NO913965L - Fremgangsmaate for reduksjon av en tetrazoliumforbindelse og anvendelse av fremgangsmaaten ved analyse av albumin og andre reduserende midler - Google Patents

Description

ANALYSER SOM ANVENDER INTERAKSJON ALBUMIN-TETRAZOLIUM

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en forbedret fremgangsmåte for reduksjon av tetrazoliumforbindelser til fargede formazaner og anvendelse av denne fremgangsmåte ved analyser (dvs. deteksjon og/eller kvantitativ analyse) av analytter, spesielt albumin.

Tetrazoliumsalter inneholder den kationiske tetrazoliumkjerne: som åpnes ved reduksjon til å frembringe et formazan inneholdende den ringåpnede gruppe: Dannelsen av et formazan vil frembringe en fargeendring, ettersom formazangruppen er en sterkt farget kromofor, og tetrazoliumsaltene er ofte fargeløse. Nærværet og/eller mengden av formazan som frembringes kan derfor fordelaktig detekteres visuelt eller kolorimetrisk, f.eks. ved å iaktta endringen i absorbens i området mellom 505 og 660 nm, særlig omtrent 59 0 nm.

Generelt kan svake reduksjonsmidler bare redusere tetrazodium-salter til formazaner i nærvær av det proteinholdige materiale. Denne fargeendring ved reduksjon kan anvendes ved analysemetoder som f.eks. beskrevet i WO88/08882.

Albumin er et protein, i en form med en relativ molekylmasse på 67000 og bestående av en enkelt kjede med 584 aminosyrer. Det er tilstede i human serum ved en høyere konsentrasjon enn noe annet enkelt protein. De primære funksjoner av albumin i serum inkluderer opprettholdelse av osmotisk trykk og virkning som et bærerprotein for metabolitter som bilirubin, fettsyrer, uorganiske forbindelser som kalsiumforbindelser, hormoner og mange medisiner og kan også tilveiebringe en kilde for aminosyrer.

Av mange grunner blir albumin ofte i det kliniske biokjemi-laboratoriet analysert. Det anvendes f.eks. som en indikator på leversykdom, det er en vesentlig faktor ved albuminerstat-ningsterapi, det kan videre indikere nivåer av ubundet (ukonjugert) bilirubin, det kan indikere tilfeller av myelom og kan anvendes innen ernæringsmessige behandlingsopplegg (Whicher og Spencer, Ann. Clin. Biochem. 24 572 (1987)).

Det er flere kjente metoder for kvantitativ måling av serum-albumin. Det kan måles ved elektroforese, eller ved hjelp av immunologiske metoder. En av de mest vanlig anvendte metoder er imidlertid basert på fargestoffbinding under anvendelse av enten bromkresolgrønt (BCG) (Rodkey, F.L., Clin Chem. 11 478

(1965)) eller bromkresolpurur (BCP) (Louderback, A., Mealey, E.H.,&Taylor, N.A. Clin. Chem. 14 793 (1968)). Bromkresol-grønt-metoder gir lave gjengivelser ved høye albuminkonsentrasjoner og høye gjengivelser ved lave albuminkonsentrasjoner (Webster, D. Bignell, A.H.C. & Atwood, E.C., Clin. Chim. Acta. 53 101 (1974)), og er generelt ikke spesifikke (Slater, L., Carter, P.M.&Hobbs, J.R., Ann. Chim. Biochim. 12 33 (1975)). Metoder basert på bromkresolpurpur er generelt mere spesifikke (Pinell, A.E.&Northam, B.E., Clin. Chem. 24 80 (1978)). Bromkresolpurpur har imidlertid ikke albumin-interspecies-spesifisitet. Mange kalibratorer inneholder enten albumin-standarder av storfe eller hester som gir en absorbens for langt under absorbensen av humant albumin til at de kan være av verdi. Heparin er videre angitt å forstyrre (Perry, B.W. & Douman, B.T. Clin.Chem. 25 1520 (1979)), og dette utelukker bruk av heparinisert blod. Bilirubin er også antatt å forstyrre. En fremgangsmåte basert på dannelse av et farget produkt i respons til nærvær og konsentrasjon av albumin og som ikke lider av forstyrrelser fra andre komponenter som kan være tilstede i prøven ville derfor være av stor praktisk nytte. Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en ny fremgangsmåte som ikke lider av de beskrevne ulemper og som kan anvendes for kvantitering av albumin ved hjelp av en prosedyre som utvikler et farget produkt. Andre formål og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse.

I henhold til et første aspekt av den foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for reduksjon av en tetrazoliumforbindelse inneholdende den kationiske kjerne: for fremstilling av en ringåpnet formazanforbindelse inneholdende gruppen:

karakterisert vedtrinnet med å bevirke at tetrazoliumforbindelsen reagerer med albumin og tetrazoliumforbindelse - albumininteraksjonsproduktet reduseres med et reduksjonsmiddel i en vandig løsning ved pH mellom 6 og 10.

Oppfinnelsen beror på den uventede erkjennelse at selv om svake reduksjonsmidler bare kan redusere mange tetrazoliumsalter ved pH over 10 og i fravær av albumin, blir reduksjonen av tetrazoliumsalter ved det lavere pH-område i samsvar med oppfinnelsen vesentlig påskyndet ved interaksjon med albumin. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er særlig anvendelig for reduksjon av leukoformen av 2-(2'-benzotiazolyl)-5-styryl-3-(4<1->ftalhydrazidyl)tetrazolium, (forkortet heri til "BSPT"), særlig hydrokloridet.

BSPT inneholder tetrazoliumkationet:

Interaksjonen mellom tetrazoliumsaltet og albuminet er av en type som resulterer i økning, påskynding eller katalyse av reduksjonen av tetrazoliumsaltet til det fargede farmazan-fargestoff. Selv om den nøyaktige natur av interaksjonen mellom tetrazoliumsaltet og albuminet ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ikke er fullstendig forstått antas det at interaksjonen kan involvere dannelse av en kompleks mellom saltet og albuminet. Interaksjonen og/eller kompleks-dannelsen kan resultere fra dannelse av substituentgrupper på tetrazoliumkjernen. Etter som fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen kan være spesielt anvendbar for tetrazoliumsalter hvori kjernen er substituert med en eller flere av substituentene tilstede i BSPT, nemlig benzotiazolyl, styryl eller ftalhydrazidylgrypper som selv kan bære substituent(r) på deres ringsystemer, eller en kombinasjon av slike grupper.

Mange reduksjonsmidler er egnet for bruk ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, men foretrukket anvendes et svakt reduksjonsmiddel. Eksempler på midler som er funnet brukbare inkluderer ditiotreitol ("DTT"), merkaptoetanol og p-merkaptoetanol, cystein, nikotinamidadenindinukleotid og aminofenol. Et særlig foretrukket reduksjonsmiddel er NADH (redusert form av nikotinamidadenindinukleotid).

En elektronbærer kan anvendes i reaksjonsmediet for fremgangsmåten for å øke hastigheten av elektronoverføringen mellom reduksjonsmidlet og tetrazoliumsaltet. En foretrukket elektronbærer er et fenaziniumsalt, dvs. forbindelser inneholdende den kationiske kjerne: hviri R er hydrogen eller alkyl. Et foretrukket fenazoinium-salt er metoksy-N-metylfenazinium-metylsulfat ("MPMS"), dvs.

selv om andre egnede men mindre foretrukne fenaziniumsalter inkluderer fenaziniummetosulfat ("PMS") og fenaziniumetosulfat

("PES").

En hvilken som helst buffer som er i stand til å opprettholde pH mellom 6 og 10 kan anvendes idet en foretrukket buffer er trishydroksymetylaminometan HC1 ("Tris-HCl"). En foretrukket pH i oppløsningen er 8,5.

Det foretrekkes også å inkludere et overflateaktivt middel i reaksjonsoppløsningen ved fremgangsmåten ettersom dette fremmer oppløseliggjøringen av det dannede formazan. Et foretrukket overflateaktivt middel er et ikke-ionisk overflateaktivt middel særlig en polyoksyetylen-sorbitolester, spesielt "Tween" 80.

Reduksjonsgraden av tetrazoliumforbindelsen og etterfølgende dannelse av formazanet er kvantitativt relatert til mengden av albumin og/eller reduksjonsmiddel tilstede i reaksjonsopp-løsningen og når en av disse to er den begrensende faktor ved reaksjonen, dvs. alle de andre reaksjonskomponenter er tilstede i overskudd, kan derfor fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen anvendes som basis for analyse for albumin eller reduksj onsmidler.

Ved et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer denne en fremgangsmåte for analyse av humant eller mammalt albumin i en prøve ved å omsette et tetrazoliumsalt som er istand til interaksjon med albumin, med et reduksjonsmiddel for å frembringe et formazan i en vandig oppløsning ved pH mellom 6 og 10 i nærvær av prøven, og relatere nærvær og/eller mengden av fremstilt formazan til nærvær og/eller mengde av albumin i prøven.

Selv om andre tetrazoliumsalter som bare kan reduseres signifikant (i løpet av en tidsperiode som r aksepterbar ved klinisk analyse) ved hjelp av svake reduksjonsmidler i pH området 6 til 10 etter interaksjon med albumin kan anvendes, er foretrukne tetrazoliumsalter salter av BSPT, særlig hydrokloridet, eller andre tetrazoliumsalter hvori kjernen er substituert med en eller flere av substituentene til stede i BSPT som nevnt i det foregående, som selv kan bære substituenter på deres ringsystemer eller en kombinasjon av slike grupper.

Fremgangsmåten for analyse av albumin er egnet for bruk ved en hvilken som helst prøve som antas å inneholde albumin betinget av at minst en andel av mulig albumin inneholdt deri kan oppløses til å danne den nødvendige vandige oppløsning hvis oppløsningen ikke allerede omfatter en vandig oppløsning. Fremgangsmåten er derfor mest egnet for analyse av vandige prøver som antas å inneholde albumin, spesielt biologiske prøver som kroppsvæsker, og spesielt blodserum, som kan anvendes direkte uten noen forbehandling, eller urin etc.

Ved gjennomføring av analysefremgangsmåten er det ønskelig at mengden av tetrazoliumsalt og reduksjonsmiddel tilstede i reaksjonsblandingen bør være i overskudd utover de mengder som ventes å interagere med albuminet i prøven slik at mengden av tilstedeværende albumin er den begrensende faktor.

Egnede og foretrukne reaksjonsbetingelser og reagenser for albuminanalysefremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen er som drøftet i det foregående med henvisning til det første aspekt av oppfinnelsen, dvs. valget av reduksjonsmiddel, bruken av en elektronbærer, buffere og pH, og bruk av et overflateaktivt middel, etc. Disse parametere er oppsummert i den etter-følgende tabell i.

Under disse betingelser foregår reduksjon av tetrazoliumsaltet hurtig nok til at analysen kan gjennomføres i løpet av noen få minutter som er en tidsskala passende for klinisk bruk.

Fremgangsmåten er sensitiv for albuminnivåer lavere enn dem som har klinisk signifikans og den kolorimetriske analyse har et lineært forhold med initiale albuminnivåer opp til omtrent 10 0 mg/ml i en opprinnelig serumprøve. Serum i seg selv absorberer ikke signifikant over det bølgelengdeområdet som anvendes for målinger og en blindprøve er derfor ikke vanlig nødvendig. Fremgangsmåten synes å være spesifikk for albumin, krever ingen forbehandling av en serumprøve og er ikke særlig utsatt for forstyrrelser. Fremgangsmåten for å anslå albumin i samsvar med oppfinnelsen vil ha mange anvendelser, men vil være særlig nyttig hvis en hurtig og rutinemessig analyse-metode er nødvendig, særlig på området klinisk kjemi. Andre anvendelser kan inkludere kvalitetskontroll målinger ved albuminfremstilling, bedømmelse av albumininnhold i andre blodprodukter og strukturundersøkelser av albumin.

Ved et tredje aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer denne fremgangsmåte for analyse av reduksjonsmidler i en prøve som omfatter at en tetrazoliumsalt som er istand til interaksjon med albumin, omsettes med prøven i nærvær av albumin i en vandig oppløsning ved pH mellom 6 og 10 og nærværet og/eller mengden av formazan som frembringes relateres til nærvær og/eller mengde av reduksjonsmiddel i prøven, idet mengden av tetrazoliumsalt som anvendes er i overskudd utover den mengde som ventes å bli redusert med reduksjonsmidlet i prøven.

Egnede og foretrukne reaksjonsbetingelser og reagenser for denne fremgangsmåte for analyse av reduksjonsmidler er som drøftet i det foregående med henvisning til det første og annet aspekt, nemlig valget av tetrazoliumsalt, bruk av en elektronbærer, buffere og pH, og bruk av et overflateaktivt middel etc. Det er ønskelig å ordne det slik at parameterne i reaksjonsoppløsningen ved fremgangsmåten er innenfor de områder som er gjengitt i tabell 1 hvis den omtrentlige konsentrasjon av reduksjonsmiddel i prøven kan aproksimeres på forhånd. En albuminkonsentrasjon på opp til 100 mg/ml synes å være egnet.

Denne fremgangsmåte for analyse av reduksjonsmidler kan anvendes for analyse av mange forskjellige kjemiske reduksjonsmidler. Den er særlig egnet for analyse av reduksjonsmidler som er av biokjemisk klinisk eller diagnostisk betydning, som aminofenoler, NADH eller ko-enzym A (CO-A) og ved anvendelse av denne metode kan de analyseres i prøver av kroppsvæsker som serum, urin, etc.

Som en ytterligere modifisering kan fremgangsmåten for analyse av reduksjonsmidlene anvendes for analyse av forbindelser som kan delta i en kjemisk reaksjon hvori et reduksjonsmiddel dannes og som kan analyseres ved hjelp av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen og relateres til nærvær og/eller mengde av forbindelse.

Ved en slik reaksjon kan forbindelsen som skal analyseres i seg selv omdannes til reduksjonsmidlet. F.eks. kan den aktive forbindelse paracetamol (p-hydroksyacetanilid) kvantitativt omdannes til reduksjonsmidlet para-aminofenol under anvendelse av f.eks. et arylacylamidase-enzym ved en velkjent reaksjon. Den dannede para-aminofenol kan så analyseres og relateres til mengden av paracetamol.

Alternativt kan ved en slik reaksjon en eller flere av de andre deltagende reagenser enn forbindelsen omdannes til et reduksjonsmiddel i en mengde relatert til mengden av tilstedeværende forbindelse.

F.eks. kan de antibiotiske midler kloramfenicol og tiamfeni-col, eller gentaminciner acetyleres i en reaksjon hvori acetyl Co-A anvendes som et acetylerende middel og som deretter omdannes til Co-A. Slike reaksjoner foregår lettere under innvirkning av enzymene kloramfenikol acetyltransferase ("CAT") henholdsvis gentanicinacetyltransferase ("GAT"). I hver tilfelle kan nærvær og/eller menge av Co-A som fremstilles kvantitativt relateres til nærvær og/eller mengde av antibiotisk middel.

Disse analysefremgangsmåter i samsvar med oppfinnelsen kan gjennomføres enten manuelt eller automatisk på en rekke måter. F.eks. kan det tildannes en vandig oppløsning inneholdende i det minste prøven, tetrazoliumsaltet og reduksjonsmidlet eller albumin som passende ved den indikerte pH, eventuelt også inneholdende de andre reagenser som er omhandlet i det foregående, og inkubering derav ved en passende temperatur. Fargen som blir frembringes blir så detektert og f.eks. sammenlignet med en standard eller målt kolorimetrisk. Selv om reaksjonsoppløsningen er vandig kan det være nødvendig å inkludere ytterligere vannblandbare løsningsmidler for å fremme oppløsningen av alle reagensene, spesielt tetrazolium saltet. Et foretrukket eksempel på et slik løsningsmiddel er dimetylformamid ("DMF"). Når fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen utgjøres på denne måte synes rekkefølgen hvormed reagensene og prøven blandes ikke å være kritisk.

Alternativt kan passende reagenser som tetrazoliumsalter, reduksjonsmiddel eller albumin som det passer, buffere, etc. immobiliseres på en fast bærer ved f.eks. impregnering, adsorpsjon eller absorpsjon. Eksponering for en oppløsnings-prøve inneholdende albumin eller reduksjonsmiddel etter behov vil da bevirke en fargeendring i bæreren som kan detekteres.

For å gjennomføre analysefremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen passende for laboratoriebruk og klinisk bruk tilveiebringer oppfinnelsen også et analysesett som inkluderer i kombinasjon en eller flere ferdigfremstilte reagenser som beskrevet i det foregående for gjennomføring av fremgangsmåten. F.eks. kan et sett omfatte separate oppløsninger inneholdende henholdsvis tetrazoliumsaltet som er istand til interaksjon med albuminet, buffer og reduksjonsmiddel eller albumin som passende, ved konsentrasjoner egnet for å gjøre dem istand lett anvendelse ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, eventuelt sammen med de andre reagenser, f.eks. overflateaktivt middel, elektronbærer som er omhandlet i det foregående. Et slikt sett kan alternativt omfatte et fast substrat med passende reagenser immobilisert derpå. Settet kan også inkludere standarder og instruksjoner som kan inkludere et fargesammenligningskart. I et slikt testsett er reagensene blitt funnet å være stabile ved lagring i minst 3 0 døgn, men det er ønskelig å tildanne oppløsningen av tetrazoliumsaltet i en sur oppløsning, f.eks. 0,01 til 0,2M salt-syre, eplesyre eller spesielt sitronsyre, ved pH 3 - 6 for stabilitet ved langtidslagring. Fremgangsmåte for fremstilling av slike sett som muliggjør fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen vil være klar for fagfolk på området.

Eksempler som illustrerer oppfinnelsen skal nå beskrives med henvisning til: Fig. 1 som viser det hyperkromiske skift ved reduksjon av

et BSPT-albumin interaksjonsprodukt

Fig. 2 som viser absorbens ved 590 nm versus albuminkon sentrasjon for fremgangsmåten i eks. 1 Fig. 3 som viser stabiliteten av reagensene ved lagring Fig. 4 som viser sammenligning mellom fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen og en konvensjonell metode som anvendes manuelt Fig. 5 som viser sammenligning mellom fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen og en konvensjonell metode anvendt på et automatisert apparat Fig. 6 som viser sammenligning mellom fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen og en konvensjonell immunologisk metode Fig. 7 som viser absorbens versus Co-A konsentrasjon Fig. 8 som viser absorbens versus paracetamolkonsentrasjon

og

Fig. 9 som viser absorbens versus kloramfenikolkonsentra-sjon.

EKSEMPEL 1. DIAGNOSTISK SETT FOR ALBUMIN ( I)

REAGENSER

Reagens A:

Utgangsoppløsning av tetrazoliumsalt:

(i) BSPT-hydroklorid: 10 mg opplost i 10,5 ml dimetylformamid

(ii) 9,4 ml 12 mmol/L sitronsyre.

arbeidsoppløsning av tetrazoliumsalt:

et 18 ml volum av utgangsoppløsningen fortynnes ved tilsetning av 76 ml 12 mmol/L sitronsyre, 4 ml 15 % (vekt/ volum) "Tween" 80 og 2 ml lmml/L MPMS.

Reagens B:

20mmol/L tris HCl, pH 8,5

Reagens C:

5mmol/L nikotinamidadenin-dinukletid (redusert form).

FREMGANGSMÅTE

1. Til 0,5 ml reagens A tilsettes 0,5 ml reagens B og

40 yl reagens C.

2. Blandingen ekvilibreres i 3 min. ved romtemperatur.

3. 50 ul prøve tilsettes og blandingen blandes godt.

4. Absorbens ved 590nm avleses etter 1 min.

Resultatene for A590nm gitt for forskjellige initiale konsentrasjoner av albumin er gitt i kalibreringskurven i fig. 2. Den frembragte farge er stabil i minst en time.

EKSEMPEL 2 DIAGNOSESETT FOR ALBUMIN ( II)

REAGENSER

Reagens A:

12,0 mmol/L sitronsyre

0,18 mmol/LBSPT hydroklorid

0. 5 mmol/L MPMS

Reagens B:

200 mmol/L tris HCl, pH 8,5

35 % volum/volum "Tween" - 80

Reagens C:

2,5 mmol/L NADH

FREMGANGSMÅTE

1. Det fremstilles et arbeidsreagens ved å blande 5 0 ml reagens A, 5 0 ml reagens B og 4,0 ml reagens C.

Denne blanding er stabil i minst 12 timer.

2. Til 1,0 ml arbeidsreagens tilsettes 5ul serum (eller en prøve inneholdende albumin). Absorbens avleses ved 59 0 nm mot en reagensblindprøve etter 1 min.

Reagensene A, B og C som fremstilt og lagret separat er stabile i minimum 30 døgn som påvist i fig. 3 ved stabilieten av absorpsjonen ved 590nm som skriver seg fra tilsetning av forskjellige albuminkonsentrasjoner til et arbeidsreagens fremstilt fra reagenser lagret i de angitte perioder.

EKSEMPEL 3. ALBUMINANALYSE MED ANDRE REDUKSJONSMIDLER

Tabell 2 i det følgende viser bruken av andre reduksjonsmidler enn NADH ved indikerte konsentrasjoner. Området av albuminkonsentrasjoner hvorover forholdet mellom formazanfremstilling og albuminkonsentrasjoner er lineært er også vist, med NADH anvendt som en sammenligningsstandard. I hvert tilfelle var tetrazoliumsaltet BSPT hydroklorid.

EKSEMPEL 4 FORSTYRRELSER VED ALBUMINANALYSE

Forstyrrelser med albuminanalyser under anvendelse av settet i eks. 1 eller 2 ble undersøkt ved sammenligning av testprøver inneholdende forskjellige potensielle forstyrrende materialer. Resultatene er angitt i tabell 3.

Som vist i det foregående ga ingen av blodbestanddelene noen forstyrrelse. De undersøkte konsentrasjoner var over de normale områder som finnes i blodet. Heparin ble tilsatt blodet for å stanse koagulasjon ved en konsentrasjon på 6,7 enheter/ml.

Den eneste merkbare forstyrrelse ble oppnådd med urea.

EKSEMPEL 5 KORRELASJON MED " KONVENSJONELLE" ALBUMINANALYSE-METODER

BSPT-metoden med albuminbestemmelse ble sammenlignet med andre metoder som vanlig anvendes i sykehus. Disse var en farge-bindende metode basert på bromkresolgrønt (BCG) og en immunologisk metode. Totalt 71 patologiske serumprøver ble testet manuelt under anvendelse av BSPT-metoden og sammenlignet med en automatisert BCG-metode. I disse prøver varierte mengden av albumin mellom omtrent 15 og 60 mg/ml. Disse data ble så statistisk analysert for å gi en regresjons-ligning med Y = 9,268 + 0,7X, som indikerte en god korrelasjon mellom BSPT og BCG-metodene. Disse data relaterer til bruk av BSPT og BCG-metodene manuelt og resultatene er vist i fig. 4.

Metodene anvendt i det foregående (BSPT og BCG) kan også anvendes i automatiserte instrumenter. Lignende analyser ble gjennomført under anvendelse av BSPT og BCG-metoder som automatiserte prosedyrer på "Multistat III plus" og resultatene er illustrert i fig. 5.

BSPT-metoden korrelerer også godt med den immunologiske teknikk som vist i fig. 6 (resultater er ikke vist).

EKSEMPEL 6. ANALYSE AV KOENZYM- A

En oppløsning ble fremstilt inneholdende BSPT-hydroklorid, albumin, MPMS, Tris-HCl buffer og "Tween"-80 ved konsentrasjoner i området indikert i tabell 1. Til delprøver derav ble tilsatt Co-A over konsentrasjonsområdet 0,25 mM av Co-A endelig konsentrasjon. Fig. 7 viser at over dette området var absorbens ved 590 nm lineært reletert til Co-A konsentra-sj onen.

EKSEMPEL 7. ANALYSE AV PARASETAMOL

Parasetamol ble kvantitativt fjernet under dannelse av p-aminofenol under anvendelse av enzymet arylacylamidase ved en kjent reaksjon. En oppløsning ble fremstilt inneholdende BSPT hydroklorid, albumin. MPMS, Tris-HCl buffer og "Tween" 80 ved konsentrasjoner i områdene angitt i tabell 1. Til delprøver derav ble det tilsatt p-aminofenol. Grafen av 4-aminofenol-konsentrasjon mot absorbens ved 590 nm viser en absorbensendring opp til en konsentrasjon på 3,0 mM endelig konsentrasjon av p-aminofenol. Dette kunne relateres til parasetamolkonsentrasjon versus absorbens ved 590 nm som viste et godt lineært forhold opp til en konsentrasjon på 2,0 mM som vist i fig. 8.

EKSEMPEL 8. ANALYSE AV KLORAMFENIKOL

Kloramfenikol ble acetylisert under anvendelse av acetyl Co-A og enzymet CAT ved en kjent reaksjon. Dette resulterte i dannelse av en mengde Co-A som ble kvantitativt relatert til mengden av kloramfenikol opprinnelig tilstede. Det Co-A som ble fremstilt ble analysert under anvendelse av prosedyren i eks. 6. Absorbens ved 590 nm mot kloramfenikol-konsentrasjon var lineær over kloramfenikol-området 10 - 200 um som vist i fig. 9.

Claims (24)

1. Fremgangsmåte for reduksjon av en tetrazoliumforbindelse som inneholder den kationiske kjerne:

for å tildanne en ringåpnet formazanforbindelse inneholdende gruppen:

karakterisert ved at tetrazoliumforbindelsen bringes til interaksjon med albumin og tetrazoliumforbindelse-albumininteraksjonsproduktet reduseres med et reduksjonsmiddel i en vandig løsning ved pH mellom 6 og 10.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at kjernen er substituert med en eller flere substituentgrupper valgt fra benzotiazolyl, styryl eller ftalhydrazidyl, idet gruppene selv kan bære substituenter på sine ringsystemer, eller en kombinasjon av slike grupper.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at tetrazoliumforbindelsen er et salt av leukoformen av 2-(2'-benzotiazolyl)-5-styryl-3-(4'-ftalhydrazidyl)tetrazolium, ("BSPT").

4. Fremgangsmåte for analyse av humant eller mammalt albumin i en prøve, karakterisert ved å omsette et tetrazoliumsalt som er istand til interaksjon med albumin, med et reduksjonsmiddel for å danne et formazan i en vandig løsning ved pH mellom 6 og 10 i nærvær av prøven, og relatering av nærværet og/eller mengden av dannet formazan med nærvær og/eller mengde av albumin i prøven.

5. Fremgangsmåte for analyse av reduksjonsmidler i en prøve, karakterisert ved å omsette et tetrazoliumsalt som er istand til interaksjon med albumin, med prøven i nærvær av albumin i en vandig oppløsning ved pH mellom 6 og 10 og relatering av nærvær og/eller mengde av fremstilt formazan med nærvær og/eller mengde av reduksjonsmiddel i prøven, idet den mengde tetrazoliumsalt som anvendes er i overskudd utover den mengde som forventes å bli redusert av reduksjonsmidlet i prøven.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at reduksjonsmidlet er aminofenol, NADH eller koenzym-A.

7. Fremgangsmåte for analyse av en forbindelse som deltar ved en kjemisk reaksjon hvori et reduksjonsmiddel dannes, karakterisert ved at det dannede reduksjonsmiddel analyseres under anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i krav 5 og relateres så kvantitativt til nærvær og/eller mengde av forbindelsen.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at forbindelsen som skal analyseres i seg selv omdannes til reduksjonsmiddel.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at forbindelsen som analyseres er paracetamol (p-hydroksyacetanilid) som omdannes til reduksjonsmidlet p-aminofenol.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at en eller flere av de andre deltagende reagenser enn den forbindelse som skal analyseres omdannes til reduksjonsmidlet.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at forbindelsen som analyseres er kloramfenikol eller tiamfenikol eller et gentamicin, som acetyleres ved en reaksjon acetyl Co-A deltar og omdannes til reduksjonsmidlet Co-A.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at reduksjonsmidlet er NADH.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at reduksjonsmidlet er ditiotreitol, merkaptoetanol, cystein eller aminofenol.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at konsentrasjonen av tetrazoliumsalt er i området 10uM til lOOuM og at konsentrasjonen av reduksjonsmidlet er luM til lOOmM.

15. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 4 - 14, karakterisert ved at tetrazoliumsaltet er et salt med en kjerne substituert med en eller flere substituentgrupper valgt fra benzotiazolyl, styryl eller ftalhydrazidyl, idet gruppene selv kan bære substituenter på sine ringsystemer, eller en kombinasjon av slike grupper.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 15, karakterisert ved at tetrazoliumsaltet er et salt av BSPT.

17. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 4 - 14, karakterisert ved at albuminet, reduksjonsmidlet eller forbindelsen (som det passer) som skal analyseres er inneholdt i en kroppsvæske.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at kroppsvæsken er blodserum.

19. Fremgangsmåte som angitt i ett eller flere av kravene 4-14, karakterisert ved at tetrazoliumsaltet, reduksjonsmidlet eller albumin (som det passer) og en pH-buffer immobiliseres på en fast bærer som utsettes for en oppløsningsprøve inneholdende albumin eller reduksjonsmiddel (som det passer).

20. Et fast substrat, karakterisert ved at det er immobilisert derpå et tetrazoliumsalt, reduksjonsmiddel eller albumin (som det passer) og en pH-buffer og som er egnet for anvendelse ved en fremgangsmåte som angitt i krav 19.

21. Analysesett for analyse av albumin under anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at det i kombinasjon inkluderes separate oppløsninger inneholdende (i) et tetrazoliumsalt istand til interaksjon med albumin, (ii) en pH-bufferoppløsning og (iii) et reduksjonsmiddel.

22. Analysesett som angitt i krav 21, karakterisert ved at tetrazoliumsaltet er et salt med en kjerne som er substituert med en eller flere substituentgrupper valgt fra benzotiazolyl, styryl eller ftalhydrazidyl idet gruppene i seg selv kan bære substituenter på sine ringsystemer, eller en kombinasjon av slike grupper.

23. Analysesett som angitt i krav 22, karakterisert ved at tetrazoliumsaltet er et salt av BSPT.

24. Analysesett for analyse av et reduksjonsmiddel eller en forbindelse (som det passer) under anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i krav 5 eller 7, karakterisert ved at det inkluderer i kombinasjon separate oppløsninger inneholdende (i) et tetrazoliumsalt istand til å interagere med albumin (ii) en bufferoppløsning og (iii) albumin.