4-sek-butyl-smørsyre som reaktant i det første koblingstrinn. Passende derivater av statin kan fremstilles etter konvensjonelle syntesemetoder. Således kan for eksempel forbindelsen som her er betegnet aminostatin, fremstilles i en form hvor begge aminogruppene er beskyttet, ved å omsette en amino-beskyttet statinester med et sulfonylklorid slik at det dannes en sulfonatester, som omsettes med natriumazid til en amino-beskyttet 4-isobutyl-2-butensyre-ester og en amino-beskyttet 4-isobutyl-3-azidosmørsyre-ester, hvorpå alkenforbindelsen omsettes med et primært amin og/eller azidoforbindelsen hydrogeneres og den resulterende mellomforbindelse, reduseres med et alkalimetallhydrid i nærvær av et aldehyd, under dannelse (i begge tilfeller) av et 4-isobutyl-3-sek-amino-derivat av smørsyre, som så hydrogeneres og deretter omsettes med acylhalogenid under basiske betingelser. N-beskyttede forbindelser

som her omtales som N-beskyttede cyklostatinforbindelser, kan fremstilles ved hydrogenering av den korresponderende N-beskyttet-4-amino-4-fenylmetyl-3-hydroksysmørsyre-forbindelse, som selv kan fremstilles som beskrevet av Rich, D. H. et al., Jour. Med. Chem., 23( 1) s. 27-33 (1980).

Den reduserte peptid1 binding (-C0- erstattet med -CH-z-)

i nye forbindelse hvor R er

n er minst 1 og Q er -NH-, kan oppnås ved å redusere et aldehyd med formelen

beskyttende i nærvær av en aminosyre-ester med formel

hvor R er forskjellig fra hydrogen.

Virkningen av de nye forbindelsene, som inhibitorer av reninets angiotensinogen-spaltende virkning, kan studeres gjennom (1) deres evne til å inhibere reninets angiotensinogen-spaltende virkning in vitro og (2) deres evne til å anta-gonisere eksogen renin-indusert pressor-respons in vivo.

Forbindelsene fremstillet i henhold til foreliggende oppfinnelse, kan gis som antihypertensive midler, enten peroralt eller parenteralt, av bekvemmelighetshensyn for pasienten, fortrinnsvis peroralt. Disse antihypertensive forbindelsene gis normalt i doser på 0,1-10 mg/kg legemsvekt/dag med visse variasjoner avhengig av pasientens tilstand og hvilken forbindelse som gis. Det startes med en lav døgndose som økes dersom behandlende lege finner det nødvendig. Forbindelsene kan, for begge angitte administrasjonsmåter, gis i kombinasjon med farmasøytisk akseptable bæremidler, ved en enkelt eller gjentatt behandling.

De nye forbindelsene kan gis peroralt i mange forskjellige doseringsformer, dvs. de kan formuleres med forskjellige farmasøytisk akseptable, inerte bæremidler i form av tabletter, kapsler, pastiller, drops, pulvere, spray, vandige suspensjoner, miksturer, siruper og lignende. Bære-midlene innbefatter faste fortynnings- eller fyllmidler, sterile, vandige media, forskjellige ugiftige, organiske opp-løsningsmidler, etc. Preparatene kan dessuten være tilsatt søtnings- og/eller aromamidler av vanlig anvendt type. De perorale doseringsformene inneholder i alminnelighet de nye forbindelser i konsentrasjoner på 0,5-90 vektprosent, i mengder som er tilstrekkelige for å gi denønskede enhetsdose.

For den perorale administrasjon kan det benyttes tabletter inneholdende forskjellige hjelpestoffer, så som natriumcitrat, kalsiumkarbonat og kalsiumfosfat, sammen med forskjellige sprengmidler, så som stivelse, fortrinnsvis potet- eller tapiokastivelse, alginsyre og visse komplekse silikater, sammen med bindemidler, så som polyvinylpyrrolidon, sukrose, gelatin og gummi arabicum. Glattemidler, så som magnesium-stearat, natriumlaurylsulfat og talkum er dessuten ofte for-delaktige under tablettfremstillingen. Faste sammensetninger av lignende type kan også benyttes som innhold i myke og hårde gelatinkapsler. Foretrukne materialer i denne forbindelse vil også innbefatte laktose eller melkesukker, så vel som poly-etylenglykoler med høy molekylvekt. I vandige suspensjoner og/eller miksturer for peroral administrasjon, kan virkestoffet kombineres med forskjellige søtningsmidler eller aromamidler, naturlige eller kunstige farvestoffer og eventuelt med emulgerings- og/eller suspenderingsmidler, samt med for-tynningsmidler som vann, etanol, propylenglykol, glycerol og forskjellige kombinasjoner av disse.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

[ N-( t- butyloksykarbonyl)- Phe]- His- Sta- Lys- Phe

A. [N-alfa-(t-butyloksykarbonyl)-N-epsilon-benzyloksy-karbonyl- lysin]- fenylalanin- benzylester

N-hydroksybenzotriazol (162 mg, 1,2 mmol), N-metyl-morfolin (101,2 mg, 1 mmol), L-fenylalanin-benzylester-p-toluensulfonat (428 mg, 1 mmol), N-alfa-(t-butyloksykarbonyl)-N-epsilon-benzyloksykarbonyl-L-lysin (456 mg, 1,2 mmol) og 1-cykloheksyl-3-(2-morfolinetyl)-karbodiimid-meto-p-toluensulfonat (635 mg, 80 % rent, 1,2 mmol), ble i rekkefølge løst opp i metylenklorid (50 ml) ved 0°C og den resulterende opp-løsning omrørt i 19 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter vasket suksessivt med 75 ml 5,5 % vandig HC1, 75 ml mettet, vandig NaHC03og 75 ml saltoppløsning og tørket over vannfri MgSO4 ,. Etter filtrering og inndampning ble 669 mg råprodukt oppnådd som et skum ( H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]). Råproduktet ble benyttet uten videre rensing i det neste trinn.

B. (N-epsilon-benzyloksykarbonyl-lysin)-fenylalanin-benzylester- hydroklorid

[N-alfa-(t-butyloksykarbonyl)-N-epsilon-benzyloksy-karbonyl-lysin]-fenylalanin-benzylester fra trinn A (650 mg,

1 mmol) ble løst opp i 7 ml 3,7N HCl/dioksan og satt tilside

i 1 time ved 20°C. Oppløsningen ble deretter inndampet til tørrhet, hvorved 583 mg råprodukt ble oppnådd som en olje som ble benyttet uten rensing i det neste trinn ( iH-NMR, CD^OD, 5,2 delta, 2H s [benzyl CH21).

C. [N-(t-butyloksykarbonyl)-statin]-(N-epsilon-benzyl-oksykarbonyl- lysin)- fenylalanin- benzyl- ester

(N-epsilon-benzyloksykarbonyl-lysin)-fenylalanin-benzylester-hydroklorid fra trinn B (583 mg, 1 mmol) , N-metyl-morfolin (101,2 mg, 1 mmol), N-(t-butyloksykarbonyl)-statin (330 mg, 1,2 mmol), N-hydroksybenzotriazol (162 mg, 1,2 mmol) og 1-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbodiimid-meto-p-toluensulfonat (635 mg, 80 % rent, 1,2 mmol), ble i rekkefølge løst opp i 50 ml metylenklorid ved 0°C og den resulterende oppløsning omrørt i 19 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble opparbeidet som i trinn A til 76 0 mg råprodukt som ble benyttet uten videre rensing i det neste trinn. ( 1H-NMR, CDCl-^, 1,5 delta, 9H s [BOC]).

D. Statin-(N-epsilon-benzyloksykarbonyl-lysin)-fenylalanin-benzylester- hydroklorid

[N-(t-butyloksykarbonyl)-statin]-(N-epsilon-benzyloksy-karbonyl-lysin)-fenylalanin-benzylester fra trinn C (760 mg,

1 mmol) ble løst opp i 10 ml 3,7N HCl/dioksan og satt tilside

i 1 time ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble opparbeidet som i trinn B til 620 mg råprodukt i form av et skum (<1>H-NMR, CD3OD, 5,2 delta, 2H s [benzyl CH2]), som ble benyttet uten rensing i det neste trinn.

E. [N-alfa-(t-butyloksykarbonyl)-N-im-(t-butyloksykarbonyl)-histidin]-statin-(N-epsilon-benzyloksykarbonyl-lysin)-fenylalanin- benzylester

Statin-(N-epsilon-benzyloksykarbonyl-lysin)-fenylalanin-benzylester-hydroklorid fra trinn D (600 mg, 0,857 mmol), N-metyl-morfolin (86,7 mg, 0,857 mmol), N-alfa-(t-butyloksykarbonyl) -N-im-(t-butyloksykarbonyl)-L-histidin (365 mg,

1,03 mmol), N-hydroksybenzotriazol (135 mg, 1,03 mmol) og 1-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbodiimid-meto-p-toluensulfonat (545 mg, 1,03 mmol), ble i rekkefølge løst opp i 50 ml metylenklorid ved 0°C og omrørt i 19 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble opparbeidet som i trinn A til 770 mg råprodukt i form av et skum (H-NMR, CDCl3, 1,5 delta, 2H s [BOC] og 1,6 delta, 9H s [BOC]), som ble benyttet i det neste trinn uten videre rensing.

F.Histidin-statin-(N-epsilon-benzyloksykarbonyl-lysin)-fenylalanin- benzylester- dihydroklorid

[N-alfa-(t-butyloksykarbonyl)-N-im-(t-butyloksykarbonyl)-histidin]-statin-(N-epsilon-benzyloksykarbonyl-lysin)-fenylalanin-benzylester fra trinn E (770 mg, 0,85 mmol) ble løst opp i 10 ml 3,7NHCl/dioksan og satt tilside i 1,5 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble opparbeidet som i trinn B til 602 mg råprodukt i form av et skum (<1>H-NMR, CD3OD, 5,2 delta, 2H s [benzyl CH,,]), som ble benyttet i det neste trinn uten rensing.

G. [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-( N- epsilon- benzyloksykarbonyl- lysin)- fenylalanin- benzylester

Histidin-statin-(N-epsilon-benzyloksykarbonyl-lysin)-fenylalanin-benzylester-dihydroklorid fra trinn F (602 mg, 0,689 mmol), N-metyl-morfolin (139 mg, 1,38 mmol), N-(t-butyloksykarbonyl)-L-fenylalanin (219 mg, 0,827 mmol), N-hydroksybenzotriazol (112 mg, 0,827 mmol) og 1-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbodiimid-meto-p-toluensulfonat (438 mg, 0,827 mmol) ble i rekkefølge løst opp i 50 ml metylenklorid ved 0°C og den resulterende oppløsning omrørt i 19 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble opparbeidet som i trinn A til 555 mg av et skum som ble renset ved kromatografi (silikagel, 95:5 CH2Cl2/MeOH) og ga 136 mg renset produkt i form av et skum (<1>H-NMR,CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]).

H. Tittelforbindelse

[N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-(N-epsilon-benzyloksykarbonyl-lysin)-fenylalanin-benzylester

(136 mg, 0,17 mmol) og 70 mg 2 0 %Pd(0H)2/C katalysator ble tilsatt i den angitte rekkefølge til 15 ml metanol, hvorpå den resulterende blanding ble hydrogenert i 4 timer ved 3,5 kg/cm^ H2og 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert gjennom Super-Cel og inndampet til tørrhet til 76 mg av et glassaktig produkt som ble utgnidd med eter og ga 63 mg renset [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-lysin-fenylalanin som et pulver ( iH-NMR, CD^OD,

1,5 delta, 9H s [BOC]).

Eksempel . 2

[ N-( t- butyloksykarbonyl)- Phe]- His- Sta- Ile- Sta ( natriumsalt)

A. [ N-( t- butyloksykarbonyl)- isoleucin]- statin- etylester

Statin-etylester-hydroklorid (717 mg, 3 mmol), N-metyl-morfolin (304 mg, 3 mmol), N-(t-butyloksykarbonyl)-L-isoleucin 1/2 H20 (865 mg, 3,6 mmol), N-hydroksybenzotriazol (486 mg, 3,6 mmol) og 1-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbo-diimid-meto-p-toluensulfonat (1,91 g, 80 % rent, 3,6 mmol) ble i rekkefølge tilsatt til 100 ml metylenklorid ved 0°C og den resulterende oppløsning omrørt i 19 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter vasket suksessivt med 75 ml 5,5 % vandig HC1, 75 ml mettet, vandig NaHCO^ og 75 ml salt-oppløsning og tørket over vannfri MgSO.. Etter filtrering og inndampning, ble 1,39 g råprodukt oppnådd som et skum ( H-NMR, CDC13. 1,5 delta, 9H s [BOC]), som ble benyttet uten videre rensing i det neste trinn.

B. til G. [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin- isoleucin- statin- etylester

På lignende måte som beskrevet i trinn B til G i Eksempel 1, ble [N-(t-butyloksykarbonyl)-isoleucin]-statin-etylester fra trinn A (1,37 g) omdannet til det rensede tittelprodukt (121 mg, skum,<1>H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]). 95:5 CHCl3/MeOH ble benyttet som gradient i den kromatografiske rensing under trinn G.

H. Tittelforbindelse

En oppløsning av [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin- histidin-statin-isoleucin-statin-etylester fra trinn G (120 mg, 0,14 mmol) i 2 ml dimetoksyetan, ble behandlet med 0,17 ml 1N vandig NaOH. Etter omrøring i 2,5 timer ved 20°C ble nye 0,17 ml 1N vandig NaOH tilsatt. Etter ytterligere 2 timers omrøring ble reaksjonsblandingen behandlet i en rotasjonsfordamper for å fjerne dimetoksyetan, fortynnet med 5 ml H20 og etter justering til pH 7,8, frysetørket. Det frysetørkede residuum ble oppslemmet i eter. Den overstående væske ble inndampet til tørrhet til 88 mg av et skum som etter utgnidning med et lite volum eter, førte til renset [N-(t-butyloksykarbonyl) -fenylalanin]-histidin-statin-isoleucin-statin-(natriumsalt) som et gulaktig pulver (65 mg, H-NMR, CDC13,

1,5 delta, 9H s [BOC]).

Eksempel 3

[N-(t-butyloksykarbonyl)-Phe]-His-Sta-Ile- [amino-( n- smørsyre) ]

A. [N- (t-butyloksykarbonyl) -Isoleucin] - [ajnino (n-smørsyre) ] - benzylester

N-(t-butyloksykarbonyl)-L-isoleucin (2,4 g, 10 mmol), N-metyl-morfolin (1,0 g, 10 mmol), benzyl-4-aminobutyrat-hydroklorid (1,93 g, 10 mmol), N-hydroksybenzotriazol (1,35 g, 10 mmol) og 1-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)karbodiimid-meto-p-toluensulfonat (4,23 g, 80 % rent, 10 mmol) ble i rekkefølge løst opp i 60 ml metylenklorid ved 0°C og den resulterende oppløsning omrørt i 19 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet til tørrhet og residuet løst opp i etylacetat. Oppløsningen ble vasket to ganger med 50 ml 5 % vandig HC1, to ganger med 50 ml 1N vandig NaOH, en gang med H20 og

en gang med saltoppløsning, tørket over vannfri MgS04og filtrert og konsentrert i en rotasjonsfordamper til 2,87 g råprodukt i form av et skum (<i>H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]), som ble benyttet i det neste trinn uten videre rensing.

B. Isoleucin-[ amino( n- smørsyre)]- benzylester- hydroklorid

[N-(t-butyloksykarbonyl)-isoleucin]-[amino(n-smørsyre)]-benzylester fra trinn A (2,87 g, 7,1 mmol) ble løst opp i 10 ml 3,7N HCl/dioksan og den resulterende oppløsning satt

tilside i 1 time ved 20°C. Reaksjonsoppløsningen ble deretter inndampet til tørrhet, hvorved det etter utgnidning, ble oppnådd 2,4 g råprodukt i form av et hvitt faststoff ( H-NMR, CD3OD, 5,2 delta, 2H s [benzyl CH2]), som ble benyttet uten rensing i det neste trinn.

C. [N-(t-butyloksykarbonyl)-statin]-isoleucin-[amino-( n- smørsyre)] benzylester

N-(t-butyloksykarbonyl-statin (275,35 mg, 1 mmol), N-metyl-morfolin (101 mg, 1,0 mmol), isoleucin-[amino(n-smørsyre)]benzylester-hydroklorid fra trinn B (342 mg, 1 mmol), N-hydroksybenzotriazol (135 mg, 1,0 mmol) og dicykloheksylkarbodiimid (206 mg, 1,0 mmol) ble i rekkefølge tilsatt til 20 ml metylenklorid ved 0°C og den resulterende oppløsning omrørt i 19 timer ved 20°C. Reaksjonsoppløsningen ble deretter filtrert og inndampet til et residuum som ble oppslemmet i etylacetat. Oppslemmingen ble filtrert og filtratet inndampet til tørrhet. Etter kromatografi av det resulterende residuum (silikagel, CHCl^/EtOAc gradient), ble 464 mg renset produkt oppnådd (<1>H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]).

D. Statin- isoleucin-[ amino( n- smørsyre) 3benzylester- hydroklorid

På lignende måte som beskrevet i trinn B, ble beskyttelsesgruppen fjernet (deblokkering) fra [N-(t-butyloksykarbonyl) -statin] -isoleucin- [ (amino(n-smørsyre)]-benzylester fra trinn C (464 mg, 0,82 mmol), hvorved 416 mg råprodukt i form av et hvitt faststoff ble oppnådd. Dette ble benyttet uten rensing i det neste trinn ( iH-NMR, CD3OD,

5,2 delta, 2H s [benzyl CH2]).

E. [N-alfa-(t-butyloksykarbonyl)-N-im-(t-butyloksykarbonyl) -histidin]-statin-isoleucin-[amino(n-smørsyre)]-benzylester

På lignende måte som beskrevet i trinn C, ble statin-isoleucin- [amino(n-smørsyre)]benzylester-hydroklorid fra trinn D (416 mg, 0,83 mmol) koblet med N-alfa-(t-butyloksykarbonyl) -N-im-(t-butyloksykarbonyl)-L-histidin (295 mg,

0,82 mmol) til 391 mg renset produkt (^H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC] og 1,6 delta, 9H s [BOC]).

F. Histidin-statin-isoleucin-[amino(n-smørsyre)]-benzylester- dihydroklorid

På lignende måte som beskrevet i trinn B, ble [N-alfa-(t-butyloksykarbonyl)-N-im-(t-butyloksykarbonyl)-histidin]-statin-isoleucin-[amino(n-smørsyre)]benzylester fra trinn E (391 mg, 0,4 9 mmol) deblokkert, hvorved 328 mg råprodukt i form av et hvitt faststoff (<1>H-NMR, CD3OD, 5,2 delta, 2H s [benzyl CH2]) ble oppnådd. Dette ble benyttet uten rensing i det neste trinn.

G. [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-isoleucin-[ amino( n- smørsyre)] benzylester

Histidin-statin-isoleucin-[amino(n-smørsyre)]-benzylester-dihydroklorid fra trinn F (328 mg, 0,487 mmol), N-metyl-morfolin (0,128 ml, 1,17 mmol), N-(t-butyloksykarbonyl) -L-f enylalanin (155 mg, 0,585 mmol), N-hydroksybenzotriazol (79 mg, 0,585 mmol) og dicykloheksylkarbodiimid (121 mg, 0,585 mmol) ble i rekkefølge løst opp i 20 ml metylenklorid ved 0°C og den resulterende oppløsning omrørt i 19 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter opparbeidet og kromatografert som i trinn C, hvilket ga 324 mg renset produkt (^H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]).

H. Tittelforbindelse

En oppløsning av [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-isoleucin-[amino(n-smørsyre)]-benzylester fra trinn G (324 mg, 0,38 mmol) i 5 ml metanol ble hydrogenert ved romtemperatur under 3,5 kg/cm 2 H2i 1 time med 20 % Pd(0H)2/C katalysator. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert for å fjerne katalysatoren og filtratet inndampet til tørrhet. Etter utgnidning av det resulterende residuum med eter, ble det oppnådd 190 mg ren [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-isoleucin[amino(n-smørsyre)]som et hvitt pulver (<1>H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]).

Eksempel 4

[N-(t-butyloksykarbonyl)-Phe]-His-Sta-[amino(4-sek.-butyl-smørsyre) 3

A. N-( t- butyloksykarbonyl)- isoleucinat

En oppløsning av N-(t-butyloksykarbonyl)-L-isoleucin-metylester (10,0 g, 40,7 mmol) i 100 ml toluen, ble avkjølt til -75°C og deretter dråpevis behandlet med 102 ml 1M diisobutylaluminiumhydrid i toluen, slik at reaksjonstemperaturen ble holdt lavere enn -65°C. Etter endt tilsetning ble blandingen omrørt i 10 minutter ved -75°C og reaksjonen lang-somt avbrutt ved tilsetning av 10 ml metanol, hvorunder temperaturen ble holdt lavere enn -65°C. Reaksjonsoppløsningen ble deretter helt over i 200 ml kald, mettet, vandig oppløsning av Rochelle-salt. Den resulterende blanding ble overskiktet med eter og omrørt i 1 time, hvorpå det organiske lag ble fraskilt, vasket med saltoppløsning, tørket over vannfri Na^O^, filtrert og inndampet til tørrhet til 7,0 g råprodukt (^H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]), som ble benyttet i det neste trinn uten rensing.

B. Etyl- L-( 4- amino- 4- sek.- butyl- butyrat)- hydroklorid

N-(t-butyloksykarbonyl)-isoleucinat fra trinn A (1 g,

4,6 mmol) og karbetoksymetylentrifenylfosforan (1,93 g,

5,56 mmol), ble løst opp i 50 ml kloroform og den resulterende oppløsning satt tilside i 48 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet til tørrhet og renset ved kromatografi (silikagel, CHCl^), hvilket ga 1 g renset etyl-L-[4-(t-butyloksykarbonylamino)-4-sek.-butyl-delta-2-butyrat3-som en olje (^H-NMR, CDC13, 4,2 delta, 2H s [etyl CH23). Etyl-L-[4-(t-butyloksykarbonylamino)-4-sek.-butyl-delta-2-butyrat] (300 mg, 1,05 mmol) ble deretter hydrogenert i ca. 2 timer ved 3,5 kg/cm^ H2og 20°C i metanol inneholdende en 20 % Pd(OH)2/C katalysator. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert for å fjerne katalysatoren og filtratet konsentrert i en rotasjonsfordamper til 300 mg rå etyl-L-[4-(t-butyloksykarbonylamino)-4-sek.-butyl-butyrat] i form

av en olje (^H-NMR, CDC13, 4,2 delta, 2H s [etyl CH23). Etyl-L-[4-(t-butyloksykarbonylamino)-4-sek.-butyl-butyrat]

(300 mg) ble deretter løst opp i 4 ml 3,7N HCl/dioksan og

den resulterende oppløsning omrørt i 1 time ved 2 0°C. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet til tørrhet til

231 mg råprodukt i form av et skum, som ble benyttet uten<0>rensing i det neste trinn (iH-NMR, CDC13, 4,2 delta, 2H s [etyl CH2]).

C. [N-(t-butyloksykarbonyl)-statin]-[amino(4-sek-butyl-smørsyre)] etylester

N-(t-butyloksykarbonyl)-statin (286 mg, 1,04 mmol), etyl-L-(4-amino-4-sek-butyl-butyrat)-hydroklorid fra trinn B (232 mg. 1,04 mmol), N-hydroksybenzotriazol (141 mg, 1,04 mmol), N-metyl-morfolin (105 mg, 1,04 mmol) og dicykloheksylkarbodiimid (215 mg, 1,04 mmol), ble tilsatt etter hverandre til 15 ml metylenklorid ved 0°C, hvorpå den resulterende oppløsning ble omrørt i 19 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert og filtratet inndampet til tørrhet. Kromatografi av residuet (silikagel, CHCl3/EtOAc gradient) førte til 400 mg renset produkt (^H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]).

D. til G. [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-[ amino( 4- sek- butyl- smørsyre)]- etylester

På lignende måte som beskrevet under trinn D til G i Eksempel 3, ble [N-(t-butyloksykarbonyl)-statin]-[amino(4-sek-butyl-smørsyre)]-etylester fra trinn C (400 mg, 0,94 mmol), omdannet til renset [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-[amino(4-sek-butyl-smørsyre)]etylester (211 mg, (^H-NMR,CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]).

H. Tittelforbindelse

En oppløsning av [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-[amino(4-sek-butyl-smørsyre)]etylester fra trinn G (200 mg, 0,274 mmol) i 5 ml dimetoksyetan, ble behandlet med 0,3 ml 1N vandig NaOH, og den resulterende blanding omrørt i 3 timer ved 20°C. Ytterligere 0,3 ml 1N vandig NaOH ble deretter tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt i 1 time til ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter konsentrert i en rotasjonsfordamper for å fjerne dimetoksyetan, behandlet med etylacetat og deretter justert til pH 2 med 5 % vandig HC1. Det organiske lag ble fraskilt, vasket med salt-oppløsning, filtrert, tørket over vannfri MgS04og konsentrert til et hvitt faststoff, som etter utgnidning med eter, førte til 35 mg renset [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]histidin-statin-[amino(4-sek.-butyl-smørsyre)]

(^H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]).

Eksempel 5

[ N-( t- butyloksykarbonyl)- Phe]- His- aminostatin- Ile- Phe- diacetat A. Etyl-4(S)-(t-butyloksykarbonylamino)-3(S)-azido-6-metyl-heptanoat og etyl-4(S)-(t-butyloksykarbonylamino)-6-metyl-trans- 2- heptenoat

En blanding av 3-epi-N-(t-butyloksykarbonyl)-statin (7,6 g, 25,05 mmol) og trietylamin (2,78 g, 27,55 mmol) i metylenklorid (200 ml) ble dråpevis tilsatt 3,15 g (27,55 mmol) metansulfonylklorid ved 0°C. Den resulterende blanding ble omrørt i 1 time ved 0°C, hvorpå den fikk anta romtemperatur i løpet av 1 time og deretter ble vasket med 1N vandig HC1-oppløsning (2 x 200 ml) og mettet, vandig NaHCO^-oppløsning (1 x 200 ml). Det organiske lag ble tørket over MgSO^ og inndampet til 9,75 g av en gul olje. En oppløsning av oljen i N,N-dimetylformamid (150 ml) ble behandlet med natriumazid (2,45 g, 37,7 mmol) og den resulterende blanding oppvarmet i 4 timer ved 60°C. Oppløsningsmidlet ble deretter fjernet under høyvakuum og residuet fortynnet med 500 ml H20 og ekstrahert med eter (2 x 150 ml). De kombinerte eterekstraktene ble vasket med saltoppløsning (1 x 100 ml), tørket (MgS04) og inndampet til 6,6 g av en lysegul olje. Separasjon av oljen ved "flash"-kromatografi med 25-30 % eter i heksan som eluent, ga 334 mg (4 % utbytte) etyl-4(S)-(t-butyloksykarbonylamino)-3(S)-azido-6-metylheptanoat som en olje tRf= 0,62 i eter-heksan, 1:1; ^H-NMR (CDCl-j): delta 0,95 (d, J=6,6H), 1,30 (t, J=7,3H), 1,47 (s, 9H), 2,58 (d, J=7f2H), 4,17 (q, J=7,2H), 4,53 (bredd, 1H);<13>C-NMR (CDC13): delta 14,2; 22,2; 23,0; 24,9; 28,4;

37,2; 42,4; 51,6; 61,1; 62,8; 79,6; 155,8; 171,0; IR (CHC1-J: 3473, 2102 cm ]. Den mer polare kromatografiske fraksjon,

4,9 g, ga en klar olje (Rf- 0,55 i eter-heksan, 1:1), som krystalliserte ved henstand. Utgnidning i iskald heksan førte til 3,78 g (53 % utbytte) etyl-4(S)-(t-butyloksykarbonyl-

amino)-6-metyl-trans-2-heptenoat som et luftig, hvitt faststoff [smp. 56-58°C;<1>H-NMR (CDClg): delta 0,93 (d, J=6,6H), 1,30 (t, J=7,3H), 1,47 (s, 9H), 4,18 (q, J=7,2H), 5,9(dd, J=15,1,1H), 6,83 (dd, J=15,5,1H); IR (KBr): 3350, 3307, 1720, 1701, 1684, 1659 cm"<1>].

B(1). Etyl-3-benzylamino-4-(t-butyloksykarbonylamino)-3,4-(S,S)-6-metylheptanoat fraEtyl-4(S)-(t-butyloksykarbonyl-amino)- 6- metyl- trans- 2- heptenoat

En blanding av etyl-4(S)-(t-butyloksykarbonylamino)-6-metyl-trans-2-heptenoat (3,52 g, 12,35 mmol), benzylamin (3,97 g, 37,0 mmol) og abs. EtOH (90 ml), ble oppvarmet i 7 dager ved 58°C. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet og separert ved "flash"-kromatografi med 10-15 % etylacetat i heksan som eluent. De mindre polare fraksjoner ga 963 mg

(20 % utbytte) produkt i form av en olje [Rf= 0,32 i 25 %

EtOAc i heksan; 1 H-NMR (CDCl-j): delta 0,97 (d, J=5,6H),

1,25 (t, 3H, J=7), 1,45 (s, 9H), 2,43 (m, 2H), 3,32 d (m, 1H), 3,77 (s, 2H), 4,10 (q, 2HJ=7), 4,65 (d, 1H, J = 9), 7,22 (s, 5H), IR (CHC13): 3433, 1720 (skulder), 1709 cm<-1>; Massespektrum

m/e 393 (M<+>+1), 319, 206 (base), 91]

B(2). Etyl-3-benzylamino-4-(t-butyloksykarbonylamino)-3,4(S,S)-6-metylheptanoat fra etyl-4(S)-(t-butyloksykarbonyl-amino)- 3( S)- azido- 6- metylheptanoat

20 mg 10 % Pd/C katalysator ble tilsatt til en oppløsning av etyl-4(S)-(t-butyloksykarbonylamino)-3(S)-azido-6-metyl-heptanoat (120 mg, 0,36 mmol) i 5 ml eddiksyre:etanol 1:1

og den resulterende blanding hydrogenert i 3 timer ved romtemperatur og en atmosfære H2. Etter frafiltrering av katalysatoren ble reaksjonsblandingen inndampet til en olje ved hjelp av redusert trykk og azeotropisk destillasjon med etanol. Oljen (136 mg) ble deretter løst opp 3 ml metanol og behandlet med 37^uliter (38,2 mg, 0,36 mmol) benzaldehyd ved romtemperatur og deretter med 34 mg (54 mmol) NaCNBH3ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i \ time ved 0 C hvorpå den

fikk anta romtemperatur før fortynning med H20 og mettet, vandig NaHC03~oppløsning. Det dannet seg et oljeaktig bunnfall som ble ekstrahert med metylenklorid. Det resulterende organiske lag ble tørket (MgSO^) og inndampet til et olje-

aktig residuum. TLC av dette oppviste kun en epimer, som korresponderte med etyl-3-benzylamino-4-(t-butyloksykarbonyl-amino) -3,4(S,S)-6-metylheptanoat. Rensing av det oljeaktige residuum ved "flash"-kromatografi med 10-15 % etylacetat: heksan, førte til 68 mg produkt som ifølge NMR og TLC var identisk med materialet fremstillet under trinn B(1).

C. 3-benzyloksykarbonylamino-4-(t-butyloksykarbonylamino)-3, 4( S, S)- 6- metylheptansyre

60 mg 10 % Pd/C katalysator ble tilsatt til en oppløsning av etyl-3-benzylamino-4-(t-butyloksykarbonylamino)-3,4(S,S)-6-metylheptanoat fra trinn B(1) (53 0 mg, 1,3 5 mmol) i 12 ml eddiksyre:etanol, 1:1, og den resulterende blanding hydrogenert i 3 timer ved romtemperatur under 3,5 kg/cm 2 H2. Katalysatoren ble frafiltrert og filtratet konsentrert til en olje som ble tatt opp i en blanding av 10 ml dioksan og 10 ml H20. Fast NaHC03ble tilsatt til reaksjonsblandingen (pH 7,8) etterfulgt av 289^uliter (345 mg, 2,025 mmol) benzyloksykarbonylklorid (Chemalog). Den resulterende blanding ble omrørt i 1,5 timer ved romtemperatur, hvorunder pH ble holdt ved 8 med fast NaHCO^. Deretter ble blandingen omrørt i ytterligere 4 timer ved

pH 12,5 ved tilsetning av 4 ml vandig 1N NaOH-oppløsning og r^O-dioksan etter behov for å løse opp eventuelt bunnfall. Blandingen ble deretter nøytralisert med 1N vandig HC1 ved 0°C og dioksanet fjernet under redusert trykk. Residuet ble fortynnet med 50 ml H20 og ekstrahert med etylacetat (2 x 50 ml). De kombinerte etylacetatekstraktene ble tørket (MgSO^) og inndampet til 588 mg av en olje som ble renset ved "flash"-kromatografi med 3 % MeOH i CHCl^som eluent, hvilket resulterte i 288 mg (41 % utbytte) produkt i form av en olje [<1>H-NMR (DMSO d<6>, 250 MHz): delta 0,81 (d, J=7,3H), 0,86

(d, J=7,3H), 1,38 (s, 9H), 2,2-2,4 (m, 2H), 5,02 (centroid av AB-mønster, J=13, 2H), 6,48 (d, J=9, 1H), 7,05 (d, J=9,1H), 7,30 (s, 9H);

Massespektrum: m/e 186, 130, 91, 86 (base)]

D. Isoleucin- fenylalanin- benzylester- hydroklorid

En oppløsning av 14,05 g (58,5 mmol) N-(t-butyloksykarbonyl) -L-isoleucin-hemihydrat (Chemalog) i 500 ml metylenklorid ble tørket (MgS04>, filtrert og behandlet med 6,43 ml (5,92 g, 58,5 mmol) N-metyl-morfolin. Den resulterende blanding ble avkjølt til -16°C og deretter behandlet med 7,59 ml (7,99 g, 58,5 mmol) isobutylklorformiat med en hastighet som sikret at den eksoterme reaksjon ikke brakte temperaturen over -10°C. Etter 10 minutter ytterligere omrøring etter endt tilsetning, ble en oppløsning av 24,8 g (58,0 mmol) L-fenylalanin-benzylester-p-toluensulfonat og 6,43 ml (5,92 g, 58,5 mmol) N-metylmorfolin i 50 ml metylenklorid dråpevis tilsatt til reaksjonsblandingen med en hastighet som sikret at den eksoterme reaksjon ikke overskred -10°C. Etter fullført tilsetning fikk reaksjonsblandingen anta romtemperatur i løpet av 1 time, hvorpå den ble vasket med 5 % vandig HCl-oppløsning (2 x 300 ml) og 10 % vandig H2C03-oppløsning (2 x 300 ml). Det resulterende organiske lag ble tørket (MgS04) og inndampet til 27,40 g hvitt faststoff. Utgnidning i heksan ga 24,97 g renset [N-(t-butyloksykarbonyl)-L-isoleucin]-L-fenylalanin-benzylester [42 % utbytte; smp. 131-132°C, Rf = 0,43 i eter: etylacetat, 1:1;<1>H-NMR (CDC13) delta: 0,78-0,9 (bred d, 6H), 1,43 (s, 9H), 3,08 (d,J=6), 3,87 (dd, J=5,9,1H), 4,75-5,1

(m, 1H), 5,06 (s, 2H), 6,3 (d, J=9,1H), 7,0-7,3 (m, 11H)].

En oppløsning av 12,50 g (25,7 mmol) [N-(t-butyloksykarbonyl)-L-isoleucin]-L-fenylalanin-benzylester i 125 ml 4N HC1 i dioksan, ble omrørt i 2 timer ved romtemperatur under beskyttelse fra fuktig atmosfære med et CaCl2~rør. Oppløsnings-midlet ble deretter fjernet under redusert trykk og residuet utgnidd med eter, hvilket førte til 11,16 g produkt i form av et hvitt faststoff [smp. 178-179,5°C (dekomp.); Rf= 0,73 i BuOH-H20-AcOH, 4:1:1; (<1>H-NMR (CD3OD) delta: 0,9-1,1 (m, 6H), 3,1-3,0 (m, 2H), 3,73 (d, J=5,1H), 5,08 (s, 1H), 7,18 (s, 5H), 7,24 (s, 5H)]

E. [ N-gamma-(t-butyloksykarbonyl)-benzyloksykarbonylamino-statin]- isoleucin- fenylalanin- benzylester

En oppløsning av isoleucin-fenylalanin-benzylester-hydroklorid (412 mg, 1,02 mmol) i 10 ml metylenklorid ble nøytralisert ved 0°C med 142^uliter trietylamin (103 mg,

1,02 mmol). 3-benzyloksykarbonylamino-4-(t-butyloksykarbonyl-amino) -3 , 4 ( S , S) -6-metylheptansyre (416 mg, 1,02 mmol) og N-hydroksybenzotriazol (205 mg, 1,52 mmol) ble deretter tilsatt til oppløsningen ved 0°C. Tilslutt ble en oppløsning av dicykloheksylkarbodiimid (210 mg, 1,02 mmol) i 5 ml metylenklorid tilsatt ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt i 3 timer ved 0°C og deretter i ytterligere 16 timer under oppvarming til romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og residuet omrørt i 75 ml etylacetat. Den resulterende blanding ble filtrert for å fjerne en del faststoff og filtratet vasket med 10 % vandig sitronsyre (1 x 75 ml) og mettet, vandig NaHCO^-oppløsning (1 x 75 ml), tørket (MgS04) og inndampet til et faststoff (217 mg). Faststoffet ble slått sammen med det frafiltrerte faststoff fra den nevnte etylacetat-blanding. De kombinerte faststoff-fraksjonene (1,043 g), en blanding av produkt og dicykloheksylurea, ble benyttet i det neste trinn uten rensing.

F. Benzyloksykarbonylaminostatin-isoleucin-fenylalanin-benzylester- hydroklorid

Det rå [N-gamma-(t-butyloksykarbonyl)-benzyloksykarbonyl-aminostatin]-isoleucin-fenylalanin-benzylester fra trinn E (1,043 g) ble omrørt i 25 ml 4N HCl i dioksan i 1 time ved romtemperatur under beskyttelse fra fuktig atmosfære med et CaC^-rør. Fjerning av oppløsningsmidlet under redusert trykk (ved hjelp av azeotropisk destillasjon med metylenklorid og eter) og utgnidning i eter, førte til 963 mg faststoff, som besto av en blanding av produkt og dicykloheksylurea. Dette rå faststoff ble benyttet i det neste trinn uten rensing.

G. [N-alfa-(t-butyloksykarbonyl)-N-im-(t-butyloksykarbonyl)-histidin]-benzyloksykarbonylaminostatin-isoleucin-fenylalanin-benzylester

En suspensjon av det rå benzyloksykarbonylaminostatin-isoleucin-fenylulanin-benzylester-hydroklorid fra trinn F

(963 mg ) i 20 ml metylenklorid ble nøytralisert ved 0°C med 177^uliter trietylamin (128 mg, 1,02 mmol). N-alfa-(t-butyloksykarbonyl) -N-im-(t-butyloksykarbonyl)-L-histidin (542 mg, 1,53 mmol) og N-hydroksybenzotriazol (206 mg, 1,53 mmol) ble deretter tilsatt til suspensjonen ved 0°C. Til slutt ble en oppløsning av dicykloheksylkarbodiimid (315 mg, 1,53 mmol) i 1 ml metylenklorid tilsatt ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt i 3 timer ved 0°C og deretter i ytterligere 16 timer ved romtemperatur. Ca. halvparten av oppløsnings-midlet ble fjernet under redusert trykk og residuet omrørt i 125 ml etylacetat. Den resulterende blanding ble filtrert for å fjerne en del faststoffer og filtratet vasket med vandig 10 % sitronsyreoppløsning (2 x 100 ml) og vandig, mettet NaHCO^-oppløsning (1 x 100 ml), tørket (MgSO^) og inndampet til 920 mg faststoff. Faststoffet ble renset ved "flash"-kromatografi under bruk av 0,5-0,75 % MeOH i CHCl^som eluent, hvorved det ble oppnådd 221 mg renset produkt i form av et faststoff. Faststoffet som ble frafiltrert fra den ovennevnte etylacetat-blanding, inneholdt en vesentlig mengde av produktet sammen med dicykloheksylurea. Det meste av sistnevnte forbindelse ble skilt fra produktet ved filtrering etter utgnidning av faststoffet (under kraftig omrøring) i 100 ml metylenklorid. Filtratet ble konsentrert (1,1 g) og kromatografert som ovenfor, hvorved ytterligere 4 01 mg produkt ble oppnådd. De kombinerte, rensede faste produktene ble utgnidd i eter og førte til 592 mg av et skjellaktig hvitt faststoff [58 % utbytte; smp. 229-231°C; Rf= 0,22 i 2,5 % MeOH i CHC13;

<1>H-NMR (CDC13, 250 MHz): delta 0,6-0,85 (m, 12H), 1,42 (s, 9H),

1,58 (s, 9H) , 2,42 (centroid av AB-mønster av ABX, 2H, J-=14,

Ari JAX"5'JBX=10)'2,94 (d'J=5, 2H)'3,13 (d'J=6, 2H)'3'55-3'7 (m, 1H), 4,1-4,3 (m, 3H), 4,98 (q, J=7, 1H), 5,2-5,5 (m, 4H), 6,10 (d, J=7, 1H), 6,37 (bred d, 1H), 6,80 (d, 1H, J=8), 7,0-7,4 (m, 17H), 7,5 (bred, 1H), 8,00 (s, 1H)].

H. Histidin-benzyloksykarbonylaminostatin-isoleucin-fenylalanin- benzylester- hydroklorid

En oppløsning av 204 mg [N-alfa-(t-butyloksykarbonyl)-N-im-(t-butyloksykarbonyl)-histidin]-benzyloksykarbonylamino-statin-isoleucin-fenylalanin-benzylester i 7 ml 4N HC1 i dioksan, ble omrørt i 5 timer ved romtemperatur under beskyttelse mot fuktig atmosfære med CaCl2-rør. Oppløsnings-midlet ble fjernet under redusert trykk (under azeotropisk destillasjon med metylenklorid og eter), hvilket førte til 153 mg produkt i form av et hvitt pulver [68 % utbytte;

smp. 154-157°C; Rf= 0,55 i butylalkohol:H20:eddiksyre (4:1:1);<1>H-NMR (CD30D): delta 1,05-1,1 (m, 12H), 2,3-2,5 (m, 2H), 3,1 (d,J=8,2H), 5,08 (s,4H), 7,18 (s, 5H), 7,30 (s, 10H), 7,53

(a, 1H) , 8,83 (s, 1H) ]

I. [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-benzyl-oksykarbonylaminostatin- isoleucin- fenylalanin- benzylester

En oppløsning av histidin-benzyloksykarbonylaminostatin-isoleucin-fenylalanin-benzylester-hydroklorid (306 mg,

0,352 mmol) i 5 ml dimetylformamid ble nøytralisert ved 0°C

med 123^uliter trietylamin (88 mg, 0,879 mmol). N-(t-butyloksykarbonyl) -L-fenylalanin (103 mg, 0,38 7 mmol) og N-hydroksybenzotriazol (79 mg, 0,580 mmol) ble deretter tilsatt til oppløsningen ved 0°C. Til slutt ble en oppløsning av dicykloheksylkarbodiimid (980 mg, 0,387 mmol) i 1,5 ml dimetylformamid tilsatt ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt i 3 timer ved 0°C og deretter i ytterligere 16 timer ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble fjernet under høyvakuum, residuet omrørt i 50 ml etylacetat og den resulterende blanding filtrert for å fjerne en del faststoff. Oppløsningsmidlet ble fjernet fra filtratet og residuet omrørt i metylenklorid (50 ml) og den resulterende blanding filtrert for å fjerne en ny porsjon faststoff. Filtratet etter sistnevnte filtrering, ble konsentrert, residuet løst opp i 50 ml etylacetat og den resulterende oppløsning vasket med 10 % vandig sitronsyre (2 x 40 ml) og mettet, vandig NaHCO^-oppløsning (2 x 40 ml) .

Det resulterende organiske lag ble tørket (MgS04) og konsentrert til et faststoff (153 mg). Dette sammen med faststoffet fra etylacetat- og metylenkloridutgnidningen, ble slått sammen og renset ved "flash"-kromatografi, under bruk av 2-3 % metanol i kloroform som eluent, hvilket ga 261 mg faststoff. Utgnidning av dette i eter førte til 218 mg produkt i form

av et glassaktig faststoff [59 % utbytte; smp. 228-229°C;

Rf= 0,25 i 5 % MeOH i kloroform;<1>H-NMR (CDClg, 250 MHz);

delta 0,6-0,8 (m, 12H), 1,26 (s, 9H), 2,38 (bred d, 2H), 2.8- 3,0 (m, 2H), 3,15-3,4 (m, 4H), 4,1-4,0 (m, 1H), 4,1-4,2

(m, 1H), 4,2-4,4 (m, 2H), 4,6 (bred d, 1H), 4,9-5,2 (m, 6H), 5.9- 6,1 (m, 1H), 6,78 (s, 1H), 7,2-7,4 (m, 22H), 7,49 (s, 1H)].

J. TittelforbindeIse

10 % Pd/C katalysator (12 mg) ble tilsatt til en opp-løsning av [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-benzyloksykarbonylaminostatin-isoleucin-fenylalanin-benzylester (24 mg, 0,023 mmol) i 5 ml eddiksyre:etanol (1:1) og den resulterende blanding hydrogenert i 3 timer ved romtemperatur og 2,8 kg/cm 2 H2. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert for å fjerne katalysatoren og filtratet konsentrert til et residuum. Utgnidning av residuet i eter førte til 17 mg [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-aminostatin-isoleucin-fenylalanin-diacetat som et hvitt pulver [smp. 155-159°C; Rf= 0,58 i n-butylalkohol:H20:eddiksyre (4:1:1);<1>H-NMR (CD3C02D 250 MHz): delta 0,7-1,0 (m, 12H),

1,33 (s, 9H), 2,7-2,9 (m, 2H), 3,0-3,6 (m, 6H), 3,6-3,9

(m, 1H), 4,15-4,30 (m, 1H), 4,35-4,55 (m, 2H), 4,8-4,95 (m, 2H), 7,1-7,4 (m, 10H), 7,38 (s, 1H), 8,78 (s, 1H)].

Eksempel 6

[N-(t-butyloksykarbonyl)-Phe]-His-Sta-Ala-Sta-Glu-dibenzylester

A. [N-(t-butyloksykarbonyl)-alanin]-statin-glutaminsyre-dibenzylester

N-hydroksybenzotriazol (324 mg, 2,4 mmol), N-metyl-morfolin (202 mg, 2 mmol), L-glutaminsyre-dibenzylester-p-toluensulfonat (995 mg, 2 mmol), N-(t-butyloksykarbonyl)-statin (660 mg, 2,4 mmol) og 1-cykloheksyl-3-(2-morfolino-etyl) -karbodiimid-meto-p-toluensulfonat (1271 mg, 80 % rent, 2,4 mmol) ble i rekkefølge løst opp i metylenklorid (100 ml) ved 0°C og den resulterende oppløsning omrørt i 19 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter vasket suksessivt med 5,5 % vandig HCl, mettet, vandig NaHC03-oppløsning og salt-oppløsning og deretter tørket over vannfri MgS04. Etter filtrering og inndampning ble det oppnådd 1269 g rå [N-(t-butyloksykarbonyl)-statin]-glutaminsyre-dibenzylester i form av en olje (<1>H-NMR, CDC13, 5,2 delta, 2H s [benzyl CH2]). Denne olje (1269 g) ble løst opp i 10 ml 3,7N HCl/dioksan og den resulterende oppløsning satt tilside i 1 time ved romtemperatur. Oppløsningen ble deretter inndampet under høy-vakuum til et residuum som ble utgnidd med eter og tørket under nitrogen, hvilket førte til 9 00 mg statin-glutaminsyre-dibenzylester-hydroklorid som et skum ( H-NMR, CDCl^, 5,2 delta, 2H s [benzyl CH,,]). N-hydroksybenzotriazol (186 mg, 1,38 mmol), N-metyl-morfolin (116 mg, 1,15 mmol), en del av det ovenfor oppnådde statin-glutaminsyre-dibenzylester-hydroklorid (600 mg, 1,15 mmol), N-(t-butyloksykarbonyl)-L-alanin (261 mg, 1,38 mmol) og 1-cykloheksyl-3-(2-morfolino-etyl) -karbodiimid-meto-p-toluensulfOnat (732 mg, 80 % rent, 1,38 mmol) ble i rekkefølge løst opp i metylenklorid (60 ml) ved 0°C, hvorpå den resulterende oppløsning ble omrørt i 19 timer ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter vasket suksessivt med 5,5 % vandig HCl, mettet, vandig NaHCO^-oppløsning og saltoppløsning, og tørket over vannfri MgSO^. Etter filtrering og inndampning, ble 743 mg råprodukt oppnådd som et skum (<1>H-NMR, CDC13, 5,2 delta, 2H s [benzyl CH2]).

B. til G. Tittelforbindelse

På lignende måte som beskrevet i trinn B til G i Eksempel 1, ble [N-(t-butyloksykarbonyl)-alanin]-statin-glutaminsyre-dibenzylester fra trinn A (743 mg) omdannet til [N(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-alanin-statin-glutaminsyre-dibenzylester (300 mg, skum,<1>H-NMR, CDC13, 5,2 delta 2H s [benzyl CH,,]). I hvert deblokkeringstrinn ble inndampningen til tørrhet etterfulgt av utgnidning med eter. Etter avslutning av trinn E ble det rå skumproduktet renset ved kromatografi (silikagel 95:5 CHC13/metanol), hvilket førte til et renset skum. Det ble ikke foretatt kromatografisk rensing på slutten av trinn G.

Eksempel 7

[ N-( t- butyloksykarbonyl)- Phe]- His- Sta- Ala- Sta- Glu En blanding av [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-alanin-statin-glutaminsyre-dibenzylester (90 mg, 0,077 mmol), 20 %Pd(OH)2/C katalysator (45 mg) og metanol (10 ml) ble hydrogenert i 2 timer ved romtemperatur og 3,5 kg/cm 2H2. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert for å fjerne katalysatoren, hvorpå filtratet ble inndampet til et skum (72 mg). Skummet ble utgnidd med eter og tørket og førte til et renset [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-alanin-statin-glutaminsyreskum (51 mg, 72 % utbytte,<1>H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]).

Eksempel 8

[N-(t-butyloksykarbonyl)-Phe]-His-sta-[amino(2-sek-butyl- etylen)]- Phe- eddiksyresalt

A. N-( t- butyloksykarbonyl)- L- isoleucinat

En blanding av L-isoleucin-metylester (24,3 g, 0,134 mmol) og trietylamin (13,5 g, 0,134 mmol) i metylenklorid (210 ml), ble fremstillet og en oppløsning av ditertbutyldikarbonat (Aldrich, 29,1 g, 0,134 mmol) i metylenklorid (25 ml) ble dråpevis tilsatt til blandingen ved 0°C. Etter endt tilsetning fikk blandingen anta romtemperatur i løpet av natten, hvorpå den ble filtrert. Filtratet ble vasket suksessivt med H20

(3 x 75 ml), vandig 0,1N HCl-oppløsning, H20 (1 x 100 ml) og mettet, vandig NaHCO-j-oppløsning (1 x 75 ml), tørket (MgS04)

og inndampet til N-(t-butyloksykarbonyl)-L-isoleucin-metylester som en olje [30,7 g; 93 % utbytte;<1>H-NMR (CDC13): delta 0,92 (d, J=7,6H), 1,43 (s, 9H), 3,70 (s, 3H), 4,17 (dd, J=5, 9,1H), 5,03 (d, J=9,1H)]. En oppløsning av N-(t-butyloksykarbonyl) -L-isoleucin-metylesterolje (15,0 g, 61,1 mmol) i tørr toluen (260 ml), ble avkjølt til -78°C og dråpevis tilsatt en 1M oppløsning av diisobutylaluminiumhydrid i heksan (153 ml), med en hastighet som sikret at temperaturen av den eksoterme reaksjon ikke overskred -65°C. Etter fullført tilsetning, ble omrøringen fortsatt i 15 minutter ved -78°C. Reaksjonen ble

deretter avbrutt forsiktig med 15 ml metanol (temperaturen i blandingen fikk ikke overskride -65°C), etterfulgt av 200 ml Rochelle-salt oppløsning. Etter oppvarming til romtemperatur, ble det organiske lag fraskilt og ekstrahert med eter (3 x 200 ml), og tilsatt mer Rochelle-salt oppløsning, etter behov for oppløsning av aluminiumsaltene. De kombinerte, organiske ekstraktene ble tørket (Na^O^) og inndampet til et oljeaktig råprodukt. Oljen ble oppbevart ved -78°C for å hindre even-tuell racemisering, og deretter benyttet uten rensing i det neste trinn [132 g; 98 % utbytte; Rf= 0,32 i 35 % eter i heksan;<1>H-NMR (CDC13): delta 1,00 (d, J=7,6H), 1,46 (s, 9H), 9,65

(s, 1H)]

B. [Amino(2-sek-butyl-etylen)]-fenylalanin-benzylester-dihydroklorid

En blanding av N-(t-butyloksykarbonyl)-L-isoleucinat (2,00 g, 9,29 mmol) og L-fenylalanin-benzylester-p-tosylat (Chemalog, 3,78 g, 8,84 mmol) i metanol (150 ml), ble omrørt i 3 5 minutter i nærvær av molekylarsikt (3 Å, Ventron) ved romtemperatur. 0,73 g (11,6 mmol) NaCNBH^ ble deretter tilsatt og blandingen omrørt i ytterligere 1 time ved romtemperatur. Molekylarsikten ble deretter frafiltrert og filtratet konsentrert til et oljeaktig residuum, som ble fortynnet med mettet, vandig NaHCO^-oppløsning og ekstrahert to ganger med eter. De kombinerte eterekstraktene ble tørket (Na2S04) og konsentrert til en olje som ble renset ved "flash-kromatografi med 12 % etylacetat i heksan som eluent. Det ble oppnådd 1,69 g [(t-butyloksykarbonyl)amino(2-sek-butyl-etylen)]-fenylalanin-benzylester som en olje (40 % utbytte; Rf= 0,28 i 25 % etylacetat i heksan). Oljen krystalliserte ved henstand [smp. 53-55°C;<1>H-NMR (CDC13): delta 0,6-1,0 (m, 6H), 1,48

(s, 9H), 2,92 (d, J=7,2H), 5,07 (s, 2H), 7,17 (s, 5H), 7,25

(s, 5H)]. En oppløsning av [(t-butyloksykarbonyl)amino(2-sek-butyl-etylen)]-fenylalanin-benzylester (2,94 g, 6,47 mmol) 1 4N HCl/dioksan (110 ml), ble dannet, og denne ble omrørt i

2 timer ved romtemperatur, beskyttet mot atmosfæren med et CaCl2-rør. Oppløsningsmidlet ble deretter fjernet under redusert trykk ved azeotropisk destillasjon med eter, hvorpå residuet ble utgnidd med eter, hvilket førte til et hvitt faststoff [2,65 g; 95 % deblokkeringsutbytte; smp. 183-184°C; Rf= 0,73 i BuOH:H20:eddiksyre (4:1:1);<1>H-NMR (CD30D): delta 1,00 (bredd, 6H), 5,13 (s, 2H), 7,1-7,5 (m, 10H)]

C. [n-(t-butyloksykarbonyl)-statin]-[amino(2-sek-butyl-etylen)]-( N- benzyloksykarbonyl- fenylalanin)- benzylester

En suspensjon av [amino(2-sek-butyl-etylen)]-fenylalanin-benzylester-dihydroklorid (1,55 g, 3,63 mmol) i metylenklorid (40 ml), ble avkjølt til 0°C og nøytralisert ved denne temp-eratur med trietylamin (0,808 g, 7,99 mmol). N-(t-butyloksykarbonyl) -statin (1,00 g, 3,63 mmol) og N-hydroksybenzotriazol (0,74 g, 5,45 mmol) ble deretter tilsatt til suspensjonen ved 0°C. Tilslutt ble dicykloheksylkarbodiimid (0,75 g, 3,63 mmol) i metylenklorid (2 ml) tilsatt til suspensjonen ved 0°C og den resulterende blanding omrørt i 3 timer ved 0°C og deretter i 16 timer ved romtemperatur. Det resulterende presipitat ble deretter frafiltrert og filtratet konsentrert og omrørt i 125 ml etylacetat. Etter ny frafiltrering av uløst faststoff, ble etylacetatlaget vasket med mettet, vandig NaHCO^-oppløsning (135 ml), tørket (Na2S04) og inndampet til et skum. Skummet ble renset ved "flash"-kromatografi med 35 % etylacetat i heksan som eluent og førte til et renset [N-(t-butyloksykarbonyl) -statin]-[amino(2-sek-butyl-etylen)]-fenylalanin-benzylester produkt som et skum [1,96 g; 88 % utbytte; R^= 0,58 i etylacetat:heksan, 1:1); 1H-NMR (CDC13): delta 0,6-1,1

(m, 12H), 1,5 (s, 9H), 4,88 (d, J=9,1H), 5,06 (s, 2H), 7,15

(s, 5H), 7,25 (s, 5H)]. En oppløsning av det rensede [N-(t-butyloksykarbonyl)-statin]-[amino(2-sek-butyl-etylen)]-fenylalanin-benzylester-skum (1,91 g, 3,12 mmol) i dioksan (16 ml), ble acylert med benzyloksykarbonylklorid (Chemalog, 67 ^uliter, 0,80 g, 4,68 mmol) ved hjelp av mettet, vandig NaHC03~oppløsning for å holde pH 8. Etter forbruk av hele utgangsmaterialet (ifølge TLC), ble dioksanet fjernet under redusert trykk og residuet fortynnet med H20 og ekstrahert med etylacetat. Etylacetatekstraktet ble tørket (MgS04) og inndampet til et skum som ble renset ved "flash"-kromatografi og førte til et hvitt skum [2,06 g; Rf= 0,7 i etylacetat:heksan, (1:1); 1H-NMR (CDC13>: delta 0,6-1,0 (m, 12H), 1,48 (s, 9H), 7,0-7,4 (m, 15H)]

a

D. til G. [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin- [amino(2-sek-butyl-etylen)]-[N-benzyloksykarbonyl-fenylalanin]- benzylester

På lignende måte som beskrevet i trinn F til I i

Eksempel 5, ble det rensede [N-(t-butyloksykarbonyl)-statin]-[amino(2-sek-butyl-etylen)]-(N-benzyloksykarbonyl-fenylalanin)-benzylester fra trinn C (2,03 g, 2,72 mmol), omdannet til renset [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-[amino(2-sek-butyl-etylen)]-(N-benzyloksykarbonyl-fenylalanin)-benzylester [0,595 g; skum; R^- 0,36 i 5 % metanol i kloroform;<1>H-NMR (CDC13): delta 0,6-1,0 (m, 12H), 1,38 (s, 9H), 6,75 (s, 1H), 7,1-7,3 (m, 20H), 7,38 (s, 1H)].

H. Tittelforbindelse

10 % Pd/C katalysator (18 mg) ble tilsatt til en oppløsning av [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-[amino(2-sek-butyl-etylen)]-(N-benzyloksykarbonyl-fenylalanin)-benzylester (150 mg, 0,150 mmol) i 4 ml etanol:eddiksyre (1:1), og den resulterende blanding hydrogenert i 12 timer ved romtemperatur og 2,8 kg/cm 2 H2 • Blandingen ble deretter filtrert og filtratet konsentrert til et faststoff (128 mg) som ble utgnidd med eter og ga et renset [N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin]-histidin-statin-[amino(2-sek-butyl-etylen)]-fenylalanin-eddiksyresalt i form av et fast produkt [109 mg; 84 % utbytte; smp. 117-126°C; R,-= 0,57 i BuOH-H-O-AcOH (4:1:1);<1>H-NMR (CD3OD, 250 MHz): delta 0,8-1,0 (m>12H), 1,36 (s, 9H), I, 92 (s, 6H), 2,2-2,45 (m, 2H), 4,28 (dd,J=9,4,1H), 3,54 (bred t, 1H), 6,92 (s, 1H), 7,2-7,4 (m, 10H), 7,63 (s, 1H)]

Eksempel 9

[ N-( t- butyloksykarbonyl)- Phe]- His- cyklostatin- Lys- Phe

A. N-( t- butyloksykarbonyl)- cyklostatin

Iseddik (6,5 ml) og 10 % Rh/C katalysator (1,5 g) ble tilsatt til en oppløsning av N-(t-butyloksykarbonyl)-4(S)-amino-3(S)-hydroksy-5-fenylpentansyre (10,02 g, 9,70 mmol) i metanol (200 ml) og den resulterende blanding hydrogenert i 8 timer ved romtemperatur under 3,2 kg/cm 2 H2 • Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert og filtratet konsentrert til et hvitt faststoff, som etter utgnidning i heksan, førte til et renset produkt [8,46 g; 83 % utbytte; smp. 109-110°C;

Rf= 0,72 i CHC13:MeOH:eddiksyre, 18:2:1;<1>H-NMR (CDC13):

1,45 (s, 9H), 2,55 (d, J=6,2H)

B. Tittelforbindelse

På lignende måte som beskrevet i Eksempel 1, men med N-(t-butyloksykarbonyl)-cyklostatin i stedet for N-(t-butyloksykarbonyl) statin, ble tittelforbindelsen fremstillet (1H-NMR, CD30D, 1,50 delta, 9H s [BOC]).

Eksempel 10

[ N-( t- butyloksykarbonyl)- Pro]- Phe- His- cyklostatin- Lys- Phe På lignende måte som beskrevet under trinn A til F i Eksempel 1, men med N-(t-butyloksykarbonyl)-cyklostatin i stedet for N-(t-butyloksykarbonyl)statin ble histidin-cyklostatin-(N-epsilon-benzyloksykarbonyllysin)-fenylalanin-benzylester-dihydroklorid fremstillet. På lignende måte som beskrevet under trinn G og H i Eksempel 1, men med [N-(t-butyloksykarbonyl) prolin]-fenylalanin (som er kommersielt tilgjengelig) i stedet for N-(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin og bruk av 95:5 CHCl3:MeOH som eluent under silikagelkromatograferingen, ble tittelforbindelsen oppnådd som et renset, fast produkt.

(<1>H-NMR, CD30D, 1,49 delta, 9H s [BOC]).

Eksempel 11

[N-(t-butyloksykarbonyl)-Phe]-His-cyklostatin-[amino-( 2- sek- butyl- etylen)]- Phe- eddiksyresalt

På lignende måte som beskrevet i Eksempel 8, men med N-(t-butyloksykarbonyl)-cyklostatin i stedet for N-(t-butyloksykarbonyl) -statin , ble tittelforbindelsen fremstillet [smp. 150-163°C (dekomp.);Rf= 0,50 i butanol:eddiksyre:vann 4:1:1 (ninhydrin);<1>H-NMR (CD3OD). 0,6-2,4 (m, 23H), 1,37

(s, 9H), 7,1-7,4 (11H), 6,95 (s, 1H), 7,70 (s, 1H)].

Eksempel 12

[ N-( t- butyloksykarbonyl)- Phe]- His- cyklostatin- Lys- Sta På lignende måte som beskrevet i Eksempel 1, men med statin-benzylester-hydroklorid i stedet for L-fenylalanin-benzylester-p-toluensulfonat og N-(t-butyloksykarbonyl)-cyklostatin i stedet for N-(t-butyloksykarbonyl)statin, ble tittelforbindelsen fremstillet ( iH-NMR, CD3OD, 1,5 delta,

9H s [BOC]).

Eksempel 13

[N-(t-butyloksykarbonyl)-Phe]-His-cyklostatin-( 3- metoksykarbonyl- 1, 2, 3, 4- tetrahydro- 2- isokinolin)

A. [N-(t-butyloksykarbonyl)-cyklostatin]-(3-metoksy-karbonyl- 1, 2, 3, 4- tetrahydro- 2- isokinolin)

På lignende måte som beskrevet under trinn C i

Eksempel 1, men med N-(t-butyloksykarbonyl)-cyklostatin

(190 mg, 0,60 mmol) i stedet for N-(t-butyloksykarbonyl)-statin og 3-metoksykarbonyl-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-hydroklorid (137 mg, 0,60 mmol) i stedet for (N-epsilon-benzyloksykarbonyl-lysin)-fenylalanin-benzylester-hydroklorid, ble [N-(t-butyloksykarbonyl)cyklostatin]-(3-metoksykarbonyl-1,2,3,4-tetrahydro-2-isokinolin) fremstillet som et skum som ble benyttet uten rensing i det neste trinn (3 01 mg,<1>H-NMR, CDC13, 1,5 delta, 9H s [BOC]).

Eksempel 2 0

[N-(t-butyloksykarbonyl)-Phe]-His-cyklostatin-Pro-metylester

A. [ N-( t- butyloksykarbonyl)- cyklostatin]- prolin- metylester

På lignende måte som beskrevet under trinn C i

Eksempel 1, men med N-(t-butyloksykarbonyl)-cyklostatin (3,15 g, 10 mmol) i stedet for N-(t-butyloksykarbonyl)-statin og prolin-metylester-hydroklorid (1,65 g, 10 mmol) i stedet for (N-epsilon-benzyloksykarbonyl-lysin)-fenylalanin-benzylester-hydroklorid, ble [N-(t-butyloksykarbonyl)-cyklostatin]-prolin-metylester fremstillet som et hvitt faststoff (3,945 g).

B. Tittelforbindelse

På lignende måte som beskrevet under trinn D til H i Eksempel 1 ble forbindelsen [N(t-butyloksykarbonyl)-fenylalanin] -histidin-cyklostatin-prolin-metylester fremstillet.

Eksempel 21

Inhibering av den angiotensinogen-spaltende virkning av renin in vitro

Blodplasma fra friskt laboratoriepersonell ble slått sammen og lagret dypfryst inntil aktuelt behov. Før bruk ble en del av plasmaet tint opp og sentrifugert og den overstående væske blandet med proteaseinhibitorer og tilsatt buffer til pH 7,4. Renininhibitorer ble tilsatt til ulike konsentrasjonsnivåer til forskjellige alikvoter av det sentrifugerte plasma og de resulterende blandinger (310^uliter) inkubert i 3 timer ved 3 7°C sammen med renininhibitor-frie kontrollblandinger. Etter inkubering ble reaksjonen i blandingene avbrutt i isvann og undersøkt med henblikk på angiotensin I ved bruk av angiotensin I antistoffer. Dannelsen av angiotensin I i nærvær av en renininhibitor ble sammenlignet med hva som ble dannet uten inhibitor, og den prosentuelle inhibering beregnet. Ved bruk av data oppnådd ved inkubering av dobbeltprøver av ulike inhibitorkonsentrasjoner, ble den nødvendige konsentrasjon i inkuberingsblandingen for å oppnå 50 % inhibering av reninets angiotensinogen-spaltende virkning, dvs. inhibitorens IC,-Q-verdi, beregnet for forskjellige inhibitorer.

Angiotensin I i blandinger hvor inkuberingen var avbrutt, ble bestemt ved hjelp av radioimmunoassay, ved å benytte komponenter fra et renin-radioimmunoassay sett fra Becton Dickinson and Co. (Orangeburg, N. Y.). Denne radioimmunoassay var basert på teknikk utviklet av Haber et al., J. Clin. Endocrinol., 29^s. 1349-1355 (1969).

Ved å benytte den angitte fremgangsmåte, ble renin-inhiberingskoeffisientene bestemt for forbindelsene fremstillet i Eksempel 1-5 og Eksempel 7-20. I samtlige tilfeller var den eksperimentelle ICC^-verdien lavere enn 5 mikromol/- liter.

Eksempel 22

Antagonisering av eksogen renin-indusert pressor-respons in vivo

Sprague-Dawley hannrotter (230-300 g legemsvekt) ble anestetisert med natriumpentobarbital (65 mg/kg legemsvekt, intraperitonealt), hvorpå femoralvene- og arteria carotis-kateteret ble implantert i hvert dyr. Etter det kirurgiske inngrep ble dyrene anbrakt i liggende stilling og rektal-temperaturen kontinuerlig avlest. Det midlere arterielle blodtrykk (MAP) ble registrert via arteria carotis-kateteret ved hjelp av en Statham P23 ID trykktransducer og en skriver. Etter en stabiliseringsperiode, ble kontrollverdier av renin-pressor-respons (dP) på 20-30 mm Hg oppnådd ved administrasjon av svinerenin (30-80 mU/kg legemsvekt, intravenøst). Etter at MAP var kommet tilbake til basisverdien, ble det gitt en renininhibitor (10 mg/kg legemsvekt, intravenøst). Dyrene ble igjen stimulert med svinerenin (samme dosering som for kontroll-respons) 5, 15 og 30 minutter etter administrasjon av renin-inhibitoren og de korresponderende verdier for renin-pressor-responsen (dP) målt. Prosent antagonisering beregnes som:

( kontroll dP - eksperimentell dP) x 100 %,

kontroll dP

hvor kontroll dP og eksperimentell dP er pressor-forandringene i MAP henholdsvis før og etter administrasjon av renin-inhibitoren. Minst tre forsøksdyr ble benyttet i hver test,

og gjennomsnittsresultatene ble beregnet.

Ved å benytte den beskrevne fremgangsmåte, kan den prosentuelle renin-induserte pressor-respons-antagonisering bestemmes for forbindelsene i henhold til oppfinnelsen.

Claims (23)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med formelen

og de farmasøytisk akseptable salter derav, hvor W er fenylalanin, histidin, leucin, tyrosin, 1-naftyl-alanin eller 2-fenylmetyl-propionylen; W 1er fenylalanin, histidin, leucin, tyrosin eller norleucin, hvor peptidbindingen mellom W og W i eventuelt er erstattet med -CH(alkyl med 1-4 karbonatomer)-NH- når W er fenylalanin og W er histidin; R er hydrogen, en amino-beskyttende acyldel med en molekylvekt på mindre enn 500, prolin, amino-beskyttet prolin, pyroglutaminsyre eller amino-beskyttet pyroglutaminsyre; R 2er hydrogen, alkyl med 1-6 karbonatomer, fenyl, cykloalkyl med 4-7 karbonatomer, fenylalkyl med 7-9 karbonatomer eller cykloalkyl(alkylen) med 5-10 karbonatomer; 3 9 9 9 R er hydroksyl, amino, -NHR , -NHCOR , -OR eller 9 9 -OCOR , hvor R er alkyl med 1-4 karbonatomer; og R <1> er (a) -A-E-B, hvor A er lysin eller prolin, eller dessuten, bare når R 3 er amino, isoleucin, E kan være fenylalanin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, lysin, ornitin, arginin, asparaginsyre, gamma-forestret asparaginsyre, glutaminsyre eller delta-4 4 5 forestret glutaminsyre, B kan være -OR , -NR R , -glutamin-4 4 4 5 syre(OR )~, -glutaminsyre(-OR )(NR R ) eller -glutaminsyre-4 5 4 5 (NR R )2 , og R og R hver kan være hydrogen, alkyl med 1-4 karbonatomer, fenylalkyl med 7-9 karbonatomer eller cykloalkyl (alkyl) med 5-10 karbonatomer,

hvor X kan mangle eller være alanin, isoleucin, lysin, prolin, ornitin, arginin, N-(alkyl med 1-4 karbonatomer)-lysin, N,N-di-(alkyl med 1-4 karbonatomer)-lysin, N-(alkyl med 1-4 karbonatomer) -ornitin eller N,N-di(alkyl med 1-4 karbonatomer)-ornitin, Z og Z 1hver er hydrogen, alkyl med 1-6 karbonatomer, cykloalkyl med 4-7 karbonatomer, cykloalkyl(alkylen) med 5-10 karbonatomer eller fenylalkyl med 7-9 karbonatomer, n og m begge er heltall fra 0 til 6, Q er

sr sr - i Y er metyl, fenyl, -COOR , -CONR R , -NH~ , (benzyloksy)-karbonylamino, -CO-glutaminsyre(-0R 6 )~, -CO-glutaminsyre(-OR 6)-6 7 6 7 6 7 (NR R ) eller -CO-glutaminsyre(-NR R )2, og R og R hver er hydrogen, alkyl med 1-4 karbonatomer, fenylalkyl med 7-9 karbonatomer eller cykloalkyl(alkylen) med 5-10 karbonatomer,

karakterisert ved følgende trinn:(A) en forbindelse med formel

12 3 1 eller et syreaddisjonssalt derav, hvor R , R , R og W er som ovenfor angitt og alle eventuelle reaktive grupper i 1 3 R og R er beskyttet, acyleres med en forbindelse med formel R-W-OX , hvor -0X står for en karboksyldel som er aktivert for acyleringsformål; (B) de eventuelle beskyttende grupper i R 1 og R 3 fjernes; og (C) den resulterende forbindelse med formel I eventuelt omdannes til et farmasøytisk akseptabelt salt.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at R er en amino-beskyttende acyldel med en molekylvekt på mindre enn 500 eller et amino-beskyttet prolin, W er fenylalanin, W 1 er histidin og W og W 1 er bundet gjennom en peptidbinding.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert 2 3 ved at R er isobutyl og R er hydroksyl.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at R 2 er cykloheksyl(metylen) og R <3> er hydroksyl.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller 4, karakterisert ved at R er -lysin-E-B.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at E er fenylalanin og B er hydroksyl.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at R er t-butyloksykarbonyl.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at R er N-(t-butyloksykarbonyl)-prolin.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller 4, karakterisert ved at R i er

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at X ikke mangler.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at X er valgt fra alanin, prolin, isoleucin og lysin.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at Z er isobutyl, OH Q er -C' H- , Z 1er hydrogen og n og m begge er null.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert 6 6 7 ved at Y er valgt fra -COOR , -CONR R , -CO-glutaminsyre- f - f \ ft 7 (-OR )„, -CO-glutaminsyre(-OR )(NR R ) og -CO-glutaminsyre-(-nr6r') 2.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at Z og 2? begge er hydrogen, Q er -CH-, summen av n og m er fra 0 til 3 og Y er -COOR eller -CONR R .

15. Fremgangsmåte ifølge krav 12-14, karakterisert ved at X er lysin.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at X mangler.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at Z er hydrogen, Q er -CH,,-, Y er -COOR , -CONR R , fi 6 6 7 -CO-glutaminsyre(-OR ) -CO-glutaminsyre(-OR )(NR R ) eller -CO-glutaminsyre(-NR R )2 , Z er alkyl med 1-6 karbonatomer og summen av n og m er fra 0 til 3.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at Q er -NH-, m er null, n er 0 eller 1, Y er -COOR , 6 7 6 6 -CONR R , -CO-glutaminsyre(-OR )9, -CO-glutaminsyre(-OR )- 6 7 6 7 (-NR R ) eller CO-glutaminsyre(-NR R )2 og Z er alkyl med 1-6 karbonatomer.

19 Fremgangsmåte ifølge krav 17 eller 18, karakterisert ved atYer -COOR eller -CONR <6> R <7> .

20. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at Z <1> er benzyl.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 17 eller 18, karakterisert ved atZer sek-butyl.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at R har formelen

eller

hvor M er -0-, -CH.,-, -NH- g eller -S02 NH-, og R er alkyl med 1-6 karbonatomer, fenyl, fenylalkyl med 7-9 karbonatomer eller cykloalkyl(alkyl) med 5-10 karbonatomer.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at R er N-(t-butyloksykarbonyl)-prolin.