NO892191L - Ikke-nukleotide reagenser for substituering av terminale ender hos oligonukleotider. - Google Patents

Abstract

Reagens som kan koble med 5'-hydroksystillingen av et nukleotid, typisk det terminale nukleotid 1 en nukleotid-multimer, under de samme betingelser som anvendes 1 kjent standard fiast-fasenukleotid-multimersyntese. Når reagensen således er koblet, gir reagensen en substituert nukleotid-multimer med en beskyttet bindingsrest som avbeskyttes under de samme alkaliske betingelser som typisk anvendes for å avbeskytte nukleotideksocykliske aminer av en fullstendig syntetisk nukleotid-multimer. En enkelt av gruppene av reagenser kan så kobles til ethvert nukleotid, og da reagensene har en ikke-nukleotid hovedkjede, har den oppnådde substituerte nukleotid-multimer ikke et ytterligere nukleotid som eventuelt vil kunne interferere med hybridisering med en targetnukleotidsekvens.

Description

Qppfinnelsesområde.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører reagenser av en type som er passende for fremstilling av et 5' hydroksysubstituert nukleotid, hvis substituent deretter passende kan avbeskyttes under de samme alkaliske betingelser som anvendes for å avbeskytte nukleotideksocykliske aminer under standard fast fase nukleotid-multimersyntese, til å gi en bindingsgruppe hvortil det deretter kan bindes passende rester, f.eks. en markør eller en interkalator.

Teknologisk tilbakeblikk.

I klinisk forskning og diagnose er en kjent teknikk for å bestemme tilstedeværelsen av en spesiell nukleotidsekvens ("targetnukleotidsekvensen" eller simpelthen "targetsekvensen") i enten RNA eller DNA polynukleotider, å gjennomføre en nukleinsyre-hybridiseringsbestemmelse. I en slik bestemmelse velges en nukleotid-multimerprobe (typisk en oligonukleotid-probe) som har en nukleotidsekvens som er komplementær til minst en del av targetsekvensen. Proben er typisk merket, d.v.s. at den har et atom eller en gruppe bundet dertil, hvis tilstedeværelse lett kan påvises. Når den merkede probe utsettes for en testprøve som antas å inneholde targetnukleotidsekvensen, under hybridiseringsbetingelser, vil de to hybridisere. Tilstedeværelsen av targetsekvensen i prøven kan bestemmes kvalitativt eller kvantitativt, vanligvis ved separering av hybridisert og ikke-hybridisert probe, hvoretter mengden merket probe som hybridiserte bestemmes, enten ved å bestemme tilstedeværelsen av markør i probehybrider eller bestemme mengden markør i ikke-hybridiserte prober.

En kjent markeringsteknikk omfatter innlemmelse av en radioak-125 32

tiv markør, slik som I eller P i proben. Anvendelse av radioaktivt merkede prober er imidlertid forbundet med visse ulemper, omfattende probeustabilitet og de vanlige farer forbundet med håndtering av radioaktive isotoper. I et forsøk på å overvinne disse ulemper er prober i den senere tid blitt

merket med ikke-radioaktive ender, slik som biotin, haptener eller fluoroforer. Anvendeligheten av slike ikke-radioaktive ender har allerede en utbredt anvendelse innen området som vedrører immunodiagnostika. Anvendelse av ikke-radioaktive ender i påvisning av DNA-prober er også allerede omtalt i litteraturen. Eksempler på dokumenter vedrørende påvisning omfatter anvendelse av enzymantistoffkonjugater, som gjenkjenner en haptenende, eller enzymavidinkonjugater, som gjenkjenner biotinender.

Tidligere metoder utviklet for binding av ikke-radioaktive markører til syntetiske nukleotid-multimerprober omfatter kjemiske modifikasjoner av proben etter at den er syntetisert eller/og renset ("post-modifikasjon"). R.P. Viscidi et al. (J. Clin. Microbiol., 1986, 23, side 311-317) anvendte f.eks. en bisulfittkatalysert transamineringsreaksjon for å binde 1,2-diaminoetan i C-6-stillingen hos cytosinrester i lambda fag DNA. Reaksjon av den transaminerte DNA med biotinyl-e-aminokapronsyre N-hydroksysuksinimidester, ga biotinylert DNA som kunne hybridiseres til komplementær DNA på nitrocellulose og påvises ved anvendelse av et streptavidin-alkalisk fos-fatasekompleks. Man har forsøkt å merke et syntetisk DNA oligonukleotid ved hjelp av denne metode, og har observert en dramatisk nedsettelse av smeltetemperaturen assosiert med dens RNA- hybrid. Således synes binding av markører på cytosin å interferere med normal baseparing assosiert med hybridisering og synes ikke å være en passende metode i tilfellet med korte syntetiske oligonukleotider.

En annen post-modifikasjonsmetode involverer anvendelse av en fotoaktiverbar analog av biotin som merker DNA tilfeldig (A.C. Forster et al., Nucl.Acids Res., 1985, 13, side 745-761). Denne metode er igjen ikke særlig passende for å merke syntetiske oligonukleotider, noe som skyldes interferens med baseparing og resulterende destabilisering av hybridet dannet med targetoligonukleotidet.

I en ytterligere post-modifikasjonsmetode er en rekke nukleo tid- og deoksynukleotidtrifosfater fremstilt med aminter-minerte linkere som kan innlemmes i korte DNA-prober ved hjelp av enzymatiske teknikker. Aminlinkere er blitt substituert i N6-stillingen hos adenin (L. Klevon, PCT-ansøkning nr. WO 86/02929, publisert 22/5.1986, "The CS position of cytosine", D. Ward et al., EPO patent publikasjonsnr. 0063879, publisert 11/3.1982). I en metode er en biotinylert form av C5-modifisert dUTP festet til 3'-enden av en oligonukleotidprimer med et komplementært oligonukleotid som templat ved anvendelse av enzym DNA polymerase (A. Murasugi og R.B. Wallace, DNA, 1984, 3, side 269.277, P.R. Langer, A.A, Waldrop og D.C. Ward, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 1981, 78, side 6633-6637). En annen metode anvender den enzymterminale deoksynukleotidyltransferase for å addere disse linkermodifiserte trifosfater til 3'-enden av oligonukleotider (se f.eks. L. Riley et al. DNA, bind 5, side 333, 1986). Ulemper ved disse metoder omfatter det påkrevede antall rensetrinn, begrensninger med oppeskalering som er forbundet med arbeidet med prerensede oligonukleotider, og potensialet for mis- eller ikke-paringer assosiert med de ytterligere eller modifiserte nukleotidrester under hybridiseringsbetingelser.

I en annen post-modifikasjonsmetode er aminlinkere blitt bundet til 5'-enden av de 5<1->fosforylerte oligonukleotider ved anvendelse av karbonyldiimidazol (B. Chu., G. Wahl og L.E. Orgel, Nucl. Acids Res., 1983, 11, side 6513-6529). Denne metode er blitt anvendt for å binde biotin for anvendelse i ikke-radioaktive påvisningsformater (B. Chu og L.E. Orgel, DNA, 1985, 4, side 327-331, A. Chollet og E.H.Kawashima, Nucl. Acids Res., 1985, 13, side 1529-1541). Binding av en markør på 5'-enden har den fordel at den generelt reduserer interferens av proben i hybridiseringsreaksjoner. Metoden har imidlertid den ulempe at den krever en rekke trinn for å binde linkeren, nemlig enzymatisk fosforylering, reaksjon med imidazol, reaksjon med 1,2-diaminoetan eller 1,6-diaminoheksan, og kolonnerensning.

En mere direkte merkingsmetode er innlemmelse av festingen av en aminlinker, som et trinn i automatisert fast fase nukleotid-multimersyntese. Av de mange metoder som er beskrevet i litteraturen er ingen uten begrensninger. Wachter et al.

(Nucl. Acids Res., 1986, 14, side 7985-7995), anvendte karbonyldiimidazol for å oppnå aminoalkylering av 5'-hydroksyl i et syntetisk oligonukleotid på slutten av en trinnvis automatisert syntese, idet oligonukleotidet fremdeles var bundet til polymerbæreren. Skjønt denne metode har den fordel at den forenkler rensning, krever reaksjonsbetingelsene at de siste trinn utføres manuelt. Kempe et al. (Nucl. Acids Res., 1985, 13, side 45-57) bant 2-(biotinylamid)etanol til et 5'-fosforylert syntetisk oligonukleotid bundet til en fast bærer i nærvær av et kondensasjonsmiddel. I tillegg til å være noe omstendelig, krever denne metode at den bundne markør overlever forholdene vedrørende avbeskyttelse og fjerning av den faste bærer. Således er den ikke passende for binding av kjemisk sensitive markører.

Prosedyren etter Smith et al. (Nucl. Acids. Res., 1985, 13, side 2399-2412) er mere direkte anvendbar for automatisert oligonukleotidsyntese ved at et 5'-beskyttet-5'-amino-5'-deoksytymidin-3'-0-fosforamiditt er bundet i en endelig standard koblingsreaksjon. En fri aminogruppe dannes under avbeskyttelse og fjerning fra den faste bærer, som deretter er tilgjengelig for binding av en rekke markører. Da en nuk-leotidhovedkjede (d.v.s. tymidin) anvendes for å bevare et komplementært forhold mellom en probe og en targetsekvens, må så mange som åtte forskjellige linkere av typen som er beskrevet av Smith et al. fremstilles. Ellers kan en ytterligere tymidinrest i noen tilfeller gi et tap i spesifisitet for targetsekvensen som skyldes mishybridisering.

Det er blitt foreslått forbindelser som kan anvendes for å innføye et primært aminmodifisert dioligonukleotid under standard automatiserte synteseprosedyrer. Slike forbindelser omfatter analoger av deoksytymidin, deoksyadenin og de-oksyguanin (G.B. Dreyer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., bind 82, side 968, 1985, J.L. Ruth, PCT-ansøkning nr. WO84/03285, publisert 30. august 1985). Disse metoder lider imidlertid av de samme begrensninger som metoden etter Smith et al.

Agrawal et al. (Nucl. Acids Res., 1986, 14, side 6227-6245) har nylig rapportert to metoder vedrørende binding av markører, som kan anvendes i automatisert fast fase DNA-syntese. I den første metode tilføyes en uridin-2', 3<1->beskyttet-5<1->fosforamiditt eller 5'-fosfitt til 5'-enden av oligonukleotidet som et siste koblingstrinn. 2'- og 3'-hydroksyler avbeskyttes deretter og oksyderes til et dialdehyd ved anvendelse av periodat. Biotinhydrazid kondenseres deretter til å danne en cyklisk binding etter behandling med borhydrid. Denne metode

har de ufordelaktigheter at den krever en rekke post-modifika-sjonstrinn. I den andre metode tilsettes N-beskyttet-O-fosforamidittderivat av etanolamin i den siste koblingssyklusen under den automatiserte syntese. N-beskyttelse gjennomføres ved hjelp av 0-fluorenylmetoksykarbonylgrupper.

Definisjoner.

Som anvendt i den foreliggende beskrivelse og i kravene er følgende betegnelser definert som: - nukleotid: en subenhet av nukleinsyre bestående av en fosfatgruppe, et sukker med 5 karbonatomer og en nitrogen-inneholdende base. I RNA er sukkeret med 5 karbonatomer ribose. I DNA er det 2-deoksyribose. Betegnelsen omfatter også analoger av slike subenheter. - nukleotid- multimer: en kjede av nukleotider bundet ved hjelp av fosfordiesterbindinger eller analoger derav. - oli<g>onukleotid: en nukleotid-multimer med en lengde på generelt omtrent fra 10 til omtrent 100 nukleotider, men som kan ha en lengde som er større enn 100 nukleotider. De antas vanligvis å være syntetisert fra nukleotidmonomerer, men kan også oppnås ved hjelp av enzymatiske metoder. -<p>olvnukleotid: en nukleotid-multimer med en lengde på generelt omtrent 100 nukleotider. Disse er vanligvis av biologisk opprinnelse eller er oppnådd ved hjelp av enzymatiske metoder. - nukleotid- multimerprobe: en nukleotid-multimer med en nukleotidsekvens komplementær med en targetnukleotidsekvens inneholdt i en annen nukleotid-multimer, vanligvis et polynuk-leotid. Proben velges vanligvis å være perfekt komplementær til den tilsvarende base i targetsekvensen. I noen tilfeller kan det imidlertid være passende eller til og med ønskelig at en eller flere av nukleotidene i proben ikke er komplementær til den tilsvarende base i targetsekvensen, eller at forskjellige rester av syntetisk opprinnelse enten erstatter et nukleotid i proben eller innskytes mellom basene i proben. Proben er typisk merket. - oliaonukleotidprobe: en probe av syntetisk eller enzymatisk opprinnelse med mindre enn 100 nukleotider, men som kan inneholde over 200 nukleotider. - h<y>bridiserin<g>: dannelsen av et "hybrid", som er komplekset dannet mellom to nukleotid-multimerer ved Watson-Crick baseparing mellom de komplementære baser.

Oppsummering av oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således et reagens som er passende for fremstilling av et 5<1->hydroksysubstituert nukleotid. Nukleotidet er vanligvis det siste nukleotid i en biologisk eller syntetisk nukleotid-multimer, typisk den sistnevnte. Etter at den ønskede sekvens er syntetisert ved anvendelse av en standard nukleotid-multimer fast-fasesyntese avbeskyttes 5'-hydroksy i det siste nukleotid, og kan deretter omsettes med en passende koblingsgruppe på den foreliggende reagens for å tilveiebringe en substituert nukleotid-multimer. En bindingsrest på reagenset er beskyttet ved hjelp av en acylfunksjonell gruppe, som inhiberer reagenspolymerisering under det foregående koblingstrinn. Bindingsresten kan deretter avbeskyttes under de samme ikke-gunstige alkaliske betingelser som typisk anvendes for å avbeskytte eksocykliske aminer, etter fast-fasesyntese av en nukleotid-multimer. Således kan avbeskyttelse av den acylbeskyttede bindingsrest og eksocykliske aminer gjennomføres samtidig, uten at man trenger ytterligere trinn i tillegg til dem som anvendes i standard nukleotid fast-fasesyntese. Den oppnådde substituerte nukleotid-multimer har således en 5'-"bindingsarm" som kan bindes til anvendbare rester, slik som ikke-isotopmarkører.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således, i sitt brede omfang, et reagens som er passende for fremstilling av et 5'-hydroksysubstituert nukleotid (igjen, typisk et terminalt nukleotid på en nukleotid-multimer), idet reagenset har formelen:

dersom XI = svovel, n = 1,

dersom XI = aminogruppe, n = 1 eller 2,

m = enten 1, 2 og 3.

I den ovennevnte formel er Y en ikke-nukleotidbasert koblingsgruppe, RI er en ikke-nukleotid hovedkjede, XI er en beskyttet bindingsrest valgt fra svovel eller en aminogruppe (som

omfatter substituerte aminogrupper hvori amino N er bundet til RI og karbonylkarbonet i den beskyttende gruppe). Acylgruppen

er en beskyttelsesgruppe for XI, som kan kuttes (under betingelser beskrevet under), til å gi en bindingsgruppe H-X1-. Ved enhver bestanddel som er "ikke-nukleotid" menes at strukturen av denne bestanddel er slik at den "ikke i betydelig grad deltar i hybridisering", idet nevnte struktur f.eks. ikke må delta i noen betydelig hydrogenbinding med et nukleotid, og vil utelukke strukturer som har en av de fem nukleotidbasene eller analoger derav som en bestanddel. Y velges slik at den er i stand til å koble RI til 5'-hydroksy av et nukleotid, under koblingsbetingelser som er ikke-ugunstige. Ved "ikke-ugunstige" betingelser menes betingelser som er slik at de ikke i vesentlig grad skadelig påvirker polymerhovedkjeden og dens sukker, base, linkerarm eller andre bestanddeler, og heller ikke monomerreagensene.

Videre, i ovennevnte formel, representerer m et passende antall R2 for å tilfredsstille den normale tetravalensen for karbon. Hver R2 kan være del av en cyklisk gruppe. Hver R2 kan også være like eller forskjellige, idet det viktigste er at de velges slik at ct-karbonet i acylgruppen har en elektronegativitet slik at XI ikke avbeskyttes i vesentlig grad under koblingsbetingelsene (og således er reagenspolymerisering derved inhibert), men avbeskyttes under ikke-ugunstige alkaliske betingelser for å tillate XI å binde til en eller annen anvendbar rest under ikke-ugunstige betingelser. I dette henseendet er et mål på elektronegativiteten av R2mgitt ved Hammett ligningen (for en redegjørelse for anvendelse av denne ligning og en tabell av substituentparametre, se J. Connolly Martin, "Quantitative Drug Design, A Critical Introduction", Marcell Dekker,Inc., NY, 1978):

som, som beskrevet over, er definert for ioniseringen av parasubstituerte benzosyrer i vandig løsning, hvori: k = likevektskonstant for ionisering av parasubstituert

benzosyre.

ko = likevektskonstant for ionisering av benzosyre.

P = en konstant, definert som 1,0 0 for ioniseringen av

benzosyre i vann ved 25°C.

Op = en empirisk bestemt verdi for en spesiell parasub-stituent.

Positive verdier av ap gjenspeiler elektrontiltreknings-potensialet for en bestemt substituent.

I det foretrukne tilfellet av den foreliggende oppfinnelse hvor hver R2 er F (d.v.s. beskyttelsesgruppen er trifluoracetyl), er Op (F-) 0,15, og Op (CF3-) er lik 0,54. Det forutsies imidlertid at andre passende R2mC-grupper kan omfatte CI3C- (øp =

0,33), N C (Op = 0,66), CF3CF2- (ap = 0,52), CH3C- (ap = 0,50), CH3O-C- (op = 0,45), eller hvor XI = N og n = 2, kan også omfatte grupper som danner cykliske N-grupper.

En rekke av de aminobeskyttende grupper som vanligvis anvendes innen teknikken for proteinmodifiseringer kan også forutsies å tjene som passende aminobeskyttende grupper i den foreliggende oppfinnelse. (For en redegjørelse vedrørende protein-aminobeskyttende grupper, se The Peptides, bind 3, Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis", ed. E. Gross og

J. Meinhofer, Academic Press, 1981). Disse inkluderer trifluoracetyl, ftaloyl og maleoyl.

Foretrukket er derfor XI = N, og minst en, og foretrukket hver R2 er valgt fra et halogen (mest foretrukket er hver R2 fluor). RI vil typisk være alkyl, og er ønskelig en acyklisk hydrokarbonkjede med fra 1 til 10 karbonatomer.

-Y velges foretrukket fra gruppene med formel:

I ovennevnte formler er:

X^ = halogen (foretrukket Cl) eller substituert amino (foretrukket et dialkylamino eller heterocyklisk N-amin) ,

X-<*>= halogen (foretrukket Cl) , amino (foretrukket et ;heterocyklisk N-amino), eller 0~,;R-<*>= alkyl, foretrukket alkoksy valgt fra metoksy, etoksy,

klorfenoksy, eller (3-cyanoetoksy, eller aryloksy,

R<4>= alkyl, foretrukket alkoksy valgt fra metoksy, etoksy eller p-cyanoetoksy, aryloksy, slik som klorfenoksy, eller H kun dersom X3 = -0~.

En fremgangsmåte for fremstilling av en nukleotid-multimer, som har en bindingsrest i 5'-hydroksystillingen er også gitt, idet man ved fremgangsmåten anvender reagenser av typen som er beskrevet over, og den gjennomføres under ikke-ugunstige betingelser. Fremgangsmåten omfatter først kobling av RI gjennom Y (d.v.s. at Y tjener som koblingsgruppen og hele eller en del av Y blir eller blir ikke igjen etter faktisk kobling), til 5' hydroksy av et terminalt nukleotid i en nukleotid- multimer. Deretter utsettes det oppnådde produkt for ikke-ugunstige alkaliske betingelser for samtidig å avbeskytte alle bindingsrestene og alle beskyttede eksocykliske aminer og fosfater.

Tegninger.

Utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet med henvisning til tegningene, hvori: Fig. 1 viser syntesen av et reagens i henhold til oppfin nelsen, Fig. 2 viser syntesen av en substituert nukleotid-multimer i

henhold til den foreliggende oppfinnelse, og

Fig. 3 viser en fremgangsmåte for merking av den substituerte nukleotid-multimer fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten vist i fig. 2, ved binding av en biotinmarkør til aminbindingsresten på den først-nevnte .

Detaljert beskrivelse av utførelsesformer av oppfinnelsen. Eksemplene 1-5 under viser forskjellige aspekter av den foreliggende oppfinnelse. Særlig eksempel 1 beskriver detaljert syntesen av et reagens i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Eksempel 2 beskriver syntesen av en substituert nukleotid-multimer i henhold til den foreliggende oppfinnelse, ved hjelp av en koblingsreaksjon mellom reagenset fremstilt i eksempel 1 og en syntetisk nukleotid-multimer. Eksempel 3 illustrerer ytterligere syntesen av andre substituerte nukleotid-multimerer i henhold til oppfinnelsen, mens eksemplene 4 og 5 illustrerer binding av en markør til en slik substituert nukleotid-multimer.

Eksempel 1

Fig. 1 viser reaksjonsskjemaet for følgende syntese.

Materialer: 6-amino-l-heksanol, 5-etyltrifluortioacetat, N,N-diisopropyletylamin og N,N-diisopropylamino-klormetoksyfosfin var produkter fra Aldrich Fine Chemicals, Milwaukee, WI.

(a) 6- trifluoracetamido- l- heksanol (IV)

Til en slurry under omrøring av 6-aminoheksanol (II) (1,17 g, 10 mmol) i vannfri etylacetat (15 ml) ble det tilsatt dråpevis S-etyltrifluortioacetat (2 ml, 15 mmol). En klar løsning ble oppnådd så snart tilsetningen av S-etyltrifluortioacetat var fullstendig. Etter omrøring av reaksjonsblandingen ved romtemperatur i fem timer ble ytterligere 0,5 ml S-etyltrifluortioacetat tilsatt. Etter omrøring av reaksjonsblandingen 1 ytterligere en halv time indikerte silikageltynnsjikt-kromatografi i acetondiklormetan, forhold 5:7, at utgangsfor-bindelsen aminoheksanol (II) var forsvunnet (ninhydrin-spray). Visualisering av TLC-platen etter spraying med 0,1 M piperidin etterfulgt av, etter 15 minutter, spraying med ninhydrin og oppvarming av platen til 110°C i to til tre minutter viste en raskere bevegende bred flekk nær løsningsmiddelfronten (Rf 0,85). Petroleumeter (60 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen og den turbide løsning ble lagret ved -20°C i 16 timer til å gi fargeløst pulver som ble vasket med kald (-20°C) petroleumeter (3 x 5 ml). Produktet ble deretter tørket forsiktig under vakuum og deretter behandlet med 5 ml 10 % pyridinvannblanding i ti minutter for å avhydrolysere enhver Q-trifluoracetylgruppe som er blitt dannet under oppnåelse av III. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til tørrhet, resten ble ko-avdampet med pyridin (4 x 10 ml) til å gi 1,1 g (471) av forbindelse IV i form av en gummi.

(b) 6- trifluoracetamidoheksan- l- N. N- diisopropvlamino-metoksvfosfin I

Til en løsning under omrøring av forbindelse IV (0,426 g,

2 mmol) i tørr THF (10 ml) ble det tilsatt, under argon, N,N-diisopropyletylamin (1,4 ml, 8 mmol) etterfulgt av tilsetning av N,N-diisopropylaminoklor-metoksyfosfin (0,79 g, 4 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i en halv time hvoretter det hvite presipitat ble avfiltrert. Filtratet ble fortynnet med etylacetat (60 ml) og vasket med en 5 % natrium-karbonatløsning (3 x 15 ml). Det organiske lag ble deretter tørket over MgSC>4 og avdampet til å gi en mobil sirup som ble tørket i vakuum i 16 timer til å gi 0,7 g (94 %) av den ønskede forbindelse I som ble anvendt uten ytterligere rensing.

Tilstedeværelsen av det ønskede fosforamiditt (I) ble bekreftet ved hjelp av<31>P NMR (i CD3CN, trimetylfosfat, ekstern standard): (ppm) 117,4.

Eksempel 2: Automatisk kobling av amino- linker I med de

syntetiske DNA- fragmenter

Reaksjonsskjerna i fig. 2 viser trinnene som er involvert i den automatiske syntese av en nukleotid-multimer etterfulgt av den automatiske tilsetning av amin-linkerreagenset I. Syntese ved hjelp av en polymerbærer av en nukleotid-multimer med definert sekvens ble først gjennomført ved anvendelse av enten et

Applied Biosystems ("ABI") modell 380A, eller en Biosearch modell 8600 DNA-syntetisator, ved anvendelse av en modifisert

versjon av leverandørens synteseprogram. Denne modifisering gjør bruk av et basisk vandig vasketrinn (10 % vann i 2 %

pyridin-THF) før oksydasjonstrinnet (se fig. 2). Denne modifikasjon ble innlemmet for å minimalisere bireaksjoner i den totale syntese.

Den automatiserte kobling av amin-linkeren I ble gjennomført ved at den innføres, som en 0,2 molar løsning i acetonitril, i stilling nr. 6 på ABI 380 A DNA syntetisatoren. Ved anvendelse av metoden ble amino-linkeren tilføyd til 5'-hydroksylgruppen i den harpiksbundne N-beskyttede oligomer på samme måte som 5'-dimetoksytrityl-N-beskyttet nukleosid p-cyanoetylfosforami-ditter med generell struktur V tilføyes. Etter en endelig vasking med en basisk vannholdig løsning og oksydasjonstrinn, ble den harpiksbundne oligomer avspaltet fra harpiksen ved behandling med konsentrert vandig NH4OH ved romtemperatur i en time. Oligomeren ble deretter avbeskyttet ved at NH4OH-løsningen oppvarmes ved 5 5°C i 16 timer. Dette trinn avbe-skytter samtidig eksocykliske aminer av nukleotidene, og bindingsaminresten (ved spalting av trifluoracetyl til å gi et primært amin). Etter avdamping av ammoniumhydroksydløsningen ble det urene produkt deretter renset ved elektroforese på en 12 % polyakrylamid - 7M ureagel. Bånd ble visualisert ved

anvendelse av en UV-skyggingsteknikk, hvorved en fluorescerende tynnsjiktkromatografiplate ble plassert under gelen og en UV-

lampe ble holdt over gelen. Den linker-modifiserte oligomer ga et bånd som vandret saktere på gelen enn den umodifiserte oligomer. Det linker-modifiserte bånd ble deretter skåret ut fra gelen og ekstrahert med 0,1M NH4OAc (pH 7,5) og deretter avsaltet gjennom en Sephadex G-25 kolonne for å oppnå det rene 5'-hydroksysubstituerte nukleotid X. Basert på intensiteten av de relative bånd fra polyakrylamidgelen (UV-skyggingsmetode) ble koblingen av amin-linkeren estimert til mere enn 90 %.

Eksempel 3

Ved anvendelse av den ovennevnte prosedyre ble følgende substituerte syntetiske nukleotid-multimerer med amino-linkeren i 5'-enden syntetisert og renset. Det vil forstås at substituert nukleotid X, eller hvilken som helst av disse substituerte nukleotider under kan anvendes som probe for å påvise en komplementær targetnukleotidsekvens. I slike tilfeller vil selvfølgelig en passende markør typisk være bundet til aminbindingsdelen.

I hvert tilfelle beveget den substituerte syntetiske oligomer seg senere enn den usubstituerte oligomer som vist ved UV-

skygging av 12 % akrylamid-7M ureagel.

Eksempel 4

For å vise at aminresten i de ovennevnte substituerte nukleotider er passende for binding til en markør, ble den bundet til biotin. Reaksjonsskjemaet for slik binding og påfølgende konjugering av det biotinmerkede substituerte nukleotid er vist i fig. 3.

(a) Biotinvlerina:

For å forenkle målingen ble 5'-aminobundet syntetisk deoksy-oligonukleotid som er detaljert beskrevet i eksempel 3(b) først merket i dens 3'-0H terminale ende ved anvendelse av a- 32P(TTP) og terminal deoksynukleotidyl transferase ved følgende standard metode etter Tu og Cohen (Gene, 10, 177). Resultatet er

forbindelse XI.

For biotinylering ble 5 pmol frysetørket 3' -32° merket probe (XI) inkubert med 0,2M natriumborat (pH 9,0) (5 ml), dimetyl-sulfoksyd (4 ml) og 30 mmol biotin-x-NHS (Calbiochem-Belving Corp., San Diego, CA, U.S.A.) (1 ml) ved romtemperatur i en time. Reaksjonsblandingen ble deretter etanolpresipitert to ganger ved tilsetning av 250 ml 0,3M natriumacetat, 750 ml etanol og 20 ug glykogen. Pelleten av produktet XIII ble oppløst i 20 ml H20.

(b) Strentavidin- koni uaat:

Påvisningen av tilstedeværelsen av biotinrest på den ovennevnte merkede probe XIII ble gjennomført ved konjugering av den biotinylerte probe med streptavidin-agarose i overensstemmelse med følgende prosedyre:

100 ul streptavidin-agaroseslurry ble tilført til to

1,5 ml Eppendorph-rør (Bethesda Research Labs, Inc., Gaithersburg, MD, U.S.A.). Til det ene rør ble det tilsatt 1 mg biotin (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA, U.S.A.) i 500 pl vaskebuffer (vaskebuffer bestå av 500 mM fosfatbuffer, 2 mM EDTA, 0,5M natriumklorid, pH 7,4). Etter omrøring ved romtemperatur i 15 minutter ble 2 yl av løsningen av merket probe XII tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt ved

romtemperatur i 30 minutter.

Til det andre rør ble det tilsatt 500 yl vaskebuffer og 2 yl av løsningen av biotinylert probe og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 45 minutter.

Begge rørene ble deretter sentrifugert og supernatanten ble fjernet og merket som Sl og S2. Agarosegelene i form av pelleter ble vasket igjen med 500 pl vaskebuffer og supernatanten kombinert med henholdsvis Sl og S2. Hver av restene ble suspendert i 500 ul vaskebuffer og mengden 32p ble målt ved Cerenkov-scintillasjonstelling.

Resultatene viser klart dannelsen av biotinstreptavidinaddukt som i sin tur videre viser tilstedeværelsen av aminobinding på proben.

Eksempel 5

B. Merking av aminlinkerarmprobe med akridiniumester og

påfølgende rensning.

En 25mM stamløsning av akridiniumester (for sammensetning henvises til I. Weeks et al., Clin. Chem., bind 29, side 1474, 1983) ble fremstilt i destillert DMSO. Aminlinkerproben beskrevet over i eksempel 3(b) ble avdampet til tørrhet i 1,5 ml koniske polypropylenrør. Følgende væskeblanding ble fremstilt ved tilsetning av følgende bestanddeler i den gitte rekkefølge:

3 pl H20

1 pl IM HEPES (8,0)

4 pl DMSO (destillert)

2 pl 25 mM akridiniumester i DMSO (destillert)

Blandingen ble vortexblandet, sentrifugert i en mikrosentrifuge i to sekunder (for å bringe innholdene til bunnen av røret), og inkubert ved 37°C i 20 minutter. Ved dette punkt ble følgende bestanddeler tilsatt til reaksjonsvæskeblandingen i rekkefølgen som er gitt i det følgende:

3,0 pl 25 mM akridiniumester i DMSO (destillert)

1,5ul H20

0,5 ul IM HEPES (8,0)

Væskeblandingen ble vortexblandet på nytt, sentrifugert og inkubert ytterligere 20 minutter ved 37°C. Den ureagerte markør ble uskadeliggjort ved anvendelse av et 5-ganger overskudd av lysin ved tilsetning av 5 ul 0,125M lysin i 0,1M HEPES (8,0), 50 % DMSO, og inkubert i fem minutter ved romtemperatur.

Ved dette punkt i prosedyren ble den akridiniumestermerkede oligomer renset ved anvendelse av følgende metode. Til 20 ul av den uskadeliggjorte reaksjonsblanding ble 30 ul 3M NaOAc (5,0), 245 ul H20 og 5 ul glykogen tilsatt som en bærer (glykogenet ble forbehandlet for å fjerne enhver nuklease-aktivitet). Prøven ble vortexblandet forsiktig og 64 ml absolutt EtOH ble tilsatt. Prøven ble forsiktig vortexblandet og inkubert på is i fem til ti minutter og deretter sentrifugert i fem minutter ved 15.000 rpm i en mikrosentrifuge. Supernatanten ble forsiktig fjernet og pelleten ble oppløst på nytt i 20 ul 0,IM NaOAc (5,0), 0,1 % SDS. Prøven ble ytterligere renset ved ionebytter-høytrykksvæskekromatografi (HPLC) som følger: 20 ul gjenoppløst pellet ble injisert på en nukleogen-DEAE 60-7 ionebytter HPLC-kolonne montert i et IBM 9533 HPLC-system. Alle bufferne anvendt i prosessen var fremstilt med kvalitetsbestemt vann for HPLC, acetonitril (CH3CN) og natriumacetat (NaOAc), og iseddik (HOAc) og LiCl med reagensrenhet. I tillegg ble alle bufferne filtrert gjennom nylon-66 filtere med porestørrelse 0,45 \ m før anvendelse. Buffer A var 20 mM NaOAc, pH 5,5, 20 % CH3CN, og IM LiCl. Eluering ble oppnådd med en lineær gradient fra 5 5 % buffer A, 45 % buffer B til 30 % buffer A, 70 % buffer B i 25 minutter ved strømningshastighet på 1 ml/min. Absorbans ved 260 nm ble målt under kjøring, fraksjoner på 0,5 ml ble samlet i koniske polypropylenrør på 1,5 ml. Umidddelbart etter kjøringen ble 5 pl 10 % SDS tilsatt til hvert rør etterfulgt av vortexblanding av hvert rør (denne ble gjennomført for å sikre at akridiniumestermerket probe ikke klebet til rørveggene). En 0,5 pl prøve ble fjernet fra fraksjonene 21-42 og tilsatt til 200 pl vann i et 12 x 75 mm rør (en separat pipettespiss ble anvendt for hver prøve for å unngå overføringsproblemer). Kjemiluminiscensen for hver prøve ble deretter bestemt i en Berthold Clinilumat ved automatisk injeksjon av 200 pl 0,25 N HNO3, 0,1 % H2O2, etterfulgt av, etter et opphold på ett sekund, 200 pl IN NaOH og kjemiluminiscensen ble avlest i ti sekunder.

Fraksjoner 29-33 ble presipitert med EtOH ved tilsetning til hver 5 pl glykogen, vortexblanding, tilsetning av 1 ml EtOH til hver, vortexblanding, inkubering fem til ti minutter på is og sentrifugering i fem minutter ved 15.000 rpm i en mikrosentrifuge. Hver supernatant ble forsiktig fjernet, hver pellet ble gjenoppløst i 20 pl 0,IM NaOAc, pH 5, 0,1 % SDS og disse separate fraksjoner ble deretter samlet.

Basert på en sammenligning av UV-absorbans og kjemiluminiscens, ble kjemiluminiscens-spesifikk aktivitet av den merkede prøve og utgangsmarkørreagenset sammenlignbare på en molar basis.

Man vil således se at det er blitt beskrevet reagenser som lett kan kobles til 5'-hydroksystillingen i et nukleotid, typisk det terminale nukleotid i en nukleotid-multimer, til å gi en substituert nukleotid-multimer med en bindingsrest som lett avbeskyttes under de samme betingelser som avbeskyttelse av eksocykliske aminer i standard fast-fasesyntese. Som vist kan slike reagenser kobles til en nukleotid-multimer som et siste trinn i en velkjent fast-fasesynteseprosedyre ved anvendelse av standard kjemi for slike prosedyrer. Videre kreves intet spesielt avbeskyttelsestrinn for bindingsresten i den oppnådde substituerte nukleotid-multimer, da den acylbeskyttende gruppe, som kan spaltes under de samme alkaliske betingelser som anvendes for å avbeskytte eksocykliske nukleotide aminer i multimeren, avbeskyttes samtidig dermed.

Skjønt spesifikke utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse er beskrevet, vil variasjoner og modifikasjoner av slike utførelsesformer være mulige for den fagkyndige på området. Følgelig vil rammen for den foreliggende oppfinnelse ikke være begrenset til utførelsesformene som beskrevet detaljert over.

Claims (17)

1. Reagens passende for fremstilling av et 5'-hydroksysubstituert nukleotid, karakterisert ved at reagenset har formelen:

hvori (a) y er en ikke-nukleotidbasert koblingsgruppe som er i stand til å koble RI til 5'-hydroksy i et nukleotid, under koblingsbetingelser er som ikke-ugunstige, (b) RI er en ikke-nukleotid hovedkjede, (c) XI er en beskyttet bindingsrest valgt fra S eller en aminogruppe,

er en XI beskyttende gruppe, hvori m er et passende tall for R2, som hver kan være forskjellige og som omfatter en eller flere karbonatomer, oksygenatomer, nitrogenatomer eller halogenatomer, eller er en kombina-sjon derav, slik at R2m C- har en elektronegativitet slik at XI ikke avbeskyttes under koblingsbetingelsene men avbeskyttes under ikke-ugunstige alkaliske betingelser, (e) n = 1 når XI = S, n = 1 eller 2 når XI er en aminogruppe.

2. Reagens som angitt i krav 1, karakterisert ved at XI = N og minst en av R2 er valgt fra et halogen.

3. Reagens som angitt i krav 1, karakterisert ved at R2m C er valgt fra:

4. Reagens som angitt i krav 1, karakterisert ved ved at

er valgt fra trifluoracetyl, ftaloyl og maleoyl.

5. Reagens som angitt i krav 1, karakterisert ved at X1 = N og reagensformelen er:

hvori hver X2 er valgt fra et halogen ogR<1> = alkyl.

6. Reagens som angitt i krav 1, karakterisert ved at XI = N og RI = alkyl, og reagensformelen er valgt fra:

7. Reagens som angitt i krav 1, karakterisert ved at RI er en acyklisk hydrokarbonkjede med fra en til ti karbonatomer.

8. Reagens som angitt i hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert ved at X er en aminogruppe, og-y er valgt fra:

(a) X2 = halogen eller substituert amino, (b) X3 = halogen, amino, eller 0~, (c) R3 = alkyl, alkoksy, aryloksy, (d) R4 = alkyl, alkoksy, aryloksy, eller H kun dersom X3 = 0~.

9. Reagens som angitt i hvilket som helst av kravene 1-7, karakterisert ved at RI = alkyl, xl er en aminogruppe, og -Y er valgt fra:

(a) X2 = Cl eller en sekundært amin, (b) X3 = Cl, et sekundært amin eller 0~, (c) R3 = alkoksy, arykoksy. (d) R4 = alkoksy, eller H kun hvis X <3> er0 ~.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av en nukleotid-multimer med en bindingsrest på 5'-hydroksy, ved anvendelse av et reagens med formel:

hvori: (i) y er en ikke-nukleotidbasert koblingsgruppe, (ii) RI er en ikke-nukleotid hovedkjede, (iii) XI er en beskyttet bindingsrest valgt fra svovel amino,

er en XI beskyttende gruppe, hvori m er et passende tall for R2, som hver kan være forskjellig men som velges slik at R2m C- er mere elektronegativ enn et alkyl, karakterisert ved : (a) først kobling av RI gjennom y til 5'-hydroksy av et terminalt nukleotid av multimeren under ikke-ugunstige betingelser, (b) deretter utsettes det oppnådde produkt for ikke-ugunstige alkaliske betingelser for samtidig å avbeskytte XI og alle beskyttede eksocykliske aminer.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at XI = N og minst en av R2 er valgt fra et halogen.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at XI = N og

er valgt fra trifluoracetyl, ftaloyl og maloyl.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at XI = N og RI = alkyl, og reagensen har formelen:

hvori hver X2 er valgt fra et halogen.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at XI = N og RI = alkyl, og reagensen har formelen:

15. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kravene 10 -14, karakterisert ved at XI er en amino, og -y er valgt fra:

(a) X2 = halogen eller substituert amino, (b) X3 = halogen, amino eller 0-, (c) R3 = alkyl, alkoksy, aryloksy -0-, (d) R4 = alkyl, alkoksy, aryloksy, eller H kun hvis X <3> = 0-.

16. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kravene 10-14, karakterisert ved at -y er valgt fra:

(a) X2 = Cl eller et sekundært amin, (b) X3 = Cl, et sekundært amino, eller 0~, (c) R3 = alkoksy, (d) R4 = alkoksy eller H kun hvis X3 = 0-, (e) RI = alkyl.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av en merket nukleotid-multimer , karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) fremstilling av en nukleotid-multimer med en bindingsrest i 5'-hydroksy, ved hjelp av fremgangsmåten som angitt i hvilket som helst av kravene 9 til 15, (b) binding av en kjemiluminiscerende akridiniumester til bindingsresten.