Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego tetradekapeptydu o wzorze 1.Wytwarzany sposobem wedlug wynalazku tetra¬ dekapeptyd jest zwiazkiem posrednim w procesie wytwarzania nowej D-ya^-somatostatyny wykazu¬ jacej róznorodna aktywnosc biologiczna, w tym np. czynnosc hamowania wydzielania kwasów zoladkowych i zmniejszania ruchliwosci jelita.Somatostatyna, znana takze jako czynnik hamu¬ jacy wydzielanie somatotropiny jest tetradeka- peptydem o wzorze 3. Ten tetradekapeptyd wyizo¬ lowano z ekstraktów podwzgórzy owczych, stwier¬ dzajac, ze wykazuje on aktywnosc hamowania wy¬ dzielania hormonu wzrostu (GH), znanego takze jako somatotropina.W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3904594 opisano naturalna somatosta¬ tyna jak równiez rodzine innych zwiazków posia¬ dajacych sekwencje dodekapeptydowa reprezento¬ wana w pozycjach 3—14 naturalnego hormonu.Oprócz tego zwiazek oznaczony D-Ala1 — somato¬ statyna, zostal przedstawiony przez Ferlanda i wspól¬ pracowników w Molecular and Cellular Endo- crinology, 4, 79—88 (1976).Chociaz D-Alai-somatostatyna jest stereoizome- rem naturalnej L-Ala^omatostatyny, posiada ona o polowe mniejsza aktywnosc w hamowaniu in vivo wydzielania kwasów zoladkowych niz natu¬ ralna somatostatyna. D-yal^somatostatyna rózni sie od D-Ala^somatostatyny tym, ze w miejsce dwóch 10 19 atomów wodoru posiada dwie grupy metylowe.Mozna byloby wiec oczekiwac, ze aktywnosc far¬ makologiczna D-yaP-somatostatyny bedzie podob¬ na do aktywnosci D-Ala^somatostatyny, a wiec bedzie nizsza, niz aktywnosc naturalnego hormonu w hamowaniu in vivo wydzielania kwasów zolad¬ kowych. D-ya^-somatostatyna posiada jednakze nieco wyzsza aktywnosc od aktywnosci naturalnego hormonu, co wskazuje na nieoczekiwane wlasci¬ wosci D-yaU-somatostatyny w porównaniu ze zna¬ nymi zwiazkami o podobnej strukturze.Jak wyzej podano, sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie nowy posredni tetradekapeptyd o wzorze 1, przy czym sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze nowy zwiazek o wzorze 2 w któ¬ rym R oznacza grupe zabezpieczajaca grupe a-ami- nowa, Ri oznacza grupe zabezpieczajaca grupe tiolowa, R2 oznacza grupe zabezpieczajaca grupe £-aminowa, kazdy R3 i R4 oznacza grupe zabezpie¬ czajaca grupe hydroksylowa, R5 oznacza atom wo¬ doru lub grupe formylowa a X oznacza ugrupo¬ wanie o wzorze 4, w którym okreslenie zywica oznacza polistyren, poddaje sie reakcji z mocnym kwasem.Korzystnie jako zwiazek wyjsciowy stosuje sie N-(BOC)-D-Val-Gly-L-(PMB)-Cys-L-(CBzOC)- Lys- -L-Asn-L-Phe-L-Phe-L- (For) Trp-L-(CBzOC) - Lys- -L-(Bzl)Thr-L-Phe-L-(Bzl)Thr-L-(Bzl)Ser-L-(PMB)- Cys-X, gdzie X ma wyzej podane znaczenie. 115 8273 115 827 4 Wlasciwosci grupy zabezpieczajacej sa dwoja¬ kiego rodzaju. Po pierwsze grupa zabezpieczajaca chroni aktywna czesc danej czasteczki przed prze- reagowaniem w trakcie dzialania na czasteczke w takich warunkach, które moglyby spowodowac rozszczepienie innej aktywnej czesci tej czasteczki.Po drugie, grupa zabezpieczajaca jest taka grupa, która daje sie latwo usunac z przywróceniem pierwotnej aktywnej czesci czasteczki i to w takich warunkach, które nie moga wplywac w niepoza¬ dany sposób na inne czesci tej czasteczki. Grupy uzyteczne w tym zastosowaniu, to znaczy sluzace do zabezpieczenia grupy aminowej, hydroksylowej i tiolowej sa dobrze znane. Opisowi i omówieniu sposobów stosowania grup tego rodzaju poswiecono wiele publikacji. Jednym z takich opracowan jest praca zbiorowa Protective Groups in Organie Che- mistry, pod redakcja M.F.W. McOmie, Plenum Press, New York, 1973.Grupy zabezpieczajace grupe a-aminowa ozna¬ czone symbolem R sa dobrze znane w dziedzinie peptydów. Wiele z nich wyszczególnia J.W. Barton w rozdziale 2 cytowanej wyzej pracy McOmie.Przykladami takich grup zabezpieczajacych sa grupy: benzyloksykarbonylowa, p-chlorobenzylo- ksykarbonylowa, p-bromobenzyloksykarbonylowa. o-chlorobenzyloksykarbonylowa, 2,6-dwuchloroben- zyloksykarbonylowa, 2,4-dwuchlorobenzyloksykar- bonylowa, o-bromobenzyloksykarbonylowa, p-me- toksybenzyloksykarbonylowa, p-nitrobenzyloksy- karbonylowa, Ill-rzed.-butoksykarbonylowa (BOC), III - rzed. - amyloksykarbonylowa, 2 - (p - dwufe- nylo)izopropoksykarbonylowa (BpOC), adamenty- loksykarbonylowa, izopropoksykarbonylowa, cyklo- pentyloksykarbonylowa, cykloheksyloksykarbonylo- wa, cykloheptyloksykarbonylowa, trójfenylometylo- wa (tritylowa) i p-toluenosulfonylowa.Korzystna grupa zabezpieczajaca grupe a-ami¬ nowa, oznaczona symbolem R, jest grupa III-rzed.- -butoksykarbohyIowa.Grupy zabezpieczajace grupe tiolowa cysteiny oznaczone symbolem Ri opisali R.G. Hickey, V.R.Rac i W.G. Rhodes w rozdziale 7 cytowanego McOmie. Przykladami takich grup zabezpieczaja¬ cych sa takie grupy jak p-metoksybenzylowa, benzylowa, p-tolilowa, benzhydrolowa, acetamido- metylowa, tritylowa, p-nitrobenzylowa, III-rzed.- -butylowa, izobutoksymetylowa, a takze jakakol¬ wiek z pochodnych grupy tritylowej. Inne grupy opisal, na przyklad Houben-Weyl w Methodes der Organischen Chemie, „Synthese von Peptiden", tomy 15/1 i 15/2 (1974), Stuttgart, RFN. Korzystna grupa zabezpieczajaca grupe tiolowa oznaczona symbolem Ri jest grupa p-metoksybenzylowa.R2 oznacza grupe zabezpieczajaca grupe f-ami- nowa. Przykladem takich grup jest wiekszosc grup wyzej wymienionych, nadajacych sie do uzycia jako grupy zabezpieczajace grupe a-aminowa. Do typowych grup tego rodzaju nalezy grupa benzy¬ loksykarbonylowa, Ill-rzed.-butoksykarbonylowa, Ill-rzed.-amyloksykarbonylowa, cyklopentyloksy- karbonylowa, adamantyloksykarbonylowa, p-me- toksybenzyloksykarbonylowa, p-chlorobenzyloksy- karbonylowa, p-bromobenzyloksykarbonylowa, o- -chlorobenzjloksykarbonylowa, 2,6-dwuchloroben- zyloksykarbonylowa, 2,4-dwuchlorobenzyloksykar- bonylowa, o-bromobenzyloksykarbonylowa, p-nitro- benzyloksykarbonylowa, izopropoksykarbonylowa, cykloheksyloksykarbonylowa, cykloheptyloksykar- 5 bonylowa i p-toluenosulfonylowa.Jak przedstawiono ponizej, proces, w którym wyt¬ warza sie tetradekapeptyd obejmuje powtarzajace sie odszczepianie grupy zabezpieczajacej grupe a-aminowa od koncowego aminokwasu obecnego 10 w lancuchu peptydowym. To tez jedynym ograni¬ czeniem odnoszacym sie do rodzaju grupy zabez¬ pieczajacej grupe ^-aminowa reszty lizyny jest warunek, aby stanowila ja taka grupa, która nio ulegnie odszczepieniu w warunkach przyjetych dii 15 selektywnego odszczepiania grupy zabezpieczajacej grupe a-aminowa. Dobór odpowiednich grup za¬ bezpieczajacych grupy a-aminowa i s-aminowa jest dobrze znany w dziedzinie chemii peptydów i za¬ lezy od wzglednej latwosci odszczepiania sie posz- 20 czególnych grup. Takie grupy jak grupa 2-(p-bife- nylilo)izopropoksykarbonylowa (BpOC) i tritylowa, sa bardzo labilne i moga zostac odszczepione juz nawet w obecnosci slabego kwasu.Do odszczepienia innych grup, takich jak grupa 25 Ill-rzed.-butoksykarbonylowa, Ill-rzed.-amyloksy¬ karbonylowa, adamantyloksykarbonylowa i p-me- toksybenzyloksykarbonylowa, konieczne jest uzycie umiarkowanie mocnego kwasu, takiego jak kwas solny i trójfluorooctowy lub trójfluorek boru w jo kwasie octowym. Jeszcze bardziej kwasne srodo¬ wisko niezbedne jest do spowodowania odszcze¬ piania innych grup zabezpieczajacych, takich jak grupa benzyloksykarbonylowa, chlorowcobenzylo- ksykarbonylowa, p-nitrobenzyloksykarbonylowa. 35 cykloalkiloksykarbonylowa i izopropoksykarbonylo¬ wa. Do odszczepienia t3'ch ostatnich grup potrzebne sa drastyczne kwasne warunki, takie jak zastosowa¬ nie bromowodoru, fluorowodoru lub trójfluorooc- tanu boru w kwasie trójfluorooctowy m. Oczywiscie 40 w przypadku uzycia mocniejszego kwasu ulega od- szczepieniu-kazda z bardziej labilnych grup.Wlasciwy dobór grup zabezpieczajacych grupy aminowe polega na zastosowaniu do ochrony funk¬ cji a-aminowej grup bardziej labilnych niz do 45 ochrony funkcji f-aminowej, z uwzglednieniem warunków selektywnego odszczepienia, które za¬ pewniaja usuniecie wylacznie grupy zabezpiecza¬ jacej funkcje a-aminowa. W tym kontekscie R2 korzystnie oznacza grupe o-chlorobenzyloksykarbo- 50 nylowa lub cyklopentyloksykarbonylowa i w zwiaz¬ ku z tym korzystna grupa zabezpieczajaca grupe a-aminowa z wyboru, która mozna zastosowac w przypadku kazdego aminokwasu, który przylacza sie do lancucha peptydowego, jest grupa III-rzed.- g, -butoksykarbonylowa.R3 i R4 oznaczaja grupy zabezpieczajace grupe wodorotlenowa treoniny i seryny. Wiele grup za¬ bezpieczajacych tego rodzaju opisal C.B. Reese w rozdziale 3 cytowanego McOmie. Do typowych M grup zabezpieczajacych tego rodzaju nalezy, na przyklad, grupa alkilowa o 1—4 atomach wegla, taka jak metylowa, etylowa i Ill-rzed.-butylowa, grupa benzylowa, podstawiona grupa benzylowa, taka jak p-metoksybenzylowa, p-nitrobenzylowa, U p-chlorobenzylowa i o-chlorobenzylowa, grupa ,,;l;f^0^5 115 827 6 £lkanokarbon^ Iowa o 1-3 atomach wegla, taka jak formylowa, acet^lowa i propionylowa, grupa trójfenylometylowa (tritylcrwa) i temu podobne.Korzystnie, jezeli R* i R4 oznaczaja grupy zabez¬ pieczajace, grupa ta z wyboru jest w obu przypad¬ kach grupa benzylowa.R5 oznacza albo atom wodoru albo grupe formy¬ lowa i stanowi ugrupowanie ~NR* reszty trypto- fanu. Grupa formylowa pelni funkcje grupy za¬ bezpieczajacej. Uzycie takiej grupy zabezpieczaja¬ cej jest warunkowe, to tez wlasciwie R5 moze ozna¬ czac atom wodoru (N-niezabezpieczony) lab grupe formylowa (N-zabezpieczony).Grupa X jest zwiazana z terminalna grupa kar¬ boksylowa lancucha tetra dekapeptydu. Jak wspom¬ niano X oznacza zywice stanowiaca staly nosnik, z którym w trakcie syntezy polaczona jest koncowa grupa karboksylowa peptydu. Te stala zywice przedstawia wzór 4.W niniejszym opisie stosuje sie nastepujace skró¬ ty, z których wiekszosc jest dobrze znana i stoso¬ wana: Ala — alanina; Aan — asparagina; Cys — cysteina; Gly — glicyna; Lys — lizyna, Phe — fe- nyloalanina; J3er — seryna; Thr — treonina; Trp — tryptofen; Val — walina; DCC — N,N'- dwucykloheksylokarbodwuimid; DMF — NTN- -dwumetylaformamid; BOC — grupa III-rzei.- butoksykarbonylowa; PMB — grupa p-metoksy- benzylowa; CBzOC — grupa o-chlorobenzyloksy- karbonylowa; CPOC — grupa cyklopentyloksykar- bonylowa; Bzl — grupa benzylowa; For — grupa formylowa; BpOC — grupa 2-(p-bifenylilo)izopro- poksykarbonyIowa.Chociaz dobór poszczególnych grup zabezpiecza¬ jacych stosowanych_w syntezie tetradekapeptydów jest dobrze znany w dziedzinie peptydów, nalezy wziac pod uwage, ze wybór danej grupy ochronnej jest zalezny od sekwencji. Innymi slowy, grupe zabezpieczajaca z wyboru powinna stanowic grupa trwala wobec odczynników i warunków stosowa¬ nych w nastepnych etapach sekwencji procesu. Na przyklad, jak to juz czesciowo omówiono, zastoso¬ wana grupa zabezpieczajaca musi byc taka grupa, która pozostaje nienaruszona w warunkach od- szczepienia grupy zabezpieczajacej grupe a-amino- wa koncowego aminokwasu we fragmencie pep¬ tydu przygotowywanego do przylaczenia kolejnego fragmentu aminokwasowego do lancucha peptydo- wego.Jest takze rzecza wazna, aby jako grupe zabez¬ pieczajaca wybrac taka grupe, która pozostaje nie¬ naruszona podczas budowy lancucha peptydowego i która mozna latwo usunac po zakonczeniu syn¬ tezy zadanego tetradekapeptydn. Zagadnienia te sa znane w dziedzinie chemii peptydów.Z powyzszego wynika, ze wyjsciowy tetradeka- peptyd o wyzej podanym wzorze mozna wytwarzac na drodze syntezy w fazie stalej. Synteza ta po¬ lega na stopniowej budowie lancucha peptydo¬ wego, zaczynajac od C-konca peptydu. Dokladniej, najpierw wiaze sie cysteine poprzez jej grupe kar¬ boksylowa z zywica na drodze reakcji cysteiny, o zabezpieczonej grupie aminowej i tiolowej, z chlorometylowana lub hydroksymetylowana zywi¬ ca. Sposób wytwarzania zywicy hydroksymetylo- wanej jest opisany przez Bodanszky'ego i wspólpra¬ cowników w Chem. Ind. (London), 38, 1597—93 ( 96€.Wiazanie cysteiny C-koncem z zywica prowadzi 5 sie w ten sposób, ze najpierw zabezpieczona cyste- i e przeksztalca sie w jej sól cezowa. Otrzymana scl poddaje sie nastepnie reakcji z zywica wedlug n-etody opisanej przez B. F. Gisina w Helv. Chim.Acta, 58, 1476 (1973). W inny sposób,cysteine mozna 10 zwiazac z zywica aktywujac funkcje karboksylowa czasteczki cysteiny znanymi metodami. Na przyk¬ lad cysteine mozna poddac reakcji z zywica w obecnosci zwiazku aktywujacego grupe karboksy¬ lowa, takiego jak N,N'-dwucykloheksylokarbodwu- 15 imid (DCC).Po przylaczeniu cysteiny jej wolna grupa karbo- ksj^wa do nosnica zywicy, pozostale etapy sek- wei^ji budowy peptydu obejmuja kolejna addycje poszczególnych aminokwasów do N-koncowej czesci 20 lancucha peptydowego. To tez nieodzownie kazda sekwencja procesu obejmuje odszczepienie grupy zabezpieczajacej grupe a-aminowa z aminokwasu stanowiacego N-koniec fragmentu peptydu, a nas¬ tepnie przylaczenie kolejnej reszty aminokwaso- 25 wej do juz wolnego i aktywnego aminokwasu na N-koncu. Odszczepienia grupy zabezpieczajacej grupe a-aminowa dokonac mozna w obecnosci kwasu, takiego jak kwas bromowodorowy, solny, trójfluorooctowy, p-toluenosulfonowy, benzenosul- 30 fonowy, naftalenosulfonowy i octowy z utworze¬ niem odpowiedniej kwasnej soli addycyjnej.Inna metoda nadajaca sie do przeprowadzenia odszczepiania grupy zabezpieczajacej grupe ami¬ nowa polega na uzyciu trójfluorku boru. Na 36 przyklad dwuetyloeterat trójfluorku boru w lodo¬ watym kwasie octowym powoduje przeksztalcenie fragmentu peptydu z zabezpieczona grupa amino¬ wa w kompleks z BF3, który nastepnie mozna przeksztalcic w odblokowany fragment peptydu 40 poddajac go dzialaniu zasady, takie} jak wodny roztwór wodoroweglanu potasowego. Mozna stoso¬ wac kazda z tych metod jezeli tylko stwierdzi sie, ;e metoda z wyboru daje odszczepianie grupy za- t ezpieczajacej N-koncowa grupe a-aminówa z 45 uniknieciem odszczepienia jakiejkolwiek innej gru¬ py zabezpieczajacej wystepujacej w lancuchu pep- tydowm. Z tego wzgledu odszczepienie N-konco¬ wej grupy zabezpieczajacej, korzystnie prowadzi sie za pomoca kwasu trójfluorooctowego. Ogólnie 50 biorac, odszczepienie prowadzi sie w temperaturze od okolo 0°C do zblizonej do temperatury pokojo¬ wej.Zwiazek otrzymany po rozszczepieniu na N- koncu wystepuje zazwyczaj w postaci kwasnej soli 55 addycyjnej z tym kwasem, którego uzyto do od¬ szczepienia grupy zabezpieczajacej. Nastepnie otrzymany zwiazek mozna przeksztalcic w zwiazek o wolnej koncowej grupie aminowej poddajac go dzialaniu slabej zasady, zazwyczaj aminy trzecio- 60 rzedowej, takiej jak pirydyna, trójetyloamina i tym podobne.Lancuch peptydowy jest teraz przygotowany do reakcji z nastepnym aminokwasem. Mozna ja przeprowadzic róznymi znanymi metodami. Aby 65 uzyskac przylaczenie sie bezposrednio nastepuja-7 115 827 8 cego aminokwasu do N-konca lancucha peptydo- wego, stosuje sie aminokwas zawierajacy wolna grupe karboksylowa, o odpowiednio zabezpieczo¬ nej funkcji a-aminowej i kazdym innym aktyw¬ nym ugrupowaniu. Aminokwas poddaje sie reakcji prowadzacej do uaktywnienia funkcji karboksylo¬ wej, w celu przeprowadzenia reakcji sprzegania.Do tego rodzaju metod aktywacji, mozliwych do zastosowania w syntezie, nalezy przeksztalcenie aminokwasu w mieszany bezwodnik. W ten sposób wolna grupa karboksylowa aminokwasu ulega aktywacji na drodze reakcji z innym kwasem, zazwyczaj kwasem. weglowym w postaci chlorku kwasowego. Przykladami takich chlorków kwaso¬ wych, których mozna uzyc w celu wytworzenia odpowiednich mieszanych bezwodników sa chloro- mrówczan etylu, chloromrówczan fenylu, chloro- mrówczan Il-rzed.-butylu, chloromrówczan izobu- tylu, chlorek trójmetyloacetylu i temu podobne.Innym sposobem aktywowania funkcji karboksy¬ lowej aminokwasu w celu przeprowadzenia reakcji sprzegania jest przeksztalcenie aminokwasu w jego aktywna pochodna estrowa. Przykladami takich aktywnych estrów sa, na przyklad ester 2,4,5-trój- chlorofenylowy, ester pieciochlorofenylowy, ester p-nitrofenylowy, ester utworzony z 1-hydroksy- benzotriazolem oraz ester utworzony z N-hydroksy- bursztynimidem. Inna wydajna metoda przylacza¬ nia C-konca aminokwasu do fragmentu peptydu polega na przeprowadzeniu reakcji sprzegania w obecnosci co najmniej równomolowej ilosci N,N'- dwucykloheksylokarbodwuimidu (DCC). Te ostat¬ nia metode korzystnie stosuje sie w przypadku wytwarzania tetradekapeptydu, o wyzej podanym wzorze, w którym X oznacza grupe o wzorze 4.Po wytworzeniu zadanej sekwencji aminokwa¬ sów, otrzymany peptyd mozna usunac z zywicy stanowiacej nosnik. Przeprowadza sie to przez pod¬ danie zabezpieczonego, zwiazanego z nosnikiem tetradekapeptydu reakcji z fluorowodorem. Dzia¬ lanie to powoduje uwolnienie peptydu z zywicy.Jednakze zarazem uwalniaja sie pozostale grupy zabezpieczajace znajdujace sie przy aktywnych ugrupowaniach obecnych w lancuchu peptydo- wym, jak równiez grupa zabezpieczajaca grupe a-aminowa wystepujaca na N-koncu aminokwasu.W przypadku uzycia fluorowodoru do przepro¬ wadzenia odszczepienia peptydu od zywicy, a takze do usuniecia grup zabezpieczajacych, korzystnie reakcje prowadzi sie w obecnosci anizolu. Stwier¬ dzono, ze obecnosc anizolu hamuje mozliwe alkilo¬ wanie pewnych reszt aminokwasowych obecnych w lancuchu peptydowym. Poza tym, odszczepienie korzystnie prowadzi sie w obecnosci etanotiolu.Etanotiol sluzy do ochrony pierscienia indolowego reszty tryptofanu oraz ulatwia przeksztalcenie za¬ blokowanych reszt cysternowych w forme tiolowa.Takze w przypadku, gdy Rs oznacza grupe formy- lowa, obecnosc etanotiolu ulatwia odszczepienie grupy formylowej przez fluorowodór. Zwiazek uzyskany po zakonczeniu reakcji rozszczepiania stanowi peptyd o lancuchu prostym zlozony z 14 reszt aminokwasowych.Nastepujace przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku oraz sposób wytwarzania zwiazków wyjsciowych.Przyklad I. N-III-rzed.-butoksykarbonylo-L- -cysteinylo(S-p-metoksybenzylo)metylowana zywica 5 polistyrenowa.Do 500 ml N,N-dwumetyloformamidu (DMF) za¬ wierajacego sól cezowa N-III-rzed.-butyloksykar- bonylo-(S^p-metoksybenzylo)-cysteiny [wytworzo¬ na z 9,06 g (26,5 milimola) wolnego kwasu] dodano io 51,0 g chlorometylowanej zywicy polistyrenowej (Lab. Systems Inc., 0,75 milimola/gram). Miesza¬ nine mieszano w temperaturze pokojowej przez szesc dni. Nastepnie zywice odsaczono i przemyto kolejno trzy razy mieszanina 90°/o DMF i 10% wody, ii trzy razy 95% etanolem i trzy razy DMF.Do zywicy zawieszonej w 500 ml DMF dodano roztwór 10,5 g octanu cezowego. Mieszanine mie¬ szano przez szesc dni w temperaturze pokojowej.Nastepnie zywice odsaczono i przemyto kolejno 20 jeden raz wodnym DMF, trzy razy mieszanina 90% DMF i 10% wody, trzy razy 95% etanolem, trzy razy chlorkiem metylenu, trzy razy 95% etanolem i trzy razy chloroformem. Drobne czastki usunieto zawieszajac czterokrotnie zywice w chloroformie, 25 za kazdym razem zlewajac plyn. Nastepnie zywice wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem w tempe¬ raturze 40°C przez noc, otrzymujac 44,8 g tytulo¬ wego zwiazku. Analiza aminokwasów wykazala zawartosc 0,25 milimola Cys na gram zywicy. 30 Cysteine oznaczono jako kwas cysteinowy po hyd¬ rolizie kwasowej wykonanej przy uzyciu miesza¬ niny 1 : 1 dioksanu i stezonego kwasu solnego, do której dodano niewielka ilosc dwumetylosulfotlen- ku. u Przyklad II. N-III-rzed.-butoksykarbonylo- -D-waliloglicylo-L- (S-p-metoksybenzylo)cysteinylo- -L-(Ne-o-chlorobenzyloksykarbonylo) - lizylo - L - as- paraginylo-L-fenyloalanylo-L-fenyloalanylo-L- (for- mylo)tryptofilo-L-Ne-o-chlorobenzyloksykarbonylo)- 40 lizylo-L-(0-benzylo)treonylo-L-fenyloalanylo - L-(0- -benzylo)-treonylo-L-(0-benzylo)-seryk - L-S-p-me- toksybenzylo)cysteinylometylowana zywica polisty¬ renowa. 7,0 grama zwiazku z przykladu I umieszczono 45 w naczyniu reakcyjnym automatycznego syntety- zera peptydów Beckman 990, po czym dodano dwanascie sposród pozostalych trzynastu amino¬ kwasów poslugujac sie automatycznym syntety- zerem. Otrzymany zabezpieczony trójdekapeptyd 50 na zywicy podzielono na dwie równe czesci i do jednej z nich wprowadzono koncowy rodnik.Zastosowane aminokwasy i ich kolejnosc jest nastepujaca: (1) N-III-rzed.-butoksykarbonylo-(0- -benzylo)-L-seryna; (2) N-III-rzed.-butoksykarbo- 55 nylo-(0-benzylo)-L-treonina; (.3) N-III-rzed.-butok- sykarbonylo-L-fenyloalanina; (4) N-III-rzed.-bu- toksykarbonylo-(0-benzylo)-L-treonina; (5) Na-III- -rzed. - butoksykarbonylo - N8 - o - chlorobenzyloksy- karbonylo-L-lizyna; (6) Na-III-rzed.-butoksykarbo- 60 nylo-(N-formylo)-L-tryptofan; (7) N-III-rzed.-bu- toksykarbonylo-L-fenyloalanina; (8) N-III-rzed.- -butoksykarbonylo-L-fenyloalanina; (9) N-III-rzed.- -butoksykarbonylo-L-asparagina, ester p-nitrofe¬ nylowy; (10) Na-III-rzed.-butoksykarbonylo-Ne-o- w -chlorobenzyloksykarbonylo-L-lizyna; (11) N-III-9 115 827 10 -rzed.- butoksykarbonylo -(S-p - metoksybenzylo)-L- -cysteina; (12) N-III-rzeJ.-butoksykarbonylo-glicy- na i (Ib) N-in-rzed.-butoksykarbon4,lo-D-walma.Kolejnosc odszczepiania grup zabezpieczajacych, zobojetnienia, sprzegania i ponownego sprzegani a przy wprowadzania kazdego aminokwasu do pep- tydu jest nastepujaca: ('.) trzy przemycia chloro¬ formem (10 ml/gram zywicy) .za kazdym razem po trzy minuty; (2) usuniecie grupy BOC przez dzia¬ lanie dwa razy, za kazdym razem przez dwa¬ dziescia minut, 10 ml/gram zywicy, mieszaniny 29% kwasu trójfluorooctowego, 48% chloroformu, 6% trójetylosilanu i 17% chlorku metylenu; (3) dwa przemycia chloroformem (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem po trzy minuty; (4) jedno przemycie chlorkiem metylenu (10 ml/gram zywicy) przez trzy minuty; (5) trzy przemycia mieszanina 90% alohcl.: U-rzed.-butylowego i 10% alkoholu Iil- -rzed.-amylowego (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem po trzy minuty; (6) trzy przemycia chlor¬ kiem metylenu (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem po trzy minuty; (7) zobojetnienie za pomoca podzialania trzy razy, za kazdym razem po trzy minuty, 3% roztworem trójetyloaminy w chlorku metylenu, po 10 ml/gram zywicy; (8) trzy prze¬ mycia chlorkiem metylenu (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (9) trzy prze¬ mycia mieszanina 90% alkoholu Ill-rzed.-butylo- wego i 10% alkoholu Ill-rzed.-amylowego (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (10) trzy przemycia chlorkiem metylenu (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (11) dodanie zabezpieczonego aminokwasu w ilosci 1,0 milimola/gram zywicy i N,N'-dwucyk- loheksylokarbodwuimidu (DCC) w ilosci 1,0 mili¬ mola/gram zywicy, w chlorku metylenu uzytym w ilosci 10 ml/gram zywicy, a nastepnie mieszanie w ciagu 120 minut; (12) trzy przemycia chlorkiem metylenu (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (13) trzy przemycia mieszanina 90% alkoholu Ill-rzed.-butylowego i 10% alkoholu Ill-rzed.-amylowego (10 ml/gram zywicy) za kaz¬ dym razem przez trzy minuty; (14) trzy przemycia chlorkiem metylenu (10 ml/gram zywicy) za kaz¬ dym razem przez trzy minuty; (15) zobojetnienie za pomoca podzialania trzy razy, za kazdym razem przez trzy minuty, 3% roztworem trójetyloaminy w chlorku metylenu, po 10 ml/gram zywicy; (16) trzy przemycia chlorkiem metylenu (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (17) trzy przemycia mieszanina 90% alkoholu III-rzed.- -butylowego i 10% alkoholu Ill-rzed.-amylowego (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (18) trzy przemycia chlorkiem metylenu (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (19) trzy przemycia DMF (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem po trzy minuty; (20) do¬ danie zabezpieczonego aminokwasu w ilosci 1,0 mi¬ limola/gram zywicy i N,N'-dwucykloheksylokarbo- dwuimidu (DCC) w ilosci 1,0 milimola/gram zywicy, w mieszaninie 1:1 DMF i chlorku metylenu uzytej w ilosci 10 ml/gram zywicy, a nastepnie mieszanie w ciapu 120 minut; (21) trzy przemycia DMF (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (22) trzy przemycia chlorkiem metylenu (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (2C) trzy przemycia mieszanina 90% alko¬ holu Ill-rzed.-butylowego i 10% alkoholu III-rzed- -^mylowego (10 rr.l/gram zywicy) za kazdym razem 5 przez trzy minuty; (24) trzy przemycia chlorkiem metylenu (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (25) zobojetnienie za pomoca podzialania trzy razy, za kazdym razem przez trzy minuty, o% roztworem trójetyloaminy w chlorku io metylenu, po 10 ml/gram zywicy; (26) trzy prze¬ mycia chlorkiem metylenu (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (27) trzy prze¬ mycia mieszanina 90% alkoholu Ill-rzed.-butylo- wego i 10% alkoholu Ill-rzed.-amylowego (10 15 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy mi¬ nuty; (28) trzy przemycia chlorkiem metylenu (0 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty.Powyzsza kolejnosc postepowania przyjeto przy 20 dodawaniu kazcego z aminokwasów z wyjatkiem reszty glicyny i reszty asparaginy. Dodawanie resz¬ ty glicyny obejmuje tylko etapy 1—18. Reszte aspa¬ raginy wlaczo :o przez jej aktywny ester p-nitrofe- nylowy. W takim wykonaniu powyzszy etap (11) zi zostal zmodyfikowany do nastepujacej 3-stopnio- wej sekwencji: (a) trzy przemycia DMF (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty; (b) do¬ danie estru p-nitrofenylowego N-III-rzed.-butylo- ksykarbonylo-L-asparaginy w ilosci 1,0 mili- 30 mola/gram zywicy, w * mieszaninie 1 :3 DMF i chlorku metylenu uzytej w ilosci 10 ml/gram zywicy, a nastepnie mieszanie w ciagu 720 minut; i (c) trzy przemycia DMF (10 ml/gram zywicy) za kazdym razem przez trzy minuty. Takze etap (20) 25 zostal zmodyfikowany w ten sposób, ze stosowano ester p-nitrofenylowy N-III-rzed.-butoksykarbo- nylo-L-asparaginy w mieszaninie 3:1 DMF i chlor¬ ku metylenu, a nastepnie mieszano w ciagu 720 minut. 40 Koncowy zwiazek peptydu z zywica wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem. Czesc produktu poddano hydrolizie za pomoca ogrzewania pod chlodnica zwrotna w ciagu 72 godzin w miesza¬ ninie kwasu solnego i dioksanu. Analiza amino- 45 kwasów otrzymanego zwiazku dala nastepujace wyniki, przy uzyciu lizyny jako standardu: Asn 1,04; 2 Thr 2,68; Ser 1,08; Val 1,12; Gly 1,04; 3 Phe 2,87; 2 Lys 2,00; Trp 0,75.Tryptofan oznaczono za pomoca 21-godzinnej N hydrolizy próbki produktu w obecnosci dwumety- losulfotlenku i kwasu tioglikolowego. Cysteiny nie oznaczono, poniewaz ulegla ona rozkladowi powo¬ dowanemu przez sama metode badania.Przyklad III. D-walilo-glicylo-L-cysteinylo- 55 -L-lizylo-L-asparaginylo-L-fenyloalanylo-L- fenylo- alanylo-L-tryptofilo-L-lizylo-L-treonylo - L- fenylo- alanylo-L-treonylo-L-serylo-L-cysteina.Do mieszaniny 5 ml anizolu i 5 ml etanotiolu do¬ dano 2,828 grama (przy poziomie podstawiania m 0,150 milimola/gram) ochronionego tetradekapep- tydu zywicy z przykladu II. Mieszanine oziebiono w cieklym azocie, po czym dodano 56 ml cieklego fluorowodoru za pomoca destylacji. Otrzymana mieszanine pozostawiono w celu ogrzania sie do 65 temperatury 0°C, po czym mieszano w ciagu 2 go-11 115 827 12 dzin. Nastepnie usunieto fluorowodór za pomoca destylacji i do poozstalej mieszaniny dodano eter.Mieszanine oziebiono do temperatury 0°C i utwo¬ rzony osad zebrano za pomoca odsaczenia i prze¬ myto eterem.Produkt wysuszono i wyekstrahowano z zywicy zabezpieczony tetradekapeptyd przy uzyciu 1M kwasu octowego i niewielkiej ilosci kwasu octo¬ wego lodowatego. Natychmiast po tym roztwór w kwasie octowym zliofilizowano do sucha bez dostepu swiatla. Otrzymana stala pozostalosc o barwie bialej zawieszono w mieszaninie 10 ml odgazowanego 0,2 M kwasu octowego i 4 ml kwasu octowego lodowatego. Otrzymana "zawiesine ogrza¬ no, jednakze osad nie rozpuscil sie calkowicie.Czesc nierozpuszczalna odsaczono, a nieprzezro¬ czysty, bezbarwny przesacz naniesiono na kolumne zawierajaca Sephadex G-25 F. Warunki chroma¬ tografii byly nastepujace: rozpuszczalnik: odgazo- wany 0,2 M kwas octowy; wymiary kolumny, 7,5X150 cm; temperatura, 26°C; szybkosc przeply¬ wu, 629 ml/godzine; objetosc frakcji, 22,0 ml.Wykres przedstawiajacy wielkosc absorbancji przy 280 m// w zaleznosci od kolejnych frakcji wykazywal jeden duzy pik a po nim przegiecie. 10 15 25 Badania spektroskopowe UV potwierdzily, ze glów¬ ny pik odpowiada wlasciwemu produktowi. Pola¬ czono nastepujace frakcje, którym odpowiadaly ponizsze objetosci wycieku: frakcje 224—240 (4906—5280 ml, pik =5054 ml)..Zebrane frakcje nie obejmowaly nastepujacego po nich przegiecia krzywej. Badania spektroskopo¬ we UV wykazaly obecnosc 175 mg produktu (wy¬ dajnosc = 24,8%). Miareczkowanie próbki metoda Ellmana wykazalo zawartosc wolnej grupy tiolo- wej = 93,6% w stosunku do teoretycznej.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego tetradekapeptydu o wzorze 1, znamienny tym, ze zwiazek o wzorze 2, w którym R oznacza grupe zabezpieczajaca grupe a-aminowa, Ri oznacza grupe zabezpieczajaca grupe tiolowa, R2 oznacza grupe zabezpieczajaca grupe e-aminowa, kazdy R3 i R4 oznacza grupe zabezpieczajaca grupe hydroksylowa, R5 oznacza atom wodoru lub grupe formylowa a X oznacza ugrupowanie o wzorze 4, w którym okreslenie zywica oznacza polistyren, poddaje sie reakcji z mocnym kwasem. ' 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako mocny kwas stosuje sie fluorowodór.H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys L- Trp-L-Phe-L-Phe-L-Asn 1 L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr I HO-L-Cys-L-Ser Wzór 1 R-D-Val- ay-L-CysCR^-L-Lys (Rfc) L-Trp L- L^(Ra)-L-Thr(R3)-L-r^e-L-Thr(R3) X-L-Cys(Ri)-L-SerCR4) Wzór2 ^, L-Ala-Qy - L-Cys- L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp- 1 = 1 - L- Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L- Cys -OH -0-CH. :<¥ \nzor $ zywca ¦&" Wzór 4 OZGraf. Z.P. Dz-wo, z. 437 (90+15) 1.83 Ctna IM zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL