Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antybiotyku C-15003 P-4.Antybiotyk C-15003 P-4 (dalej oznaczany skró¬ tem „P-4") jest nowym zwiazkiem, otrzymywanym w hodowli mikroorganizmu rodzaju Nocardia, wy¬ odrebnionego ze zródel naturalnych.Powyzszy mikroorganizm hodowany w pozyw¬ kach konwencjonalnych wytwarza równoczesnie kilka skladników antybiotyku C-15003. Wydzielenie kazdego ze skladników z brzeczki fermentacyjnej wymaga stosowania bardzo skomplikowanej ope¬ racji, co nieuchronnie prowadzi do malej wydaj¬ nosci pozadanego skladnika.Na podstawie przeprowadzonych szerokich badan nad wybiórczym wyodrebnianiem skladnika P-4 stwierdzono, ze skladnik ten mozna wytwarzac z duza wydajnoscia, w stosunku do sumy skladni¬ ków antybiotyku C-15003, jezeli stosuje sie pozyw¬ ke hodowlana o specjalnym skladzie.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia antybiotyku C-15003 P-4, w którym hodowle mikroorganizmu rodzaju Nocardia, zdolnego do wy¬ twarzania antybiotyku C-15003 P-4 (dalej czasami zwanego szczepem wytwarzajacym antybiotyk C- -15003 P-4) prowadzi sie w pozywce zawierajacej leucyne lub jej pochodne lub sole, dzieki czemu uzyskuje sie wybiórcze wytwarzanie antybiotyku C-15003 P-4, który wyodrebnia sie z brzeczki fer¬ mentacyjnej.Termin „antybiotyk C-15003" lub „C-15003" ozna- 10 15 20 25 30 cza, zwiazki o wzorze 1, w którym R oznacza rod¬ nik —COCH2CH3, —COCH2CH2CH3 lub rodnik o wzorze 2 lub 3 jako mieszanine dwóch lub trzech tych zwiazków lub pojedynczy zwiazek z tej grupy.Zwiazek o wzorze 1, w którym R oznacza rodnik —COCH2CH3 nazywa sie antybiotykiem C-15003 lub „P-2", zwiazek o wzorze 1, w którym R oznacza rodnik —COCH2CH2CH3 antybiotykiem C-15003 P-3' lub „P-3", zwiazek o wzorze 1, w którym R oznacza rodnik o wzorze 2 — „antybiotykiem C-15003 P-3" lub „P-3", a zwiazek o wzorze 1, w którym R oznacza rodnik o wzorze 3 — antybioty¬ kiem C-15003 P-4 lub „P-4".Jako przyklad szczepu wytwarzajacego antybio¬ tyk C-15003 P-3 mozna wymienic szczep actinomy- cete nr C-15003 (dalej czasami nazywany skrótowo „szczepem C-15003"), który zostal wyodrebniony z gleby i innych materialów w skriningowych poszu¬ kiwaniach mikroorganizmów wytwarzajacych anty¬ biotyki.Mikrobiologiczna charakterystyke szczepu nr C- -15003 badano sposobami analogicznymi do zapro¬ ponowanych przez Schirlinga i Gottlieba (Interna¬ tional Journal of Systematic Bacteriology 16, 313— —340 (1966)). Wyniki obserwacji prowadzonych w 28°C w ciagu 21 dni sa nastepujace: 1) Charakterystyka morfologiczna Grzybnia wegetatywna rozprzestrzenia sie dob¬ rze i rozwija w odgalezienia, zarówno na agarze 122 365* 122 365 3 4 jak i w pozywce cieklej. Wiele sposród strzepków jest srednicy 0,8 do 1,2 urn, a w pewnych przypad¬ kach moga sie one dzielic na fragmenty przypo¬ minajace bakterie paleczkowe lub strzepki rozga¬ lezione o malej dlugosci. Szczep dobrze wzrasta na róznych pozywkach taksonomicznych. Grzybnia po¬ wietrzna naklada sie na grzybnie wegetatywna, choc czesto formuje twory podobne do koremii (50—200X200—1000 \im), na których nastepuje dal¬ szy wzrost powietrzny. Liczne sposród grzybni po¬ wietrznych sa krete, od czasu do czasu napotyka sie konfiguracje proste lub w postaci luznych spi¬ rali.Mikroskopowe badania starszych hodowli wyka¬ zuj^, zfe' tylko w nielicznych przypadkach komórki kóremiopodobne wystepuja w lancuchach, nato¬ miast zawiesiny komórkowe otrzymane z powierz¬ chni takich hodowli *w badaniach mikroskopowych wykazuja obecnosc wielu tworów, przypominaja¬ cych artrospory, o ksztalcie elipsy (0,8—1,2 ^m X X 1,0—2,0 u.) lub wydluzonej elipsy (0,8—1,2 \im X X 4,8—6,8 ^m). Obserwacje pod mikroskopem elek¬ tronowym wykazuja, ze twory te maja gladkie po¬ wierzchnie. 2) Skladniki komórek (B) Agar glicerynowo-azotanowy G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniowej (2 ca)*; formuja sie twory kóremiopodobne AM: umiarkowana, barwy bialej SP: brak (C) Agar glukozowo-asparaginowy G: umiarkowany, barwy nogietku (3 pa)* do jas- nozóltej (2 pa) * AM: skapa, barwy bialej SP: jasnozólty (2 pa)* (D) Agar glicerynowo-asparaginowy G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniowej (2ca) *; formuja sie twory kóremiopodobne AM: skapa, barwy bialej SP: brak (E) Agar skrobiowy G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniowej (2 ca) * do jasnopszenicznej (2 ea); * formuja sie twory kóremiopodobne AM: obfita, barwy jasnej kosci sloniowej (2 ca) * SP: brak (F) Agar odzywczy , -" G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniowej - , (2 ca)*do jasnopszenicznej (2ea ); * formuja sie twory kóremiopodobne AM: obfita, barwy jasnej kosci sloniowej (2 ca) * SP: brak .....Szczep hodowano na trzesawce w zmodyfikowa¬ nej pozywce ISP nr 1, w 28°C, w ciagu 66—90 go¬ dzin, a po zakonczeniu hodowli komórki zbierano i plukano. Sposobami B. Beckera i innych (Applied 5 Microbiology 12, 421 (1964) i M.P. Lechevaliera (Journal of Laboratory and Clinical Medicine 17, 934 (1968)) powyzsze cale komórki badano na kwas dwuaminopimelinowy i sklad cukrów. Stwierdzo¬ no, ze kwas dwuaminopimelinowy wystepuje w po¬ staci mezo, a sposród cukrów wystepuje galaktoza i arabinoza. 3) Charakterystyka na pozywkach taksonomicz¬ nych Szczep wykazuje stosunkowo dobry wzrost na róznych pozywkach. Grzybnia wegetatywna jest bezbarwna lub barwy jasnozóltej w poczatkowej fazie hodowli, a w dalszych fazach barwy jasnozól- tawobrazowej do zóltawobrazowej. Szczep wytwa¬ rza, w róznych pozywkach taksonomicznych, roz¬ puszczalne pigmenty zólte do zóltawobrazówych.Grzybnia powietrzna jest proszkowata i zwykle da¬ je umiarkowany wzrost. Charakterystyka szczepu w róznych pozywkach taksonomicznych jest przed¬ stawiona w tabeli 1.(H) Agar z ekstraktem drozdzowym i slodowym G: umiarkowany, barwy bursztynowej (3 lc) * do jasnozóltej (3 la) *; formuja sie twory kóre¬ miopodobne AM: umiarkowana, barwy bialej do jasnej kosci sloniowej (2 ca) * SP: brak (I) Agar z maka owsiana G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniowej (2 ca) * do zólcieni kolonialnej (2 ga) *; for¬ muja sie twory kóremiopodobne AM: skapa, barwy bialej do jasnozóltej SP: brak (J) Agar z peptonem, ekstraktem drozdzowym i ze¬ lazem G: umiarkowany, barwy zólcieni kolonialnej (2 ga) * AM: brak SP: zólcien kolonialna (2 ga)* (K) Agar tyrózynowy G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniowej (2 ca) * do jasnej zólcieni melonowej (2 ea) *; formuja sie twory kóremiopodobne AM: umiarkowana, barwy bialej do jasnej kosci sloniowej (2 ca) * SP: wielbladzi (3 ie) * * Kod barw wedlug Color Harmony Manual, wydanie czwarte Container Corporation of America, 1958) Tabela 1 Charakterystyka hodowlana szczepu nr C-15003 w pozywkach taksonomicznych (A) Agar sacharozowo-azotanowy Wzrost (G). umiarkowany, barwy jasnozóltej — melonowej (3 ia)_* do bursztynowobrazowej (3 lc)*; formuja sie twory kóremiopodobne Grzybnia powietrzna (AM): skapa, barwy bialej Rozpuszczalny pigment (SP). brak lub jasnozólta- wobrazowy 30 35 (G) Agar z jablczanem wapnia G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniowej (2 ca) * do jasnopszenicznej (2 ea). * formuja sie twory kóremiopodobne AM: umiarkowana, barwy bialej do jasnej kosci sloniowej (2 ca)* SP: brak 10 20 25 ) e wl ta 30 35 40 45 50 55 60 65122 365 6 4) Charakterystyka fizjologiczna Charakterystyke fizjologiczna szczepu przedsta¬ wiono w tabeli 2. Zakres temperatury dla wzrostu: 12—38°C. Zakres temperatury, w którym wystepu¬ je dobry wzrost powietrzny na agarze (ISP nr 2) 5 wynosi 20 do 35°C.T a b e 1 a 2 Charakterystyka fizjologiczna szczepu nr C-15003 zakres temperatury dla wzrostu: 12 do 38°C io zakres temperatury dla wzrostu powietrznego: 20 do 35°C uplynnianie zelatyny: dodatnie hydroliza skrobi: dodatnia redukcja azotanów: dodatnia 15 peptonizacja mleka: dodatnia koagulacja mleka: ujemna rozklad kazeiny: dodatni produkcja pigmentów melanoidowych: ujemna (agar z peptonem, ekstraktem dróz- 20 dzowym i zelaza),' dodatnia (agar tyrozynowy) rozklad tyrozyny: dodatni rozklad ksantyny: ujemny rozklad hipoksantyny: ujemny " 25 tolerancja na lizozym: dodatnia tolerancja na chlorek sodu: 2% 5) Utylizacja zródel wegla Utylizacje zródel wegla badano stosujac pozyw¬ ke opisana przez Pridhama i Gottlieba (Journal of Bacteriology 56, 107 (1948)) i pozywke podstawowa 9 tym samym skladzie +0,1% ekstraktu drozdzo¬ wego. Otrzymane spektrum przedstawiono w ta¬ beli 3. 30 35 Barwienie grzybni wegetatywnej wedlug Gra¬ ma: dodatnie.Powyzsza charakterystyke szczepu nr C-15003 po¬ równano z opisami przedstawionymi w monogra¬ fiach S.A. Waksman: „The Actinomycetes" Vol. 2 (The Williams and Wilkins Co., 1961); R.E. Bucha¬ nan i N.E. Gibbons: „Bergey's Manual of Determi- native Bacteriology", wydanie 8, 1974; i w innej li¬ teraturze.Przyjeto, ze szczep nalezy do grupy III rodzaju Nocardia; poniewaz posród znanych nie znalezio¬ no szczepu o wyzej przedstawionej charakterysty¬ ce; wyciagnieto wniosek, ze C-15003 jest mikroor¬ ganizmem nowego gatunku.Szczep nr C-15003 zlozono w Fermentation Re¬ search Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM), Japonia, z numerem dezycyj- nym FERM-P nr 3992; w The Institute for Fer¬ mentation, Osaka (IFO), Japonia, pod numerem IFO 13726; oraz w The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, USA pod numerem ATCC-31281.Leucyna stosowana w wynalazku jako dodatek moze byc wprowadzana w postaci pochodnych.Przykladami takich pochodnych sa estry, jak estry alkilowe o 1 lub 2 atomach wegla w rodniku estro¬ wym (np. ester mteylowy lub etylowy), amidy lub alkiloamidy, majace w rodniku alkilowym 1 lub 2 atomy wegla (np. N-metyloamid lub N-etyloamid) leucyny, jej- ketokwasy (np. kwas a-ketokaprono- wy) lub sole powyzszych zwiazków (np. chlorowo¬ dorek). Pozadana jest postac L leucyny. Stosowac mozna równiez mieszaniny wolnej postaci leucyny z jej pochodnymi lub mieszaniny jej pochodnych.Powyzsze dodatki dodaje sie do pozywki w ilosci Tabela 3 Utylizacja zródel wegla przez szczep nr C-15003 Zródlo wegla D-ksyloza L-arabinoza D-glukoza D-galaktoza D-fruktoza L-ramnoza D-mannoza sacharoza laktoza maltoza Wzrost + + + + + +;+ + + • • + + + + +.— , ± + +* + + + + + + + + '+ ''+ + — + Zródlo wegla trehaloza rafinoza melibioza i-inozytol D-sorbit D-mannit gliceryna skrobia rozpuszczalna kontrola (bez dodatku) Wzrost + ± + — - — + + — + — + +* ± + — ¦ +.+¦ ± + — * pozywka podstawowa z 0,1% dodatkiem ekstraktu drozdzowego Skala ocen: + + + : + + : + : ±: bujny wzrost dobry wzrost wzrost slaby wzrost brak wzrostu 6) Dalsza charakterystyka Komórki zbierano sposobem opisanym w punkcie 2), a DNA preparowano sposobem analogicznym do opisanego przez J. Marmura i innych (Journal of Molecular Biology 3, 208, 1961). Znaleziona zawar¬ tosc G-C (guaniny-cytozyny) w DNA wyniosla oko¬ lo 71% molowych. 0,01 do 1,0, korzystnie 0,1 do 0,5% wagowych w ob¬ jetosci, w jakimkolwiek etapie hodowli Nocardia sp. nr C-15003, korzystnie w jej etapie poczatko¬ wym.Jako pozywke do hodowli szczepu wytwarzaja¬ cego antybiotyk C-15003 P-4 mozna stosowac jaka¬ kolwiek pozywke plynna lub stala, zawierajaca7 J22 365 $ Skladniki odzywcze, które szczep moze zuzytkowy- wac. W produkcji na duza skale stosuje sie zwy¬ kle pozywki plynne. Pozywka moze zawierac sub¬ stancje dodatkowe stosowane w sposobie wedlug wynalazku, zródla wegla i azotu, fermentowane i przyswajalne przez szczep nr C-15003, substancje nieorganiczne, pozywki sladowe itp. Jako przykla¬ dowe, zródla wegla mozna wymienic glukoze, lak¬ toze, sacharoze, maltoze, dekstryne, skrobie, gli¬ ceryne, mannit, sorbit itp., tluszcze i pieje (np. olej sojowy, olej smalcowy, olej kurzy) itp.Zródlem azotu moze byc np. ekstrakt miesny, ekstrakt drozdzowy, drozdze suszone, maka sojo¬ wa, namok kukurydziany, pepton, maka z nasie¬ nia bawelny, melasa, mocznik, sole amonowe (np. siarczan amonu, chlorek amonu, azotan amonu itp.), azotany (np. azotan sodu, azotan potasu).Pozywka moze równiez zawierac sole sodu, po- fasu, wapnia, magnezu, zelaza, manganu, cynku, kobaltu, niklu itp., sole kwasu fosforowego, kwasu borowego itp., witaminy (np. B^ B2, kwas nikoty¬ nowy, B12, C, E itp.), kwasy nukleinowe (np. pu- ryne, pirymidine i ich pochodne) oraz inne sub¬ stancje. 10 15 20 wartosci pH 6,5—7,5. Czas prowadzenia hodowli równiez zmienia sie w zaleznosci od wyzej wymie¬ nionych czynników. Zaleca sie prowadzenie ho¬ dowli do uzyskania maksymalnej aktywnosci P-4.W hodowli na trzesawce lub aerobowej podpo- wierzchniowej w pozywce cieklej wymagany czas wynosi zwykle od okolo 48 do 240 godzin.Ponizsze jest konkretnym przykladem wytwa¬ rzania P-4.Szczepem nr C-15003 inokulowano pozywke ho¬ dowlana (I) zawierajaca 3% rozpuszczalnej skrobi, 0,2% chlorku amonu, 0,05% siarczanu magnezu, 1,09% dwuwodorofosforanu potasu, 2,09% wodoro- fosforanu potasu, 0,001% siarczanu zelazawego i substancje dodatkowe lub pozywke hodowlana (II) zawierajaca 5% dekstryny, 3% namoku kuku¬ rydzianego, 0,1% peptonu, 0,5% weglanu wapnia i substancje dodatkowe. Hodowle prowadzono w ciagu 144 godzin na trzesawce obrotowej (200 obro¬ tów na minute) lub w fermentorze, w 28°C.W tabelach 4 i 5 przedstawiono wyniki uzyskane przy stosowaniu pozywek (I) i (II).Aktywnosc C-15003 oznaczano metoda krazków bibuly, stosujac Talaromyces avellaneus IFO 7721 Tabela 4 Substancja dodana nie dodano L-leucyna L-leucyna L-leucyna Ilosc (%) 0,1 0,3 0,1 Czas dodania (godzina) * 0 0 72 Udzial skladnika (% wagowych sumy) P-2 | P-3 10 5 8 5 65 28 13 30 P-4 25 67 79 65 Aktywnosc sumaryczna (^g/ml) 10 13,5 11,5 10 • Czas zero oznacza, ze substancja dodatkowa zostala wprowadzona do pozywki jako jeden z jej skladników.Tabela 5 Substancja docfana nie dodano L-leucyna | L-leucyna Ilosc (%) 0,3 0,5 Czas dodania ¦ (godzina) * 0 0 Udzial skladnika (% wagowych sumy) P-2 15 7 5 P-3 60 21 11 , P-4 - 25 72 84 Aktywnosc sumaryczna (ug/ml) 20 15 Czas zero ma to samo znaczenie co w przypadku tabeli 4.Do korygowania pH srodowiska mozna stosowac kwas nieorganiczny i/lub amoniak lub wodorotlen¬ ki metali alkalicznych. Jezeli to jest pozadane, mozna równiez dodawac oleje i tluszcze, srodki po¬ wierzchniowo czynne i srodki przeciwpienne.Hodowle mozna prowadzic stacjonarnie, na trze¬ sawce, aerobowo, podpowierzchniowo i w innych warunkach. W skali wielkoprodukcyjnej korzystna jest oczywiscie hodowla aerobowa, podpowierz- chniowa. Warunki hodowli zaleza oczywiscie od warunków fermentacji i skladu pozywki, uzytego szczepu, sposobu prowadzenia hodowli i innych czynników.Zwykle korzystnie jest prowadzic inkubacje w 2C do 35°C przy poczatkowej wartosci pH okolo §,5—3,5, zwlaszcza w 23 do 30°C przy poczatkowej 50 55 65 jako organizm testowy. W oznaczeniach stosowano pozywke zawierajaca 3,5 g wodorofosforanu sodu, 0,5 g dwuwodorofosforanu potasu, 5 g ekstraktu drozdzowego (Difco, USA), 1 Og glukozy, 15 g aga¬ ru i 1000 ml destylowanej wody (pH 7,0). Oznaczen nagromadzonego w brzeczce P-2, P-3 i P-4 doko¬ nywano jak nastepuje: Brzeczke" fermentacyjna ekstrahowano octanem etylu w objetosci równej objetosci brzeczki. War¬ stwe rozpuszczalnika odparowano, a pozostalosc wysuszono. \Vysuszony material rozpuszczono w oc¬ tanie etylu w objetosci równej 1/100 objetosci wyj¬ sciowej brzeczki. Produkty rozwinieto na plycie do chromatografii cienkowarstwowej, powleczonej ze¬ lem krzemionkowym (silical-gel eOF^, Merck, RFN), stosujac jako uklad rozwijajacy octan ety-mm $ w lu nasycony woda. Ilo§c antybiotyku i stosunek skladników oznaczono za pomoca aparatu Shima- zu model CS-910 (Japonia), na podstawie scalko- wanych gestosci kazdej z plam na chromatogra- mie, mierzonych przy 254 mm. Stosunek skladni- 5 ków wyrazono w procentach wagowych P-2, P-3 i P-4 w odniesieniu do sumy skladników.Jak przedstawiono w tabelach 4 i 5, w obecnosci specyficznych dodatków Szczep nr C-15003 produ¬ kuje P-4 w ilosci 65 do 84% w odniesieniu do su- !0 my skladników, natomiast w nieobecnosci tych skladników produkcja P-4 wynosi 25% lub mniej.Tak wiec w pierwszym przypadku odzysk P-4 z brzeczki fermentacyjnej jest pelniejszy niz w przy- .padkudrugim. 15 P-4 wytworzony w brzeczce fermentacyjnej jest substancja lipofilna o charakterze obojetnym i mo¬ ze byc wyodrebniany z brzeczki i oczyszczany spo- spbami zwykle stosowanymi do odzyskiwania tego typu metabolitów. P-4 latwo jest ekstrahowany z 20 przesaczonej brzeczki do nie mieszajacego s$e z wo¬ da rozpuszczalnika organicznego, jak estry "kwasów tluszczowych, np. octan etylu lub octanuamylu; alkohole, np. butanol; chlorowcowane weglowodo¬ ry, np. dwuchlorometan lub chloroform; lub keto- 25 ny,* np. keton metyloizobutylowy. Ekstrakcje P-4 z przesaczu przeprowadza sie przy pH zblizonym do obojetnego, korzystnie octanem etylu przy pH 7. Ekstrakt przemywa sie woda i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Do zatezonego ekstraktu 30 dodaje sie rozpuszczalnika niepolarnego, jak eter naftpwy lub heksan, co powoduje wytracenie aktywnych zwiazków.Jezeli to jest pozadane, surowy produkt poddaje sie konwencjonalnej obróbce oczyszczajacej. Jako 35 rutynowy zabieg oczyszczajacy, odpowiednia jest chromatografia adsorpcyjna na konwencjonalnym adsorbencie, jak zel krzemionkowy, aktywny tle¬ nek glinu, makropprowata niejonowa zywica itp.W chromatografii na zelu krzemionkowym za- 40 warty w surowym produkcie P-4 rozwija sie np. e$erem naftowym i heksanem, a eluuje dodaniem rozpuszczalnika polarnego, jak octan etylu, aceton, etanol lub metanol lub chlorowcowanego weglowo¬ doru, jak dwuchlorometan lub chloroform, zawie- 45 rajacego rozpuszczalnik polarny, jak alkohol, np. metanol lub etanol, keton, np. aceton lulp keton metyloetylowy lub podobne. W ten sposób P-4 elu- UJe sie, wydziela i odzyskuje.W przypadku zastosowania do oczyszczania P-4 50 rnakrpporowatej zywicy adsorpcyjnej, elucji P-4 z l^plumny dokonuje sie mieszanina wody z niz¬ szym alkoholem, nizszym ketonem lub estrem. Niz¬ szym alkoholem moze byc przykladowo metanol, etanol, propanol lub butanol, a nizszym ketonem *55 aceton lub. keton metyloetylowy. Estrem moze byc przykladowo octan etylu, octan butylu itp. W po¬ stepowaniu typowym, surowy produkt rozpuszcza sie w 60% wodnym metanolu i absorbuje na ko¬ lumnie z adsorbentem Diaion HP-10 (Mitsubishi 60 Chemical Industries, Ltd., Japonia). Kolumne prze¬ mywa sie 70% wodnym metanolem i eluuje P-4 za pomoca 90% wodnego metanolu.W wyzej opisanym sposobie, frakcje zawierajace P-4 laczy sie i odparowuje pod zmniejszonym cis- 65 nieniem. Do surowego prpduktu dodaje sie 5 do 8 objetosci octanu etylu i pozostawia mieszanine w spoczynku, co prowadzi do wykrystalizowania P-4.W sposobie wedlug wynalazku udzial P-4 w su¬ mie produktów C-15003 wynosi 65% lub wiecej, a P-4 jest latwo odzyskiwalny z brzeczki fermen¬ tacyjnej. Dzieki temu sposób wedlug wynalazku jest bardzo korzystny w wytwarzaniu P-4 na skale przemyslowa.W tabeli 6 przedstawiono wlasciwosci fizyko- -chemiczne P-4 otrzymanego w przykladzie IV.Tabela 6 Antybiotyk C-15003 P-4 (C33H45C1N209 = 649,196) Temperatura topnie¬ nia (°C) Skrecalnosc wlasciwa (a) D Analiza elementarna znaleziono (%) obliczono (%) Widmo w nadfiolecie (w metanolu nm (e) - Wiidmo absorpcji w podczerwieni (cm-1), KBr I Widmo magnetyczne¬ go rezonansu jadro¬ wego (ppm) 100 MHz w CDC13 . Widmo masowe (m/e) Rozpuszczalnosc Reakcje barwne ' 1 177—180 -142° ±10° (c = 0,522, CHCI3) C 60,65 H 7,05 N 4,25 Cl 5,23 C 61,05 H 6,99 .N 4,32 Cl 5,46 233 (29900), 240 (prze¬ giecie, 28240), 252 (27590), 280 (5712), 288 (5680) 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 1,03 (d) (6H) 587, 485, 470, 450 nierozpuszczalny w eterze naftowym, he¬ ksanie, wodzie slabo rozpuszczalny w benzenie, eterze rozpuszczalny w chlo- 1 roformie, octanie ety¬ lu, acetonie, etanolu, metanolu, pirydynie, czterowodorofuranie, dwumetylosulfotlenku Dragendorfa: dodatnia Beilsteina: dodatnia [ Przyjmuje sie, ze P-3, P-3' i P-4 sa zwiazkami nowymi, natomiast P-2 jest identyczny z propio- nianem maytansinolu, co zostalo wykazane w do¬ niesieniu Kupchana i innych (Journal of the Ame¬ rican Chemical Society 97, 5294 (JL975) na podsta¬ wie analizy elementarnej, skrecalnosci wlasciwej, absorpcji w nadfiolecie i w podczerwieni, spektro¬ grafii masowej itp.11 Czynnosc biologiczna P-4 przedstawia sie naste¬ pujaco: A) Czynnosc wobec mikroorganizmów Stezenie hamujace wzrost nizej podanych mikro¬ organizmów oznaczono metoda krazków bibuly, stosujac jako pozywke agar tryptikazowo-sojowy (BBL). Krazki bibuly (Toyo Seisakusho, typu cien¬ kiego, srednicy 8 mm) zaimpregnowano 0,002 ml roztworu P-4 o stezeniu 300 [ig/ml i umieszczono na plytach aagrowych inokulowanych odpowiedni¬ mi mikroorganizmami. P-4 nie wykazal czynnosci w stosunku do nastepujacych bakterii: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomo- nas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cere*us, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens i Mycobacterium avium.Natomiast wzrost grzyba Talaromyces avellaneus jest inhibitowany przez P-4 na plycie z agarem o skladzie: 3,5 g wodorofosforanu dwusodowego, 0,5 g dwuwodorofosforanu monopotasowego, 5 g eks- trktu drozdzowego (Difco), 10 g glukozy, 15 g aga¬ ru i 1000 ml wody destylowanej, pH 7,0. Minimal¬ ne stezenie hamujace P-4 wynosi 1,0 do 1,5 \ig/ml.Ponadto, Tetrahymena pyriformis W jako orga¬ nizm testowy byl hodowany na pozywce testowej o skladzie 20 g proteozo-peptonu (Difco), 1 g eks¬ traktu drozdzowego, 2 g glukozy, 1000 ml wody destylowanej i 10 ml buforu fosforanowego, w 28°C, w ciagu 44 do 48 godzin, a czynnosc,, hamo¬ wania wzrostu tego pierwotniaka przez P-4 byla oznaczona metoda rozcienczen seryjnych. Hamowa¬ nie wzrostu wystapilo przy 0,5 [jig/ml.P-4 wykazal czynnosc wobec nastepujacych mi¬ kroorganizmów: Fusicladium levieri, Helmintho- sporium sigmoidium var. irregulare, Pyricularia oryzae, Cochlioborus miyabeanus, Sclerotinia acre- rotiorum, Pellicularia sasakii, Trichophyton ru¬ brum, Rhodotorula rubra i Cryptococcus neofor-4 mans.B) Czynosc przeciwnowotworowa Zbadano czynnosc terapeutyczna P-4 (dawkowa¬ nego dootrzewnowo w ciagu 9 kolejnych dni) wo¬ bec bialaczki P38L8 u myszy (1X108 komórek/zwie¬ rze, mysz, transplantacja dootrzewnowa). Czynnosc przeciwnowotworowa P-4 w dawce 0,00625 mg/kg/ /doba wyrazila sie przedluzeniem zycia o 180%.C) Toksycznosc We wstepnej próbie toksycznosci ostrej, przepro¬ wadzonej u myszy i która obejmowala dootrzewno¬ wa injekcje P-4, antybiotyk wykazal wartosc LD50 powyzej 0,313 mg/kg. .Jak wyzej wspomniano, P-4 wykazuje silna czyn¬ nosc hamowania wobec grzybów i pierwotniaków i dlatego jest cennym czynnikiem przeciwgrzybo- wym i przeciwpierwotniakowym. Ponadto, ponie¬ waz P-4 wykazuje czynnosc przedluzania zycia ssa¬ ków z nowotworami (np. myszy), oczekuje sie, ze zwiazek ten bedzie uzyteczny jako lek przeciwno- wotworowy.P-4 jako czynnik przeciwgrzybowy i przeciw- pierwotniakowy moze byc z korzyscia stosowany do szacowania ekologii bakteryjnej w glebie, osa¬ dzie czynnym, zwierzecym plynie ustrojowym i po¬ dobnych. Tak wiec w przypadku, gdy z próbek gleby maja byc wyodrebnione wartosciowe bakte- 365 12 rie lub gdy ma byc oszacowana czynnosc bakterii w oddzieleniu ód czynnosci grzybów i pierwotnia¬ ków, w zwiazku z operacja i analiza ukladu z osa¬ dem czynnym w obróbce scieków, antybiotyk mo- 5 ze byc stosowany do uzyskania wybiorczego wzros¬ tu flory bakteryjnej, uniemozliwiajac równoczesny wzrost w próbce grzybów i pierwotniaków.W typowym przypadku, próbke dodaje sie do cieklej lub stalej pozywki, do której nastepnie do- io daje sie P-4 w 1% wodnym metanolu, w ilosci 0,1 ml roztworu o stezeniu 1 Odo 100 ^ig/ml na 1 ml pozywki.P-4 moze byc równiez stosowany jako czynnik przeciwbakteryjny w zwalczaniu chorób rosiln spo- 15 wodowanych wyzej podanymi mikroorganizmami.W typowym stosowaniu, P-4 uzywa sie w postaci roztworu w 1% wodnym metanolu, zawierajacego antybiotyk w stezeniu 0,5—5 jig/ml. Przykladowo, P-4 mozna stosowac do zwalczania schorzen roslin 20 ryzowych, jak porazenie, plamy lisci spowodowane przez Helminthosporium i rdza pochewki.Wynalazek jest ilustrowany ponizszymi przykla¬ dami, w których opisie „czesci" oznaczaja czesci wagowe, jezeli nie zaznaczono inaczej, a stosunek 25 miedzy „czesciami" a „czesciami objetosciowymi" dotyczy stosunku miedzy „gramami" a „mililitra- mi", a natomiast „%" dotyczy „wagiyobjetosci", je¬ zeli nie zaznaczono inaczej.Przyklad I. 40 czesci objetosciowych pozyw- 30 ki posiewowej (1,0% glukozy, 2,0% Bactotryptonu i 1,2% ekstraktu drozdzowego Bacto, pH 7,0) wle¬ wa sie do kolby Erlenmayera o objetosci 200 czes¬ ci objetosciowych.Po sterylizacji, pozywke szczepi sie Nocardia sp. 35 nr C-15003 (IFO 13726). Zaszczepiona pozywke in- kubuje sie w temperaturze 28°C na wstrzasarce obrotowej (200 obrotów na minute), uzyskujac ho¬ dowle posiewowa. Komórki w hodowli przemywa sie trzykrotnie sterylizowana woda destylowana 4Ó i przemyte komórki ponownie zawiesza w sterylizo¬ wanej wodzie destylowanej, w objetosci równej po¬ czatkowej objetosci brzeczki. Jedna czescia obje¬ tosciowa powyzszej zawiesiny szczepi sie 40 obje¬ tosci podstawowej pozywki hodowlanej, zawiera- 45 jacej 3% skrobi rozpuszczalnej, 0,2% chlorku amo¬ nu, 0,05% siarczanu magnezu, 1,09% dwuwodoro- fosforanu potasu, 2,09% wodorofosforanu potasu, 0,001% siarczanu zelazawego i 0,3% L-leucyny.Fermentacje prowadzi sie w 28°C w ciagu 8 dni, 50 na trzesawce obrotowej (200 obrotów na minute).Antybiotyk C-15003 powstaje w ilosci sumarycz¬ nej 12 [ig/ml, a udzial skladnika P-4 w sumie wy¬ nosi 80% wagowych.Przyklad II. 500 czesci objetosciowych hodo- 55 #wli posiewowej jak przedstawiona w przykladzie 1 wprowadza sie do 2000 czesci objetosciowych na¬ czynia Sakaguchi i prowadzi hodowle w 28°C w ciagu 48 godzin, na trzesawce posuwisto-zwrotnej (110 suwów na minute), uzyskujac inokulum. Ino- 60 kulum przenosi sie do 100 X103 czesci objetoscio¬ wych pozywki zawierajacej 2,0% glukozy, 3,0% skrobi rozpuszczalnej, 1% namoku kukurydzianego, 1% maki sojowej, 0,5% polipeptonu (Daigo Nitri- tive Chemicals, Ltd., Japonia), 0,3% chlorku sodu 65 i 0,5% weglanu wapnia, zawartej w fermentorze13 122 365 14 ze stali nierdzewnej o objetosci 200X10* czesci.Hodowle prowadzi sie w 28°C w ciagu 48 go¬ dzin, przy napowietrzaniu 100 X108 czesci objetos¬ ciowych na minute i mieszaniu z szybkoscia 200 obrotów na minute. Brzeczke hodowlana (10X10* czesci objetosciowych) przenosi sie do 100X10* czes¬ ci objetosciowych pozywki fermentacyjnej (5% dekstryny, 3°/o namoku kukurydzianego, 0,1% pep¬ tonu, 0,5% t-leucyny i 0,5% weglanu wapnia, wa¬ ga w objetosci, pH 7,0) w 200X10* czesciach obje¬ tosciowych fermentora ze stali nierdzewnej. Hodo¬ wle prowadzi sie w ciagu 4 dni w 28°C, przy na¬ powietrzaniu 100X10* czesci objetosciowych na mi¬ nute, mieszanie z szybkoscia 150 obrotów na mi¬ nute.Antybiotyk C-15003 powstaje w ilosci suma¬ rycznej 12jAg/ml, a udzial skladnika P-4 w sumie wynosi okolo 85% wagowych.Przyklad III. Do 95X10* czesci objetoscio¬ wych brzeczki otrzymanej w przykladzie II doda¬ je si£ 50X10* czesci objetosciowych acetonu. Mie¬ szanine miesza sie w ciagu 30 minut, po czym do¬ daje 2X10* czesci sorbentu Hyflo Super-Cel (Johnes and Manville Products, Ltd.) i calosc dokladnie miesza. Mieszanine przesacza sie na filtrze cisnie¬ niowym, otrzymujac 135X10* czesci objetosciowych przesaczu.Do przesaczu dodaje sie 50X10* czesci objetoscio¬ wych wody i 90 X10* czesci objetosciowych octanu etylu, mieszanine miesza i dwukrotnie ekstrahuje.Otrzymane ekstrakty. w octanie etylu laczy sie, przemywa dwiema porcjami po 80X10* czesci ob¬ jetosciowych wody zadaje 1X10* czesciami bez¬ wodnego siarczanu sodu, suszy i zateza do 200 czesci objetosciowych. Do koncentratu dodaje sie eteru naftowego, a wytracony osad odsacza, otrzy¬ mujac 35 czesci surowego produktu.Do tak otrzymanego surowego produktu dodaje sie 50 czesci objetosciowych octanu etylu i calosc miesza. Odsacza sie czesci nierozpuszczalne, a do przesaczu dodaje 10 czesci zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm). Po wymieszaniu ca¬ losci, pod zmniejszonym cisnieniem oddestylowuje sie octan etylu.Pozostalosc nanosi sie na kolumne z zelem krze¬ mionkowym (500 czesci objetosciowych). Antybio¬ tyk eluuje sie kolejno 500 czesciami objetosciowy¬ mi ri-heksanu, 500 czesciami objetosciowymi mie¬ szaniny n-heksanu octan etylu (3:1), 2000 czesci objetosciowych mieszaniny n-heksan-octan etylu (1.1) i 2000 czesci objetosciowych octanu etylu na¬ syconego woda, zbierajac wycieki frakcjami obje¬ tosci po 50 czesci objetosciowych.Jedna czesc objetosciowa kazdej frakcji odpa¬ rowuje sie do sucha, dodaje do pozostalosci 0,1 czesci objetosciowej octanu etylu, a mieszanine na¬ nosi na plyte szklana powleczona zelem krzemion¬ kowym (Merck, RFN, 60F2m, 0,25 mm, 20X20), w odleglosci 2,5 cm od dolnej krawedzi. Chromato- gram rozwija sie w octanie etylu wysyconym wo¬ da, do wysokosci okolo 17 cm. Po rozwinieciu przeprowadza sie detekcje w nadfiolecie (2537- •10-™ m. Frakcje aktywne o Rf 0,49 zbiera sie i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do okolo 2 czesci objetosciow/ch.Do koncentratu dodaje sie 20 czesci objetoscio¬ wych eteru naftowego, otrzymujac 9,1 czesci suro- Vych krysztalów. Surowe krysztaly rozpuszcza sie w 20 czesciach objetosciowych cieplego octanu ety- 5 lu. Po oziebieniu odzyskuje sie 0,92 czesci P-4.Czystosc otrzymanych krysztalów wynosi 94% wa¬ gowych, a temperatura topnienia 178—180°C.Przyklad IV. W 400 czesciach objetosciowych 50% metanolu rozpuszcza sie 20 czesci surowego io produktu otrzymanego w przykladzie III. 1000 cze¬ sci objetosciowych sorbentu Diaion HP-10 (Mitsu¬ bishi Chemical Industries Ltd., Japonia) wprowa¬ dza sie do kolumny (srednica 2,5 cm) w7 3000 ob¬ jetosciowych czesci 50% wodnego metanolu. Roz- 15 winiecie i elucje P-4, po przepuszczeniu przez ko¬ lumne wyzej sporzadzonego roztworu, przeprowa¬ dza sie stosujac 1000 czesci objetosciowych 60°/o metanolu, 7500 czesci objetosciowych 60% metano- lu-wody i 7500 czesci objetosciowych metanolu- 20 -wody, w podanej kolejnosci.Wycieki zbiera sie frakcjami po 75X10* czesci objetosciowych,-a kazda frakcje analizuje chroma¬ tografia cienkowarstwowa na zelu krzemionko¬ wym, w sposób opisany w przykladzie III. 25 Frakcje aktywne nr 182-190 laczy sie i zateza.Do koncentratu dodaje sie 50Ó czesci objetoscio¬ wych wody i 1000 czesci objetosciowych octanu etylu. Mieszanine wstrzasa sie w rozdzielaczu, od¬ dziela warstwe wodna, a warstwe octanu etylu 30 dwukrotnie przemywa 300 czesciami objetosciowy¬ mi wody, suszy nad bezwodnym^ siarczanem sodu, zateza i pozostawia w spoczynku.Wytracone krysztaly P-4 odsacza sie i suszy (0,950 czesci P-4). Czystosc otrzymanych kryszta- 35 lów P-4 wynosi 92% wagowe, a temperatura top¬ nienia 177 do 179°C.Przyklad V. 40 czesci objetosciowych pozyw¬ ki posiewowej (1% glukozy ,2,0% Bactotryptonu, i 1,2% ekstraktu drozdzowego Bacto, pH 7,0) wle- 40 wa sie do kolby Erlenmayera o pojemnosci 200 czesci objetosciowych.Po sterylizacji pozywke szczepi sie Nocardia sp. nr C-15003 (IFO 13726). Zaszczepiona pozywke in- kubuje sie w temperaturze 28°C na wstrzasarce 45 obrotowej (200 obrotów na minute), uzyskujac ho¬ dowle posiewowa. Komórki w hodowli przemywa sie trzykrotnie sterylizowana woda destylowana i przemyte komórki ponownie zawiesza w steryli¬ zowanej wodzie destylowanej w objetosci równej 50 poczatkowej objetosci brzeczki. Jedna czescia ob¬ jetosciowa tej zawiesiny szczepi sie 40 objetosci podstawowej pozywki hodowlanej, skladajacej sie z 3% skrobii rozpuszczalnej, 0,2% chlorku amono¬ wego, 0,05% siarczanu magnezu, 1,09% dwuwodo- 55 rofosforanu.potasu, 2,09% wodorofosforanu potasu, 0,001% siarczanu zelazawego i 0,3% estru metylo¬ wego leucyny. Fermentacje prowadzi sie w ciagu 8 dni na wstrzasarce obrotowej (200 obrotów na minute) w temperaturze 28°C. 60 Calkowita ilosc wytworzonego antybiotyku C- -15003 wynosi 12 [Jig/ml, a udzial skladnika P-4 w tej ilosci wynosi 80% (wagowych).Przyklad VI. 40 czesci objetosciowych po¬ zywki posiewowej (1% glukozy, 2% Bactotryptonu 65 ' i 1,2% ekstraktu drozdzowego Bacto, pH 7,0) wie-15 122 365 16 wa sie do kolby Erlenmeyera o pojemnosci 200 czesci objetosciowych.Po sterylizacji pozywke szczepi sie Nocardia sp. nr C-15003 (IFO 13726). Zaszczepiona pozywke in- kubuje sie w temperaturze 28°C na wstrzasarce obrotowej (200 obrotów/minute), uzyskujac hodowle posiewowa. Komórki w hodowli przemywa sie trzykrotnie sterylizowana woda destylowana i prze¬ myte komórki zawiesza w sterylizowanej wodzie destylowanej w objetosci równej poczatkowej ob¬ jetosci brzeczki. Jedna czescia objetosciowa tej za¬ wiesiny szczepi sie 40 objetosci podstawowej po¬ zywki hodowlanej, skladajacej sie z 3% skrobi roz¬ puszczalnej, 0,2% chlorku amonowego, 0,05% siar¬ czanu magnezu, 1,09°/© dwuwodorofosforanu pota¬ su, 2,09% wodorofosforanu potasu, 0,001% siarcza¬ nu zelazawego i 0,3% N-metyloamidu lefucyny.Fermentacje prowadzi sie w ciagu 8. dni na wstrza¬ sarce obrotowej (200 obrotów na minute) w tem¬ peraturze 28°C.Calkowita ilosc wytworzonego antybiotyku C- -15003 wyncsi 12 ng/ml a udzial skladnika P-4 w tej ilosci wynosi 80% wagowych).Przyklad VII. 40 czesci objetosciowych po¬ zywki posiewowej (1% glukozy, 2% Bactotryptonu i 1,2% ekstraktu drozdzowego Bacto, pH 7,0) wle¬ wa sie do kolby Erlenmeyera o pojemnosci 200 czesci objetosciowych.Po sterylizacji pozywke szczepi sie Nocardia sp. nr C-15003 (IFO 13726). Zaszczepiona pozywke in- kubuje sie w temperaturze 28°C na wstrzasarce obrotowej (200 obrotów/minute), uzyskujac hodo¬ wle posiewowa. Komórki w hodowli przemywa sie trzykrotnie sterylizowana woda destylowana i przemyte komórki zawiesza ponownie w steryli¬ zowanej wodzie destylowanej w objetosci równej poczatkowej objetosci brzeczki. Jedna czescia ob¬ jetosciowa tej zawiesiny szczepi sie 40 objetosci podstawowej pozywki hodowlanej, skladajacej sie z 3% skrobi rozpuszczalnej, 0,2% chlorku amono¬ wego, 0,05% siarczanu magnezu, 1,09% dwuwodo¬ rofosforanu potasu, 2,09% wodorofosforanu potasu, 0,001% siarczanu zelazawego i 0,3% a-ketoizoka- pronianu leucyny. Fermentacje prowadzi sie w cia- 10 15 20 35 40 gu 8 dni na wstrzasarce obrotowej (200 obrotów na minute) w temperaturze 28°C.Calkowita ilosc wytworzonego antybiotyku C- -15003 wynosi 12 ^g/ml, a udzial skladnika P-4 w tej ilosci wynosi 80% (wagowych).Przyklad VIII. 40 czesci objetosciowych po¬ zywki posiewowej 1% glukozy, 2% Bactotryptonu. i 1,2% ekstraktu drozdzowego Bacto, pH 7,0) wle¬ wa sie do kolby Erlenmeyera o pojemnosci 200 czesci objetosciowych.Po sterylizacji pozywke szczepi sie Nocardia sp'. nr C-15003 (IFO 13726). Zaszczepiona pozywke in- kubuje sie w temperaturze 28°C na wstrzasarce obrotowej (200 obrotów/minute), uzyskujac hodo¬ wle posiewowa. Komórki w hodowli przemywa sie trzykrotnie sterylizowana woda destylowana i przemyte komórki zawiesza ponownie w steryli¬ zowanej wodzie destylowanej w objetosci równej poczatkowej objetosci brzeczki. Jedna czescia ob¬ jetosciowa tej zawiesiny szjczepi sie 40 objetosci podstawowej pozywki hodowlanej, skladajacej sie z 3% skrobii rozpuszczalnej, 0,2% chlorku amono¬ wego, 0,05% siarczanu magnezu, 1,09% dwuwodo¬ rofosforanu potasu, ,209% wodorofosforanu potasu 0,001% siarczanu zelazawego i 0,3% chlorowodor¬ ku leucyny. Fermentacje prowadzi sie w ciagu 8 dni na wstrzasarce obrotowej (200 obrotów/mi¬ nute) w temperaturze 28°C.Calkowita ilosc wytworzonego antybiotyku C- -15003 wynosi 12 ng/ml, a udzial skladnika P-4 w tej ilosci wynosi 80% (wagowych).Zastrzezenie patentowe Sposóla wytwarzania nowego antybiotyku C- -15003 P-4 o wzorze 1, w którym R oznacza grupe o wzorze 3, znamienny tym, ze prowadzi sie ho¬ dowle mikroorganizmu Nocardia sp. nr C-15003 (IFO, 13726), zdolnego do wytwarzania antybiotyku C-15003 P-4, w pozywce zawierajacej przyswajalne zródla Wegla i azotu, a ponadto zawierajacej jako substancje dodatkowa leucyne i/lub jej pochodne w ilosci 0,01—1,0% wagowo/objetosciowych.Cl CK? chjoOJkC. <1 1 ff CH5 R CKii [ho OCH, i-t^i rcH, H u -CO-CH CH3 CH, -C0-CHrCH \ ,CH, CH3 is/zor wzór 2 wzór 3 ZGK Oddz. 2, zam. 7262-83 — 80 egz.Cena 100 zl PL PL PL PL PL PL