Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku C—15003 P—3.Antybiotyk C—15003 P—3 (dalej oznaczany skró- teim „P—3") jest nowym zwiazkiem, otrzymywanym w hodowli mikroorganizmu rodzaju Nocardia, wy¬ odrebnionego ze zródel naturalnych.Powyzszy mikroorganizm hodowany w pozyw¬ kach konwencjonalnych wytwarza równoczesnie kilka skladników antybiotyku C—15003. Wydzie¬ lenie kazdego ze skladników z brzeczki fermen¬ tacyjnej wymaga stosowania bardzo skomplokowa- nych operacji, co nieoM^Tonnie prowadzi do malej wydajnosci pozadanego skladinilka.Na podstawie przeprowadzonych szerokich ba¬ dan nad wybiórczym wyodrebnianiem skladnika P—3 stwierdzono, ze skladnik ten mozna wytwa¬ rzac z duza wydajnoscia, w stosunku do sumy skladników antybiotyku C—15003, jezeli stosuje sie pozywke hodowilana o specjalnym skladzie.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku C—15003 P—3, w którym hodowle mikroorganizmu rodzaju Nocardia, zdol¬ nego do wytwarzania antybiotyku C^15003 P^3 (dalej zwanego szczepem wytwarzajacym antybio¬ tyk C^H15003 P—3) parowajdza sie w pozywce zawie¬ rajacej waline, kwas izomaslowy i/liutó pochodne tych zwiazków, dziejki czeimiu uzyskuje sie wybiorcza wytwasrzanei antybiotyku C—15O03 P—3, który wy¬ odrebnia sie z brzeczki fermentacyjnej.Termin antybiotyk C—15003" lub „C—15003" oznacza zwiazki o wzorze 1, w którym R oznacza rodnik —COCH2CH3, —COCH2CH2CH3 lub rodnik o wzorze 2 lub 3 jako grupe, mieszanine dwóch lub trzech tych zwiazków lub pojedynczy zwiazek z tej grupy.Zwiazek o wzorze 1, w którym R oznacza rodnik —COCHaCH3 nazywa sie „antybiotykiem C—15003 P—2" lub „P—2", zwiazek z rodnikiem ^COCH2CH2CH3 „antybiotykiem C^15003 P^3" fljub „P—3", zwiazek z rodnikiem o wzorze 2 „antybio¬ tykiem C^15003 P—3" lub „P^3", a zwiazek z iicdriikfteim o wzorze 3 „antybiotykiem C—15003 P_4» lub „P^T.Jako przyklad szczepiu wytwarzajacego anty¬ biotyk C—15003 P^3 mozna wymienic szczep acti- nomyceite nr C—15003 (dalej czasami nazywany skrótowo „szczep C—15003"), który zostal wyodreb¬ niony z gleby i innych materialów w skriningo- wych poszukiwaniach mikrooinganizmów wytwarza¬ jacych antybiotyki.Mikrobiologiczna charakterystyke szczepu nr C—'15003 badano sposobami analogicznymi do za- pronowanych przez Scihirliinga i GottMefoa (Interoa- tionad Jounnal of Systematic Racteriology 16, 313— —340 /1966). Wyniki obserwacji prowadzónyc w 28°C w ciagu 21 dni sa nastepujace: 1) Charakterystyka morfologiczna. Grzybnia we- 30 geitatywna rozprzestrzenia sie dobrze i rozwija w 10 15 20 25 122 4633 122 463 4 odgalezienia, zarówno., na agarze jak i w pozywce cieklej.Wiele sposród strzepków jest srednicy 0,8 do 1,2 ^m, a w pewnych przypadkach moga sie orne dzie¬ lic na fragmenty przypominajace bakterie palecz- koiwe lub strzepki rozgalezione o malej dlugosci.Szczep dobrze wzrasta na róznych pozywkach ta¬ ksonomicznych. Grzybnia powietrzna naklada sie na grzybnie wegetatywna, choc czesto formuje two¬ ry podobne do koremii (50—200 X 200—1000 |wm), na których nastepuje daJLszy wzrost powietrzny.Liczne sposród girzybmi powietrznych sa krete, odrczasu do czasiu iniapotyka sie konfiguracje pro¬ ste lub* w postaci luznych spirali. Mikroskopowe batalia starszych hodowli wykazuja, ze tylko w nielicznych przypadkach komórki koreimtiopodjobne wyptejpiuja w -lancuchach, *na/tomilas.t zawiesiny ko- móJrfeOiwe otrzymane z powderzohni takich hodowli w badaniach rniikroskopowych wykazuja obecnosc wieilu tworów przypoirninajacych arifcrospory, o ksztalcie elipsy (0,8—1,2 jum X 1,0—2,0 \n) lub wy¬ dluzonej elipisy (0,8—1,2 jmi X 4,8—6,8 |iim). Obser¬ wacje pod mikroskopem elektronowym wykazuja, ze twory te maja gladkie powierzchnie. 2) Skladniki komórek. Szczep hodowano na trze- sawce w zmodyfikowanej pozywce ISP nr 1, w 28°C, w ciagu 66—00 godzin, a po zakonczeniu ho¬ dowli komóniki zbierano i plukano. Sposobami B.Beckera i innych (Applied Microbdiology 12, 421 /l964) i M. P. Leohevaliera (Journail of Laiboraitory arud Clinical Medicine 71, 934 /1968) powyzsze cale komórki badano na kwas dwiuamnnopimeiinowy i sklad cukrów.Stwierdzono, ze kwas dwuaminopimeOliinowy wy¬ stepuje w postaci mezo, a sposród cukrów wystepu¬ je galaktoza i araibinoza. 3) Charakterystyka na pozywkach taksonomicz¬ nych. Szczep wykazuje stosunkowo djofbry wzrost na róznych pozywkach. Grzybnia wegetatywna jest bezbarwna lub barwy jasnozóltej w poczatkowej fazie hodowli ,a w dalszych fazach barwy jasmo- zóltawobrazowej do zóltawotorazowej. Szczep wy¬ twarza, w róznych pozywkach taksJoriomicznych, rozpuszczalne pigmenty zólte do zóltawobrazowych.Grzybnia powietrzna jest proszkowata i zwykle daje umiarkowany wzrost. Charakterystyka szczepiu w róznych pozywkach taksonjomiaznych jest przed- .stawiiona w tablicy 1.Tablica 1. Charakterystyka hodowlana szcze¬ pu nr C—15003 w pozywkach taksonomicznych (A) Agar sacnarc^owo-azotanowy Wzrost (G): 'umiarkowany, barwy jasnozóltej-imelo- noweij (3 ia)* ido baijrsztynowobrazoweij (3 lc)*, for¬ muja sie twory koremijopodobne Grzybnia powietrzna (AM): skapa, barwy bialej Rozpuszczalny pigment (SP): brak lub jasmozólta- wobrazowy (B) Agar glicerynowe-azotanowy G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniowej (2 iOa)*;ifonmuja sie twory koremiopodobne AM: umiarkowana, barwy bialej SP: brak 15 (C) Agar glukozowo-asparaginowy G: omiarkowany, barwny nagietka (3 pa)* do jasno¬ zóltej (2 pa)* AM: skapa, barwy bialej 5 SP: jasmozólty (2 pa)* (D) Agar gliicerynowo-asparaginowy G: umiarkowany, barwy jasnej kosoi sloniiowej (2 ca)*; formuja sie twory kojremiopodobne AM: skapa, barwy bialej 10 SP: brak (E) Agar skrobiowy G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniiowej (2 ca)* do jasnopszenicznej (2 ea)*; ifiorimuja sie twory koremiopodobne AM: obfita, -barwy jasnej kosci sloniowej (2 ca)* SP: brak (F) Agar odzywczy G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniowej (2 20 ca)* do jasnopszenicznej (2 ea)*; formaija sie twory koremiopodobne AM: obtfiita, ibarwy jasnej kosci sloniowej (2 ca)* SP: brak (G) Agar z jablezanem wapnia 25 G: umiarkowany, barwy jasnej (kosci sloniowej (2 ca)x do jasnopszenicznej (2 ea)x; formuja sie twory koreimiopodobne AM: umiarkowana, barwy bialej do jasnej kosci sloniowej (2 ca)* 30 SP: brak (H) Agar z ekstraktem dirozdzowym i slodowym G: umiarkowany, barwy burszytnowe (3 lc)* do jasnozóltej (3 la)*, formuja sie twory koremiopo¬ dobne 35 AM: umiarkowana, barwy bialej do jasnej kosci sloniowej (2 ca)* SP: brak (1) Agar z maka owsiana G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniiowej (2 40 ca)* do zólcieni kolonialnej (2 ga)*, formuja sie twory koremiopodobne AM: skapa,, barwy bialej do jasnozóltej SP: brak (J) Agar z peptonem, ekstraktem drozdzowym 45 i zelazem G: lumiarkowany, barwy zólceini kolonialnej (2 ga)* AM: brak SP: zólcien kolonialna (2 ga)* (K) Agar tyrozynowy G: umiarkowany, barwy jasnej kosci sloniowej (2 ca)* dc jasnej zólcieni melonowej (2 ea)*; formuja sie twory korernLopjodoibne AM: umiarkowana, barwy bialej do jasnej kosoi sloniowej (2 ca)* SP :wiielibladzi (3 ie)* * Kod barwy wedlug Color Harmony Manual, wydanie czwarte (Container Coapbriation of Ameri¬ ca, 1958) 60 4) Charakterystyka fizjologiczna. Charakterystyke fizjologiczna szczepu przedstawiono w tablicy 2.Zakres temperaitury dla wzrostu: 12—38°C. Zakres temperatury, w którym wystepuje dobry wzrost po- •5 wietrzny na agarze (ISP nr 2) wynosi 20 do 36°C. 50122 463 Tablica 2. Charakterystyka fizjologiczna szczepu inr C^150O3 zaikres temperatury dla wzrostu: 12 do 38°C zakres temperatury dlia wzrostu powietrznego: 20 do 35°C uplynnianie zelatyny: dodatnie hydroliza skrobi: dodatnia redukcja azotanów: dodatnia peptiomizacja m'leka: dodatnia koagulacja mleka: ujemna roizklad kazeiny: dodatni produkcja pigmentów ujeimnia (agar z peptonem, ekstraktem drozdzo¬ wym i zelaizem) dodatnia (agar tyrozymowy) rozklad tyrozyny: dodatni rozklad ksantyny: ujeimny rozklad hipoksantyny: ujemny tolerancja na lizozym: dodatnia tolleriancja na chlorek sodu: 2% 5) Utylizacja zródel wegla/Utylizacje zródel wegla badano stosujac pozywke opisana przez Prodhama i Gottlieba .(Journal of Bacterioiogy 56, 107/1948) i pozywke podstawowa o tym samym skladzie + + 0,1% ekstraktu drozdzowego. Otrzymane spe¬ ktrum poizeidstawiono w 'tablicy 3.Tablica 3. Utylizacja zródel wegla przez szczep nr C^15003 Zródlo wegla | Wzrost D-ksyljoiza + ++* L-arabimoza I + + D-giukaza ++ + + D-galaktoza + + D-fruktoiza + + + +¦+ L-T,aimnoEa + + D-mannoza + + + +¦+ sacharoza ++ +i+ laktoza — — maltoza ± + trehaloza + + +* rafiiinoza ± ± me/liibioza + + i-inozytoi — — D-sorbit — D-mannit +¦+ ++ gliceryna — + skrobia rozpuszczalna + + kontrola (bez dodatku) | — * pozywka podstawiowa z 0,1% dodatkiem ekstira- ktu drozdzowego Skala ocen: + +:+: bujny wzrost + + : dobry wzrost + : wzrost ±: slaby wzrost —: brak wzrostu 6) Dalsza charakterystyka. Komórki zbierano spo¬ sobem opisanym w punkcie 2), a DNA preparowa¬ no sposobem analogicznym do opisanego przez Jf 20 25 Marmura i innych (Journal of Molecular Biology 3, 208, 1961). Znaleziona zawartosc G—C (guandiny- -cytozyny) w DNA wyniosla okolo 71% mollowych.Barwienie grzybni wegetatywnej wedlug Grama: 5 dodatnie Powyzsza charakterystyke szczepu nr C—15003 porównano z opisami przedstawionymi w mono¬ grafiach S. A. Waksman: „The Acftrinomycetes" Vol. 2 (The Williaims and WiOitoins Q., 1961); R. E. io Buchanan i N. E. Giibbons: .,Bergey's Mantual of Deftarminiative Bacteriology", wydanie 8, 1974; i w innej literaturze.Przyjeto, 'ze szczep nalezy do ignupy III rodzaju Nocairdia; poniewaz posród znanych nie znaleziono 15 szczepu o wyzej przedstawionej charakterystyce, wyciagnieto wniosek, ze C—15003 jest mikrooirgand- zimem nowego gaitunku.Szazejp nr C-15003 zlozono w Fermentation Rese¬ arch Insititute, Agemcy of Industrial Science and Tecihnology (FERM), Japonia, z numerem depozy- cyjnyim FERM—P nir 3992; w The Institiute for Far- menAation, Osalka (IFO), Japonia, pod numerem IFO 13726; oraz w The American Type Cultiure Collec- tion (ATCC), Maryland, U.S.A. pod numerem ATCC-312ai.Walina i kwas izomaslowy, stosowiane w wyna¬ lazku jako idodatki, moga byc wprowadzane w po¬ staci pochodnych. Przykladami takich pochodnych sa estry, jak estry (alkilowe o 1 lub 2 atomach we¬ gla w rodniku estrowym (np. ester metylowy lub etylowy), amidy lub alkifloarnidy, majace w rod¬ niku alkilowym 1 lub 2 atomy wegla (np. N-mety- loamid 'lub Nnetyloamid), ketokwasy (np. kwas a-ketoiziowalenianowy) oraz sole powyzszych zwiaz¬ ków, jak chiowodoirki, sole sodowe, potasowe lub wapniowe. Walina moze byc stosowana w positacd D, L lub DL. Jako dodatki mozna stosowac mie¬ szaniny walimy, kwasu izomaslOwego i/lub ich po¬ chodnych.Powyzsze dodatki dodaje sie do pozywki w ilosci 0,01 do 1,0, korzystnie 0,1 do 05% wagowych w ofbjetoscli, w jakimkolwiek etapie hodowli Nocardia sp. nr C—15003, korzystnie w jej etapie poczatko¬ wym.Jako pozywke do hodowli szczepu wytwarzaja¬ cego antybiotyk C^15003 P—3 mozna stosowac ja¬ kakolwiek pozywke plynna lub stala, zawierajaca skladniki odzywcze, które szczep moze zaizytkowy- wac.W produkcji na duza skale stosuje sie zwykle pozywki plynne. Pozywka moze zawierac suibstan- ' cje dodatkowe stosowane w sposobie wedlug wy¬ nalazku, zródla wegla i azotu, feinmenitowaine i pnzyswajiame przez szczep nr C—15003, substancje nieorganiczne, pozywki sladowe dtp. Jako przykla¬ dowe zródla wegla mozna wymienic glukoze, lakto¬ ze, sacharoze, maltoze, dekstryne, skrobie, glicery¬ ne, mannit, sorbit itp., tluszcze i oleje (np. olej so¬ jowy, olej smalcowy, olej kurzy) itp. 60 Zródlem azotu moze byc np. ekstrakt miesny, ekstrakt drozdzowy, drozdze suszone, maka sojowa, namok kukurydziany, pepton, maka z nasienia ba¬ welny, melasa, mocznik, sole amonowe (np. siar¬ czan amonu, chlorek 'amonu, azotan amonu itp.), 35 azotany (np, azotan sod/ii, azotan potasu). 35 40 45 50 557 122 463 8 Pozywka imoze równiez zawierac sole sodu, pota¬ su, wiapinda, magnezu, zelaza, manganu, cynku, ko¬ baltu, milkfliu i ftp., sole kwasu fosforowego, kwasu borowego itp., wiiitaimdny (np. Bi, B2, kwas nikoty¬ nowy, Bi2, C, E itp.), kwasy nukleinowe (mp. pury- ne, piryimidyne i ich pochodne) oraz dinne substan¬ cje. Do fcoryigowanda pH srodowiska mozna stoso¬ wac kwas nieorganiczny i/Mo aimontiak lub wodo¬ rotlenki metali alkalicznych. Jezeli to jest pozada¬ ne ,mozna równiez dodawac oleje i tluszcze, srodki powierzchniowo czynne i srodki przeoiwpienine.Hodowle mozna prowadzic stacjonarnie, na trze- sawce, aerobowo, podpowieirzchniiowo i w innych warunkach. W skali wielikoprodukcyjnej korzystna jest oczywiscie hodowla aerobowa, podpowierzch- niowa. Wanunki hodowli zaleza oczywiscie od wa¬ runków fermentacji i skladu pozywki, uzytego szczepu, sposobu prowadzenia hodowli i innych czynników.ZfwyMe korzysitnie jest pirowadizic inkubacje w 20 do 35°C przy poczatkowej wartosci pH okolo 5,5—8,5, zwlaszcza w 23 do 30° przy poczatkowej wartosci pH 6,5—75. Czas prowadzenia hodowli równiez zmienia sie iw zaleznosci od .wyzej wymie¬ nionych czynników.Zaleca sie prowadzenie hodowli do uzyskania maksymalnej aktywnosci P^3. W hodowli na trze- sawce lub aerobowej (podpownerzlchniowe^ w po- zywice cieklej wymagany czas wynosi zwykle od okolo 48 do 240 godzin.Ponizsze jest konkretnym przykladem sposobu 10 15 20 30 wytwarzania P—3. Szczepem nr C—15O03 inokulb- wano pozywke hodowlana puszczalnej skrobi, 0,2% chlorku amonu, 0,05% siarczanu magnezu, 1,09% dwuwodoirofostfiaranu po¬ tasu, 2,09% wodorofosifonanu potasu, 0,001% siar¬ czanu zelazawego i substancje dodatkowe lufo po¬ zywke hodowlana (II) zawierajaca 5% deksitryny, 3% namoku kukurydizianego, 0,1% peptonu, 0,5% weglanu wapnia i substancje dodatkowe. Hodowle prowadzono w 28°C w ciagu 144 godzin na trzesa- wce obrotowej (200 obrotów na minute) lub w fer- rnentorze.W tablicach 4 i 5 przedstawiono wyniki uzyska¬ ne przy stosowaniu pozywek (I) i (II).Aktywnosc C—15003 oznaczano metoda krazków bibuly, stosujac Talaromyces avelHaneus IFO 7721 jako orgamizim testowy. W oznaczeniach stosowano pozywke zawierajaca 3,5 g wodoroifostoranu sodu, 0,5 g dwuwodorofosforanu potasu, 5 g ekstraktu drozdzowego (Dlrfico, USA), 10 g glukozy, 15 g aga¬ ru i 1000 ml idestylowanej wody (pH 7,0). Oznaczen nagromadzonego w brzeczce P—2, P—3 i P—4 dokonywano jak nastepuje: Brzeczke fermentacyjna eksttaahowano octanem etylu w objetosci równej objetosci brzeczki. War¬ stwe rozpuszczalnika odparowano, a pozostalosc wysuszono. Wysuszony material rozpuszczono w octanie etylu, w objetosci równej 1/1O0 objetosci wyjsciowej brzeczki. Pirodukty rozwinieto na plycie do chromatografii cienkowarstwowej, powleczonej zelem krzemionkowym (silica-gel ©OF^, Menck, Tablica 4 Substancja dodana nie dodano L-walina L-walina L-walina D-wallima izomaslan sodu Ilosc PL PL PL PL PL PL