Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia prekursora insuliny.W ciagu ostatnich kilku lat doko-riano róznorod¬ nych prób syntetycznego lub pólsyntetycznego wy¬ twarzania insuliny. Insulina jest czasteczka o dwóch lancuchach peptyidowych, lancuchu A zawieraja¬ cym 21 reszt aminokwasowych i lancuchu B za-* wiernajacym 30 reszt amiiiiokwasowych. Lancuchy te zawieraja trzy mostki dwusiarczkowe, z których kazd|y tworza dwie reszty cysternowe. Dwa mostki dwusiarczkowe lacza lancuch A z lancuchem B.Mostki tworza odpowiednie reszty przy A-6 i A-lI, i A-7 i B-7 oraz A-20 i B-19.Jedna ze znanych metod wytwarzania insuliny prowadza przez czasteczke proiirnsuliny lub typu proinsuliny. Proiriisuliina jest pojedynczym lancu¬ chem polipeptydowym, w którym N-koncowa lan¬ cucha A insuliny wiaze sie peptydem wiazacym z C-koncowa grupa lancucha B insuliny, parzy czym wiazania dwusiarczkowe lacza odpowiednie reszty cysteinowe. Np. proinsulina ludzka ma 86 reszt aminokwasowych, z których 35 tworzy peptyd wia¬ zacy. Yanaihara i inni w Diabetes 27 (Suppl. 1) 14£—160 (1978) ujawniaja synteze róznych pepty- dów laczacych i proinisuliny ludzkiej.W literaturze ujawniono inne czasteczki typu proinisulLny, pnzy czym glówna róznica w stosunku do proiinsiuliny jest budowa ugrupowania laczacego lancuchy A i B oraz miejsce tego polaczenia. 10 ii 20 25 30 Tak wiec Busse i inni w Biochemistry 15, nr 8, 1649—1657 (1976) opisuja polaczenie zawierajace dwie reszty metionylowe polaczone iich N-konco-? wymi grupami poprzez grupe karbonylowa, przy czym 0'stateczne ugrupowanie laczy sie z N-konco- wa grupa glicymowa A-l i N-koncowa grupa lizy- nowa B-29.Podobnie opisano inne ugrupowanie laczace (patrz. np. Geiger i inni,. Biochem. i Biophys. Res.Comm. 55, 60—66 (1973), Brandenburg i inni, Hoppe- -Seyler s Z. Physiol. Chem. b.d. 354, 613—627 (1973), opisy patentowe St Zjedn. Am. nr 3847893, 3907763, 3883496, 3883500 i 3884897).W kazdym z powyzszych sposobów wytwarzania insuliny prowadzacych przez pojedynczy lancuch zawierajacy lancuchy A i B polaczone okreslonym ugrupowaniem, bezposrednie polaczenie wewnetrz¬ ne nalezy prowadzic poprzez utworzenie trzech mostków dwusiarcizkowych z szesciu reszt cysterno¬ wych obecnych w lancuchach A i B. Po utworzeniu wiazania dwusiarczkowego usuwa sie oryginalne ugrupowanie laczace, wytwarzajac insuline.W celu zastosowania tego sposobu do wytwa¬ rzania insuliny bardzo pozadany jest skuteczny i latwy sposób wytwarzania prawidlowego mostka dwusiarczkowego. Na ogól znane sposoby wytwa- rmnia mostka dwusiarczkowego polegaja na utle¬ nianiu na powietrzu odpowiedniej grupy -SH. Po¬ nadto, poniewaz stwierdzono, ze grupa -SH jest nietrwala, zwykle wytwarza sie prekursor z grupa 127 843127 843 zabezpieczajaca, najczesciej ugmpowainiem S-sul- fondanowym (-SSO3-). Tak wiec sposoby literaturo¬ we wymagaja dwóch etapów, to znaczy redukcji S-sulfonrianu do grupy -SH poprzez dzialanie mer- kaptamem a nastepnie utienianda na powietrzu utworzonego zwiazku -SH.Jedyny wyjatek znany w stanie techniki w sto^ sunku do ogólnego dwuetapowego sposobu, który zastosowano jednakze do polaczenia lancuchów A i B instuliny; a nie do wytworzenia dwusiarczku z S-sulfondanowego lancucha prekursora insuliny o liniowym lancuchu, opisuje Dixon i iinini w Natu¬ re 188, 721—724 (1960), przy czym sposób ten praw¬ dopodobnie zaklada wytwarzanie insuliny poprzez polaczenie S-sulfonianów lancuchów A i B w jed¬ nym roztworze. Szczególy tego znanego sposobu podano w sposób zupelnie szkicowy a wydajnosc okreslona na podstawie czynnosci odzyskanego pro¬ duktu wynosi jedynie 1—2?/o. Pózniejsza publikacja (Dixoin^ Proc: Intern. Congr. Bndocrinal. 2nd Londyn 1964, 1207—1215 (1965) wydaje sie nieco wyjasniac szczególy tego sposobu, sugerujac w Tablicy IV, stroma 1211 dwuetapowy sposób wyma¬ gajacy beztlenowej redukcji S-sulfarl/^nu a nastepnie utleniania do dwusiarczku.Zgodnie z wynalazkiem wytwarza sie prekursor insuliny o wzorze 1, w którym R oznacza atom wo¬ doru, Y oznacza grupe o wzorze 2, w którym Z oznacza Ala lub Thr, ugrupowania od A-l do A-21 sa insuliinowym lancuchem A insuliny ludzkiej, bydlecej lub swinskiej, ugrupowania od B-l do B-30 sa insulinowym lancuchem B insuliny ludz¬ kiej, bydlecej lub swinskiej, a X oznacza ugrupo¬ wanie, które_ laczy sie z lancuchem A insuliny przy aminowej grupie A-l i z lancuchem B insuliny przy e-aminowej grupie B-29 lub karboksylowej grupie B-30, przy czym ugrupowanie to mozna che¬ micznie lub enzymaitycznie 0'dszczepic od obu lan¬ cuchów A i B bez ich rozerwania, przy czym spo¬ sób wedlug wynalazku polega na tym, ze S^sul- fonian o wzorze 3, w którym R, X i Y maja wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji z merkapta- nem.Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze merkaptan stosuje sie w ilosci dostarczajacej okolo 1—5 grup -SH na* kazda grupe -SS03^, w roztworze wodnym o pH okolo 7—11,5, przy stezeniu S-sulfo- mamu do okolo 10 mg/ml srodowiska wodnego, w temjperaturze okolo 0—37°C, przy czym sposób re¬ alizuje sie jedooetapowo, w srodowisku zasadniczo wolnym od srodka utleniajacego.Uzyte okreslenie „prekursor insuliny" odnosi sie do czasteczki, która zawiera lancuch A insuliny i lancuch B insuliny, ma co najmniej trzy wia¬ zania dwusiarczkowe bedace polaczeniem atomów siarM kazdej z grup Cys obecnej w lancuchach A i B w polozeniach odpowiednio A-6 i A-ll, A-7 i B-7 oraz A-20 i B-19, oraz ma mozliwa do usu¬ niecia grupe laczaca przylaczona do lancucha A insuliny przy aminowej grupie A-l i do lancucha B insuliny przy e-amiinowej grupie reszty lizynowej B-29 karboksylowej grupie aminokwasu B-30.Grupa Z, która okresla reszte anninokwasowa B-30 insuliny jest jedna z reszt Ala lub Thr. Reszty te reprezentuja naturalnie wystepujace insuliny, 20 30 przy cz;-m Thr wystepuje w insulinie ludzkiej, a Ala w insulinie bydlecej i swinskiej.Ugrupowanie laczace X prekursora insuliny i S- sulfonianu prekursora insuliny o liniowym lancu- 5 chu moze pochoctoic z wielu róznych zwiazków. Ko¬ rzystnie ugnipcwianie x jest polipeptydem. Poli- peptyd zwykle zawiera co najmniej 2, a korzystnie 2—35, a najkorzystniej okolo 6—35 reszt aminokwa- sowych. Ugrupowanie X laczy sie z lancuchem A 10 przy grupie aminowej A-l, a z lancuchem B przy grupie hydroksylowej B-30. Najkorzystniej ugru¬ powanie laczace X, jezeli jest peptydem, jest natu¬ ralnym peptydem laczacym prekursora insuliny i zwykle tej insuliny, która reprezentuje jeden lub 11 oba lancuchy A i B, z którymi sie laczy. Przykla¬ dami naturalniie wystepujacych peptydów laczacych sa nastepujace peptydy: Króliczy: -Arg-Arg-Glu- Val - Glu - Glu - Leu- Gln-Val-Gly-Gln-Ala-Glu-Leu - Gly- Gly-Gly - Pro-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu- Gln-Pro-Ser-Ala-Leu-Glu-Ala - Leu- Gln-Lys-Arg-.Ludzki: -Arg-Arg-Glu-Ala - Glu - Asp - Leu- Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu- Gly.Giy-Gly-Pro-Gly -Ala-Gly-Ser - Leu- Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly - Ser.Leu-Gln-LylSKArg-.Malpi: -Arg-Arg-Glu - Ala - Glu - Asp - Pro.Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly- Gly-Gly-ptro-Gly-Ala-Gly-Ser - Leu.Gln - Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser- Leu-Gln-Lys-Arg-.Konski: -Arg-Arg-Glu - Ala - Glu - Asp - Pro- Gln-Val-Gly- Glu-Val-Glu-Leu-Gly.Gly-Gly-Pro-Gly-Leu -Gly-Gly-Leu- Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Ala- Gly-Pro- Gln-Gln-Lys-Arg-.Szczurzy I: -Arg-Arg-Glu - Val- Glu - Asp - Pro.Gln-Val-Pro-Gln-Leu-Glu - Leu-Gly- Gly-Gly-Pro-Glu-Ala -Gly-Asp-Leu- Gln-Thr-Leu-Ala-Leu-Glu-Val-Ala- Arg-Gln-Lys-Arg-.Szczurzy II: -Arg - Arg - Glu - Val- Glu-Asp-Pro- Gln -Val-Ala-Gln-Leu-Glu-Leu-Gly- Gly-Gly-Pro-Gly-Ala - Gly-Asp-Leu- Gln-Thr-Leu-Ala-Leu- Glu-Val-Ala- Arg-Gln-Lys-Arg-.Wieprzowy: _Air,g - Ar£ - Glu - Ala - Glu-Asn-Pro- Gln-Ala-Gly-Ala-Val - Glu-Leu-Gly- Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu -Gln-Ala- Leu - Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln- Lys-Arg-.Bydlecy -Arg - Arg - Glu - Val - Glu-Gly-Pro- Gln^Val-Gly-.B&rani: Ala-Leu-Glu-Leu-Ala-Gly - Gly-Pro- 55 Gly-Ala-Gly-Gly-Leu-Glu - Gly-Pro- Gln^Lys-Arg-.Psi: -Arg - Arg - Asp - Val- Glu-Leu-Ala- Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly - Gly-Leu- Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu - Gly-Ala- 00 Leu-Gln-Lys-Arg-.Swinki -Arg-Arg-Glu -Leu - Glu - Asp - Pro- morskiej: Gln-Val-Glu-Gln-Thr- Glu-Leu-Gly- Met-Gly-Leu-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu- Gln-Pro-Leu-Gln-Gly-Ala-Leu -Gln- w Lys- Arg-, 40 45 M127 843 Szynszyli; . -Arg-Arg- Asp-Val- Glu - Gin - Pro- L.eii-Val-Asn-Gly-Pro-Leu- His-Gly- G1 i-Val-Gly-Glu-Leu-Pro-Phe-Gln- His-Glu-Glu-Tyr-Gln-Lys-Arg-.Bardzo korzystne jest jezeli sekwencje amino¬ kwasów A-l do A-21, X i B-l dio B-20 sa naturalnie wystepujacymi sekwencjami lancucha A, peptydu laczacego i lancucha B proinsuliny wieprzowej, bydlecej lub ludzkiej, a najkorzystniej proinsuliny ludzkiej.Jakkolwiek, jak stwierdzono wyzej, korzystnie stosuje sie maturalna sekwencje laczaca, jako pep-r tydiu laczacego mozna równiez stosowac duzo- krót¬ sze sekwencje pe^tydowe. Jedynymi wymaganiami sa odpowiednia dlugosc pozwalajaca na wlasciwe utworzenie wiazania dwusiarczkowego pomiedzy lancuchami A i B oraz ich zdolnosc do odszczepia^ nia oid prekursora, powodujaca wytworzenie insu¬ liny. Typowym dwuceptydam mozliwym do stoso¬ wania jeist -Arg-Arg-. Ponadto mozna stosowac mo¬ dyfikacje wyzej wspomnianego dwupeptydu o .wzo¬ rze -Arg-X-Arg-, w którym X oznacza ©o najmniej jedna reszte aminokwajsowa. Bardzo korzystnymi peptydami laczacymi sa -Arg-Arg-Lys-Arg-, a tak¬ ze dlugi lancuch peptydowy o budowie -Arg-Arg- -X2-Lys-Arg-, w którym X2 oznacza najmniej jedna reszte aminokwasowa, a korzystnie dwie reszty amiinokwaisowe. Oczywiscie do tego ostatnie¬ go rodzaju naleza naturalnie peptydiy laczace, z któ¬ rych wiele omówiono wyzej.Tak wiec uwzgledniajac powyzsze kryteria,, moz¬ na stosowac dowolne ugrupowanie laczace. W tych przypadkach, w których ugrupowaniem laczacym jest polipeptyd;, punktami polaczenia jest aminowai zakonczenie lancucha A (A-l) i" karboksylowe za¬ konczenie lancucha B. (B-30). Poniewaz jednak reszta amainokwasowa B-29 (Lys) z&wiera grupe E-amino^a, ugti^upowanie laczace mozna przylaczyc do lancuchów A i B poprzez grupy aminowe A-l i B-29. Tak wiec np. grupa karbonyloibis (metiony- lowa), która opisuja Busse i inni w cytowanej po¬ wyzej pracy, grupa 2,2^sulfonylobis(etoksykarbony- lowa), która opisuja Obermeier i linini w Hoppe- -Sayler'a Z. Physiol. Chem. 356, 1631—1634 (1975), grupa 2,7-dwuamjinosulberoilowa, która opisuja Geiger i inni, w cytowanej pracy itp, sa uzyteczr nymi ugrupowaniami laczacymi ostatniego rodzaju.Realizujac sposób wedlug wynalazku, S-sulfonian prekursora insuliny o liniowym lancuchu poddaje sie dzialaniu menkaptainiu w srodowisku wodnym o odczynie pH okolo 7—-11,5. Przez merkaptan ro¬ zumie sie zwiazek zawierajacy co najmniej jedna grupe -SH. Jedynym ograniczeniem dla merkapta- nu, .który stosuje sie w sposobie wedlug wynalazku jest. to, ze miusi on byc rozpuszczalny w wodzie.Przykladami typowych merkaptanów rozpusz¬ czalnych w wodzie sa dwutiotreitol, dwutioerytryt, 2^meiikaptoetainol, tioglikolan metylu, 3-merkapto- -1,2-proparaodiol, kwas-3-merkaptopropionowy i po- doibne. Jakkolwiek mozna stosowac merkaptany za¬ wierajace kilka gpnup -SH, takie jak dwutiotreitol, korzystnie stosuje sie merkaptan zawierajacy jedna grupe -SH. Z merkaptanów tych bardzo korzystny jest 2-morkaptoetainol, Sposób wedlug wynalazku realizuje sie w srodo¬ wisku wodnym, w którym utrzymuje sie wymagana" wartosc pH zwykle dodajac odpowiedniiego srodka buforujacego'. Odczyn srodowiska odpowiada war-" 5 tosci pH okolo 7—11,5. Jednak korzystnie wartosc pH wynosi okolo 9,5—10,5. W sposobie wedlug wy¬ nalazku mozna stosowac kazdy srodek buforujacy wykazujacy pojemnosc buforowa w wyzej wymie¬ nionych granicach. Przykladami odpowiednich sród- 10 ków buforujacych sa bufory fosforanowe, trójhyd- rokaymetyloiaiminometan (Tris), bufory boranowe, glicynowe, itp.Stezenie srodka buforujacego w srodowisku wod¬ nym wynosi zwykle do okolo 0,5n. Korzystnie 15 stezenie wynosi okolo 0,005—0,5n, a najkorzystniej okolo 0,005—0,ln.S-sulfonian prekursora insuliny o liniowym lan¬ cuchu wprowadza sie do srodowiska wodnego w stezeniu nie wiekszym niz okolo 10 mg/ml. Ko- 20 rzysitnle stosuje sie stezenie nizsze, zwykle okolo 0,05—2mg/ml. * Waznym elementem sposobu wedlug wynalazku jest ilosc uzytego merkaptaou w stosunku do S-sul¬ fonianu prekursora insuliny o liniowym lancuchu. 25 W zdanych w stanie techniki sposobach redukcji S-sulfonianu do -SH stosowano bardzo duzy nad¬ miar merkapitanu w stosunku do S-sulfonaanu.Obecnie jest oczywiste, ze taki duzy nadmiar nisz-' czy S-sulfoinianowa substancje wyjsciowa, w'wy- 30 niku czego uzyskuje sie calkowita redukcje S-sul¬ fonianu do odpowiedniego zwiazku -SH. To z kolei powoduje koniecznosc wyodrebnienia zwiazku przejsciowego -SH lub rozcienczenia mieszaniny reakcyjnej, a nastepnie stosowania odrebnego etapu 35 utleniania, zwykle przy uzyciu powietrza, w celu przemiany zwiazku przejsciowego- -SH w wyma¬ gany zwiazek -S-S- (patrz np. Cretstfield i inni, • J. Biol. Chem. 238, 622—627 (1963), Steiner i inni, Proc. Nat 1 Acad, Sci U.S.A. 60, 622—629 {1968) w i Yanaihara i inni, Diabetes 27 (Suppl. 1), 149—160 x (1978).Z drugiej strony sposób wedlug wynalazku wy¬ maga uzycia merkaptanu w ilosci, która dostarcza okolo 1—5 grup -SH na kazda grupe -S-S03~~, a ko- 45 rzystnie ilosci, która dostarcza okolo' 2—4 grup -SH na grupe -SS03^. Stwierdzono, ze jezeli uzywa sie merkaiptanu w wyzej wymienionej ilosci, mozliwa jest z duza wydajnoscia i latwoscia przemiana S-sulfonianu prekursora insuliny o liniowym lan¬ cuchu bezposrednio w zadany dlwusiarczkowy pre¬ kursor insuliny. Poniewaz insulinowe lancuchy A i B obecne jako czesc S-sulfonianu zawieraja szjesc grup S-sulfonianowych, w celu osiagniecia wyzej podanej ilosci grup -SH w stosunku do grup „ -SS03~ merkapitanu zawierajacego pojedyncza gru- 55 pe -SH oczywiscie uzyje sie w stosunku molowym od okolo 6 : 1 do okolo 30 : 1.Wspólzaleznosc pH, sily jonowej roztworu bufo¬ rowego i stezenia S-sulflonianu prekursora insuliny o liniowym lancuchu jest waznym, jakkolwiek nie zasadniczym, warunkiem realizacji sposobu wedlug wynalazku. Tak wiec na ogól korzystnie stosuje sie roztwór buforowy o wyzszym pH i nizszej sile jonowej a takze nizsze stezenie S-sulfonianu pre- 11 kursora insuliny o liniowym lancuchu.7 127 843 8 Pondto w odróznieniu od typowych sposobów znanych w stanie, techniki,, nie ma zasadniczego znaczenia prowadzenie procesu wedlug wynalazku w srodowisku utleniajacym. Jakkolwiek srodek utleniajacy, np. powietrze, moze byc obecny w sro¬ dowisku reakcji, nieoczekiwanie stwierdzono, ze bardzo korzystnie prowadzi sie reakcje przy zasad¬ niczym braku powietrza lub innego srodka utlenia¬ jacego. Przez okreslenie ^zasadniczy brak" rozumie sie pominiecie celowego dodawania powietrza. Osia¬ ga sie to prowadzac reakcje w ukladzie zamknie¬ tym, który wyklucza dostep powietrza lub innego srodka utleniajacego. W celu dalszego zapewnienia bralcu dostepu powietrza, srodowisko^ wodne mozna przedmuchac azotem iodgazowac przed dodaniem reagenitów. ......Inna bardzo pozadana, jakkolwiek nie zasadnicza, cecha sposobu wedlug wynalazku jest kontrola tem¬ peratury. Proces prowadzi sie zwykle w tempera¬ turze okolo 0—37°C. Korzystnie stosuje sie tempe¬ rature blizsza 0°C, zwykle temperature okolo 2—8°C, a jeszcze korzystniej temperature 4—6°C.Jednakze jeszcze korzystniej proces prowadzi sie w dwóch przedizialach temperaturowych. Miesza¬ nine reakcyjna przygotowuje sie w temperaturze pokojowej i po przygotowaniu oziebia sie do tem¬ peratury oikolo 2—8°C i utrzymuje w tej tempera¬ turze w ciagu pozostalego czasu reakcji Dlatego zwykle realizujac sposób wedlug wyna¬ lazku przygotowuje sie srodowisko wodne o wybra¬ nym odczynie pH sitosujac np. glicyne o stezeniu okolo 0,05in. Taik przygotowane srodowisko wodne, które utrzymuje sie zwykle w temperaturze okolo 0—37°C, a korzystnie w temperaturze pokojowej, odgazowuje sie, przedmuchuje azotem i ponownie odgazowuje. W srodowisku wodnym rozpuszcza sie S-sulfonian prekursora insuliny o liniowym lan¬ cuchu w ilosci odpowiadajacej wymaganemu ste¬ zeniu- ^np/okolo 0,1 mg/ml srodowiska. Merkaptan dodaje sie w ilosci dostarczajacej do okolo 5 grup -SH na grupe -SSO3-. Otrzymana mieszanine, która utrzymuje sie zasadniczo bez dostepu powietrza lub innego srodka utleniajacego oziebia sie do tempe¬ ratury okolo 4—6°C, i utrzymuje w tej tempera¬ turze dlp zakonczenia reakcji Czas reakcji wynosi na ogól oikolo 5—72 godziny, czesciej okolo 15—24, zwykle okolo 18—20 godzin.Po zakonczeniu reakcji produkt, który jest pre¬ kursor insuliny, mozna wyodrebnic stosujac jaki¬ kolwiek z róznorodnych sposobów uznawanych w dziedzinie oczyszczania insuliny. Najczesciej stosuje sie techniki chromatograficzme, do których nalezy np. chromatografia zelowa lub chromatografia jo¬ nowymienna.Otrzymany prekursor insuliny mozna przepro¬ wadzic w insuline droga enzymatyczna lub che¬ miczna stosujac znane sposoby. Do sposobów tych nalezy np. odazczepianie z zastosowaniem trypsyny i karboksypeptydazy B (Kemmler i inni, J. Biol.Chem. 246, 6786—6791 (1971).Produkt insuliny mozna ocenic pod wzgledem czystosci i czynnosci wzglednej stosujac znane spo- soby, takie jak elektroforeza w zelu poliakryloami- dowym, analiza aminokwasów, próba radiorecep to¬ rowa, próba radiodirnmiunolo-gicana, cisnieniowa chromatografia cisczawa (HPLC), widmo w nad¬ fiolecie, dansylacja, próba glikozowa krwi króli¬ czej itp.S-sulfoniany prekursora insuliny o liniowym lan- 5 cuchu bedace substancjami wyjsciowymi mozna wytworzyc stosie sposoby polegajace na rekombi¬ nacji DNA. Mozna je równiez wytworzyc z natu¬ ralnych insulin i proimsulin, a takze stosujac kla¬ syczne sposoby syntezy bialek, do których naleza 10 techniki reakcji w roztworze lub w fazie stalej S-sulfoniain prekursora insuliny o liniowym lan¬ cuchu mozna wytworzyc z proinsuldiny w nastepu¬ jacy sposób. Do 100 ml dejomizowanego 7m mocz¬ nika, który umieszcza sie w chlodnym pomieszcze- 15 niu, dodaje sie 786 mg siarczynu sodowego. Roztwór miesza sie dokladnie. Nastepnie dodaje sie 594 czte- rotioniainu sodowego. Po rozmieszaniu duza czesc czterotionianiu rozpuszcza sie, jednak roztwór po¬ zostaje metny. Odczyn roztworu doprowadza sie do 20 wartosci pH, 7,7 uzywajac lodowatego kwasu octo¬ wego. Nastepnie dodaje sie podczas mieszania 503 mg oczyszczonej za pomoca HPLC prodinsuliiny wolowej. Odczyn roztworu ponownie doprowadza sie do wartosci pH 7,6 uzywajac 2n wodorotlenku so- 25 dowego. Otrzymany lekko metny roztwór miesza sie w temperaturze 6°C w ciagu 18 godzin.Odczyn okolo polowy mieszaniny reakcyjnej do¬ prowadza sie do wartosci pH 9,1 uzywajac 2n wo¬ dorotlenku sodowego i wprowadza sie do kolumny 30 Sephadex G-25 Coarse. Stosuje sie nastepujace wa¬ runki chromatografowania: rozpuszczalnik 0,05m wodoroweglan amonowy, pH 9,0, rozmiary kolumny 2X90 cm, temperatura 21°C,szybkosc przeplywu 18,5 ml/minute. Poczatkowe 120 ml eluantu usuwa M sie, a nastepne 75 ml zbiera sie i zachowuje. Nas¬ tepnie kolumne przemywa sie kolejna iloscia 400 ml 0,05 m wodoroweglanu sodowego o pH 9,0. Ten tok postepowania powtarza sie dla drugiej polowy mie¬ szaniny reakcyjnej. Wydajnosc wyodrebnionych 40 dwóch porcji okreslona za pomoca spektroskopii UV wynosi 401 mg. Porcje te laczy sie i liofilizuje do sucha. Zbiera sie 445,7 mg suchego odsolomego produktu. Budowe produktu, S-sulfonianiu proinsu- liny wolowej o liniowym lancuchu oraz brak sub- 45 stancji wyjsciowej potwierdza elektroforeza w oc¬ tanie celulozy i elektroforeza dyskowa na zelu poliaikryloamidowym.S-sulfoniiam prciinsuliny bydlecej o liniowym lan¬ cuchu oczyszcza sie za pomoca chromatografii 59 DEAE celulozowej, 443 mg surowej próbki roz¬ puszcza sie w 10 ml roztworu zawierajacego 7,5m mocznik, 0,0Im trójhydroksymetyloaminometan i 0,00Im kwas etylenodwuaminocaterooctowy o pH 8.5 i wprowadza na kolumne DEAE celulozowa. 55 Stosuje sie nastepujace warunki chrómatograifowa- nia: jako rozpuszczalnik roztwór o skladzie 7,5m mocznik, 0,01 frójhydroksymetyloaminometan i 0,00Im kwas etylenodwuamiiinoczterooctowy przy wzrastajacym steze::iu 0—0,35m chlorku sodowego, 60 wymiary kolumny 2,5 X 90 cm, temperatura 4°C, szybkosc przeplywu okolo 0,9 ml/miniute, objetosc , frakcji 5,3 ml.Zaleznosc absorbancji kazdej frakcji przy 276 nm od numeru frakcji wykaauje duzy pdk obnizajacy „ sie lagodnie. Na podstawie analizy widma UV ;127 8A3 £ *lo ?{Jteiegj$j09no, ze pik ten odpowiada produktowi.Laczy sie frakcje 199—240 o objetosci aluatu 1069- -^1291 ml. Wydajnosc produktu w tej próbce okres¬ lona na pQfpi»tawie spektroskopii UV wynosi 355 mg.Porcje produktu odsala sie na kolumnie Sepha- dex G-25 Goarse. Stosuje sie nastepujace warunki chromat^gra^owania: jako rozpuszczalnik 0—0,5m wodoroweglan sodowy, pH 8,0, rozmiary kolumny 3,7 X 105 cm, temperatura 4°C, szybkosc przeplywu 16,0 ml/miiniute. Poczatkowe 395 ml eluatu -usuwa sie a nastepne 250 ml zbiera sia i zachowuje. Nas¬ tepne kolumne przemywa sie dodatkowymi 2000*ml, 0,05m wodoroweglanu amonowego o pH £,G. ^Wy¬ dajnosc produktu ^w tej próbce okresloma ha -pod¬ stawie s^kAroskopsi W wynosi 321 mg. Próbke liofilizuje sie do sucha. Zbiega «e 373 mg-Sfuehej suOgptaincji. Fxo4uiki &denrt#&kuje «ae za pomoca ele&tixtfc oraz casTieniomnej c^cmatograiii cieczowej x wyso¬ kiej rc^dzielozosci na podstawie punktu ehieji.Przyklad I. Zastosowanie stezenia 0£ mg/ml.?H^S9^9^!^ si§ roztwór l;til mg S-sulfonianu proinsuliiny bydlecej ^Jponjpwjftfi ^cufJ^i,,itf£ra rozpuszcza sde w 16,1 ml odga^o^ajnej, Gtfpn glicyny o odczynie pH 0,5. po tego roztworu dodaje sie ,0,158 mlrpojflsrtawowejgo roztworu jjflpdmego 2-mer^ kaptoetaiQoJ|a o stezeniu merkaptica&L 2,11 mg/m) jak wykasuje miarecakowainie odozamjnikiem Ellma- na. Odipqwdada to 4 , równowazmikeD^ 2nmerkapto^ etanolu na jeden -SSO^w-S-suMoBianie proinauM- ny bydlecej1 o lamowym lancuchu. *Koncowy- odczyn pH wyinoai 9,46. Roztwór - przygotowany w tempera¬ turze pokojowej zamytka sie paralfilmem, po c^ym miesza sie oziebiajac -w temperature *d°C w * ciagu 19 godzin Nastepnie mieszanine reakcyjna zakwasza sie do wartosci pH 4,0 ± 6; 1 (w ustalonej temperaturze) uzywajac stezonego kwasu rolnego i d,5n wodoro¬ tlenku sodowego. Produkt wyodrebnia sie i spraw¬ dza za pomoca caaniiftniowej- chromatografii cieczo¬ wej o wysokiej rozdzielczosci HPLPLC. Stosuje sie nastepujace wairunki HPLPLC: kolumna szklana o wymiarach 1L1X 54 cm wypelniiona wypelniaceem LP-V€i8^ Vh$M+ Q roag^szcizain^ 30°/a( ace-. tonitrylu i 7p*/oj 0,lm mrówczanu amonowego o pH 4,25, temgaratiuira 21°C, cisnienie 80,5 kPa i szyb-.Kosc przeplywu 2,40 ml/mdnute. Próbki wprowadzaj sie do kolpnjny za pomoca wfoyskiwaoza petlowegoi o pojemnosci 5 ml i wykrywa przy dlugosci fali: 280 nim.Jako pi/j^wsza próbke wprowadza sie, 5 ml roz¬ tworu- podiSJaMCojwftgo proiin^iuliny bydlecej, o, nomi-, nalnyirn sj§«fn^L bi*U% 0$/ mg/ml. Jako druga peróbjss- ^rj^pojza aic:.5: ml za^asiapraej miegza- sie na BOnpta^ft.. Wdtftk «**«*: Wydajno^cv p:oM- s^ft^T]b^ oli naAsojjataj$&:^e^e^ic^rd pafrówfrdy^óch*przetltegnw Hi?^I^-ws^k^^A wyda^^wcir.taoir^tyczn^j.P^zy.fc£a4 Ift ^st^^w^nieyfi^zep^ ^ ipg/rnj.. iy^go£owuje sie, r^wór:: 25/)7. mg S-sulfonianu, proinsuliny bydlecej p^l^io^yra^lan^ czonego w 50,).4t ml odgaizowanej 0,05m glicyny c odczynie pH 10,51, Do roztw^u,dodaje sie 1,302 ml wodnego tfaztotf&rii poStetewowego %-*tóe?bsfrlo&ta- iwlw^oeti^teriiiu 2,10 mg/rril *jak wykasuje mtartecz- kowawte ^tesynndkiem ~mnlama. odpowiada -powri«wti«dka ^meirteftptefeteawilu «a je&en *-J&&bi- 5 w S*««ulfoniaraie 'pr^Sna^liny bydftetsej 4 Iktfowym 4aóou»fnt-lEoneowy Mwlo^n pH -wyinasi 10$7. "ftzy- -actowatay w temiiar&tiairfce' p&kojowej toatwor la- ra$ka «Le^ipawiUfflraeHi, *pr*5zymmfasta sfte X5^iebia]iac w 'twnpertrtupne 4%e w isiaga 1« ^o*zfei. -ao Nastepnie maeszanine J^akcyjna^-^tóftwlhtóa tóe itto j*vawftosci pK 4,«±0,1 "Uiy^aja*? st^zenego fewmwi sóltregio i 0,ln *wsisii «ótoeg9. Wydaja^esc proinisifltey ^yd§^ej w -ttntr- ^za#tirrie*^key$Be$^^ na ^pwIstawiettl^LMit: ii wynosi «^e ^yfejftosei teotresljrcsnej. Pftdttkt 1* *«d«al«ri« -wyeda^bwia sie s*ooujac idiroma^&jgra^re zelowa. Odczyn mieszaiflitty ireaftfleyjrtej ^if^tM^acfea ?iie do wartosci pH d^O uzywane &tez«W!ego wofldro- *lei*to mi^M^^g^i^i&mr^ -mli!^uiit^ -wpro^^za to tf*-4»- tacikimny Sephad<« G^25 Ooufrse. 9!ó*ttje s^ r*go: p^E^wsEraafcdfc ^OSmwc^doirwYe^afi ^ttttónó^ wy, is« IE0, r«tomaffy Mffttn^T' 2f509*^ ^ Itett^^ ratura 2ite, sizybkDic #r*0^y^ai •«,«• l^ftlittcite « FveB8#w**e l-ao ml elaa*a tWttwa a*c,-a irtós1«a«hi^ « nrd zfa^a tóe i Eachowfl^ ftfairtfe lJttnita). N^s- 0,0Im wodorotlenku amonowe^a odeyoteu je^ ^sde z wyekjnos«a 11^' ttLg ^topeslMa na ( liofilizwje si^ da sucha. Zbiera sie 22,2i mg suchego; odsolonego bialka.Porcje tej fi»bstamcji w ilosci 14,84 tag rozpuszcza sie w 5,5 ml l,0m kwasu octowego. Spektroskopia" m UV czystego rozitwozru wskazuje na silenie bialka! 2;56 mg/ml. 5 ml powyzszego roztworu;iL2,8 mg na podstawie UY) wprowadza sie do koluimny Sepha- dex G-50 Supearfine. Stosuje sie nastepujace wa¬ runki chromato^iafowaiiiia: roapuszczalnd^r lftl kwas m s^lny, rozmiary koiummy 1,5 X *W cnr, -tefllperatitra ^r^C, szybkosc przeplywu e,W rnltalmctte, oUJetosc- frakcji okolo 1,9 ml.Po przemywaniu kolumny Imkiwasem octbwymw ciagu nocy sprawdza sie'absorbcj£ ptzy *Z&b nm*. ;ftaL H wTykresie otrzymuje sfic dwa pifc^- Pferwsiz^ mYCfeJ* szy odpowiada zagregowanym postaettom- ^roinsir-- liny wolowej. Dragi pife odtKrwizttfó: manoJYJgryc^iigj proinsultnie wolowej. Partfe fratóji^ocibo^atJajace" dwóm pikom zbiera sie i laczy poszczególne^fraiccje; w< Otrzymuje sie Tiastepujace- objetostal-eluattr: Partia I: Frakcja 30—46 (55,0—8$ partia H:/Fr«kcje 47—62 (84^-H2,0^tói pdfkrrW^^nil) Spektroskopia UV wskakuje na dbecnosc 1^4' mg proinsuliny wolowej w partiii I i. 10,11 mg w partii II. Daje to ilosc calkowita 12,05, mg i odpo¬ wiada 94;l*/o ilosci wprowadzonej do kolumny. Z tej ilosci 83,9^/a odpowiada mionomeryczniej.proinsiulinie wolowe}.Obt!^ partie liofilizuje sie de sueba.- P^odtokt^ w partii Xl uznaje sie za proinsuline wolowa' ita podstawie punktu elucji podczas przebiciu tl^LPLC Produkt sprawdza, sie równiez dzialajac ina~ niego trypsyna i kacbeksypeptydina, Bi z^odanei z', litctffc- turowym tokiem postepowania wytwarzania insu- ei Itoywolowej. __ 5* 60811 127 843 12 Przyklad III. Wplyw temperatury.Tok postepowania z przykladu I stosuje sie do okreslenia wplywu temperatur na wydajnosc pro¬ insuliny bydlecej otrzymanej z S-sulfonianu pro¬ insuliny bydlecej o liniowym lancuchu. Reakcje prowadzi sie przy stezeniu bialka 0,1 mg/ml w0,05m glicynowym roztworze buforowym przy pH 9,5 sto¬ sujac jako merkaptan 2-merkaptoetanol w ilosci dostarczajacej 4 równowazniki -SHna jeden -SS03™ w ciagu 18 godzin.Przy prowadzeniu reakcji w temperaturze 21°C wydajnosc proiinsuliny bydlecej okreslona za po¬ moca HPLPLC wynosi 47% wydajnosci teoretycz¬ nej. Jezeli natomiast reagenty zmiesza sie w tem¬ peraturze 21°C, a nastepnie obnizy sie temperature mieszaniny do temperatury 6°C wydajnosc wynosi 77%! wydajnosci teoretycznej.Przyklad IV. Wplyw pH.Tok postepowajnia z przykladu I stosuje sie do okreslenia wplywu pH na wydajnosc proinsuliny bydlecej otrzymanej z S-sulfondaniu prodnsulkry bydlecej o liniowym lancuchu w serii reakcji, które prowadzi sie równoczesnie. Reakcje prowadzi sie przy stezeniu bialka 0,5 mg/ml w 0,05m glicynowym roztworze buforowym stosujac jako merkaptan 2-merikaptoetanol w ilosci dostarczajacej 2 równo¬ wazniki -SH na jeden -SSOs~ w ciagu 18 godzin w temperaturze 6°C.Wydajnosci proinsuliny okreslone za pomoce HPLPLC sa nastepujace: 1 ¦¦¦ ¦ pH 9,0 9,5 [ 10,0 10,5 11,0 Wydajnosc, °/o 43,1 44,3 66,7 76,0 61,0 P r zy kia d V. Wplyw stezenia bialka Tok postepowania z przykladu I stosuje sie do okreslenia wplywu stezenia bialka na wydajnosc proinsuliny bydlecej otrzymanej z S-sulfonianu proiinsuliniy bydlecej o liniowym lancuchu w serii reakcji, któire prowadzi sie równoczesnie. Reakcje prowadzi sie w 0,05m glicynowym roztworze bufo¬ rowym przy pH 9,5 stosujac jako merkaptan 2-mer¬ kaptoetanol w ilosci dostarczajacej 4 równowazniki -SH na jeden ^SSOs- w ciagu 18 godzin w tempera¬ turze G°C.Wydajnosci proinsuliny okreslone za pomoca HPLPLC sa nastepujace: Stezenie bialka, mg/ml 0,1 0,2 " 9,3 0,4 0,5 1,0 Wydajnosc, e/o 78 63 46 37,6 25,4 12 | Prowadzac druga serie reakcji dla 2 równowaz¬ ników -SH na jeden -SS03- i pH 10,5 otrzymuje sie nastepujace wyniki: Stezenie bialka, mg/ml 1 " 1 1 0,5 Wydajnosc, °/o V 77,2 - ' c. d. tabeli 1 0,96 1,83 4,2* 7,4* 2 1 58,3 19,5 20,1 19,6 * stosunek równowaznikowy -SH do -SSOg— = 1,2 Przyklad VI. Wplyw stosunku równowazni¬ kowego -SH do SS03~.Tok postepowania z przykladu I stosuje sie do okreslenia wplywu stasnimku równowaznikowego -SH do -SS03— na wydajnosc proinsuliny bydlecej, otrzymanej z S-sulfonianu proinsuliny bydlecej o liniowym lancuchu w serii reakcji, które pro¬ wadzi sie równoczesnie. Reakcje prowadzi sie przy stezeniu bialka 0,5 mg/ml stosujac 0,05m glicyno- wy roztwór buforowy przy pH 9,5 w ciagu 18 godzin w temperaturze 6°C.Wydajnosci otrzymanej insuliny okreslone za po¬ moca HPLPLC sa nastepujace: Stosunek równowaznikowy | -SH do -SS03- 4,0 2,0 1,0 0,5 Wydajnosc, °/o; 30,8 44,7 37,0 4,5 Przyklad VII. Wplyw rodzaju merkaptanu.Tok postepowania z przykladu I stosuje sie do okreslenia wplywu budowy merkaptanu na wydaj¬ nosc proinsuliny bydlecej otrzymanej z S-sulfonia¬ nu proinsuliny bydlecej o liniowym lancuchu w serii reakcji, które prowadzi sie równoczesnie. Reakcje prowadzi sie przy stezeniu bialka 0,1 mg/ml w gli¬ cynowym roztworze buforowym przy pH 9,5 sto¬ sujac merkaptan w ilosci 4 równowazników -SH na jeden -SS03— w ciagu 18 godzin w temperatu¬ rze 6°C.Wydajnosci proinsuliny okreslone za pomoca HPLPLC sa nastepujace: Merkaptan Dwutiotreitol Dwutiioerytryt Tioglikolan metylu 3-merkapto-l,2-prqpanodiol kwas 3-merkaptopropio- 1 nowy 1 2-merkaptoetanol Wydajnosc, °/o 39,3 34,9 56,1 65,5 65,3 64,1 Przyklad VIII. Wplyw rodzaju bialka.Tok postepowania z przykladu I stosuje sie do 55 okreslenia wplywu rodzaju bialka na wydajnosc proinsuliny otrzymanej z S-sulfonianu proinsuliny o liniowym lancuchu w serii reakcji, które pro¬ wadzi sie równoczesnie. Reakcje prowadzi sie przy stezeniu bialka 0,1 mg/ml w 0,05m glicynowym roz- M twoirze buforowym przy pH 9,5 stosujac jako mer¬ kaptan ZHmerkaptoetanoi w ilosci dostarczajacej 4 równowazniki -SH na jeden -SS03- w ciagu 1F; godzin w temperaturze 6°C.Wydajnosci proinsuliny okreslone za pomoca w HPLPLC sanastepujace: _13 S-sulfonian proinsuliny o liliowym lancuchu bydlecy wieprzowy Wydajnosc, % 60,6 65,8 | Przyklad IX Wytwarzanie insuliny ludzkiej.Przygotowuje sie roztwór 169,3 mg wytworzonego biosyinitetyczrjie S-sulfonianu proiinisuliiny ludzkiej o liniowym lancuchu, który rozpuszcza sie w 338,6 ml cdgazowainej glicyny o pH 10,54. Do otrzy¬ manego roztworu dodaje sie 7,71 ml wodnego roz¬ tworu podstawowego 2-merkaptoetainolu o stezeniu merkaptarm 2,08 mg/ml jak to wskazuje miareczko¬ wanie ouzzjmukiem Ellmana. Odpowiada to 2 rów¬ nowaznikom -SH na Jeden -SS03~~ w S-sulfonianie proinsuliny ludrzkiej o liniowym lancuchu. Odczyn koncowy roztworu doprowadza sie do wartosci pH 10,52 diodajac niewielka ilosc 5n wodorotlenku sodo¬ wego. Roztwór zamyka sie parafilmem i miesza w temperaturze 6°C w ciagu 18 godzin.Nastepnie mieszanine reakcyjna zakwasza sie do wartosci pH Z,9±0,l (w ustalonej temperaturze) uzywajac sfceztiriego kwasu solnego. Otrzymany kla¬ rowny roztwór wprowadza sie do kolumny odsala¬ jacej Sephadex G-25 Coairse. Stosuje sie nastepu¬ jace warunki chromatografowania: rozpuszczalnik 2°/o kwas octowy (objetosciowo), rozmiary kolumny 5 X 100 cm, temperatura 25°C, szybkosc przeplywu 28,8 mi/minute, objetosc frakcji 20,2 ml.Poczatkowe 779 ml eluatu usuwa sie, a nastepnie 464 ml zbiera sie i zachowuje. Na podstawie absor- bacji przy 280 nim stwierdza sie, ze otrzymana frakcja zawiera bialko. Kolumne przemywa sie do¬ datkowymi 2500 ml 2%r, kwasu octowego Obliczenia dokonane na podstawie widma UV partii; zawiera¬ jacej bialko wykazuja, ze odzyskuje sie 164 mg bialka co odpowiada 101,9% 'ilosci wprowadzonej do kolumny (wydajnosc teoretyczna reakcji przeksztal¬ cenia). Partie zamraza sie i liofilizuje do sucha.Wymagany produkt wyodrebnia sie za pomoca chromatografii zelowej. Sucha substancje (nie zwa- zona) rozpuszcza sie w 20 ml Im kwasu octowego.Otrzymany klarowny rozwtór wprowadza sie do kolumny Sephadex G-50 Superfine. Stosuje sie nastepujace warunki chromatografowania: rozpusz¬ czalnik Im kwas octowy, rozmiary kolumny 2,5 X 125 cm, temperature 25°C, szybkosc przeply¬ wu okolo 0,82 ml/miniute, objetosc frakcji okolo, 4,92 ml.Po przemywandoi kolumny Im kwasem octowym w ciagu nocy sprawdza sie absorbacje przy 280 nra.Na wykresie absorbacji przy 280 nm otrzymuje sie dwa glówne piki. Pierwszy mniejszy pik odpowiada zagregowanym postaciom proinsuliny ludzkiej. Dru¬ gi pdk odpowiada monomerycznej proinsulinie ludz¬ kiej. Pik ten posiada garb ma przednim ramieniu.Zebrane frakcje laczy sie w trzy partie otrzymujac nastepujace objetosci eluatu: Partia I: frakcje 46—67 (218—325,5 ml), Partia II: frakcje 68—81 (325,5—395,5 ml), Partia III: frakcje 82—100 (395,5—490,3 ml).Na podstawie widma UV oblicza sie, ze partie za¬ wieraja nastepujace ilosci bialka: Partia I: 22,1 mg 843 14 ^ Partia II: 28,3 mg Partia III: 103,6 mg.Daje to calkowita ilosc 154 mg co odpowiada od¬ zyskaniu 94°/oi ilosci wprowadzonej do kolumny. 5 Z tej ilosci 67,3% odpowiada monomerycznej pro- imsulinie ludzkiej. Wszystkie trzy partie zamraza sie i liofilizuje do smcha.Z partii III zbiera sie calkowita ilosc 106,55 mg suchej substancji. Uznaje sie ja za proinsuline ludz- 19 ka na podstawie analizy aminokwasów i elektrofo¬ rezy dyskowej w zelu polikryloamidowym. Stosujac HPLC wymywa sie ja w punkcie, w którym ocze¬ kuje sie elucji proinsuliny ludzkiej okreslonym w stosunku do proinsuliny wolowej. Ponadto otrzy- 15 mana proinsuline sprawdza sie poddajac ja dzia¬ laniu trypsyny i karboksypeptydazy B w wyniku czego otrzymuje sie insuline ludzka Zastrzezenia patentowe 2Q 1. Sposób wytwarzania prekursora insuliny o wzo¬ rze 1, w którym R oznacza atom wodoru, Y oznacza grupe o wzorze 2, w którym Z oznacza Ala, ugru¬ powania od A-l do A-21 sa insulinowym lancu¬ chem A insuliny bydlecej lub swinskiej, ugrupowa- 25 nda od B-l do B-30 sa insulinowym lancuchem B insuliny bydlecej lub swinskiej, a X oznacza ugru¬ powanie, które laczy sie z lancuchem A insuliny przy aminowej grupie A-l, a z lancuchem B insu¬ liny przy e-aminowej grupie B-29 lub karboksylo- ^ wej grupie B-30, przy czym ugrupowanie to mozna chemicznie lub enzymatycznie odszczepic od obu lancuchów A i B bez ich rozerwania, polegajacy na tym, ze S-sulfonian o wzorze 3, w którym R, X i Y maja wyzej podane znaczenie poddaje sie re- jg akcji z merkaptanem, znamienny tym, ze merkap- tan stosuje sie w ilosci dostarczajacej okolo 1—5 grup -SH na kazda grupe -SS03—, w roztworze wod¬ nym o pH okolo 7—11,5, przy stezeniu S-sulfonianu dc okolo 10 mg/ml srodowiska wodnego, w tempe- 40 raturze okolo 0—37°C, przy czym sposób realizuje de jedmoetapowo, w srodowisku zasadniczo wolnym od srodka utleniajacego. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze 3, w którym X ozna- 45 cza ugrupowanie peptydowe pochodzace z lancu¬ cha C proinsuliny swinskiej. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze 3, w którym X ozna¬ cza ugrupowanie peptydowe pochodzace z lanou- 50 cha C proinsuliny bydlecej. 4. Sposób wedlug zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, ze reakcje korzystnie prowadzi sie przy pH okolo 9,5-^10,5. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 55 korzystnie stosuje sie merkaptan w ilosci dostar¬ czajacej 2—4 grup -SH na 1 grupe -SS03~~. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze korzystnie stosuje sie stezenie S-sulfonianu okolo 0,05—2 mg/ml srodowiska wodnego. 60 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze Jako merkaptan stosuje sie 2-merkaptoetanol 8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcje korzysffcnie prowadzi sie w temperaturze m okolo 2—8°C.15 127 843 16 9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze mieszanine reakcyjna przygotowuje sie, w tempera¬ turze zblizonej do pokojowej* a reakcje prowadzi sie oziebiajac mieszainine reakcyjna do tempera¬ tury 2—8°C. 10. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze utrzymuje sie pH mieszaniny reakcyjnej dodajac srodka buforujacego w stezeniu okolo 0,005—0,5n, 11. Sposób wedlug zastrz. 10, znamienny tym, ze jako srodek buforujacy stosuje sie glicyne. 12. Sposób wytwarzania prekursora insuliny o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, Y oznacza grupe o. wzorze 2, w którym Z oznacza Thr, ugrupowania od A-l do A-21 sa insulinowym lancuchem A insuliny ludzkiej, ugrupowania od B-l do B-30 sa insulinowym lancuchem B insuliny ludzkiej, a X oznacza ugrupowanie, które laczy sie z lancuchem A insuliny parzy aminowej grupie A-l, a z lancuchem B insuliny przy e-aminowej grupie B-29 lub karboksylowej grupie B-30, przy czym ugrupowanie to mozna chemicznie lub enzymatycz¬ nie odszczepic od obu lancuchów A i B bez ich rozerwania, polegajacy na tym, ze S-sulfonian o wzorze 3, w którym R, X i Y maja wyzej podane znaczenie poddaje sie reakcji z merkaptanem, zna¬ mienny tym, ze merkaptan stosuje sie w ilosci dostarczajacej okolo 1—5 grup -SH na kazda grupe -SS03-, w rozwtorze wodnym o pH okolo 7—11,5, przy stezeniu S-sulfonianu do okolo 10 mg/ml sro¬ dowiska wodnego, w temperaturze okolo 0—37°C, przy czym sposób realizuje sie jednoetapowo w sro¬ dowisku zasadniczo wolnym od srodka utleniaja¬ cego. 13. Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym,- ze stosuje sie zwiazek o wizorze 3, w którym X ozna¬ cza ugrupowanie peptydowe lancucha C proinsuliny ludzkiej. 14. Sposób wedir.ig zastrz. 12, znamienny tym, ze stosuje sie zwitek o wzorze 3, w którym X ozna¬ cza ugrupowanie reptydowe lancucha C proinsiuliny swinskiej. 15. Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wizorze 3, w którym X ozna¬ cza ugmpowanie peptydowe lancucha C proinsuliny bydlecej. 16. Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym, ze reakcje korzystnie prowadzi sie przy pH okolo 9,5—10,5. 17. Sposób wedlug-ziaisitrz. 12, znamienny tym, ze korzystnie stosuje sie merkaptan w ilosci dostar¬ czajacej Z—4 grup -SH na 1 grupe -SSO3-. 18. Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym, ze korzystnie stosu.je sie stezenie S-sulfonianu okolo C,05—2 mg/ml srodowisk«wiodinego. 19. Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym, ze jakp merkaptan stosuje sie 2-jmerkaptoettanol, 20. Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym, ze reakcje korzystnie prowadzi sie w temperaturze okolo 2^-8°a ; 21. Sposób wedlug zastrz 12, znamienny tym, ze mieszanine reakcyjna przygotowuje sie w tempe¬ raturze pokojowej a reakcje prowadzi sie oziebiajac mieszandne reakcyjna do temperatury 2^8°C. 22. Sposób wedlug zastrz 12, znamienny tym, ze utrzymuje sie pH mieszaniny reakcyjnej dodajac srodka buforujacego w stezeniu okolo 0,005—0,5n, 23. Sposób wedlug zastrz 22, znamienny tym, ze jako srodek buforujacy stosuje sie glicyne. 10 u 20 25 30127 843 (A-1) (A-6) (A-7) (B-1) R-HN-Phe- Gly-NH Cys-s-s I I Cys Cys-- S (A-11) S -X -Cys- IB-7) (A-20)(A-21) Cys—Asn-OH s S NZOR 1 -Lys—-— (B-29) (B-30) NZOR 2 -Cys- (B-19) -Z- -y (A-1) (A-6) (A-7) (B-1) R-HN-Phe- Gly-NH \ i cys-s-so; s-so; I I Cys-- -Cys-- S-S03" (A-11) S-SO3- -Cys (B-7) -x (A-20)(A-21) -Cys-Asn-OH l S-SO3- S-SO3- -CyS- (B-19) -y NZÓR 3 PL PL PL PL PL PL PL