NO861962L - Radioaktivt halogenerte smaa molykyler for proteinmerking. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører radioaktivt halogenerte små molekyler for merking av proteiner, spesielt antistoffer, som er anvendelige for klinisk diagnose og terapi, og fremgangsmåter for å innføre meget spesifikk aktive radioaktive halogener i proteinmolekyler.

Radioaktivt halogenerte proteiner har vært gjenstand for utstrakte vitenskapelige undersøkelser og lover å være anvendelige for en rekke kliniske formål, både in vitro og in vivo. F.eks. er radioaktivt jodert ferritin brukt i en in vitro diagnostisk bestemmelse av ferritinkonsentrasjon i serum. Radioaktivt jodert tyroidstimulerende hormon anvendes i en lignende måling.

Radioaktive nukleider av halogener har egenskaper som gjør dem meget attraktive både for diagnostisk billeddannelse og radioaktiv terapi. F.eks. er radioaktivt jod som jod-123

(Tl/2 = 13 h, 159 keV gamma, elektronoppfanging) nesten ideell for billeddannelse med vanlige gammakameraer, og jod-131

(Tl/2 = 8 d, 364 keV gamma, beta partikkel), som gir bilder med lavere kvalitet, er vist å være anvendelig i klinisk radioaktiv terapi av skjoldbruskkjertelen. På lignende måte har brom radioaktive nukleider såsom brom-75 (Tl/2 = 1,6 h, positron) og brom-76 (Tl/2 = 16 h, positron) egenskaper som gjør dem attraktive for positrontomografisk billeddannelse, og brom-77

(Tl/2 = 2,4 d, flere gammaer, elektronoppfanging) har egenskaper som gjør det attraktivt for radioaktiv terapi. Andre radioaktive halogener såsom fluor-18 (Tl/2 = 110 min, positron) og astatin-211 (Tl/2 = 7,2 h, alfa partikkel), er også attraktive kanditater for radioaktiv billeddannelse og radioaktiv terapi.

Utviklingen av monoklonale antistoffer som lokaliseres i kreftvev på grunn av deres høye spesifitet og affinitet til antigener på tumorcelleoverflater har øket muligheten for kliniske anvendelser av radioaktivt merkede antistoffer for diagnose og/eller terapi. Antistoffenes store spesifitet gjør dem til ønskelige kanditater som bærermolekyler for å feste spesifikke radioaktive nukleider for å gi radioaktivitet til kreftstedet.

Uheldigvis er det for tiden ingen kliniske diagnostiske eller terapeutiske rutineanvendelser av radioaktivt halogen- merkede antistoffer for bruk in vivo. Direkte radioaktiv halogenmerking av antistoffer og andre proteiner har vist seg å være vanskelig. Antistoffer viser varierende sensitiviteter overfor radioaktive merkingsreaksjonsbetingelser, og de nød-vendige oksydasjonsreaksjonsbetingelser for radioaktive halogeneringer er spesielt skadelige. Direkte radioaktiv jodering av proteiner er blitt en rutine, men meget ofte får man en målbar reduksjon i proteinets biologiske aktivitet. Den tilknyttede radioaktive markørs stabilitet kan også variere. F.eks. er tapet av radioaktivt jod fra antistoffer funnet å være så høyt som 50% på 24 timer for noen merkede antistoffer. Radioaktive bromerin-ger krever også sterkere oksydasjonsreaksjonsbetingelser enn radioaktive joderinger, og forsøk på å radioaktivt bromere proteinet direkte har hatt lite hell med seg, med mindre enzymer som er dyre og vanskelige å få fatt i, anvendes som oksydanter. Videre opptrer direkte radioaktiv halogenering av proteiner primært på tyrosylrester, og tyrosinets aktiverte fenolring bidrar til en medfølgende elektronisk ustabilitet av den resulterende ortosubstituerte radioaktive halogenmarkør. Den radioaktive halogenmarkør er også gjenstand for steriske hindringer og kan i tillegg være tilgjengelig for dejodinase enzymer som kataboliserer de strukturelt lignende tyroide hormoner, f. eks. tyroksin.

En løsning som sparer de foreliggende proteiner for røffe reaksjonsbetingelser som er nødvendig for direkte radioaktive halogeneringer, er bruken av små molekyler som kan være radioaktivt merkede i en separat reaksjonskjeie og deretter kobles til proteinet under milde reaksjonsbetingelser. Dette prinsipp er grunnlaget for Bolton-Hunter reagenset som finnes i handelen, N-succinimidyl-3-(4-hydroksyfenyl)propionat. Moderate utbytter av radioaktiv markering oppnås derved med radioaktivt jod (30-60% utbytter på merkede proteiner), men stabiliteten til den radioaktive jodmarkør lider av de samme problemer som er beskrevet for de kjemisk beslektede radioaktivt joderte tyrosylrester. Lignende kan Wood's reagens i handelen, metyl-4-hydroksybenzi-midat,joderes radioaktivt før knytting til proteiner. Imidlertid er det radioaktivt joderte produkt også plaget med ustabiliteten som følger det orto-joderte fenol. Selv om disse reagenser ikke gir en så stabil radioaktiv markør som ønskelig, er de blitt brukt meget for radioaktiv jodering på grunn av den svake reaktivering av proteinet som bruken av den medfører.

Den fenoliske ring anvendes i både Bolton-Hunter og Wood's reagenser fordi en aktivert aromatisk ring kreves for å innføre meget spesifikt aktivt radioaktivt jod i disse molekyler. Det ville være megetønskelig å kunne innføre radioaktive halogener i små molekyler som inneholdt en annen aromatisk ring enn fenol, slik at den radioaktive markør kunne festes mer stabilt, og videre hvis hydroksylgruppen ikke var tilstede, ville den radioaktive markør være mindre utsatt for elektroniske og steriske hindringseffekter.

Nyere rapporter i litteraturen beskriver bruken av organometalliske mellomprodukter til å innføre meget spesifikt aktive radioaktive halogener i ikke-aktiverte aromatiske ringer i enkle organiske molekyler, men ikke i mere komplekse organiske molekyler som kan være knyttet til proteiner uten de foran nevnte ulemper.

Denne oppfinnelse gir en rask og virkningsfull metode for å innføre meget spesifikt aktive radioaktive halogennukleider i ikke-aktiverte aromatiske ringer av små molekyler som kan konjugeres til proteinet under betingelser som tar vare på proteinets biologiske aktivitet. Erstatning med det radioaktive halogen på den ikke-aktiverte aromatiske ring gir et radioaktivt merket protein med større stabilitet enn tidligere kjente substitusjoner på aktiverte aromatiske ringer såsom fenol. Videre kan det radioaktive halogen settes inn i slike stillinger som para eller meta på en aromatisk ring som ikke inneholder en hydroksyfunksjon for å gjøre den radioaktive markør mindre ømfintlig for angrep av dejodase enzymer.

Ifølge denne fremgangsmåte metalleres halogenarylforbin-delser med en av de følgende organometalliske grupper: Sn(n-By)3eller SnMe3. Den resulterende aryltinforbindelse kan trans-metalleres i en punktspesifikk reaksjon med en av de følgende organometalliske grupper: HgX2, Hg(0Ac)2, BX3eller BZ3, hvor X er Cl, Br eller Jod, og Z er alkyl eller alkoksy. De metallerte forbindelser halogeneres så radioaktivt gjennom en demetal-leringsreaksjon. En funksjonell gruppe som er regnet for

konjugasjon til proteinet kan tilsettes etter eller før den radioaktive halogenering.

Forbindelser med formel Ri-Ar-R2tilveiebringes også, hvor Ri enten er et radioaktivt halogen eller en av de organometalliske grupper som er angitt ovenfor, Ar er aromatisk eller heteroaromatisk ring, og R2er en kortkjedet substituent som ikke aktiverer den aromatiske ring sterkt og som bærer en egnet funksjonell gruppe for konjugasjon med protein under betingelser som bevarer proteinets biologiske aktivitet. De radioaktivt halogenerte små molekyler i denne oppfinnelse kan også konjugeres til proteiner såsom monoklonale antistoffer for bruk ved diagnose og terapi.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1, 2, 3 og 4 er stolpediagrammer som gir sammenlignende blodfordelingsdata som bekrefter, som beskrevet i eksempel 14, den økede in vivo stabilitet av monoklonale antistoffer radioaktivt merket ifølge denne beskrivelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører radioaktivt halogenerte små molekyler med formelen:

hvori<*>X er et radioaktivt halogen, Ar er aromatisk eller heteroaromatisk ring, og R er en kortkjedet substituent som ikke sterkt aktiverer ringen Ar som er substituert med radioaktivt halogen<*>X, og som inneholder en egnet funksjonell gruppe for konjugasjon til protein under milde, f.eks. acyleringsbetingelser som bevarer proteinets biologiske aktivitet. Forbindelser med formel I kan kobles til proteiner såsom monoklonale antistoffer eller plasmaproteiner (eller til slike bærere som aminosyrepolymerer som igjen kan kobles til proteiner) og gir reagenser for diagnostiske eller terapeutiske formål.

Slik det her er brukt betyr symbolet<*>X enhver radioaktiv isotop av: jod, spesielt jod-123, jod-125 og jod-131; brom, spesielt Br-75, Br-76 og Br-77; fluor, spesielt F-18; og astatin, spesielt At-211. Foretrukne radioaktive halogener<*>X for diagnostisk billeddannelsesformål er j-131 og helst j-123 for billeddannelse med gammekameraer; og for positrontomografiske

billeddannelser: F-18, Br-75 og Br-76. For klinisk radioaktiv terapi er foretrukne radioaktive halogener<*>X J-131, Br-77 og At-211. Foretrukne radioaktive halogener<*>X for in vitro radioaktiv immunologisk måling er J-125 og J-131. Ifølge denne oppfinnelse er det radioaktive halogen<*>X fortrinnsvis i para-eller meta-stilling på ringen Ar i forhold til substituenten R for å gjøre det radioaktive halogen mindre ømfintlig for katabolisme med dehalogenase enzymer.

Symbolet Ar betyr enhver aromatisk eller heteroaromatisk ring. Foretrukne ringer Ar er benzen, pyridin, furan, tiofen, de siste tre på grunn av den økede vannløselighet de medfører. Feste av det radioaktive halogen til et karbonatom i ring Ar foretrekkes fremfor binding til et alkylkarbonatom på grunn av denøkede bindingsstyrken av karbon-halogenbindingen i den aromatiske eller heteroaromatiske ring. Typen av ring Ar er ikke kritisk og kan være mono-, bi-, tri- eller høyere antall ringer, men en monocyklisk ring foretrekkes på grunn avøket vannløselig-het. Ringen Ar kan bestå av bare karbonatomer eller kan inneholde heterogenatomer såsom nitrogen, oksygen eller svovel. At heteroaromatiske ringer inngår såsom pyridiner, furaner eller tiofener kan hjelpe til å øke vannløseligheten til de radioaktivt joderte små molekyle konjugater. Ytterligere substitusjon på ringen Ar foruten med * X og R med polare substituenter såsom en nitro, sulfonsyre, karboksylsyre eller dialkylaminogrupper kan også brukes til å øke vannløseligheten. Øket vannløselighet er ønskelig for å gi høyere utbytte (og mindre potensiell aggre-gering) i konjugeringsreaksjonen med proteinet, og bevirke mindre perturbasjon av lipofiliteten til antistoffkonjugatet. Andre substituenter kan tilføyes for å gi en viss kontroll mot en enzymatisk nedbrytning.

Symbolet R angir alle substituenter som tilfredsstiller de følgende tre krav: Først må substituenten R ikke sterkt aktivere ringen Ar for elektrofil substitusjon. Med andre ord kan R ikke være bundet til ringen Ar ved en binding som øker elektron-tettheten til Ar av den økningsorden som fås med en fri hydroksy eller fri amino substitusjon. For det andre bør R være en kortkjedet substituent, slik at ikke konjugerte eller spaltede radioaktivt markerte molekyler raskt kan fjernes fra nyrene.

Således kan R inneholde en alkyl eller annen avstandsgivende kjede mellom arylbindingen og den funksjonelle gruppe for protein konjugasjon, men en slik avstandsgivende kjede bør fortrinnsvis ikke inneholde mer enn 5 og helst ikke mer enn 3 rettkjedede karbonatomer. For det tredje bør substituenten R inneholde en funksjonell gruppe som er tilgjengelig for konjugasjon til protein under milde konjugasjonsbetingelser såsom acylering eller amidering, som bevarer proteinets biologiske aktivitet. Således bør R gi en funksjonell gruppe (her kalt Q) såsom imidester eller imidatester for kovalent binding til tilsvarende funksjonelle grupper (eller konjugerte tilknytningspunkter) på aminosyre eller karbohydratrester av proteiner, glycoproteiner eller bærermolekyler såsom aminosyrepolymerer som igjen kan konjugeres til proteinmolekyler.

Egnede funksjonelle grupper for Q for det ovennevnte formål er fenoliske estere (f.eks. para-nitrofenol), imidestere (f.eks. succinimidester), imidatestere, anhydrider, acylsuccinimider, aldehyder, isotiocyanater, tiol, diazo, aminer, hydraziner, alkylhalogenider, Michael akseptor a,p-umettede karbonylfor-bindelse såsom maleimider og andre grupper som kan brukes til å knytte molekylet til et protein gjennom kovalent binding. Videre frembringes radioaktivt halogenerte små molekyler med formel I hvori R substituenten inneholder et forstadium for funksjonell gruppe Q. Egnede forstadier er: karboksylsyre hvor Q er fenol-ester, imidester, anhydrid, acylsuccinimid eller maleimid; nitril hvor Q er imidatester, alkohol hvor Q er aldehyd; halogenid hvor Q er isotiocyanat, tiol, hydrazin eller amin; og amin hvor Q er diazo eller maleimid.

Representative R substituenter er imidestere, alkylimid-estere, amidoalkylimidestere, imidatestere, alkylimidatestere og amidoalkylimidatestere.

Representative radioaktivt halogenerte små molekyler ifølge denne oppfinnelse innbefatter forbindelsene med formel II og III:

hvor<*>X er radioaktivt halogen som ovenfor angitt, n er et heltall og Q er en funksjonell gruppe som ovenfor angitt. Det radioaktive halogen kan plasseres som hvilken som helst regio-isomer på den aromatiske ring Ar, men para- eller meta-substitusjon er foretrukket for å gjøre det radioaktive halogen mindre ømfintlig for sterisk ustabilitet og katabolisme ved dejodase enzymer. Avstandskomponenten (CH2)nkan være en rett eller forgrenet kjede alkyl- eller heteroalkylgruppe inneholdende opptil 12, men fortrinnsvis ikke mer enn 5 karbonatomer i rett kjede. I de sterkest foretrukne utførelsesformer skiller ikke mer enn 3 karbonatomer i rett kjede den funksjonelle gruppe Q fra den aromatiske ring; dvs. n = 0, 1, 2 eller 3. For raskt å klare bakgrunnsaktiviteten for diagnostisk billeddannelse, og for å minimalisere bestrålingsdose på vitale organer, bør alkyl-avstandskomponenten forkortes, slik at ikke konjugerte og kjemisk eller enzymatisk spaltede radioaktivt halogenerte forbindelser raskt kan skilles ut gjennom nyrene i stedet for gjennom fett-syrenedbrytningsbaner i hjerte eller lever. For visse formål kan på den annen side en kort alkyl- eller heteroalkyl-avstands-holder mellom den radioaktivt markerte arylring og proteinet være ønsket.

Illustrerende, men ikke begrensende eksempler på radioaktivt halogenerte små molekyler i denne oppfinnelse er: N-succinimidyl 3_(4._[i3i j] jodfenyDpropionat; metyl 3- (4 * - E1 3 11] jodf enyl) - propioimidat; N-succinimidyl 4-t<131>1]jodbenzoat; metyl 4-[<13l>I]-jodbenzimidat; N-succinimidyl 4-t<131>1]jodbenzamidoacetat eller

N-succinimidyl 4-C1 3 1 I] jodhippurat; metyl 4-C<131>1]jodbenzamido-acetimidat og 4-C131 I]jodbenzamidoacetonitril.

Videre tilveiebringes ifølge foreliggende oppfinnelse organometalliske mellomproduktmolekyler med formel IV:

hvori M er Sn(n-Bu)3, (Bu er butyl), SnMe3, (Me er metyl), HgX, (X er Cl,Br eller J), HgOAc,(OAc er acetat), B(OH)2eller BZ2 , (Z er alkyl eller alkoksy inneholdende ikke mer enn 5 og fortrinnsvis færre karbonatomer), med både Ar og R som definert under henvisning til formel I. Den organometalliske gruppe M er fortrinnsvis i para- eller meta-stilling. Illustrerende, men ikke begrensende eksempler på organometalliske metallprodukt-molekyler i denne oppfinnelse er: N-succinimidyl 3-(4'-tributyl-stannylfenyl)propionat; metyl 3-(4'-tributylstannylfenyl)propio-imidat; N-succinimidyl 4-tributylstannylbenzoat; metyl 4-tri-butylstannylbenzimidat; N-succinimidyl 4-tributylstannylbenz-amidoacetat eller N-succinimidyl 4-tributylstannylhippurat;

metyl 4-tributylstannylbenzamidoacetimidat og 4-tributylstannyl-benzamidoacetonitril.

En fremgangsmåte er frembrakt for syntese av forbindelsen med formel I. Kort sagt kan en av de tre reaksjoner som er beskrevet nedenunder brukes til å metallisere enhver posisjons-isomer av et halogenaromatisk derivat med en funksjonell gruppe Q eller et forstadium for en funksjonell gruppe Q. Metalliseringen vil skje med et trialkyltinreagens såsom Sn(n-Bu)3eller SnMe3. Den resulterende aryltinforbindelse kan transmetalliseres i en punktspesifikk reaksjon med en av de følgende organokvikksølv-eller organobor-reagenser: HgX2, Hg(OAc)2, BX3eller BZ3, hvor X er Br, J eller fortrinnsvis Cl, og Z er alkyl eller alkoksy. De resulterende organometalliske mellomprodukter kan eventuelt fremstilles gjennom metalliseringsreaksjoner som nevnt nedenunder. Den stannylerte eller på annen måte metalliserte forbindelse halogeneres radioaktivt gjennom en demetalliseringsreaksjon, fortrinnsvis etter funksjonell gruppe Q foreligger.

De angitte organometalliske reagenser kan frembringes

gjennom kjent kjemi og kan kjøpes, f.eks. fra Alpha Products, Danvers, MA.

Forstadier for de organometalliske mellomproduktmolekyler med formel IV er tilgjengelige ved kjent kjemi eller kan kjøpes. Egnede forstadiumsmolekyler er: para-brom eller para-jodbenzo-syrer (Pfaltz and Bauer, Stamford,Conn.); para-brom og para-jodbenzonitriler (Pfaltz and Bauer). Syntese av para-bromfenyl-propionsyre i høye utbytter er beskrevet nedenunder i eksempel 1. Overføring av syren i det tilsvarende nitril kan utføres som beskrevet i J.0rg.Chem.41(7):1187-1191, 1976.

Synteser av arylstannanene kan utføres gjennom hver av de følgende tre tydelige forskjellige reaksjoner. I den første reaksjon omsettes den halogenaromatiske forbindelse med n-butyllitium ved nær -100°C eller med magnesium ved romtemperatur, etterfulgt av reaksjon av arylmetallforbindelsen med et halogenid derivat av et trialkyltinreagens, fortrinnsvis tri-n-butyltin. I den andre reaksjon omsettes halogenaromatforbindelsen med heksaalkylditin og tetrakis(trifenylfosfin)palladium. I den tredje reaksjon omsettes den halogenaromatiske forbindelse med et trialkylstannyl alkaliderivat (f.eks. trimetylstannylnatrium) i tetraglym ved 0°C.

Syntese av organokvikksølv- og organobormellomprodukter kan utføres ved de tidligere beskrevne metoder (Orgonometallic Chem. Rev. 1:305-329, 1966; Tetrahedron 38(12):1713-1754,1982) eller fortrinnsvis ved transmetallisering av de ovennevnte aryl-stannaner. Transmetallisering av en aryltinforbindelse med en av de angitte organokvikksølv- eller organoborgrupper kan foretas for å oppnå en punktspesifikk substitusjon på den aromatiske ring. F.eks. i transmetallisering med BCI3den tilsvarende aryl-BCl2forbindelse, som så kan baseomdannes i den tilsvarende aryl-B(OH)2forbindelse. Reaksjonen med Hg(OAc)2gir den tilsvarende aryl-HgOAc forbindelse som videre kan overføres i aryl-HgX ved omsetning med halogenidion (X).

Knytting av de kommende radioaktivt markerte forbindelser til proteiner vil kreve at en funksjonell gruppe Q er tilgjengelig, som man kan få ved å overføre en karboksylat forstadiumgruppe i en ester inneholdende en god avgangsgruppe, f.eks. hydroksysuccinimid, eller ved overføring av et cyanoforstadium i en imidatester. Slike overføringer kan anses å aktivere molekylet mot omsetning med en tilsvarende funksjonell gruppe såsom en aminogruppe (f.eks. lysinrester), en tiol eller hydroksy (eller mindre foretrukket et karboksylat) til et protein. På grunn av alkalimetallmellomproduktenes nukleofile karakter, kan, når disse reagenser brukes, de aktiverte imid- og imidatestere eller andre nukleofile reagenssensitive overfor nevnte funksjonelle grupper Q først syntetiseres etter innføring av tri-alkyltinfunksjonen på den aromatiske ring. Derfor er det funnet at den andre arylstannan syntesereaksjon er spesielt anvendelig for å fremstille forbindelser som er ømfintlige for nukleofile reaksjoner. Fremstilling av de aktiverte imid- og imidatestere eller annen funksjonell gruppe før innføringen av det radioaktive halogen forhindrer tap i radioaktivt kjemisk utbytte og den innføring av radioaktivt kjemiske forurensninger som ellers ville følge.

Omdannelse av de aryltin- eller på annen måte metalliserte derivater fra fri karboksylsyrer eller deres stannylestere i en succinimidylester kan utføres før det radioaktive halogenerings-trinn ved å bruke dicykloheksylkarbodiimid (DCC) og N-hydroksysuccinimid (NHS) i vannfritt tetrahydrofuran (THF). Imidlertid blir syntesen av imidatestere fra cyanoforbindelser problematisk ved syreustabiliteten til arylmetallbindingen, spesielt aryltin-bindingen. Således kan de cyanholdige forbindelser halogeneres radioaktivt før dannelsen av imidatesteren. Den foretrukne fremgangsmåte er å danne imidatesteren av det tilsvarende halogenbenzonitril eller halogenarylalkylnitril, og deretter metallisere den imidatholdige forbindelse ved bruk av heksaalkylditin og tetrakis(trifenylfosfin)palladium (ved bruk av den andre arylstannan syntesevei).

Radioaktive halogenering av de tilsvarende N-succinimidyl-estere vil gi de ønskede forbindelser gjennom punktspesifikk demetalliseringsreaksjon. På grunn av hydrolysemuligheten av N-succinimidylesterene, bør reaksjonene utføres ved å bruke betingelser som vil minimalisere reaksjonstiden. F.eks. kan reaktanten bringes til romtemperatur for å minimalisere hydrolysen ved forkortelse av reaksjonstiden. Alternativt kan reaksjonsblandinger hvori hydrolysen er relativt langsom anven des. Overraskende gjør tilsetning av eddiksyre til reaksjonsblandingen hydrolysen av N-succinimidylesteren betydelig lang-sommere. F.eks. er N-succinimidylesteren av 4-tri-n-butyl-stannylbenzoat funnet å være stabil over måneder i 5% eddiksyre/- metanolløsning, hvilket på egnet måte unngår korttidsbegrens-ningene man alltid finner ved Bolton-Hunter metoden.

Den radioaktive halogeneringsreaksjonsblanding bør være tilsatt en fortynnet natriumtiosulfatløsning før rensings- og opparbeidingsprosessen. Alt gjenværende radioaktivt halogenid kan lett skilles fra før eller under rensningen av det radioaktivt markerte protein gjennom kromatografiske separasjoner.

De radioaktive halogeneringsreaksjoner utføres fortrinnsvis i protiske løsningsmidler såsom vann, metanol, etanol eller blandinger derav. De alkoholiske løsningsmidler kan lett fjernes før tilsetningen av den radioaktive forbindelse til protein-løsningen (eller omvendt). Alternativt kan ikke-protiske løsningsmidler (f.eks. karbontetraklorid) brukes for radioaktiv halogenering da et tofasesystem kan gi en grei metode for å skille fritt radioaktivt halogenid fra de merkede forbindelser.

De radioaktive halogeneringer kan kontrolleres og renses ved radioaktiv-HPLC, f.eks. på en reversfase HPLC-kolonne (C-18) eluert med en blanding av MeOH/1% HOAc i H2O.

Videre tilveiebringes radioaktive farmasøytiske sett for klinisk bruk som inneholder et glass inneholdende en forbindelse (IV) som har en riktig funksjonell gruppe Q sammen med de riktige reagenser, slik at innføringen av et radioaktivt halogen vil gi det ønskede radioaktivt halogenerte molekyl. Det radioaktivt halogenerte produkt kan så konjugeres til protein, såsom et monoklonalt antistoff tilført i et separat glass. Settet kan også inneholde en eller flere små kolonner for kromatografisk separasjon av gjenværende forstadier og forurensninger fra det radioaktivt halogenerte proteinprodukt.

Oppfinnelsen er videre illustrert med de følgende eksempler.

Eksempel 1

Syntese av 3-( 4'- bromfenyl) propionsyre.

En kolbe inneholdende 10,0 g 2,4,4-trimetyl-2-oxazolin

(88 mmol) oppløst i vannfri tetrahydrofuran (THF) under nitrogen fikk likevektsinnstille seg ved -78°C (tørr is/acetonbad) i 10 minutter. Denne kolbe ble langsomt tilsatt 55 ml n-butyl litium (1,6 N, 85 mmol). Den lysegule løsning ble så overført til en andre kolbe som inneholdt 29,4 g (100 mmol) 4-brombenzyl-bromid i 200 ml vannfri THF under nitrogen ved -78°C. Såsnart tilsetningen var ferdig, ble reaksjonsblandingen rørt i 20 minutter ved -78°C, deretter ble kjølebadet fjernet og røringen fortsatt i 3 timer.

Et 200 ml volum mettet NH«Cl ble tilsatt (forsiktig) og de to fasene ble adskilt. THF-laget ble tørket over vannfritt MgSCu og inndampet og ga en olje. Denne olje ble oppløst i 200 ml dimetoksyetan og 100 ml 3N HC1 og ble oppvarmet til tilbakeløp i 5 timer. Den resulterende løsning ble helt på is, og det lysebrune faste stoff ble oppsamlet (utbytte: 17 g).

Dette faste stoff ble oppløst i ca. 300 ml 15% KOH og ekstrahert med 200 ml dietyleter. KOH-løsningen ble fortynnet med is og surgjort med konsentrert HC1. Den hvite felling ble samlet og vasket godt med H20 (utbytte: 10 g).

Eksempel 2

Syntese av 4- tri- n- butylstannylbenzonitril.

En kolbe inneholdende 1 ekvivalent (f.eks. 10 mmol) 4-brombenzonitril i nydestillert vannfritt THF fikk likevektsinnstille seg ved ca. -100°C (dietyleter/flytende nitrogenbad) i ca. 30 minutter under nitrogen. Kolben ble så tilsatt 1,1 ekvivalenter (f.eks. 11 mmol) av en n-butyllitiumløsning (2,3 M i heksan) ved en slik hastighet at reaksjonstemperaturen ble holdt under -90°C. Etter tilsetningen var ferdig, ble reaksjonsblandingen rørt ved ca. -100°C i 5 minutter til.

Så ble en løsning av 1,1 ekvivalenter (f.eks. 11 mmol) tri-n-butyltinklorid i vannfritt THF tilsatt dråpevis. Som før ble tilsetningen foretatt ved en slik hastighet at reaksjonsblandingen ble holdt under -90°C. Etter at reaksjonen var ferdig, ble reaksjonsblandingen rørt ved -100°C i 30 minutter. Kjølebadet ble deretter fjernet og reaksjonsblandingen fikk stige til romtemperatur over et to timers tidsrom.

Så ble THF fjernet ved rotasjonsinndampning og ga en melkeaktig olje. Denne oljen ble oppløst i CH2 CI2 , vasket med H2O og tørket over MgSCU . Fordampning av CH2CI2ga (96%) av en svakt gul olje. Rensing av denne olje ved destillasjon ved 132°C/100p ga en farveløs olje som var 85% ren ved HPLC-analyse: 1H N MR (CDC13)5 0,68-2,0 (m, 27H), 7,68 (s,4H).

Eksempel 3

Syntese av tri- n- butylstannyl 4-( tri- n- butylstannyl) benzoat.

Metode 1: Til en løsning av 2,01 g (10 mmol) 4-brombenzosyre (Alfa Products) i 100 ml vannfri THF avkjølt til -100°C (dietyleter/flytende nitrogen) (i en kolbe utstyrt med termometer, dråpetrakt og magnetrørestav) satte man dråpevis 13,5 ml (21 mmol) 1,55N n-butyl litium i heksan (Aldrich) ved en slik hastighet at den innvendige temperatur ikke oversteg -90°C. Den viskøse blanding fikk oppvarmes til -78°C og 5,70 ml (6,83 g, 21 mmol) n-tributyltinklorid (Aldrich) ble tilsatt over 15 minutter. Når tilsetningen var ferdig, fikk blandingen komme til romtemperatur og ble rørt i 1 time. Blandingen ble så tilsatt 150 ml mettet (NH4)2SO4-løsning, og blandingen ble ekstrahert med 150 ml dietyleter. Det øvre sjikt ble vasket med saltvann, tørket (MgSC-4 ) , filtrert og konsentrert og ga 7,49 g væske. Rensing ved kieselgel kromatografi (25% EtOAc/heksan) ga 2,32 g (33%) tri-n-butylstannyl 4-(tri-n-butylstannyl)benzoat som en viskøs olje:<*>H N Mr (CC14)5 0,32-2,70 (m, 54H), 7,50 (d, J=7Hz, 2H), 7,99 (d, J=7Hz, 2H). IR (ren) 1635, 1450, 1315 cm"<1>.

Metode 2: Til en omrørt suspensjon av 1,00 g (5 mmol) 4-brombenzosyre (Alpha) i 7,6 ml heksabutylditin (Alfa) og 10 ml toluen under N2atmosfære satte man 58 mg tetrakis(trifenyl-fosfin)palladium(O)(Aldrich), og blandingen ble rørt ved 95°C i 20 timer. Etter avkjøling ble den oransje blanding fordelt mellom 100 ml 10% vandig KF-løsning og 100 ml dietyler. Etersjiktet ble vasket med saltvann, tørket (MgSCu ), filtrert, konsentrert og destillert i kulerør og ga 1,14 g (33%) tri-n-butylstannyl 4-(tri-n-butylstannyl)benzoat som en viskøs olje, destillerte ved 200-250°C, 0,25 mm Hg.

E ksempel 4

Syntese av N-succinimidy l 4-(tri-n-butyl stannyl) benzoat.

Til en løsning av 1,29 g (1,84 mmol) tri-n-butylstannyl-4-(tri-n-butylstannyl)benzoat i 18,4 ml vannfritt THF satte man 417 mg (2,02 mmol) dicykloheksylkarbodiimid (Sigma) og 212 mg (1,84 mmol) N-hydroksysuccinimid (Sigma), hvor blandingen ble rørt 15 timer ved romtemperatur. Til blandingen satte man så tre dråper HOAc. De faste stoffer ble fjernet ved filtrering og blandingen ble konsentrert. Rensing med kieselgel kromatografi (25% EtOAc/heksan) ga 731 mg (78%) N-succinimidyl 4-(tri-n-butylstannyl ) benzoat :<1>H N MR (CDC13)5 0,50-2,20 (m, 27H), 2,90 (s, 4H), 7,65(d, J=8Hz, 2H),8,06(d, J=8Hz, 2H). IR(ren)1780, 1750, 1190,1055, 980 cm"<1>.

Eksempel 5

S yntese av 4-( tri- n- butylstannyl) hippursyre.

Til en løsning av 406mg (0,80 mmol) N-succinimidyl 4-(tributylstannyl)benzoat i 6,4 ml CH3CN satte man 224pl (160 mg, 1,60 mmol) Et3N (Fisher) fulgt av en løsning av 60 mg (0,80 mmol) glycin (Fisher) i 1,6 ml H2O. Blandingen ble rørt 1 time ved romtemperatur og fordelt mellom 10 ml 5% vandig HCl-løsning og 10 ml EtzO. Et2O-sjiktet ble vasket med saltvann, tørket (MgS04), filtrert og konsentrert og ga 374 mg (100%) 4-(tri-n-butylstannyl ) hippursyre , en viskøs olje ren nok for videre reaksjon: lK N MR (CDC13)5 0,40-2,50 (m, 27H), 3,94-4,53 (m, 2H), 6,70-7,25 (m, 1H), 7,53 (d, J=8Hz, 2H), 7,80 (d, J=8Hz, 2H), 9,00-9,65 (bred s, 1H). IR (ren) 3600-2300 bred med flere sterke bånd ved 3330, 1720, 1635, 1535 cm"<1>.

Eksempel 6

Syntese av N- succinimidyl 4-( tri- n- butylstannyl) hippurat.

Til en løsning av 378 mg (0,80 mmol) 4-(tri-n-butylstannyl)-hippursyre i 8 ml THF satte man 182 mg dicykloheksylkarbodiimid (Sigma) etterfulgt av 92 mg N-hydroksysuccinimid (Sigma). Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 6 timer og 3 dråper eddiksyre ble deretter tilsatt. Blandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert til et oljeaktig faststoff. Rensing ved kromatografi på kieselgel (50% EtOAc/heksan) ga rent N-succinimidyl 4-{tri-n-butylstannyl)hippurat 158 mg (35%) som et hvitt fast stoff, smp. 109-111°C (EtOAc/heksan); 'H N MR(CDC13)5 0,33-2,27 (m, 27H), 2,85 (s, 4H), 4,66 (d, J=6Hz, 2H), 7,02 (t, J=6Hz, 1H), 7,63 (d, J=8Hz,2H), 7,89 (d, J=8Hz, 2H).

Eksempel 7

S yntese av tri- n- butylstannyl 3-(4'-t ri- n- butylstannyl-f enyl) propionat.

En løsning av 2,29 g (10 mmol) 3-(4'-bromfenyl)propionsyre i 125 ml THF og 25 ml heksan (i en kolbe utstyrt med N2-innløp, dråpetrakt og termometer under N2atmosfære) ble avkjølt til -100°C (dietyleter/flytende nitrogen). Løsningen ble dråpevis tilsatt 13,5 ml (21 mmol) av en 1,55 M løsning butyllitium i heksan (Aldrich) ved slik hastighet at løsningens temperatur ikke overskred -90°C. Den resulterende viskøse masse fikk oppvarmes til -75°C over en halv time, og 5,70 ml n-tributyltinklorid (Aldrich) ble tilsatt dråpevis over et minutt. Blandingen ble så igjen flytende og ble rørt ved -75°C i 30 minutter. Kjølebadet ble så fjernet, og blandingen ble rørt inntil den nådde romtemperatur. Til blandingen satte man 100 ml mettet (NH4)2SO<i-løsning. Etter risting i en skilletrakt, ble øvre sjikt i rekkefølge vasket med 100 ml 10% KF-løsning og 50 ml saltvann, tørket med MgS04 , filtrert og konsentrert og ga 7,5 g voksaktig faststoff. To omkrystalliseringer av 1,00 g av dette materialet fra H2O/aceton ga 405 mg (42%) tri-n-butylstannyl 3-(4'-tri-n-butylstannylfenyl)propionat som et hvitt pulver: smp. 59-60°C;<1>H N MR (CDC13)5 0,50-2,34 (m, 54H), 2,75 (m, 4H), 7,23 (d, J=8Hz, 2H), 7,45 (d, J=8Hz, 2H); IR (smelt) 1695, 1530 cm"<1>.

Eksempel 8

Syntese av N-succinimidyl 3-( 4'- tri- n- butylstannylfenyl)-propionat.

Til en løsning av 460 mg (0,63 mmol) tri-n-butylstannyl 3-(4<1->tri-n-butylstannylfenyl)propionat i 6,5ml vannfritt THF satte man 143 mg (0,69 mmol) dicykloheksylkarbodiimid (Sigma) etterfulgt av 73 mg (0,63 mmol) N-hydroksysuccinimid (Sigma). Blandingen ble rørt i 24 timer og 37ul (38 mg, 0,63 mmol) eddiksyre ble tilsatt. Blandingen ble filtrert og konsentrert. Rensing ved kieselgel kromatografi (30% EtOAc/heksan) ga en

195 mg (58%) N-succinimidyl 3-(4'-tri-n-butylstannylfenyl)-propionat som en viskøs olje:<*>H N MR (CDC13)5 0,38-2,15 (m,

27H), 2,53-3,32 (m, 8H), 7,20 (d, J=8Hz, 2H), 7,38 (d, J=8Hz,2H); IR (ren) 1820, 1790, 1740,1185, 1045 cm"<1>.-

Eksempel 9

Synte se av mety l 4- brombenzimidat.

HC1 gass ble boblet gjennom en suspensjon av 7,2 g (40 mmol) 4-brombenzonitril (Pfaltz and Bauer) i 20 ml metanol inntil alt det faste gikk i løsning. Blandingen ble så plassert i et kjøleskap ved 4°C i 90 timer, ved hvilket tidspunkt lange nåler av hydrokloridsaltet av metyl 4-brombenzimidat var dannet. Saltet ble isolert ved vakuumfiltrering og ga 8,17 g (81%) lange hvite nåler og overført til base ved fordeling av 1,33 g av HC1 saltet mellom 50 ml iskald 10% Na2CO3-løsning og 50 ml dietyleter. Dietyletersjiktet ble vasket med 50 ml saltvann, tørket over MgS04 , filtrert, konsentrert og omkrystallisert fra heksan og ga 0,83 g (60% totalutbytte) av rent metyl 4-brombenzimidat som nåler: smp. 64-65°; *H N MR (CDC13)5 3,91 (s, 3H), 7,60 (s, 4H), 7,53-7,90 (bred,1H).

Eksempel 10

S yntese av metyl 4-( tri- n- butylstannyl) benzimidat.

Til en løsning av 214 mg (1,0 mmol) metyl 4-brombenzimidat i 2 ml ttoluen under N2atmosfære satte man 1,52 ml (1,74 g,

3.0 mmol) heksabutylditin (Alfa) etterfulgt av 11 mg (0,01 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)palladium (0) (Aldrich). Blandingen ble oppvarmet ved 75-80°C i et oljebad i 18 timer. Etter avkjøling ble blandingen fordelt mellom 10 ml 10% vandig KF-løsning og 10 ml dietyleter. Dietyletersjiktet ble tørket med MgS04 , filtrert og konsentrert. Rensing av det oljeaktige konsentrat ved kieselgel kromatografi (25% EtOAc/heksan) ga 226 mg (53%) rent metyl-4-(tri-n-butylstannyl)benzimidat som en viskøs olje: •H N MR (CCl4)6 0,54-2,18 (m, 27H), 3,87 (s,3H), 7,45 (d, J=8Hz, 2H), 7,67 (d, J=8Hz, 2H); IR(ren)3340, 1635 cm"<1>.

Eksempel 11

Syntese av 4-( 3'- propionsyre) fenyl kvikksølvbromid.

Til en løsning av 96 g (0,30 mmol) kvikksølvacetat (Aldrich) i 15 ml vannfritt THF ved 20°C (vannbad) satte man l,72ml eddiksyre etterfulgt av en løsning av 218 mg tri-n-butylstannyl 3-(4'-tri-n-butylstannylfenyl)propionat i 1 ml THF. Den resulterende løsning ble rørt ved 20°C i 1 time og 15 ml vandig 3% KBr-løsning ble tilsatt. Etter en ytterligere time ble meste-parten av THF'et fjernet på rotasjonsfordamperen inntil man fikk hvit utfelling, og blandingen ble fortynnet med 15 ml H20. Fellingen ble samlet ved vakuumfiltrering og vasket med en liten mengde EtOH som ga 93 mg (72%) 4-(3'-propionsyre)fenylkvikksølv-bromid som et hvitt fast stoff: 1 ti N MR (DMSO-d6)5 2,23-3,09 (m, 4H), 7,15 (d, J=8Hz, 2M), 7,39 (d, J=8Hz, 2H); massespektrum (CI) m/z 431,433 (M + 18,7, 6,0), 351 (27), 133 (100).

Transmetalleringer med organoborgrupper utføres på lignende måte.

E ksempel 12

Radioaktiv jodering av N- succinimidyl 4-( tributylstannyl)-benzoat.

Til et glass inneholdende 10-50 pg N-succinimid 4-(tri-n-butylstannyl ) benzoat (0,02-0,10Mmol) i 50 pl 5% HOAc/metanol satte man 10-20 pg (0.08-0,15 pmol) N-klorsuccinimid i 10-20 pl metanol. Til denne løsningen satte man 10 pl Na<125>I-løsning

(fortynnet i Delbecco's fosfatbuffrede saltvann, Gibco Labs)

(100 pCi-2 mCi). Etter 3-5 minutter ble 20 pl av en 0,25 pg/ml løsning av Na2S2Os tilsatt. Reaksjonsblandingen ble videre fortynnet med 50 pl PBS-løsning og en strøm av N2ble blåst over toppen av løsningen inntil volumet var redusert til bare vandig (ca. 80 pl). Radioaktivt merkede utbytter på 75-95% ble oppnådd. Dette materialet kan brukes direkte for proteinmerkingseksperi-menter som beskrevet nedenunder.

Radioaktiv jodering med jod-131 ble utført på lignende måte med sammenlignbare utbytter.

Eksem pel 13

Proteinmerking med radioaktivt halogenerte små molekyler.

Den ovennevnte rå vandige radioaktivt joderte esterblanding ble overført til et glass som inneholdt buffret proteinløsning (pH 8,5-9) eller omvendt. Konjugeringsreaksjonen var ferdig i løpet av 5 minutter ved romtemperatur. Konjugeringsutbyttet varierte fra ca. 35-60%. Det merkede protein ble renset fra ikke-konjugert radioaktivitet ved bruk av enten en gelgjennom-trengningskromatografikolonne eller et filtreringssystem med små porer (f.eks. Centricon ultra centrifugation).

De radioaktivt halogenerte proteinprodukter i eksempel 13 kan brukes for radiaktiv diagnose og terapi. F.eks. kan monoklonale antistoffer eller antigenbindende fragmenter som er spesifikt reaktive med tumorcellen i forbindelse med antigener halogeneres radioaktivt ved denne fremgangsmåten og så brukes for billeddannelse av tumorcelleplassering i et pattedyrs legeme: en passende mengde av det radioaktivt halogenerte antistoff kan innføres, f.eks. ved intravenøs injeksjon, i pasientens legeme, og deretter kan legemet undersøkes med en scintillasjonsdetektor såsom et gammakamera. Slike radioaktivt halogenerte antistoffer kan også innføres i legemet til et pattedyr for tumor radio-terapi.

Andre proteiner og peptider som har tendens til å kon-sentrere seg i et organ eller sykt vev kan likeledes halogeneres radioaktivt ved denne fremgangsmåten og brukes til å styre avganger fra homeostase og sykdomstilstander. F.eks. kan radioaktivt halogenert fibrinogen brukes til å lokalisere trombose i dype vener ved in vivo billeddannelse. Sykdomsendrede opptak av hypofyse- og andre peptidhormoner kan kontrolleres på lignende måte.

Som et videre eksempel kan radioaktivt halogenerte antistoffer i forbindelse med denne beskrivelse anvendes i in vitro radioaktive immunologiske målinger.

Alle de forannevnte radioaktivt halogenerte proteiner er stabilt radioaktivt merket fordi det radioaktive halogen sitter på en ikke-aktivert aromatisk eller heteroaromatisk ring av konjugatet. Videre gjør man ved å sette inn det radioaktive halogen i para- eller meta-stilling uten nærvær av en hydroksyl-gruppe det radioaktive halogen mindre utsatt for katabolisme av legemets dejodase enzymer.

Eksempel 14

Biofordelingsstudier.

Den fordelaktige in vivo stabilitet av de foreliggende proteiner radioktivt jodert med små molekyler sammenlignet med vanlig radioaktivt joderte proteiner gjennom en fenolholdig aromatisk ring ble påvist ved de følgende dyreeksperimenter. I eksperimentene ble tyroidopptaket av radioaktivt jod (målt ved halsradioaktivitet) brukt som et mål på in vivo metabolisme.

Tolv mus ble injisert med et antistoff som var merket med et radioaktivt jodert produkt fra eksempel 12. Grupper på tre ble avlivet 2, 24, 48 og 72 timer etter injeksjonen, og biofordelingene av den radioaktive markør ble bestemt umiddelbart ved vanlige teknikker. Resultatene er vist som stolpediagrammer i fig. 1 og 2, hvori de følgende symboler brukes: BL, blod; TA, hale; TU, melanoma tumor; SK, hud; MU, skjelettmuskel; BO, ben; LU, lunge; LI, lever; SP, milt; ST, mage; NE, hals (innbefattet skjoldbruskkjertelen); Kl, nyre; og IN, tarm. Resultatene er alternativt presentert som prosent dose pr. gram vev eller prosent totaldose. (Kurvene som viser prosent totaldose viser bare en liten del av den totale legemsaktivitet for blod, hud, muskel og ben.) Bemerk at aktivitetsmengden i skjoldbruskkjertelen ikke øket med tiden fra den opprinnelige 2-timers grunnlinje akkumulering.

Som en sammenligning av stabiliteten ved 24 timer, ble tre ytterligere mus injisert med samme mengder av det samme antistoff, men direkte merket med radioaktivt jod gjennom en kjent kloramin-T oksydasjon. Biofordeling av radioaktiv markør ble bestemt som ovenfor, og resultatene er vist i fig. 3 og 4.

På figurene var ved 24 timer biofordelingene av de foreliggende og tidligere kjente reagenser meget like i huden, bensubstansen, lever, nyre og tarm, hvilket viste at de radioaktivt merkede antistoffer forholdt seg lignende. Derimot hadde magen og halsen i dyr injisert med det kloramin-T merkede protein betydelig større fraksjoner av injeksjonsradioaktivt jod, som viser at det fri radioaktive jod mest sannsynlig dannes ved metabolisme av det kloramin-T merkede protein. Disse sammenlignende forsøksresultater viser at det foreliggende parajod-fenylmerkede antistoff er meget mer stabilt in vivo, hvilket for første gang viser at en ikke-aktivert aromatisk ring som inneholder meget spesifikke aktivt radioaktivt jod ikke metabolisk eller på annen måte mister jod in vivo. Kontrolldata (fig. 3 og 4) anses å være sammenlignbare med radioaktivt merkede fenol-holdige aromatiske ringer generelt, enten de er direkte merket som gjennom kloramin-T oksydasjon eller indirekte, som med Bolton-Hunter eller Woods reagenser.

Ytterligere biofordelingsstudier med F(ab')2viste at antistoff-fragmenter radioaktivt jodert ved denne metoden var stabile mot in vivo metabolisme. Videre ble denne type radioaktiv reagens raskere utskilt enn det merkede hele antistoff-preparat som omtalt ovenfor og levnet minimal rest etter 72 timer i kroppsorganene.

Skjønt foreliggende oppfinnelse er beskrevet i forbindelse med den foretrukkede utførelsesform, vil en fagmann etter å ha lest foregående beskrivelse være i stand til å utføre forskjellige forandringer, substitusjoner av ekvivalenter og andre forandringer og blandingene og fremgangsmåtene som her er beskrevet. Beskyttelsesomfanget skal derfor anses definert av kravene og ekvivalenter til disse.

Claims (17)

1. Fremgangsmåte ved syntese av et radioaktivt halogenert lite molekyl for proteinmerking med formelen

hvor <*> X er en radioaktiv isotop av jod, brom, fluor eller astatin, Ar er en aromatisk eller heteroaromatisk ring, og R er en kortkjedet substituent som ikke aktiverer ringen sterkt hvorpå den radioaktive isotop sitter, og som inneholder en funksjonell gruppe egnet for konjugasjon til protein under betingelser som preserverer proteinets biologiske aktivitet, karakterisert ved at man (a) erstatter et halogen på en halogenaromatisk forbindelse med den funksjonelle gruppe eller et forstadium for den funksjonelle gruppe med en organometallisk gruppe som er valgt fra Sn(n-Bu>3 og SnMe3; (b) overfører enhver forstadiumgruppe på produktet fra trinn (a) i den funksjonelle gruppe; og (c) halogendemetalliserer produktet fra trinn (a) eller (b) som inneholder den funksjonelle gruppe for å fjerne den organometalliske gruppe og erstatte denne med en radioaktiv isotop av jod, brom, fluor eller astatin.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at forstadiet i trinn (a) er en karboksylsyre og den funksjonelle gruppe i trinn (b) er en imidester.

3. Fremgangsmåte ved syntese av et radioaktivt halogenert lite molekyl for proteinmerking med den generelle formel

hvor <*> X er en radioaktiv isotop av jod, brom, fluor eller astatin, A er en fenyl eller en heterocyklisk aromatisk ring, og R er en kortkjedet substituent som ikke sterkt aktiverer den ring hvorpå den radioaktive isotop sitter, og som inneholder en funksjonell gruppe egnet for konjugasjon til protein under betingelser som tar vare på proteinets biologiske aktivitet, karakterisert ved at man (a) erstatter et halogen på en halogenaromatisk forbindelse som inneholder et forstadium for den funksjonelle gruppe med en organometallisk gruppe som er valgt fra Sn(n-Bu>3 og SnMe3 ; (b) halogendemetalliserer produktet fra trinn (a) for å fjerne den organometalliske gruppe og erstatte den med en radioaktiv isotop av jod, brom, fluor eller astatin; og (c) overfører forstadiegruppen på produktet fra trinn (b) i den funksjonelle gruppe.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at man som forstadiumgruppe anvender nitril og overfører dette i en imidatester.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 3, karakterisert ved at trinn (a) omfatter følgende: --trinnene (i) å omsette den halogenaromatiske forbindelse med enten n-butyllitium ved -100° C eller med magnesium ved romtemperatur, og (ii) omsette reaksjonsprodukter fra (i) med den organometalliske gruppe; --trinnet å omsette den halogenaromatiske forbindelse med heksaalkyltin og tetrakis(trifenylfosfin)palladium; eller, --trinnene å omsette den halogenaromatiske forbindelse med et trialkylstannyl alkali i tetraglym ved 0°C.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 3, karakterisert ved at trinn (a) videre omfatter transmetallering av den aryltinsubstituerte forbindelse med en organometallisk gruppe valgt fra HgX2 , Hg(OAc)2 , BX3 og BZ3 , hvori X er Cl, Br eller J, og Z er alkyl eller alkoksy.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 3, karakterisert ved at det som halogenaromatisk forbindelse i trinn (a) anvendes en forbindelse med halogenet i para- eller meta-stilling.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 3, karakterisert ved at den funksjonelle gruppe er valgt fra fenolestere, imidestere, imidatestere, anhydrider, acylsuccinimider, aldehyder, isotiocyanater, tioler, diazoforbindelser, aminer, hydraziner, alkylhalogenider og maleimider.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 3, karakterisert ved at forstadiet for den funksjonelle gruppe velges fra karboksylsyrer, nitriler, alkoholer og aminer.

10. Fremgangsmåte ved syntese av et radioaktivt halogenert lite molekyl for proteinmerking med formelen

hvor <*> X er en radioaktiv isotop av jod, brom, fluor eller astatin, Ar er fenyl eller heterocyklisk aromatisk ring, og R er en kortkjedet substituent som ikke sterkt aktiverer den ring hvorpå den radioaktive isotop sitter, og som inneholder en egnet funksjonell gruppe for konjugasjon til protein under betingelser som tar vare på proteinets biologiske aktivitet, karakterisert ved at man (a) danner imidatesteren av et tilsvarende halogenbenzonitril eller halogenarylalkylnitril; (b) erstatter halogenet på produktet fra trinn (a) med en organometallisk forbindelse valgt fra Sn(n-Bu)3 og SnMe3 , og substitusjonen omfatter omsetning av det imidatholdige trinn (a) produkt med heksaalkyltin og tetrakis(trifenylfosfin)palladium; (c) halogendemetalliserer produktet fra trinn (b) for å fjerne den organometalliske gruppe og erstatte denne med en radioaktiv isotop av jod, brom, fluor eller astatin.

11. Forbindelse, karakterisert ved formelen

hvor <*> X er en radioaktiv isotop av jod, brom, fluor eller astatin, spesielt J-123, J-125, J-131, Br-75, B-76, Br-77, F-18 eller At-211; Ar er aromatiske eller heteroaromatiske ringer; og R er en kortkjedet substituent som ikke aktiverer den ring sterkt hvorpå den radioaktive isotop sitter og som inneholder en egnet funksjonell gruppe for konjugasjon til protein under betingelser som tar vare på proteinets biologiske aktivitet.

12. Forbindelse, karakterisert ved formelen

hvori M er Sn(n-Bu)3 , SnMe3 , HgX2 , (X er Cl, Br eller J), HgOAc, B(OH)2 eller BZ3 , (Z er alkyl eller alkoksy); Ar er en aromatisk eller heteroaromatisk ring; og R er en kortkjedet substituent som ikke aktiverer den ring sterkt hvorpå M sitter og som inneholder en funksjonell gruppe egnet for konjugasjon til protein under betingelser som tar vare på proteinets biologiske aktivitet.

13. Forbindelse ifølge krav 11 eller 12, karakterisert ved at den funksjonelle gruppe på substituenten R er valgt fra fenolestere, imidestere, imidatestere, anhydrider, acylsuccinimider, aldehyder, isotiocyanater, tioler, diazoforbindelser, aminer, hydraziner, alkylhalogenider og maleimider.

14. Forbindelse ifølge krav 11 eller 12, karakterisert ved at R er en imidester, alkyl-imidester, amidoalkylimidester, imidatester, alkylimidatester eller amidoalkylimidatester.

15. Forbindelse ifølge krav 11 eller 12, karakterisert ved at M sitter i para- eller meta-stilling i forhold til substituenten R.

16. Fremgangsmåte ved radioaktiv halogenering av et protein, karakterisert ved at man i et vandig medium omsetter amino-, tiol- eller hydroksygrupper på proteinet med en forbindelse ifølge krav 12.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at proteinet velges fra gruppen antistoffer, antigenbindende fragmenter, aminosyrepolymerer, plasmaproteiner og peptidhormoner, spesielt monoklonale antistoffer som er spesifikt reaktive med antigener i forbindelse med tumorceller.