NO892192L - Akridiniumester-merking og rensing av nukleotidprober. - Google Patents

Description

"Akridiniumester-merking og rensing av nukleotidprober."

Dette er en "continuation-in-part" av patentansøkning med serienummer 105.080, innsendt 5. oktober 1987.

Oppfinnelsesområde

Oppfinnelsen vedrører fremgangsmåte og sammensetninger for binding av påvisbare markører til diagnostiske reagenser. Mer spesielt vedrører oppfinnelsen merking og rensing av nukleotidprober med kjemiluminescerende akridniumester for anvendelse i diagnostiske hybridiseringsbestemmelser.

Oppfinnelsesbakgrunn

Tidligere kjent teknikk

I de siste 20 år er en rekke midler anvendt som markører i klinisk diagnostikk og forskningsforsøk. I den senere tid er hybridiseringsbestemmelser utviklet for sensitiv påvisning av tilstedeværelsen av spesielle polynukleotidsekvenser. I slike bestemmelser merkes typisk en nukleotid-multimer (probe) med et atom eller en gruppe som lett kan påvises.

Når den merkede probe utsettes for en testprøve som antas inneholde en target-nukleotidsekvens, under hybridiseringsbe-tingelser, vil targeten hybridisere med hvilken som helst av en slik merket probe. Tilstedeværelsen av targetsekvensen i prøven kan bestemmes kvalitativt eller kvantitativt, vanligvis ved separering av hybridisert og ikke-hybridisert probe, hvorpå mengden merket probe som hybridiserte bestemmes, enten ved å bestemme tilstedeværelsen av markør i probe-hybridene eller ved å bestemme mengden markør i ikke-hybridiserte prober.

Tidligere ble radioaktive markører anvendt. Pga helserisiko og vanskeligheter med behandling av radioaktive markører ble imidlertid ikke-isotop-markører senere utviklet. Slike markører omfatter dem hvis tilstedeværelse bestemmes enten direkte eller indirekte. Eksempler på direkte markører omfatter kjemiluminescerende, fluorescerende eller spektro- skopisk påvisbare markører. Eksempler på indirekte markører omfatter forbindelser slik som biotin og forskjellige antigener som kan påvises ved hjelp av proteiner konjugert til en passende påvisbar markør.

En foretrukket metode for å innføre markører i nukleotid-multimerprober har vært å innføre linker-armer i enzymatisk eller kjemisk syntetiserte prober. 4-tio-UTP (H. Eshaghpour et al., Nucl. Acids Res., Vol. 7, side 1485, 1979) er f. eks bundet til 3'-enden av DNA-fragmenter og deretter merket i sin nukleofile sulfhydrylrest. En annen metode gitt i en PCT-ansøkning etter Tchen (Internasjonal publikasjonsnummer WO 86/00074; publisert 3. januar 1986) omhandler en teknikk hvori pyrimidin-basenukleotider depyrimidiseres, og de oppnådde sukkerringene åpnes slik at den aminbærende rest kan bindes dertil.

I tillegg, kan 5-allylamin-uridin-trifosfat-forløper analogene som er angitt hos P.R. Langer et al. (Proe. of Nat. Acad. Sei. USA, Vol. 78, side 6633, 1981) anvendes for å innlemme nukleofile aminrester i nukleotid-multimerprober som tilveiebringer seter for merking.

Kjemiske metoder for merking er også foreslått som tillater at markører bindes til nukleotider i en nukleotid-multimer. En slik metode omfatter bisulfitt-katalysert transaminering med etyldiamin i C-4 esterstillingen i cytosinrestene i nukleinsyre-prober (R.P. Viscidi et al, J. Clin. Biol. Vol. 23, side 311, 1986). Andre teknikker er angitt som tillater binding av kun en enkel markør i 5'- eller 3<1->enden av en nukleotid-multimer, typisk et oligonukleotid.

Fremgangsmåter for terminal merking er f. eks angitt som tillater linker-arm-binding som et endelig trinn i en fast-fase oligonukleotidsyntese. Slike linker-armer anvendes således for markør-binding. Se f. eks B.A. Connolly, Nucl. Acids Res., Vol. 13, side 4485, 1985; S. Agrawal et al., Nucl. Acids Res., Vol. 15, side 3131, 1987.

Det er også omtalt forbindelser som kan anvendes for å innføre en primær amin-modifisert nukleotidrest på utvalgte steder i et syntetisk oligonukleotid under standard automati-serte synteseprosedyrer. Slike forbindelser omfatter analoger av deoksytymidin og deoksyadenin, deoksyguanin osv (G.B. Dreyer et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol 82, side 968, 1985; J.L. Ruth, PCT-ansøkning nr US84/00279, publikasjonsnummer WO 84/03285, publisert 30. august, 1984). I tillegg er alkylaminderivater av nukleotid-bindingsfosfatgrupper omtalt, hvis aminofunksjonelle gruppe deretter kan merkes (R.L. Letsinger og M.E. Schott, Jour. Amer. Chem. Soc., Vol. 103, side 7394, 1981; Japanske patenter etter N. Sugimoto nr 61 44.353, utgitt 4. mars 1986; 61 57.595, utgitt 24. mars 1986; 61 44.352 utgitt 4. mars 1986). Teoretisk tillater slike forbindelser at merkede nukleotider kan plasseres på en rekke seter langs en sekvens, og tillater således anvendelse av multiple markører for å øke sensitiviteten av påvisningen. Man må imidlertid være forsiktig ved utvelgelse av linker-arm-plasseringer da enkelte linker-arm-seter kan redusere stabiliteten av et hybrid dannet med en targetsekvens, særlig når multiple markører er tilstede.

I tillegg til linker-armene som beskrevet over, har man konstruert ikke-nukleotid-baserte linker-arm-reagenser som er angitt i to ikke avgjorte patentansøkninger etter Arnold et al, med titler "Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotid Probes" US patentansøkning, serienummer 099,050 innsendt 21. september 1987 og "Non-Nucleotide Reagents for substituting the Termini of Oligonucleotides" US patentansøkning, serienummer 104.330, innsendt 2. oktober 1987. Disse linker-arm-reagenser overvinner begrensninger av andre reagenser i den tidligere kjente teknikk og tillater binding av linker-armer på en rekke seter såvel som oppbygning av nukleotid/- ikke-nukleotid-polymerer.

En av de mest sensitive grupper av ikke-isotop-markører som er kjent er de kjemiluminescerende akridiniumesterne som er beskrevet av Campbell et al, i GB patentnr 2.112.779B, ut- stedt 15. oktober 1986 og i Richardson et al., "Chemilumine-scence Immunoassay of Plasma Progesterone with Progesterone-Acridinium Ester Used As the Labeled Antigen", Clin. Chem., Vol. 31, side 1664-1668 (1985), for binding av akridiniumestere til proteiner og hormoner for anvendelse i immuno-diagnostiske bestemmelser. Bindingen av akridiniumestere til nukleotid-probe-multimerer oppnås ikke lett ved anvendelse av merking og renseprosedyre som er beskrevet for proteiner. Merking av nukleotid-multimer-prober med akridiniumestere er foreslått tidligere. Disse forslag tilveiebringer imidlertid ikke noen metode for merking og rensing (Yabusaki et al., US patent nr 4.599.303) eller de beskrevne prosedyrer gir dårlig merking og utilstrekkelig rensing av de merkede prober for anvendelse i hybridiseringsbestemmelser (Mock et al, EPA patentansøkning nr 86.306.305.3, innsendt 15. august 1986, publikasjonsnummer 0212951). Metoden beskrevet av Mock og Septek, beskriver f. eks en prosedyre som er analog med den for merking og rensing av proteiner (Weeks et al). Man har funnet at slike metoder er utilstrekkelige for merking av oligonukletidprober som inneholder amin-terminerte linker-armer i en betydelig utstrekning (<10%). Dessuten vil gelfiltreringsmetodene som anvendes for rensing av akridiniumester-merkede proteiner ikke separere merket og umerket probe, og de fjerner heller ikke ukonjugert markør tilstrek-kelige. For anvendelse i hybridiseringsdiagnostiske bestemmelser, er det nødvendig at hverken betydelige mengder umerket probe er tilstede, da slike umerkede prober vil konkurrere med merkede prober i hybridiseringsreaksjoner, eller at den rensede prøve består av mer enn 1 % ukonjugert markør da ukonjugert markør binder seg til separasjonsbærere og danner høy kjemiluminescerende bakgrunn som i betydelige grad reduserer sensitiviteten av de diagnostiske bestemmelser. Det man behøver er metoder for å merke nukleotid-multimerer og rense merkede multimerer i ialt vesentlig ren form. Den foreliggende oppfinnelse beskriver slike metoder.

Formål med oppfinnelsen

Et formål for den foreliggende oppfinnelse er å merke prober med akridiniumester og å rense de således merkede prober til en høy renhetsgrad. Tidligere kjente systemer for (1) merking av nukleotidprober med akridiniumester og rensing av nevnte merkede prober; og (2) merking av proteiner med akridiniumestere og rensing av nevnte merkede proteiner viste seg utilfredsstillende for dette formål. Tidligere kjente teknikker lærer spesielt merking av nukleotidprober ved anvendelse av konsentrasjoner av akridiniumester-reagenser i det lave mikromolare området og rensing ved anvendelse av normale gelfil-treringsteknikker. Slike mikromolare konsentrasjonsområder er bare anvendbare for å merke nukleotidprober i liten utstrekning (mindre enn eller lik 10 %). Likeledes er tidligere kjente separasjonsteknikker, omfattende gelfiltrering, ikke gjennomførbare når de anvendes på akridiniumester-merkede prober. Man har funnet at aggregert fri akridiniumester-markør ko-eluerte i voidvolumet med akridniumester-merket probe. I tillegg, assosierte fri akridiniumester-markør ikke-kovalent med proben og ko-migrerte med den akridiniumester-merkede probe i kolonnen. Til slutt var prosedyrer som er kjent innen teknikkens stand utilfredsstillende for å separere akridiniumester-merket probe fra umerket probe.

Følgelig omfatter formålene for den foreliggende oppfinnelse metoder for merking av nukleinsyre-prober med akridiniumester med høy virkningsgrad. Et annet formål for den foreliggende oppfinnelse er metoder for separering, til en høy renhetsgrad, av nevnte merkede probe fra ureagert såvel som aggregert og ikke-kovalent assosiert akridiniumester. Et ytterligere formål for den foreliggende oppfinnelse er metoder for separering av nevnte merkede probe fra umerket probe og nedbrytningsprodukter av merket probe. Et annet formål for den foreliggende oppfinnelse er metoder som er effektive, raske, reproduserbare og i stand til å gi store mengder akridiniumester-merket oligomer med høy renhet, slik at den merkede probe dermed kan anvendes for diagnostiske bestemmelser.

Oppsummering av oppfinnelsen

Akridiniumesteren 4-(2-succinimidyloksykarbonyletyl)-fenyl-10-metylakridinium-9-karoboksylatfluorsulfonat er en sterk kjemiluminescerende forbindelse som inneholder en aminreaktiv succinimidylgruppe. Reaksjon av denne forbindelse og lignende forbindelser med nukleinsyre-prober inneholdende primære aminer gir en kjemiluminescerende merket probe. I et nærliggende reaksjonssystem, kan også nukleinsyre-prober inneholdende tioler og andre amin- og tiol-konjugeringspartnere også omsettes med akridiniumestere til å gi en kjemiluminescerende merket probe. Den foreliggende oppfinnelse beskriver metode for oppbygning, merking og påfølgende rensing av probe inneholdende primære aminer med akridiniumester, noe som gir en probe med en enkel akridiniumester pr primært amin. Oppfinnelsen beskriver også nærliggende systemer for oppbygning, merking og påfølgende rensing av probe inneholdende tiol-grupper, med akridiniumester.

Det er vanskelig å merke prober ved anvendelse av N-hydroksysuccinimidylaktiv ester merkingsreagens i det lave mikromolekylære konsentrasjonsområdet. Akridiniumester-merking av nukleotidprober kompliseres ytterligere ved det faktum at akridiniumestere er spesielt ustabile når de er bundet til probene. Den foreliggende oppfinnelse vedrører en ny metode for binding av akridiniumestere til amin- eller sulfhydrylgrupper som utgjør prober. Disse rester, særlig aminer, er vanskelige å merke med akridiniumester fordi de virker sammen med de negativt ladede fosfater i proben. Metoden i henhold til den foreliggende oppfinnelse for binding av akridiniumester til prober omfatter anvendelse av høye (0,1 - 50 mM) akridiniumester-konsentrasjoner. Disse høye konsentrasjoner kan oppnås ved anvendelse av organisk løsningsmiddel i en konsentrasjon fra 20 - 80 % av totalt reaksjonsvolum. Forhøyet pH kan også anvendes for å øke den effektive konsentrasjon av enten de nukleofile amino- eller tiol-konjugeringspartnere. Den foretrukne metode for å merke proben er å anvende 1 - 10 mM konsentrasjoner av akridiniumester med organisk løsningsmiddel. Slike merkingsmetoder kan gjennomføres enten i løsning, eller med enten akridiniumesteren eller proben suspendert i løsningen.

De således dannede merkede prober kan renses ved anvendelse av metodene i henhold til oppfinnelsen som er anvendt heri. Rensing eller separasjon av akridiniumester-merket probe fra umerket probe såvel som fra fri akridiniumester, omfatter først fjerning av det meste av den frie akridiniumester-markør fra proben hvorpå ialt vesentlig all gjenblivende fri markør fjernes fra proben og tilslutt separeres den merkede probe, den umerkede probe og merkede probe-nedbrytningsprodukter. Disse trinnene kan utføres i rekkefølge eller samtidig.

Foretrukne metoder for å fjerne størstedelen av fri markør fra proben er raske separasjonsteknikker, omfattende, uten begrensning, nukleinsyre-persipitering, ionebytter-HPLC og revers fase HPLC. Foretrukne metoder for å fjerne gjenblivende spor av fri akridiniumester fra proben og for samtidig å separere merket probe fra umerket probe omfatter spesifikke anvendelser av ionebytter, revers fase eller hydroksyapatitt HPLC.

På denne måte kan nukleinsyre-prober merkes med akridiniumester og renses til en høy grad av renhet. Slike merkede og rensede prober kan deretter anvendes innen området for diagnostiske bestemmelser for å påvise svært små mengder spesifikke targetsubstanser. I den foreliggende oppfinnelse er det også inkludert en beskrivelse av reagens- og bestem-melsessystemer og kit som anvendes for påvisning av akridiniumester-merkede prober.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er en grafisk fremstilling av akridiniumester- reaksjonsskj emaet. Fig. 2 er en grafisk fremstilling av en probe som er

internt merket med akridiniumester.

Fig. 3 er en tabell som oppsummerer konjugeringspartnere og reaksjonsprodukter og betingelser for merking av prober med akridniumester. Fig. 4 er en grafisk fremstilling av en ionebytter (4A) og en revers fase (4B) HPLC-kurve for en akridiniumester-merket probe. Fig. 5 er en grafisk fremstilling av påvisning av

akridiniumester-merkede prober.

Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer Definisi oner

Som anvendt i den foreliggende beskrivelse og patentkrav, er følgende betegnelser definert: N- Hvdroksvsuccinimidvlester av akridiniumester: Akridiniumderivat med et kvaternært nitrogensenter og derivatisert i 9-stillingen til å gi en fenylesterrest, særlig 4-(2-succinimdidyloksykarbonyletyl)-fenyl-10-metyl-akridinium-9-karboksylatfluorsulfonat:

AKRIDINIUMESTERMETOKSYIMIDAT

Akridiniumestere: Derivater av følgende generelle type

R]_ = ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUERT ALKYL, SUBSTITUERT ALKENYL, SUBSTITUERT ARYL, ALKOKSY, ARYLOKSY

ELLER ER FRAVÆRENDE NÅR X = HALOGEN.

R2= H, ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUERT ALKYL,

SUBSTITUERT ALKENYL, SUBSTITUERT ARYL, ALKOKSY,

ARYLOKSY, BARE, OG KUN BARE DERSOM X = N.

R3= H, AMINO, HYDROKSY, TIOL, HALOGEN, NITRO, AMINO,

AMIDO, ACETYL, ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUERT ACETYL, SUBSTITUERT ALKYL, SUBSTITUERT ALKENYL, SUBSTITUERT ARYL, ALKOKSY, ARYLOKSY.

R4= ALKYL, ALKENYL, ARYL, SUBSTITUERT ALKYL, SUBSTITUERT ALKENYL, SUBSTITUERT ARYL.

X = 0, N, S, HALOGEN, SUBSTITUERT FOSFOR, SUBSTITUERT

SVOVEL, SUBSTITUERT BOR ELLER SUBSTITUERT ARSEN.

Y = 0, S ELLER NH.

Ri OG/ELLER R2OG/ELLER R3OG/ELLER R4HAR ET REAKTIVT SETE SOM TILLATER KJEMISK KONJUGERING.

Nukleotid: En subenhet av en nukleinsyre bestående av en fosfatgruppe, et sukker med fem karbonatomer og en nitrogen-inneholdende base. I RNA, er sukkeret med fem karbonatomer ribose. I DNA er det 2-deoksyribose. Betegnelsen inkluderer også analoger av slike subenheter.

Nukleotidmultimer: En kjede av nukleotider bundet sammen med fosfordiesterbindinger, eller analoger derav. Oli<g>onukleotid: En nukleotid-multimer med en lengde på generelt fra omtrent 10 til omtrent 100 nukleotider, men som kan ha en lengde på mer enn 100 nukleotider. De anses vanligvis for å være syntetisert fra nukleotid-monomerer, men kan også oppnås ved enzymatiske metoder. Deoksvribonukleotid: Et oligonukleotid bestående av deoksyribonukleotid-monomerer.

Polynukleotid: En nukleotid-multimer med en lengde på generelt omtrent 100 nukleotider. Disse er vanligvis av biologisk opprinnelse eller de er oppnådd ved enzymatiske metoder.

Nukleotid- multimerprobe: En nukleotid-multimer med en nukleotidsekvens komplementær med en target-nukleotidsekvens inneholdt i en annen nukleotid-multimer, vanligvis et polynukleotid. Proben er vanligvis valgt til å være perfekt komplementær med den tilsvarende base i targetsekvensen. I enkelte tilfeller er det imidlertid passende eller til og med ønskelig at en eller flere nukleotider i proben ikke er komplementære til den tilsvarende base i targetsekvensen. Proben er da typisk merket. Forkortelsen "probe" anvendes i det følgende som betegnelse for en nukleotid-multimer-probe som definert heri.

Nukleotid/ ikke- nukleotid polymer: En polymer omfattende nukleotid og ikke-nukleotid monomerenheter. Når den anvendes som en probe, vil den typisk være merket.

Hybrid: Komplekset dannet mellom to nukleotid-multimerer ved hjelp av Watson-Crick baseparing mellom de komplementære baser.

Sus<p>ension: En blanding av væsker eller av ikke-utfelte partikler av et faststoff i en væske, idet partiklene er den dispergerte fase og suspensjonsmediumet er den kontinuerlige fase.

Akridiniumesterkjemi generelt er beskrevet i Weeks et al. Akridinium Esteres as Hiqh- Specific Activitv Labels in Immunoassav, Clin. Chem. 2918, 1474 - 1479 (1983). Kort oppsummert, eksisterer akridiniumesterne i likevekt med deres tilsvarende base. Basedannelse favoriseres ved høy pH. Dannelsen av kvaternære nitrogenforbindelser favoriseres ved lav pH. Kjemiluminescens-reaksjonen omfatter angrep av hydroksyperoksydioner på akridinium-forbindelsene, som resulterer i dannelsen av N-metylakridon med eksisterte elektroner. Reaksjonen er vist i fig. 1 på tegningene. 1. Merking med N-hydroksysuccinimidylester av akridiniumester .

a. Utvelgelse av probe

I den foretrukne utførelsesform, inneholder proben som skal merkes et primært amin. Man har vellykket praktisert denne metode med amin linker-arm prober modifisert på den 5'-terminale ende (5'-aminoetylfosfat; "terminal amin linker-arm"), modifisert internt (ikke-nukleotidbasert "intern amin linker-arm", type 1 (se LI i patentansøkning med serienummer 099.050), 2 (se L3 i patentansøkning med serienummer 099.050, L2, L4, L5, L6, L7 eller L8 anvendt enten som en baseerstat-ning eller en innskyting mellom baser) eller ved tilsetning av amin-modifiserte baser internt (amino (12)d UTP, Calbio-chem, San Diego, CA), eller på 3'-enden av proben (5'-allyl-amin UTP). I tillegg kan den foreliggende oppfinnelse anvendes for å merke f. eks fosfat-hovedkjeden og sukker- restene. Den foreliggende oppfinnelse ser på anvendelsen av andre modifiserte nukleotidprober kjent innen teknikkens stand og nevnt i det forutgående avsnitt som omhandler kjent teknikk, omfattende, uten begrensning, amin linker-arm probe, tiolfosfat-inneholdende prober og tioluridin inneholdende prober.

Fig. 2 i tegningene viser en probe som er internt merket med akridiniumester.

b. Merking av proben

1. Utvel<g>else av pH: Denne avhenger i noen grad av amin linker-armen, men den optimale pH er omtrent 8. 2. Utvelgelse av buffer: Den må være en god buffer ved optimal pH. Mulige valg omfatter, men er ikke begrenset til HEPES, fosfat, bikarbonat. 3. Utvelgelse av organisk løsningmiddel: Skal anvendes i området fra 20 - 80 % i den endelige reaksjons-væskeløsningen. Valg omfatter, men er ikke begrenset til DMSO, CH2CN, dimetylformamid, dioksan, aceton, metanol. Kravet for utvelgelsen er at proben og akridiniumesteren må være svært oppløselige i det utvalgte løsningsmiddel, og at akridiniumesteren og proben ikke i urimelig grad nedbrytes av løsningsmidlet. 4. Akridiniumester- konsentrasion: Områder mellom 0,1 mM og 5 0 mM er aksepterbare avhengig av de valgte kjemiske forhold. Det optimale området for N-hydroksysucci-nylimidylester-konjugeringspartneren er omtrent 1 - 10 mM akridiniumester, avhengig av det anvendte amin linker-arm kjemiske forhold. Multiple addisjoner under reaksjonen øker den endelige grad av merking, men gjør rensing vanskeligere. 5. Temperatur: Optimal temperatur mellom 15 - 40°C. 6. Vari<g>het av reaksjonen: Dette er avhengig av linker-arm kjemiske forhold og andre reaksjonsparametrer og bør bestemmes ved hjelp av analyser av tidspunkts-prøver. I analysen overveies graden av merking sammenlignet med tilstedeværelsen av akridiniumester-probe nedbrytningsprodukter. 7. Ødeleggelse av ureagerte elektrofile koniugerings-partnere av N- hvdroksvsuccinimidvl- akridinlumester: Enkle analoger av konjugeringspartner-nukleofilen bør tilsettes under samme reaksjonsbetingelser.

Fig. 3 oppsummerer reaksjonsprodukter og betingelser i henhold til oppfinnelsen for nukleinsyre-prober inneholdende aminer, tioler og deres respektive konjugeringspartnere.

C. Rensing av merket probe.

En to-trinns prosedyre er typisk mer effektiv. Først bør det meste av den frie markør fjernes ved anvendelse av en rask og enkel prosedyre. Eksempler på denne omfatter, men er ikke begrenset til, presipitering; binding av fri markør til hydroksyapatitt, Bio-Beads SM-2, Sep-pak eller andre faste bærere

hvortil fri markør bindes og merket probe ikke-bindes eller

omvendt; rask gelfiltrering; ekstraksjon av fri markør inn i en organisk fase; filtrering (slik som Centricon); rask ione-bytterkromatografering (omfattende HPLC), eller rask revers-fasekromatografering (omfattende HPLC). Deretter må den merkede probe separeres fra gjenværende fri markør, omfattende akridiniumester som er ikke-kovalent assosiert med proben, til en svært høy renhetsgrad, og fra umerket probe. Valgene her er mindre begrenset. Den raskeste og mest effektive prosedyre er HPLC, omfattende, men ikke begrenset til, ionebytter, revers-fase og hydroksyapatitt. En annen prosedyre som man har funnet å være tilstrekkelig god nok, skjønt ikke så god som HPLC og som er langsommere og følgelig tidskre-vende, er gel-filtrering i nærvær av organisk løsningsmiddel, typisk ved anvendelse av Biogel P-100 eller P-200 i formamid.

Rensing kan også oppnås i et trinn ved anvendelse av HPLC, og ved anvendelse og ved anvendelse av gelfiltrering i organisk løsingsmiddel dersom mengdene som skal renses er små nok. Denne en-trinns prosedyren er typisk ikke så effektiv som to-trinns prosedyren beskrevet over.

Arbeidseksempler

Eksempel 1

Merking og rensing via etanolpresipitering etterfulgt av ionebytter HPLC av en rekke amin linker-arm prober.

A. Syntese og rensing av amin linker- arm prober.

For å vise den vellykkede anvendelse av metoden og prose-dyrene som er beskrevet heri på en rekke deoksynukleotid-prober med en rekke amin linker-arm kjemiske forhold, ble følgende amin linker-arm prober fremstilt.

1.5'-amin linker-arm prober

For å binde en 5'-amin linker-arm til proben, ble to fremgangsmåter anvendt. Den ene var å anvende det kommersielt tilgjengelige reagens "Aminolink" fra Applied Biosystems, Inc. Den andre var å anvende følgende forbindelse:

Denne forbindelse vil heretter omtales som terminalt linker-arm-reagens. Reagenset ble syntetisert som følger: 6-aminoheksanol ble omsatt med S-etyltrifluortioacetat i vannfri etylacetat. Reaksjonsproduktet ble presipitert i petroleumeter, behandlet med en 10 % blanding av pyridin i vann i 10 minutter for å hydrolysere det O-trifluoracetyl som er dannet og avdampet til tørrhet i form av en gummi. Forbindelsen ble deretter fosfittylert i overensstemmelse med standard prosedyrer innen litteraturen (se Nucleic Acids Research, 12 (11), 4539 (1984)) til å gi den ønskede forbindelse, nemlig terminal amin linker-arm-reagens (1).

Prober inneholdende en 5<1->amin linker-arm (enten Aminolink eller terminal amin linker-arm) ble syntetisert som følger. Ved anvendelse av et Applied Biosystems, Inc. Model 380A DNA-syntetisator, ble prober med ønsket nukleotidsekvens frem stilt ved anvendelse av standard fosforamidittkjemi, idet probene ble oppbygget fra 3'-enden til 5'-enden. Etterat den ønskede sekvens var fullstendig, ble amin linker-armen auto-matisk koblet til 5'-hydroksylgruppen i proben ved anvendelse av enten det terminale amin linker-arm-reagens, på samme måte som et annet fosforamidittnukleosid ville blitt koblet, eller Aminolink ved anvendelse av prosedyren som er beskrevet av fabrikanten. Ved anvendelse av standard prosedyre, ble proben deretter spaltet fra den faste bærer og avbeskyttet ved anvendelse av NH4OH og renset ved hjelp av polyakrylamingel-elektroforese etterfulgt av Sephadex G-25 kromatografi.

Følgende prober ble syntetisert og renset ved anvendelse av denne prosedyre:

hvori armen, og representerer amin linker-

hvori

Aminolink.

representerer

2. Intern amin linker-arm probe.

For å innlemme en amin linker-arm i den indre del av en probe, ble internt amin linker-arm reagens, type 1 eller type 2, anvendt som beskrevet i US patentansøkning med serienummer 099.050 med tittel "Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes", innsendt 21. september 1987, etter Arnold et al. Igjen ble prober syntetisert ved anvendelse av standard fosforamidittkjemi og renset ved anvendelse av polyakrylamidgel-elektroforese og Sephadex G25 kromatografi.

Følgende prober ble syntetisert ved anvendelse av denne prosedyre: 1.) En 30mer komplementær til 16S subenheten i rRNA fra E. coli, med en indre amin linker-arm, type 1, som erstatter en adeninrest i 18-stillingen i sekvensen: Erstattet med en intern amin linker- arm, type 1

Prober ble også syntetisert på denne måte hvor intern linker-arm, type 1, erstattet tymidin, cytidin eller guanosinrester.

2.) En 33mer komplementær til 16S subenheten i rRNA fra Chlamydia trachomatis, med en intern amin linker-arm, type

1, som erstatter en adeninrest i 21-stillingen i sekvensen.

Erstattet med en intern amin linker- arm, type 1

eller innskutt mellom restene 21 og 22,

En intern amin linker- arm, type 1 eller type 2, innskutt her

3.) En 24mer komplementær til 23S subenheten i rRNA fra Chlamydia trachomatis, med en intern linker-arm, type L7, innskutt mellom restene 15 og 16, En intern linker-arm, tvoe L7, innskutt her

B. Merking av amin linker-arm prober med NHS-ester av akridiniumester og påfølgnede rensing.

En 25 mM stamløsning av NHS-esteren eller akridniumester ble fremstilt i destillert DMSO. Den ønskede probemengde (se en oppsummering av de forskjellige prober merket i del A over) ble avdampet til tørrhet i et konisk polypropylenrør på 1,5 ml. Følgende væskeblanding ble dannet ved tilsetning av følgende bestanddeler i følgende rekkefølge:

3 mikroliter H2O

1 mikroliter 1 M HEPES (pH 8,0)

4 mikroliter DMSO (destillert)

2 mikroliter 25 mM NHS-ester av akridiniumester i DMSO

(destillert)

Blandingen ble vortex-blandet, sentrifugert i en mikrosentrifuge i 2 sekunder (for å bringe innholdene til bunnen av røret) og inkubert ved 37°C i 20 minutter. Følgende kompo-nenter ble deretter tilsatt til reaksjonsvæskeblandingen i den gitte rekkefølge: 3,0 mikroliter 25 mM NHS-ester av akridiniumester i DMSO

(destillert)

1,5 mikroliter H2O

0,5 mikroliter 1 M HEPES (pH 8,0)

Væskeblandingen ble igjen vortex-blandet, sentrifugert og inkubert i ytterligere 20 minutter ved 37°C. Ureagert markør ble stanset ved anvendelse av et 5-ganger overskudd av lysin ved tilsetning av 5 mikroliter 0,125 M lysin i 0,1 M HEPES (pH 8,0), 50 % DMSO, og inkubering i 5 minutter ved romtemperatur .

Den akridiniumester-merkede probe ble deretter renset ved anvendelse av følgende metoder. For å fjerne mesteparten av den ureagerte markør, ble proben etanol-presipitert som følger: til 20 mikroliter av den stansede reaksjonsblanding ble 30 mikroliter 3 M NaOAc (pH 5,0), 245 mikroliter H20 og 5 mikroliter glykogen tilsatt som en bærer (glukogenet var forbe-handlet for å fjerne enhver nukleaseaktivitet). Prøven ble forsiktig vortex-blandet og 640 mikroliter absolutt EtOH ble tilsatt. Prøven ble forsiktig vortex-blandet og inkubert på is i 5 - 10 minutter, og deretter sentrifugert i 5 minutter ved 15.000 rpm i en mikrosentrifuge. Supernatanten ble forsiktig fjernet og pelleten ble oppløst pånytt i 20 mikroliter 0,1 M NaOAc (pH 5,0), 0,1 % SDS. Den AE-merkede probe ble deretter separert fra enhver gjenblivende fri markør, fra umerket probe og fra nedbrytningsprodukter av AE-merket probe ved hjelp av et av de to HPLC-systemer som er beskrevet under:

IONEBYTTER HPLC

De 20 mikroliterne gjenoppløst pellet ble injisert på en nukleogen-DEAE 60-7 ionebytter HPLC-kolonne montert i et IBM 9533 HPLC-system. Alle bufferene var fremstilt med HPLC kva- litetsbestemt vann, acetonitril (CH3CN) og natriumacetat (NaOAc) fra Fisher Scientific, og iseddik (HOAc) og LiCl med reagensrenhet. Alle bufferne ble filtrert gjennom Nylon-66-filtre med porestørrelse 0,45 mikromol før anvendelse. Eluering ble oppnådd med en lineær gradient fra 55 % buffer A, 45 % buffer B til 30 % buffer A, 70 % buffer B i 25 minutter ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min. Absorbans ved 260 nm ble målt under kjøringen; feltområde lik 1 O.D. enhet; papirhastigheten var 20 cm/time. Fraksjoner på 0,5 ml ble samlet i 1,5 ml Eppendorf-rør med skrukork. Resultatene er vist i fig. 4A (i dette tilfellet var proben den terminale, amin linker-arm inneholdende 2 6mer beskrevet i del A over; alle andre prober ga svært lignende profiler). Umiddelbart etter kjøringen, ble 5 mikroliter 10 % SDS tilsatt til hvert rør etterfulgt av vortex-blanding av hvert rør (dette ble utført for å sikre at den akridiniumester-merkede probe ikke klebet til rørveggene). En 0,5 mikroliter prøve ble fjernet fra fraksjonene 21 - 42 og tilsatt til 200 mikroliter vann i et 12 x 75 mm rør (en egen pipettespiss ble anvendt for hver prøve for å unngå overføringsproblemer). Kjemiluminescensen for hver prø-ve ble deretter bestemt i en Berthold Clinilumat ved anvendelse av følgende automatiske injeksjon og avles-ningssekvens: injeksjon av 200 mikroliter 0,25 N HNO3, 0,1 % H2O2; et sekunds opphold; en 200 mikroliter injeksjon av 1 N NaOH; og den kjemiluminescerende mengde ble avlest i 10 sekunder.

Fraksjonene 64 - 68 ble deretter EtOH-presipitert som følger: Tilsett til hver 5 mikroliter glykogen, vortex-bland, tilsett 1 ml EtOH, vortex-bland, inkuber 5-10 minutter på is og sentrifuger i 5 minutter ved 15.000 rpm i en mikrosentrifuge. Hver supernatant ble forsiktig fjernet, pelleten oppløst på nytt i 20 mikroliter 0,1 M NaOAc, pH 5, 0,1 % SDS, og fraksjonene ble samlet.

REVERS FASE HPLC

Akridiniumester-merket probe ble også renset som generelt beskrevet over, med følgende unntak: En Vydac C4 revers fase kolonne ble anvendt; buffer A var 0,1 M trietylammoniumacetat (Applied Biosystems, Inc, Foster City, CA) og buffer B var CH3CN; den merkede probe ble eluert ved anvendelse av en lineær gradient på fra 10 - 15 % løsningsmiddel B i 25 minutter med en strømningshastighet på 1 ml/min; absorbansen ble målt ved 260 nm; 0,5 ml fraksjoner ble samlet. Den største kjemiluminescerende topp ble deretter identifisert og bearbeidet som beskrevet over (med unntak av at 4 5 mikroliter 3 M NaOAc også ble tilsatt til hver fraksjon før EtOH-presipitering). Fig. 4B i tegningene viser elueringsprofilen av 24mer proben (intern linker-arm, type L7) beskrevet i del A over; alle andre prober ga svært like profiler.

Ved anvendelse av begge disse prosedyrer, ble svært rene akridiniumester-merkede prober oppnådd med ialt vesentlige ekvivalente resultater med alle linker-arm kjemiske forhold omtalt heri. Den spesifikke aktivitet av slike prober var typisk 5 - 10 x 10' kjemiluminescerende lysimpulstall (Berthold Clinilumat) pr picomol probe. Fig. 5 i tegningene viser sensitiviteten hvormed slike prober kan påvises når de er renset.

C. Merking av amin linker-arm probe med metoksyimidat-derivatet av akridiniumester og påfølgende rensing. Prosedyren var generelt den samme som den som er beskrevet i del B, med følgende forskjeller: Den tørkede probe ble

■gjenoppløst i 50 mikroliter 0,5 M NaC03, pH 9, pluss 25 mikroliter dimetylformamid. Deretter ble 0,2 mg metoksyimin akridiniumester (MI-AE) tilsatt, blandingen ble vortex-blandet og fikk stå for å reagere i 30 minutter ved romtemperatur. Ytterligere 0,2 mg MI-AE ble tilsatt, og reaksjonen ble fortsatt i ytterligere 30 minutter ved romtemperatur. Den ureagerte markør ble deretter inhibert med 100 mikroliter 50 mM lysin i 0,5 M NaHC03, pH 9 (10 minutters inkubasjon ved romtemperatur).

Den akridiniumester-merkede probe ble deretter etanol-presipitert som beskrevet i del A, med unntak av at 40 mikroliter 3 m NaOAc (pH 5,0), 105 mikroliter H20 og 750 mikroliter absolutt EtOH ble anvendt. Proben ble deretter ytterligere renset ved anvendelse av ionebytte HPLC som beskrevet i del B.

Eksempel 2

Påvisning av en fortynningsserie av target-polynukleotid-sekvens i klinisk medium ved anvendelse av akridiniumester-merket probe.

Probe merket internt med akridiniumester (33mer, intern linker-arm, type 1, adenosinerstatning; se eksempel 1) ble hybridisert til sin target rRNA (i dette tilfellet Chlamydia trachomatis) i overensstemmelse med følgende prosedyre:

Hvbridiseringsblandinq

16 mikroliter halssekret i 3 % litiumlaurylsulfat, 30 mM

fosfatbuffer (PB) pH 6,8, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA.

2 mikroliter 4,8 M PB, pH 4,7.

1 mikroliter rRNA (IO-<3>, IO<-2>, 10_<1>, eller 0,33

mikrogram)

1 mikroliter probe (0,33 pmol)

Kontrollblandingen var den samme som hybridiseringsblandingen med unntak av at den inneholdt vann istedet for rRNA. Blan-dingene ble deretter inkubert i 60 minutter ved 60°C. Hybrid ble deretter separarert fra ikke-hybridiserte prober ved anvendelse av hydroksyapatitt (HAP) som følger: Til hver hybrid- og kontrollblanding ble det tilsatt 150 mikroliter 0,14 M PB, pH 6,8, inneholdende 2 % HAP. Hver oppnådde blanding ble vortex-blandet i 5 sekunder, inkubert i 5 minutter ved 60°C, vortex-blandet i 20 sekunder og deretter sentrifugert i 30 sekunder i en mikrosentrifuge ved 15.000 rpm. Supernatanten ble fjernet, 150 mikroliter 0,14 M PB, pH 6,8, ble tilsatt til HAP-pelleten, blandingen ble vortex-blandet i 10 sekunder og deretter sentrifugert i 30 sekunder i en mikrosentrifuge ved 15.000 rpm. Supernatanten ble fjernet, og denne vaskeprosedyre ble gjentatt ytterligere to ganger på nøyaktig samme måte. Den oppnådde HAP-pellet ble resuspen- dert i 150 mikroliter 0,14 M PB, pH 6,8, og kjemiluminescensen ble avlestdirekte nøyaktig som beskrevet i eksempel 1.

RESULTATER:

Resultatene representerer gjennomsnittet av to verdier. Signalene er gitt som antall tusen av relative lysenheter (rlu's). Kontrollsignalet representerer omtrent 0,1 % av input rlu. S:B er forholdet mellom signal og bakgrunn, dvs kjemiluminescens ved en spesiell rRNA-konsentrasjon dividert med kjemiluminescens for kontroll.

Disse data viser at probene merket med akridiniumester og renset som beskrevet heri deretter kan anvendes for sensitiv og spesifikk påvisning av target-polynukleotidsekvenser.

Claims (26)

1. Fremgangsmåte for merking av en nukleinsyreprobe som har en første konjugeringsrest, med, et akridiniumester-merkingsreagens som har en annen konjugeringsrest, karakterisert ved trinnet: kombinering av nevnte merkingsreagens og nevnte nukleinsyreprobe for å tilveiebringe en merkingsreagens-konsentrasjon på omtrent 0,1 - 50 mM for å oppnå akridiniumester-merkede nukleinsyreprober i høyt utbytte.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at trinnet gjennomføres i pH-området fra 7 - 9.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at trinnet gjennomføres i temperaturområdet fra 15 - 40°C.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at trinnet gjennomføres i løsning.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at trinnet gjennomføres med nevnte nukleinsyre-probe i løsning og hvori nevnte merkingsreagens er suspendert i løsning.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at trinnet gjennomføres med nevnte merkingsreagens i løsning og nevnte nukleinsyre-probe suspendert i løsning.

7. Fremgangsmåte for å merke en nukleinsyre-probe som har en første konjugeringsrest, med en akridiniumester-merkingsreagens som har en annen konjugeringsrest, karakterisert ved trinnet: Kompinenng av nevnte merkingsreagens og nevnte nukleinsyre-probe på en måte slik at man tilveiebringer en merkingsreagens-konsentrasjon på omtrent 0,1 - 50 mM og en konsentrasjon. av organisk løsningsmiddel på omtrent 20 - 80 volum% for å oppnå akridiniumester-merkede nukleinsyreprober i høyt utbytte.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at trinnet gjennomføres i et pH-område fra 7 - 9.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at trinnet gjennomføres i temperaturområdet fra 15 - 40°C.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, 8 eller 9, karakterisert ved at trinnet gjennomføres i løsning.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, 8 eller 9, karakterisert ved at trinnet gjennomføres med nevnte nukleinsyre-probe i løsning og hvori nevnte merkingsreagens er suspendert i løsning.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, 8 eller 9, karakterisert ved at trinnet gjennomføres med nevnte merkingsreagens i løsning og nevnte nukleinsyre-probe suspendert i løsning.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at nevnte organiske løsningsmiddel er valgt fra gruppen bestående av DMSO, CH3 CN, dimetylformamid, dioksan, aceton og metanol.

14. Fremgangsmåte for merking av nukleinsyre-prober som har en første konjugeringsrest, med et akridiniumester-bindings-reagens som har en annen konjugeringsrest, karakterisert ved trinnene: kombinering av nevnte merkingsreagens i en omtrentlig 0,1 - 50 mM konsentrasjon med et organisk løsningsmiddel s i en konsentrasjon på omtrent 20 - 80 volum% for å oppnå akridiniumester-merkede nukleinsyrer-prober i høyt utbytte, hvorpå det ureagerte merkingsreagens inhiberes.

15. Fremgangsmåte for merking av nukleinsyre-prober som har en første konjugeringsrest, med et akridiniumester-merkingsreagens som har en annen konjugeringsrest, karakterisert ved trinnene:kombinering av nevnte merkingsreagens i en konsentrasjon på omtrent 0,1 - 50 mM med et organisk løsningsmiddel i en konsentrasjon fra 20 - 80 volum% for å oppnå akridiniumester-merkede nukleinsyre-prober i høyt utbytte, hvori nevnte første og annen konjugeringsrester er valgt, henholdsvis fra gruppen av par bestående av:

med et organisk løsningsmiddel i en konsentrasjon på omtrent 20 - 80 volum% for å oppnå akridiniumester-merkede nukleinsyre-prober i høyt utbytte.

16. Fremgangsmåte for merking av nukleinsyre-prober som har en første konjugeringsrest, med et N-hydroksysuccinimid-akridiniumester-merkingsreagens, karakterisert ved trinnet: kombinering av nevnte merkingsreagens i en konsentrasjon på omtrent 1 - 10 mM med et organisk løsningmiddel i en konsentrasjon på omtrent 20 - 80 volum% for å oppnå akridiniumester-merkede nukleinsyreprober i høyt utbytte.

17. Fremgangsmåte for merking av nukleinsyre-prober som har en første konjugeringsrest, med et akridiniumester-metoksy-imidat-merkingsreagens, karakterisert ved trinnet: kombinering av nevnte merkingsreagens i en konsentrasjon på omtrent 1 - 10 mM med et organisk løsningsmiddel i en konsentrasjon på omtrent 20 - 80 volum% for å oppnå akridiniumester-merkede nukleinsyre-prober i høyt utbytte.

18. Fremgangsmåte for å separere akridiniumester-merket probe fra umerket probe og fra fri akridiniumester-markør til en høy renhetsgrad, karakterisert ved følgende trinn: binding av nevnte merkede probe til en HPLC-kolonne valgt fra gruppen bestående av ionebytter, revers-fase og hydroksyapatitt, i en første buffer; nevnte HPLC-kolonne bringes i kontakt med en annen buffer eller en gradient av nevnte første buffer og nevnte annen buffer, for å gjennomføre forskjellig eluering av merket probe, umerket probe og fri akridiniumester-markør .

19. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert ved . at nevnte kolonne er en ionebytterkolonne og nevnte første buffer er 20 mM NaOAc, pH 5,5, 20 % CH3 CN, og hvori nevnte annen buffer er 20 mM NaOAc, pH 5,5, 20 % CH3 CN, 1 M LiCl.

20. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert ved at nevnte kolonne er en ionebytterkolonne og nevnte gradient er fra en første buffer bestående av 20 mM NaOAc, pH 5,5, 20 % CH3 CN, 0,45 M LiCl til en annen buffer bestående av 20 mM NaOAc, pH 5,5, 20 % CH3 CN, 0,7 M LiCl.

21. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert ved at nevnte kolonne er en revers fasekolonne og nevnte buffer er 0,1 M trietylammoniumacetat, pH 7,0 og nevnte annen buffer er CH3 CN.

22. Fremgangsmåte som angitt i krav 18, karakterisert ved at nevnte kolonne er en revers fasekolonne og nevnte gradient er fra en første buffer bestående av 0,1 M trietylammoniumacetat, pH 7,0, 10 % CH3 CN til en annen buffer bestående av 0,1 M trietylammoniumacetat, pH 7,0, 50 % CH3 CN.

23. Fremgangsmåte for å separere akridiniumester-merket probe fra umerket probe og fra fri akridiniumester-markør til en høy renhetsgrad, karakterisert ved trinnene: fjerning av det meste av nevnte frie akridiniumester-markør fra nevnte merkede probe ved anvendelse av raske separasj onsmetoder; fjerning av ialt vesentlig all gjenblivende fri akridiniumester-markør fra proben og separering av den merkede probe fra den umerkede probe ved anvendelse av HPLC valgt fra gruppen bestående av ionebytter, revers-fase eller hydroksyapatitt.

24. Fremgangsmåte som angitt i krav 23, karakterisert ved at nevnte raske ut-velgelsesmetode er valgt fra gruppen bestående av:

(1) nukleinsyre-presipitering;

(2) binding av fri markør til hydroksyapatitt, Bio-Beads SM2, Sep-pak eller fast bærer hvortil markøren binder eller fri merket probe ikke binder, eller hvortil merket probe binder og fri markør ikke binder;

(3) hurtig gelfiltrering;

(4) ekstraksjon av fri akridiniumester-markør over i en organisk fase;

(5) filtrering;

(6) hurtig ionebytterkromatografi;

(7) ionebytter-HPLC; og

(8) revers-fase HPLC.

25. Fremgangsmåte som angitt i krav 23, karakterisert ved at nevnte raske separa-sjonsmetoder er etanolpresipitering og hvor nevnte HPLC er ionebytting og hvori nevnte fjerning og separasjon oppnås ved anvendelse av en gradient fra en første buffer bestående av 20 mM NaOAc, pH 5,5, 20 % CH3 CN, 0,45 M LiCl til en annen buffer bestående av 20 mM NaOAc, pH 5,5, 20 % CH3 CN, 0,7 M LiCl.

26. Fremgangsmåte som angitt i krav 23, karakterisert ved at nevnte raske separa-sjonsmetode er etanolpresipitering og hvori nevnte HPLC er revers-fase og hvori nevnte fjerning og separasjon oppnås ved anvendelse av en gradient fra en første buffer bestående av 0,1 M trietylammoniumacetat, pH 7,0, 10 % CH3 CN til en annen buffer bestående av 0,1 M trietylammoniumacetat, pH 7,0, 50 % CH3 CN.