NO964674L

NO964674L - Cytokinregulerende midler og fremgangsmåter for anvendelse ved patologier og tilstander forbundet med endrede cytokinnivåer

Info

Publication number: NO964674L
Application number: NO964674A
Authority: NO
Inventors: Beverly E Girten; Ali Andablibi; Amaresh Basu; Patrick Fagan; Richard A Houghten; Costas C Loullis; Paul Omholt; Mark J Suto; Patricia A Weber; Ronald R Tuttle
Original assignee: Houghten Pharm Inc
Priority date: 1995-03-06
Filing date: 1996-11-05
Publication date: 1997-01-06
Also published as: CA2189250A1; NO964674D0; FI964449L; CA2189250C; CN1156965A; JP2810240B2; AU703402B2; AU5093696A; JPH10330397A; EP0759770A4; FI964449A7; FI964449A0; NZ303889A; US5726156A; JPH10509737A; WO1996027386A1; EP0759770A1; KR100248030B1

Description

62104-AK/JØ-964674

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse er en delvis fortsettelse av patentsøknad nr. 08/484262, innsendt 7. juni 1995, som er en delvis fortsettelse av patentsøknad nr. 08/400983, innsendt 6. mars 1995, som begge er inkorporert heri i sin helhet ved referanse.

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår generelt områdene peptidkjemi og molekylær patologi, og nærmere bestemt nye cytokinregulerende midler og deres anvendelse ved kontroll av cytokinregulerte fysiologiske prosesser og patologier.

Bakgrunnsinformasjon

Cytokiner er en klasse av utskilte, løselige proteiner produsert av mange forskjellige celler som respons på mange forskjellige typer av induserende stimuli, inkludert miljømessige, mekaniske og patologiske belastninger. Lymfoide, inflammatoriske og hemopoesiske celler utskiller mange forskjellige cytokiner som regulerer immunresponsen ved å kontrollere celleproliferasjons-, differensierings- og effek-torfunksjoner. Regulatoriske cytokiner produsert som respons på T-cellestimulering under en immunrespons, kan f.eks. være immunundertrykkende eller immunstimulerende. Immunresponsen og responsen i den akutte fase forbundet med endrede cytokinnivåer kan f.eks. forekomme på grunn av inaktivitetsdekondisjonering, organskade, slik som forbundet med transplantasjon, cancerbehandling, septisk sjokk og andre bakterielt beslektede patologier, skadelige legemiddelreaksjoner, nitrogenoksid-formidlet vevsskade og diabetes.

Cytokiner er vanligvis til stede i meget lave konsentrasjoner i et vev, og deres virkninger formidles gjennom binding til høyaffinitetsreseptorer på spesifikke celletyper. Forskjellige cytokiner, slik som interleukiner (IL), interferoner (IFN), kolonistimulerende faktorer (CSF) og tumornekrosefaktorer (TNF), produseres under immun-, inflammatoriske, reparasjons- og akuttfaseresponser, og de kontrollerer forskjellige aspekter av disse responser. Etter induksjon av en slik immun-, inflammatorisk, reparasjons- eller akuttfase-respons kan konsentrasjonene av forskjellige cytokiner øke eller minske ved forskjellige tidspunkter. Økte nivåer av cytokiner er f.eks. forbundet med forskjellige situasjoner, slik som romfart, immobilisering, ryggmargsskade og sengeleie, hvilket fører til inaktivitetsdekondisjonering. Under romfart øker f.eks. nivåer av TNF, IL-6 og IL-2 når et individ innled-ningsvis utsettes for vektløshet, og på nytt ved tilbakeven-delse fra rommet.

Endrede nivåer av cytokiner er også blitt forbundet med unormal benmetabolisme og den hurtige avkalking som forekommer under immobilisering, ryggmargsskade eller langtids-sengeleie. Cytokinnivåer endres likeledes under kroniske tilstander, slik som under reparasjon og autoimmunreaksjoner på organskader, nefrotoksisitet forbundet med administrering av syklosporin til transplanterte individer, cancerkjemoterapi, så vel som hos individer som er tykke eller lider av diabetes, septisk (endotoksisk) sjokk eller glomerulonefritt.

Cytokiner, inkludert TNF, CSF, interferoner og interleukiner, formidler vertens forsvarsresponser, celleregulering og celledifferensiering. Disse cytokiner kan f.eks. indusere feber hos et individ, kan forårsake aktivering av T-celler, B-celler og makrofager, og kan påvirke nivåene av andre cytokiner, hvilket fører til en kaskadeeffekt hvorved andre cytokiner formidler de biologiske nivåer og virkninger av det første cytokin.

Cytokiner kan regulere immunresponsen gjennom immunstimulerende eller immunundertrykkende virkninger. IL-10 kan f.eks. blokkere aktivering av mange av de inflammatoriske cytokiner, inkludert TNF, IL-1 og IL-6, mens antiinflammatoriske cytokiner, slik som IL-12, oppreguleres. IL-10, som produseres av makrofager og andre celletyper, stimulerer også proliferasjonen av mastceller og tymocytter og inhiberer forskjellige funksjoner av monocytter og makrofager. Som en konsekvens av denne monocytt- og makrofaginhibering påvirkes også aktiviteten av T-celler. Hele rekkevidden av den rolle IL-10 har i immunsystemet er kun i sin begynnelse til å bli forstått.

Cytokiner har mange forskjellige biologiske aktivi- teter og innvirker på mer enn én celletype. Det har således ikke vært mulig å målrette et spesielt cytokin eller en celletype for å forhindre de skadelige bivirkninger av behandling. En bedre metode for å forhindre skade på grunn av den uventede og ukontrollerte merundertrykkelse eller overstimulering av cytokinaktivitet, ville være å regulere ekspresjonen av det relevante eller kontrollerende cytokin, eller cytokiner, involvert i en immunrespons uten å eliminere eller overuttryk-ke noe annet cytokin. En slik behandling ville ikke skape eller forverre en patologisk eller pågående immunrespons. På denne måten kan patologiske immunformidlede virkninger, slik som immunundertrykkelse eller autoimmunreaksjoner, forhindres og homøostase kan opprettholdes.

Kortikosteroider kan anvendes for å modulere cytokinekspresjon. De kan imidlertid forårsake fullstendig immunundertrykkelse og har andre uønskede bivirkninger, slik som at de induserer "tærings"-syndrom, diabetes og osteoporose. Ikke-steroide, antiinflammatoriske legemidler (NSAID), slik som ketorolac ("Toradol"; Syntex), er likeledes effektive ved behandling av inflammasjon og smerte. NSAID forårsaker imidlertid også uønskede bivirkninger ved å inhibere prostaglandin-produksjon, hvilket kan føre til potensielt alvorlige kompli-kasjoner, inkludert magesår, blødning og nyresvikt.

For å forhindre patologiske tilstander eller ødeleg-gelse av normale immunformidlede funksjoner, forårsaket av den avvikende ekspresjon av cytokiner som beskrevet ovenfor, ville det være fordelaktig dersom cytokinnivåer kunne manipuleres nøyaktig og kontrolleres effektivt. Det eksisterer således et behov for midler som kan regulere aktiviteten av cytokiner i et individ uten å forårsake uønskede bivirkninger. Det eksisterer videre et behov for identifiserende midler som kan anvendes ved behandling av patologier og tilstander forbundet med endrede cytokinnivåer.Foreliggende oppfinnelse tilfreds-stiller disse behov og tilveiebringer også beslektede fordeler .

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår nye peptider som er potente cytokinregulerende midler. Som beskrevet heri, har slike cytokinregulerende midler de generelle strukturer Xx- X2- His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - X3og<X>4- X5- (D)Phe - Arg - (D)Trp - X3, hvori Xlf<X>2, X3, X4og X5kan være aminosyrer eller aminosyreanaloger. Foreliggende oppfinnelse angår også et cytokinregulerende middel med strukturen Ac-His-(D)Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2, som inneholder en redusert (D)Trp-analog.

Foreliggende oppfinnelse angår dessuten farmasøytiske preparater som omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer og et cytokinregulerende middel eller midler. Administrering av et slikt cytokinregulerende middel, eller en kombinasjon derav, til et individ kan modifisere nivåene av forskjellige cytokiner i individet, hvilket vil føre til immunstimulering eller immunundertrykkelse, avhengig av de bestemte cytokiner som reguleres.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for regulering gjennom forhøyelse av cytokinaktiviteten i et individ, og fremgangsmåter for behandling av en tilstand, patologi eller en skade, som delvis er kjennetegnet ved endret eller avvikende cytokinaktivitet. Slike tilstander, patologier eller skader inkluderer inaktivitetsdekondisjonering, sykdommer formidlet av nitrogenoksid og cytokiner, diabetes, fedme, autoimmunsykdommer, septisk (endotoksisk) sjokk, glomerulonefritt, organskade, slik som den som forekommer under transplantasjon, og skadelige bivirkninger av cancerkjemoterapi, slik som nefrotoksisitet.

Kort beskrivelse av figurene

Figurene la og lb viser at et cytokinregulerende middel effektivt hemmer reduksjonen av glomerulær filtreringshastighet som forekommer på grunn av syklosporinindusert nefrotoksisitet. Figur 2 viser at EX-2 forhøyer IL-10-nivåer i museplasma. Figurene 3a og 3b viser at EX-2 induserer IL-10-nivåer i humant plasma. Figur 4 viser kroppsvektene for tykke (fa/fa) og normale (fa/+) rotter behandlet med EX-2.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår generelt nye cytokinregulerende midler med strukturen: Xx- X2- His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - X3, hvori

hvori Y er 0, H2eller S; R-l er H, COCH3,<C>2<H>5, CH2Ph, COPh, COO-t-butyl, COOCH2Ph, CH2CO-(polyetylenglykol) eller A; R2er H eller COCH3; R3er en lineær eller forgrenet alkylgruppe med 1-6 karbonatomer eller en syklisk alkylgruppe med 3-6 karbonatomer; R4er (CH2)m-<C>ONH2, (CH2 ^-CONHR-l eller (CH2)m-CONHA; R5er OH, 0R3, NH2, SH, NHCH3, NHCH2Ph eller A; og R6er H eller R3; og hvori "Ph" er C6H5; "m" er 1, 2 eller 3; "n" er 0, 1, 2 eller 3; og "A" er et karbohydrat med den generelle formel:

I én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse inneholder peptidene enhver av de ovenfor beskrevne variabler for Xxog X2, og spesielt er X3OH (X3er R5, hvori R5er OH). I en ytterligere utf ørelsesf orm kan Y, R1, R2, R4, R5og R6være enhver av de ovenfor beskrevne variabler, og R3er en syklisk alkylgruppe med 3-6 karbonatomer.

Eksempler på peptider omfattet av formlene beskrevet ovenfor inkluderer Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2; Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2; og Ac-(sykloheksyl)-Gly-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2, hvilke alle kan regulere cytokinaktivitet.

Foreliggende oppfinnelse angår også nye cytokinregulerende midler med strukturen: X4- X5- (D)Phe - Arg -

(D)Trp - X3, hvori

hvori Y er 0, H2eller S; Rx er H, C0CH3,<C>2H5, CH2Ph, COPh,

C00-t-butyl, C00CH2Ph, CH2C0-(polyetylenglykol) eller A; R2er H eller C0CH3; R4er (CH2 )m-C0NH2, (CH2 ^-CONHR-l eller (CH2)m<->CONHA; R5er OH, 0R3, NH2, SH, NHCH3, NHCH2Ph eller A; og R6er H eller R3; og hvori "Ph" er<C>6H5; "m" er 1, 2 eller 3; "n" er 0, 1, 2 eller 3; og "A" er et karbohydrat med den generelle formel:

I én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er peptidene forkortede analoger med 3-5 aminosyrerester, hvor X4og X5er enhver av variablene beskrevet ovenfor, og spesielt hvor X3er OH (X3er R5, hvori R5er OH). I en ytterligere ut-førelsesform, hvor X4er fraværende, X5er H eller COCH3og X3er R5, er de cytokinregulerende midler tripeptider av (D)Phe-Arg-(D)Trp. Foretrukne peptider inkluderer His-(D)Phe-Arg-(D)-Trp-Gly-NH2; Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2; His-(D)Phe-Arg-(D)-Trp-OH; Ac-(D)Phe-Arg-Trp-NH2; og syklo(His-(D)Phe-Arg-(D)-Trp), som kan regulere cytokinaktivitet.

Som anvendt heri, betyr betegnelsene "regulere" eller "regulatorisk" å kontrollere ved å forhøye, begrense, innskrenke, forhindre, modulere eller moderere. Slik regulering inkluderer de pleiotropiske, overflødige, synergistiske eller antagonistiske effekter som forekommer på grunn av aktiviteten av biologiske midler, slik som cytokiner, som kan påvirke mange forskjellige biologiske funksjoner direkte eller indirekte gjennom kaskademekanismer eller biologiske feedback-mekanismer.

Som anvendt heri, betyr betegnelsen "cytokinregulerende middel" et middel som kontrollerer cytokinaktivitet

ved å forhøye, begrense, innskrenke, forhindre, modulere eller moderere den biologiske aktivitet av et cytokin. Det bør imidlertid erkjennes at selv om de cytokinregulerende midler generelt kan regulere cytokinaktivitet, er det ikke foreslått noen spesifikk virkningsmekanisme vedrørende hvordan et cytokinregulerende middel virker for å bevirke en tilstand kjennetegnet ved endret eller avvikende cytokinaktivitet.

Cytokiner er velkjent i teknikken og inkluderer, men er ikke begrenset til, tumornekrosefaktorer (TNF), kolonistimulerende faktorer (CSF), interferoner (IFN), interleukiner (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 og IL-15), transformerende vekst-faktorer (TGF), onkostatin M (OSM), leukemiinhiberende faktor (LIF), blodplateaktiverende faktor (PAF) og andre oppløselige immunregulerende peptider som formidler vertens forsvarsresponser, celleregulering og celledifferensiering (se f.eks. Kuby, Immunology, 2. utg. (W.H. Freeman og co., 1994); se kapittel 13, som er inkorporert heri ved referanse.

De cytokinregulerende midler ifølge foreliggende oppfinnelse kan regulere den avvikende eller endrede ekspresjon av ett eller flere cytokiner som forekommer ved forskjellige tilstander, inkludert f.eks. patologier, immunresponser og inflammatoriske responser. Slike tilstander, vurdert sammen for foreliggende oppfinnelses formål, er delvis kjennetegnet ved endret eller avvikende cytokinaktivitet, og de er derfor mottakelige for regulering ved hjelp av ett eller flere cytokinregulerende midler.

Som anvendt heri, betyr betegnelsen "kjennetegnet ved" bidrar eller påvirker, i det minste delvis. Selv om cyto-kinbidraget kan være det eneste primære eller en hovedfaktor ved tilstanden, bør dette ikke være tilfellet. Det er f.eks. velkjent i teknikken at en infeksjon medfører endrede cytokinnivåer, og den er derfor en tilstand kjennetegnet ved cytokinaktivitet, men denne cytokinaktivitet er kun en del av den infeksiøse tilstand.

Som anvendt heri, inkluderer betegnelsen "tilstand kjennetegnet ved endret eller avvikende cytokinaktivitet" alle cytokinregulerte eller modulerte patologier og skader, inkludert de immuninflammatoriske og helingsprosesser forbundet med en skade. Den dyktige fagperson kan gjenkjenne en slik tilstand ved å påvise et økt eller redusert nivå eller aktivitet av et spesielt cytokin sammenlignet med det normale nivå av cytokinet som forventes å eksistere i et friskt individ. Fremgangsmåter for bestemmelse av slike normale nivåer er velkjent i teknikken.

Tilstander kjennetegnet ved endret eller avvikende cytokinaktivitet inkluderer, men er ikke begrenset til, inaktivitetsdekondisjonering, organskade, slik som forekommer som respons på organtransplantasjon; skadelige reaksjoner forbundet med cancerkjemoterapi; fedme; sykdommer som diabetes og aterosklerose som formidles av frie radikaler og nitrogen-oksidvirkning; bakteriell endotoksisk sepsis og beslektet sjokk; smerte; kakeksi; åndenødssyndrom hos voksne; og autoimmunsykdommer eller andre patoimmunogene sykdommer eller reaksjoner, slik som allergiske reaksjoner eller anafylakse, artritt, inflammatorisk tarmsykdom, glomerulonefritt, systemisk lupus erythematosus, transplantasjonsaterosklerose og parasittformidlede immundysfunksjoner, slik som Chagas sykdom.

Et cytokinregulerende middel kan f.eks. være et peptid som omfatter aminosyrer eller aminosyreanaloger som beskrevet heri. I tillegg til eksemplene tilveiebrakt ovenfor inkluderer andre representative eksempler på peptidcytokinregulerende midler: 1) Ac - Nie - Gin - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - Gly-OH; 2) Ac - Nie - Gin - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - Gly-NH2; 3) Ac - Nie - Gin - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - Gly-OC2H5; 4) Ac - Nie - Gin - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - Gly-NH-NH2; 5) Ac - Nie - Asn - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - Gly-NH2; 6) Ac - Nie - Asn - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - Gly-OH; 7) Ac - Nie - Gin - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - Gly-NHCH2-CH2Ph; 8) Ac - Nie - Gin - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - Gly-NHCH2-Ph;

9) Nie - Gin - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - Gly

I I

N 0;

10) Ac - Gin - His - (D)Phe - Arg -(D)Trp - Gly-NH2; 11) Ac - Nie - Gin - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp-NH2; 12) Ac - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - Gly-NH2; 13) His - (D)Phe - Arg - (D)Trp-NH2;

14) Ac - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp-OH; og

15) Ac - His - (D)Phe - Arg - {(D)Trp(CH2)} - (NAc)Gly-NH2, hvori {(D)Trp(CH2)} er en analog av (D)Trp, hvor H2erstatter a-karbonyloksygenet, og (NAc)Gly er et glysinderivat med en N-acetylkomponent.

Peptidcytokinregulerende midler som beskrevet ovenfor er delvis kjennetegnet ved en kjernestruktur med aminosyre sekvensen (D)Phe - Arg - (D)Trp eller en analog av (D)Trp, og mer foretrukket er aminosyresekvensen His-(D)Phe- Arg-(D)Trp eller en analog av (D)Trp. Aminosyrene er angitt ved deres vanlig kjente trebokstavkode, og (D) betegner en aminosyre med "D"-konfigurasjon, i motsetning til de naturlig forekommende L-aminosyrer. Der hvor ingen spesifikk konfigurasjon er angitt, vil en fagperson oppfatte at aminosyren er en (L)-aminosyre. I peptidene eksemplifisert ovenfor er "Nie" tre-bokstavkoden for norleucin, og "Ph" indikerer en "fenyl"-gruppe (C6H5).

Cytokinregulerende midler, slik som peptidene beskrevet ovenfor, ble syntetisert ved anvendelse av en modifikasjon av fastfase-peptidsyntesemetoden ifølge Merrifield (J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1964), som er inkorporert heri ved referanse), eller de kan syntetiseres ved anvendelse av standard løsningsmetoder velkjent i teknikken (se f.eks. Bodanzsky, M., Principles of Peptide Synthesis, 2. reviderte utg. (Springer-Verlag, 1988 og 1993), som er inkorporert heri ved referanse). Peptider fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Merrifield kan syntetiseres ved anvendelse av et automatisert peptidsyntetiseringsapparat, slik som the Applied Biosystems 431A-01 Peptide Synthesizer (Mountain View, CA) eller ved anvendelse av den manuelle peptidsynteseteknikk beskrevet av Houghten, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 82:5131 (1985), som er inkorporert heri ved referanse.

Peptider ble syntetisert ved anvendelse av aminosyrer eller aminosyreanaloger, hvor de aktive grupper i disse ble beskyttet som nødvendig ved anvendelse av f.eks. en t-butyl-dikarbonat(t-BOC)gruppe eller en fluorenylmetoksykarbonyl-(FMOC)gruppe. Aminosyrer og aminosyreanaloger kan innkjøpes kommersielt (Sigma Chemical Co.; Advanced Chemtec) eller syntetiseres ved anvendelse av metoder kjent i teknikken. Peptider syntetisert ved anvendelse av fastfasemetoden kan festes til resiner inkludert 4-metylbenzhydrylamin (MBHA), 4-(oksymetyl)-fenylacetamidometyl og 4-(hydroksymetyl)fenoksy-metyl-kopoly(styren-1 % divinylbenzen) (Wang-resin), hvilke alle er kommersielt tilgjengelige, eller til p-nitrobenzo-fenonoksimpolymer (oksimresin), som kan syntetiseres som beskrevet av De Grado og Kaiser, J. Org. Chem., 47:3258 (1982),

som er inkorporert heri ved referanse.

En fagperson vil vite at valget av aminosyrer eller aminosyreanaloger inkorporert i peptidet vil delvis avhenge av de spesifikke fysiske, kjemiske eller biologiske karakteristiske egenskaper som fordres for cytokinregulerende middel. Slike karakteristiske egenskaper bestemmes delvis av administreringsmåten for det cytokinregulerende middel eller belig-genheten i et individ som aktiviteten av det cytokinregulerende middel vil rettes mot.

Selektiv modifikasjon av de reaktive grupper i et peptid kan også bibringe ytterligere ønskelige karakteristiske egenskaper til et cytokinregulerende middel. Peptider kan manipuleres mens de fremdeles er festet til resinet for å erholde N-terminalt modifiserte forbindelser, slik som et acetylert peptid, eller de kan fjernes fra resinet ved anvendelse av hydrogenfluorid eller et ekvivalent spaltningsmiddel, og deretter modifiseres. Syntetiserte forbindelser inneholdende den C-terminale karboksylgruppe (Wang-resin) kan modifiseres etter spalting fra resinet eller, i noen tilfeller, før løsningsfasesyntese. Metoder for modifisering av N-terminalen eller C-terminalen av et peptid er velkjent i teknikken og inkluderer f.eks. fremgangsmåter for acetylering av N-terminalen eller fremgangsmåter for amidering av C-terminalen. Metoder for modifisering av sidekjeder av aminosyrer eller aminosyreanaloger er likeledes velkjent for fagfolk på peptid-synteseområdet. Valget av modifikasjoner av de reaktive grupper til stede på peptidet vil bestemmes av de karakteristiske egenskaper som den dyktige fagperson fordrer for det cytokinregulerende middel.

Spesielle sykliske peptider kan også være et effektivt cytokinregulerende middel. Et syklisk peptid kan f.eks. erholdes ved å indusere dannelsen av en kovalent binding mellom f.eks. aminogruppen på N-terminalen av peptidet og karboksylgruppen på C-terminalen. Peptidet syklo(His-(D)Phe-Arg-(D)Trp), som kan fremstilles ved å indusere dannelsen av en kovalent binding mellom His og (D)Trp, kan f.eks. ha cytokinregulerende aktivitet. Alternativt kan et syklisk peptid erholdes ved å danne en kovalent binding mellom en terminal reaktiv gruppe og en reaktiv aminosyresidekjede eller mellom to reaktive aminosyresidekjeder. En fagperson vil vite at valget av et spesielt syklisk peptid bestemmes av de reaktive grupper til stede på peptidet, så vel som de ønskede karakteristiske egenskaper for peptidet. Et syklisk peptid kan f.eks. tilveiebringe et cytokinregulerende middel med økt stabilitet, økt oppløselighet, redusert immunogenitet eller redusert eliminering in vivo.

Et nylig syntetisert peptid kan renses ved anvendelse av en metode, slik som reversfase-høyytelsesvæskekromatografi (RP-HPLC), som er beskrevet i detalj nedenfor (se eksempel I), eller andre separasjonsmetoder basert på størrelsen eller ladningen av peptidet. Det rensede peptid kan dessuten karak-teriseres ved anvendelse av disse og andre velkjente metoder, slik som aminosyreanalyse og massespektroskopi, hvilke er beskrevet i detalj nedenfor (se eksempel I).

Foreliggende oppfinnelse angår også farmasøytiske preparater omfattende et cytokinregulerende middel, eller midler, og en farmasøytisk akseptabel bærer. Farmasøytisk akseptable bærere er velkjent i teknikken og inkluderer vandige løsninger, slik som fysiologisk bufret saltløsning eller andre buffere, eller løsningsmidler eller vehikler som glykoler, glyserol, oljer som olivenolje eller injiserbare organiske estere.

En farmasøytisk akseptabel bærer kan inneholde fysiologisk akseptable forbindelser som f.eks. virker til å stabi-lisere det cytokinregulerende middel eller øke absorpsjonen av midlet. Slike fysiologisk akseptable forbindelser inkluderer f.eks. karbohydrater, slik som glukose, sukrose eller dekstraner, antioksidanter som askorbinsyre eller glutation, chelatdannende midler, lavmolekylære proteiner eller andre stabilisatorer eller eksipienser. En fagperson vil vite at valget av en farmasøytisk akseptabel bærer, inkludert en fysiologisk akseptabel forbindelse, avhenger f.eks. av administreringsmåten for det cytokinregulerende middel og de spesielle fysisk-kjemiske karakteristika for det spesifikke cytokinregulerende middel.

Et cytokinregulerende middel som beskrevet ovenfor, eller et farmasøytisk preparat inneholdende et cytokinregulerende middel, kan administreres til et individ for å regu lere patologisk modifisert, inkludert redusert eller forhøyet, cytokinaktivitet i individet. Peptidet eller preparatet kan f.eks. administreres til et individ som en behandling av trau-matiske skader, bakteriell sepsis og endotoksisk sjokk, inflammasjon, smerte, kakeksi, åndenødssyndrom hos voksne, transplantasjonsaterosklerose og patoimmunogene sykdommer som artritt, inflammatorisk tarmsykdom, systemisk lupus erythematosus og andre autoimmundysfunksjoner, hvilke alle er kjennetegnet ved patologisk forhøyet inflammatorisk cytokinaktivitet .

Som anvendt heri, betyr betegnelsen "patologisk for-høyet" at en cytokinaktivitet er forhøyet over et aktivitets-område som er forventet i en normal populasjon av slike individer, og som er forbundet med en patologisk respons. Et normalt område for aktiviteten av IL-1, slik som IL-1(J, til stede i et spesifikt vev kan f.eks. bestemmes ved å ta prøver av et antall individer i populasjonen. Et individ med en patologi som er kjennetegnet ved cytokininduserte patologiske virkninger, kan lett identifiseres ved å bestemme at cytokinaktiviteten i individet er patologisk forhøyet, som er høyere enn det normale området og som fører til en patologisk respons, slik som feber.

Som beskrevet i nærmere detalj nedenfor, kan dessuten peptidene eller de farmasøytiske preparater også anvendes for behandling av fedme, inaktivitetsdekondisjonering og sykdommer formidlet av nitrogenoksid, slik som diabetes og glomerulonefritt, transplantasjonsaterosklerose, multippel sklerose, så vel som for å redusere de negative virkninger av cancerkjemoterapeutisk middel, og for beskyttelse av organer mot skade indusert av kjemoterapeutiske, fungicide (amfotericin), anti-bakterielle (aminoglykosidantibiotika) og antivirus(azidotymi-din)midler, hvilke alle er forbundet med patologisk endrede nivåer av cytokiner.

Inaktivitetsdekondis jonering

Endrede nivåer av cytokiner er forbundet med mange forskjellige tilstander som fører til inaktivitetsdekondisjonering, slik som romfart, immobilisering, ryggmargsskade, sengeleie og trauma. Eksempler på andre tilstander som fører til inaktivitetsdekondisjonering, inkluderer f.eks. simulert vektløshet, "kasting", og denervering.

Eksempelvis endrer romfart mange immunresponser og regulatoriske komponenter av immunresponsen, inkludert cyto-kinnettverket. Romfart, så vel som modellsystemer for romfart, påvirker produksjonen og aktiveringen av forskjellige cytokiner, inkludert interleukiner og TNF. Nivåer av IL-6 og IL-2 forhøyes på den første dag av romfarten og på nytt etter til-bakevendelse fra romfarten.

Cytokiner modulerer også funksjonen av osteoklaster, og IL-1 og TNF er blitt implisert i den hurtige avkalking eller tap av benmineraltetthet som resulterer fra immobilisering, sengeleie og ryggmargsskade. Sammenhengen mellom cytokinekspresjon og økt tilbakegående transport etter skade antyder at cytokiner spiller en rolle ved perifer nerveskade. Sengeleie, når det kombineres med intraartikulær administrering av steroider, gir en spesielt hurtig systemisk virkning på den akutte faserespons som formidles av cytokiner.

Et cytokinregulerende middel ifølge foreliggende oppfinnelse, eller et preparat inneholdende peptidet, kan anvendes for behandling av inaktivitetsdekondisjonering ved å redusere eller lindre de negative virkningene av inaktivitetsdekondis jonering forbundet med endrede cytokinnivåer. De negative virkninger inkluderer f.eks. tap av muskelmasse, bentett-het, treningskapasitet og oksygenforbruk, så vel som reduserte nivåer av oksiderende og antioksiderende enzymer, slik som

soleussitratsyntetase i muskelvev.

Orqanbeskyttelse

Cytokiner spiller også en viktig rolle ved organskade og organbeskyttelse. Cytokiner påvirker f.eks. i betydelig grad slike hendelser og tilstander som organtransplantasjoner, spesielt avvisningen av et transplantert organ, transplantasjonsaterosklerose, iskemireperfusjon, syklosporinindusert nefrotoksisitet, myokardialt infarkt og slag.

Angående organtransplantasjoner er cytokiner, spesielt tumornekrosefaktor (TNF), viktige formidlere av allo-transplantatavvisning. Ytterligere bevis på tilstedeværelse av TNF er blitt demonstrert ved avvisning av hjerte- og nyreallo- transplantater i rotter, så vel som humane nyre- og lever-transplantater. Akutte avvisningsepisoder hos nyretransplanta-sjonspasienter er medfulgt av en økning av serum-IL-6-nivåer. Administrering av glukokortikoider under slike episoder ble av Ray et al., J. Am. Soc. Nephr., 2(12):5214-5221 (1992), rapportert å føre til en hurtig og markert reduksjon av IL-6-nivåer og av alvorligheten av avvisningsepisodene. De cytokinregulerende midler ifølge foreliggende oppfinnelse kan likeledes være anvendelige ved reduksjon av alvorligheten av slike avvisningsepisoder og skaden forårsaket av disse.

Administrering av immunundertrykkende midler, slik som syklosporin, til transplantasjonsindivider påvirker også cytokinaktivitet og forårsaker syklosporinindusert nefrotoksisitet som fører til skade på nyren. Midler som regulerer cytokiner, slik som dem i foreliggende oppfinnelse, kan være effektive ved å redusere syklosporinindusert nefrotoksisitet.

Cytokinregulerende midler ifølge foreliggende oppfinnelse kan dessuten beskytte mot organskade forbundet med iskemireperfusjon, inkludert slik skade som redusert glomerulær filtreringshastighet og økt vaskulær resistens i nyren. Iskemireperfusjonsskade er også blitt forbundet med forhøyel-ser av cytokiner. IL-1 og TNF formidler myokardial iskemi, og økte nivåer av IL-1 kan forekomme under reperfusjonsfasen av skjelettmuskeliskemi. Økt TNF-frigivelse etterfølger både moderat og alvorlig iskemisk skade på leveren.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for beskyttelse av et organ hos et individ mot organskade ved administrering av et cytokinregulerende middel til individet. Organskaden det skal beskyttes mot kan være resultatet av slike tilstander eller hendelser som en organtransplantasjon, administrering av et immunundertrykkende middel, slik som syklosporin, den resulterende skade fra iskemireperfusjon, myokardialt infarkt, slag og lignende.

Som anvendt heri, inkluderer "skade" en skade på et helt organ, slik som dysfunksjon av et organ, eller skade på et vev i organet. I mange tilfeller involverer en slik skade ikke kun økte cytokinnivåer, men også økninger i frie radikaler. De aktiverte hvite blodceller som resulterer fra iskemi, frigir f.eks. oksygenradikaler og utleverer aggressive formidlere, slik som cytokiner og PAF, hvilke er kjemotaktiske for leukocytter. Dette resulterer i en syklus hvori oksygenradikaler og formidlere, slik som cytokiner, er ansvarlige for forsterkningen av postiskemisk skade.

Den type skade som frie radikaler eller cytokiner kan indusere, inkluderer, men er ikke begrenset til, inflammasjon, aterosklerose, økninger av vaskulær permeabilitet, fibrose og nekrose. Disse og andre typer skade kan vurderes histomorfo-logisk ved hjelp av metoder velkjent i teknikken. Skade kan også vises ved organdysfunksjon som ofte avspeiles ved endringer i fysiologiske og biokjemiske parametere som har en tendens til å være spesifikke for et spesielt organ eller vev, og som kan måles rutinemessig ved hjelp av velkjente teknik-ker. Nyredysfunksjon, som er et tegn på nyreskade, kan f.eks. føre til reduksjoner i glomerulær filtreringshastighet og nyreblodgjennomstrømning, så vel som økt renal vaskulær resistens. Eksempler på biokjemiske parametere som kan anvendes som tidlige markører for vevs- og organskade, inkluderer økte nitrogenoksid- eller malondialdehydnivåer. Malondialdehyd er et biprodukt fra lipidperoksidasjon og er derfor en indikasjon på nivåer av frie radikaler. Alternativt, eller i tillegg, kan økte nivåer av slike enzymer som laktatdehydrogenase, en markør for celledød, vurderes.

Organer som kan beskyttes mot skade ved administrering av de cytokinregulerende midler ifølge foreliggende oppfinnelse, inkluderer, men er ikke begrenset til, hjerte, nyrer, lever, lunger, hjerne, muskler, hud eller ben. Et eksempel på vev innen et organ som kan beskyttes ved hjelp av foreliggende oppfinnelse, er hudepitel. Det er også inkludert organer som kan transplanteres, eller som er forbundet med de negative bivirkninger forårsaket av administrering av et immunundertrykkende middel til et transplantasjonsindivid, så vel som organer utsatt for iskemireperfusjon, infarkt, slag eller andre spesifikke tilstander eller hendelser som kan føre til cellulær skade eller død. Flere enn ett organ kan beskyttes ved et tidspunkt.

Cancerkjemoterapi

Et cytokinregulerende middel ifølge foreliggende opp finnelse, eller et preparat inneholdende midlet, kan også anvendes ved cancerkjemoterapi for å redusere den nefrotoksiske virkning eller andre negative virkninger av cancerkjemoterapeutiske midler.

Cancerkjemoterapeutiske midler, slik som cisplatin, "Taxol" og "Adriamycin", induserer og forhøyer produksjonen av cytokiner. "Taxol", et mikrotubulusstabiliserende antineoplas-tisk middel, induserer ekspresjon av TNF og IL-1 og forhøyer produksjonen av TNF i makrofager. Økte konsentrasjoner av IL-6 og TNF forekommer hos pasienter som mottar cisplatin, og hvor cytokinkonsentrasjoner er spesielt forhøyet hos pasienter som erfarer nyre- eller levertoksisitet. Cytokinproduksjon økes også hos cancerpasienter under kjemohypertermi. TNF- og IL-6-nivåer målt når en hypertermiinduserende oppvarmingsløsning inneholdende cisplatin ble administrert, viste en dramatisk økning av IL-6 som forekom innen 30 minutter etter at behand-lingen startet. TNF-verdier ble kun ubetydelig forhøyet.

Som vist i eksemplene, kan anvendelse av et cytokinregulerende middel ifølge foreliggende oppfinnelse ved cancerkjemoterapi redusere den nefrotoksiske virkning av et cancerkjemoterapeutisk middel. Peptidene kan dessuten administreres til et individ som gjennomgår cancerkjemoterapi for å redusere andre negative bivirkninger av kjemoterapeutiske midler, inkludert, men ikke begrenset til, kvalme, oppkast, mukositt, anoreksi, tretthet og andre organdysfunksjoner.

S<y>kdommer formidlet av nitrogenoksid og cytokiner, inkludert diabetes og glomerulonefritt

Cytokiner og nitrogenoksid (NO) er begge viktige formidlere av forskjellige sykdomstilstander, inkludert f.eks. diabetes og glomerulonefritt. Cytokiner og NO regulerer p-celleskade ved tidlig insulinavhengig diabetes mellitus. IL-1, interferon-y og TNF induserer NO i de langerhanske øyer. Parallelt med NO-produksjon svekker IL-1, interferon-y og TNF funksjonen av de langerhanske øyer, reduserer glukosenivåer og reduserer glukoseindusert insulinfrigivelse. De fleste av de skadelige virkninger forårsaket av cytokiner på langerhans-celler, kan forebygges ved blokkering av NO-produksjon. Selv om noen undersøkelser har vist at isolerte humane langerhanske øyer er mer resistente mot de undertrykkende virkninger av cytokiner og NO enn isolerte gnagerlangerhanske øyer, kan cytokiner undertrykke funksjonen av humane langerhanske øyer uten hensyn til deres virkninger på NO-dannelse.

Cytokiner og NO påvirker også graden av skade som resulterer fra glomerulonefritt. TNF og IL-1 kan øke alvorligheten av glomerulær skade ved nefritt, og kan derfor være viktige ved å modulere glomerulær skade klinisk. Karker et al., Clin. Expt. Immunol., 90(2):312-318 (1992), har rapportert at midler som undertrykker cytokiner, er effektive ved å redusere forhøyede albuminnivåer og vevsskade ved glomerulo-nef ritt. Andre undersøkelser har vist at in vivo-induksjon av induserbar nitrogenoksidsyntetase (iNOS) forekommer ved immun-kompleksglomerulonefritt (Jansen et al., Kid. Internat., 45(4):1215-1219 (1994)).

Cytokinregulerende midler ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for behandling av et individ med en sykdom formidlet av nitrogenoksid og cytokiner, slik som diabetes og glomerulonefritt. Som anvendt heri, inkluderer betegnelsen "behandling" en betydning som omfatter reduksjon eller lindring av ett eller flere symptomer eller tilstander forbundet med en spesiell sykdomstilstand formidlet av NO og cytokiner. Behandling av diabetes kan f.eks. manifesteres ved å redusere glukosenivåer i et diabetisk individ.

Virkning av et cytokinregulerende middel på kroppsvekt

Cytokinregulerende midler er anvendelige for å redusere kroppsvekten til et individ. Midlene er spesielt anvendelige for reduksjon av vekten av et overvektig individ. En forbindelse mellom fedme og ikke-insulinavhengig diabetes mellitus (NIDDM) er velkjent i teknikken (se Hotamisligil og Spiegelman, Diabetes, 43:1271-1278 (1994a)). Økt TNF-oc-ekspresjon er blitt påvist i fettvevet hos overvektige individer og er blitt antydet å spille en rolle ved fremkomsten av NIDDM i disse individer (Hotamisligil et al., J. Clin. Invest., 95:2409-2415 (1995)). Forsøk på å nøytralisere TNF-aktivitet ved anvendelse av et antistoff som binder TNF-reseptoren, førte imidlertid ikke til betydelig vekttap ved forsøk i en rottefedme-/diabetesmodell, Zucker fa/fa-rottemodellen

(Hotamisligil et al., J. Clin. Invest., 94:1543-1549 (1994b)).

Administrering av et cytokinregulerende middel, EX-2, til normale eller overvektige rotter førte bemerkelsesverdig til en betydelig reduksjon av graden av kroppsvektøkning eller en betydelig reduksjon av kroppsvekt, avhengig av den administrerte dose (se eksempel XX). Som anvendt heri, benyttes betegnelsen "reduksjon av kroppsvekt" generelt for å bety en reell reduksjon av kroppsvekt eller en reduksjon av graden av kroppsvektøkning over tid sammenlignet med den normalt forventede kroppsvektøkning i tidsperioden. Som vist i eksempel XX, gav EX-2 også en liten, men signifikant, reduksjon av kroppsvekten til normale (ikke-overvektige) rotter. Disse resultater indikerer at et cytokinregulerende middel kan forårsake en reduksjon av graden av kroppsvektøkning og en reduksjon av kroppsvekt.

Det observerte vekttap hos EX-2-behandlede rotter korrelerte med en økt metabolsk hastighet, som bestemt ved økt hvileforbruk av oksygen. Disse resultater viser at et cytokinregulerende middel også er anvendelig for å øke et individs hvileopptak av oksygen. Som diskutert ovenfor, kan et cytokinregulerende middel også dempe reduksjonen av det maksimale oksygenforbruk som f.eks. forekommer på grunn av inaktivitetsdekondis jonering. Evnen til å øke maksimalt oksygenforbruk i et individ kan tilveiebringe en signifikant klinisk fordel til et individ som f.eks. lider av kongestiv hjertesvikt eller en annen tilstand kjennetegnet ved et utilstrekkelig oksygenopptak, slik som reduksjon av oksygenforbruk som forekommer under dekondisjonering (se eksempel XIII). Inaktivitetsdekondis joneringsresultatene viser dessuten at gjentatt behandling med et cytokinregulerende middel i minst ca. 2 uker kan produ-sere en positiv tilpasningsendring i et individ, hvilket fører til økt aerob kapasitet og treningsytelse. Et cytokinregulerende middel finner således ytterligere anvendelse for å øke oksygenforbruk i et individ. Som anvendt heri, benyttes betegnelsen "økt oksygenforbruk" eller "økt oksygenopptak" i bred forstand for å bety en økning over et normalt basislinje-nivå ved hvile, eller maksimalt oksygenopptak hos et individ eller en reduksjon av det forventede tap av hvileforbruk eller maksimalt forbruk av oksygen.

Behandling av negative bivirkninger formidlet av cancerkjemoterapi hos mennesker

Cytokinregulerende midler kan anvendes for å lindre eller redusere de negative bivirkninger av cancerterapeutiske midler. Et cytokinregulerende middel kan administreres sammen med et cancerterapeutisk middel under et behandlingsregime for en cancer, eller kan administreres sammen i et profylaktisk regime med f.eks. "Taxol", som administreres for å redusere tilbakefallet av brystcancer.

Eksempel XIX beskriver anvendelse av det cytokinregulerende middel EX-2 for å lindre de skadelige bivirkninger forbundet med cancerterapeutiske midler, slik som cisplatin, "Taxol" og "Adriamycin", som induserer og forhøyer produksjonen av cytokiner.

EX-2 kan administreres ved intravenøs infusjon til pasienter som gjennomgår, eller som er i ferd med å gjennomgå, cancerkjemoterapi eller cancerkjemopreventive regimer. Cisplatin, "Taxol", "Adriamycin" eller en annen kjemoterapeutisk eller radiologisk behandling kan f.eks. administreres sammen med et cytokinregulerende middel for å redusere eller inhibere de skadelige bivirkninger forårsaket av kjemoterapien eller radioterapien.

Økte nivåer cytokiner i pattedyr

Et cytokinregulerende middel ifølge foreliggende oppfinnelse, eller et preparat inneholdende midlet, kan også anvendes for å øke det fysiologiske nivå av ett eller flere cytokiner. En bestemt tilstand kan f.eks. redusere nivået eller aktiviteten av et cytokin, hvilket kan inhibere hele, eller en del av, en immunrespons eller immunsystemet. Administrering av et cytokinregulerende middel i en farmasøytisk virkningsfull dose kan forhøye nivået eller aktiviteten til cytokinet og derved tillate reduksjon av immunundertrykkelses-nivået.

Et cytokinregulerende middel kan øke nivåene av IL-10 i et pattedyr, slik som et menneske (se figurene 2 og 3). IL-10 kan blokkere aktiveringen av noen inflammatoriske cytokiner, inkludert TNF, IL-1 og IL-6, mens det kan oppregulere cytokiner som IL-12. IL-10 stimulerer også proliferasjonen av mastceller og tymocytter. IL-10 inhiberer flere monocytt- og makrofagfunksjoner, inkludert f.eks. antigenpresentasjon til T-celler ved å minske klasse II-MHC-ekspresjon; syntese av IL-1, IL-6, IL-8, CSF og TNF; og mikrobiocidaktiviteter. De inhiberte mikrobiocidaktiviteter inkluderer undertrykkelse av produksjon av nitrogenoksider og baktericide metabolitter. Som en konsekvens av monocytt- og makrofag-IL-10-formidlet inhibering inhiberes aktiviteten av noen typer hjelper-T-celler. THl-celler, som er ansvarlige for celleformidlede funksjoner, slik som forsinket type hypersensitivitetsceller og cytotoksiske T-celler, blir spesielt inhibert. Som en ytterligere konsekvens av THl-celleinhibering forsterkes aktiviteten av TH2-cellene, spesielt T-celleundersettet som for-sterker B-celleaktivering, resistens mot bakterier og inn-vollsormer og allergiske reaksjoner. Som beskrevet heri, kan administrering av et cytokinregulerende middel øke plasma-nivåene av IL-10 i pattedyr (se eksemplene XVII og XVIII og figurene 2 og 3), og kan derfor være anvendelig for å modulere f.eks. immunmottakelignet i et individ.

Cytokinregulerende midler, eller farmasøytiske preparater inneholdende peptidene, kan anvendes for behandling av enhver av de ovenfor beskrevne patologier og tilstander. En fagperson vil vite at et farmasøytisk preparat omfattende et cytokinregulerende middel kan administreres til et individ med forhøyet cytokinaktivitet på forskjellige måter, inkludert f.eks. oralt, intravaginalt, rektalt eller parenteralt, slik som intravenøst, intramuskulært, subkutant, intraorbitalt, intrakapsulært, intraperitonealt, intracisternalt eller ved passiv eller lettet absorpsjon gjennom huden ved anvendelse av f.eks. et hudplaster eller transdermal iontoforese. Preparatet kan dessuten administreres ved injeksjon, intubasjon, oralt eller topisk, idet den sistnevnte kan være passiv ved f.eks. direkte applisering av en salve eller et pulver, eller aktiv ved f.eks. anvendelse av en nesespray eller et inhalasjons-medikament. Et cytokinregulerende middel kan også administreres som en topisk spray, i hvilket tilfelle en komponent av preparatet er et egnet drivmiddel. Det farmasøytiske preparat kan altså inkorporeres, hvis ønsket, i liposomer, mikro-kuler eller andre polymere matrikser (Gregoriadis, Liposome Technology, vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, FL, 1984, som er inkorporert heri ved referanse). Liposomer, som består av fosfolipider eller andre lipider, er f.eks. ikke-toksiske, fysiologisk akseptable og metaboliserbare bærere som er for-holdsvis enkle å fremstille og administrere.

Cytokiner kan uttrykkes lokalt, slik som på et sted for lokalisert infeksjon, eller de kan uttrykkes systemisk, f.eks. som ved inaktivitetsdekondisjonering eller ved en immunrespons. Cytokinekspresjon kan indusere pyreksi (feber) og hyperalgesi (ekstrem følsomhet for smerte) hos et individ, så vel som makrofag- og monocyttaktivering, hvilket produserer eller bidrar ytterligere til en inflammatorisk respons i et individ. Fordi cytokinekspresjon kan være lokalisert eller systemisk, vil en fagperson velge en spesiell administrerings-måte og metode for det cytokinregulerende middel basert på kilden for og fordelingen av cytokiner i et individ. Til et individ som lider av en systemisk tilstand, slik som inaktivitetsdekondis jonering, kan f.eks. et farmasøytisk preparat omfattende et cytokinregulerende middel administreres intra-venøst, oralt eller ved enhver annen metode som fordeler det cytokinregulerende middel systemisk. Til et individ som lider av en patologi forårsaket av lokalisert cytokinekspresjon, slik som akutt åndenødssyndrom, kan et cytokinregulerende middel suspenderes eller oppløses i den egnede farmasøytisk akseptable bærer og administreres direkte i lungene ved anvendelse av f.eks. en nesespray.

For å regulere den biologiske aktivitet av et cytokin må det cytokinregulerende middel administreres i en effektiv dose som er ca. 0,0001-0,5 mg/kg kroppsvekt pr. injeksjon,

eller ved alternative administreringsmåter er en effektiv dose ca. 0,0001-100 mg/kg kroppsvekt. Den totale effektive dose kan administreres til et individ som en enkelt dose, enten som en bolus eller ved infusjon i en relativt kort tidsperiode, eller den kan administreres ved anvendelse av en oppdelt behand-lingsprotokoll hvori de mange doser administreres i løpet av en mer forlenget tidsperiode. En fagperson vil vite at konsen-trasjonen av et cytokinregulerende middel fordret for å oppnå en effektiv dose i et individ avhenger av mange faktorer, inkludert individets alder og generelle helse, så vel som

administreringsmåten og antall behandlinger som skal administreres. I betraktning av disse faktorer vil den dyktige fagperson justere den spesielle dose for å oppnå en effektiv dose for virkningsfull regulering av cytokinaktivitet.

Eksempler på cytokinregulerende midler og effektiviteten av et cytokinregulerende middel ved forebyggelse eller minimalisering eller eliminering av ugunstige biologiske virkninger formidlet av cytokiner, er vist nedenfor og oppsummert i tabellene I-V. Som beskrevet nedenfor, kan cytokinregulerende midler, slik som peptidene beskrevet i eksempel II, effektivt regulere cytokinekspresjon i mus (eksemplene III og IV) og avhjelpe cytokinformidlet smerte, svelling, feber og dødelighet, som vist ved anvendelse av muse-, rotte- og kanin-modellsystemer som i teknikken er anerkjent for å kunne forut-si virkningsfullhet hos mennesker (eksemplene V-XII).

Forbindelsene beskrevet heri kan anvendes som medika-menter for behandling av tilstander som inflammasjon, smerte, kakeksi og patoimmunogene sykdommer som artritt, inflammatorisk tarmsykdom, systemisk lupus erythematosus og andre autoimmundysfunksjoner som er kjennetegnet ved endret cytokinaktivitet. Eksemplene tilveiebringer dessuten bevis for at et cytokinregulerende middel ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendelig ved å svekke de negative aspekter av inaktivitetsdekondis jonering (eksempel XIII), beskytte organer, spesielt etter iskemireperfusjonsskade og syklosporinindusert nefrotoksisitet (eksempel XIV), redusere de nefrotoksiske virkninger av cancerkjemoterapi (eksempel XV), behandle sykdomstilstander forbundet med nitrogenoksid, inkludert diabetes og glomerulonefritt (eksempelXVI), og redusere kroppsvekten til et individ (eksempel XX).

Et ytterligere bevis for at midlene ifølge foreliggende oppfinnelse regulerer cytokinekspresjon og derfor er anvendelige ved behandling av de ovennevnte tilstander, til-veiebringes i eksempleneXVII-XVIX. Økende cytokinnivåer i pattedyr, inkludert mus (eksempel XVII) og mennesker (eksempel XVIII), etter administrering av et cytokinregulerende middel tilveiebringer ytterligere bevis for at midlene ifølge foreliggende oppfinnelse regulerer cytokinekspresjon og aktivitet.

De følgende eksempler er ment å illustrere, men ikke

begrense, foreliggende oppfinnelse.

Eksempel I

Syntese av peptidcytokinrequlerende midler

Dette eksempel beskriver metoder for fastfasesyntese av peptidcytokinregulerende midler.

A. Nie - Gin - His - ( D) Phe - Arg - ( D) Trp - Gly- NH2

Et peptidcytokinregulerende middel med aminosyresekvens Nie - Gin - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - Gly ("EX-1") ble syntetisert ved anvendelse av en modifikasjon av fastfase-peptidsyntesemetoden ifølge Merrifield (1964). I alt vesentlig ble MBHA-resin inneholdende et t-BOC-glysinderivat (Advanced Chemtech; Louisville, KY) tilsatt til en reaksjonsbeholder egnet for fastfase-peptidsyntese (se Houghten (1985), supra). Resinet ble vasket tre ganger med metylenklorid, og t-BOC-beskyttelsesgruppen ble fjernet ved anvendelse av trifluor-eddiksyre (TFA) inneholdende 1-2 % anisol i metylenklorid. Resinet ble deretter vasket med metylenklorid og behandlet med diisopropyletylamin.

Peptidet ble utvidet ved tilsetning av 3,2 ekvivalenter N-formyl-BOC-beskyttet D-tryptofan i dimetylformamid og 3,0 ekvivalenter disykloheksylkarbodiimid. Reaksjonen ble overvåket ved anvendelse av ninhydrin og ble tillatt å forløpe i 25 minutter, hvoretter resinet ble vasket med metylenklorid. Prosedyren ble gjentatt ved anvendelse av ditoluyl-BOC-arginin, og deretter med hver av de ønskede beskyttede aminosyrer inntil det komplette heptapeptid var syntetisert.

Etter syntese av heptapeptidet ble N-formylbeskyttel-sesgruppen på tryptofanresten fjernet ved anvendelse av 20 % piperidin i DMF, og resinet ble vasket med metylenklorid. Peptidet ble spaltet fra resinet ved anvendelse av vannfritt hydrogenfluorid (HF) inneholdende 10 % anisol, reaksjons-blandingen ble konsentrert, og resten ble ekstrahert med vandig eddiksyre. Eddiksyrefraksjonen som inneholdt den opp-løste prøve, ble fjernet, og resten ble vasket med vann. Vaskeløsningen ble tilsatt til eddiksyrefraksjonen, og den kombinerte prøve ble konsentrert. Det resulterende råpeptid ble renset ved RP-HPLC (Vydac, C-18-kolonne, ved anvendelse av en gradient fra 1 til 60 % løsning B i 30 minutter (løsning A er 0,1 % TFA/vann, og løsning B er 0,1 % TFA/acetonitril)).

Peptidet ble bestemt til å være 97 % rent ved RP-HPLC (Vydac, C-18-kolonne, ved anvendelse av isokratisk 24 % løsning B; løsning A og løsning B som ovenfor; absorpsjon bestemt ved 215 nm). Massen av det rensede heptapeptid ble bestemt ved plasmadesorpsjonsmassespektrometri ved anvendelse av en Biolon 20 masseanalysator-"time of flight"-detektor. Massen av EX-l-peptidet ble målt til 942,7, hvilket var vesentlig det samme som den forventede molekylmasse (MS (M + 1) = 942,2).

B. His - ( D) Phe - Arg - {( D) Trp( CH2)} - ( NAc) Gly- NHn

Et cytokinregulerende middel ifølge foreliggende oppfinnelse med aminosyresekvens His - (D)Phe - Arg - {(D)Trp-(CH2)} - (NAc)Gly-NH2ble syntetisert og renset som beskrevet ovenfor, med unntak av de følgende modifikasjoner. Boc-(D)Trp ble omdannet til det tilsvarende N,O-dimetylhydroksamat ved anvendelse av metylklorformiat ogN,0-dimetylhydroksylamin-hydroklorid. Reduksjon av tryptofanamidet med litiumaluminium-hydrid gav Boe-(D)Trp-aldehydet.

En oppløsning av Boe-(D)Trp-aldehydet og natriumcyan-borhydrid i DMF ble tilsatt til glysin bundet til Rink-amid-resinet i DMF inneholdende 1 % eddiksyre. Etter at den reduk-tive aminering var fullstendig ble det sekundære amin acetylert med eddiksyreanhydrid, og resinet ble ristet med 1:1 tri-fluoreddiksyre og metylenklorid for å fjerne Boc-gruppen. Sekvensiell kobling av de resterende aminosyrer ble utført på et peptidsyntetiseringsapparat (Applied Biosystems) for å fremstille peptidet His - (D)Phe - Arg - {(D)Trp(CH2)} -

(NAc)Gly-NH2. Peptidet ble spaltet fra resinet og renset som beskrevet ovenfor.

Eksempel II

Fremstilling av acetylerte peptidcytokinregulerende midler

Dette eksempel beskriver metoder for fremstilling av N-acetylerte peptidcytokinregulerende midler.

Heptapeptidet Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2ble syntetisert som beskrevet i eksempel I.A., med unntak av at før spalting av det nysyntetiserte peptid fra resinet ble aminoterminalen i peptidet acetylert ved behandling av prøven med eddiksyreanhydrid, diisopropyletylamin og metylenklorid i 2 timer. Etter acetylering ble heptapeptidet spaltet fra resinet, renset ved RP-HPLC ogkarakterisert vedmassespektro-metri som beskrevet ovenfor. Det acetylerte heptapeptid fra eksempel II, betegnet heri som EX-2, ble bestemt til å være 98 % rent, og massen ble målt til 985,2 dalton, hvilket var det samme som den forventede molekylmasse.

Lignende metoder som beskrevet i eksemplene I og II ble anvendt for å syntetisere andre cytokinregulerende midler ifølge foreliggende oppfinnelse, inkludert Ac-(sykloheksyl)-Gly-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2("EX-3"); Ac-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2("EX-4"); Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2("EX-5"); og Ac-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-NH2("EX-6"). Ac-His-(D)Phe-Arg-{(D)Trp(CH2)}-(NAc)Gly-NH2ble fremstilt ved anvendelse av metoden beskrevet i eksempel I.B., med unntak av at før spalting av peptidet fra resinet ble peptidet acetylert ved anvendelse av overskudd av eddiksyreanhydrid.

Eksempel III

Reduksjon av lipopolysakkaridinduserte tumornekrosefaktor-nivåer i mus

Dette eksempel beskriver effektiviteten av to cytokinregulerende midler for reduksjon av tumornekrosefaktor-(TNF)nivåer i lipopolysakkarid(LPS; endotoksin)behandlede mus.

Balb/c-hunnmus med vekt ca. 20 g ble plassert i to grupper, én kontrollgruppe og én behandlingsgruppe. 5 mg/kg LPS i 0,9 % saltløsning ble administrert ved intraperitoneal (IP) injeksjon i kontrollmusene. Mus i behandlingsgruppen ble først injisert IP med 30^g EX-2 eller 150 jug EX-3 i salt-løsning, og deretter, 1 minutt etter at EX-2 eller EX-3 var administrert, mottok musene LPS som beskrevet for kontrollgruppen .

Blodprøver ble oppsamlet fra den orbitale sinus hos behandlings- og kontrollmus ved forskjellige tidspunkter opptil 4 timer etter at LPS var administrert. Plasmaet ble separert ved sentrifugering ved 3000 x g i 5 minutter, deretter fortynnet med 4 volumer 1 x fosfatbufret saltløsning (pH 7,4) inneholdende 1 % bovint serumalbumin. En 100 pl prøve av serum ble analysert ved ELISA for TNF-a (Genzyme; Cambridge, MA).

Det gjennomsnittlige (+/- SEM) TNF-a-nivå i 6 mus fra hver gruppe ble bestemt, og prosent reduksjon i TNF-nivåer ble beregnet. Som vist i tabell I, resulterte behandling av mus med EX-2 i en 50 % reduksjon i nivået av TNF-a sammenlignet med ubehandlede kontrollmus. Behandling av mus med EX-3 resulterte likeledes i en 56 % reduksjon av nivået av TNF-a sammenlignet med ubehandlede kontrollmus, og behandling med EX-4 resulterte i en 53 % reduksjon (tabell II). Disse resultater indikerer at peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan begrense LPS-indusert cytokinaktivitet.

Eksempel IV

Reduksjon av lipopolysakkaridinduserte interleukin- 6- nivåer i mus

Dette eksempel beskriver effektiviteten av et cytokinregulerende middel for reduksjon av interleukin-6(IL-6)-nivåer i LPS-behandlede mus.

Balb/c-mus ble gruppert og behandlet som beskrevet i eksempel III ovenfor. Blodprøver ble erholdt fra den orbitale sinus ved forskjellige tidspunkter opptil 6 timer, og serum ble oppsamlet og fortynnet som beskrevet ovenfor. En 100 pl aliguot ble analysert for IL-6-nivåer ved anvendelse av en IL-6-spesifikk ELISA ved en modifikasjon av metoden ifølge Starnes et al., J. Immunol., 145:4185-4194 (1990), som er inkorporert heri ved referanse.

Det gjennomsnittlige (+/- SEM) IL-6-nivå i 6 mus fra hver gruppe ble bestemt, og prosent reduksjon i IL-6 ble beregnet. Som vist i tabell I, resulterte behandling av mus med EX-2 i en 60 % reduksjon i nivået av IL-6 sammenlignet med ubehandlede kontrollmus.

Eksempel V

Karraqenindusert potesvellinq

Dette eksempel beskriver effektiviteten av to cytokinregulerende midler for å dempe inflammasjon og smerte.

Karragenindusert potesvelling ble indusert ved anvendelse av en modifikasjon av metodene ifølge Hiltz og Lipton, Peptides, 11:979-982 (1990); Vinegar et al., Fed. Proe, 46:118-126 (1987); og Vinegar et al., J. Pharmacol. Expt. Therap., 166:96-103 (1969), hvilke alle er inkorporert heri ved referanse. Kort beskrevet ble voksne Balb/c-hunnmus bedøvd ved IP-injeksjon av 7 mg/kg ketoamin og 0,6 mg/kg rompun. Fotputetykkelse ble målt ved anvendelse av et fjærbelastet mikro-meter (Swiss Precision Instruments). Fotputetykkelse ble uttrykt i enheter på 0,254 mm. Etter at basislinjemålinger var erholdt ble musene injisert i en bakbenspote med enten 0,2 ml fysiologisk saltløsning (kontroll) eller varierende doser av EX-2 eller EX-3 i 0,2 ml saltløsning (behandlingsgruppe). Den første injeksjon ble umiddelbart etterfulgt av injeksjon av 0,02 ml 0,15 % K-karragen (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO).

Bakbensfotputetykkelse ble målt hver time i 6 timer, endringen i tykkelse ble bestemt, og prosent reduksjon av svellingen på grunn av behandling med EX-2 ble beregnet. Som vist i tabellene I og II, reduserte IP-injeksjon av 1 pq EX-2 eller 1 pq EX-3 karragenindusert svelling med henholdsvis 45 % eller 49 % ved måling etter 2 timer.

Eksempel VI

Lipopolysakkaridindusert dødelighet

Dette eksempel beskriver effektiviteten av de cytokinregulerende midler EX-2, EX-3 og EX-4 ved reduksjon av dødeligheten fra sepsis indusert ved administrering av LPS.

Disse eksperimenter ble utført basert på informasjon rapportert av Rivier et al., Endocrinology, 125:2800-2805

(1989), som er inkorporert heri ved referanse. Voksne Balb/c- hunnmus ble gitt mat og vann ad libitum. Musene ble injisert IP hver 4. time i 40 timer med 30-300 pq EX-2, EX-3 eller EX-4 i 0,2 ml saltløsning (behandlingsgruppe) eller med 0,2 ml saltløsning alene (kontrollgruppe) (10 mus pr. gruppe). Umiddelbart etter den første injeksjon ble 0,6 mg LPS-endotoksin i 0,2 ml saltløsning administrert til hver mus. Etter LPS-injeksjon ble EX-2 eller saltløsning administrert til henholdsvis musene i behandlingsgruppen eller kontrollmusene hver 4. time i 3 6 timer.

Som vist i tabellene I og II, produserte administrering av 3,3 mg EX-2, EX-3 eller EX-4 (11 injeksjoner på 300 pq) henholdsvis 83 %, 86 % og 75 % økning i overlevelse sammenlignet med kontrollmus. Disse resultater viser at intraperitoneal administrering av de cytokinregulerende midler ifølge foreliggende oppfinnelse kan redusere dødelighet på grunn av LPS-indusert sepsis.

Eksempel VII

Reduksjon i interleukin- ip- indusert hyperalqesi

Dette eksempel beskriver effektiviteten av et cytokinregulerende middel, EX-2, ved tilveiebringelse av smerte-profylakse.

Disse eksperimenter ble utført ved anvendelse av en modifikasjon av metodene beskrevet av Poole et al., Br. J. Pharmacol., 105:489-492 (1992); Follenfant et al., Br. J. Pharmacol., 98:41-43 (1989); og Randall og Sellito, Arch. Internatl. Pharmacodyn., 121:409-419 (1957), hvilke alle er inkorporert heri ved referanse. Voksne Sprague-Dawley-hannrotter (175-275 g) ble testet for hyperalgesi ved hjelp av en potetrykkteknikk ved anvendelse av variabel trykkinstrumen-tering (IITC Life Sciences; Woodland Hills, CA). Rotter ble akklimatisert til oppholdsmiljøet og ble oppbevart i 3 dager før en treningsperiode ble innledet. Dagen før hyperalgesi-eksperimentene skulle starte ble hver rotte plassert i en sokk, og to variable potetrykktester ble utført med 15 minutters mellomrom. Den neste dag ble rottene forhåndstestet for å bestemme trykket (mmHg) ved hvilket hvert dyr utviste flukt-reflekser, slik som stritting imot med hele kroppen og/eller frembringelse av lyder. Cirka 5-10 % av rottene viste ingen

reaksjon og ble eliminert fra videre eksperimenter.

Dyr som reagerte på potetrykket, ble forhåndsbehandlet ved IP-injeksjon av forskjellige konsentrasjoner av EX-2 i et volum på 1 ml/kg (behandlingsgruppe) eller saltløsning alene (kontrollgruppe). Etter 20 minutter ble 100 pl IL-ip (1 U/100 pl) administrert til rotter via injeksjon i fotsålen. 2 timer etter IL-l-administrering ble rotter underkastet to ytterligere potetrykktester, og trykkøkningen i mmHg som kunne anvendes på de EX-2-behandlede rotter sammenlignet med kontrollrottene, ble bestemt. Som vist i tabell I, økte behandling med 1 pg EX-2 den mengde trykk som rottene ville tolerere med 125 % sammenlignet med kontrollrottene.

Eksempel VIII

Åndenødssyndrom hos voksne

Dette eksempel beskriver effektiviteten av et cytokinregulerende middel, EX-2, ved minimalisering av åndenøds-syndrom hos LPS-behandlede rotter.

Disse eksperimenter ble utført ved anvendelse av en modifikasjon av metodene beskrevet av Ulich et al., Am. J. Pathol., 141:61-68 (1992), og av Wheelden et al., Lab. Animals, 25:29-37 (1992), hvilke er inkorporert heri ved referanse. Harlan Sprague-Dawley-hannrotter ble bedøvd ved anvendelse av en blanding av 70 mg/kg ketamin og 6 mg/kg rompun injisert IP. Et 2-3 cm innsnitt ble gjort i halsen på hver bedøvde rotte, og luftrøret ble blottlagt ved stump disseksjon av det omgivende bløtvev. Rottene ble oppspent på en nesten vertikal plate, og intratrakeale injeksjoner ble utført ved at det i det blottlagte luftrør, ved et punkt 1 cm bak strupe-hodet, ble innført en 25 G x 12,7 mm nål forbundet med en 1 cm<3>sprøyte.

Hver rotte mottok 0,5 ml/kg saltløsning eller

0,5 ml/kg 10 mg/ml (5 mg/kg) LPS-endotoksin via langsom intratrakeal administrering. Umiddelbart etter administrering av LPS-endotoksin ble rottene injisert IP med 1 mg/kg av enten saltløsning (kontroll) eller saltløsning inneholdende forskjellige konsentrasjoner av EX-2 (behandlingsgruppe). Rottene ble opprettholdt i den oppreiste posisjon i 1-2 minutter for å lette fordeling av LPS og saltløsningen i lungen. Innsnittene

ble lukket, og rottene ble tillatt å komme seg. 2 og 4 timer etter intratrakeal injeksjon ble saltløsning eller EX-2 på nytt administrert IP til henholdsvis kontroll- og behandlings-rotter. 6 timer etter intratrakeal injeksjon ble rottene bedøvd på nytt, og blodet ble fjernet via hjertepunktur. Serum ble oppsamlet og oppbevart. Halsen og brystet ble åpnet for å blottlegge luftrør og lunger, lungene ble vasket med 6 x 5 ml saltløsning ved anvendelse av en 27 G x 19 mm nål, og vaske-fluidet ble sammenslått.

Det totale antall polymorfonukleære leukocytter (PMN; nøytrofiler) i det bronkoalveolære vaskefluid ble tellet i de EX-2-behandlede rotter og sammenlignet med antallet i kontrollrottene. Som vist i tabell I, gav behandling med 100 pg/kg EX-2 en inhibering av økningen av PMN-infiltrering i LPS-behandlede lunger på 58 %.

Eksempel IX

Inhibering av interleukin- lfl- eller lipopolysakkaridindusert temperaturøkning

Dette eksempel beskriver effektiviteten av de cytokinregulerende midler EX-2, EX-3 og EX-4 ved inhibering av kroppstemperaturøkning i rotter som respons på to forskjellige midler.

Wistar-hannrotter (45-75 dager gamle) ble plassert i et temperaturkontrollert rom ved 2 6 °C, hvilket er temperatur-messig nøytralt for rotters normale kroppstemperatur, og ble opprettholdt i rommet med fri tilgang på mat og vann i 24 timer før testing. På morgenen for undersøkelsen ble rottene merket for identifisering og veid. Temperaturen hos hver rotte ble bestemt ved å plassere dyret i et regulerings-bur utformet for å minimalisere stress og innsette en tempera-turprobe (YSI-probe nr. 402) 3-5 cm i dyrets rektum. Temperaturen ble registrert 15 sekunder etter at avlesningen var stabil. Målinger ble gjentatt 1 time senere for å etablere en basislinjetemperatur for hver rotte.

Etter at basislinjetemperaturene var etablert ble rottene injisert IP med saltløsning, IL-lp eller LPS-endotoksin. Rottene ble deretter injisert IP med enten saltløsning

(kontroll) eller forskjellige konsentrasjoner av EX-2, EX-3 eller EX-4 (behandlingsgruppe). Temperaturen i rottene ble målt hver time i 6 timer, og inhiberingen av EX-2, EX-3 eller EX-4 av temperaturøkningen på grunn av IL-ip eller LPS ble bestemt.

Som vist i tabell I, inhiberte behandling med

500 pg/kg EX-2 IL-l-indusert feber med 52 %. Behandling med 50 eller 150 pg/kg EX-2 inhiberte dessuten LPS-indusert feber med henholdsvis 45 % eller 52 % ved måling 6 timer etter LPS-injeksjon. Behandling med 150 pg/kg EX-3 eller EX-4 inhiberte dessuten LPS-indusert feber med henholdsvis 57 % og 52 %

(tabell II). Disse resultater viser at forskjellige cytokinregulerende midler ifølge foreliggende oppfinnelse effektivt kan redusere feber.

Eksempel X

Reduksjon av arakidonsyreindusert øresvellinq hos mus

Dette eksempel viser at EX-2 og EX-3 kan redusere arakidonsyreindusert øresvelling hos mus.

Eksperimenter ble utført ved anvendelse av Balb/c-hunnmus med vekt 18-23 g. Saltløsning eller 100 pg EX-2 eller EX-3 ble administrert IP 30 minutter før topisk applisering av arakidonsyre (AA). En 10 pl pipette ble anvendt for å appli-sere 10 pl AA-løsning (100 mg/ml etanol; Calbiochem-Novabio-chem; San Diego, CA) på de indre og ytre overflater av det høyre øre hos hver mus. 10 pl etanol alene ble applisert på den indre og ytre overflate av det venstre øre hos hver mus.

Øretykkelse ble målt manuelt med en fjærbelastet krumpasser umiddelbart før og 60 minutter etter AA-applisering. Økning av øretykkelsen ble beregnet ved å subtrahere den observerte endring i kontrolløret fra den observerte endring i AA-behandlet øre. Verdien for hver gruppe (salt-løsning og kontroll) er gjennomsnittet for svellingen observert hos de individuelle mus i hver gruppe. Den prosentvise reduksjon av svelling er basert på svellingen observert i kontrollgruppen med saltløsning. Som vist i tabellene I og II, reduserte EX-2 og EX-3 AA-indusert øresvelling med henholdsvis 72 % og 62 %.

Eksempel XI

Reduksjon av morfinindusert respirasjonssenkinq i kaniner

Dette eksempel viser at EX-2 og EX-3 kan redusere senkingen av respirasjon indusert av morfin i kaniner.

Shelton-hannkaniner (3-4 kg) ble fastspent og utstyrt med en respirasjonstransduser (modell F-RCT; Grass Instruments; Quincy, MA) rundt brystkassen like bak forlemmene. Transduseren ble forbundet med en Grass-polygraf via en EKG-kabel. En intravenøs linje ble etablert for legemiddeladmini-strering ved å kanylere den marginale ørevene ved anvendelse av en 25G sommerfuglnål.

Kaninenes pusting ble tillatt å stabiliseres, og deretter ble morfinsulfat (2 mg/kg i 0,5 ml saltløsning) administrert ved intravenøs (iv) injeksjon, og respirasjonshastighet og dybde ble registrert i 10 minutter. En andre dose morfin ble administrert, og deretter, etter 10 minutter, ble EX-2 eller EX-3 (10 pg/kg i 0,5 ml saltløsning) administrert iv, og kaninene ble registrert i 20 minutter. To ytterligere doser av EX-2 eller EX-3 (20 pg/kg i 1,0 ml saltløsning) ble administrert med 10 minutters mellomrom, dvs. 40 og 60 minutter etter den første morfininjeksjon.

Resultater ble beregnet som den prosentvise endring fra basislinjeverdier og er uttrykt som differansen av gjennomsnittsverdien for behandlingsgruppen minus gjennomsnittsverdien for kontrollgruppen ved slutten av eksperimentet (80 minutter). Som vist i tabellene I og II, reduserte EX-2 og EX-3 den morfininduserte respirasjonssenking i kaniner med henholdsvis 50 og 65 %.

Eksempel XII

Virkning av oralt administrerte cytokinregulerende midler ved reduksjon av TNF- g- nivåer og LPS- indusert dødelighet

Dette eksempel beskriver den orale effektivitet av forskjellige cytokinregulerende midler ved reduksjon av LPS-induserte TNF-a-nivåer og dødelighet hos mus.

De LPS-induserte dødelighetsundersøkelser ble utført basert på informasjon rapportert av Rivier et al., supra, 1989. Voksne Balb/c-hunnmus ble gitt mat og vann ad libitum. Mus ble administrert med 150 pg eller 300 pg EX-2, EX-3, EX-5 eller EX-6 i 100 pl saltløsning ved foring gjennom et rør hver 4. time i 40 timer (totale doser på henholdsvis 1,65 mg og 3,3 mg). Kontrollmus mottok 100 pl saltløsning alene. Umiddelbart etter den første dose av cytokinregulerende middel eller saltløsning ble 0,6 mg LPS i 0,2 ml saltløsning administrert ved IP-injeksjon. En statistisk signifikant økning i overlevelse ble observert hos mus som mottok 3,3 mg EX-5 (63 %), 1,65 mg EX-6 (68 %) eller 3,3 mg EX-5 (44 %) sammenlignet med kontrollmus (0 %) eller mus som mottok EX-2 eller EX-3 (0-11 %) .

Evnen til oralt administrerte cytokinregulerende midler til å redusere LPS-induserte TNF-a-nivåer ble også undersøkt. Balb/c-hunnmus (20 g) ble administrert 150 pg eller 300 pg EX-2, EX-3, EX-5 eller EX-6 i 100 pl saltløsning ved foring gjennom et rør. Kontrollmus mottok 100 pl saltløsning alene. 1 minutt senere ble 0,1 mg LPS administrert ved IP-injeksjon. Prøver ble oppsamlet, og TNF-a-nivåer ble bestemt som beskrevet i eksempel III ovenfor.

De gjennomsnittlige TNF-a-nivåer i musene fra hver gruppe (n = 9-20) ble bestemt, og den prosentvise reduksjon av TNF-a-nivåer ble beregnet. TNF-a-nivåer ble signifikant redusert i mus som mottok 150 pg EX-3 (49 %); 300 pg EX-3 (40 %) eller 300 pg EX-5 (44 %) sammenlignet med kontrollmus (0 %) og mus som mottok EX-2 (26-28 %). Disse resultater viser at forskjellige cytokinregulerende midler ifølge foreliggende oppfinnelse er effektive når de administreres oralt.

Eksempel XIII

Inaktivitetsdekondisjonerinq i rotter

Dette eksperiment beskriver virkningen av cytokinregulerende middel, EX-2, ved lindring av de negative virkninger forbundet med 14 dagers inaktivitetsdekondisjonering i rotter.

Voksne Sprague-Dawley-hannrotter (355-365 g) ble anvendt i denne undersøkelsen. Dyrene ble oppbevart individuelt i standard rottebur og ble akklimatisert på en tredemølle i 4 dager. Den neste dag ble det utført en basislinjebloduttap-ping etterfulgt av en maksimal tredemøllestresstest dagen etter. Dagen etter stresstesten ble dyrene delt i passende behandlingsgrupper og kontrollgrupper, og dyrene ble hengt opp etter halene i opphengingsbur som simulerer vektløshet og derfor dekondisjonerer dyrene. En annen gruppe med kontrolldyr ble plassert i standard rottebur med gittergulv lignende gulvene anvendt i opphengingsburene. Alle dyr ble oppbevart i hvert sitt bur og gitt mat og vann ad libitum. Kroppsvekter og matinntak ble målt daglig. Dyrene mottok to ganger daglig IP-injeksjoner på 1 pg/kg eller 5 pg/kg kroppsvekt EX-2 (behandlingsgruppe) eller 1 ml/kg kroppsvekt saltløsning (kontrollgruppe). På dag 10 ble alle dyr stresstestet på tredemøllen inntil utmattelse. Data for maksimum V02og løpetid på trede-møllen ble innsamlet og sammenlignet med resultater før opp-henging. På dag 14 ble alle dyr avlivet, og blod, vev og organer ble innsamlet for videre analyse. Alle prosedyrer og tester ble utført blindt for å unngå subjektivitet ved under-søkelsen. Statistisk signifikans (p < 0,05) mellom grupper ble evaluert ved hjelp av ANOVA med Student-Newman-Keuls-test for multiple sammenligninger. Alle data er gitt som gjennomsnitt standardfeil (SE).

Kroppsvekter minsket signifikant for alle opphengte dyr, uansett behandling. Matinntak var ikke signifikant for-skjellig mellom gruppene. Alle dyrene ble underkastet stress-testene som målte aktivitetstid og maksimal V02. Nivåer for det oksidative enzym soleussitratsyntetase og tibiabentetthet ble også målt.

Som oppsummert i tabell III, oppviser EX-2 en signifikant virkning på mange av parameterne forbundet med inaktivitetsdekondis jonering. To daglige injeksjoner av lave doser av EX-2 (1 eller 5 pg/kg) svekket signifikant dekondisjo-neringsvirkningene på aktivitetstid, maksimal V02, soleus-sitratsyntetasenivåer og tibiabentetthet. Nærmere bestemt svekket EX-2 signifikant både aktivitetsytelsesparametere, aktivitetstid og maksimal V02med henholdsvis 44 % og 80 % sammenlignet med minskingen mellom saltløsningskontrolldyrene og de opphengte dyr. Soleussitratsyntetase ble redusert med 50 %. Tibiabentetthetsmålinger viste at EX-2 signifikant reduserte suspensjonsindusert bendemineralisering med 50 %. Disse resultater viser at administrering av et cytokinregulerende middel ifølge foreliggende oppfinnelse reduserer de negative virkninger av inaktivitetsdekondisjonering.

Eksempel XIV

Orqanbe s kytte1s e

Dette eksempel beskriver effektiviteten av et cytokinregulerende middel, EX-2, ved forebyggelse av nyreskade i to rottemodeller, en iskemireperfusjonsmodell og en syklosporinindusert nefrotoksisitetsmodell.

A. Iskemireperfusjonsskade

Disse eksperimenter ble utført for å bestemme hvorvidt et peptid med cytokinregulerende egenskaper, EX-2, kan bedre den reperfusjonsinduserte vasokonstriksjon og reduksjon av glomerulær filtreringshastighet som resulterer fra sammenklemming av nyrearterien. Som en sammenligning ble det ikke-steroide antiinflammatoriske legemiddel ketorolac anvendt i den samme modell.

Sprague-Dawley-rotter (250-300 g) ble bedøvd med "Inactin" (120 mg/kg). Etter at dyp anestesi var sikret ble rottene kanylert i luftrøret med polyetylen(PE)rør (PE 240), halsvenen, lårarterien, blæren (PE 50 for tidligere tre kany-leringer) og den venstre urinleder (strukket PE 50). Når kany- leringen var fullført ble det laget et 2 cm innsnitt i siden over den venstre nyre, og den vaskulære bunt ble blottlagt. Vevet rundt den venstre nyrearterie ble forsiktig dissekert bort fra arterien. Den blottlagte nyrearterie ble sammenklemt i 1 time ved anvendelse av en liten vaskulær kryssklemme.

Like før sammenklemming ble EX-2 (50 eller 500 pg/ kg), ketorolac (KETO, 1 mg/kg) eller vehikkel administrert intravenøst (iv) etter 1 times sammenklemming (iskemi), klemmen ble forsiktig fjernet for å unngå å skade nyrearterien eller nervene. En infusjon av<3>H-inulin (NEN/Dupont; Wilming-ton, DE) (0,6 pCi/ml i fosfatbufret saltløsning (PBS))

(2 ml/time) ble innledet ved en konstant hastighet på

4 pCi/time. Etter 60 minutters reperfusjon ble glomerulær filtreringshastighet (GFR), renal plasmagjennomstrømning (RPF) og renal vaskulær resistens (RVR) målt i løpet av to 30 minutters oppsamlingsperioder. Nyren ble deretter fjernet for analyse. Simulert opererte og sammenklemte rotter tjente som kontroller for den ovennevnte gruppe. Kontralateral nyrefunksjon ble anvendt for å bestemme stabiliteten av rottens nyrefunksjon under målingsperioden. Resultatene viser at EX-2 bevirker en økning i glomerulær filtreringshastighet og en reduksjon av vaskulær resistens (tabell IV). Disse data viser at et foreliggende cytokinregulerende middel effektivt beskyt-ter nyren mot skade forbundet med iskemireperfusjon.

B. Syklosporinindusert nefrotoksisitet

Dette eksperiment ble utført for å bringe på det rene hvorvidt EX-2 kan dempe reduksjonen av glomerulær filtreringshastighet (GFR) og renal blodgjennomstrømning, så vel som dys-funksjonen i fluid- og elektrolytthomøostase indusert ved immunundertrykkende behandling med syklosporin A.

I den første undersøkelsen ble Sprague-Dawley-hannrotter (n = 43) med et vektområde fra 240 til 290 g, ved inn-ledningen av syklosporin A(CsA)-behandlingen, delt i fire vekttilpassede grupper. Gruppene var som følger: (1) kontroll: intet CsA, intet EX-2, kun behandling med CsA-vehikkel (PBS) PO og EX-2-vehikkel (også BPS) IP; (2) CsA: behandling med CsA (50 mg/kg i PBS administrert PO daglig kl 0830 i 9 dager) og IP-injeksjoner av PBS (EX-2-vehikkel); (3) CsA og 50 pg: CsA-behandling identisk med gruppe 2 med tillegg av EX-2 (50 pg/kg IP administrert daglig kl 0800 og 1700 i EX-2-vehikkel); og (4) CsA og 500 pg: CsA-behandling identisk med gruppene 2 og 3, og EX-2-behandlingsprotokoll lignende gruppe 3, med unntak av at dosen av EX-2 var 500 pg/kg BW. Etter at dyp anestesi var sikret ble rottene kanylert i luftrøret (PE 240), halsvenen, lårarterien og blæren (PE 50 for de tidligere tre kany-leringer). Etter kanylering ble infusjon av<3>H-inulin innledet 50 minutter før målingsperioden for å bestemme glomerulær filtreringshastighet, renal blodgjennomstrømning og plasma-gjennomstrømning. Renal blodgjennomstrømning ble bestemt ved hjelp av inulinekstraksjonsteknikken. Ved slutten av under-søkelsen ble nyrene fjernet for histologisk analyse.

I den andre undersøkelsen ble Sprague-Dawley-hannrotter (n = 31) med et vektområde fra 240 til 290 g, ved tids-punktet for innledning av syklosporinbehandlingen, delt i fire vekttilpassede grupper.Tidsforløpet og protokollen for denne undersøkelsen tilsvarte den første undersøkelsen med de følgende unntak: (1) den daglige dose av CsA ble redusert til 30 mg/kg og ble administrert subkutant (SC), og (2) 50 pg/kg-dosen av EX-2 ble erstattet med en dose på 200 pg/kg to ganger daglig. 500 pg/kg-dosen av EX-2 ble gjentatt i denne under-søkelsen. Renal hemodynamikk ble bestemt, og ekstracellulære fluidvolumer ble også målt.

CsA-behandling gav ingen signifikant reduksjon av renal blodgjennomstrømning i disse undersøkelser på grunn av spredningen i dataene. EX-2-behandling forbedret imidlertid blodgjennomstrømning til verdier som ikke var forskjellige fra kontrollen. I den andre undersøkelsen, hvor ekstracellulære fluidvolumer (ECF) ble målt, var det ingen forskjeller i ECF mellom kontrollgrupper og behandlingsgrupper (27,6 ± 1,9 i kontrollgruppen, 27,5 ± 1,7 i CsA- og vehikkelgruppen, 26,2 0,9 i Csa + 200 pg/kg EX-2, og 25,7 ± 1,4 % i CsA + 500 pg/kg EX-2).

Proteinutskillelse fra nyrene ble også målt, og dataene viste at EX-2-behandling ikke økte proteinutskillelse fra nyrene sammenlignet med CsA-behandlede rotter, til tross for den betydelige økning i GFR. EX-2 økte signifikant GFR sammenlignet med CsA- og vehikkelkontroller i begge under-søkelser og brakte renal blodgjennomstrømning tilbake til verdier som ikke var forskjellige fra kontrollen. Det var ingen endringer i ECF som et resultat av EX-2-behandling, og det var en tendens til redusert proteinutskillelse fra nyrene normalisert til glomerulær filtreringshastighet. Resultatene fra de to eksperimenter er vist i figurene la og lb og tilveiebringer bevis på at et cytokinregulerende middel ifølge foreliggende oppfinnelse reduserer syklosporinindusert nefrotoksisitet og skaden forårsaket av denne.

Eksempel XV

Cancerkj emoterapi

Dette eksempel beskriver effektiviteten av et cytokinregulerende middel, EX-2, ved reduksjon av de nefrotoksiske virkninger av cancerkjemoterapeutiske midler.

Sprague-Dawley-hannrotter ble anvendt for å bestemme virkningen av EX-2 på nyrefunksjon etter administrering av cisplatin (CDDP). Alle rotter ble administrert CDDP (4 mg/kg IP) og delt i tre behandlingsgrupper (n = 6/gruppe). Gruppene var som følger: (1) administrering med vehikkel og steril PBS 3 x/dag; (2) administrering av EX-2 i en dose på 5 pg/kg, 3 x/dag; og (3) samme som gruppe 2, med unntak av at dosen av EX-2 var 50 pg/kg, 3 x/dag.

En infusjon av<3>H-inulin (0,6 pCi/ml i PBS) (2 ml/ time) ble innledet ved slutten av den kirurgiske preparerings-periode. Den kontinuerlige infusjon ble startet 60 minutter før nyrefunksjonsmålingene og ble opprettholdt til slutten av undersøkelsen. Glomerulær filtrering ble målt ved inulin-klaringsteknikkene i to 30 minutters perioder, og renal blod-gjennomstrømning (RBF) og renal plasmagjennomstrømning (RPF) ble målt ved inulinekstraksjonsteknikker (arteriell vs. nyre-veneinulinkonsentrasjon) fra blod fra den venstre nyrevene uttatt ved slutten av den andre GFR-målingsperiode. Urin-produksjon ble også registrert for å bestemme både urin-utstrømning og relativ utskillelse av vann. Elektrolyttkonsen-trasjoner i urinen (Na<+>og K<+>) ble analysert ved flammefoto-metri (modell 51 Ca,Bacharch, Inc., Pittsburgh, PA), og proteinkonsentrasjoner i urinen ble bestemt. Ved slutten av målingsperiodene ble nyrene fjernet for histologisk analyse. Påvirkningen av varierende behandlingsdoser av EX-2 på nyrefunksjon i tre CDDP-administrerte rotter (CDDP ved 4 mg/kg IP) er oppsummert i tabell V. Dataene viser at et cytokinregulerende middel ifølge foreliggende oppfinnelse øker glomerulær filtreringshastighet, renal plasmagjennomstrømning og renal blodgjennomstrømning, og reduserer derved nefrotoksisiteten av et cancerkjemoterapeutisk middel.

Eksempel XVI

Behandling av sykdommer formidlet av nitrogenoksid og cytokiner

Dette eksempel beskriver effektiviteten av EX-2 ved inhibering av induserbar nitrogenoksidsyntetase (iNOS) og redusering av glukose ved streptozotocinindusert diabetes og ved redusering av albuminnivåer ved glomerulonefritt.

A. Induserbar nitroqenoksidsyntetase ( iNOS)

Glatte muskelceller fra rotteaorta (RASMC) ble iso-lert fra hannrotter (325-350 g) ved anvendelse av de tidligere publiserte prosedyrer ifølge Gelsterfer et al., Circ. Res., 62:749-756 (1988), som er inkorporert heri ved referanse. Celler ble positivt identifisert som glatte muskelceller ved indirekte immunfluorescensfarging for anti-a-aktin ved anvendelse av et museanti-a-aktinantistoff og antimuse-IgG-FITC-konjugat. Celler ble dyrket i T-75 vevskulturflasker (Corning Delbecco's Glass, Inc.; Corning, NY) i 50 % F12 og 50 % Delbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10 % bovint serum, 0,2 g/l L-glutamin, penicillin (100 U/ml) og streptomycin (0,1 mg/ml).

Celler mellom passasjer 1-5 ble forhåndsbehandlet med ett av de følgende materialer: vehikkel, LPS (1 pg/ml), IL-ip (10 U/ml) eller TNF-a (100 U/ml) i 6 timer. I lignende grupper ble 0,1 eller 1 pM EX-2 tilsatt 10 minutter før tilsetningen av LPS, IL-ip eller TNF-a. 6 timer senere ble cellene vasket med Earles balanserte saltløsning og inkubert i 30 minutter med vehikkel bestående av 100 pM L-nitroargininmetylester (L-NAME). Akkumulering av cGMP ble bestemt etter behandling med 0,3 mM 3-isobutyl-l-metylxantin (IBMX) i nærvær eller fravær av 1 mM L-arginin. Mediet ble deretter hurtig sugd bort, og 500 pl 0,1 N HCl ble tilsatt til hver brønn for å stanse reaksjonene og ekstrahere cGMP. 30 minutter senere ble HC1-ekstraktet oppsamlet, og cellerester ble fjernet fra brønnene ved tilsetning av varm 1,0 N NaOH og skraping av brønnene med en gummiskrape. HCl-ekstraktet ble analysert for cGMP ved hjelp av RIA, og de NaOH-oppløste cellerester ble anvendt for proteinbestemmelse.

Sprague-Dawley-hannrotter ble bedøvd med 55 mg/kg pentobarbital IP. Katetre ble innsatt i halsarterien og halsvenen for henholdsvis bloduttapping og legemiddeladmini-strering. EX-2 eller saltløsning ble gitt til en gruppe på 6 rotter. 1 time senere, når rottene fremdeles var under anestesi, ble blod tappet over i en heparinbehandlet sprøyte, og plasma ble erholdt ved sentrifugering. RASMC ble inkubert med plasma fra kontrolldyr eller EX-2-behandlede dyr, og plasmakomponenters evne til å inhibere induksjonen av iNOS ved hjelp av LPS eller IL-ip ble bestemt som beskrevet ovenfor.

Radioliganden (<125>1-succinyl-cGMP-tyrosinmetylester) ble fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Hunter og Greenwood, Nature, 94:495-496 (1962), som er inkorporert heri ved referanse, ved anvendelse av bærerfritt<125>I. Reaksjonsproduktene fra joderingen ble separert ved RP-HPLC i overensstemmelse med prosedyrene ifølge Patel og Lindent, Anal. Biochem., 168:417-425 (1988), som er inkorporert heri ved referanse. Ved anvendelse av et monoklonalt antistoff for cGMP ble RIA utført i det automatiske RIA-system "Gammaflow", som beskrevet av Brooker et al., Science, 291:270-276 (1976), som er inkorporert heri ved referanse. Standard stamløsninger av cGMP

(20 pM) ble preparert i 0,1 N HC1, og absorbansen av løsningen ble rutinemessig registrert spektrofotometrisk (Shimadzu, UV 160U). Standardfortynninger (0,63-80 nM) ble laget fra stam-løsningen. HCl-ekstraktet inneholdende cGMP ble anvendt direkte for RIA. Resultatene er oppsummert i tabell V nedenfor og viser at EX-2 kan inhibere induserbar nitrogenoksidsyntetase, hvilket derved reduserer nivåene av NO-produksjon og de negative virkninger forbundet med denne, slik som diabetes eller glomerulonefritt.

B. Indusert diabetes

Sprague-Dawley-hannrotter ble gitt 65 mg/kg strepto-zotocin (STZ) intravenøst gjennom halevenen. Rottene ble delt i to grupper. Den første gruppen ble administrert EX-2,

150 pg/kg, hver 8. time i 72 timer, og den andre gruppen var en kontrollgruppe. Blodprøver ble uttatt under eterbedøvelse hver 8. time i de første 72 timer, deretter hver 12. time eller 24. time inntil slutten av observasjonsperioden. Plasma-prøver ble analysert for glukose ved anvendelse av et glukose-analysesett (Trinder, Sigma Chemical Co.). Som vist i tabell VI nedenfor, bevirker EX-2 en 72 % reduksjon i blodglukose-nivåer.

C. Arvelig diabetes

Zucker-hannrotter er en veletablert rottemodell for arvelig ikke-insulinavhengig diabetes mellitus (NIDDM), som f.eks. beskrevet av Ward et al., Ann. Clin. Lab. Sei., 24:266- 277 (1994), som er inkorporert heri ved referanse. 18 Zucker-hannrotter ble anvendt for å undersøke virkningene av EX-2 på NIDDM, en kronisk sykdom. Rottene ble plassert i to grupper og mottok enten saltløsning eller 25 pg/kg EX-2 hver 8. time i ca. 3 måneder. Blodprøver ble oppsamlet ved haleklipping, og urinprøver ble oppsamlet ved å plassere dyrene i metabolske bur i 24 timer. Plasmainsulin ble analysert ved anvendelse av et RiA-sett (Amersham Life Sciences Plus, Arlington Heights, IL). Urinprotein ble analysert ved anvendelse av et kommersielt proteinanalysesett (Coomassie Plus, Pierce, Rockford, IL). Kroppsvektmålinger ble utført med en Mettler Toledo topp-belastningsvekt. Som vist i tabell VI, bevirket EX-2 en 39 % reduksjon av insulin, en 87 % reduksjon av urinprotein og ca. 100 g reduksjon av kroppsvekt (32 % reduksjon; se eksempel

XX) .

D. Glomerulonefritt

Sprague-Dawley-hannrotter (vekt 194-248 g) ble immu-nisert ved subkutan injeksjon av 1 mg normalt kanin-IgG (Sigma Chemical Co.) i Freunds komplette adjuvans (Sigma Chemical Co.). EX-2 ble administrert tre ganger pr. dag (100 pg/kg pr. injeksjon) gjennom hele eksperimentet. 7 dager senere ble rottene injisert med 1,5 ml nefrotoksisk serum iv via den dorsale penisvene. Urin, plasma og serum ble oppsamlet før injeksjon av nefrotoksisk serum 4, 6, 24, 48 og 96 timer deretter. Alle rotter utviklet akutt glomerulonefritt med albu-minuri som økte progressivt fra 4 til 96 timer, som vist ved albuminutskillelse etter 24 timer.Albuminuri ble kvantifisert ved immunelektroforese.Resultatene er oppsummert nedenfor i tabell VI og viser at et cytokinregulerende middel ifølge foreliggende oppfinnelse demper økningen i albuminnivåer observert ved glomerulonefritt, hvilket er en indikasjon på forbedring av sykdomstilstanden.

I sammendrag viser de ovenfor angitte data at et cytokinregulerende middel ifølge foreliggende oppfinnelse inhiberer induserbare nitrogenoksidsyntetasenivåer, hvilket derved reduserer produksjonen av NO. De cytokinregulerende midler er også anvendelige for behandling av spesielle sykdommer hvori nitrogenoksid bidrar til vevsskade, slik som diabetes, glomerulonefritt, aterosklerose og multippel sklerose.

Eksempel XVII

Økende nivåer av IL- 10 i mus

Dette eksempel beskriver effektiviteten av EX-2 ved å øke nivåene av IL-10 i pattedyr ved anvendelse av økningen i museplasma etter EX-2-administrering som et illustrerende eksempel.

Figur 2 viser den IL-10-induserende virkning av EX-2 i museplasma. EX-2 ble administrert intraperitonealt til 19 mus i doser som varierte fra 1,0 pg/mus til 1000,0 pg/mus. Resultatene viser en doseavhengig økning av IL-10-nivåer som varierer fra 5,0 pg/ml til 23,0 pg/ml.

Eksempel XVIII

Økende nivåer av IL- 10 i mennesker

Dette eksempel viser den cytokinforhøyende virkning av det cytokinregulerende middel EX-2 i et menneskelig individ.

EX-2 ble administrert ved intravenøs infusjon til åtte friske, frivillige mannlige forsøkspersoner i doser på enten 200 eller 500 pg/kg. Plasma-IL-10-nivåer økte hos to av fire frivillige etter administrering av 200 pg/kg EX-2 (figur 3a) og i fire av fire frivillige etter administrering av 500 pg/kg EX-2 (figur 3b). Resultatene viser en 85 % økning av IL-10 hos individer som mottok 200 pg/kg EX-2 og en økning på 230 % hos individer som mottok 500 pg/kg EX-2.

Eksempel XIX

Behandling av de ugunstige bivirkninger forårsaket av cancerkjemoterapi i mennesker

Dette eksempel beskriver anvendeligheten av et cytokinregulerende middel, slik som EX-2, ved å lindre de ugunstige bivirkninger forbundet med cancerkjemoterapi ved anvendelse av cisplatin, "Taxol" eller "Adriamycin", som induserer og forhøyer produksjonen av cytokiner.

EX-2 kan f.eks. administreres ved intravenøs infusjon til pasienter som gjennomgår, eller som skal gjennomgå, kjemo-terapi. Det kan f.eks. bestemmes at en pasient skal motta cisplatin, "Taxol", "Adriamycin" eller en annen passende kjemoterapeutisk eller radiologisk behandling. EX-2 kan administreres i en dose på mellom 1 og 1000 pg/kg, med en foretrukket infusjonsdose på 500 pg/kg. Dosene kan administreres ved kontinuerlig drypp eller ved periodisk bolus.

Eksempel XX

Reduksjon av kroppsvekt på grunn av administrerin<g>av et cytokinregulerende middel

Dette eksempel viser at administrering av et cytokinregulerende middel kan forårsake en reduksjon av kroppsvekten til et individ.

Voksne Zucker-rotter med fedme (fa/fa; 325-350 g) eller Zucker-rotter uten fedme (Fa/+; 250-275 g) ble delt i to grupper. Hver av en gruppe med fa/fa- og Fa/+-rotter mottok intraperitoneale (IP) injeksjoner av 250 pg/kg EX-2, 3 x/dag i 8 6 dager, etterfulgt av behandlinger 2 x/dag i ytterligere 29 dager. Den andre gruppen av fa/fa- og Fa/+-rotter mottok saltløsning etter den samme behandlingsplan.

Administrering av EX-2 forårsaket en signifikant reduksjon av vektøkningen hos fa/fa- og Fa/+-rottene (se figur 4). Nærmere bestemt økte vekten av fa/fa-rotter behandlet med saltløsning med ca. 360 g i løpet av behandlingstiden på

105 dager, mens vekten av fa/fa-rotter behandlet med EX-2 kun økte med 275 g, hvilket representerer en 24 % reduksjon i vektøkning. Denne vektreduksjon korrelerte signifikant med redusert epididymal fettputevekt, hvilket indikerer at vekten av fett og ikke ren muskelmasse reduseres ved administrering av EX-2. Hos Fa/+-rotter var den reduserte vektøkning mer moderat, men korrelerte også her med fettmasse i stedet for ren muskelmasse. Disse resultater viser at et cytokinregulerende middel kan redusere vektøkning hos normale og overvektige individer ved å redusere akkumuleringen av fett.

I andre eksperimenter mottok fa/fa-rotter 0,5-

10 mg/kg EX-2, 2 x/dag, i 14 dager (1-20 mg/dag). En redusert grad av vektøkning ble observert i hver gruppe. Rotter behandlet med 20 mg EX-2/dag viste dessuten en ca. 10 % reduksjon av kroppsvekt. Dette vekttap korrelerte med økt konsumpsjon hos de EX-2-behandlede rotter sammenlignet med kontrollrottene. Disse resultater viser at et cytokinregulerende middel er anvendelig for å redusere kroppsvekten til et individ.

Selv om foreliggende oppfinnelse er beskrevet med referanse til de ovenfor beskrevne eksempler, er det under-forstått at forskjellige modifikasjoner kan utføres av fagfolk uten å avvike fra oppfinnelsen.Foreliggende oppfinnelse er følgelig fremlagt i de følgende krav.

Claims

1. Cytokinregulerende middel, karakterisert ved at det omfatter:Xx - X2 - His - (D)Phe - Arg - (D)Trp - X3 , hvori

hvori Y er 0, H2 eller S; R-L er H, C0CH3 , C2 H5 , CH2 Ph, COPh, C00CH2 Ph, C00-t-butyl, CH2 C0-(polyetylenglykol) eller A; R2 er H eller C0CH3 ; R3 er en lineær eller forgrenet alkylgruppe med 1-6 karbonatomer eller en syklisk alkylgruppe med 3-6 karbonatomer; R4 er (C <H>2 )m -CONH2 , (C <H>2 )m -C0NHR1 eller (CH2 )m -C0NHA ; R5 er OH, 0R3 , NH2 , SH, NHCH3 , NHCH2 Ph eller A; og R6 er H eller R3 ; og hvori "Ph" er C6 H5 ; "m" er 1, 2 eller 3; "n" er 0, 1, 2 eller 3; og "A" er et karbohydrat med den generelle formel:

2. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at aminoterminalen er modifisert.

3. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at karboksyterminalen er modifisert.

4. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved atR^ er utvalgt fra C2 H5 og CH2 Ph, og hvori R2 er utvalgt fra H og COCH3 .

5. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at R: og R2 er den samme komponent som er utvalgt fra H, C2 H5 og CH2 Ph.

6. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at Xj er utvalgt fra norleucin, norvalin, leucin eller isoleucin.

7. Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at R5 er kovalent bundet til X1# idet den kovalente binding danner et syklisk peptid.

8. Cytokinregulerende middel, karakterisert ved at det omfatter: X4 - X5 - (D)Phe - Arg - (D )Trp - X3 , hvori

X5 er His, H eller COCH3 ; og

hvori Y er 0, H2 eller S; Rx er H, COC <H>3 , C2 H5 , CH2 Ph, COPh, COOCH2 Ph, COO-t-butyl, CH2 CO-(polyetylenglykol) eller A; R2 er H eller COCH3 ; R4 er (C H2 )m -CONH2 , (CH2 ^-CONHR-l eller (CH2 )m-CONHA; R5 er OH, 0R3 , NH2 , SH, NHCH3 , NHCH2 Ph eller A; og R6 er H eller R3 ; og hvori "Ph" er C6 H5 ; "m" er 1, 2 eller 3; "n" er 0, 1, 2 eller 3; og "A" er et karbohydrat med den generelle formel:

9. Peptid ifølge krav 8, karakterisert ved at aminoterminalen er modifisert.

10. Peptid ifølge krav 8, karakterisert ved at karboksyterminalen er modifisert.

11. Peptid ifølge krav 8, karakterisert ved at R1 er utvalgt fra C2 H5 og CH2 Ph, og R2 er utvalgt fra H og C0CH3 .

12. Peptid ifølge krav 8, karakterisert ved at R1 og R2 er den samme komponent som er utvalgt fra H, C2 H5 og CH2 Ph.

13. Peptid ifølge krav 8, karakterisert ved at R5 er kovalent bundet til X4 , idet den kovalente binding danner et syklisk peptid.

14. Cytokinregulerende middel, karakterisert ved at det har en aminosyresekvens utvalgt fra (sykloheksy1)-Gly-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly; His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly; His-(D)Phe-Arg-(D)Trp; (D)Phe-Arg-(D)Trp og His-(D)Phe-Arg-{(D)Trp(CH2 )}-(NAc)Gly.

15. Peptid ifølge krav 14, karakterisert ved at karboksyterminalen er modifisert ved amidering.

16. Peptid ifølge krav 14, karakterisert ved at aminoterminalen av peptidet er acetylert.

17. Cytokinregulerende middel, karakterisert ved at den har aminosyresekvensen syklo(His-(D)Phe-Arg-(D)Trp).

18. Fremgangsmåte for regulering av cytokinaktivitet i et individ med en tilstand kjennetegnet ved endret eller av vikende cytokinaktivitet, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 1.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at det cytokinregulerende middel forhøyer cytokinaktiviteten.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at cytokinaktiviteten er en IL-10-aktivitet.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at tilstanden er en inflammatorisk respons.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at tilstanden er kakeksi.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at tilstanden er en pato-immunogen respons.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at tilstanden er åndenøds-syndrom hos voksne.

25. Fremgangsmåte for reduksjon av virkningene av inaktivitetsdekondis jonering i et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 1.

26. Fremgangsmåte for beskyttelse av et organ i et individ mot organskade, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 1.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at organskaden er resultatet av en tilstand utvalgt fra organtransplantasjon, administrering av et immunundertrykkende middel og iskemireperfu-s jon.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at det immunundertrykkende middel er syklosporin.

29. Fremgangsmåte for lindring av en ugunstig bivirkning av cancerkjemoterapi i et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av et cytokinregulerende middel ifølge krav 1.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29, karakterisert ved at den ugunstige bivirkning er den nefrotoksiske virkning av et cancerkjemoterapeutisk middel.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at det cancerkjemoterapeutiske middel er utvalgt fra cisplatin, "Taxol" og "Adriamycin".

32. Fremgangsmåte for behandling av et individ med en sykdom formidlet av nitrogenoksid og cytokiner, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 1.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32, karakterisert ved at sykdommen er utvalgt fra diabetes og glomerulonefritt.

34. Fremgangsmåte for reduksjon av kroppsvekten til et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 1.

35. Fremgangsmåte for økning av oksygenforbruket i et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 1.

36. Fremgangsmåte for regulering av cytokinaktivitet i et individ med en tilstand kjennetegnet ved endret eller avvikende cytokinaktivitet, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 8.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at det cytokinregulerende middel forhøyer cytokinaktiviteten.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 37, karakterisert ved at cytokinaktiviteten er IL-10-aktivitet.

39. Fremgangsmåte ifølge krav 37, karakterisert ved at tilstanden er en inflammatorisk respons.

40. Fremgangsmåte ifølge krav 37, karakterisert ved at tilstanden er kakeksi.

41. Fremgangsmåte ifølge krav 37, karakterisert ved at tilstanden er en pato-immunogen sykdom.

42. Fremgangsmåte ifølge krav 37, karakterisert ved at tilstanden er åndenøds-syndrom hos voksne.

43. Fremgangsmåte for reduksjon av virkningene av inaktivitetsdekondis jonering i et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 8.

44. Fremgangsmåte for beskyttelse av et organ i et individ mot organskade, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 8.

45. Fremgangsmåte ifølge krav 44, karakterisert ved at organskaden er resultatet av en tilstand utvalgt fra organtransplantasjon, administrering av et immunundertrykkende middel og iskemireperfu-s jon.

46. Fremgangsmåte ifølge krav 45, karakterisert ved at det immunundertrykkende middel er syklosporin.

47. Fremgangsmåte for lindring av en ugunstig bivirkning av cancerkjemoterapi i et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av et cytokinregulerende middel ifølge krav 8.

48. Fremgangsmåte ifølge krav 47, karakterisert ved at den ugunstige bivirkning er nefrotoksisitet.

49. Fremgangsmåte ifølge krav 47, karakterisert ved at kjemoterapien omfatter administrering av et kjemoterapeutisk middel utvalgt fra cisplatin, "Taxol" og "Adriamycin".

50. Fremgangsmåte for behandling av et individ med en sykdom formidlet av nitrogenoksid og cytokiner, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 8.

51. Fremgangsmåte ifølge krav 50, karakterisert ved at sykdommen er utvalgt fra diabetes og glomerulonefritt.

52. Fremgangsmåte for reduksjon av kroppsvekten til et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 8.

53. Fremgangsmåte for økning av oksygenforbruket i et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 8.

54. Fremgangsmåte for regulering av cytokinaktivitet i et individ med en tilstand kjennetegnet ved endret eller avvikende cytokinaktivitet, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av et cytokinregulerende middel ifølge krav 14.

55. Fremgangsmåte for regulering av cytokinaktivitet i et individ med en tilstand kjennetegnet ved endret eller avvikende cytokinaktivitet, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel ifølge krav 17.

56. Fremgangsmåte for reduksjon av virkningen av inaktivitetsdekondis jonering i et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel med sekvens: Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2 .

57. Fremgangsmåte for beskyttelse av et organ i et individ mot organskade, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel med sekvens: Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2 .

58. Fremgangsmåte for reduksjon av en ugunstige bivirkning av cancerkjemoterapi i et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av et cytokinregulerende middel med sekvens: Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2 .

59. Fremgangsmåte for behandling av et individ med en sykdom formidlet av nitrogenoksid og cytokiner, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel med sekvens: Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2 .

60. Fremgangsmåte for reduksjon av kroppsvekten til et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel med sekvens: Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2 .

61. Fremgangsmåte for økning av oksygenforbruket i et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av det cytokinregulerende middel med sekvens: Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2 .

62. Fremgangsmåte for økning av nivåene av et cytokin i et individ, karakterisert ved at det til individet administreres en effektiv mengde av et cytokinregulerende middel med sekvens: Ac-Nle-Gln-His-(D)Phe-Arg-(D)Trp-Gly-NH2 .

63. Fremgangsmåte ifølge krav 62, karakterisert ved at cytokinet er IL-10.