JPH0734757B2 - グルコースの定量のための分析法、分析用試薬組成物及びその使用 - Google Patents
グルコースの定量のための分析法、分析用試薬組成物及びその使用Info
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- JPH0734757B2 JPH0734757B2 JP2507031A JP50703190A JPH0734757B2 JP H0734757 B2 JPH0734757 B2 JP H0734757B2 JP 2507031 A JP2507031 A JP 2507031A JP 50703190 A JP50703190 A JP 50703190A JP H0734757 B2 JPH0734757 B2 JP H0734757B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はグルコースの定量、更に詳しくは未希釈全血中
の総グルコースの定量に関する。本発明は分析法、分析
用試薬組成物及びその試薬組成物の使用に関する。
の総グルコースの定量に関する。本発明は分析法、分析
用試薬組成物及びその試薬組成物の使用に関する。
臨床化学において日常的に行われる重要な分析は血中グ
ルコースの定量である。このタイプの分析は真性糖尿病
の診断と治療に、また多数の代謝障害の診断に用いられ
る。全血中のグルコースを定量する方法として幾つかの
方法が知られている。
ルコースの定量である。このタイプの分析は真性糖尿病
の診断と治療に、また多数の代謝障害の診断に用いられ
る。全血中のグルコースを定量する方法として幾つかの
方法が知られている。
これら公知の方法の１つはグルコースデヒドロゲナーゼ
によるグルコースの酵素定量に基づくものであって、そ
のための試薬組成物が米国特許第4,120,755号明細書に
記載されている。この組成物は緩衡液、ピリジン補酵素
及びグルコースデヒドロゲナーゼを含んで成る。緩衡液
のpHは7.9〜9.0である。米国特許第3,964,974号明細書
にもう１つの公知のグルコース定量用組成物が記載され
ている。この組成物は主として純度とタイプに関して特
定されているグルコースデヒドロゲナーゼ、NADのよう
なピリジン補酵素、組成物の水性溶液のpHを6.5〜8.5に
維持するための緩衡系及びムタロターゼより成る。これ
らの２件の特許のいずれにも未希釈全血、即ち前に希釈
又は沈澱の工程を経ていない血液中の総グルコースを直
接定量するのに適した方法又は組成物は開示されていな
い。前記米国特許第3,964,974号明細書の実施例７にど
のようにすれば全血中のグルコースを分析できるかにつ
いて唯一の情報が与えられているが、そこでは全血試料
について湿式の化学的グルコース定量が行われている。
しかし、グルコースの測定前に全血試料から蛋白質が除
去される。蛋白質を除去することによって赤血球も除去
されてしまう。従って、グルコースの測定は全血につい
て行われるものではない。ここで、前記米国特許明細書
の第９頁を参照すると、そこでは読者を全血の測定時に
赤血球を保持するという考えとは明白に別の方法に向け
ている。予備希釈工程で未希釈血液から蛋白質を除去し
た後、その血液は酵素／緩衡液溶液と混合される。次に
補酵素の溶液（NAD）を添加することによって反応が開
始され、その結果グルコース含量が定量される。グルコ
ース含量は、なかんずく、NADH2−指示用染料又は色反
応によって、例えば酵素ジアホラーゼの影響下でテトラ
ゾリウム塩を水素化して対応するホルマザンを形成する
ことによって測定することができる、と述べられてい
る。この米国特許明細書には、しかし、全血の溶血産物
中の総グルコースを測定するのにこのNADH2−指示法を
使用することの示唆はなく、ただ血漿中のグルコースの
測定にその方法を用いることが示唆されているだけであ
る。更に、米国特許第3,964,974号明細書の血中グルコ
ースの測定では、例えばその実施例７によれば、測定
は、未希釈血液試料に対して直接測定することに頼る本
発明と対比して、いかなるときも希釈された血液に対し
て行われる。
によるグルコースの酵素定量に基づくものであって、そ
のための試薬組成物が米国特許第4,120,755号明細書に
記載されている。この組成物は緩衡液、ピリジン補酵素
及びグルコースデヒドロゲナーゼを含んで成る。緩衡液
のpHは7.9〜9.0である。米国特許第3,964,974号明細書
にもう１つの公知のグルコース定量用組成物が記載され
ている。この組成物は主として純度とタイプに関して特
定されているグルコースデヒドロゲナーゼ、NADのよう
なピリジン補酵素、組成物の水性溶液のpHを6.5〜8.5に
維持するための緩衡系及びムタロターゼより成る。これ
らの２件の特許のいずれにも未希釈全血、即ち前に希釈
又は沈澱の工程を経ていない血液中の総グルコースを直
接定量するのに適した方法又は組成物は開示されていな
い。前記米国特許第3,964,974号明細書の実施例７にど
のようにすれば全血中のグルコースを分析できるかにつ
いて唯一の情報が与えられているが、そこでは全血試料
について湿式の化学的グルコース定量が行われている。
しかし、グルコースの測定前に全血試料から蛋白質が除
去される。蛋白質を除去することによって赤血球も除去
されてしまう。従って、グルコースの測定は全血につい
て行われるものではない。ここで、前記米国特許明細書
の第９頁を参照すると、そこでは読者を全血の測定時に
赤血球を保持するという考えとは明白に別の方法に向け
ている。予備希釈工程で未希釈血液から蛋白質を除去し
た後、その血液は酵素／緩衡液溶液と混合される。次に
補酵素の溶液（NAD）を添加することによって反応が開
始され、その結果グルコース含量が定量される。グルコ
ース含量は、なかんずく、NADH2−指示用染料又は色反
応によって、例えば酵素ジアホラーゼの影響下でテトラ
ゾリウム塩を水素化して対応するホルマザンを形成する
ことによって測定することができる、と述べられてい
る。この米国特許明細書には、しかし、全血の溶血産物
中の総グルコースを測定するのにこのNADH2−指示法を
使用することの示唆はなく、ただ血漿中のグルコースの
測定にその方法を用いることが示唆されているだけであ
る。更に、米国特許第3,964,974号明細書の血中グルコ
ースの測定では、例えばその実施例７によれば、測定
は、未希釈血液試料に対して直接測定することに頼る本
発明と対比して、いかなるときも希釈された血液に対し
て行われる。
臨床試験場では、未希釈全血中の総グルコースの簡単で
速やかな定量試験が重要な助けになるだろうことは明ら
かである。
速やかな定量試験が重要な助けになるだろうことは明ら
かである。
本発明の１つの目的は、従って、透過分光測光法（tran
smission spectrophotometry）で未希釈全血中の総グル
コースを定量する方法を提供することである。
smission spectrophotometry）で未希釈全血中の総グル
コースを定量する方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的はそのような定量法のための乾
燥試薬組成物を提供することである。
燥試薬組成物を提供することである。
本発明は、特に、少容量の未希釈全血中総のグルコース
の定量に関する。本明細書において、“少容量”とは0.
1〜0.001mL（ミリリットル）、好ましくは0.02〜0.111m
Lの容量を意味する。本発明によれば、血液は好ましく
は未希釈であるばかりでなく、無処理である。
の定量に関する。本明細書において、“少容量”とは0.
1〜0.001mL（ミリリットル）、好ましくは0.02〜0.111m
Lの容量を意味する。本発明によれば、血液は好ましく
は未希釈であるばかりでなく、無処理である。
本発明の第１の面によれば、未希釈全血中の総グルコー
スの定量法が提供される。この方法は、好ましくは20マ
イクロリットル未満の未希釈全血試料を次の成分： −グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）； −ジアホラーゼ、フェナジンメトサルフェート、フェナ
ジンエトサルフェート、フェナジンフェノサルフェート
及びメルドラブルーよりなる群から選択される１種又は
２種以上の物質； −NAD、NADP、チオ−NAD、チオ−NADP、ニコチンアミド
−プリンジヌクレチオド、ニコチンアミド−メチルプリ
ンジヌクレチオド、ニコチンアミド−２−クロロ−メチ
ルプリンジヌクレチオドよりなる群から選択される１種
又は２種以上の物質； −ホスホリパーゼ、溶血性（hemolysing）サポニン類、
並びに親水性のモノ−、ジ−又はトリ−サッカライド化
合物及び10〜16個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素化
合物よりなる群から選択される１種又は２種以上の溶血
性物質； −レドックス系指示剤染料；及び −任意成分としてのムタロターゼ から成り、マイクロキュベット内に含まれる乾燥形態の
試薬と接触させ；そしてその試薬とグルコースとの未希
釈全血中における反応でもたらされる色変化を透過分光
測光法で測定することを特徴とする。
スの定量法が提供される。この方法は、好ましくは20マ
イクロリットル未満の未希釈全血試料を次の成分： −グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）； −ジアホラーゼ、フェナジンメトサルフェート、フェナ
ジンエトサルフェート、フェナジンフェノサルフェート
及びメルドラブルーよりなる群から選択される１種又は
２種以上の物質； −NAD、NADP、チオ−NAD、チオ−NADP、ニコチンアミド
−プリンジヌクレチオド、ニコチンアミド−メチルプリ
ンジヌクレチオド、ニコチンアミド−２−クロロ−メチ
ルプリンジヌクレチオドよりなる群から選択される１種
又は２種以上の物質； −ホスホリパーゼ、溶血性（hemolysing）サポニン類、
並びに親水性のモノ−、ジ−又はトリ−サッカライド化
合物及び10〜16個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素化
合物よりなる群から選択される１種又は２種以上の溶血
性物質； −レドックス系指示剤染料；及び −任意成分としてのムタロターゼ から成り、マイクロキュベット内に含まれる乾燥形態の
試薬と接触させ；そしてその試薬とグルコースとの未希
釈全血中における反応でもたらされる色変化を透過分光
測光法で測定することを特徴とする。
この方法を実施例する１つの補助手段が米国特許第4,08
8,448号明細書に開示される。
8,448号明細書に開示される。
本発明のもう１つの面によれば、未希釈全血中の総グル
コースの定量用試薬組成物が提供される。この試薬組成
物は乾燥形態を取り、そして次の成分： −グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）； −ジアホラーゼ、フェナジンメトサルフェート、フェナ
ジンエトサルフェート、フェナジンフェノサルフェート
及びメルドラブルーよりなる群から選択される１種又は
２種以上の物質； −NAD、NADP、チオ−NAD、チオ−NADP、ニコチンアミド
−プリンジヌクレチオド、ニコチンアミド−メチルプリ
ンジヌクレチオド、ニコチンアミド−２−クロロ−メチ
ルプリンジヌクレチオドよりなる群から選択される１種
又は２種以上の物質； −ホスホリパーゼ、溶血性サポニン類、並びに親水性の
モノ、ジ−又はトリ−サッカライド化合物及び10〜16個
の炭素原子を有する脂肪族炭化水素化合物よりなる群か
ら選択される１種又は２種以上の溶血性物質； −レドックス系指示剤染料；及び −任意成分としてのムタロターゼ から成り、マイクロキュベット内に含まれることを特徴
とする。
コースの定量用試薬組成物が提供される。この試薬組成
物は乾燥形態を取り、そして次の成分： −グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）； −ジアホラーゼ、フェナジンメトサルフェート、フェナ
ジンエトサルフェート、フェナジンフェノサルフェート
及びメルドラブルーよりなる群から選択される１種又は
２種以上の物質； −NAD、NADP、チオ−NAD、チオ−NADP、ニコチンアミド
−プリンジヌクレチオド、ニコチンアミド−メチルプリ
ンジヌクレチオド、ニコチンアミド−２−クロロ−メチ
ルプリンジヌクレチオドよりなる群から選択される１種
又は２種以上の物質； −ホスホリパーゼ、溶血性サポニン類、並びに親水性の
モノ、ジ−又はトリ−サッカライド化合物及び10〜16個
の炭素原子を有する脂肪族炭化水素化合物よりなる群か
ら選択される１種又は２種以上の溶血性物質； −レドックス系指示剤染料；及び −任意成分としてのムタロターゼ から成り、マイクロキュベット内に含まれることを特徴
とする。
本発明の第３の面によれば、次の成分： −グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）； −ジアホラーゼ、フェナジンメトサルフェート、フェナ
ジンエトサルフェート、フェナジンフェノサルフェート
及びメルドラブルーよりなる群から選択される１種又は
２種以上の物質； −NAD、NADP、チオ−NAD、チオ−NADP、ニコチンアミド
−プリンジヌクレチオド、ニコチンアミド−メチルプリ
ンジヌクレチオド、ニコチンアミド−２−クロロ−メチ
ルプリンジヌクレチオドよりなる群から選択される１種
又は２種以上の物質； −ホスホリパーゼ、溶血性サポニン類、並びに親水性の
モノ、ジ−又はトリ−サッカライド化合物及び10〜16個
の炭素原子を有する脂肪族炭化水素化合物よりなる群か
ら選択される１種又は２種以上の溶血性物質； −レドックス系指示剤染料；及び −任意成分としてのムタロターゼ を含んで成る、乾燥形態を取る試薬組成物の、未希釈性
全血中の総グルコースの透過分光測光法による定量を行
うための使用に関する発明が提供される。
ジンエトサルフェート、フェナジンフェノサルフェート
及びメルドラブルーよりなる群から選択される１種又は
２種以上の物質； −NAD、NADP、チオ−NAD、チオ−NADP、ニコチンアミド
−プリンジヌクレチオド、ニコチンアミド−メチルプリ
ンジヌクレチオド、ニコチンアミド−２−クロロ−メチ
ルプリンジヌクレチオドよりなる群から選択される１種
又は２種以上の物質； −ホスホリパーゼ、溶血性サポニン類、並びに親水性の
モノ、ジ−又はトリ−サッカライド化合物及び10〜16個
の炭素原子を有する脂肪族炭化水素化合物よりなる群か
ら選択される１種又は２種以上の溶血性物質； −レドックス系指示剤染料；及び −任意成分としてのムタロターゼ を含んで成る、乾燥形態を取る試薬組成物の、未希釈性
全血中の総グルコースの透過分光測光法による定量を行
うための使用に関する発明が提供される。
本発明の乾燥試薬組成物中の色々な成分の含量は臨界的
ではないが、1mlの未希釈全血試料について計算して、
次の範囲にあるのが好ましい： 基本組成物には種々の適用においてその反応機能をでき
るだけ完全なものにする成分を添加することができる。
ムスロターゼはアルファーグルコースをグルコースデヒ
ドロゲナーゼと反応する形態であるベーターグルコース
に速やかに転化させるために用いることができる。これ
は患者から直接採取されない試料を分析すべき場合に特
に興味のあるものである。グルコースデヒドロゲナーゼ
はベーターグルコースを特定的に分解する。水性溶液に
おいて、アルファー及びベーターグルコースは温度依存
性の平衡状態で存在する。この平衡状態は比較的緩徐に
確立される。体温は比較的一定であるから、試料を体温
にある血液から採取する場合ムタロターゼ−これは平衡
の確立を促進する−は試薬から除いてもよい。利点は、
コストの低減に加えて、反応時間が短縮され、また分析
範囲が拡張されることにある。１つの不利な点は検量溶
液及び対照溶液を少なくとも１時間の間に適性温度にも
たらさなければならないことである。
ではないが、1mlの未希釈全血試料について計算して、
次の範囲にあるのが好ましい： 基本組成物には種々の適用においてその反応機能をでき
るだけ完全なものにする成分を添加することができる。
ムスロターゼはアルファーグルコースをグルコースデヒ
ドロゲナーゼと反応する形態であるベーターグルコース
に速やかに転化させるために用いることができる。これ
は患者から直接採取されない試料を分析すべき場合に特
に興味のあるものである。グルコースデヒドロゲナーゼ
はベーターグルコースを特定的に分解する。水性溶液に
おいて、アルファー及びベーターグルコースは温度依存
性の平衡状態で存在する。この平衡状態は比較的緩徐に
確立される。体温は比較的一定であるから、試料を体温
にある血液から採取する場合ムタロターゼ−これは平衡
の確立を促進する−は試薬から除いてもよい。利点は、
コストの低減に加えて、反応時間が短縮され、また分析
範囲が拡張されることにある。１つの不利な点は検量溶
液及び対照溶液を少なくとも１時間の間に適性温度にも
たらさなければならないことである。
試薬には、pH調整効果を有して操作pHを確実に酵素の活
性範囲内に収める物質を加えることができる。
性範囲内に収める物質を加えることができる。
試薬組成物の溶解性と耐久性とに影響を及ぼす物質を種
々の要求がある色々な適用に用いるためにその試薬に加
えることができる。
々の要求がある色々な適用に用いるためにその試薬に加
えることができる。
グルコースデヒドロゲナーゼは種々の分子量、最適pH条
件等を有する色々な種から得ることができる。ここでは
グルコースデヒドロゲナーゼはNAD−又はNAD−類縁物質
依存性酵素を包含するだけであるが、これに対して酵素
依存性で、キノイド補酵素と共に作用するタイプでない
ものもグルコースデヒドロゲナーゼと称される。
件等を有する色々な種から得ることができる。ここでは
グルコースデヒドロゲナーゼはNAD−又はNAD−類縁物質
依存性酵素を包含するだけであるが、これに対して酵素
依存性で、キノイド補酵素と共に作用するタイプでない
ものもグルコースデヒドロゲナーゼと称される。
ジアホラーゼもまた色々な種から得ることができるが、
これはフェナジンメトサルフェート、メルドラブルー等
のような公知の物質で代替することができる。他の公知
のNAD類縁物質、例えば最もよく知られているものとし
てNADPもある。これらのNAD類縁物質はグルコース／グ
ルコースデヒドロゲナーゼで還元し、かつその還元反応
を染料又は色素系に伝達することができる。
これはフェナジンメトサルフェート、メルドラブルー等
のような公知の物質で代替することができる。他の公知
のNAD類縁物質、例えば最もよく知られているものとし
てNADPもある。これらのNAD類縁物質はグルコース／グ
ルコースデヒドロゲナーゼで還元し、かつその還元反応
を染料又は色素系に伝達することができる。
表面活性物質も補助アプライアンス上の表面の濡れを促
進するのに必要とされる。
進するのに必要とされる。
懸濁液を色々なタイプの塗布装置に合うようになすべく
その粘度を適当な高分子量ポリマーの添加によって変え
ることができる。高分子量ポリマーをどう選択するかは
重要でないが、それは乾燥試薬の溶解速度に影響を及ぼ
す。使用可能なポリマーの中では、ポリエチレングルコ
ース、ポリビニルピロリドン、デキストラン及び種々の
セルロース誘導体を挙げることができる。ポリマーはま
た懸濁液を安定化することを目的として選択することも
できる。例えば、食品工業又は化粧品工業からの公知の
調製技術に基づいて、試薬を色々な表面に合わせる際に
問題はほとんどない。
その粘度を適当な高分子量ポリマーの添加によって変え
ることができる。高分子量ポリマーをどう選択するかは
重要でないが、それは乾燥試薬の溶解速度に影響を及ぼ
す。使用可能なポリマーの中では、ポリエチレングルコ
ース、ポリビニルピロリドン、デキストラン及び種々の
セルロース誘導体を挙げることができる。ポリマーはま
た懸濁液を安定化することを目的として選択することも
できる。例えば、食品工業又は化粧品工業からの公知の
調製技術に基づいて、試薬を色々な表面に合わせる際に
問題はほとんどない。
表面張力低下物質、例えばデカノイル−Ｎ−メチルグル
カミドにも溶血効果がある。このことは周知の事実であ
り、従って多くの物質又は物質の組み合わせが使用可能
である。また、特に表面活性ではない溶血性物質、例え
ばメリチン及びホスホリパーゼも存在する。
カミドにも溶血効果がある。このことは周知の事実であ
り、従って多くの物質又は物質の組み合わせが使用可能
である。また、特に表面活性ではない溶血性物質、例え
ばメリチン及びホスホリパーゼも存在する。
また、NADH及びジアホラーゼによって影響されるときに
色を変化させることができる公知の数種のタイプの変色
性物質も存在する。テトラゾリウム化合物が、通常の反
応条件下ではホルマザン染料が不可逆的に形成される点
で有利である。３−（4,5−ジメチルチアゾール−２−
１）−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド
（MMT）が組成物において良好な結果を生むが、多くの
他のテトラゾリウム化合物も使用可能である。ここで、
溶血性物質又は物質類が選択される群には、テトラゾリ
ウム化合物との組み合わせでは沈澱の妨害を起こさない
ので、そのような物質しか含まれないことに留意すべき
である。
色を変化させることができる公知の数種のタイプの変色
性物質も存在する。テトラゾリウム化合物が、通常の反
応条件下ではホルマザン染料が不可逆的に形成される点
で有利である。３−（4,5−ジメチルチアゾール−２−
１）−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド
（MMT）が組成物において良好な結果を生むが、多くの
他のテトラゾリウム化合物も使用可能である。ここで、
溶血性物質又は物質類が選択される群には、テトラゾリ
ウム化合物との組み合わせでは沈澱の妨害を起こさない
ので、そのような物質しか含まれないことに留意すべき
である。
本発明を添付図面を参照してここに幾つかの実施例で説
明する。
明する。
第１図に関係している反応の反応式を模式的に示すもの
である。
である。
第２図は“終点”を決定する参照法に対する分布と相関
関係を例証する線図である。
関係を例証する線図である。
第３図は“終点”を決定する際の反応プロセスのグラフ
である。
である。
第４図はヘモグロビンとMTT−ホルマザンにおけるスペ
クトルを示し、かつ測定波長と参照波長を示すグラフで
ある。尚、実線がヘモグロビンであり、グルコース濃度
はＣgluは、以下の式により計算される。
クトルを示し、かつ測定波長と参照波長を示すグラフで
ある。尚、実線がヘモグロビンであり、グルコース濃度
はＣgluは、以下の式により計算される。
Ｃglu＝Ｋ（A660−A880） K:定数 A660:測定波長660nmにおけるホルマザンの測定吸光度 A880::参照波長880nmにおける参照測定の吸光度 第５図は動力学的測定に際しての、参照法に対する相関
関係を例証する線図である。
関係を例証する線図である。
測定は色々なグルコースレベルを達成するためにグルコ
ースを用いて調製した全血試料に対して行われている。
参照法はメルク（Merck）のグルック（Gluc）−DH
（Ｒ）法、タイプ13886、13887からのグルコースデヒド
ロゲナーゼテスト系であった。参照法については、分光
測光法をその参照法に付随するパッキング仕様書に従っ
てUV−範囲の340nmで行った。参照法は湿式の化学的タ
イプの分析法である。
ースを用いて調製した全血試料に対して行われている。
参照法はメルク（Merck）のグルック（Gluc）−DH
（Ｒ）法、タイプ13886、13887からのグルコースデヒド
ロゲナーゼテスト系であった。参照法については、分光
測光法をその参照法に付随するパッキング仕様書に従っ
てUV−範囲の340nmで行った。参照法は湿式の化学的タ
イプの分析法である。
実施例１ 試薬組成物1mL グルコースデヒドロゲナーゼ（メルク）100U ジアホラーゼ（メルク）20U NAD（メルク）22ミリモル MTT（メルク）30ミリモル ホワイトサポニン（BDH）25mg デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド5mg イオン交換に付された水1mL この組成物は米国特許第4,088,448号明細書に記載され
る射出成型タイプのマイクロキュウベット中の凍結乾燥
するのに適した溶液を与える、これは市販されている
［ヘモキュウ（HemoCue）AB］。良好な再現性と直線性
が得られた（第２図を参照されたい）。測定は参照波長
として“終点”の測定を行う880nmを用いて660nmで行っ
た。
る射出成型タイプのマイクロキュウベット中の凍結乾燥
するのに適した溶液を与える、これは市販されている
［ヘモキュウ（HemoCue）AB］。良好な再現性と直線性
が得られた（第２図を参照されたい）。測定は参照波長
として“終点”の測定を行う880nmを用いて660nmで行っ
た。
実施例２ 試薬組成物1mL グルコースデヒドロゲナーゼ（メルク）1kU ジアホラーゼ（メルク）200U NAD（メルク）220ミリモル MTT（メルク）0.3ミリモル ホワイトサポニン（Ｒ）（BDH）250mg プルロニック（Pluronic）P85（Ｒ）（SERVA）50mg イオン交換に付された水250mmL 各含有成分は色々な印刷技術、例えば絹−スクリーン印
刷、シリンダー印刷等で表面に塗布するのに適した、微
細分割して懸濁液にすることのできるものである。この
タイプの懸濁液は米国特許第4,088,448号明細書に記載
される分割タイプのマイクロキュウベットに塗布するの
に適している。
刷、シリンダー印刷等で表面に塗布するのに適した、微
細分割して懸濁液にすることのできるものである。この
タイプの懸濁液は米国特許第4,088,448号明細書に記載
される分割タイプのマイクロキュウベットに塗布するの
に適している。
実施例３ 酢酸／酪酸セルロースからできている、深さが約0.15mm
の、米国特許第4,088,448号明細書によるマイクロキュ
ウベットにダッパー（dabber）印刷機で実施例２による
試薬組成物を塗布した（４−プリント）。乾燥及び集成
後、それらマイクロキュウベットの色々な全血試料によ
る機能を調べた。660nmにおいて溶血性を測定し、その
際測定時間は赤血球の量に応じて20秒と40秒の間で変え
た。同じ波長で色の発現を調べた。それは、測定の面か
らは満足できるものであった終点としての約12ミリモル
/Lのグルコース濃度を有する全血試料について1.5分後
に達成された（第３図を参照されたい）。第４図はヘモ
グロビンのスペクトルと実施例３によるキュウベット中
に約12ミリモル/Lのグルコースを有する全血試料に由来
する染料のスペクトルを示すものである。それは、形成
されたホルマザン染料をヘモグロビンによる望ましくな
いなんらの妨害もなしに測定できる高い可能性があるこ
と、またこれらのスペクトル以外の背景を保証するため
に濁りを測定できる可能性もあることを明白に示す。コ
ーティングの厚さを変えることによって反応時間は勿論
影響を受け、またある程度は最大の測定可能な濃度も影
響を受ける。
の、米国特許第4,088,448号明細書によるマイクロキュ
ウベットにダッパー（dabber）印刷機で実施例２による
試薬組成物を塗布した（４−プリント）。乾燥及び集成
後、それらマイクロキュウベットの色々な全血試料によ
る機能を調べた。660nmにおいて溶血性を測定し、その
際測定時間は赤血球の量に応じて20秒と40秒の間で変え
た。同じ波長で色の発現を調べた。それは、測定の面か
らは満足できるものであった終点としての約12ミリモル
/Lのグルコース濃度を有する全血試料について1.5分後
に達成された（第３図を参照されたい）。第４図はヘモ
グロビンのスペクトルと実施例３によるキュウベット中
に約12ミリモル/Lのグルコースを有する全血試料に由来
する染料のスペクトルを示すものである。それは、形成
されたホルマザン染料をヘモグロビンによる望ましくな
いなんらの妨害もなしに測定できる高い可能性があるこ
と、またこれらのスペクトル以外の背景を保証するため
に濁りを測定できる可能性もあることを明白に示す。コ
ーティングの厚さを変えることによって反応時間は勿論
影響を受け、またある程度は最大の測定可能な濃度も影
響を受ける。
実施例４ 試薬組成物1mL 最大量のポリエチレングルコールアルデヒドメチルエー
テルが750個結合されたグルコースデヒドロゲナーゼ25U ジアホラーゼ（メルク）5U NAD（メルク）７ミリモル MTT（メルク）20ミリモル ホワイトサポニン（Ｒ）（メルク）25mg イオン交換に付された水1mL この組成物は実施例１と同様に凍結乾燥に適した溶液を
与える。この試薬は終点の測定に関する前記実施例と対
比して動力学的測定に合うようにされたものである。こ
の比較的大量のグルコースデヒドロゲナーゼは指定ポリ
マー分子を結合していると起こる活性の低下に依存す
る。この酵素に結合しているポリマー分子は安定性を増
加させるが、これは周知の事実であって、動力学的測定
にも望ましい。最適ポリマーがどのようなタイプのもの
かは調べられておらず、この実施例は単にポリマーを使
用することの可能性を説明しようとしたものである。ポ
リエチレングルコールモノメチルエーテルはジメチルス
ルホキシド及び無水酢酸と反応することによってアルデ
ヒドに転化された。pH10の塩化ナトリウム／炭酸塩緩衡
液中での過剰のポリマーによるグルコースデヒドロゲナ
ーゼに対する結合後に混合物を透析し、濃縮した。この
酵素／ポリマー錯体は純酵素よりも良好な安定性を示し
た。この実施例による試薬を用いた動力学的測定から得
られた結果の例を第５図に示す。測定は参照波長880nm
に対して660nmにおいて３〜3.75時間行った。
テルが750個結合されたグルコースデヒドロゲナーゼ25U ジアホラーゼ（メルク）5U NAD（メルク）７ミリモル MTT（メルク）20ミリモル ホワイトサポニン（Ｒ）（メルク）25mg イオン交換に付された水1mL この組成物は実施例１と同様に凍結乾燥に適した溶液を
与える。この試薬は終点の測定に関する前記実施例と対
比して動力学的測定に合うようにされたものである。こ
の比較的大量のグルコースデヒドロゲナーゼは指定ポリ
マー分子を結合していると起こる活性の低下に依存す
る。この酵素に結合しているポリマー分子は安定性を増
加させるが、これは周知の事実であって、動力学的測定
にも望ましい。最適ポリマーがどのようなタイプのもの
かは調べられておらず、この実施例は単にポリマーを使
用することの可能性を説明しようとしたものである。ポ
リエチレングルコールモノメチルエーテルはジメチルス
ルホキシド及び無水酢酸と反応することによってアルデ
ヒドに転化された。pH10の塩化ナトリウム／炭酸塩緩衡
液中での過剰のポリマーによるグルコースデヒドロゲナ
ーゼに対する結合後に混合物を透析し、濃縮した。この
酵素／ポリマー錯体は純酵素よりも良好な安定性を示し
た。この実施例による試薬を用いた動力学的測定から得
られた結果の例を第５図に示す。測定は参照波長880nm
に対して660nmにおいて３〜3.75時間行った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭49−73193（ＪＰ，Ａ) ・Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ，18（４），Ｐ．255〜 256，1980 ・Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，34（１），Ｐ. 173，1988
Claims (4)
- 【請求項１】未希釈全血試料を次の成分： −グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）； −ジアホラーゼ、フェナジンメトサルフェート、フェナ
ジンエトサルフェート、フェナジンフェノサルフェート
及びメルドラブルーよりなる群から選択される１種又は
２種以上の物質； −NAD、NADP、チオ−NAD、チオ−NADP、ニコチンアミド
−プリンジヌクレチオド、ニコチンアミド−メチルプリ
ンジヌクレチオド、ニコチンアミド−２−クロロ−メチ
ルプリンジヌクレチオドよりなる群から選択される１種
又は２種以上の物質； −ホスホリパーゼ、溶血性サポニン類、並びに親水性の
モノ、ジ−又はトリ−サッカライド化合物及び10〜16個
の炭素原子を有する脂肪族炭化水素化合物よりなる群か
ら選択される１種又は２種以上の溶血性物質； −レドックス系指示剤染料；及び −任意成分としてのムタロターゼ から成り、マイクロキュベット内に含まれる乾燥形態の
試薬と接触させ；そしてその試薬と未希釈性全血中のグ
ルコースとの反応でもたらされる色変化を透過分光測光
法で測定することを特徴とする未希釈全血中の総グルコ
ースの定量法。 - 【請求項２】乾燥形態を取る、次の成分： −グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）； −ジアホラーゼ、フェナジンメトサルフェート、フェナ
ジンエトサルフェート、フェナジンフェノサルフェート
及びメルドラブルーよりなる群から選択される１種又は
２種以上の物質； −NAD、NADP、チオ−NAD、チオ−NADP、ニコチンアミド
−プリンジヌクレオチド、ニコチンアミド−メチルプリ
ンジヌクレチオド、ニコチンアミド−２−クロロ−メチ
ルプリンジヌクレチオドよりなる群から選択される１種
又は２種以上の物質； −ホスホリパーゼ、溶血性サポニン類、並びに親水性の
モノ−、ジ−又はトリ−サッカライド化合物及び10〜16
個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素化合物よりなる群
から選択される１種又は２種以上の溶血性物質； −レドックス系指示剤染料；及び −任意成分としてのムタロターゼ から成り、マイクロキュベット内に含まれることを特徴
とする未希釈全血中の総グルコースを定量するための試
薬組成物。 - 【請求項３】レドックス系指示剤染料がテトラゾリウム
塩であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の試
薬組成物。 - 【請求項４】次の成分： −グルコースデヒドロゲナーゼ； −ジアホラーゼ； −NAD; −１種又は２種以上のサポニン； −テトラリゾリウム塩；及び −任意成分としてのムタロターゼ； を含んで成る、ことを特徴とする請求の範囲第２項又は
第３項に記載の試薬組成物。
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| FI (1) | FI97551C (ja) |
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