NO894218L - Beskyttede kjemiluminiscerende merkinger av f.eks. en biologisk probe. - Google Patents

Description

BESKYTTEDE KJEMILUMINESCERENDE MERKINGER

OPPFINNELSESOMRÅDET

Den foreliggende oppfinnelse vedrører spesifikke bindingspartnere, som f.eks. biologiske prober, merket med en beskyttet kjemiluminescerende merking, slik at inaktivering av merkingen inhiberes, og hvorfra den avbeskyttede, kjemiluminescerende merking kan gjendannes.

TEKNOLOGIOVERSIKT

Ved klinisk forskning og diagnose innbefatter en kjent metode for å bestemme nærvær av en biologisk faktor, enten kvalita-tivt eller kvantitativt, bruk av en probe som vil knytte esg spesifikt til den faktor som det er spørsmål om (dens spesifikke bindingspartner). For eksempel i situasjoner hvor en assay skal gjennomføres for et target i form av et antigen eller en spesiell nukleotidsekvens kan proben være et antistoff henholdsvis et oligonukleotid. I alle fall er proben typisk merket, slik at den .er forsynt med et atom eller en gruppe knyttet dertil, hvis nærvær lett kan detekteres. For å bestemme nærvær av target i en testprøve utsettes den merkede probe for prøven under betingelser som vil tillate at den merkede probe knyter seg til sin spesifikke bindingspartner inne i testprøven (f.eks. i tilfellet av antistoff-probe at proben binder med antigenet og i tilfellet av en oligonukleotidprobe at denne hybridiserer med nukleotid-multimeren). Etter dette blir tilstedeværende merket probe/- targetkompleks typisk separert fra ikke-kompleksdannet probe og nærværet av merking bestemt i enten den komplekserte eller ikke-komplekserte probe.

Historisk er radioaktive merkinger anvendt. På grunn av vanskeligheter med håndtering, helsefare og ustabilitet ble imidlertid ikke-isotopmerkinger utviklet senere. Slike merker inkluderer de merkinger hvis nærvær bestemmes enten direkte eller indirekte. Eksempler på direkte merkinger inkluderer kjemiluminescerende, fosforescerende, fluorescerende eller spektroskopisk detekterbare merkinger. Eksempler på indirekte merkinger inkluderer forbindelser som biotin og forskjellige antigener, som kan detekteres ved hjelp av spesifikke bindingspartnere konjugert itl en passende detekterbar merking. Av de foregående merkingstyper er kjemiluminescerende merkinger blitt funnet å være særlig nyttige.

Et antall kjemiluminescerende forbindelser er kjent. Noen av disse er anført av McCapra, Progress In Organic Chemistry, 8, 78(23), pp.231-277 (1973). Den foregående henvisning, såvel som alle andre anførte henvisninger, er innlemmet heri som referanse. Mange av de ovennevnte forbindelser kjemilumine-scerer ved behandling med hydrogenperoksyd eller oksygen, og hydroksyd. Slike forbindelser inkluderer akridiniumforbindelser og akridanforbindelser, med strukturer I henholdvis II som anført i det følgende, så vel som forbindelser med strukturtyper III, IV og V anfør i det følgende:

UK patentskrift nr 2 112 779B til Campell et al., (ansøkning 82.35019 ingitt 8 desember 1982) lærer bruken av akridium-estere med struktur VI som anført i det følgende, som kjemiluminescerende biologiske probemerkinger:

I den ovennevnte formel er X- et hvilket som helst anion, R]_ står for H, C1 til C 1Q alkyl, alkenyl, alkynyl eller aryl-substituenter, R2og R3er hydrogen, aminosubstituert amino, karboksyl, hydroksyl, alkoksyl, nitro, eller halogensubsti-tuenter, og R4er en eventuelt substituert fenoksydel. Weeks et al., Clin Chen. 29/8, pp 1474-1479 (1983) viser også bruken av akridiniumestere med den ovennevnte formel, som kjemiluminescerende antistoffmerkinger.

Den kjemiluminescerende reaksjonsmekanisme for akridiniumforbindelser og akridanforbindelser er blitt ganske utførelig belyst. I tilfettet av akridiniumforbindelser blir den kjemiluminescerende reaksjon initiert ved tilsetning av hydrogenperoksyd etterfulgt av base. Som omhandlet av McCapra, "Chemiluminescent Reactions of Acridines", Chemistyr of Heterocyclic Compounds, volum 9, p 16 til 30 ((1973) innbefatter mekanismen øyensynlig peroksydangrep på ringen ved karbonet i 9-stillingen, med etterfølgende deprotonering av peroksydgruppen og nukleofilt angrep på nabokarbonyl til å gi et dioksetan-lignende mellomprodukt. Dette kan foregå samtidig med spaltning av en avgående gruppe, som for eksempel kan være et oksydanion (f.eks. spaltning av en oksyd i det spesielle tilfellet av en akridiniumfenyl-ester). Det er kjent at tilsetning av hydrogenperoksyd bør foregå før eller samtidig med basen, ettersom akridium forekommer i likevekt med sin tilsvarende "pseudobase" (representert ved tilsetning av hydroksyion til ringens 9-stilling). Pseudobasen er øyensynlig ikke kjemiluminescerende og for å oppnå hurtig lysemisjon fra akridinium bør pH være lav før hydrogenper-oksydtilsetningen, slik at likevekt av akridinium og dets pseudobase skiftes til fordel for fritt akridinium. En forklaring av det ovennevnte er gitt av Weeks et al., supra.

Som påpekt av McCapra, "Chemiluminescence of Organic Compounds" , Progress in Organic Chemistry, vol. 8, 231-277 (197 3) vil kjemiluminescens av akridanforbindelser synes først å innbefatte deprotonering av akridanringens hydrogen i 9-stilling i nærvær av en sterk base, til å danne det tilsvarende akridananion, som reagerer med oksygen ved ringens 9-stilling, etterfulgt av etterfølgende dioksetandannelse og oksydavstøtning ved en lignende mekanisme som for akridiumfor-bindelser.

Den kjemiluminescerende mekanisme for akridiniumforbindelser eller akridanforbindelser ville antyde at i begge tilfeller kreves en god avgående gruppe (f.eks. fenoksyd). Dette krav er detaljert av McCapra, Accounts of Chemical Research, volum 9, nr 6, pp 201-208 (juni 1976) som viser at kvanteutbyttet (basert på kjemisk utbytte av eksitert produkt) øker med en minskende pKa av ROH (hvor RO- er det avgående oksydanion). Det vil si at kvanteutbyttet øker når RO- er en bedre avgående gruppe.

Merkede prober fremstilles ofte som en komponent i et assay-testsett for en biologisk target. Typisk inneholder settet merket probe i form av en vandig oppløsning. Vanskeligheten med denne situasjon er at de kjemiluminescerende forbindelser av den ovennevnte type er utsatt for hydrolyse ved ringens 9-faktor (deres aktive faktor) nødvendig for kjemiluminescens. For eksempel i tilfettet av akridiniumfenyl-estere er karbonylkarbonet av "den aktive esterfaktor" utsatt for hydrolyse selv under svakt sure betingelser (f.eks. pH 6) til å gi den tilsvarende ikke-kjemiluminescerende akridiniumsyre, og den avgående gruppe (som i dette tilfellet er fenoksyd-anionet). Denne hydrolyse kan foregå når en probe som bærer merkingen anvendes ved en assay for en target. Dette er særlig tilfellet når proben er et oligonukleotid som kreves ved assayforskriften, for å hybridisere med en targetsekvens ved forhøyede temperaturer (f.eks. 60°C) og i løpet av lengere tidsperioder (f.eks. 2 timer).

Med hensyn til pyridinanaloger og akridinanaloger er det utført generelle arbeider vedrørende nukleofil addisjon ved C4- henholdsvis C9-stillingene. For eksempel er sådant arbeid beskrevet i Colowick et al, J. Biol. Chem., vol 191, p. 447

(1951) Ludowieg et al, Biochem Biophys. Res. Commun., vol. 14, p. 431 (1964) og i verket til Acheson, "Acridines", publisert av John Wiley and Sons Inc., London, UK (1973).

DEFINISJONER

rlu - relativ lysenhet. Når et foto treffer fotoforsterker-røret i et luminometer vil det igangsette en elektronisk kaskade som resulterer i en maskinbestemt tallverdi. Effektiviteten av denne prosess er maskinavhengig og enhetene benevnes derfor relative lysenheter.

addukt - refererer til et enkelt molekylært produkt som resulterer fra reaksjonen mellom to strukturmessige forskjellige reaksjonskomponenter.

spesifikk bindingsparter - et biologisk molekyl som binder til et annet biologisk molekyl med høy grad av spesifisitet. For eksempel er hver av et antistoff og en analytt hvortil dette binder spesifikt, en spesifikk bindingsparter (enkelte ganger benevnt som "komplement") for den annen.

aktiv del - en del av en kjemiluminescerende merking som er i en tilstand som nødvendig for etterfølgende exitasjon til den luminescerende form.

lysavgivelse - den spesifikke reaksjon som frembringer kjemiluminescens fra en kjemiluminescerende merking når dette ønskes.

lysavgivelsesreagenser - de reagenser som anvendes for å frembringe lysavgivelse fra en kjemiluminescerende merking.

inaktivering - enhver reaksjon som gjør den kjemiluminescerende merking ute av stand til å kjemiluminescere ved tidspunktet for lysavgivelsen.

adduktdanner - enhver kjemisk forbindelse som er tilstrekkelig reaktiv til å danne et addukt med en annen forbindelse.

beskyttende adduktdannere - en adduktdanner som vil beskytte en kjemiluminescerende merking mot inaktivering.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse er basert på en erkjennelse av at for å oppnå det maksimale kvanteutbytte fra kjemiluminescerende merkinger av den type som er beskrevet i det foregående, bør den aktive del ha en god avgående gruppe. Dette medfører imidlertid at den aktive del vil være mer følsom for inaktivering, ettersom det karbon hvortil den avgående gruppe er knyttet vil være mer følsom for uønskede reaksjoner, som hydrolyse eller for tidelig kjemiluminescens. De merkinger av den ovenfor beskrevne type, som ville frembringe det høyeste kvanteutbytte, og følgelig kunne anvendes for å gi merkede prober med høy følsomhet, er således også dem som er mest følsomme for inaktivering. Merkingshydrolyse er en særlig problematisk form av merkingsinaktiverings. Merkingsinaktivering resulterer i tap av assayfølsomhet og nøyaktighet, særlig under lagring av sett inneholdende merkede prøver, eller under en assayprosedyre som kan fremme merkingsinaktivering (f.eks. hybridisering av en merket nukleotidprobe med sin spesifikke bindingspartner, som i dette tilfellet er en targetnukleotidsekvens). Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et middel hvormed følsomheten av merkingen overfor inaktivering kan reduseres, slik at dette fører til forbedret merkings- lagringstid og økt assayfølsomhet og nøyaktighet. Generelt oppnås dette ved å fremstille addukter av merkingene, med passende beskyttende adduktdannere, som beskytter den aktive del mot inaktivering mens en kjemiluminescerende form av merkingen lett kan gjendannes fra adduktene, typisk etter en kompleksdannelse med den biologiske target.

En fremgangsmåte for fremstilling av en merket spesifikk bindingspartner tilveiebringes idet fremgangsmåten anvender et peptid eller nukleotiddel, eller annen spesifikk bindingspartner, og en kjemiluminescerende merking. Merkingen har en aktiv del nødvendig for kjemiluminescens, men som er utsatt for inaktivering til å gi en ikke-kjemiluminescerende form av merkingen. Fremgangsmåten omfatter at den spesifikke bindingspartner knyttes til merkingen, og det fremstilles et addukt av merkingen med en beskyttende adduktdanner slik at det tilveiebringes en beskyttende del for den aktive del slik at den aktive del beskyttes mot inaktivering. Adduktet kan enten fremstilles før eller etter at merkingen knyttes til proben. Hvis adduktet fremstilles etter at merkingen er blitt knyttet til proben innsees det dog at det blir mer ønskelig å velge betingelser som er "ikke-skadelige" for proben (dvs. at de ikke resulterer i at en vesentlig andel av proben blir ineffektiv til å detektere den spesifikke bindingspartner som den var bestemt for). I tilfellet av kjemiluminescerende forbindelser som kjemiluminescering etter behandling med hydrogenperoksyd eller oksygen og en base, betyr dette at den beskyttende del er en annen enn OH eller peroksyd (00H). Hydroksyd ansees ikke som en beskyttende del, ettersom fremstilling og lagring av et addukt derfor krever opp-løsninger som er tilstrekkelig alkaliske til å fremme hurtig khydrolyse av den aktive gruppe. H kan anvendes som en beskyttende del, men er ikke foretrukket ettersom dannelse av forbindelser som akridanforbindelser krever reduksjon med hydrid, en reaksjon som ikke er lett reversibel. Peroksyd er på den annen side uegnet som en beskyttende del for de fleste kjemiluminescerende merkinger, ettersom dets nærvær vil fremme for tidlig kjemiluminescens. Den beskyttendel del velges også slik at adduktet kan avbeskyttes til å gi en kjemiluminescerende form av merkingen.

Foretrukket tilveiebringer den beskyttende adduktformer en beskyttende del ved hjelp av en lett reversibel reaksjon.

(Mest foretrukket en lett reversibel likevektsreaksjon), slik at den beskyttende del enkelt spaltes under avbeskyttelsen for å gjendanne den kjemiluminescerende merking.

Merkinger som kan anvendes ved den ovennevnte metode har følgende formel:

I den ovennevnte formel er pyridiniumringen eventuelt ytterligere substituert, og: Y er 0; eller NH;

Ri er et eventuelt substituert hydrokarbon eller H;

R4er en avgående gruppe;

11

Y

- C-R4er den aktive del som er knyttet til orto-eller para-pyridiniumstillingene, og er utsatt for hydrolyse til å gi en ikke-kjemiluminescerende form av merkingen og den avgående gruppe. I dette tilfellet er den beskyttende gruppe et addukt av en nukleofil ved a-karbonet til den aktive del, det vil si tilfellet av strukturen VI i det foregående, et karbon i pyridiniumringen. Foretrukket er merkingen en akridiniumforbindelse med formel:

hvori Ri foretrukket er eventuelt substituert alkyl, alkenyl eller alkynyl.

R2og R3er eventuelle substituenter, foretrukket valgt fra H, amino, hydroksy, tiol, halogen, amido, acetyl, alkyl, alkenyl, arylsubstituert acetyl, substituert alkyl, substituert alkenyl, substituert aryl, alkoksy eller aryloksy. R4er halogen, substituert fosfor, substituert nitrogen, substituert bor, substituert arsen. R4kan også ha strukturen -Z(R5)(Rg) hvori Z er 0,S,N og R5er et eventuelt substituert hydrokarbon. I det foregående er Rg H eller eventuelt substituert hydrokarbon bare hvis Z = N.

Mest foretrukket er merkingen en akridinium-ester med formel:

Forskjellige mulige beskyttende addukt-dannere kan selvfølge-lig velges, men det foretrekkes imidlertid at den beskyttende adduktformer er en nukleofil valgt fra en primær tiol, mest foretrukket fra en primær alkyl eller aryltiol.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også beskyttede kjemiluminescerende merkinger som er nyttige som bilologiske probemerkinger som beskrevet i det følgende. I den den

etterfølgende formel er

en aktiv del av den type som

allerede er beskrevet i forbindelse med den ovennevnte fremgangsmåte, mens M er en annen beskyttende del enn H eller OH eller 00H (peroksyd). Den beskyttende del er spaltbar til å gi avbeskyttet, kjemiluminescerende merking, og er valgt slik at C=Y carbonet i det beskyttede merking er mindre utsatt for hydrolyse enn i den avbeskyttede merking. R4(den avgående gruppe) inneholder foretrukket en funksjonell gruppe som lett kan knyttes til en biologisk prøve, eller kan allerede være knyttet til proben.

Foretrukket har de beskyttede merkinger enten formel IXb eller IXc som følger:

Beskyttede kjemiluminescerende merkinger av typen IXb eller ixc i det ovenstående, kan betraktes som et addukt av en beskyttende adduktformer inneholdende M, med merkinger med struktur VI i det foregående, idet M- adderes til a-karbonet til den aktive gruppe. De mest foretrukne av de beskyttede merkinger er akridiniumestere med den følgende formel:

hvori M foretrukket er en primær tiol.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre biologiske prober knyttet til beskyttede merkinger av den ovenfor beskrevne type.

FIGURER

Utførelsesformer av oppfinnelsen skal nå beskrives med henvisning til tegningene hvori: Figur 1 er en grafisk fremstilling som illustrerer stabiliteten av beskyttede merkinger i samsvar med den foreliggende oppfinnelse over tid, (se eks. 1). Figur 2 er et delvis ultrafiolett spektrum som illustrerer avhengigheten av beskyttelse som kan gis til merkinger ved hjelp av beskyttende addukt-dannere etter beskyttende addukt-dannerkonsentrasjon (se eksempel 2). Figur 3 er en grafisk fremstilling som illustrerer avhengigheten av dannelse av addukter i samsvar med oppfinnelsen, på beskyttende addukt-dannerkonsentrasjon (se eksempel 3). Figur 4 illustrerer en lett reversibel likevektsreaksjon for dannelse av en spesiell beskyttet merking i samsvar den foreliggende oppfinnelse (se eksempel 4). Figur 5 er en grafisk fremstilling som illustrerer gjenvinning av signal, og følgelig gjenvinning av avbeskyttet merking, fra beskyttet merking i samsvar med oppfinnelsen ved hjelp av oksydasjon av addukt-danneren (se eksempel 6). Figur 6 illustrerer temperaturstabilitet av addukter i samsvar med den foreliggende oppfinnelse (se eksempel 8).

DETALJERT BESKRIVELSE AV UTFØRELSESFORMER AV OPPFINNELSEN

En prosedyre for selektering av egnede beskyttende addukt-dannere for fremstilling av beskyttede merkinger i samsvar med den foreliggende oppfinnelse skal først beskrives. Også en prosedyre for knytting av spesifikke bindingspartnere til merkingene er beskrevet. Dernest illustreres avhengigheten av beskyttelse av beskyttede merkinger i samsvar med den foreliggende oppfinnelse, fra peroksydinaktivering, på adduktdannerkonsentrasjonen. De neste eksempler vedrører nye måter til å omdanne beskyttede merkinger i samsvar med den foreliggende oppfinnelse tilbake til den ubeskyttede merking ved 1) fortynning, 2) generell oksydasjon, og 3) spesifikk oksydasjon. Etter dette er vist brukbarheten av beskyttende adduktdannere ved manipulering av akridinium-estere.

I tilfellet av akridinium-estermerkinger med formel VII i det foregående, kan beskyttelse av den aktive del, særlig C=Y (f.eks. karbonyl) karbonet derav, mot hydrolyse oppnås ved å fremstille et addukt mellom en passende nukleofil og merkingen, idet dette addukt dannes ved a-karbonet til den aktive gruppe (dvs. at dette spesifikt vil være et pyridiniumring- karbon). Mulige egnede beskyttende addukt-dannere kan fastslås i dette tilfellet ved eksperimentelt å bestemme deres evne til å nedsette hydrolyse av den aktive del. En slik teknikk er illustrert i det etterfølgende eksempel 1.

EKSEMPEL 1

Fremgangsmåte for selekterina av beskyttende addukt- dannere.

Forskjellige nukleofiler ble selektert som potensielle beskyttende grupper for akridinium-fenylester med formel:

Evnen til hver nukleofil til å virke som en beskyttende del ble fastslått eksperimentelt ved å blande nukleofilene (i form av en potensiell addukt-danner oppført som "middel" i tabell 4 i det følgende) i den følgende vandige testoppløsning:

0,5 M fosfatbuffer ("PB") — (pH 6,0

0,1 % natriumdodecylsulfat ("SDS")

5mM av midlet

10^ rlu av en biologisk probe i form av et 26 basepart ("bp") oligonukleotid, merket med substituert akridiniumfenyl-ester.

Merking av oligonukleotid-proben kan gjennomføres ved hjelp av metoden beskrevet i US patentansøkningen med titel "Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes", inngitt 5 oktober 1987 med løpenummer 105.080.

Den ovennevnte blanding ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter etterfulgt av inkubasjon ved 60°C og en delmengde ekstrahert ved tidspunkter indikert i den etterfølgende tabell 1. Delmengden ble så tilsatt til 100 mikroliter ("ul") av 0,5N HNO3for å sikre at enhver pseudo-baseform av den tilstedeværende akridiniumester ble omdannet til den frie ester. Lysavgivelse ble så iverksatt ved at det til salpeter-syreoppløsningen ble tilsatt 100 ul 0,2 % H2O2etterfulgt av 200 ul alkalisk fosfatbuffere (pH 12,75). Lysemisjonsmålinger ble også foretatt på et antall kontroller, bestående den ovennevnte blanding uten den potensielle adduktdannende forbindelse som testes (dvs. "midlet"). Lysemisjon ble målt over omtrent 10 sekunder i hvert tilfelle, og den resulterende verdi ved hvert tidspunkt (i tusen rlu) er gjengitt i den etterfølgende tabell 1. Den nukleofile komponent av de testede midler ble betraktes som potensielt egnede beskyttende addukt-dannere hvis lysemisjonen var vesentlig større ved hvert tidspunkt etter tidspunktet null minutter enn i kontrollen. Basert på det foregående kriterium er en indikasjon av de addukt-dannere som ansees å frembringe beskyttede merkinger merkinger i samsvar med den foreliggende oppfinnelse og som er potensielt egnet ved fremgangsmåtem i henhold til den foreliggende oppfinnelse, indikert med en "Y" under spalten med overskrift "potensielt egnet" i følgende tabell.

Resultatene for noen av de potensielle adduktdannere oppført i tabell 1 er illustrert i figur 1 som en avsetning av: Log [100 x (rlu ved det aktuelle tidspunkt)/(rlu ved tidspunkt 0)] versus tiden.

Som det kan sees både fra tabell 1 og figur 1 tilveiebragte mange av de testede midler beskyttende deler som nedsatte merkingsinaktiveringen. Disse adduktdannere er indikert med en "Y" i tabell 1 i det foregående under kolonnen med overskrift "potensielt egnet".

Den beskyttelse som tilveiebringes av beskyttende deler av de midler som er potensielt egnede adduktdannere, medfører spesielt to potensielle fordeler. For det første er lagrings-levetiden for spesifikke bindingspartnere merket med beskyttende merkinger større enn levetiden av prober merket med tilsvarende ubeskyttet merking. For det annet er denne beskyttelse særlig fordelaktig under kompleksdannelse av den. merkede spesifikke bindingspartner med sitt komplement, under strenge betingelser som kunne fremme hydrolyse av merkingen. Når for eksempel den spesifikke bindingspartner er en oligonukleotidprobe som skal hybridiseres med en komplementtarget under forsøket, ved forhøyede temperaturer og over en forlenget tidsperiode. Som vist i tabell 1 og figur 1, vil en forhøyet temperatur på 60°c betraktelig øke den grad hvormed den ubeskyttede merking inaktiveres, idet den øyensynlig hydrolyseres til en ikke-kjemiluminescerende form. Det kan også fra tabell 1 og figur 1 sees at initial lysemisjon fra beskyttet merking i mange tilfelelr er betraktelig lavere enn fra den tilsvarende ubeskyttede merking. Dette er øyensynlig resultatet av at adduktet danner en sterk binding med merkingen i konkurranse med hydrogenperoksyd under lysavgivelsen. Som det kan sees i det følgende kan disse tilsyne-latende "tapte rlu" av lysemisjonen gjenvinnes ved metoder som skal beskrives.

Det minnes om at hvorvidt en potensielt egnet beskyttende adduktdanner faktisk er egnet i en gitt situasjon vil avhenge av den spesifikke bindingspartner hvormed merkingen skal anvendes. Det er for eksempel funnet at hvor den spesifikke bindingspartner er en oligonukleotid-probe vil bruken av bisulfit nedsette hybridiseringen markert. Dette skyldes sansynligvis resulterende spaltning av cytosin til uridin slik at homologien mellom proben og dens target (d.v.s. dens komplement) reduseres. I et spesielt tilfelle bør man således kontrollere med hensyn til skadelige virkninger av en potensielt egnet beskyttende adduktdanner på de spesifikke bindingspartnere hvormed den skal anvendes.

EKSEMPEL 2

Konsentrasionsavhenaiahet av beskyttelse mot peroksvd

Dette eksempel illustrerer avhengigheten av dannelse av beskyttede merkinger i samsvar med den foreliggende oppfinnelse på adduktdannerkonsentrasjonen. Fem oppløsninger ble fremstilt som hver inneholdt følgende:

0,5M fosfatbuffer ved pH 6,0,

0,1% SDS,

80 nanomolar ("nM") av akridiniumfenylester-merking.

Stadig økende mengder av adduktdanneren 3-merkaptopropionsyre ("MPA") ble tilsatt for å oppnå konsentrasjoner fra 0 til 10 mM.

Ultrafiolett ("UV") sveipinger av de resulterende blandinger . ble så oppnådd i området 300-240 nanometer ("nm"). Disse sveipinger er illustrert i figur 2.

Absorpsjonen ved 260nm tilsvarer ikke-addukt akridinium ringstrukturen. Som det sees fra figur 1 bevirker således økede konsentrasjoner av adduktdanneren en tilsvarende nedsettelse i 260nm absorppsjonen på grunn av omdannelse av akridinium ringstrukturen til et addukt. Det ble også iakttatt mengden av addukt ikke endret seg særlig med tiden ved en fiksert konsentrasjon av MPA. Dette indikerer at adduktet er dynamisk likevekt med den fri akridiniumstruktur.

EKSEMPEL 3

Konsentrasionsavhengighet av beskyttelse mot peroksvd sett som ki emiluminescens.

Dette eksempel illustrerer også at som i eksempel 2 er graden av dannelse av beskyttet merking avhengig av adduktdannerkonsentrasj onen.

I dette eksempel ble forskjellige oppløsninger av den følgende blanding fremstilt ved å tilsette en ul av en oppløsning inneholdende den akridiniumester-merkede probe, til 100 yl 0,5N HNO3etterfulgt av den nødvendige mengde av adduktdannere (3-merkaptopropionsyre) for å frembringe adduktdannerkonsen-trasjoner indikert i figur 3. Lysavgivelse ble så iverksatt ved at det til hver resulterende blanding ble tilsatt 100 ul 0,2 % H2O2(vekt/volum) etterfulgt av tilsetning av 200 ul alkalisk fosfatbuffer med pH 12,75. Den resulterende lysemisjon versus log av konsentrasjonen av adduktdanner

(i nM) er avsatt i figur 3.

Figur 3 viser også avhengigheten av dannelse av noen av de beskyttede merkinger i samsvar med oppfinnelsen av konsentrasjonen av adduktdanner. Det vil si at jo høyere konsentrasjon av adduktdanner desto høyere vil andelen av merking omdannet til den beskyttede merkingsform være. Dette resultat antyder også at i det minste med adduktdannere i det foreliggende eksempel kan den kjemiluminescerende merking gjenvinnes fra dens ikke-kjemiluminescerende beskyttede form ved å redusere adduktdannerkonsentrasj onen.

EKSEMPEL 4

Demonstrasjon av reverserbarhet ved fortynning.

Et middel til å redusere adduktdannerkonsentrasjonen for å

gjenvinne den kjemiluminescerende merking er enkelt å fortynne en oppløsning inneholdende merkingen og adduktdanneren. Denne teknikk vil selvfølgelig bare være effektiv hvis det velges en oppløsning hvori den totale kjemiske oppløsning er slik at

fortynning vil bevirke en skifting i likevektsreaksjonen mellom adduktdanneren og merkingen for å frembringe den beskyttende merking. Ved å betrakte en primær tiol som adduktdanner vil den forventede likevektreaksjon være:

I det ovenstående er RSH adduktdanneren i form av en primær tiol, Akr<+>er den ubeskyttede akridiniumester-merking, og RSAkr er akridiniumadduktet (d.v.s. beskyttet merking). I et slikt system, når en buffer til tilstede og H+ konsentrasjonen forblir konstant, vil således fortynningen av oppløsningen resultere i en skifting av likevekten til venstre, med den derav følgende avbeskyttelse av den beskyttede akridiniumestermerking til å gjenvinne den kjemiluminescerende akridiniumestermerking.

For å illustrere dette ble en forsøksoppløsning fremstilt ved at det til akridinium-fenylester i en fosfatbufferoppløsning (pH 6,0) ble tilsatt en oppløsning av adduktdanneren 3-merkaptopropeon-syre for å bringe den endelige addukt-dannerkonsentras j on til 10 mM. Denne oppløsning ble så fortynnet for fremstilling av resulterende forsøksprøver inneholdende forskjellige konsentrasjoner av adduktdanneren som indikert i figur 4. Lysavgivelse av disse forsøksprøver ble så iverksatt ved at det til de fortynnede prøver ble tilsatt 100 yl 0,5N HN03, etterfulgt av 100 ul 0,2 % H202og dertil 200 ul alkalisk fosfatbuffer pH 12,75. Lysemisjon, korrigert for den anvendte fortynning, versus konsentrasjoner avsatt i figur 4 både for forsøksprøvene, så vel som for kontrollprøver fremstilt i samsvar med den samme teknikk med unntagelse av at disse var uten tilstedeværende beskyttende adduktdanner.

Det sees av fig. 4 at for den beskyttende adduktdanner 3-merkaptopropion-syre er likevektsreaksjonen i samsvar med ligning (1) i det foregående, en lett reversibel likevekts-reaks jon. Spesielt, ved denne adduktdanner er den kjemiluminescerende merking lett gjenvinnbar ved hjelp av prose-dyrer som skifter likevekten til gunst for avbeskyttelse av den beskyttede merking, f.eks. ved fortynning under hovedsakelig konstant pH.

Eksempel 5

Reversering ved vasking etter binding til en fast bærer.

I det tilfellet hvor den spesifikke bindingspartner er en oligonukleotidprobe merket med en beskyttet merking i samsvar med den foreliggende oppfinnelse, og den resulterende probe/- targethybrider er bundet til en fast bærer, kan fortynningen beskrevet i eksempel 4 lett gjennomføres under vasking av bæreren etter hybridisering. Dette er illustrert ved det foreliggende eksempel. "Merkede probehybrider" ble fremstilt og behandlet under anvendelse av følgende prosedyre: (i) en hybrid ble forhåndsdannet i fosfatbuffer ("PB"), pH 6,0, mellom et 26 bp oligonukleotid merket med akridiniumfenyl-ester, og en target nukleotidsekvens,

ii) hybridisert, merket probe ble separert fra ikke-hybridisert probe på en fast bærer, og den faste bærer ble så vasket med PB, pH 6,0,

iii) 5 0 ul av slurryen fra trinn (ii) ble behandlet med salpetersyre og bragt til å lyse på samme måte som beskrevet i forbindelse med eksempel 4. Lysemisjonen er opptegnet i tabell 2 under "forhåndsaddukt" (alle Tabell 2 lysemisjoner er oppført i rlu),

iv) til resten av slurry-porsjonen fra trinn (ii) ble det tilsatt 3-merkaptopropion-syre (beskyttende adduktdanner) for å bringe dens konsentrasjon til 10 mM,

v) ytterligere 50 ul delmengde av slyrry fra trinn (iv) ble så bragt til å lyse på samme måte som i trinn (iii) og emisjonen opptegnet under "etter dannelse" i tabell 2 i det følgende.

vi) Resten av den resulterende slurry fra trinn (iv) ble vasket en gang med PB og en 5 0 ul delprøve ble bragt til lysemisjon under anvendelse av prosedyren i trinn (iii)

ovenfor. Den resulterende emisjon er oppført i tabell 2 under "etter vasking 1".

vi) Resten av slurryen som skriver seg fra trinn (iv) ble på nytt vasket med PB, og en ytterligere delprøve ble så bragt til lysemitering under anvendelse av prosedyren i trin (ii) ovenfor. Emitteringen er oppført under "etter vasking 2" i tabell 2 i det følgende.

Den ovennevnte prosedyre ble også gjentatt med en kontroll og en blindprøve, og i tilfellet med kontrollen ble det ikke tilsatt noe beskyttende adduktdanner (d.v.s. ingen 3-merkaptopropionsyre) og i tilfellet med blindprøven var der intet oligonukleotid. Lysemisjonen fra hver av kontrollen og blindprøven er gjengitt i tabell 2 i det følgende, sammen med linjene merket henholdsvis "kontroll" og "blindprøve".

Som det fremgår av tabell 2 omdannet MPA effektivt nesten all merkingen til en beskyttet, ikke kjemiluminescerende merking, som illustrert ved lysemisjonen under kolonnen "etter dannelse". Videre kunne avbeskyttelse lett gjennomføres ved vasking med OB, til å gi den ubeskyttende, kjemiluminescerende merking, med en vasking like så effektiv som to vaskinger.

For formålet med en klinisk assay,ville et testsett selv-følgelig typisk bli fremstilt før assayet, inneholdende den uhybridierte probe merket med en beskyttet merking i samsvar med oppfinnelsen, slik at merkingsinaktiveringen ble nedsatt til et minimum, både under lagring av den merkede probe og under inkubasjon ved assayprosedyren. De samme kvalitative resultater som er gitt i tabell 2 ville imidlertid også være ventet i denne situasjon.

Eksempel 6

3_

Reversering ved oksydasjon med Fe(CN)g

Som det er illustrert i de ovennevnte eksempler er likevektsreaksjonen mellom disse beskyttende adduktdannere og en merking, som for eksemepl en akridiniumester-merking, lett reverserbar til å gjenvinne den kjemiluminescerende ubeskyttede merking. Fortynning er vist å være en måte til å skifte likevekten til gunst for ubeskyttet merking, men andre metoder for skifting av likevekten vil imidlertid være aktuelle. Det foreliggende eksempel illustrerer en ytterligere slik metode, nemlig oksydasjon av den beskyttende adduktdanner. I dette eksempel ble følgende prosedyre fulgt: i) en 26-mer oligonukelotid-probe, merket med akridinium-fenylester, ble blandet i PB (pH 4,9);

ii) en tilstrekkelig mengde av den beskyttende addukt-blander 4-hydroksytiofenol, ble tilsatt for å bringe dens konsentrasjon til 7,5 mM,

iii) 5 ul delmengder av opplsøningen fra foregående (ii) ble tilsatt til respektive 5 ul delmengder av en kalium-ferricyanid <K3Fe(CN)g> oppløsning med konsentrasjoner angitt i figur 5, og dette resulterte i et antall forsøksprøver,

iv) hver av forsøksprøvene fra trinn (iii) i det foregående ble bragt til lysemisjon ved hjelp av prosedyren beskrevet i forbindelse med eksempel 1, det vil si ved tilsetning til salpetersyre, etterfulgt av en behandling med hydrogenperoksyd og etterfølgende alkalisk fosfatbuffer med pH 12,75.

Den samme prosedyre ble gjentatt under anvendelse av en kontroll, hvor det ikke ble tilsatt noe adduktdanner (4-hydroksytiofenol). Resultatene av lysemisjonen fra forsøksprøvene er angitt i figur 5 som lysemisjon i form av prosentvis emisjon fra prøven i sammenligning med emisjonen av den tilsvarende kontrollprøve versus ferricyanid-konsentrasjonen i den oppløsning hvortil den merkede probe ble tilsatt (ferricyanid-konsentrasjonen i de resulterende prøver er da halvdelen av den som er indikert i figur 5).

Som det sees i figur 5 er oksydasjon av adduktdanneren 4-hydroksytiofenol også en meget effektiv måte til å skifte likevekten for avbeskyttelse av den beskyttede merking, og gjenvinning av den ubeskyttede kjemiluminescerende merking. Ved en klinisk assay ville et slikt avbeskyttelsestrinn typisk følge kompleksdannelse mellom den merkede probe og target, før lysemisj onen.

Eksempel 7

Reverserin<g>av addukter ved reaksjon med et tiol- spesifikt reagens

Reverseringen demonstrert i det foregående i eksempel 6 anvendes et ikke-spesifikt oksyderende middel. Her demon-streres bruken av et spesifikt reagens. I dette tilfelle er aldritiol (2,2'-ditiodipyridin) nyttig som et middel for å reversere adduktdannelse, ettersom den beskyttende addukt-danner er en reaktiv primær tiol. Denne reaksjonskomponent innebærer ikke alle muligheter og andre tiolspesifikke reagenser, eller reagenser spesifikke for andre beskyttende adduktdannende nukleofiler kan anvendes. Følgende prosedyre ble anvendt: i) akridiniumester-merket oligonukleotidprobe-oppløsning ble fremstilt ved å tilsette probe til en oppløse av 50 % formamid (volumbasis), 0,2 M PB pH 6,0, ii) oppløsninger av adduktdanneren 2-merkaptoetansulfon-syre ("2MESA"), og oppløsninger av aldritiol, ble hver fremstilt ved 0, 0,1, 1 og 10 mM i den ovennevnte buffer henholdsvis 100 % formamid,

iii) til 100 ul probeoppløsning ble tilsatt 100 ul av adduktoppløsning og 100 ul av aldritiol-oppløsning som indikert i den etterfølgende tabell 3,

iv) prøver fremstilt på denne måte ble inkubert i 5 minutter ved romtemperatur og derettera bragt til lysavgivelse ved tilsetning av 200 yl av 0,4N HNO3med 0,1 % H202, etterfulgt av 200 ul IN NaOH.

Resultatene i tabell 3 i det følgende indikerer at en støkiometrisk reversering foregår ved effektivt å redusere konsentrasjonen av adduktdannere i oppløsning.

EKSEMPEL 8

Nedsatt temperaturfølsomhet med bruk av addukter.

For å illustrere temperaturstabiliteten av beskyttede merkinger i samsvar med oppfinnelsen ble to vandige prøver av følgende oppløsninger fremstilt: "DIBSS blanding" (d.v.s. 45 vekt% diisobutylsulfosuccinat

<"DIBBS"> pluss fosfatbuffer, etylendiamintetraacetat <"EDTA"> og EGTA <etylenglykol-bis-(B-aminoetyl-eter)-

N,N,N',N' -tetraeddiksyre> blanding pH 6,8),

IO<6>rlu av akridinium-fenylester merket 26 basepar ("bp") oligonukleotid.

To DIBSS oppløsninger ble fremstilt med 0 eller 5 mM 4-hydroksytiofenol. 2 ul av probe i 3 % LDS (litiumdodesyl-sulfat) ble tilsatt til 20 pl av hver DIBBS blanding. Hver temperaturpunkt ble gjennomført med en individuell prøve fremstilt som ovenfor. Prøver ble anbragt i et vannbad for 5 minutters inkubasjoner, ved økende forhøyede temperaturer. Lysavgivelse av hver delprøve ble så iversatt under anvendelse av hydrogenperoksyd etterfulgt av salpetersyrebehandling og deretter base. Lysemisjon versus temperatur er avsatt i figur 6 for delprøvene fra de to prøver.

Som det sees i figur 6 frembragte 4-hydroksytiofenolen øyensynlig et addukt av akridiniumesteren som var betraktelig mer stabilt ved forhøyede temperaturer enn selve akridiniumesteren. Beskyttede merkinger i samsvar med den foreliggende oppfinnelse er således særlig fordelaktige når den probe hvortil de er knyttet, er et oligonukleotid og det er ønskelig å anvende forhøyede hybridiseringstemperaturer.

Eksempel 9

Forbedring av signalqjenvinning etter lang hybridisering

Virkningene av å beskytte en merking knyttet til en oligonukleotidprobe, under lagvarige hybridiseringer, skal nå illustreres. I dette eksempel ble tre forsøksoppløsninger fremstilt under anvendelse av den samme blanding som i eksempel 8 uten at noen beskyttende adduktdanner ble tilveiebragt i en prøve, 3-merkaptopropionsyre ble tilveiebragt i en annen prøve, og 4-hydroksytiofenol tilveiebragt i den tredje prøve. Hver av de beskyttende adduktdannere og akridiniumesteren vil da danne de tilsvarende beskyttede merkinger. En delprøve fra hver av de ovenstående oppløsninger ble så hybridisert med den samme targetnukleotidsekvens rRNA ved 60°C i 2,5 time. Hver prøve ble bundet til hydroksyapatitt og supernatanten fjernet som "ikke-binding", bæreren ble vasket en gang med fosfatbuffer og vaskeløsningen tatt var på som "vaskeløsning". Lysemisjon fra bærer, ikke-binding ogvaske-løsning ble målt under anvendelse av lysavgivelsesprosedyren i eksempel 5. Lysemisjonen er vist i tabell 4.

Bemerk at signalet er nesten tre ganger sterkere i prøvene beskyttet med addukter enn i kontrollprøven. Alle forsøk hadde en mengde av merking som kunne gi de samme rlu-verdier.

Resultatene i tabell 4 illustrerer da virkningen av å tilveiebringe en beskyttende gruppe for den oligonukleotid-tilknyttede akridiniumester-merking på oligonukleotid/target-hybridisering, over lengere tidsperiode. Som det kan sees fra tabell 4 tillater beskyttede merkinger i samsvar med den foreliggende oppfinnelse større signalgjenvinning (d.v.s. de frem-viser langsommere merkingsinaktivering) enn den som oppnås med ubeskyttet merking, og tillater følgelig at en target-assay har økt følsomhet. Dette er særlig tilfellet for lengere inkubasjonsperioder (d.v.s. mer enn omtrent 2 timer).

Eksempel 10

Forbedret lagringsstabilitet ved bruk av addukter

Forbedret stabilitet som påvist i de foregående eksempler har mange fordeler. Av særlig interesse er forbedret lagring av en akridiniumester-merket probe. For å illustrere denne forbedrede lagringsstabilitet ble følgende betingelser anvendt. En oppløsning ble fremstilt som følger:

0,IM litiumsuccinat pH 5,2

0,1 % litium alurylsulfat

Akridiniumester-merket DNA-probe

lOmM 3-merkaptopropion-syre (ikke tilstede i kontroll-prøven).

Denne oppløsning ble underkastet assay for kjemiluminescerende aktivitet av merkingen ved tilsetning av 5 ul av en 100 gangers fortynning av oppløsningen til 300 yl av 5 0 % formamid, 0,2M fosfatbuffer pH 6,0 og lysavgivelse ble oppnådd som i eksempel 7 i det foregående. 1 ml delmengder av opp-løsningen ble så frysetørket og de resulterende pelleter inkubert i 1 eller tre døgn ved 45°C. De ble så rekonstituert til det opprinnelige volum og underkastet assay for bibehold-else av kjemiluminescerende aktivitet, anført i det følgende som prosentandel.

Det er klart at en vesentlig grad av forbedret stabilitet oppnås når lagring foretas som adduktet. Den forhøyede temperaturbetingelse som anvendes er en vanlig måte for å bedømme hvor god stabiliteten vil være for lengere perioder ved en lavere temperatur.

Oppsummering av utførelseseksempler

Det kan da fra det foregående sees at en kjemiluminescerende merking kan beskyttes under anvendelse av forskjellige adduktdannere for å fremstille en beskyttet merking, som kan være mindre utsatt for inaktivering, for eksempel ved hydrolyse, med den ubeskyttede merking, på grunn av nærværet et den beskyttende del fra adduktdanneren. Det er også i det foregående vist at i mange tilfeller er reaksjonen av den beskyttende adduktdanner med merkingen en likevektsreaksjon som ofte lett kan reverseres ved hjelp av foranstaltninger som for eksempel fortynning eller oksydasjon av adduktdanneren. I tilfellet med lett reverserbare likevektsreaksjoner av den foregående type innsees det imidlertid at mange andre midler for å forskyve likevekten til gunst for ubeskyttet merking kan tas i betraktning. For eksempel i tilfellet av dannelse av en beskyttet fenylakridinium-merking under anvendelse av addukt-danneren 3-merkaptopropionsyre blir likevekten forskjøvet til gunst for avbeskyttet merking ved tilsetning av N-etyl-maleimid, eller 2,2'-ditiodipyridin. Det vil likevel være klart at forskjellige andre adduktdannere kan velges for å tilføye beskyttende grupper til merkingen, og likeledes for å gjenvinne den nærmere angitte ubeskyttede merking i avhengig-het av den spesielle adduktdanner. Videre vil det innses at den foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å beskytte merkingen som er knyttet til andre spesifikke bindingspartnere enn oligonukleotidprobene. Det prinsippielle konsept for den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe merkinger som enten allerede er knyttet til spesifikke bindingspartnere, eller som kan knyttes til disse, idet disse merkinger har en aktiv del nødvendig for luminescens og som er utsatt for inaktivering, hvor den aktive del er beskyttet ved hjelp av en beskyttende del slik at den aktive del er mindre utsatt for inaktivering enn i den avbeskyttede merking, idet den avbeskyttede, kjemiluminescerende merking kan gjenvinnes typisk etter en foretatt assay.

Den foreliggende oppfinnelse er også anvendbar ved en assay hvori den beskyttende adduktdanner er anordnet knyttet til en spesifikk bindingspartner i assaysystemet i stedet for å være anordnet hovedsakelig i en fri form som i de foregående eksempler. Denne teknikk har den fordel at når en merket spesifikk bindingspartner kompleksdanner med et komplement, som enten i seg selv kan bære den beskyttende adduktdanner eller som ytterligere kan kompleksdanne med en ytterligere komplement som ikke bærer den beskyttende adduktdanner, kan merkingen beskyttes. Dette skyldes faktisk at den lokale konsentrasjon av den beskyttende adduktdanner nær merkingen er høy. Ikke-kompleksdannet merking vil imidlertid ikke bli beskyttet i den samme grad og kan følgelig inaktiveres selektivt.

Den foregående teknikk kan anvendes for eksempel ved en to-seters assay inbefattende totalt 3 spesifikke bindingspartnere. En partner vil bære den beskyttende adduktdanner, mens en annen partner vil være den ubeskyttede merking. Slike assay kan inkludere assay av typen sandwich og typen med sekvensmessig retning. Teknikken har imidlertid også anvendelse for en enkeltsete-assay (som bare inbefatter 2 spesifikke bindingspartnere).

I tillegg til denne teknikk kan assayene være enten homogene eller heterogene. Uansett assaytypen er det underliggende prinsipp at den lokale konsentrasjon av det adduktdannende middel i nærheten av en kjemiluminescerende merking kan endres i forhold til nærværet av den target som skal detekteres.

Som et spesielt eksempel kan assaytypen være et to-seters DNA probeassay hvorved 2 DNA-prober binder til naboseter på et felles polynukleotid-target. Ved et slikt assay kan den kjemiluminescerende merking anbringes på enden av en første probe og det adduktdannende middel kan anbringes på enden av en annen probe, slik at når begge prober binder til en targetnukleotidsekvens vil den beskyttende adduktdanner være proksimal til den kjemiluminescerende merking på den første probe. Den samtidige binding av de to prober til det samme targetnukleotid ville resultere i at konsentrasjonen av det adduktdannende middel da ville øke vesentlig i nærheten av den kjemiluminescerende merking. Slik øket konsentrasjon skulle i sin tur øke stabiliteten av den kompleksdannede kjemiluminescerende merking og gjøre det mulig å skjelne mellom de kompleksdannede og ikke-kompleksdannende former av probene basert på deres relative stabilitet. Etter passende inaktivering av merkingen på den ikke-kompleksdannende kjemiluminescerende probe, som ikke i vesentlig grad påvirker den beskyttende probe, og reversering av adduktet asossiert med den kompleksdannede probe, vil mengden av intakt kjemiluminescerende merking tjene som et mål mengden av det nevnte kompleks og således som et mål på mengden av tilstedeværende target. De grunnleggende trinn ved et slikt assay er som følger: 1. Kompleksdannelse av spesifikke bindingspartnere som inngår i assayet med hverandre, slik den lokale konsentrasjon av beskyttende adduktdanner i nærheten av merkingen i kompleksdannet bindingspartner vil være høy, 2. deretter inaktiveres ubeskyttet merking, for eksempel ved nedbrytning (f.eks. hydrolyse av akridiniumforbindelse),

3. deretter avbeskyttes den beskyttede merking, og

4. deretter detekteres mengden av intakt merking som et mål på tilstedeværende target.

Som illustrert i det foregående kan oppfinnelsen lett anvendes for konstruksjon av homogene assaytyper. Den kan imidlertid også anvendes assosiert til heterogene og homogene assaytyper hvor det er ønskelig ytterligere å skjelne mellom kompleksdannede og ikke-kompleksdannede spesifikke bindingspartnere.

Forkjellige modifikasjoner og endringer ved utførelsesformene av oppfinnelsen beskrevet i det foregående kan innsees av de fagkyndige på området, men oppfinnelsen er ikke begrenset til de utførelsesformer og modifikasjoner som er beskrevet detaljert i det foregående.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en merket spesifikk bindingspartner fra: (i) en spesifikk bindingspartner, og (ii) en kjemiluminescerende merking med en labil aktiv del som underkastes inaktivering til å gi en ikke-kj emiluminescerende form av merkingen, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: (a) knytting av den spesifikke bindingspartner til merkingen og deretter (b) fremstilles et addukt av en beskyttende adduktformer med merkingen slik at den aktive del beskyttes mot inaktivering idet en kjemiluminescerende form av merkingen kan gjenvinnes fra adduktet.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av en merket spesifikk bindingspartner fra: (i) en spesifikk bindingspartner, og (ii) en kjemiluminescerende merking med en labil, aktiv del som kan underkastes inaktivering til å gi■en ikke-kjemiluminescerende form av merkingen, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: (a) knytting av den spesifikke bindingspartner til merkingen, (b) fremstilling av et addukt av en beskyttende adduktdanner med merkingen, idet adduktdanneren tilveiebringer en annen beskyttende del enn H til merkingen, slik at den aktive del beskyttes mot inaktivering, idet en kjemiluminescerende form av merkingen kan gjenvinnes fra adduktet.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at merkingen har formel:

hvori: fenyl- og/eller pyridinringen eventuelt er ytterligere substituert, Y er 0, S eller NH R] _ er et eventuelt substituert hydrokarbon eller H, R4 er en avgående gruppe, Y -C-R4 er en aktiv del som kan underkastes hydrolyse til å gi merkingen og den avgående gruppe,- og er knyttet til orto- eller para-pyridinium-ringstillingene, og hvori den beskyttende adduktdanner er en nukleofil som adderer til pyridiniumkarbonet i a-stilling til den aktive del.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at merkingen er en akridiniumforbindelse med formel:

hvori fenylringen og/eller pyridinringen eventuelt er ytterligere substituert.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at er eventuelt substituert alkyl, alkenyl eller alkynyl.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av en kjemiluminescerende spesifikk bindingspartner fra: (i) en spesifikk bindingspartner, (ii) en kjemiluminescerende merking med formel:

hvori: fenylringene og/eller pyridinringen eventuelt er substituert, Ri = et eventuelt substituert hydrokarbon eller H, Y = 0, S eller N Z = 0, N, halogen, eventuelt substituert S, substituert P, substituert B, eller substituert As, Z -R5 er en avgående gruppe

er en aktiv del som er utsatt for hydrolyse ved C=Y karbonet til å gi en ikke-kjemiluminescerende hydrolysert merking og den avgående gruppe, R5 = eventuelt substituert hydrokarbon eller er fra-værende hvis Z = halogen, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: (a) den spesifikke bindingspartner knyttes til merkingen og deretter, (b) et addukt av en beskyttende adduktdanner med merkingen fremstilles slik at den aktive del beskyttes mot inaktivering og fra dette addukt kan en kjemiluminescerende form av merkingen gjeng-vinnes.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at merkingen har formel:

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 6 eller 7, karakterisert ved at merkingen er knyttet til den spesifikke bindingspartner gjennom R5 .

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at den beskyttende adduktdanner er en nukleofildanner som adderer ved ringens 9-posisjon.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at den beskyttende adduktdanner er valgt fra en primær tiol.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at den beskyttende adduktdanner er valgt fra en primær alkyl- eller aryltiol.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at den beskyttende adduktdanner er valgt fra en primær alkyltiol.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 8 eller 9, karakterisert ved at R5 -Z- er valgt fra eventuelt substituert alkoksy, alkenoksy, alkynoksy eller aryloksy.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav et eller flere av kravene 9 til 12, karakterisert ved at R5 -Z- er eventuelt substituert aryloksy og Rx er eventuelt substituert Ci til C5 alkyl.

15. En beskyttet, kjemiluminescerende merking, nyttig som en merking for en spesifikk bindingspartner, med formel valgt fra:

hvori: fenylringene og pyridinringene eventuelt er ytterligere substituert, og Y = 0, N eller S, R] _ = H eller eventuelt substituert hydrokarbon, R4 er en avgående gruppe som eventuelt er knyttet til den spesifikke bindingspartiner,

er en aktiv del som ved hydrolyse gir en ikke-kj emiluminescerende form av merkingen og den avgående gruppe, M er en annen beskyttende del enn H, 0H eller 00H som kan spaltes til å gi avbeskyttet, kjemiluminescerende merking, og som er valgt slik at den aktive del av den beskyttede merking er mindre utsatt for hydrolyse enn i den avbeskyttede merking.

16. En beskyttet merking som angitt i krav 15, karakterisert ved at R4 er eventuelt substituert fenoksy.

17. En beskyttet merking, nyttig som en merking for en spesifikk bindingspartner, med formel:

hvori fenylringene eventuelt er ytterligere substituert og Ri = H eller eventuelt substituert hydrokarbon, R5 er en avgående gruppe som eventuelt er knyttet til den spesifikke bindingspartner,

er en aktiv del som ved hydrolyse ved karbonylkarbonet gir en ikke-kjemiluminescerende form av merkingen og en avgående gruppe, M er en annen beskyttende del enn H, OH eller peroksyd som kan spaltes til å gi avbeskyttet, kjemiluminescerende merking, og som er valgt slik at karbonylkarbonet av den beskyttede merking er mindre utsatt for hydrolyse enn i den avbeskyttede merking.

18. En beskyttet merking som angitt i krav 17, karakterisert ved at den avbeskyttede merking vil luminescere i vandig oppløsning etter reaksjon med hydrogenperoksyd eller oksygen, og hydroksyd.

19. En beksyttet merking som angitt i krav 18, karakterisert ved at R5 er en eventuelt substituert aryldel og R] _ er en eventuelt substituert alkyl-, alkenyl- eller alkynyl-del.

20. En beskyttet merking som angitt i krav 18, karakterisert ved at M er en primær tiol.

21. En beskyttet merking som angitt i krav 18, karakterisert ved at de eventuelle substituenter på de to fenylgrupper er valgt fra amino, substituert amino, karbonyl, hydroksyl, alkoksyl, nitro eller halogenid-substituenter.

22. En beskyttet merking som angitt i krav 17, 18 eller 19, karakterisert ved at R]_ er C- til C^ q alkyl og de to fenylgruppene er usubstituert.

23. En merket spesifikk bindingspartner omfattende: (a) en spesifikk bindingspartner. (b) en beskyttet merking knyttet til den spesifikke bindingspartner, idet merkingen har formel:

hvori fenyl- og pyridinringene eventuelt er ytterligere substituert, og Y = 0, N eller S, R] _=H eller eventuelt substituert hydrokarbon, R4 er en avgående gruppe som eventuelt er knyttet til den spesifikke bindingspartner,

er en aktiv del som ved hydrolyse ved C=Y karbonet gir en ikke-kjemiluminescerende form av merkingen og den avgående gruppe, M er en beskyttende del enn H, OH eller peroksyd, som kan spaltes til å gi avbeskyttet, kjemiluminescerende merking, og som er valgt slik at C=Y karbonet av den beskyttede merking er mindre utsatt for hydrolyse enn i den avbeskyttede merking.

24. En merket spesifikk bindingspartner omfattende:' (a) en spesifikk bindingspartner (b) en beskyttet merking knyttet til den spesifikke bindingspartner, idet merkingen har formel:

hvori fenylringene er eventuelt ytterligere substituert, og R^ = H eller et eventuelt substituert hydrokarbon,-O-R5 er en avgående gruppe hvori R5 eventuelt er knyttet til den spesifikke bindingspartner,

er en aktiv del som ved hydrolyse av karbonylkarbonet gir en ikke-kjemiluminescerende form av merkingen, og den avgående gruppe, M er en annet beskyttende gruppe enn H, OH eller peroksyd, som kan spaltes til å gi avbeskyttet, kjemiluminescerende merking, og som er valgt slik at karbonylkarbonet av den beskyttede merking er mindre utsatt for hydorlyse enn i den avbeskyttende merking.

25. En merket spesifkkk bindingspartner som angitt i krav 22, 23 eller 24 hvori den avbeskyttede merking vil luminescere i vandig oppløsning etter reaksjon med hydrogenperoksyd eller oksygen, og hydroksyd.

26. En merket spesifikk bindingspartner som angitt i krav 24, karakterisert ved at R5 er en eventuelt substituert aryldel, og Ri er eventuelt substituert alkyl, alkenyl eller alkynyl.

27. En merket spesifikk bindingspartner som angitt i krav 26, karakterisert ved at M er en primær tiol.

28. En merket spesifkk bindingspartner som angitt i krav 26, karakterisert ved at de eventuelle substituenter på de to fenylgrupper er valgt fra amino substituert amino, karbonyl, hydroksyl, alkoksyl, nitro eller halogenid-substituenter.

30. En merket spesifikk bindingspartner som angitt i krav 25, 26 eller 27, karakterisert ved R] _ foretrukket er c1 til C^ q alkyl og de to fenylgrupper er usubstituert.

31. Fremgangsmåte for å gjennomføre en assay for et target i en testprøve under anvendelse av en spesifikk bindingspartner som er merket med en ikke-kjemiluminescerende beskyttet form av en kjemiluminescerende merking idet den beskyttede form har: (i) en labil, aktiv del som er utsatt for inaktivering til å gi en ikke-luminescerende form av merkingen, og (ii) en beskyttende del som beskytter den aktive del mot inaktivering, idet den beskyttende del kan spaltes til å gi ubeskyttet, kjemiluminescerende merking, idet fremgangsmåte omfatter: (a) gjennomføring av assayet, (b) avbeskyttelse av den beskyttede merking ved avspalting av den beskyttede del derfra, slik at det gjenvinnes ubeskyttet, kjemiluminescerende merking.

32. Fremgangsmåte som angitt i krav 31, karakterisert ved at den beskyttende del kan spaltes ved oksydasjon.

33. Fremgangsmåte som angitt i krav 31, karakterisert ved at den beskyttede del kan spaltes ved oksydasjon med ferricyanid.