Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia interferonu.Interferon jest to bialko wykazujace nieswoista aktywnosc przeciwwirusowa, co najmniej w ko¬ mórkach homologicznych, przez dzialanie na meta¬ boliczne procesy komórkowe obejmujace synteze RNA i bialka. Interferony sa przedmiotem zainte¬ resowania jalko potencjalne czynniki terapeutyczne pr.zeciwwirusowe i przeciwnowotworowe. Znana jest pewna ilosc typów interferonów, a mianowi¬ cie interferon a (leukocytowy), /? (fibrablastowy) i y (odpornosciowy). Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania interferonów «.Zródlem interferonów cc sa w pierwszym rzedzie lcrwinki biale, jednakze nie moga one zapewnic dostatecznych ilosci interferonu a potrzebnych do zastosowan klinicznych. Ostatnio opisano sposoby /wytwarzania interferonu a z transformowanych ko¬ mórek ludzkich, w szczególnosci ludzkich komórek limfoblastoidalnych [Advanceis in E&perimental Me- dicine and Biology, 110, 61^74 (1978), J. Clinical Microbiology, 7, 44—51 (1978)] i doprowadzono do produkcji interferonu a w duzej skali [Antimicro- bial Agents and Chemotherapy, 15, 420^127 (1979), Texas Report Biol. Med., 41, 175—178 (1981)].Sposób wytwarzania interferonu z ludzkich ko¬ mórek limfoblastoidalnych obejmuje stadia: prowa¬ dzenia hodowli komórek limfoblastoidalnych w od¬ powiednim podlozu, indukowania komórek w celu wytwarzania interferonu przez wprowadzenie in- 10 15 20 25 30 duktora, inkubacji komórek po indukcji i odzy¬ skiwania wytworzonego interferonu.Opisano szereg metod zwiekszenia wydajnosci in¬ terferonu w tych procesach.W jednej z tych metod komórki limfoiblastoidal- ne poddaje sie przez pewien okres czasu przed in¬ dukcja, dzialaniu czynnika wstepnego czyli „sty¬ mulatora". I tak, w europejskim opisie patento¬ wym nr 000'05i20 opisano sposób podwyzszania wy¬ dajnosci interferonu przez wstepne traktowanie (kwasem karboksylowym lub jego sola, w szcze¬ gólnosci masianem sodowym. Oipisano takze podo¬ bne traktowanie wstepne szeregiem innych zwiaz¬ ków [np. Virology, 99, 158—166 (1979), europejski opis patentowy nr 0008391)].W metodzie tej, komórki poddaje sie przez pe¬ wien czas, na przyklad okolo 48 godzin, przed in¬ dukcja, dzialaniu czynnika wstepnego, który zo¬ staje przed indukcja usuniety.W metodzie alternatywnej podwyzszenie wydaj¬ nosci interferonu uzyskujecie przez obnizenie tem¬ peratury hodowanych komórek przed, w trakcie lub po indukcji i[np. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 70, 3909—3913 (1973), Japanese J. Microbiology, 18, 217^222 (1974), Microbial ,Immunol., 24, 907—914 (1980), J. 'Gen. Virology, 56,, 163—174 (H98H)] - Z literatury wiadomo,, ze dodanie „stymulatorów" (wspomnianych powyzej) w czasie indukcji lub po niej, dziala szkodliwie na wydajnosc interferonu wytwarzanego przez komórki. W szczególnosci za- 149 5933 141 593 4 chodzi to w przypadku kwasów karbokisylowych, takich jak kwas v maslowy [np. Virology, 99, 158— —106 (1979), Biochem. Biophys. Res. Commun., 103, &06^812 (1981)].Obecnie stwierdzono, ze dodanie pewnych zwia¬ zków, okreslonych jako „czynniki wzmacniajace", w czasie indukcji, lub wkrótce rek limfotolastoidalnych, powoduje wzrost wydaj¬ nosci interferonuj Sposób wytwarzania interferonu, obejmujacy do¬ danie indulktora do komórek limfoblastoidowych podatnych na indukowanie z wytworzeniem interfe¬ ronu, polega wedlug wynalazku na tym, ze w cza¬ sie indukcji, lub wkrótce po niej, komórki poddaje sie dzialaniu czynnika wzmacniajacego, wybranego z tamid, alkiloacetamidy, acetanilid, alkoksyacetani- lidy, alkileno-bis-acetaimidy, N,N-dwumetylokapro- namid, dwumetylosulfotlenek, alkanokarbonamidy, alkilobenzamidy alkilo^2-imidazolidynony, 1-alkilo- -2-pirolidony, 2-piperydon, l-alkilo-2-piperydony, N-tlenek pirydyny i pochodne mocznika.Komórki limfoblastoidalne wybrane do wytwa¬ rzania interferonu, dobiera sie zaleznie od zada¬ nia, to tez, jezeli interferon przeznaczony jest do podawania ludziom, wybiera sie zazwyczaj komór¬ ki ludzkie. Uzywanymi w tym celu komórkami sa dogodnie komórki Namalwa lub inne odpowiednie linie komórek blastoidalhych. Linie komórek bla- stoidalnych, które mozna seryjnie namnazac w hodowli otrzymuje sie latwo z hodowli ludzkich leukocytów krwi obwodowej dobrze ustalonymi W. Scott, Int. J. Caneer, 3, 85'7—866 (1978), J. H.Hope, M. K. Horne, W. Scott, Int. J. Cancer, 4, \25<5^2!&0 (1909), R. S. Chang, H. D. Golden, Natu¬ re, 2®4, 359—360 (1971)]. Zgodnie z tym, leukocy¬ ty mozna otrzymac od osób zdrowych lub cho¬ rych, przy czym mozna je otrzymac „samorzut¬ nie", gdy komórki sa juz zakazone wirusem Epste- in — Biarra (BBV), albo mozna je uzyskac z ho¬ dowli leukocytów, które nie sa zakazone EBV, np. elukocytów krwi pepowinowej, do których dodano EBV.Linie, komórek limfófolastoidalnyoh mozna latwo otrzymac z komórek pacjentów z chloniakiem Bur- kiltfa, poniewaz sa one juz zakazone EBV. Jedna z tych linii,. Naimalwa, otrzymana w Sztokholmie przez prof. G. Kleina [O. Nyormoi, G. Klein, A.Adams, L. Dombos, Int. J. Cancer, 12, 396^408 (1973)] pochodzila z koniórek uzyskanych od afry¬ kanskiej dziewczynki o tym imieniu. Stwierdzono, ze komórki tej linii, wytwarzaja znaczne ilosci in¬ terferonu, gdy sa odpowiednio stymulowane [H.Strander, K. E. Mogesen, K. Cantell, J. Clin. Mi- crobiol., 1, 116—117 (1976), G. J. Christophinis, C.M. -Steel i N. B. Finter., J. 'Gen. Virol., 52, 169—171 (1981)]. SubkujLture tej linii komórkowej otrzymano od dr lona Gressera i(Villejuif, Francja) w stycz¬ niu 1975 r. "W tym czasie linia byla zaadaptowana do wzrostu w podlozu RMPI' 1640 zawierajacym 10% plodowej surowicy cielecej. W Wellcome Re¬ search Laiboratories komórki zaadaptowano do wzrostu w tym samym podlozu uzupelnionym i5i—7»/o surowicy otrzymanej od 6—8-miesiecznych cielat i w czasie 18 miesiecy zakladano subkultu¬ ry 2—3 razy tygodniowo.. Jako bank macierzysty tych komórek, obecnie zwanych Namalwa/WRL, zlozono pewna ilosc ampulek, które przechowywa- 5 ,ne sa w cieklym azocie. Wykazano, ze komórki te sa wolne od zakazenia Mycoplasima i próbki zdeponowano w American Type Culture Collection (7 lipca 1978, pod nr CRL 1432).W przykladach' opisanych w dalszej czesci ni- 10 hiejszego opisu uzyto komórek Namalwa/WRL, ale jsposób wedlug wynalazku mozna zastosowac tak- £e i do innych subkultur komórek Namalwa oraz innych odpowiednich komórek limfoblastoidalnych.) Termin „czynnik wzmacniajacy" odnosi sie w 15 ' niniejszym opisie do jakiegokolwiek zwiazku, któ¬ ry dodany w trakcie indukcji, lub 'Wkrótce ipo niej, powoduje istotny wzrost wydajnosci interferonu w stosunku do wydajnosci uzyskiwanej w przypadku, gdy czynnik ten jest nieobecny. 20 Stwierdzono, ze liczne, chemicznie rózne, zwiazki sa skuteczne jako czynniki wzmacniajace. Wsród mich istnieje pewna ilosc zwiazków uprzednio opi¬ sanych jako stymulatory" do- wstepnego potrak¬ towania komórek przed indukcja. Tym niemniej, 25 korzystne stymulatory, a mianowicie /kwasy alka- • nokarboksylowe, a w szczególnosci kwas maslo- iwy, ..oraz ich sole, a takze steroidy, takie jak de- ksametazon, nie sa czynnikami wzmacniajacymi i wywoluja obnizenie wydajnosci interferonu, jesli 30 sa obecne przy indukcji lub ipo niej.Poszczególne zwiazki, co do których stwierdzo¬ no, ze sa skuteczne jako czynniki wzmacniajace, isa takze skuteczne w róznicowaniu komórek, Frien- ida, aczkolwiek nie wszystkie czynniki powodujace 35 róznicowanie komórek Frienda sa aktywne jako czynniki wzmacniajace.Do skutecznych czynników wzmacniajacych nale¬ ca N-acetylo-p-aminofenol, acetamid i alkiloaceta¬ midy, takie jak N-metyloacetamid, N,N-dwumety- 40 loacetamid, N-etyloacetamid, , N,N-dwuetyloaceta- imid, N-butyloacetamid i N-acetylo-6-hydroksyhe- ksyloamina, acetanilid i alkoksyacetanilidy, takie jak p-etoksyacetanilid, alkileno-fois-acetaimidy, w szczególnosci C^g-allkilenoacetamidy,, takie jak sze- 45 sciometyleno-ibis-acetamid, pieciometyleno^bis-ace- tamid i siedmiometyleno-bis-acetamid, N,N-dwume- tylokapronamid, dwumetylosulfotlenek, alkanokar¬ bonamidy, takie jak propionamid, i butyramid, al¬ kilobenzamidy, takie jak N-metylobenzamid, al- 50 kilo-2-imidazolidynony, takie jak l,3-dwumetylo-2- -imidazolidyna, l-alkilo-2-pirolidony, takie jak 1- -;metylo-2-pirolidon i l-etylo-2^pirolidon, 2-pipery¬ don i l-alkilo-2^piperydony, takie jak l-metylo-2- -piperydoin, N-tlenek pirydyny oraz pochodne mo- 55 cznika, takie jak czterometylotiomocznik i alkilo- moczniki, np. 1-metylomocznik, 1-etylo-mocznik, 1- -propylomocznik 1,1-dwumetylomocznik, 1,3-dwu- metylomocznik i 1,3-dwuetylomocznik. Grupy al¬ kilowe wystepujace w powyzej wymienionych zwia- 60 zkaah zawieraja 1—6, korzystnie 1—4 atomy we¬ gla.Do szczególnie korzystnych zwiazków naleza N- -acetylo-p-aminofenol, N^N-dwumetyloactamid, 1;3- -dwumetylo-2-imidazolidynon, dwuimetylosulfotle- 65 nek, p-etoksyacetanilid, szesciometyleno-bis-aceta-5 mid, N-metyloacetamid, i-metylopiperydon, 1-mety- lo-2-pirolidon i czterometylomocznik.W celu wytworzenia interferonu, wybrane ko¬ mórki musza byc najpierw hodowane w warunkach odpowiednich i dogodnych dla danego typu komó¬ rek lub szczepu, jak to udokumentowano w pis¬ miennictwie. I tak np. ludzkie komórki limfoblasto- idalne, takie jak linia komórkowa Namalwa, ro¬ sna latwo w zawiesinie w podlozu wzrostowym, takim jak RiPMI 1640 [G. E. Moore i Wsp., J.Amer. Med. Assoc, 199,. 519'—©124 (10G7) uzupelnio¬ nym surowica, taka jak surowica cieleca lub su¬ rowica konska, zazwyczaj w ilosci 5—lOtyo (obj/ W celu wytworzenia interferonu, komórki lim- foblastoidalne, takie jak komórki Namalwa, ho¬ duje sie najpierw w zawiesinie az do osiagniecia odpowiedniego stezenia. Stezenia, warunki itp. wy¬ magane do produkcji interferonu sa dobrze zna¬ ne i beda jasne dla znawców.W tym wlasnie stadium - dodaje sie czynnik wzmacniajacy. Najlepiej czynnik ten dodaje sie w czasie indukcji, to znaczy wtedy, kiedy dodaje sie substancje indukujaca, taka jak wirus Sendai, w celu indukowania wytwarzania interferonu. Ozna¬ cza to, ze czynnik wzmacniajacy wprowadza sie do podloza dla zawiesiny komórek bezposrednio przed indukcja, albo do zawiesiny komórek bezposrednio po indukcji. Tym niemniej jednak, korzysci ze sposobu wedlug wynalazku mozna jeszcze ciagle uzyskiwac przy wprowadzaniu czynnika wzmacnia¬ jacego nawet po uplywie .pewnego czasu, np. do okolo 2 godzin, od indukcji.Ilosc zastosowanego czynnika wzmacniajacego be¬ dzie ograniczona jego toksycznoscia w stosunku do linii komórkowej, jednakze powinien^ on byc obec¬ ny w ilosci skutecznej jesli chodzi o powodowanie zwiekszenia wytwarzania interferonu. Optymalne stezenie uwzgledniajace zarówno toksycznosc jak i zwiekszenie produkcji interferonu bedzie sie zmie¬ niac w zaleznosci od rodzaju wybranego czynni¬ ka, ale na ogól powinno byc tak dobrane, aby za¬ pewnialo koncowe stezenie od 0,1 do 500 mM, ko¬ rzystnie 1—"200 mM, najkorzystniej okolo 5 do 50 mM.Warunki przeprowadzenia indukcji i nastepujacej po niej inkubacji moze zrealizowac kazdy obzna- jomiony z tego rodzaju procesami w tej dziedzi¬ nie wiedzy. I tak np., komórki mozna ponownie zawiesic w podlozu RiPMI 1640, nie zawierajacym surowicy, albo uzupelnionym surowica w ilosci do 5*/o obj/obj, z otrzymaniem koncowego stezenia ko¬ mórek od 0,25 do 6X.10fl. komórek/iml, korzystnie 0,5 do 3X10* komórek/ml. Do zawiesiny komórek dodaje sie odpowiedni induktor, taki jak wirus, np. wirus Sendai [M. D. Johnston, J. Gen. Viol., 56, 175^184 (1981)] do koncowego stezenia 5 do 200 jednostek hemaglutynacyjnych/ml (HAU/ml). ko- rzystnie\ 20 do '50 HAU/ml. Po dokladnym wymie¬ szaniu zawiesine komórek inkubuje sie przez okres 12 do 48 godzin w temperaturze od 34 do 37°C.Np. w temperaturze 351°C zawiesine komórek mo¬ zna dogodnie inkubowac przez noc i w tym cza¬ sie nastepuje uwolnienie interferonu z komórek do podloza. Po inkubacji komórki usuwa sie, np. 1593 6 przez odwirowanie, w/ wyniku czego pozostaje ciecz znad osadu zawierajaca surowy interferon, który .mozna, jesli jest to pozadane, oczyscic znanymi metodami. 5 Podwyzszenie wydajnosci, która mozna uzyskac za pomoca uzycia czynnika wzmacniajacego, jak zdefiniowano w niniejszym opisie, moze byc za¬ sadnicze. Wzrost wydajnosci 'moze nastapic az do wartosci 5 razy wiekszej od otrzymywanej w przy- io padku nieobecnosci tego czynnika.Jak dotychczas, nie jest w pelni zrozumialy mechanizm, dzialania czynnika wzmacniajacego./Tym niemniej dane wskazuja na to, ze szybkosc wytwarzania interferonu wzrasta w stosunku do 15 przypadków gdy czynnik wzmacniajacy jest nie¬ obecny. Przyjmuje sie, ze stanowi to konsekwencje wydluzenia czasu, w którym miRJNA interferonu jest transkrybowany, to jest rzeczywistej superin- dukcji. 20 Stosowanie czynników wzmacniajacjtoh wedlug wynalazku, wydluza okres czasu w którym zacho¬ dzi wzrost szybkosci wytwarzania interferonu w stosunku do okresu „normalnie uzyskiwanego'.Termin „normalnie uzyskiwany'' oznacza okres czasu, który osiaga sie w przypadku wytwarzania interferonu przez komórki limfolblastoidalne zna¬ nymi metodami, bez jakiejkolwiek interwencji prowadzacej do zmiany okresu czasu, w którym wzrasta szybkosc wytwarzania interferonu. 30 Korzystnie sposób wedlug wynalazku mozna po¬ laczyc ze sposobami znanymi w celu zwiekszenia wydajnosci interferonu z linii komórek limfoblasto- idalnych. Tak wiec, mozna polaczyc zarówno spo- 35 eób z obnizeniem temepratury, jak i sposób ze wstepnym podzialaniem stymulatorem przed induk¬ cja ze sposobem opisanym w niniejszym opisie - patentowym. Prowadzi to do osiagniecia wyzszej wydajnosci interferonu od wydajnosci, która mo- 40 zna uzyskac za pomoca kazdego z tych sposobów osobno., W szczególnosci stwierdzono, ze korzystne jest uzycie stymulatora do wstepnego traktowania ko¬ mórek przed indukcja (jak opisano w europejskich 45 opisach patentowych nr nr 0000520 i 00O83O1, wla¬ czonych do niniejszego opisu jako odnosniki)..Jezeli stymulator dziala takze jako czynnik wzmacniajacy, mozna go uzyc do spelnienia oby¬ dwu tych funkcji. Tym niemniej jednak, korzy- 50 stne jest przeprowadzenie wstepnego traktowania w sposób opisany w europejskim opisie patentowym nr 0000520, czyli z zastosowaniem kwasu alkano- karboksylowego lub jego soli, a w szczególnosci kwasu maslowego lub maslanu sodowego. 55 Wynalazek obejmuje swoim zakresem takze spo¬ sób wytwarzania interferonu obejmujacy dodanie induktora do komórek limfoblastoidalnych podat¬ nych na indukowanie z wytworzeniem interferonu, polegajacy na tym, ze przed indukcja inkubuje 60 sie komórki w podlozu zawierajacym skuteczna, nietoksyczna ilosc stymulatora korzystnie kwasu alkanokarboksylowego ó 1—6 atomach wegla lub * jego soli szczególnie kw. maslowego, a czynnik wzmacniajacy, jak wyzej, zdefiniowano, dodaje sie •5 w czasie indukcji lub wkrótce po niej.7 141 593 s Przyklad I. Wplyw czynników wzmacniaja¬ cych na wydajnosc interferonu, W serii eksperymentów prowadzi sie hodowle komórek Namalwa/WRL w zawiesinie w podlozu RPiMI 1640 zawierajacym 6|% surowicy bydlecej od osobników doroslych, polimyksyne i neomycy¬ ne, oraz weglan sodowy w celu utrzymywania sta¬ lej wartosci ipH. Po osiagnieciu stezenia 2X106 ko¬ mórek/ml ipoibiera sie czesc hodowli i rozciencza tym samym podlozem do stezenia lX10fl komórek/ \/ml. Dodaje sie maslan sodowy do stezenia 1 mM i inkubuje komórki prowadzac .mieszanie w tempe¬ raturze 37°C w ciagu 48 godzin.Po uplywie czasu inkubacji komórki odzyskuje sie przez odwirowanie przy 800 X g. Osad komórek .zawiesza sie w podlozu RPMI 1640 zawierajacym 2jV< surowicy bydlecej od osobników doroslych i doprowadza do stezenia 3Xl0fl komórek/ml. Doda¬ je sie wirus Sendai do stezenia 10 jednostek he- maglutynacyjnych/ml w celu indukcji tworzenia sie interferonu. Indukowane komórki zawiesza sie w objetosci 10 :ml w 25 ml plaistykowych kolbach do hodowli tkanek. Zawartosc kazdej kolby zada¬ je sie innym czynnikiem wzmacniajacym, jak to wykazano w ponizszej tablicy 1, we wskazanym stezeniu. Dwie kolby nie zawieraja dodatków. In¬ terferon odzyskuje sie po uplywie 24 godzin przez odwirowanie komórek przy 8'0I0 X g w ciagu 5 minut. Podloze, w postaci klarownej cieczy znad osadu, zawierajace interferon, zakwasza sie do pH 2 i utrzymuje w temperaturze 4°'C w ciagu 24 godzin przed oznaczeniem interferonu. Dla kaz¬ dego czynnika wzmacniajacego oznacza sie wzrost miana interferonu w stosunku do standardowej ,próby kontrolnej (do której nie dodano czynnika wzmacniajacego). Wyniki przedstawiono w tabli¬ cy 1.Tablica 1 Czynnik wzmacniajacy dodany do indukowanej hodowli 1 acetamid acetanilid N-acetylo-6-hydroksyhe- Jesylo-amina N-butyloacetamid butyramid .NyN-dwuetylpacetaimid 1,3-dwuetylomocznik .NjN-dwumetyloacetamid N,N-dwumetylokapro- namid 1,3-dwumetylo-2-imi- dazolidynoin dwumatylosulfotlenek 1,1-dwumetylomocznik 1,3-dwumetylomocznik Koncowe istezenie czynnika Wzmacnia¬ jacego !(mM) 2 20 2 5 15 10 10 6 5 3 2 140 10 5 Wzrost imiana in¬ terferonu w stosun¬ ku do pró- Iby kon¬ trolnej 3 2 2 3 5 3 4 3 2 2 3 4 2 3 10 15 20 p-etoksyacetanilid N-etyloacetamid N-etylopirolidynon etylomocznik szesciometyleno-bis- -acetamid p-hydroksyacetanilid N-metyloacetamid (N-metylobenzamid iN-metylo-ft-piperydon JSr-metylo-2-pirolidynon metylomoeznik 2^piperydon propionamid propylomocznik -N-tlenek pirydyny czterometyloitiomocznik czterometylomoc znak 30 35 40 45 50 55 80 2 10 . 6 20 !5 S 10 4 -15 10 SO 25 20 10 5(0 5 8.4 P r z y k l a d II. Wplyw czynnika wzmacniaja¬ cego na wydajnosc interferonu przy wstepnym [traktowaniu lufo bez wstepnego traktowania ma- Islanem.Komórki !Namalwa/WRL3 hodowane jak opisano jw przykladzie I, rozciencza sie swiezym podlozem do stezenia 1X106 komórek/ml. Hodowle dzieli sie jrówno do dwu kolb obrotowych. Do jednej z nich dodaje sie maslan sodowy do stezenia 1 'mM. Dru¬ ga kolba pozostaje bez dodatku. Obydwie hodowle inkubuje sie prowadzac .mieszanie w ciagu 48 (godzin. Komórki inkubuje sie wirusem Sendai, jak opisano w przykladzie I. Nastepnie dodaje sie czynnik wzmacniajacy, jak wykazano w tablicy 2, we wskazanym stezeniu, tak do indukowanych .hodowli wstepnie potraktowanych, jak i nie po¬ traktowanych masianem sodowym. Odzyskuje sie initerferon i przygotowuje go do oznaczenia, jak fopisano w iprzykladzie I. Oznacza sie wzrost mia- jna interferonu w stosunku do standardowej próby kontrolnej. Otrzymane wyniki przedstawiono w ta¬ blicy 2.Tablica 2 Stezenie maslanu sodowego 'uzytego ido wstep¬ nego trak¬ towania komórek (Namalwa (mM) Czynnik wzmacniajacy dodany przy indukcji Stezenie czynnika wzmac¬ niajacego l(mM) Wzrost 'miana in¬ terferonu w stosun¬ ku do pro¬ sby kon¬ trolnej brak acetanilid N,N-dwume- ityloacetamid7 141 593 8 1 0 0 0 i 1 1 1 1 1 -' 2 dwumetylo- sulfotlenek N-metyloben- zamid czterometylo- imocznik brak acetanilid N^N-dwume- tyloacetamid dwumetylo- isulfotlenek N-metyloben- zamid czteromety¬ lomocznik 3 140 4 8,4 — 2 5 140 4 8,4 4 2 3 6 1 2 2 2 3 3 Tablica 3 Stezenie dwume- tylosulfotlenku 'uzytego do wste- iStezenie dwu- metylosulfo- , pnego trakto- tlenku .**fego wania komórek »rzy ™Jukc3i Namalwa (mM) (mM) 0 140 0 140 0 0 140 1140 iMiano inter¬ feronu (logio jednostek Wzglednych) (ml) 3,55 4,0 8,9 4,3 Przyklad IV. Kinetyka wytwarzania interfe¬ ronu w obecnosci i nieobecnosci czynnika wzmac¬ niajacego oraz przy wstepnym traktowaniu lub ibez wstepnego traktowania maslanem.Komórki /Namalwa/WRli,, hodowane jak opisano w przykladzie I, rozciencza sie swiezym podlo- 10 15 20 Przyklad III. Uzycie dwumetylosulfotlenku jako zarówno stymulatora jak i czynnika wzmac¬ niajacego.Komórki Namalwa/WRL, hodowane jak opisa- 25 no w przykladzie I, rozciencza sie swiezym pod¬ lozem do stezenia lX106 komórek/ml. Hodowle dzie¬ li sie równo do dwu kolb obrotowych. Do jednej z nich dodaje sie dwumetylosulfotlenek do ste¬ zenia 140 mM. Druga kolba -pozostaje bez dodatku. 30 (Obydwie hodowle inkubuje sie prowadzac mie¬ szanie w ciagu 48 godzin. Komórki odwirowuje isie przy .800 X g, zawiesza w swiezym podlozu do stezenia 3 X 106 komórek/ml i indukuje inter¬ feron jak opisano w przykladzie I. Dodaje sie 35 (dwumetylosulfotlenek, do' stezenia 140 mM, do indukowanej hodowli przygotowanej z komórek wstepnie potraktowanych dwuimetylosulf o tlenkiem, jak równiez, w tym samym stezeniu, do indu¬ kowanej hodowli przygotowanej z komórek nie 40 (potraktowanych wstepnie dwumetylosulfotlenkiem.Po uplywie 24 godzin odzyskuje sie interferon i przygotowuje do oznaczenia jak oipisano w, przy¬ kladzie I. 45 50 55 60 65 zem do stezenia 1 X 106. Hodowle dzieli sie ró- iwno do dwu kolb obrotowych. Do jednej z nich dodaje sie maslan sodowy do stezenia 1 mM, dru¬ ga kolba pozostaje bez dodatku. Obydwie hodowle inkubuje sie prowadzac mieszanie w ciagu 48 go¬ dzin. Komórki wiruje sie przy 800 IX g, ponow¬ nie zawiesza w swiezym podlozu z uzyskaniem ste¬ zenia 3 X 106 komóreki/ml i indukuje w celu wy¬ tworzenia interferonu, jak opisano w przykladzie I. Dodaje sie czterometylomocznik do stezenia 8,4 mM, do polowy indukowanej hodowli przygoto¬ wanej z komórek wstepnie potraktowanych masla- mem sodowym, jak równiez, w tym samym ste¬ zeniu, do polowy indukowanej hodowli nie potrak¬ towanej maslanem sodowym. Do pozostalych ho¬ dowli nie dodaje sie czterometylomocznika. Tak wiec, dochodzi do utworzenia czterech grup ko¬ mórek indukowanych, zlozonych z komórek wstep¬ nie potraktowanych maslanem sodowym i do któ¬ rych dodano, albo nie dodano, czteronretylomocz- nlka w czasie indukcji interferonu wirusem Sen- dai, oraz komórek nie potraktowanych wstepnie maslanem sodowym, do których albo dodano, albo nie dodano czterometylomocznika w czasie indukcji interferonu wirusem Sendai. W odstepach 2-go- dzinnych jedna hodowle z kazdej z czterech grup odwirowuje sie przy 800 X g. Oddziela sie podlo¬ ze, a z osadu komórek odciaga sie ciecz, mozliwie w calosci. Nastepnie komórki ponownie zawiesza sie w pierwotnej objetosci swiezego podloza, do którego dodaje sie czterometylomocznik, jezeli byl. on obecny w podlozu przed wirowaniem. Po uply¬ wie dalszych 2 godzin inkubacji, interferon odzy¬ skuje sie z tych samych hodowli jak ojpisano w przykladzie I.Tablica 4 Miano interferonu (log10 jednostek wzglednych/ml) Ostep czasu po indukcji fpo którym odzyskuje sie inter¬ feron (godziny) Komórki Namalwa nie potraktowane wstepnie maslanem sodowym Komórki Na¬ malwa potrak¬ towane wstep¬ nie 1 mM ma¬ slanem sodo¬ wym Brak wzmocnie¬ nia. Czyn¬ nik doda¬ ny przy indukcji 8,4 mM ¦cztero- inietylo- mocz- nik do¬ dany przy "Induk¬ cji Brak wzmo¬ cnienia., Czyn¬ nik do¬ dany przy induk- • cii 8,4 mM cztero- metylo- imocz- nik do¬ dany przy induk¬ cji 0—2 2—4 4-^6 6—& 8—10 10—12 12^14 14-16 16—18 0,715 0,75 1,8 2,515 2,7 2,8 2,6 12,6 2,45 0,75 0,75 1,7 2,9 3,5 3,7 3,75 3,7 3,05 1,05 2,6 4,05 4,26 4,1 3,95 3,55 3,25' 3,15i 1,05 2,7 4,2 4,65 4,9 4,65 4,5 4,1 3,959 141 593 10 [Przyklad V. Wplyw dodania maslanu na< in¬ dukcje przy wistepnym traktowaniu lu'b bez wstep- mego traktowania maslanem.Komórki iNamalwa/WRL, hodowane jak opisa¬ no w "przykladzie I, odwirowuje sie przy 800 X g, nastepnie zawiesza w swiezym podlozu do stezenia 3 X 106 komórek/mi i indukuje w celu wytworze¬ nia interferonu jak opisano w przykladzie I. Bez¬ posrednio po indukcji wirusem Sendai dodaje sie maslan sodowy do stezenia uwidocznionego w ta¬ blicy 5. Po 'Uplywie 24 godzin inkubacji odzyskuje sie w podlozu interferon jalk opisano w przykla¬ dzie I.Tablica Stezenie anaslanu sodowego . dodanego do indukowa¬ nych hodowli 0 0,1 0,2 0,5 1 2 6 10 (mM) 6 Miano ((logio interferonu i jednostek wzglednydh/ml) 4,38 4,32 4,33 4,27 4,17 4,14 3,93 3,83 15 20 25 30 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania interferonu, obejmujacy dodanie, induktora do komórek limfoblastoidalnych podatnych na indukowanie z wytworzeniem inter¬ feronu, znamienny tym, ze w czasie indukcji, lub wkrótce po niej, kjomórki poddaje sie dzialaniu 35 czynnika wzmacniajacego, wybranego z grupy o- bejmujacej N-acetylo-p-aiminofenol, acetamid, alki- loacetamidy, acetanilid, alkoksyacetanilidy, alkile- no^bis-acetamidy, N,N-dwumetylo,kapronamdd, dwu- metylosulfotlenek, alkanokairbónamidy, alkiloben- zamidy, alkilo-2-imidazolidynony, l-alkilo-2-piroli- dony, 2-piperydon, l-alkilo-2-pifperydony, N-tlenek pirydyny i pochodne mocznika. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako czynnik wzmacniajacy stosuje sie N,iN^dwu- metyloacetamid, 1,3-dwumetylo^-imidaizolidynon, p- -etoksyacetanilid, szesciomatyleno^bis^acetamid, 1- -metyliopiperydon lub czterometylomocznik. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze czynnik wzmacniajacy stosuje sie w ste¬ zeniu 0,1^500 mM. 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze czynnik wzmacniajacy stosuje sie w stezeniu 1— 200 mM. 6. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze czynnik wzmacniajacy stosuje sie w stezeniu 5'—SIO mM. 6. Sjposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze czynnik wzmacniajacy dodaje sie w czasie induk¬ cji. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze czynnik wzmacniajacy dodaje sie w ciagu 2-go- dzinnego okresu czasu po indukcji. 8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze komórki poddaje sie przed indukcja wstepnemu dzialaniu stymulatora. 9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze jako stymulator stosuje sie prostolancuchowy kwas alkanokarboksylowy o 1—6 atomach wegla lub je¬ go sól. 10. sposób wedlug zastrz. 9, znamienny tym, ze jak|o kwas alkanokarboksylowy stosuje sie kwas maslowy.DN-3, zarn. 572/87 Cena 130 zl PL PL PL PL PL PL PL PL