PL127198B1 - Diagnstic agent for determining protheolytic enzymes andmethod of obtaining idoxyl and thioindoxyl esters of amino acids and peptides - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest srodek diagnostycz¬ ny do 'Oznaczania proteolitycznych enzymów i spo¬ sób wytwarzania estrów indoiksylowyeh i tioindo- ksylowych aminokwasów i peptydów.Oznaczanie leukocytów w plynach ustrojowych, szczególnie w moczu, zajmuje wybitne miejsce w diagnostyce schorzen nerek i ukladu moezowo- -plciowego. Dotychczas oiznacizanie to prowadzi sie przez zmudne liczenie leukocytów w niewirowa- nym .moczu albo w osadzie moczu.Wspólna cecha obydwu metod jest oczywiscie to, ze zostaja uchwycone tylko nieusizkodzoine leukocy¬ ty. Z drugiej strony wiadomo, ze szybkosc rozpadu leukocytów, zaleznie od srodowasika', ulega ogrom¬ nym wahaniom i talk np. w moczach silnie alkali¬ cznych nalezy liczyc sie z okresem póltrwania leu¬ kocytów wynoszacym tylko 60 minut. Zbyt niskie liczby leukocytów wzglednie przy dluzszym czasie stania moczu sa powodem nawet falszywie nega¬ tywnych stwierdzen.Pomijajac blad rozpadu, mikroskopowe ilosciowe oznaczanie leukocytów w niewirowarnymi, shomoge- nizowanym moczu w hemocytome'trze daje rzeczy¬ wiscie niezawodne wartosci. Jednak w praktyce metode te stosuje sie rzadko, gdyz jest ona klo¬ potliwa, meczaca i czasochlonna oraz wymaga wy- sizkolonegio personelu.Przewazajaca wiekszosc oznaczen leukocytów w moizcu przeprowadza sie w praktyce medycznej wedlug tak zwanego pola widzenia w osadzie mo- 10 15 20 3Q czu. W tym celu nalezy najpierw uzyskac przed¬ miot badania (osad) przez wirowanie. Przy tym jednak zostaja wzbogacone równiez inne skladniki .moczu, które — jak np. sole oraz komórki na¬ blonkowe — moga znacznie utrudnic mikroskopo¬ we policzenie leukocytów.Wahajaca sie zawartosc osadu, niejednorodnosci osadu jak równiez moze rózne powiekszenia mik¬ roskopowe albo rózne wyposazenie optyczne mi¬ kroskopów prowadza do tego, ze te zwykle dane o liczbie leukocytów w mikroskopowymi polu wi¬ dzenia moga byc obciazone bledami klikuiset pro¬ cent.Dlatego zadaniem wynalazku jest opracowanie takiego srodka diagnostycznego, za pomoca którego mozna oznaczyc leukocyty w plynach ustrojowych w sposób prosty i latwy do wykonania oraz moz¬ liwie szybko i calkowicie.Jako podstawe oznaczania dla takiego testu leu- kocytowegfo .zaproponowano reakcje enzymatyczna, poniewaz leukocyty posiadaja szeroki zakres dzia¬ lania enzymatycznego.W opisie patentowymi Stanów Zjedn. Ameryki nr 3087,704 opisano juz i zastrzezono oznaczanie leuklocytów, które prowadzone jest przez obecna w granuloicytowych leukocytach nadtlenkowa ak¬ tywnosc. Chlonny nosnik, który jest zaimpregno¬ wany nadtlenikiem wodoru i organicznym wskazni¬ kiem, przykladowo o-tolidyna, wykazuje obecnosc leukocytów przez tworzenie barwnego produktu 127 1983 127 198 4 utlenienia Taki test posiada jednak zdecydowane wady: po pierwsze nadtlenkowe reakcje przy za- stosowandiu .prtolidyny posiadaja ogólnie wobec re¬ dukujacych substancji w moczu, jak np. wobec kwasu askorbinowego, znaczna sklonnosc do zakló- t cen. Poiza tym liczne pozycje literaturowe np. L./ ^MiSMAj^M^d. Welt 23, 399 (197(2), wskazuja na nie- trwalosepero&sydazy leukocytowej w srodowisku moczu, która prowadzi do falszywie negatywnych stwierdzen. Jeszcze bardziej utrudniajaca jest nie¬ dostateczna selektywnosc tego teistu wiobec ery¬ trocytów.Od kilku lat w hdsto- i cytOiGhemLaznej enzymo- logii swoje stale miejisce ,maja metody oznaczania, które polegaja na esterolityicznej aktywnosci enzy¬ mów obecnych w oznaczanych ukladach (porównaj np. A.G.E. Pearse, Histocheimistry, Theoretical and Applied). W zasadzie stosuje sie tu bezbarwne albo slabo zabarwione estry, które przez enzymatyczne rozszczepienie rozkladaja sie najczesciej na bez¬ barwny skladnik kwasowy i równiez bezbarwny skladnik alkoholowy (fenolowy). Ostatni ulega dalej reakcji nastepujacej po enzymatycznym zmydlemiu do barwnych produktów jak np. sprzeganie z so¬ lami dwuazomijowyrni albo reakcje utleniajace.Tak F. Schimalzl i H. Braunsteiner opisuja przy¬ kladowo w Klin. Wschr. 46, 642 (1968) specyficzne cytochemiczne oznaczanie esterazy leukocytów na¬ ftole-AS-D-chlorooctaneim jako substraktem i sola dwuazoniowa w celu utworzenia barwnego zwiaz¬ ku aziowego.Dla srodka diagnostycznego do szybkiego zwiaz¬ ku oznaczania leukocytów w plynach ustrojowych, jak rup. w moczu, uklady dwuskladnikowe okazaly sie nieodpowiednie, poniewaz., jak wiadomo, wiele . zwiazków wystepujacych w moczu, jak uriobilino- gen, stereobilinogen, bilirubina i inne, reaguja z so¬ lami dwuazoniowytmi. Poza tym oznaczanie to jest za malo czule, na przyklad próby z 5:00i0 leukocy- tów/|il nie wykazuja reakcji.W brytyjskim opisie patentowym nr 1128371 opisano i zastrzezono diagnostyczny .srodek do oz¬ naczania hydrolltycznych enzymów w plynach ust¬ rojowych. W przypadku tym chlonny nosnik na¬ syca sie bezbarwnymi estrami indoksylowymi lub ^tioindoksylowymi oraz ewentualnie buforem i srod¬ kiem utleniajacym.W przypadku obecnosci hydrolitycznych enzymów powstaja z estrów wolny indoksyl albo tioindoksyl i z nich przez dzialanie tlenu powietrza albo srod¬ ka utleniajacego o glebokiej barwie indygo lub tio- indygo. Zwiazków zastrzezonych w tym patencie nie mozna uzyc do testu leukiocytowego, gdyz same one z 10000 leukocytów/^! nie wykazuja reakcji.Tak wiec do dzisiaj nie ma w handlu pasków te¬ stowych, które pozwola w sposób prosty i szybki oznaczyc leukocyty, chociaz oznaczanie leukocytów w moczu nalezy do najczesciej przeprowadzanych badan klinicznych.'(Nieoczekiwanie stwierdzono, ze trwale i szybko wskazujace srodki diagnostyczne, za pomoca któ¬ rych dobrze oznacza sie leukocyty w plynach ust¬ rojowych, otrzymuje sie, jesli jako substraty do oznaczania esteraz (proteaz) wystepujacych w obo- jetnochlgnnych leukocytach—granulocytach zasto¬ suje sie estry indoksylowe albo tioindoksylowe ami¬ nokwasów lub peptydów.Poza tym okazalo sie, ze substraty te nadaja sie równiez doskonale do ogólnego oznaczania prioteo- 5 litycznych enzymów, jak np. elastazy, chymotryp- syny adibo trypsyny w czystych roztworach wod¬ nych albo takze w plynach ustrojowych jak np. osoczu,- surowicy, plynie, wydzielinie trzustki albo .. w wodnych ekstraktach stolca.Przedmiotem wynalazku jest zatem srodek dia¬ gnostyczny dio oznaczania enzymów, zwlaszcza do odznaczania w plynach ustrojowych proteaz obecnych w leukocytach, w postaci chlonnego nos¬ nika, warstwy folii, mieszanki proszkowej, liofili- 15 zatu, roztworu albo tabletki odczynnikowej, za¬ wierajacy jeden albo kilka chromogienów oraz od¬ powiednia substancje buforowa i kazdorazowo zwykle substancje dodatkowe, charakteryzujacy sie tym, ze jako chromogeny zawiera estry indoksylo- 20 we i/albo tioindoksylowe aminokwasów i/albo pe¬ ptydów o wzorze ogólnym 1-, w którym Ri, R2, R8, R4 sa takie same lub rózne i oznaczaja kazdorazo¬ wo atom wodoru albo chlorowca, niska grupe al¬ kilowa, niska grupe alkoksylowa, grupe arylowa, 25 aryloalkilowa, aryloaiklolksylowa, grupe hydroksy¬ lowa, karboksylowa, grupe kariboksy-miskoalkolksy- lowa, arylioalkoksykarbonyioiwa, aryloalkoksykarbo- nylo-niskoalkoksylowa, grupe nitrowa, albo niska grupe acyloaiminowa, albo kazdorazowo dwa sa- 30 siadujace podstawniki oznaczaja ewentualnie pod¬ stawiona atomem chlorowca dolkondensowana resz¬ te benzenowa, X oznacza atom siarki albo grupe iiminowa ewentualnie podstawiona niska grupe al¬ kilowa, aryiowa, aryloalkilowa albo acylowa, A 35 oznacza grupe aiminokwasowa albo peptydowa, B oznacza zwykle stosowana w chemii peptydów gru¬ pe zabezpieczajaca azot, albo jej pochodna.Wszystkie estry indoksylowe i tioindoksylowe aminokwasów i peptydów o wzorze ogólnym 1 sa 40 zwiazkami nowymi.Przedimioteim omawianego wynalazku jest poza tym sposób wytwarzania estrów indoiksylowych i tloindoksylowych aminokwasów i peptydów o wzorze ogólnym 1. 45 W celu wytworzenia nowych estrów indoiksylo¬ wych i tioindoksylowych aminokwasów i peptydów o wzorze ogólnym 1 mozna postepowac wedlug metod znanych z chemii peptydów.Korzystnie poddaje sie reakcji w znany sposób odpowiednie zwiazki indoksylowe lub tioindoksylo¬ we o wzorze ogólnym 2, w którym Ri, R2, R8, 1R4 oraz X maja wyzej podane znaczenie, z aminokwa¬ sami i peptydami o wzorze ogólnym H—O—A-B, w którym A i B maja wyzej podane znaczenie, wzglednie z ich odpowiednimi, reaktywnymi -po¬ chodnymi.Jako reaktywne pochodne stosuje sie np. chlorki kwasowe wzglednie stosowane zwykle w syntezie 60 peptydów mieszane bezwodniki, na przyklad z chlo- romrówczanem etylu, albo aktywne estry.Zwiazki indoksylowe i tioindoksyibowe o wzorze ogólnym 2, jak równiez aminokwasy i peptydy o wzorze ogólnym HO^A—(B sa substancjami zna- 65 nymi opisanymi na przyklad przez P. Friedlaen-5 127198 6 der, w Fortscliritte der Tieerfarbenfabrikiation und verwandter Industriezweig, toim 3—120 wzglednie Houben—Weyl, Methoden der Organi;:chen Chemie, tom 1.5/1, albo mozna je wytwarzac analogicznie do znanych zwiazków.Jako chlorowiec w okresleniu Ri, R2, R« i R4 rozumie sie fluor, chlor, brom i jod, korzystnie chlor i brom.„Niska grupa alkoksylowa" w okresleniu Ri, R2, R», i R4 oraz „niska grupa alkilowa" w okresleniu Ri, R2, R, R4 oraz X zawieraja 1 do 5, korzystnie 1 do 3 atomów wegla, przy czym calkiem szcze¬ gólnie wyrózniia sie grupa metoiksylowa i mety¬ lowa.¦Pod pojeciem „grupy aryloalkoksyliowej" w okre¬ sleniu Ri, R2, Ra i R4, jak równiez pod pojeciem grupy „aryloalkilowej" w okresleniu Ri, R2, R», R4 oraz X rozumie sie np. podstawione przez reszty okisy-niskoalkilowe wzglednie niskie reszty alkilo¬ we grupy fenylów e i riaiftylowe, przy czym reszta alkilowa zawiera 1 do 5, przewaznie 1 do 3 ato¬ mów wegla. Szczególnie wyróznia sie reszta bem- zyloksylowa i reszta benzylowa.Jako „niska grupa acyloamimowa" w okresleniu Ri, R2, R« i R4 wchodza w rachube ugrupowania amidowe niskich alifatycznych kwasów karboksy- lowych o 1 do 5, przewaznia 1 do 3 atomów wegla.Szczególnie wyróznia sie reszta acetyloaiminowa.Jako „grupa acylowa" w okresleniu X wchodza w rachube reszty alifatycznych kwasów karboksy- lowych o 1 do 5, przewaznie 1 do 3 atomach weg¬ la, albo takze aromatycznych kwasów karboksy- lowych, jak na przyklad kwasów benzoesowego albo naftoesowego. Szczególnie wyrózniaja sie re¬ szty acetylowa i benzoilowa. iPod pojeciem „grupa arylowa" w okresleniu Ri, R2, R«, R4 oraz X rozumie sie przewaznie grupe fenylowa algo naftylowa.Jako „grupa aminokwasowa" w okresleniu A wchodza w rachube przewaznie reszty naturalnych a-aminokwasów w odmianie L albo D, aiibo takze w poistaci racemioznej. Szczególnie wyrózniaja sie reszty glicyny, ananiny, waliny, leucyny, izoleu- cyny, fenyloalaniny oraz tyrozyny. Ewentualnie obecne wolne grupy hydroksylowe mozna aeylowac, szczególnie acetylowac.Pod pojeciem „grupa peptydoWa" w okresleniu A rozumie sie np. dwu-, trój-, cztero- i pieciope* ptydy, szczególnie dwu- i trójpeptydy, przy czym jalko skladniki aminokwasowe .znajduja zastosowa¬ nie przewaznie wymienione wyzej aiminokwasy.Jako „stosowane w chemii peptydów grupy za¬ bezpieczajace azot" w okresleniu B rozumie sie grupy acylowa, oksykarbonylowa, tiokarbonylowa, sulfonylowa, sulfenylowa, winylowa, cyklohekiseny- lowa, fosforytowa albo karibomylowa.Stosowano w srodku wedlug wynalazku jako chro¬ mogeny estry indoksylowe ailbo tioindoskyllowe ami¬ nokwasów i peptydów o wzorze ogólnym 1 uzywa sie w stezeniach od 10-4 do 1 mola/litr, przewaz¬ nie 10'—* do ID-1 mola/lita: roztworu impregnacyj¬ nego, masy pokryciowej albo przeznaczonego do badania plynu.Dalszym skladnikiem srodka diagnostycznego do oznaczania proteolitycznych enzymów, a szczegól¬ nie proteaz leukocytów, jest odpowiedni uklad bu¬ forowy. Wchodza tu w rachube np. bufor fosfo¬ ranowy, baranowy, barbituran owy, trój-/hydroksy- lo/-aminometain/=tris/, 2i-ammo-(2Hmetylopropano- diod-l,3l/^amedii PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.