CH634039A5 - Somatostatinanalogon, sowie verfahren zu seiner herstellung. - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist das therapeutisch aktive Somatostatinanalogon der Formel

H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (I)

und seine pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze sowie das Verfahren zu seiner Herstellung. Die neue Verbindung der Formel I ist ein Tetradecapeptid.

Somatostatin, das auch als die Somatotropinfreisetzung inhibierender Faktor bekannt ist, ist ein Tetradecapeptid der Formel

L-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH.

Dieses Tetradecapeptid wurde aus Schafhypothal-amusextrakten isoliert, und seine Wirkung ist die einer Inhibierung der Sekretion von Wachstumshormon (GH), das auch als Somatotropin bekannt ist, vergleiche P. Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N. Ling, M. Butcher, J. Rivier, und R. Guillemin, Science, Bd. 179, S. 77 (1973).

Ausserdem finden sich in US-PS 3 904 594 natürliches Somatostatin und eine allgemeine Klasse von anderen Verbindungen mit der Dodecapeptidsequenz der Positionen 3 bis 14 des natürlichen Hormons.

Ausserdem ist über die der Einfachheit halber als D-Ala^Somatostatin bezeichnete Verbindungen von Ferland et al. in Molecular and Cellular Endocrinology, Bd. 4, S. 79-88 (1976) berichtet worden. D-Ala1-Somatostatin, strukturell ein Stereoisomeres von natürlichem L-Ala1-Somatostatin, ist bei der in-vivo-Inhibierung der Magensäuresekretion nur halb so wirksam wie natürliches Somatostatin. Die erfindungsgemässe Verbindung D-VaP-Somato-statin unterscheidet sich von D-Ala1-Somatostatin durch den Ersatz von zwei Wasserstoffen durch Methylgruppen. Wenn man hinsichtlich der pharmakologischen Wirksamkeit von D-VaP-Somatostatin überhaupt eine Erwartung anstellen könnte, dann würde man annehmen, dass seine Wirksamkeit der von D-Ala1-Somatostatin ähnlich ist; es würde somit als in-vivo-Inhibitor der Magensäuresekretion weniger s wirksam sein als das natürliche Hormon. Überraschenderweise zeigt D-VaP-Somatostatin jedoch eine Wirksamkeit, die etwas grösser ist als die des natürlichen Hormons. Dieser Befund zeigt die Unvorhersehbarkeit des Verhaltens von D-Val1 -Somatostatin im Vergleich mit strukturell nahestehen-lo den bekannten Verbindungen.

Die Struktur der biologisch aktiven Verbindung der Formel I unterscheidet sich von der von Somatostatin durch die Gegenwart eines D-Valinrestes in Position 1 anstelle eines L-Alaninrestes. Der Einfachheit halber wird die Verbindung 15 der Formel I als D-VaP-Somatostatin bezeichnet.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen der Formel I ist dadurch gekennzeich- -net, dass man ein entsprechendes geradkettiges Tetradecapeptid der Formel:

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H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (III)

mit einem Oxidationsmittel umsetzt. Erhaltene Verbindun-25 gen der Formel I können in pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze überführt werden.

Die im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Verbindungen der Formel III sind neue Verbindungen. Sie können aus den Verbindungen der nachfolgenden Formel II, die 30 ebenfalls neu sind, hergestellt werden.

Verbindungen der Formel II:

R-D-Val-Gly-L-Cys(R1)-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp(R5)-L-

35 Lys(R2)-L-Thr(R3)-L-Phe-L-Thr(R3)-L-Ser(R4)-L-Cys(R1)-X

In den Verbindungen der Formel II haben die Sub-stituenten die folgende Bedeutung:

40 R ist Wasserstoff oder eine alpha-Aminoschutzgruppe, Rj bedeutet Wasserstoff oder eine Thioschutzgruppe, R2 ist Wasserstoff oder eine epsilon-Aminoschutzgrup-

pe,

R3 und R4 ist Wasserstoff oder Hydroxylschutzgruppen, 45 Rs bedeutet Wasserstoff oder eine Formylgruppe und X ist eine Hydroxylgruppe oder die Gruppe

Harz r. /=X'

* \ / '

e o worin Harz für Polystyrol steht,

wobei R, Rx, R2, R3, R4 und Rs Wasserstoff bedeuten, 55 wenn X eine Hydroxylgruppe ist, und R, R1; R2, R3 und R4 eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben, wenn X für die Gruppe

«==«^/Hcrz

6° _P_pl! —y \, * > /

steht.

Das neue Tetradecapeptid der Formel I wird erfindungs-65 gemäss durch Umsetzung des entsprechenden geradkettigen Tetradecapeptids der Formel III, H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH, mit einem Oxidationsmittel hergestellt.

Durch diese Umsetzung werden die zwei Sulfhydrylgruppen in eine Disulfidbrücke übergeführt.

Zu pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Säureadditionssalzen gehören die Salze mit organischen und anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Sulfon-säure, Weinsäure, Fumarsäure, Bromwasserstoffsäure, Gly-kolsäure, Citronensäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Benzoesäure, Ascorbinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure und Propionsäure. Die Säureadditionssalze sind vorzugsweise solche, die mit Essigsäure erhalten werden. Die oben erwähnten Salze können alle in an sich bekannter Weise hergestellt werden.

Zu einer bevorzugten Verbindung der Formel II gehört die folgende Verbindung:

N-(BOC)-D-Val-Gly-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC)-

Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-(For)Trp-L-(CBzOC)-

Lys-L-(Bzl)Thr-L-Phe-L-(Bzl)Thr-L-

(Bzl)Ser-L-(PMB)Cys-0-CH2- • ^

Die Verbindungen der Formel II enthalten Schutzgruppen für Amino-, Hydroxy- und Thio-(sulfhydryl-)-funk-tionen. Die Merkmale der hier definierten Schutzgruppen sind doppelte: zum einen verhindert die Schutzgruppe, dass eine reaktionsfähige Gruppe, die in einem bestimmten Molekül vorliegt, eine Umsetzung eingeht, während das Molekül Bedingungen unterworfen wird, die zu einer Veränderung oder Zerstörung der andernfalls aktiven Gruppe führen könnten. Zum anderen ist die Schutzgruppe gewöhnlich so beschaffen, dass sie sich ohne weiteres unter Wiederherstellung der ursprünglich aktiven Gruppe unter Bedingungen entfernen lässt, die andere Teile des Moleküls nicht in Mitleidenschaft ziehen. Für diese Zwecke, d.h. für den Schutz von Amino-, Hydroxy- und Thiogruppen, insbesondere brauchbare Gruppen sind allgemein bekannt und jedem Fachmann geläufig. Der ausführlichen Beschreibung von Verfahren, wie solche Gruppen zu verwenden sind, sind voluminöse Werke gewidmet worden. Eines davon ist Protec-tive Groups in Organic Chemistry, J.F.W. McOmie, Herausgeber, Plenum Press, New York, 1973.

In den obigen Verbindungen der Formel II bedeutet R ein alpha-Aminowasserstoffatom oder eine alpha-Amino-schutzgruppe. Die für R in Betracht kommenden bevorzugten alpha-Aminoschutzgruppen sind dem Peptidchemiker geläufig. Viele davon sind in Kapitel 2 der oben angegebenen Literaturstelle im einzelnen angegeben. Beispiele für solche Schutzgruppen sind Benzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxy-carbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxy-carbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyl-oxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyl-oxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, t-Butyloxy-carbonyl (BOC), t-Amyloxycarbonyl, 2-(p-Biphenylyl)-iso-propyloxycarbonyl (BpO), Adamantyloxycarbonyl, Iso-propyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Cyclohexyl-oxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl, Triphenylmethyl (Trityl) und p-Toluolsulfonyl. Die durch R definierte alpha-Aminoschutzgruppe ist vorzugsweise t-Butyloxycarbonyl.

R1 bedeutet das Wasserstoffatom der Sulfhydrylgruppe des Cysteins oder eine Schutzgruppe für diese Sulfhydrylgruppe. Viele solcher Schutzgruppen sind in der oben angegebenen Literaturstelle in Kapitel 7 beschrieben. Beispiele für solche Schutzgruppen sind p-Methoxybenzyl, Benzyl, p-Toluyl, Benzhydryl, Acetamidomethyl, Trityl, p-Nitro-benzyl, t-Butyl, Isobutyloxymethyl sowie die verschiedenen Tritylderivate. Bezüglich weiterer Gruppen vergleiche bei634 039

spielsweise Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, «Synthese von Peptiden», Bd. 15/1 und 15/2, (1974), Stuttgart. Die durch Rj definierte Sulfhydrylschutzgruppe ist vorzugsweise die p-Methoxybenzylgruppe.

R2 bedeutet entweder ein Wasserstoffatom an der ep-silon-Aminogruppe des Lysinrestes oder eine epsilon-Aminoschutzgruppe. Beispielhaft für solche Gruppen sind die oben in Verbindung mit der alpha-Aminoschutzgruppe genannten. Hierzu gehören vor allem die folgenden Gruppen: Benzyloxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl, t-Amyloxy-carbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Iso-propyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl und p-Toluolsulfonyl.

Zur bevorzugten Herstellung der im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Verbindungen der Formel III spaltet man die a-Aminoschutzgruppe der jeweiligen Aminosäure der Peptidkette ab. Die einzige Bedingung, die die epsilon-Aminoschutzgruppe an dem Lysinrest erfüllen sollte, ist daher die, dass sie unter den Bedingungen, die zur selektiven Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe angewandt werden, nicht abgespalten wird. Die geeignete Wahl der alpha-Amino- und epsilon-Aminoschutzgruppen ist auf dem Gebiet der Peptidchemie allgemein bekannt und hängt von der relativen Leichtigkeit ab, mit der eine bestimmte Schutzgruppe abgespalten werden kann. So sind Gruppen, wie 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl (BpOC) und Trityl sehr labil und können schon in Gegenwart einer schwachen Säure abgespalten werden. Für die Abspaltung anderer Gruppen, zum Beispiel von t-Butyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyl-oxycarbonyl, sind in der Regel mässig starke Säuren, wie Salzsäure, Trifiuoressigsäure oder Bortrifluorid in Essigsäure erforderlich. Noch stärker saure Bedingungen sollten in der Regel angewandt werden, um die Abspaltung anderer Schutzgruppen, wie Benzyloxycarbonyl, Halogenbenzyloxy-carbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Cycloalkyloxycarbo-nyl und Isopropyloxycarbonyl, zu bewirken. Die Abspaltung dieser letztgenannten Gruppen erfordert im allgemeinen drastisch saure Bindungen, zum Beispiel die Verwendung von Bromwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure oder Bortrifluoracetat in Trifiuoressigsäure. Unter den stärker sauren Bedingungen werden selbstverständlich alle labileren Gruppen gleichfalls abgespalten. Zu der besonders geeigneten Auswahl von Aminoschutzgruppen gehört somit die Verwendung einer Gruppe für die alpha-Aminofunktion, die labiler ist als die Gruppe, die als epsilon-Aminoschutzgruppe verwendet wird, wenn Spaltungsbedingungen angewandt werden, die zur selektiven Entfernung allein der alpha-Aminoschutzgruppe führen. In diesem Zusammenhang ist R2 vorzugsweise die o-Chlorbenzyloxycarbonyl- oder Cyclo-pentyloxycarbonylgruppe, und in Verbindungen damit ist die alpha-Aminoschutzgruppe der Wahl jeder an die Peptidkette angereihten Aminosäure, vorzugsweise die t-Butyl-oxycarbonylgruppe.

R3 und R4 bedeuten den Wasserstoff der Hydroxylgruppe oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Threonin und Serin. Viele derartige Schutzgruppen sind in Kapitel 3 der oben genannten Literaturstelle beschrieben. Einzelne Beispiele für solche Schutzgruppen sind Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; wie die Methyl-, Ethyl- und t-Butylgruppe, die Benzylgruppe, substituierte Benzylgruppen, wie p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, p-Chlorbenzyl und o-Chlorbenzyl, Alkanolylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, wie die Formyl-, Acetyl- und

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Propionylgruppe sowie die Triphenylmethyl(trityl-)gruppe. Wenn R3 und R4 Schutzgruppen darstellen, dann sind sie vorzugsweise Benzylgruppen.

Rs bedeutet Wasserstoff oder die Formylgruppe und befindet sich in der >NR5-Gruppe des Tryptophanrests. Die Formylgruppe dient als Schutzgruppe. Die Verwendung einer solchen Schutzgruppe ist nicht unbedingt erforderlich, weshalb Rs Wasserstoff (N-ungeschützt) oder die Formylgruppe (N-geschützt) sein kann.

Die Gruppe X steht am Carboxylende der Tetradecapep-tidkette. Sie kann eine Hydroxylgruppe sein, womit sich dann eine freie Carboxylgruppe ergibt. Ausserdem kantì X der feste Harzträger sein, an den die terminale Carboxylgruppe des Peptids während seiner Synthese gebunden ist. Dieses feste Harz ist durch die Formel wiedergegeben.

Immer dann, wenn X eine Hydroxylgruppe bedeutet,

sind R, Rl5 R2, R3, R4 und R5 Wasserstoffatome. Wenn dagegen X für den festen Harzträger steht, bedeuten die einzelnen Reste R, Rls R2, R3 und R4 Schutzgruppen.

Es werden die folgenden Abkürzungen, von denen die meisten allgemein bekannt sind und üblicherweise benutzt werden, verwendet:

Ala - Alanin Asn - Asparagin Cys - Cystein Gly - Glycin Lys - Lysin Phe - Phenylalanin Ser - Serin Thr - Threonin Trp - Tryptophan Val - Valin

DCC - N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid DMF - N,N-Dimethylformamid BOC - t-Butyloxycarbonyl PMB - p-Methoxybenzyl CBzOC - o-Chlorbenzyloxycarbonyl CPOC - Cyclopentyloxycarbonyl Bzl - Benzyl For - Formyl

BpOC - 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxyearbonyl

Wie bereits erwähnt, liegt die Auswahl der zu verwendenden Schutzgruppen bei der Herstellung von Verbindungen der Formel II, die zur Herstellung von Ausgangsverbindungen der Formel III, welche im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt werden, im Rahmen des allgemeinen Fachwissens auf dem Gebiet der Peptidsynthesen, doch ist zu beachten, dass die auszuführende Reihenfolge von Reaktionen in der Regel eine Wahl bestimmter Schutzgruppen bedingt. Mit anderen Worten, die Schutzgruppe der Wahl sollte eine Gruppe sein, die gegenüber den angewandten Reagenzien und unter den angewandten Bedingungen bei den nachfolgenden Stufen der Reaktionsfolge stabil ist. So sollte, wie bereits oben erwähnt, die im einzelnen verwendete Schutzgruppe eine Gruppe sein, die unter den Bedingungen intakt bleibt, die zur Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe des terminalen Aminosäurerestes des Peptidfragments zur Vorbereitung der Anknüpfung des nächstfolgenden Aminosäurefragments an die Peptidkette angewandt werden. Ausserdem kommt es insbesondere darauf an, als Schutzgruppe bevorzugt eine Gruppe zu wählen, die während des Aufbaus der Peptidkette intakt bleibt und die sich nach Beendigung der Synthese des gewünschten Tetradecapeptids leicht entfernen lässt. Mit all diesen Bedingungen ist der durchschnittliche Peptidchemiker wohlvertraut.

Wie sich aus der vorstehenden Diskussion ergibt, kann die Verbindung der Formel II durch Festphasensynthese hergestellt werden. Bei dieser Synthese kann die Peptidkette vom C-terminalen Ende des Peptids angefangen, stufenweise aufgebaut werden. So wird zum Beispiel zunächst Cystein mit seiner Carboxylfunktion in der Weise an das Harz gebunden, dass ein amino-geschütztes, S-geschütztes Cystein mit einem chlormethylierten Harz oder einem hydroxy-methylierten Harz umgesetzt wird. Die Herstellung eines Hydroxymethylharzes ist von Bodanszky et al., in Chem. Ind. (London), Bd. 38, S. 1597-1598 (1966) beschrieben. Das chlormethylierte Harz ist im Handel erhältlich (Lab Systems, Inc., San Mateo, California, V.St.A.).

Bei der Durchführung der Bindung des C-terminalen Cysteins an das Harz kann das geschützte Cystein zuerst in sein Cäsiumsalz übergeführt werden. Dieses Salz wird dann gewöhnlich nach dem von B.F. Gisin in Helv. Chim. Acta, Bd. 56, S. 1476 (1973) beschriebenen Verfahren mit dem Harz umgesetzt. Statt dessen kann das Cystein aber auch durch Aktivierung seiner Carboxylfunktion nach an sich bekannten Methoden mit dem Harz verknüpft werden. Beispielsweise kann die Umsetzung des Cysteins mit dem Harz in Gegenwart einer Carboxylgruppen aktivierenden Verbindung, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) durchgeführt werden.

Nach der bevorzugten Verknüpfung des Cysteins mit seiner freien Carboxylgruppe mit dem Harzträger besteht der übrige Teil der Peptidaufbaufolge in der Regel in der stufenweisen Anreihung der einzelnen Aminosäuren an den N-ter-minalen Teil der Peptidkette. Die jeweilige Stufe sollte daher notwendigerweise eine Abspaltung der alpha-Amino-schutzgruppe der Aminosäure, die den N-terminalen Teil des Peptidfragments darstellt, umfassen, und anschliessend kann die Anknüpfung des nächstfolgenden Aminosäurerests an die nunmehr freie und reaktionsfähige N-terminale Aminosäure erfolgen. Die Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe kann in Gegenwart einer Säure, zum Beispiel Bromwasserstoffsäure, Chlorwasserstoffsäure, Trifiuoressigsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalin-sulfonsäure und Essigsäure unter Bildung des entsprechenden Säureadditionssalzes als Produkt erfolgen. Bei einer anderen bevorzugten Methode zur Abspaltung der Amino-schutzgruppe wird zum Beispiel Bortrifluorid verwendet. Beispielsweise wird durch Bortrifiuoriddiethyletherat in Eisessig das Peptidfragment mit geschützter Aminogruppe in einen BF3-Komplex übergeführt, der dann durch Behandlung mit einer Base, wie wässrigem Kaliumbicarbonat, in das entblockierte Peptidfragment übergeführt werden kann. Jede dieser Methoden kann angewandt werden, solange darauf geachtet wird, dass die im Einzelfall gewählte zu einer Abspaltung der N-terminalen alpha-Aminoschutzgruppe führt, ohne andere an der Peptidkette vorhandene Schutzgruppen in Mitleidenschaft zu ziehen. In dieser Hinsicht ist es bevorzugt, die Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe unter Verwendung von Trifiuoressigsäure durchzuführen. Im allgemeinen wird die Spaltung bei einer Temperatur von etwa 0 °C bis Zimmertemperatur durchgeführt.

Nach der N-terminalen Spaltung hegt das gebildete Produkt normalerweise in Form des Säureadditionssalzes der Säure vor, die für die Abspaltung der Schutzgruppe verwendet worden ist. Dieses Produkt kann dann durch Behandlung mit einer schwachen Base, zum Beispiel einem tertiären Amin, wie Pyridin oder Triethylamin, in die freie terminale Aminoverbindung übergeführt werden.

Die Peptidkette liegt nun in einem für die Umsetzung mit

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der nächstfolgenden Aminosäure bereiten Zustand vor. Diese Umsetzung kann nach einer von mehreren allgemein bekannten Arbeitsweisen durchgeführt werden. Für die Anreihung der nächstfolgenden Aminosäure an die N-terminale Peptidkette wird bevorzugt eine Aminosäure verwendet, die eine freie Carboxylgruppe aufweist, aber an der alpha-Ami-nofunktion sowie an jeder anderen reaktionsfähigen Gruppe geschützt ist. Die Aminosäure wird dann gewöhnlich Bedingungen unterworfen, die die Carboxylfunktion für die Verknüpfungsreaktion aktiv machen. Eine bei dieser Synthese bevorzugt anwendbare Aktivierungsmethode ist die Überführung der Aminosäure in ein gemischtes Anhydrid. Dabei wird zum Beispiel die freie Carboxylfunktion der Aminosäure durch Umsetzung mit einer anderen Säure, beispielsweise einer Carbonsäure in Form ihres Säurechlorids, aktiviert. Beispiele für zur Ausbildung des gemischten Anhydrids verwendbare Säureehloride sind Chlorameisensäureethyl-, -phenyl-, -sec.-butyl- und -isobutylester und Pivaloylchlorid.

Eine andere bevorzugte Methode zur Aktivierung der Carboxylfunktion der Aminosäure für die Verknüpfung besteht in der Überführung der Aminosäure in ein aktives Esterderivat. Beispiele für derartige aktive Ester sind: 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, p-Nitro-phenylester, Ester mit 1-Hydroxybenztriazol und Ester mit N-Hydroxysuccinimid. Eine weitere bevorzugte Methode zur Verknüpfung der C-terminalen Aminosäure mit dem Peptidfragment besteht in der Durchführung der Verknüpfungsreaktion in Gegenwart wenigstens einer äquimolaren Mengen N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Die letztgenannte Methode ist vor allem für die Herstellung des Tetra-decapeptids der Formel II, worin X die Gruppe

2 \ /-o=e bedeutet, bevorzugt.

Nach dem Aufbau der gewünschten Aminosäuresequenz kann das gebildete Peptid von dem Harzträger abgelöst werden. Dies wird in der Regel durch Behandlung des geschützten Tetradecapeptids auf dem Harzträger mit Fluorwasserstoff erreicht. Durch die Behandlung mit Fluorwasserstoff kann das Peptid von dem Harz abgelöst werden, wobei jedoch auch alle vorhandenen Schutzgruppen der reaktionsfähigen Gruppen der Peptidkette sowie die alpha-Aminoschutzgruppe der N-terminalen Aminosäure abgespalten werden. Bei bevorzugter Verwendung von Fluorwasserstoff zur Ablösung des Peptids von dem Harz und zur Entfernung der Schutzgruppen wird die Umsetzung vorzugsweise in Gegenwart von Anisol durchgeführt. Es hat sich gezeigt, dass durch die Gegenwart von Anisol die mögliche Alkylierung bestimmter in der Peptidkette vorliegender Aminosäurereste verhindert wird. Ausserdem ist es bevorzugt, die Spaltung in Gegenwart von Ethylmercaptan durchzuführen. Durch das Ethylmercaptan kann der Indolring des Tryptophanrestes geschützt werden und ausserdem wird gewöhnlich die Überführung der geschützten Cysteine in ihre Thiolform gefördert. Ausserdem begünstigt die Gegenwart von Ethylmercaptan, wenn R5 eine Formylgruppe bedeutet, die Abspaltung dieser Formylgruppe durch Fluorwasserstoff.

Nach der Spaltungsreaktion wird als Produkt ein geradkettiges Peptid mit 14 Aminosäureresten erhalten. Zur Erzielung des Endprodukts der Formel I muss das geradkettige Tetradecapeptid erfindungsgemäss Bedingungen unterworfen werden, die zu seiner Oxidation unter Umwandlung der beiden Sulfhydrylgruppen an den beiden Cysteinylresten des Moleküls in eine Disulfidbrücke führen. Dies kann durch Behandlung einer verdünnten Lösung des linearen Tetra-

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decapeptids mit den verschiedensten Oxidationsmitteln, beispielsweise Jod und Kaliumferricyanid, bewirkt werden.

Auch Luft kann als Oxidationsmittel verwendet werden, wobei der pH-Wert der Mischung im allgemeinen zwischen etwa 2,5 und 9,0, vorzugsweise 7,0 und 7,6, liegt. Bei der bevorzugten Verwendung von Luft als Oxidationsmittel soll die Konzentration der Peptidlösung im allgemeinen nicht höher als 0,4 mg Peptid/ml Lösung sein und vorzugsweise etwa 50 ng/ml betragen.

Die Verbindung der Formel I kann an warmblütige Säuger, einschliesslich Menschen, auf verschiedenste Weise, zum Beispiel oral, sublingual, subkutan, intramuskulär und intravenös, verabreicht werden. Die Verabreichung dieser Verbindung inhibiert die Freisetzung von Wachstumshormon. Diese inhibitorische Wirkung ist in den Fällen von Vorteil, in denen das behandelte Lebewesen wegen einer übermässigen Sekretion von Somatotropin einer therapeutischen Behandlung bedarf; eine derartige Sekretion ist mit krankhaften Zuständen, zum Beispiel juvenilem Diabetes und Acromegalie, verbunden. Die Verbindung zeigt auch noch andere physiologische Wirkungen, zum Beispiel eine Inhibierung der Magensäuresekretion, was für die Behandlung von Geschwüren nützlich ist, eine inhibierende Wirkung auf die exokrine Pankresassekretion, was zur Behandlung von Pankreatitis herangezogen werden kann, eine Inhibierung der Sekretion von Insulin und Glucagon und eine Verminderung der Darmmotilität, was bei der Gastrointestinal-radiologie von Nutzen ist. Der Dosierungsbereich für die sublinguale oder orale Verabreichung liegt vorzugsweise bei etwa 1 bis 100 mg/kg Körpergewicht und Tag. Bei intravenöser, subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung liegt die Dosis im allgemeinen zwischen etwa 10 jxg und 1 mg/kg Körpergewicht und Tag und vorzugsweise zwischen etwa 50 und 100 ng/kg Körpergewicht und Tag. Es ist selbstverständlich, dass die Dosierung innerhalb eines weiten Bereichs schwankt, weil sie sich nach dem jeweils zu behandelnden Zustand und seinem Schweregrad richtet.

Die Verbindung der Formel I kann auch zusammen mit einem pharmazeutischen Träger in Form von Tabletten oder Kapseln verabreicht werden. Es können inerte Verdünnungsmittel oder Träger, zum Beispiel Magnesiumcarbonat oder Lactose, zusammen mit üblichen Zerfallsmitteln, wie Maisstärke und Alginsäure, und Gleitmitteln, wie Magne-siumstearat, eingesetzt werden. Die Menge des Trägers oder Verdünnungsmittels kann etwa 5 bis 95%, vorzugsweise etwa 50 bis 85%, des fertigen Präparats ausmachen. Auch Aromastoffe können verwendet werden, die das fertige Präparat für die Verabreichung geschmacklich verbessern. Für die intravenöse Verabreichung der Verbindung der Formel I können hierfür geeignete Träger verwendet werden, zum Beispiel isotone Kochsalzlösung oder Phosphatpufferlösung.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Präparat 1

N-t-Butyloxycarbonyl-(S-p-methoxybenzyl)-L-cysteinyl-methyliertes Polystyrolharz

Aus 500 ml N,N-Dimethylformamid (DMF), dem Cäsiumsalz von N-t-Butyloxycarbonyl-(S-p-methoxybenzyl)-cystein, hergestellt aus 9,06 g (26,5 mMol) der freien Säure, und 51,0 g chlormethyliertem Polystyrolharz (Lab Systems, Inc., 0,75 mMol Cl/g) wird eine Suspension hergestellt, die 6 Tage bei Zimmertemperatur gerührt wird. Dann wird das Harz abfiltriert und nacheinander dreimal mit einer Mischung aus 90% DMF und 10% Wasser, dreimal mit 95%igem Ethanol und dreimal mit DMF gewaschen. Zu einer Suspension des Harzes in 500 ml DMF wird eine Lösung von 10,5 g Cäsiumacetat gegeben. Die Mischung wird 6

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Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wird das Harz abfiltriert und nacheinander mit wässrigem DMF, dreimal mit einer Mischung aus 90% DMF und 10% Wasser, dreimal mit 95%igem Ethanol, dreimal mit Methylenchlorid, dreimal mit 95%igem Ethanol und dreimal mit Chloroform gewaschen. Die Feinteile werden durch viermaliges Suspendieren des Harzes in Chloroform, wobei die Flüssigkeit jedes Mal abgezogen wird, entfernt. Dann wird das Harz im Vakuum über Nacht bei 40 °C getrocknet, wodurch 44,8 g des in der Überschrift genannten Produkts erhalten werden.

Eine Aminosäureanalyse ergibt 0,25 mMol Cys/g Harz. Das Cystein wird als Cysteinsäure bestimmt, die bei einer Säurehydrolyse unter Verwendung einer Mischung von gleichen Teilen Dioxan und konzentrierter Salzsäure mit einem kleinen Zusatz von Dimethylsulfoxid gebildet wird.

Präparat 2

N-t-Butyloxycarbonyl-D-valyl-glycyl-L-(S-p-methoxy-benzyl)- cysteinyl-L-(Ne-o-chlorbenzyloxycarbonyl)-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-(formyl)-tryptophyl-L-(NE-o-chlorbenzyloxycarbonyl)-lysyl-L-(0-benzyl)-

threonyl-L-phenylalanyl-L-(0-benzyl)-threonyl-L-(0-ben-

zyl)-

seryl-L-(S-p-methoxybenzyl)-cysteinyl-methyliertes Polystyrolharz 7,0 g des nach Präparat 1 erhaltenen Produkts werden in das Reaktionsgefäss eines automatischen Peptid-synthetisiergeräts, Beckmann 990, eingebracht, und 12 der übrigen 13 Aminosäuren werden unter Verwendung dieses Geräts angefügt. Das so erhaltene geschützte Tridecapeptid-harz wird in zwei gleiche Teile aufgeteilt, und in einen der beiden Teile wird der abschliessende Rest eingeführt. Die verwendeten Aminosäuren und die Reihenfolge sind wie folgt:

1. N-t-Butyloxycarbonyl-(0-benzyl)-L-serin,

2. N-t-Butyloxycarbonyl-(G-benzyl)-L-threonin,

3. N-t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin,

4. N-t-Butyloxycarbonyl-(0-benzyl)-L-threonin,

5. nalpha-t-Butyloxycarbonyl-NepsiI°n-o-chlorbenzyloxycar-bonyl-L-lysin,

6. Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-(N-formyl)-L-tryptophan,

7. N-t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin,

8. N-t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin,

9. N-T-Butyloxycarbonyl-L-asparagin-p-nitrophenylester,

10. NaIpha-t-Butyloxycarbonyl-Nepsil<m-o-chlorbenzyloxy-carbonyl-L-lysin,

11. N-t-Butyloxycarbonyl-(S-p-methoxybenzyl)-L-cystein,

12. N-t-Butyloxycarbonyl-glycin und

13. N-t-Butyloxycarbonyl-D-valin. Schutzgruppenentfernung, Neutralisation, Anlagerung und erneute Anlagerung zur Einführung jeder einzelnen Aminosäure in das Peptid wird folgendermassen durchgeführt: 1. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Chloroform (10 ml/g Harz), 2. Entfernung der BOC-Gruppe durch zweimaliges Behandeln von je 20 Minuten mit 10 ml/g Harz einer Mischung aus 29% Trifiuoressigsäure, 48% Chloroform, 6% Triethylsilan und 17% Methylenchlorid, 3. zwei Wäschen von je 3 Minuten mit Chloroform (10 ml/g Harz), 4. eine Wäsche von 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), 5. drei Wäschen von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90% t-Butylalkohol und 10% t-Amylalkohol (10 ml/g Harz), 6. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), 7. Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 10 ml/g Harz 3%igem Triethyl-amin in Methylenchlorid, 8. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), 9. drei Wäschen von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90% t-Butylalkohol und

10% t-Amylalkohol (10 ml/g Harz), 10. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), 11. Zugabe von 1,0 mMol/g Harz der geschützten Aminosäure und 1,0 mMol/g Harz N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml/g Harz Methylenchlorid und anschliessendes Mischen während 120 Minuten, 12. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), 13. drei Wäschen von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90% t-Butylalkohol und 10% t-Amylalkohol (10 ml/g Harz), 14. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), 15. Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 10 ml/g Harz 3%igem Triethylamin in Methylenchlorid, 16. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), 17. drei Wäschen von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90% t-Butylalkohol und 10% t-Amylalkohol (10 ml/g Harz), 18. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), 19. drei Wäschen von je 3 Minuten mit DMF (10 ml/g Harz), 20. Zugabe von 1,0 mMol/g Harz N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml/g Harz einer Mischung aus gleichen Teilen DMF und Methylenchlorid und anschliessendes Mischen während 120 Minuten, 21. drei Wäschen von je 3 Minuten mit DMF (10 ml/g Harz), 22. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), 23. drei Wäschen von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90% t-Butylalkohol und 10% t-Amylalkohol (10 ml/g Harz), 24. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), 25. Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 10 ml/g Harz 3%igem Triethylamin in Methylenchlorid, 26. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz), 27. drei Wäschen von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90% t-Butylalkohol und 10% t-Amylalkohol (10 ml/g Harz) und 28. drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz).

Mit Ausnahme des Glycin- und Asparaginrests wird jede Aminosäure durch die vorstehend beschriebenen Folgen von Massnahmen eingeführt. Zur Anfügung des Glycinrestes werden nur die Stufen 1 bis 18 angewandt. Der Asparagin-rest wird über seinen aktiven p-Nitrophenylester eingeführt. Dabei wird die Stufe 11 folgendermassen modifiziert: (a) drei Wäschen von je 3 Minuten mit DMF (10 ml/g Harz), (b) Zugabe von 1,0 mMol/g Harz des p-Nitrophenylesters von N-t-Butyloxycarbonyl-L-asparagin in 10 ml/g Harz einer 1: 3-Mischung von DMF mit Methylenchlorid und anschliessendes Mischen während 720 Minuten und (c) drei Wäschen von je 3 Minuten mit DMF (10 ml/g Harz). Die Stufe (20) wird in der Weise abgeändert, dass der p-Nitrophenylester von N-t-Butyloxycarbonyl-L-asparagin in einer 3 :1-Mischung von DMF mit Methylenchlorid verwendet und anschliessend 720 Minuten gemischt wird.

Das fertige Peptid-Harz-Produkt wird im Vakuum getrocknet. Ein Teil des Produkts wird durch Erwärmen mit einer Mischung aus Salzsäure und Dioxan zum Sieden unter Rückfluss während 72 Stunden hydrolysiert. Die Aminosäureanalyse des Produkts unter Verwendung von Lysin als Standard ergibt folgende Werte: Asn 1,04,2Thr, 2,68; Ser, 1,08; Val, 1,12; Gly, 1,04; 3Phe, 3,87; 2Lys, 2,00, Trp 0,75.

Tryptophan wird durch 21 stündige Hydrolyse in Gegenwart von Dimethylsulfoxid und Thioglykolsäure ermittelt. Cystein wird nicht bestimmt, da es durch die Analysenmethode zerstört wird.

Präparat 3

D-Valyl-glycyl-L-cysteinyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenyl-alanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein

Zu einer Mischung aus 5 ml Anisol und 5 ml Ethylmercaptan werden 2,828 g (bei einem Substitutionswert von

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0,150 mMol/g) des nach Präparat 2 erhaltenen geschützten Tetradecapeptidharzes gegeben. Die Mischung wird in flüssigem Stickstoff gekühlt, und 56 ml flüssiger Fluorwasserstoff wird eindestilliert. Die so erhaltene Mischung wird sich auf 0 °C erwärmen gelassen und 2 Stunden gerührt. Dann wird der Fluorwasserstoff abdestilliert und Äther zu der hinterbleibenden Mischung gegeben. Die Mischung wird auf 0 °C abgekühlt, und der gebildete Feststoff wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das Produkt wird getrocknet, und das von Schutzgruppen befreite Tetradecapeptid wird unter Verwendung von Im Essigsäure und einer kleinen Menge Eisessig von dem Harz extrahiert. Die Essigsäurelösung wird dann sofort im Dunkeln gefriergetrocknet. Die so erhaltene weisse Substanz wird in einer Mischung aus 10 ml entgaster 0,2m Essigsäure und 4 ml Eisessig suspendiert. Die Suspension wird erwärmt, wobei der Feststoff jedoch nicht vollständig in Lösung geht. Der unlösliche Anteil wird abfiltriert, und das etwas getrübte farblose Filtrat wird auf eine Säule aus Sephadex G-25 F aufgebracht. Bedingungen der Chromatographie: Lösungsmittel, entgaste 0,2m Essigsäure, Säulengrösse 7,5 x 150 cm, Temperatur 26 °C, Strömungsgeschwindigkeit 629 ml/Stunde, Fraktionsvolumen 22,0 ml.

Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 mp. gegen die Nummern der Fraktion wird ein grosser Spitzenwertbereich mit einer anschliessenden Schulter erhalten. Die UV-Spektroskopie zeigt, dass der Spitzenwertbereich dem Produkt entspricht. Die Fraktionen, die vereinigt werden, und ihre Austrittsvolumina sind die folgenden:

Fraktionen 224 bis 240 (4906-5280 ml, Spitze =

5054 ml). Diese Vereinigung von Fraktionen umfasst nicht die anschliessende Schulter. Die UV-Spektroskopie zeigt,

dass 175 mg des Produkts vorliegen (Ausbeute = 24,8%). Eine Ellman-Titration einer Probe ergibt einen Gehalt an freiem Sulfhydryl von 93,6% der Theorie.

Beispiel

Oxidation zu D-Val1-Somatostatin

Die nach Präparat 3 erhaltenen 374 ml Lösung des reduzierten D-Val1-Somatostatin (Gehalt 175 mg) werden mit 147 ml 0,2m Essigsäure und 2967 ml destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 50 |ig/ml verdünnt. Der pH-Wert der Mischung wird mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 6,7 eingestellt. Die Lösung wird 64 Stunden bei Zimmertemperatur im Dunkeln gerührt, wonach eine Ellman-Titration anzeigt, dass die Oxidation vollständig ist.

Die Mischung wird im Vakuum auf ein Volumen von etwa 10 ml eingeengt. Das Konzentrat wird mit 10 ml Eisessig verdünnt und dann an einer Säule aus Sephadex G-25 F entsalzt. Chromatographiebedingungen: Lösungsmittel, entgaste 50%ige Essigsäure, Säulengrösse 5,0 x 90 cm, Temperatur 26 °C, Strömungsgeschwindigkeit 246 ml/Stunde, Fraktionsvolumen 16,4 ml.

Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 m|i gegen die Nummer der Fraktion werden zwei grosse Spitzenwertbereiche erhalten. Der erste Spitzenbereich entspricht den aggregierten Formen des Produkts, und der zweite entspricht monomerem Produkt. Das dem zweiten Spitzenwertbereich entsprechende Material (Fraktionen 49 bis 64, 787-1050 ml) wird vereinigt und im Dunkeln gefriergetrocknet. Die erhaltene feste Substanz wird in 15 ml entgaster 0,2m Essigsäure gelöst und auf eine Säule aus Sephadex G-25 F aufgebracht. Chromatographiebedingungen: Lösungsmittel, entgaste 0,2m Essigsäure, Säulengrösse 5,0 x 150 cm, Temperatur 26 °C, Strömungsgeschwindigkeit 475 ml/Stunde, Fraktionsvolumen 16,6 ml.

Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 m|i gegen die Nummer der Fraktion wird ein grosser Spitzenwertbereich erhalten. Die UV-Spektroskopie zeigt an, dass der Hauptteil dieses Bereichs dem Produkt entspricht. Die Fraktionen 157 bis 172 (Austrittsvolumina von 2590 bis 2855 ml, Spitze = 2667 ml) werden vereinigt und im Dunkeln gefriergetrocknet. Die UV-Spektroskopie zeigt 95 mg des gewünschten Produkts (Ausbeute, bezogen auf die reduzierte Form = 54,3%).

Ein Teil des erhaltenen Feststoffs wird in 5 ml 50%iger Essigsäure gelöst und an einer Säule aus Sephadex G-25 F erneut chromatographiert. Bedingungen der Chromatographie: Lösungsmittel, entgaste 50%ige Essigsäure, Säulengrösse 2,5 x 180 cm, Temperatur 26 °C, Strömungsgeschwindigkeit 53,2 ml/Stunde, Fraktionsvolumen 8,87 ml.

Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 m|x gegen die Nummer der Fraktion wird ein grosser Spitzenwertbereich erhalten. Die UV-Spektroskopie zeigt, dass der grösste Teil des Bereichs dem Produkt entspricht. Die Fraktionen 56 bis 60 (488-532 ml, Spitze = 505 ml) werden vereinigt und im Dunkeln gefriergetrocknet.

Optische Drehung [alphajü26 = —42,1° (1%, Essigsäure).

Aminosäureanalyse: Val, 0,98; Gly, 1,01; 2Cys, 1,81; 2Lys, 1,99; Asn, 0,95; 3Phe, 2,94; Trp, 0,80; 2Thr, 1,91; Ser, 0,85.

Die vorstehenden Ergebnisse sind als Verhältnisse zu (Gly+Lys)/3 = 1,0 ausgedrückt. Es werden folgende drei 21stündige Hydrolysen durchgeführt:

1. in Gegenwart von Dimethylsulfoxid zur Oxidation von Cystein zu Cysteinsäure,

2. mit Thioglykolsäure gespült,

3. ohne Spül- oder Oxidationsmittel.

Alle obigen Werte sind Mittelwerte der drei Hydrolysen mit Ausnahme der folgenden:

Cys und Ser; nur (1) und (3),

Trp; nur (2),

Phe; nur (2) und (3).

D-Val1 -Somatostatin wird in vivo an Hunden auf seine Inhibierung der Magensäuresekretion geprüft. Bei 6 Hunden mit chronischer Fistel und Heidenhain-Sack wird die Magensalzsäuresekretion durch Infusion des C-terminalen Tetrapeptids von Gastrin mit einer Geschwindigkeit von 0,5 (ig/kg und Stunde induziert. Jeder Hund dient als seine eigene Blindprobe und erhält dann einen gesonderten Tag nur das Tetrapeptid. An einem anderen Tag erhalten die 6 Hunde das Tetrapeptid und nach 1 stündiger konstanter Sekretion von HCl wird D-VaP-Somatostatin mit einer Geschwindigkeit von 0,75 ng/kg und Stunde 1 Stunde lang in-fusiert. Das Auffangen von Magensäureproben wird mit 15minütigen Zwischenräumen weitere 1Vi Stunden fortgesetzt. Die Proben werden mit Hilfe eines automatischen Titriergeräts auf pH 7 titriert. Die maximale inhibierende Wirkung des D-VaP-Somatostatin wird gegen die Dosiswirkungskurve von Somatostatin extrapoliert, und die relative Wirkungsstärke des Analogons gegenüber der von Somatostatin wird als prozentuale Wirksamkeit angegeben. D-VaP -Somatostatin inhibiert die durch das C-terminale Tetrapeptid von Gastrin induzierte konstante Säuresekretion um 85,1 + 6,0%, mittlere Fehlergrenze. Diese Wirkung ist der von 0,935 f-ig/kg und Stunde Somatostatin äquivalent. Im Verhältnis zu der Wirksamkeit von Somatostatin liegt seine Wirksamkeit somit bei 125%.

D-VaP-Somatostatin wird ausserdem auf seine Wirkung auf die Darmmotilität von bei Bewusstsein befindlichen Hunden geprüft. Drei Hunde mit Intralumenalkathetern im Antrum, Duodenum und Pylorus werden eingesetzt. Druckänderungen in der Darmröhre werden auf einem Visicorder unter Verwendung von Spannungsmessern und Miniaturlichtstrahlgalvanometern aufgezeichnet. Nach der Einstellung eines konstanten Kontrollzustands wird 10 Minuten

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lang D-Val ^Somatostatin intravenös infusiert. Die Verbindung erhöht zunächst den Intraluminaldruck im Pylorus und senkt ihn dann wieder, wohingegen der Druck im Duodenum und im Antrum während der ganzen Prüfung erniedrigt bleibt. Die untere Grenze der Dosis, die für eine Erhöhung des Pylorusdrucks und zu einer Erniedrigung des Duodenum- und Antrumdrucks erforderlich ist, beträgt weniger als 0,125 ng/kg und 10 Minuten. Dies steht einer Wirksamkeit von Somatostatin selbst von 0*125 bis 0,25 (ig/kg und 10 Minuten gegenüber.

Ausserdem konnte gezeigt werden, dass D-VaF-Somato-statin eine inhibierende Wirkung auf die Pankreassekretion hat. Bei 3 Hunden mit Pankreas- und Magenfisteln wird die Pankreassekretion durch Infusion von zwei Einheiten/kg und Stunde Sekretin und 0,45 Einheiten/kg und Stunde Cholecystokinin und die Sekretion von Magen-HCl durch Infusion von 0,5 Hg/kg und Stunde Tetragastrin induziert. Nach Einstellung einer konstanten Wirkung erhält jeder Hund 1 Stunde lang D-VaP-Somatostatin in einer Geschwindigkeit von 0,75 (ig/kg und Stunde. Die stärkste inhibierende Wirkung, ausgedrückt als prozentuale Änderung gegenüber der Kontrolle für Gesamtprotein beträgt — 51%.

D-Val1 -Somatostatin wurde auch auf seine Wirksamkeit hinsichtlich der Freisetzung von Wachstumshormon geprüft. Hierfür werden normale männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 100 bis 120 g (Laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana) verwendet. Der Test ist eine Abwandlung der Methode von P. Brazeau, W. Vale und R. Guillemin, Endocrinology, Bd. 94, S. 184 (1974). Es werden 5 Gruppen von je 8 Ratten eingesetzt. Allen Ratten wird Natriumpentobarbital intraperitoneal zur Stimulierung der Wachstumshormonsekretion verabreicht. Eine Gruppe dient als Kontrollgruppe und erhält nur Salzlösung. Zwei der Gruppen erhalten Somatostatin, die eine 2-p.g/Ratte subkutan und die andere 50-pg/Ratte subkutan. Die beiden anderen Gruppen erhalten D-Val1 -Somatostatin, die eine 2-(xg/ Ratte subkutan und die andere 50-ng/Ratte subkutan. Die

Serumkonzentration an Wachstumshormon wird 20 Minuten nach der gleichzeitigen Verabreichung von Natriumpentobarbital und Testverbindung bestimmt. Dann wird das Mass der Inhibierung der Wachstumshormonkonzentration s im Serum in bezug auf die Kontrollgruppe bestimmt, und die relativen Wirksamkeiten von D-Val1 -Somatostatin und Somatostatin selbst werden einander gegenübergestellt.

Bei einer Dosis von 2-jag/Ratte inhibiert D-VaP-Somato-statin die Zunahme an Wachstumshormonsekretion um 2% io im Vergleich mit der Kontrolle, wohingegen Somatostatin eine 44%ige Inhibierung hervorruft. Bei einer Dosis von 50-Hg/Ratte inhibiert D-Val1 -Somatostatin die Zunahme in der Wachstumshormonsekretion um 73% im Vergleich mit der Kontrolle, während Somatostatin selbst eine 79%ige In-is hibierung bewirkt.

D-Val1 -Somatostatin wurde ferner auf seine in-vivo-Ak-tivität der Inhibierung der Glucagon- und Insulinsekretion nach Stimulierung mit L-Alanin geprüft. Normale mischrassige Hunde beiderlei Geschlechts werden über Nacht ohne 20 Futter gelassen. Nach der Entnahme von Kontrollblutproben wird mit der intravenösen Infusion von Salzlösung, Somatostatin bzw. D-VaP-Somatostatin begonnen. Nach 30 Minuten wird ausserdem L-Alanin 15 Minuten lang intravenös verabreicht. Nach dem Ende der L-Alanininfusion wird 25 die Infusion von Salzlösung, Somatostatin bzw. D-Val1-Somatostatin noch 15 Minuten fortgesetzt. Die Infusion von L-Alanin verursacht eine abrupte Zunahme der Serumkonzentration an Glucagon und Insulin, die nach dem Ende der L-Alanininfusion auf die Kontrollkonzentration zurückgeht. 3o Bei dieser Versuchsanordnung ergibt sich, dass die minimale Dosis von D-Val1-Somatostatin für die Glucagonin-hibierung bei 0,06 bis 0,11 ng/kg und Minute und für die In-sulininhibierung bei 0,006 bis 0,03 (ig/leg und Minute liegt, wohingegen die minimale Dosis von Somatostatin für die 35 Glucagoninhibierung 0,10 bis 0,12 ng/kg und Minute und für die Insulininhibierung 0,03 bis 0,10 (xg/kg und Minute beträgt.

s

Claims (2)

634 039 2 PATENTANSPRÜCHE

1. Therapeutisch wirksame Verbindung der Formel I

H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH, (I)

und ihre pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindung der Formel

H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (I)

sowie von pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzen davon, dadurch gekennzeichnet, dass man ein entsprechendes geradkettiges Tetratecapeptid der Formel

H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (III)

mit einem Oxidationsmittel umsetzt und die erhaltene Verbindung gegebenenfalls in die entsprechenden Salze überführt.