PL106285B1 - Sposob wytwarzania l-lizyny na drodze hodowli aerobowej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-lizyny na drodze hodowli aerobowej.

Wytwarzanie L-lizyny, uzytecznej jako dodatek paszowy na drodze fermentacji, bylo juz znane i stosowane.

Obecnie, dzieki badaniom majacym na celu ulep¬ szenie znanego procesu, stwierdzono, ze mutant Brevibacterium oporny na a-aminolaurylolaktam (dalej oznaczany symbolem ALI), y-metylolizyne (dalej oznaczana symbolem ML) i N-co-karboben- zoksylizyne (dalej oznaczana symbolem CBL) moze wytwarzac L-lizyne z wydajnoscia wyzsza niz znane mutanty, wytwarzajace ten aminokwas.

Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze prowadzi sie hodowle aerobowa w wodnym sro¬ dowisku mutanta wytwarzajacego L-lizyne, a na¬ stepnie po nagromadzeniu sie w srodowisku L- -lizyny odzyskuje sie ja z tego srodowiska. Jako mikroorganizm wytwarzajacy L-lizyne stosuje sie mutant Breyibacterium lactofermentum .FERM-P 3382 lub Brevibacterium lactofermentum FERM-P 3383 lub Bxevibaate.rium lactotermentum FJERM-P 3384 lub Brevibacterium lactofermentum FERM-P 3385 lub Brevibacterium lactofermentum FERM-P 3386 lub Brevibacterium lactofermentum FERM-P 3387 (ATCC 31269).

Korzystnie stosuje sie mutanty: oporny na u- -aminolaurylolaktam, (ALI), y-metylolizyne (ML) lub N-ca-karbobenzoksylizyne (CBL), a takze takie które ponadto sa oporne na S-/2-aminoetylo/-L- -cysteine. Korzystnie stosuje sie równiez mutant, wymagajacy ponadto do wzrostu L-alasiiny.

Najkorzystniej, stosuje sie w sposobie wedlug wynalazku nastepujace mutanty: Breyibacterium lactofermentum AJ 3985 (FERM-P 3.382) (CBL) (odporny na CBL) Breyibacterium lactofermentum AJ 3986 (FERM-P 3383) (MLy) Breyibacterium lactofermentum AJ 3987 (FERM-P 3384) (CBLy, AECy).

Breyibacterium lactofermentum AJ 3988 (FERM-P 3385) (ALLy, AECy) Breyibacterium lactofermentum AJ 3989 (FERM-P 3386) (CBLy), AECy, Ala- (wymagajacy do wzro- stu alaniny) Breyibacterium lactofermentum AJ 3990 (FERM-P 3387) (MLy, AECy, Ala-) (ATCC 31269) Numery poprzedzone symbolem FERM-P sa numerami szczepów w zbiorze Fermentation Re¬ search Institute, Agency of Industrial Science and Technology, No 5—2, 4-chome, Inagehigashi, Chi- ba-shi, Japan, skad sa one bezplatnie udostep¬ niane kazdemu na zadanie.

Numery poprzedzone symbolem ATCC sa nu¬ merami w zbiorze American Type Culture Col- lection, 12301. Parklawn Drive, Rockyille, Mary¬ land 20852, USA, skad równiez sa bezplatnie udo¬ stepniane kazdemu na zadanie.

Powyzsze mutanty wytwarzajace L-lizyne mo- 106 285106 285 zna wyprowadzic np. z nastepujacych szczepów macierzystych Brevibacterium: Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Wyzej wymienione szczepy macierzyste maja nastepujace cechy wspólne: (1) wytwarzaja kwas L-glutaminowy i naleza do tzw. bakterii ksztaltu maczugowatego; (2) mutanty wyprowadzone ze szczepów macie¬ rzystych wytwarzaja L-lizyne; (3) wzrost szczepu macierzystego jest hamowa¬ ny obecnoscia w pozywce ALL, ML lub CBL, a hamowanie wzrostu jest znoszone obecnoscia w pozywce L-lizyny. Oznacza to, ze mutanty wypro¬ wadzone ze szczepów macierzystych, oporne na ALL, ML lub CBL, moga wytwarzac L-lizyne.

Sposoby otrzymywania i wyodrebniania mutan¬ tów, stosowanych w sposobie wedlug wynalazku, sa konwencjonalne. Ilustruje je nastepujacy przy¬ klad: Na szczep Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 dziala sie w 30°C, w ciagu 30 minut, N-me- tylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyne w stezeniu 250 fig/ml. Szczepy nanosi sie na plyty z pozywka o skladzie: glukoza mocznik (NH4)2S04 KH2P04 MgS04 • 7H20 FeS04 • 7H20 MnS04 • 4H20 biotyna tiamina • HCl CBL agar 2 g/dl 0,3 g/dl 1 g/dl 0,1 g/dl 0,04 g/dl 1 mg/dl 1 mg/dl 50 p.g/1 100 ^g/1 0,1 g/dl 2 g/dl i inkubuje w ciagu 4—10 dni w 30°C, po czym oddziela wyhodowane pojedyncze kolonie.

W powyzszy sposób wyodrebniono mutant AJ 3985 o najwyzszej wydajnosci L-lizyny. W ana¬ logiczny sposób otrzymano inne mutany, stoso¬ wane w sposobie wedlug wynalazku.

Mikroorganizmy hoduje sie na pozywce A w °C w ciagu 24 godzin, a komórki wyhodowane na tej pozywce zbiera, przenosi na pozywke B i zawiesza w tej pozywce.

Sklad pozywki A wyciag z pepton NaCl glukoza agar drozdzy 1 g/dl 1 g/dl 0,5 g/dl 0,5 g/dl 2,0 g/dl (pH = 7,0) 18 as 40 49 MgS04 • 7H20 FeS04 • 7H20 biotyna tiamina • HCl NaCl CaC03 0,04 g/dl 1 mg/dl 50 jig/1 200 jjtg/1 0,05 g/dl 3 g/dl 55 (oddzielnie sterylizowany) MnS04 • 7H20 1 mg/dl (pH = 7,0) Do probówek o pojemnosci 10 ml, zawieraja¬ cych po 3 ml pozywki B z dodatkiem ALL, CBL lub ML wprowadzono po 0,1 ml zawiesiny ko¬ mórek i inokulowano je w 30°C w ciagu 20 go¬ dzin, przy wstrzasaniu.

Po zakonczeniu fermentacji oznaczono wzrost przez pomiar gestosci optycznej przy 562 mtj, 26-krotnie rozcienczonej brzeczki.

Wyniki przedstawiono w tablicy I. Tak otrzy¬ mane mutanty wytwarzaja w pozywce produkcyj¬ nej znaczne ilosci L-lizyny, nawet wówczas, gdy wykazuja opornosc jedynie na ALL, ML lub CBL.

Jezeli ponadto wykazuja cechy, o których wia¬ domo, ze przyczyniaja sie do wzrostu wydajnosci L-lizyny, takie jak opornosc na AEC lub zapo¬ trzebowanie alaniny, to ich wydajnosc wytwarza¬ nia L-lizyny zwykle znacznie wzrasta.

Sposoby wytwarzania L-lizyny z zastosowaniem wyzej wymienionych mikroorganizmów sa kon¬ wencjonalne. Fermentacje prowadzi sie w kon¬ wencjonalnych pozywkach, zawierajacych zródla wegla i azotu, nieorganiczne sole, substancje od¬ zywcze, warunkujace wzrost i inne substancje od¬ zywcze, dodawane w mniejszych ilosciach.

Jako zródlo wegla mozna stosowac weglowo¬ dany, takie jak glukoza, sacharoza, melasa lub hydrolizat skrobi, organiczne kwasy, takie jak oc¬ towy, propionowy lub benzoesowy, alkohole takie, jak etanol lub propanol, a w przypadku pewnych szczepów równiez weglowodany. Jako zródlo azotu mozna stosowac amoniak, siarczan amonu, azotan amonu, chlorek amonu, fosforan amonu, mocznik itp. Substancje wzrostowe moga byc stosowane w postaci oczyszczonej lub jako skladniki materia¬ lów pochodzenia naturalnego, takie jak hydrolizat soi, namok kukurydziany, wyciag z drozdzy lub pepton.

Fermentacje prowadzi sie w warunkach aero- bowych w 24—37°C, w ciagu 2—7 dni. W trak¬ cie fermentacji dodawaniem zasad lub kwasów, weglanu wapnia, mocznika lub gazowego amonia¬ ku utrzymuje sie pH brzeczki w zakresie 5—9.

Powstala w brzeczce L-lizyne mozna wyodreb¬ nic znanymi sposobami, np. w drodze adsorpcji na zywicach jonitowych lub w drodze bezposred¬ niej krystalizacji z plynu fermentacyjnego.

Przyklad I. Do kolb o pojemnosci 500 m] wprowadza sie po 20 ml pozywki o skladzie: Sklad pozywki B glukoza (NH4)2S04 KH2P04 2 g/dl 1 g/dl 0,1 g/dl 65 glukoza (NH4)2S04 KH^P04 MgS04 • 7H20 FeS04 • 7H20 g/dl g/dl 0,1 g/dl 0,04 g/dl 1,0 mg/dl106 285 6 MnS04-4H20 biotyna tiamina • HC1 hydrolizat soi (azot calkowity 7%) 1,0 mg/dl ,0 ^g/dl ,0 |j,g/dl 1,5 ml/dl CaCOs oddzielnie sterylizowany (pH = 7,0) Pozywki szczepi sie mikroorganizmami, poda¬ nymi w tablicy II i wstrzasajac inkubuje w ciagu 72 godzin w 31°C.

Po zakonczeniu fermentacji oznacza sie zawar¬ tosc L-lizyny w brzeczce. Wyniki, w przeliczeniu na chlorowodorek L-lizyny, zestawiono w tabli¬ cy II.

Przyklad II. Mikroorganizmy, przedstawione w tablicy 3, hoduje sie aerobowo w pozywce po- siewowej o skladzie: glukoza octan amonu mocznik KH2P04 MgS04 • 7HzO FeS04 • 7H20 MnS04 • 4H20 biotyna tiamina HC1 hydrolizat soi (azot calkowity 7%) (pH = Do hodowli bierze sie mentacje prowadzi sie w 1,5 g/dl 0,3 g/dl 0,1 g/dl 0,1 g/dl 0,04 g/dl 1 mg/dl 1 mg/dl 50 vig/l 200 ^g/l 3 ml/dl = 7,5) Po 50 ml pozywki. Fer- 31°C w ciagu 10 godzin.

Do kolb fermentacyjnych o pojemnosci 1 litra wprowadza sie po 300 ml pozywki produkcyjnej o nastepujacym skladzie: glukoza octan amonu mocznik (NH4)2S04 KH2P04 MgS04 • 7H20 FeS04 • 7H20 MnS04 • 7H20 biotyna tiamina HCl hydrolizat soi (pH 2 g/dl 0,5 g/dl 0,2 g/dl 0,5 g/dl 0,1 g/dl 0,04 g/dl 1 mg/dl 1 mg/dl 50 (tig/l 60 ^g/1 3 ml/dl = 7,5) Kolby sterylizuje sie i szczepi hodowla posie- wowa w objetosci po 15 ml na kolbe.

Hodowle prowadzi sie aerobowo w 30°C, okre¬ sowym dodawaniem wodnego roztworu kwasu octowego i octanu amonu utrzymujac pH brzeczki w zakresie 7,2—8,0.

Po 72 godzinach fermentacji uzyskuje sie L-li- zyne w ilosci, przedstawionej w tablicy III.

Przyklad III. Mikroorganizmy, podane w ta¬ blicy IV, hoduje sie aerobowo w 31°C w ciagu 18 godzin 50 ml pozywki posiewowej o skladzie, jak pozywka posiewowa w przykladzie II, z tym, ze w miejsce 0,3 g/dl octanu amonu w sklad pozywki wchodzi alkohol etylowy w ilosci 0,5 g/dl, a mocz¬ nik stosuje sie w ilosci 0,3 g/dl.

Do kolb fermentacyjnych o pojemnosci 1 litra wprowadza sie po 300 ml pozywki produkcyjnej o skladzie, jak w przykladzie II, z tym, ze ste¬ zenie glukozy wynosi 1 g/dl, a 0,5 g/dl octanu amonu zastepuje sie alkoholem etylowym, doda- jac go do pozywki w ilosci 1 g/dl. Kolby steryli¬ zuje sie i szczepi hodowle posiewowa, w objetosci po 15 ml na kolbe.

Hodowle prowadzi sie aerobowo w 31°C, okre¬ sowym dodawaniem gazowego amoniaku utrzy- io muijac pH brzeczki w zakresie 7,2—8,2. Do brzeczki dodaje sie równiez okresowo alkoholu etylowego, utrzymujac jego stezenie na poziomie okolo 0,3 g/dl. Oznaczen alkoholu w brzeczce dokonuje sie technika chromatografii gazowej.

Po 56 godzinach hodowli uzyskuje sie L-lizyne w ilosci przedstawionej w tablicy IV.

Przyklad IV. Do kolb o pojemnosci 500 ml rozlewa sie, w objetosci po 20 ml na kolbe, po¬ zywke o skladzie: melasa z buraka cukrowego lub trzciny cukrowej 40 50 55 (NH4)2S04 KH2P04 MgS04 • 7HzO biotyna CaC03 g/dl g/dl 0,1 g/dl 0,04 g/dl 0,5 mg/l g/dl (oddzielnie sterylizowany) Po sterylizacji pozywke szczepi sie mikroorga¬ nizmami, podanymi w tablicy V i w ciagu 72 go¬ dzin utrzymuje w 30°C, wstrzasajac.

Brzeczki zawieraja L-lizyne w ilosci przedsta¬ wionej w tablicy V.

W sposób analogiczny do wyzej podanego pro¬ wadzi sie hodowle AJ 3989 w 1 litrze pozywki.

Po zakonczeniu fermentacji odwirowuje sie z Tablica I Mikroorganizm ATCC 13869 (nota 1) AJ 3985 (FERjMhP 3382) AJ 3986 (FERM-P 3383) 1 AJ 3987 (FERM-P 3384) AJ 3988 (FERM-P 3385) AJ 3989 (FERM-P 3386) (nota 2) AJ 3990 (FERM-P 3387) (nota 2) (ATCC 31269) Dane che¬ mikalia brak CBL ML ALL brak CBL brak ML brak CBL brak ALL brak CBL Irak ML sc doda-1 eh che- kaliów | a Erg 0,1 0,1 0,025 — 0,1 — 0,1 — 0,1 — 0,025 — 0,1 — 0,1 >>3 S?2 100 21 9 > 12 100 79 100 96 100 94 100 58 100 82 100 79 1 nota 1: ATCC 13869 jest szczepem macierzystym mutantów AJ 3985, AJ 3986, AJ 3988, AJ 3989 i AJ 3990 nota 2: AJ 3989 i AJ 3990 hodowano w pozywce B, zawierajacej ponadto 500 ug/ml L-ala- G5 niny i 5 u,g/ml nikotynamidu.106 285 brzeczki komórki, a plyn fermentacyjny prze¬ puszcza sie przez silnie kwasna zywice jonitowa Amberlits IR-120. Zaadsorbowana na zywicy L- -lizyne eluuje sie 3% roztworem wodorotlenku amonu, a z eluatu uzyskuje sie krzysztaly dwu- 5 wodzianu chlorowodorku L-iizyny (28,5 g).

Tablica IV Tablica II 1 AJ 3985 (FERM-P 3382) AJ 3986 (FERM-P 3383) AJ 3987 (FERM-P 3384) 1 AJ 3988 (FERM-P 3385) AJ 3989 (FERM-P 3386) AJ 3990 (FERM-P 3387) AJ 3445 (ATCC 31269) Nagroma¬ dzana L-li¬ zyna (g/litr) 2;0 1.5 27 28 37 36 18 1 IG AJ 3445 (AECy) jest wytwarzajacym L-lizyne mutantem Brevibacterium lactofermentum, nie majacym opornosci na CBL, ML i ALL.

Tablica ni Mikroorganizm AJ 3988 (FERM-P 3385) AJ 3989 (FERM-P 3386) AJ 3990 (FERM-P 3387) AJ 3445 (ATCC 31269) Nagroma¬ dzama L-li- zyna (g/litr) | 85 96 94 41 40 Mikroorganizm 1 AJ 3988 (FERM-P 3385) AJ 3988 {FERM-P 3386) AJ 3998 (FERM-P 3387) AJ 3445 (ATCC 31269) Nagroma¬ dzona L-li- zyna (g/litr) 63 63 78 36 Wydajmosc L-lizyny w stosunku do skonsu- mowanego alkoholu etylowego l

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania L-lizyny na drodze ho¬ dowli aerobowej w wodnym srodowisku mikroor¬ ganizmu wytwarzajacego L-lizyne i odzyskiwania nastepnie otrzymanej L-lizyny ze srodowiska ho¬ dowlanego, znamienny tym, ze jako mikroorga¬ nizm wytwarzajacy L-lizyne stosuje sie mutant Brevibacterium lactofermentum FERM-P 3382 lub Brevibacterium lactofermentum FERM-P 3383 lub Brevibacterium lactofermentum FERM-P 3384 lub Brevibacterium lactofermentum FERM-P 3385 lub Brevibacterium lactofermentum FERM-P 3386 lub Brevibacterium lactofermentum FERM-P 3387 (ATCC 31269). PZOraf. Koszalin D-158B 100 egz. A-4 Cena 45 zl