PL106106B1 - Sposob wytwarzania l-lizyny - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-lizyny :metoda mikrobiologiczna przy uzyciu mutantów poli- auksotroficznych drobnoustroju Brevibacterium flavum.

Znany jest szereg sposobów wytwarzania L-lizyny przy uzyciu róznych typów mutantów biochemicznych drobnoustrojów z rodzaju Brevibacterium, jak równiez 2 rodzaju Corynebacterium, Arthrobacter, Microeoccus.

Dotychczas najwyzsze wydajnosci procesu biosyntezy, rzedu 50—58 g chlorowodorku L-lizyny/litr uzyskiwano przy zastosowaniu mutantów Brevibacterium lactofermen- - tum, opornych na dzialanie analogów L-lizyny i jedno¬ czesnie niezdolnych do biosyntezy niektórych aminokwasów lub witamin (opis patentowy belgijski nr 798 890 oraz opis patentowy francuski nr 2 230 723). Ponadto, dla uzyskania wysokich - wydajnosci, jak podano we wspomnianych opisach patentowych, stosowano drogie skladniki pozywek hodowlanych, takie jak: czyste cukry proste, aminokwasy i witaminy oraz dodatkowo antybiotyki, przeciwutleniacze i srodki powierzchniowo czynne.

W opisie patentowym polskim nr 94 291 opisano sposób wytwarzania chlorowodorku L-lizyny z wydajnoscia 40 g/l przy uzyciu mutanta auksotroficznegtf Microeoccus gluta- micus i pozywek, zawierajacych produkt odpadowy prze¬ myslu ziemniaczanego.

W sposobie wedlug wynalazku do wytwarzania L-lizyny metoda mikrobiologiczna zastosowano nowe wysokowy- -dajne mutanty poliauksotroficzne Brevibacterium flavum, -uzyskujac w zaleznosci od uzytego mutanta i skladników pozywki, wydajnosci rzedu 50—70 g chlorowodorku L-lizyny/litr, przy równoczesnym wykorzystaniu jako skladników pozywki tanich, posrednich i/lub odpadowych produktów przemyslu rolno-spozywczego.

Mutanty poliauksotroficzne o nieopisanych dotychczas wlasciwosciach, otrzymano ze szczepu prototroficznego Brevibacterium flavum ATCC 14067 droga kolejnych mutacji i selekcji, prowadzonych znanymi metodami (Lederberg J.:, Isolation and characterization of biochemi- cal mutants of bacteria", Methods in Medical Research, 1950).

Najkorzystniejszymi dla wytwarzania L-lizyny w sposo¬ bie wedlug wynalazku sa otrzymane mutanty Brevibacte- rium flavum o typach poliauksotrofii przedstawione w ta¬ beli 1.

Tabela 1 Mutant 1 Brevibacterium ¦ flavumIPF2105 Brevibacterium flavumIPF2110 Typ poliauksotro¬ fii: substancje konieczne do wzrostu 2 biotyna, treonina arginina biotyna, treonina izoleucyna lub biotyna, treonina pirydoksal lub Cechy dodatkowe (*) 3 nie rosnie przy wyzszych ste¬ zeniach treoniny nie rosnie przy wyzszych ste¬ zeniach treoni¬ ny 106 106106 106 3 c.d. tabeli 1 1 1 i Brevibacterium flavumIPF2146 ,2 biotyna, treonina pirydoksyna biotyna, treonina izoleucyna lub biotyna, treonina pirydoks&l lUb biotyna, treonina pirydoksyna 3 ' nie rosnie przy wyzszych stezeniach treoniny *) hamujace wzrost dzialanie wyzszych stezen treoniny (powyzej 10 mikrogramów w 1 ml) znoszone jest przez znajdujaca sie w skladnikach pozywki metionine.

Mutanty poliauksotroficzne Brevibacterium flavum IPF 2105, Brevibacterium flavum IPF 2110, Brevibacte- rium flavum IPF 2146 przechowywane sa w Muzeum Szczepów Instytutu Przemyslu Farmaceutycznego.

Proces biosyntezy L-lizyny przy uzyciu wysokowydaj- nych mutantów poliauksotroficznych Brevibacterium fla- vum sposobem wedlug wynalazku prowadzi sie w wa¬ runkach [tlenowych, w temperaturze 28—32 °C na pozyw¬ kach plynnych, zawierajacych jako zródlo wegla rozpu¬ szczalne weglowodany np. glukoze techniczna, cukier spozywczy, cukier surowy, melase, hydrolizat szlamu krochmalowego i inne lub ich mieszaniny.

Jako zródlo wegla stosuje sie równiez alkohole np. etanol, propanol oraz kwasy organiczne i ich sole, np.^kwas octowy i/lub octan amonu i/lub octan sodu i/lub octan wapnia.

Jako zródlo azotu niebialkowego stosuje sie mocznik, sole amonowe, jak np. siarczan amonu, chlorek amonu i/lub wodorotlenek amonu. Do pozywek wprowadza sie równiez zródlo azotuaminokwasowego w postaci odbialczonego soku komórkowego ziemniaka, wyciagu namokowego kukurydzy, hydrolizatu sruty rzepakowej, hydrolizatu odtluszczonej maki arachidowej lub ich mieszanin. Koizystne jest stoso¬ wanie równiez substancji buforujacych* jak np. weglanu Wapnia i soli kwasu fosforowego* Od< zyn hodowli w czasie procesu biosyntezy L-lizyny utrzymuje sie w granicach pH=6iO—8,0i dodajac roztworu mocznika i/lub wodoro¬ tlenku amonu..

Dalsze szczególy sposobu wedlug wynalazku znajduja sie w przykladach) które sluza do objasnienia* nie ogranicza¬ jacwynalazku; — Przyklad I. Hodowle na pozywce stalej mutanta poliauksotroficznego Brevibacterium flavum IPF 2146 prowadzono na skosie agarowym o nastepujacym skladzie: tepton-Protease L>ifco**' 1*0%* NaCl — 0,5%, wyciag wolów? Difco —Ó,22%i glukoza =-1,0%, agar—2,0%, woda destylowana do 100%'. Przed sterylizacja korygowano pH do wartosci 7,4. Sterylizacje pozywki agarowej prowa¬ dzono w temperaturze 117°G przez 30 minut. Agary skosne szczepiono komórkami mutanta pobranymi oczkiem fezy 2 48-godzinnej hodowli na agarach skosnych & tym f&* taym fckladzte, przechowywanej w chlodni il teoiperaturfca ^4°G w ciagu najwyzej miesiaca. Zaszczepione agar? fcko&ae umie&zezano w termostacie o temperaturze 2§*6 na 48 godzin* Komórki mutanta zmywano a hodowli agarowe) £ mol 0j8S% roztworu NaCl w wodzie lub 2 ml bulionu* Otrzymana zawiesina feomorek szczepiono pozywke posie*- wowa w kolbach. 4 Hodowle posiewowa mutanta poliauksotroficznego Brevibacterium flavum IPF 2146 prowadzono w kolbach stozkowych o objetosci 500 ml, zawierajacych po 50 ml pozywki posiewowej o nastepujacym skladzie: melasa (okolo 50% cukrów redukujacych) — 4,0%, wyciag namokowy kukurydzy (50% suchej masy) — 1,0%, (NH4)2S04 tech¬ niczny 1,5%, drozdze Suszone pastewne—0,25%, CaCOs techniczny—0,5 %3 woda wodociagowa do 100%. Przed sterylizacja korygowano pH do wartosci 7,2. Sterylizacje; prowadzono w temperaturze 117 °C przez 30 minut. Tak przygotowana pozywke posiewowa szczepiono zawiesina komórek z hodowli na pozywce stalej, w ilosci 0,2 ml za¬ wiesiny na 50 ml pozywki. Hodowle posiewowa prowadzono przez 16—24 godziny natrzesawce obrotowej o 220 obrotach /minute, umieszczonej w termostacie w temperaturze 30°C.

Hodowle produkcyjna mutanta poliauksotroficznego Brevibacterium flavum IPF 2146 prowadzono w kclbach stozkowych o pojemnosci 500 ml z lamaczem, zawieraja¬ cych 30 ml pozywki, o nastepujacym skladzie: CaCO* techniczny — 230%, (NH4)2S04 techniczny — 4,0%> me¬ lasa buraczana— 15% (w przeliczeniu na cukry redukujace),, odbialczony sok komórkowy ziemniaka — do 100%. Me¬ lase buraczana i roztwór pozostalych skladników pozywki sterylizowano oddzielnie w temperaturze 117°C przez 30 minut. Po sterylizacji roztwór skladników pozywki uzupelniano melasa. Wartosc pH tak przygotowanej po¬ zywki wynosila 7,3—7,5. Pozywke szczepiono hodowla posiewowa w ilosci 5% objetosciowych. Hodowle produk¬ cyjna prowadzono 96 godzin na trfesawce obrotowej o 220 obrotach/minute, umieszczonej w termostacie o tem¬ peraturze 30 °C. W czasie procesu biosyntezy utrzymywano pH w granicach 6,0—8,0 dodatkiem 10%-ego roztworu wodnego mocznika. Po zakonczeniu procesu biosyntezy litr brzeczki zawieral 52,0 g L-lizyny HC1.

PrzykladH. Hodowle mutanta poliauksotroficz¬ nego Brevibacterium flavum IPF 2146 na pozywce stalej i pozywce posiewowej prowadzono jak w przykladzie I.

Hodowle produkcyjna mutanta prowadzono w kolbach stozkowych o pojemnosci 500 ml z lamaczem, zawierajacych 40 30 ml pozywki o nastepujacym skladzie: wyciag namokowy kukurydzy (50% suchej masy)—.4,0%, CaC03 techniczny —2,0%, (NH4)2S04techniczny — 4,0%, MgS04 — 0,02%, K2HP04 — 0,1%, melasa buraczana — 15% lub mieszanina malasy buraczanej — 5% i hydrolizatu szlamu krochmalo- 45 wega 10% (w przeliczeniu na cukry redukujace), woda. wodociagowa do 100%7 Melase buraczana, hydrolizat szlamu krochmalowego i roztwór pozostalych skladników pozywki sterylizowano oddzielnie w temperaturze 117°G przez 30 minut. Po sterylizacji roztwór skladników pozywki 60 uzupelniano melasa lub mieszanina melaey i hydrolizatu szlamu krochmalowego. Wartosc pH tak przygotowane* pozywki wynosila 7,3—7,5. Ppzywke szczepiono hodowla^ posiewowa w ilosci 5% objetosciowych. Hodowle produk¬ cyjna prowadzono 96 godzin w warunkach, jak w przykladzie 66 Ii Po zakonczeniu procesu biosyntezy litr brzeczki zawieral L-lizyne w ilosci podanej w tabeli 2.

Tabela 2 , Zródlo wegla * Melasa buraczana 15% Melasa buraczana 5% + hydro¬ lizat szlamu krochmalowego 10% L-li^aa > HGl 1 wg/l 5Ó,t> [ 32,0 1 86 x- w'przeliczeniu na cukry redukujaee.106 106 Przyklad III. Hodowle mutantów poliauksotro- ficznych Brevibacterium flavum IPF 2105, B. flavum IPF 2110 oraz B. flavum IPF 2146 na pozywce stalej i pozywce posiewowej prowadzono jak w przykladzie I.

Hodowle produkcyjna mutantów prowadzono w kolbach stozkowych o pojemnosci 500 ml z lamaczem, zawieraja¬ cych 30 ml pozywki o nastepujacym skladzie: hydrolizat sruty rzepakowej (w przeliczeniu na srute) — 4,0%, CaC03 techniczny — 4,0%, (NH4)2S04 techniczny — 1,0%, MgS04—0,02%, K2HP04 —0,1%, cukier surowy lub melasa buraczana (w przeliczeniu na cukry redukujace) — %, woda wodociagowa do 100%. Roztwór cukru suro¬ wego, melase buraczana i roztwór pozostalych skladników pozywki sterylizowano oddzielnie przez 30 minutw tempera¬ turze 117°C. Po sterylizacji roztwór skladników pozywki uzupelniano melasa lub roztworem cukru surowego. War¬ tosc pH pozywki wynosila 7,3—7,5. Pozywke produkcyjna szczepiono hodowla posiewowa w ilosci 5% objetosciowych.

Hodowle produkcyjna prowadzono 96 godzin w warunkach, jak w przykladzie I z tym, ze nie korygowano pH w czasie procesu biosyntezy. Po zakonczeniu procesu biosyntezy 1 litr brzeczki zawieral L-lizyne w ilosci podanej w tabeli 3.

Tabela 3 Mutant BrWibacteriumflavum [IPF 2105 Brevibacteriumflavum | IPF 2110 Brevibacteriumflavum | IPF 2146 Zródlo wegla w pozywce cukier surowy melasa cukier surowy melasa cukier surowy melasa L-lizyna • •HCL wg/l 38,4 43,0 | 53,0 53,2 J 62,0 55,0 | Przyklad IV. Prowadzono hodowle mutantów poli- auksotroficznych Brevibacterium flavum IPF 2105, Brevi- bacterium flavum IPF 2110 oraz Brevibacterium flavum IPF 2146 na pozywce stalej i pozywce posiewowej, jak w przykladzie I.

Hodowle produkcyjna mutantów prowadzono w kolbach stozkowych o pojemnosci 500 ml z lamaczem, zawieraja¬ cych 30 ml pozywki i nastepujacym skladzie: hydrolizat maki arachidowej (w przeliczeniu na make) — 4,0%, 6 CaC03 techniczny — 2,0%, MgS04 — 0,02%, K2HP04 — — 0,1 %, cukier surowy (w przeliczeniu na cukry reduku¬ jace)— 15%)> woda wodociagowa do 100%. Roztwór cukru surowego i roztwór pozostalych skladników pozywki sterylizowano oddzielnie przez 30 minut w temperaturze 117°C. Po sterylizacji roztwór skladników pozywki uzupel¬ niano roztworem cukiu surowego. Wartosc pH pozywki wynosila 7,3—7,5. Pozywke szczepiono hodowla posiewowa w ilosci 5%) objetosciowych. Hodowle prowadzono 72—96 godzin w warunkach, jak w przykladzie I. Po zakonczeniu procesu biosyntezy 1 litr brzeczki zawieral lizyne w ilosci podanej w tabeli4. v Ta bela 4 Mutant Brevibacterium flavum IPF 2105 Brevibacterium flavum IPF 2110 Brevibacterium flavum | IPF 2146 L-lizyna • HC1 w g/litr w 72 godz. 55,0 53,5 58,9 w 96 godz. 58,2 64,6 70,4

Claims (2)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania L-lizyny metoda mikrobiolo¬ giczna przy uzyciu mutantów biochemicznych drobno¬ ustroju z rodzaju Brevibacterium flavum, znamienny tym, ze proces biosyntezy prowadzi sie przy uzyciu poliauksotro- ficznych mutantów Brevibacterium flavum IPF 2105, IPF 2110, IPF 2146, wymagajacych dla wzrostu biotyny, treoniny i argininy lub biotyny, treoniny i izoleucyny, równoczesnie wrazliwych na treonine, w warunkach tleno-- wych, w temperaturze 28 °—32 °C, w czasie 72—96 godzin, na pozywkach plynnych, zawierajacych przyswajalne zródla wegla, azotu oraz substancji buforujacych, przy wartosci pH hodowli 6,0—8,0.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako zródlo . przyswajalnego wegla stosuje sie weglowodany, takie jak glukoza techniczna, cukier surowy, melasa bura- czara, hydrolizat szlamu krochmalowego lub ich miesza¬ niny, jako zródlo azotu niebialkowego stosuje sie mocznik, sole amonowe oraz, jako zródlo azotu aminokwasowego —- odbialczony sok komórkowy ziemniaka, hydrolizat sruty rzepakowej, hydrolizat maki arachidowej, wyciag namokowy kukurydzy. 15 20 25 30