Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych soli izotiouroniowych. Zwiaz¬ ki te maja dzialanie przeciwnowotworowe i przeciwstymulacyjne i moga byc stosowane w te¬ rapii u ludzi i zwierzat.Sposobem wedlug wynalazku wytwarzane sa nowe zwiazki i sole o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupe C^_^-alkilowa, C2-6-alkenylowaf C2_£-alkinylowa, C^-cykloalki- lowaf aralkilowa lub arylowa, wymienione grupy moga byc dowolnie podstawione przez Jedna lub wiecej grupe hydroksylowa, merkaptanowa i/lub chlorowiec, albo grupa glicydylowa, R oznacza atom wodoru, grupe C^^-alkilowa, C2_£-alkenyIowa, C2_£-alkinylowa lub C^^-cyklo- alkilowa, X oznacza atom chlorowca z zastrzezeniem, ze jezeli R oznacza atom wodoru, R oznacza inna grupe niz metylowa, etylowa lub benzylowa.Okreslenie "grupa C.^-alkilowa" oznacza prosty lub rozgaleziony lancuch nasycone¬ go alifatycznego weglowodoru np. grupe metylowa, etylowa, n-propylowa, izopropylowa, n-butylowa, izobutylowa itd. Okreslenie "grupa C2_£-alkenylowa" oznacza prosty lub rozga¬ leziony lancuch nienasyconych olefin np. grupe winylowa, allilowa, metyloallilowa itd.Okreslenie "grupa C2_£-alkinylowa" oznacza prosty lub rozgaleziony lancuch alifatyczny zawierajacy co najmniej jedno potrójne wiazanie np. grupe propargilowa itd. Okreslenie "grupa C, r-cykloalkilowa" oznacza cykliczny nasycony alifatyczny weglowodór np. grupe cyklobutylowa, cyklopentylowa, cykloheksylowa itd. Okreslenie "grupa arylowa" oznacza so¬ no- i policykllczny weglowodór np. grupe fenylowa^ naftylowa itd. Okreslenie "grupa aral¬ kilowa" oznacza grupe alkilowa podstawiona przez co najmniej Jedna grupe arylowa np; gru¬ pe benzylowa,/3 -fenyloetylowa itd. Okreslenie "chlorowiec" oznacza ateny fluoru, chloru, bromu i jodu. 145 6362 145 636 Wymienione grupy alkilowa, alkenylowa, alkinylowa, cykloalkilowa, arylowa i aral- kilowa moga zawierac dowolnie jeden lub wiecej podstawników takich jak grupa hydroksylo¬ wa, ¦merkaptanowa i chlorowiec np. grupa 2-chloro-etylowa, 3-bromo-propylowa, 2-hydroksy- etylowa, 3-chloró-2-hydroksy-propylowa itd.Preferowana grupa zwiazków o ogólnym wzorze 1 sa takie pochodne, w których R jest grupa allilowa. Dalsza preferowana grupa zwiazków o ogólnym wzorze 1 sa te pochodne, \ 2 w których R jest' grupa 2-chlorowcoetylowa. R oznacza korzystnie atom wodoru, grupe me¬ tylowa, etylowa, n-propylowa, izopropylowa, n-butylowa, allilowa lub cykloheksylowa. X oznacza anion halogenkowy, szczególnie chlorek, bromek lub jodek* Szczególnie preferowanymi przedstawicielami zwiazków o ogólnym wzorze 1 sa farma¬ ceutycznie dopuszczalne sole nastepujacych pochodnych: sole N-aminoimino-etylo-S-metylo- izotiouroniowe, N-aminoiminometylo-S-propylo-izotiouroniowe, N-aminoiminometylo-S-allilo- izotiouroniowe, N-aminoiminometylo-S-/2-chlorxetylo/-izotiouroniower N-amino-iminometylo- S-/l-chloro-2-hydroksy-propylo/-izotiouroniowe, N-aminoiminometylo-S-/3-chloro-propylo/- -izotiouroniowe, N-aminiminometylo-S-/2-hydroksy-etylo/-izotiouroniowe, N-aminoiminomety- lo-S-glicydylo-izotiouroniowe. Dalszymi preferowanymi zwiazkami o ogólnym wzorze 1 sa sole N-aminoiminometylo-N'-alkilo-S-allilo-izotiouroniowe, szczególnie odpowiednie zwiaz¬ ki N#-metylo, N'-etylo, N'-n-propylo i N'-izopropyle Sposób wedlug wynalazku wytwarzania zwiazków o ogólnym wzorze 1 i ich soli polega na tym, ze zwiazek o ogólnym wzorze 2, w którym R oznacza grupy przedstawione powyzej A lub jego sól weglanowa poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o ogólnym wzorze R - Y, w którym -i R oznacza grupy przedstawione powyzej, a Y oznacza atom chlorowca i ewentualnie tak ot¬ rzymany zwiazek przeprowadza sie w sól w reakcji z kwasem, W wymienionych reakcjach two¬ rza sie sole izotiouroniowe. Reakcji towarzyszy na ogól powstanie N-alkilowanych produk¬ tów ubocznych.Wedlug preferowanej formy przeprowadzania procesu zwiazki wyjsciowe o ogólnym wzorze 2 nie sa uzywane w postaci wolnych zasad lecz w postaci odpowiedniej soli - szcze¬ gólnie weglanu. W ten sposób zmniejszone jest wytwarzanie N-alkilowanych pochodnych praw¬ dopodobnie wskutek tego, ze wydzielajacy sie dwutlenek wegla obniza pH silnie zasadowego srodowiska. Reagenty mozna stosowac w ilosciach równomolowych lub mozna dodac srodek al¬ kilujacy w nadmiarze. Jako srodowisko reakcji mozna stosowac obojetne organiczne rozpusz¬ czalniki, korzystnie alkohol, alifatyczny keton, alifatyczny nitryl lub eter. Reakcje mozna przeprowadzac pod cisnieniem atmosferycznym i w temperaturze 20 - 80°C. Wedlug pre¬ ferowanej postaci sposobu wyjsciowy zwiazek o ogólnym wzorze 2 i srodek alkilujacy podda¬ je sie reakcji w stosunku molowym 1:1 - 1:1,8, w bezwodnym etanolu, acetonitrylu, dwume- tyloformaraidzie, acetonie lub eterze, w temperaturze 20 - 30 C. Wiazki wyjsciowe o ogól¬ nym wzorze 2 sa znaczne lub moga byc wytworzone znanymi metodami. W ten sposób N-amino- iminometylotiomocznik mozna latwo wytworzyc poddajac dicyano-diamid reakcji z siarkowo¬ dorem (Houben-Weyl VIII., 214). Pochodne N-aminolminometylo-N'-alkilo-tiomocznika o ogólnym wzorze 2 mozna wytworzyc poddajac guanidyne (zasade) reakcji z odpowiednim izo- tiocyanianem alkilowym (US patent No. 4,009, 163).Otrzymany w ten sposób produkt przeksztalca sie w farmaceutycznie dopuszczalna sól wytworzona z organicznym lub nieorganicznym kwasem. Do wytworzenia soli korzystnie stosuje sie nastepujace kwasy: mrówkowy, mlekowy, cytrynowy, maleinowy lub siarkowy, chlorowodorowy, fosforowy, bromowodorowy.Zwiazki o ogólnym wzorze 1 maja przeciwnowotworowe i przeciwpasozytowe i immunosty- mulacyjne wlasnosci. Sila i kierunek dzialania oraz toksycznosc zalezy od podstawników w czasteczce. Wiadomo, ze gutimina, która jest pod wzgledem budowy podobna do zwiazków o ogólnym wzorze 1, byla badana jako srodek przeciwko niedotlenieniu (C.A. 66, 432,929 /1972/; Pathol. Efcys. Exp. Ther. 10, /6/) w farmakologicznych i klinicznych testach Ja¬ ko substancja powodujaca mikrokrazeniowe zaburzenia (Gematol, Transfusiol. /1984/, 29 /1/, 49-52).145 636 3 Stwierdzono, ze zwiazki o ogólnym wzorze 1 sa zdolne do zwiekszenia obnizonej na¬ turalnej odpornosci organizmu do wartosci prawidlowej lub podwyzszenia odpornosci powy¬ zej normalnego poziomu* Organizm ludzki i zwierzecy posiada system immunologiczny np. system eliminujacy nowotwory. Gdy aktywnosc wspomnianego systemu Jest zmniejszona lub przestaje on dzialac, zjawiaja sie rózne choroby i nowotwory. Zwiazki o ogólnym wzorze 1 pobudzaja naturalne systemy immunologiczne i sa w ten sposób uzyteczne we wszystkich przypadkach kiedy pozadane jest zwiekszenie obnizonej aktywnosci systemu immunologiczne¬ go i dalsze podwyzszenie jego normalnej aktywnosci.Zwiazki o ogólnym wzorze 1 wykazuja dalsze uzyteczne dzialania biologiczne, np. leczenie zaburzen mikrokrazeniowych, wiazanie rodników szkodliwych dla zdrowia, poprawa dzialania i wydluzenie czasu zycia komórek bedacych w stanie deficytu tlenowego.Czynnosc biologiczna zwiazków o ogólnym wzorze 1 przedstawiaja ponizsze testy.Stwierdzono jednakze, ze nie sa pokazane wszystkie oddzialywania tych wysoko aktywnych zwiazków.Badanie specyficznych dzialan.Testy immunologiczne. Limfocyty. Limfocyty wydzielano przy gradiencie Ficoll-Uro- miro (on Ficoll-Uromiro gradient) (Bflyum 1968) z krwi zylnej zdrowych dawców i z krwi chorych na zlosliwa bialaczke i na przerzutowe lite nowotwory. Przy selekcji pacjentów nalezacych do ostatniej grupy brano pod uwage zmniejszona aktywnosc ADCC i NK. Fagocyty usuwano dzialajac sproszkowanym zelazem i magnesem. ADCC. ADCC oznaczano metoda Perlman- na i Perlmanna (1970) z niewielkimi modyfikacjami (Lang i in., 1981). Erytrocyty kurczat 5 51 znaczone 10 J Cr i splaszczone surowica królicza z przeciwkurczeciowymi erytrocytami inkubowano z limfocytami w czasie 4 godzin w temperaturze 37°C. Reakcje stopowano i oz¬ naczano w liczniku gamma radioaktywnosc supernatantu po odwirowanych komórkach. Stopien odlaczenia chromu wyrazano jako wskaznik cytotoksycznosci (CI #). Wartosc te wyliczano w sposób opisany we wczesniejszych publikacjach (Lang i in., 1980) (Tablica 1). NK: Czyn¬ nosc NK oznaczano metoda Jondala i Prossa (1973) z zastosowaniem niewielkich modyfikacji (Lang i in., 1981). 51 Komórki nowotworu K-562 znaczone Cr inkubowano z komórkami efektorowymi w srodo¬ wisku cieklej pozywki TC 199 zawierajacej 10# surowicy cielecej pozbawionej dopelniacza.Reakcje stopowano i mierzono w liczniku gamma radioaktywnosc supernatantu z uwolnionym chromem po odwirowaniu komórek. Zabicie komórek docelowych (indeks cytotoksycznosci %) wyrazano jako róznice odlaczenia testowego 1 odlaczenia spontanicznego.Obliczenia statystyczne przeprowadzono przy pomocy jednopróbkowego testu. Kilka zwiazków o ogólnym wzorze 1 wykazuje znakomite dzialanie immunostymulacyjne np. zwiazki wytworzone wedlug przykladów XI, XII i XVI. Wymienione zwiazki sa zdolne znaczaco zwiek¬ szyc normalna i silnie obnizona czynnosc komórkowa NK i K, nawet powyzej normalnego po¬ ziomu. Efekt ten moze byc tak silny, ze cytotoksyczna czynnosc zmniejszona do jednej dziesiatej poczatkowej wartosci moze byc przywrócona do poziomu poczatkowego (Tablica 2).Vf zakresie dawki odpowiadajacej oczekiwanemu stezeniu ludzkiej plazmy zwiazki o ogólnym wzorze 1 zwiekszaja NK i K komórkowa czynnosc limfocytów ludzkich i wzmacniaja reakcje NCMC i ADCC, odpowiednio w stopniu zaleznym od dawki. Wedlug wstepnych wyników dalszych testów immunologicznych zwiazki te zwiekszaja blastyczna transformacje i migra¬ cje. Przeprowadzenie podstawienia przy atomach azotu powoduje zwykle zmniejszenie molo¬ wego proporcjonalnego immunostymulacyjnego efektu zwiazanego z toksycznoscia.Poniewaz cytotoksyczna czynnosc pacjentów z choroba nowotworowa jest zmniejszona proporcjonalnie do stadium choroby i ponadto jest dalej redukowana przez normalne lecze¬ nie cytostatyczne, jest sprawa bardzo wazna, ze ^iazkl o ogólnym wzorce 1 posiadaja silne dzialanie immunostymulacyjne i nie sa immunodepresoraml. Fakt ten moze byc bardzo znaczacy z punktu widzenia rekonwalescencji.4 145 636 Migracja leukocytów* Spontaniczna (przypadkowa) migracje leukocytów mierzono na agarozowych mikrokroplach wedlug metody McCoy i.in. (1977) z wprowadzonymi pewnymi niewielkimi modyfikacjami (Kalmar i Gergelyf 1982). 2 ml krople agarozowe (0,2%) umieszczano na plytkach migracyjnych (Greiner, Repub¬ lika Federalna Niemiec). Dodawano ciekla pozywke TC 199 1 zamykano szczelnie plytki. Po 2 24 godzinach obszar migracji mierzono w stereomikroskopie. Pole migracji wyrazano w mm .Migracja leukocytów. Bezposrednia (przypadkowa) migracje poljjnffonuklearnych ko¬ mórek zdrowych dawców zwiekszono zwiazkami wytworzonymi wedlug przykladów XI, XII i XIV. Optymalna dawka wynosila do 1,0 jig/ml. Przy wyzszej dawce 10 ig/ml efekt byl mniej wyrazny (Tablica 3).Transformacja blastyczna indukowana mitogenami. Limfocyty namnazano w srodowisku cieklej pozywki TC 199 uzupelnionej 1096 surowicy cielecej pozbawionej dopelniacza, anty¬ biotykami i 25 mH HEPES (Serva). 200 pi zawiesiny komórek zawierajacej 2 x 105 limfocy¬ tów umieszczano na mikroplytce (producent: Sterilin Wielka Brytania); przygotowano piec równoleglych próbek.Do kultur dodano 2 i 10 ^ig/ml kolejno fitohemaglutyniny /leukoaglutyniny (produ¬ cent Pharmacie Szwecja) i 25 ig/ml Konkanawaliny A (Calbiochem); powyzsze wartosci odno¬ sza sie do koncowego stezenia. Kultury kultywowano w temperaturze 37°C przez 72 godziny.Osiem godzin przed zakonczeniem okresu kultywacji dodano do próbek 0,5 uCi tymidyny- H (Chemapol, Czechoslowacja). Inkorporacje stopowano przez zamrozenie kultur. Po stopieniu kultury odsaczano na automatycznym aparacie do saczenia (Dynatech). Radioaktywnosc pró¬ bek mierzono w liczniku scyntylacyjnym. Aktywnosc wyrazano w c.p.m. czyli ilosci zliczen na minute (Tablice 4 i 5).Analiza statystyczna. Istotnosc oznaczano przy pomocy Jednopróbkowego testu 2T2.Wyniki otrzymane z produktem wytworzonym wedlug przykladu XI sa przedstawione w tablicach 1, 2 13. Wstepny szybki test oznaczania dzialania przeciwnowotworowego i immunostymula- cyjnego. Metode te opracowano w naszych laboratoriach do szybkiego badania duzej liczby próbek. Myszy (samce CFLP, sredni ciezar ciala 30 g) szczepiono czterema milionami komó¬ rek chloniaka puchliny brzusznej.W tescie uzywano tych zwierzat, u których w czwartym dniu rozwinal sie latwo wi¬ doczny nowotwór czyli puchlina brzuszna. W kazdej grupie uzyto co najmniej dziesiec zwie¬ rzat i myszom podano doustnie jedna dziesiata wielkosci Uc0» v 24 godziny po podaniu do¬ ustnym oceniano wyniki przy pomocy rozmazu z puchliny brzusznej barwionego Giemza na pod¬ stawie analizy cytologicznej. W grupie kontrolnej uzywano tej samej liczby zwierzat co w grupie leczonej.Oceniano uszkodzenie komórek nowotworowych, pobudzenie organizmu i ewentualnie dzialanie toksyczne. Przy ocenie dzialania przeciwnowotworowych okreslano procentowy sto¬ sunek zabitych i nieuszkodzonych komórek nowotworowych. Wyniki podano wedlug nastepujace¬ go ukladu: Stopien zabicia komórek nowotworowych wynik 0-3096 bez wplywu 30-70% sredni wplyw 70-100% silny wplyw Wzrost aktywnosci ukladu odpornosciowego organizmu oceniano na podstawie liczby i aktywnosci obojetnochlonnyeh granulocytów, limfocytów i makrofagów wystepujacych wsród komórek nowotworowych pochiIny brzusznej i bioracych udzial w systemie immunologicznym.Aktywnosc ukladu odpornosciowego manifestuje sie równiez stopniem tworzenia przez powyz¬ sze komórki w puchlinie brzusznej wiazania plazmowo-mostkowego z komórkami nowotworowymi.Wedlug tej oceny jezeli nie ma róznicy w ilosci i aktywnosci wspomnianych komórek, nie mozna stwierdzic zadnego wzrostu powyzej wartosci kontrolnej, sredni efekt obserwuje sie jesli wzrost liczby komórek lub aktywnosci powyzej wartosci kontrolnej wynosi do 20%.Efekt jest silny jezeli wzrost liczby komórek i aktywnosci ukladu odpornosciowego jest wiecej niz 20% wyzszy od wartosci kontrolnej (Tablica 7).145 636 5 Toksycznosc oznaczano na podstawie oceny morfologicznych zmian obojetnochlonnych granulocytów i limfocytów, waskuolizacji plazmy, fragmentaryzacji jadra, tworzenia poli- segmentów i granulacji toksycznej. Toksycznosc wyrazano wedlug nastepujacej skali: wyniki obserwowane Toksycznosc zadne powyzsze zmiany we wlasnych brak toksycznosci komórkach 2096 zmian srednia toksycznosc zmiany powyzej 20# wysoka toksycznosc Badanie dzialania przeciwnowotworowego 1, In vitro Komórki ludzkiej erytroleukemii K-562 i kultury komórek chloniaka myszy P-388 pod¬ dano dzialaniu 1-100^ug/ml badanego zwiazku, 2. In vivo a) Chloniak NK-Sy-puchliny brzusznej Jeden milion komórek chloniaka Nemeth-Kellner puchliny brzusznej transplantowano i.p. dwudziestu samcom myszy CFLP (sredni ciezar ciala 30 g); Neoplasma 8, 337 (1961). Po¬ lowa zwierzat byla kontrolna a drugiej polowie podawano jedna dziesiata wielkosci LDc0 róznych zwiazków o ogólnym wzorze 1 doustnie i sródotrzewnowo kolejno w pierwszym i pia¬ tym z rzedu dniu. Jezeli jedna dziesiata wielkosci LD™ byla skuteczna, stosowano nizsza dawke, tf grupie poddanej jednemu dzialaniu przeprowadzono cytomorfologiczne oznaczanie rozmazu z puchliny brzusznej po czasie 24 godzin i okreslano stopien uszkodzonych i zabi¬ tych komórek, fi grupach poddanych dzialaniu w czasie 5 dni oznaczano stopien przezycia. b) Nowotwór I*|210 10 komórek nowotworowych L^IO transplantowano i«P» óVudziestu samicom myszy BDF^ o ciezarze ciala 20 g. Leczenie rozpoczynano w 24 godziny po transplantacji nowotworu i kontynuowano przez osiem dni. Kazda grupa skladala sie z 5 zwierzat; dzienna dawka wyno¬ sila 5, 50 i 500 mg/kg p.o. Grupa kontrolna skladala sie równiez z 5 zwierzat. Obserwowa¬ no stopien przezycia. c) Nowotwór typu Lewis long V kazdej grupie uzywano 6 zwierzat. Dawka: 5 i 50 mg/kg. Grupa kontrolna skladala sie równiez z 6 zwierzat, tf tescie uzywano samic myszy C57BI o ciezarze 20 g. Nowotwór transplantowano s.c. do miesnia prawej nogi. Po 10 dniach noge amputowano, rozpoczynano leczenie droga doustna i kontynuowano przez 9 dni. Zwierzeta zabijano i przerzuty zlicza¬ no pod stereomikroskopem. d) Psom nalezacym do róznych ras i posiadajacym spontaniczny nowotwór sutka (doc- tus cc.) podawano doustnie w czasie 4 tygodni testowane zwiazki w dawkach 1-10 mg/kg.Przeprowadzano testowe wyciecie i zbierano próbki tkanek do analizy histologicznej. ariazki wytworzone wedlug sposobu podanego w przykladach XI, XIII, XIV, XV, XXVII, XXVIII, XXXIV, XXXV, XXXVI i XXXVIII wykazuja wybitne dzialanie przeciwnowotworowe. Zwia¬ zek wytworzony wedlug sposobu opisanego w przykladzie XI zahamowuje komórki ludzkiej ery¬ troleukemii K-562 w kulturze tkankowej w stezeniu 4 ^ug/ml. Z drugiej strony zwiazek ten hamuje proliferencje komórek P-388 tylko w stezeniu 40 jig/ml i przy wzroscie stezenia do 400 ig/ml aktywnosc jego nie zwieksza sie. Zwiazki posiadajace wysoka aktywnosc wykazuja dzialanie zaleznie od dawki w zakresie stezen 0,5 ig/ml, podczas gdy oddzialywanie zwiaz¬ ków o niskiej aktywnosci jest niezalezne od dawki, Wedlug testów in vivo zwiazki tej gru¬ py nie sa w ogóle aktywne przeciwko L-j210 lub ty^0 w niewielkim stopniu.Zwiazki znaczaco zmniejszaja liczbe przerzutów plucnych przy nowotworze typu Lewis long. Zwiazki XI, XIII, XIV, XV, XXII, XXVII, XXVIII, XLV sa skuteczne w dawce nizszej niz jedna dziesiata wielkosci LELQ. Zwiazek otrzymany wedlug sposobu podanego w przykla¬ dzie XIV zmniejsza o 5096 ilosc przerzutów plucnych juz w dawce 5 mg/kg, tfynik ten jest szczególnie znaczacy wobec faktu, ze IA-g « 2380 mg/kg.6 145 636 Stwierdzono, ze efekt moze byc spotegowany w wiekszym stopniu przez powtórzenie leczenia niz przez zwiekszenie dawki* Zwiazki wytworzone wedlug sposobów podanych w przykladach XI, XIII, XIV, XX, XXII,i XXVII i XLV okazaly sie aktywnymi przeciwko nowotworowi Nk-ly-puchliny brzusznej w steze¬ niu ponizej jednej dziesiatej wielkosci LDcq* Te ostatnie zwiazki podwyzszaja stopien przemycia i czas zycia w sposób zalezny od dawki* Zwiazki te wykazuja dzialanie immuno- stymulacyjne w malych dawkach, podczas gdy w wyzszych dawkach bezposrednie dzialanie przeciwnowotworowe ujawnia sie samo równiez* tf ten sposób zwiazki z przykladu XI 1 XXII wykazuja dzialanie immunostymulacyjne w dawkach wynoszacych odpowiednio 25 mg/kg i 20 mg/ kg. Zwiazki z przykladu XI i XXII sa cytotoksyczne w zakresie dawek wynoszacych kolejno 250-500 mg/kg i 40-160 mg/kg. S-allilo-f S-l-chloro-2-hydroksy-propylo- lub S-1-bromo-hy- droksy-propylo- podstawione zwiazki o ogólnym wzorze 1 sa wysoko aktywne w stosunku do spontanicznych nowotworów sutka u psów* M biopsji przeprowadzonej po leczeniu stosowanym w czasie 3-4 tygodni obserwowano komórkowa infiltracje o charakterze inwazyjnym w nowo¬ tworach (ductus cc*) skladajaca sie z limfocytów i obojetnochlonnych granulocytów, makro- fagów i od czasu do czasu z kwasochlonnych granulocytów* Na komórkach nowotworowych zau¬ wazono zmiany degeneracyjne i znaczny rozklad* Komórki NK tworza plazmowe mostkowe wiazania z komórkami nowotworowymi co powoduje wodniczkowa degeneracje plazmy komórek nowotworowych i znaczne scienienie w miejscu DNS jadra* Ulega zmianie wzajemny stosunek Jadro-plazma, jadro jest silnie nabrzmiale i jest zmniejszona zasadochlonnosc plazmy* tf okolo jednej czwartej przypadków infiltracji leuko¬ cytów w nowotworze jest nieznaczaca; z drugiej strony komórki nowotworowe sa nabrzmiale i szklisto zdegenerowane* W obszarze miedzykomórkowym osadzona jest duza ilosc szklisto za¬ barwionego materialu* Przy podawaniu zwiazku z przykladu XI w doustnej dziennej dawce wynoszacej 30-120mg (0,5-2 mg/kg) w czasie 6-12 miesiecy wyrazne polepszenie lub rekonwalescencje obserwo¬ wano u ludzi w przypadkach przerzutów do kosci nowotworów sutka (In haman bone metastra- sls of Mammal tumors), nowotworów jajników i nowotworów trzustki* Badanie dzialania przeciwnowotworowego w polaczeniach 1) Polaczenie ze znanymi srodkami cytostatycznymi* Rózne srodki cytostatyczne maja¬ ce biologiczne alkilujace dzialanie podawano razem ze zwiazkami o ogólnym wzorze 1 myszom CFLP z nowotworem NK-ly puchliny brzusznej* srodki cytostatyczne podawano doustnie, do- otrzewnowo lub dozylnie w dawce odpowiadajacej jednej piatej lub jednej dziesiatej wielkos¬ ci IDcq lub w bardziej efektywnym dawkowaniu obejmujacym wczesniejsze próby* Zwiazki o ogólnym wzorze 1 podawano doustnie w dawce wynoszacej Jedna dziesiata lub jedna dwudzies¬ ta wartosci IDcq jednorazowo lub kilka razy, w 48 godzin po leczeniu srodkiem cytosatycz- nym* W ten sposób podawano kombinacje cyklofosfamidu, karnomustliny, degranolu, dibromo- dulcitolu i dibromomannitolu z jednej strony i zwiazki z przykladów XI, XIII, XIV, XV, XVI, XXVII, XXVIII i XLV z drugiej strony* v porównaniu z grupa kontrolna, której podawano je¬ dynie znany srodek cytostatyczny, obserwowano wzmocnione dzialanie przeciwnowotworowe i zmniejszona immunodepresje* 2) Polaczenie ze znanymi witaminami* Sole izotiouroniowe o ogólnym wzorze 1 moga byc skutecznie kombinowane ze srednimi dawkami witamin A i D, i z duzymi dawkami witaminy C* Otrzymano dobre wyniki zarówno w testach farmakologicznych jak i w przypadkach klinicz¬ nych u ludzi* 3) Polaczenie ze znanymi hormonami* V oddzialywaniu na nowotwory zalezne od hormo¬ nów polaczenie okazalo sie byc uzyteczne zarówno w testach farmakologicznych jak 1 w przy¬ padkach klinicznych u ludzi* 4) Uzycie w chirurgii* Zwiazki o ogólnym wzorze 1 stosowano pomyslnie w testach farmakologicznych w przypadku litych nowotworów dla oddzialywania przed i po zabiegu chi¬ rurgicznym (NK-ly-solld, Yosida)* Na podstawie testów farmakologicznych mozna stwierdzic, ze zwiazki o ogólnym wzorze 1 sa prawdopodobnie równiez odpowiednie do zastosowania w chi¬ rurgii u ludzi w oddzialywaniu przed- i pooperacyjnym*145 636 7 Badanie dzialania przecIwpasozytowego Zwiazki o ogólnym wzorze 1 podawano doustnie w ciagu trzech dni psom zakazonym kleszczami (lxodes rlclnus). Tak wiec chlorowodorek N-aminoiminometylo-S-allilo-izotiou- roniowy podawano w doustnej dawce wynoszacej 1-2 mg/kg i rejestrowano tempo zabijania kleszczy. Szesc do osmiu godzin po podaniu aktywnego zwiazku o ogólnym wzorze 1 wszystkie kleszcze zostaly w psach zabite.Wiazanie wolnych rodników Zwiazki wytwarzane sposobem podanym w przykladach IXf Xf XIf XVI, XXIII i XXIX znaczaco obnizona toksycznosc (IAtq) nadtlenku wodoru, nadtlenków organicznych i biolo¬ gicznych srodków alkilujacych (tworzacych wolne rodniki). Na podstawie korzystnych danych ich toksycznosci zwiazki o ogólnym wzorze 1 sa bardziej odpowiednie do wiazania wolnych rodników i ochrony przed promieniowaniem niz znane pochodne izotiouroniowe otrzymywane z odpowiedniego tiomocznika. Tak wiec dzialanie terapeutyczne zwiazku z przykladu XXIII jest lepsze niz dzialanie terapeutyczna chlorowodorku beta-aminoetyloizotiouroniowego.Dzialanie ochraniajace serce w narkozie izoprenalinowej Szczurom samcom CFY o ciezarze 250-300 g podano i.p. 5 mg/kg izoproterenolu. T kazdej grupie uzyto 10 zwierzat. Jedna czesc zwierzat byla kontrolna a drugiej podano zwiazek No. XIV w ilosci 1-5 mg/kg i.p. lub 10-50 mg/kg p.o. Po dwóch tygodniach serca poddano ocenie histologicznej. Okreslano stopien nekrotyzacji i nieczynny obszar miesnia sercowego. Stwierdzono, ze wszystkie podania chlorowodorku NTaminoiminometylo-S-allilo- -izotiouroniowego o ogólnym wzorze 1 powodowaly znaczace zmniejszenia nekrozy.V uszkodzonym obszarze testowany zwiazek wywiera prawdopodobnie swój wplyw przez wiazanie nadtlenku wodoru wytwarzanego przez oboj etnochlonne granulocyty. V tym modelu inne wiazace wolne rodniki i przeciwutleniaczowe czasteczki wywieraja podobny skutek.Dzialanie na krazenie i oddychanie Zwiazek wytworzony wedlug sposobu podanego w przykladzie XI nie oddzialywuje po¬ waznie na hemodynamiczne parametry i funkcje oddechowe kotów z otwarta i zamknieta kla¬ tka piersiowa, po podaniu i.v. dawki wynoszacej 10 mg/kg. Badano nastepujace parametry: cisnienie komorowe I ot*rodowe, czestotliwosc pracy serca EKG, objetosc/minute, kurczli- wosc, objetosc oddechowa, tempo oddechu i opornosc. Przy dawce dozylnej wynoszacej po¬ wyzej 10 mg/kg zmniejszalo sie cisnienie lewokomorowe i czestotliwosc. Przy dawce wyno¬ szacej 50 mg/kg efekty powyzsze byly znaczace i dluzej trwajace. Przy dawce i.v. wyno¬ szacej 100 mg/kg obserwowano silne zmiany hemodynamiczne ale koty nie zginely.Dzialanie soli N-aminoiminometylo-s-allilo-izotiouroniowych (halogenków) (Zwia¬ zek A).Tablica 1 Wplyw na ADDC. Wskaznik cytotoksycznosci (96) Stosunek komórek efektorowych do komórek docelowych « 5:1 Czas inkubacji 4 godziny srednie: 4- S.E.Grupa I (liczba przy- I padkcW) Normalny ADCC (10) I Obnizony ADCC (10) Kontrola 42,045,0 2,840,8 I — i ' ¦ - i Leczenie /mole/ml/ Zwiazek A /C. czast. 194,7/ 6,7 x 10~10 mola/ml 58,5 + 5,2 * + 39* 6,35+ 1,7 ? 12696 6,7 x 10~9 mola/ml 64 + 5,8 4- 52% 7,7+1,9 ? 17596 6,7 x 10"8 mola/ml 68,2 ± 5,3X + 62* 10,2 + 2,7* + 26496 x znaczacy (p<0,05)8 145 636 Tablica 2 Wplyw na aktywnosc NK Stosunek komórek efektorowych do komórek docelowych » 50:1 Czas inkubacji 4 godziny Wskaznik cytotoksycznosci (%), Wartosci srednie: + S.E.Grupa (liczba przy¬ padków ) Normalny NK (8) Obnizony NK (7) Kontrola 32,9 + 2,5 15,1 + 2,4 Leczenie /mole/ml/ Zwiazek A (C.czast. 194,7) 6,7 x 10~10 mola 41 + 2,9 + 25% 21,6 ? 3,0 + 4396 6,7 x 10~9 mola 43,4 + 2,7 + 3296 25,3 + 3,2 + 6896 6,7 x 10"8 mola 47,6 + 1,4 + 4596 32,2 + 3,2X + 11396 x znaczacy (p<0,05) Tablica 3 Wplyw in vitro na bezposrednia (przypadkowa) migracje polimorf©nuklearnych leukocytów.Obszar migracji (mm )• Wartosci srednie siedmiu zdrowych osób kontrolnych: + S.E.M.Traktowanie Zwiazek A Kontrola 10,02 i 1,65 Dawka /jug/ml/ 0,1 10,51 + 1,221 1,0 12,25 ? 1,582 10,0 | 11,24 + 1,692 1 nie znaczacy 2 znaczacy (p<0,01) 3 znaczacy (p<0,03) Tablica 4 I Czynnik I mitogeniczny ^^ Zwiazek A PHA 2 jjtg/m PHA 10jag/m Con A 25 I ig/«l Kontrola 21166+3774 29959+ 4051 10545+3414 Dawka /ug/ml/ 0,1 22253 + 3688 29969 + 3557 10564 + 3764 1,0 23156 + 2737 33826 + 3638 14089 + 26°2 1090 I 25404 + 2660 33790 + 5203 17038 + 3202145 636 9 Tablica 5 wplyw in vitro na blastyczna transformacje ludzkich limfocytów stymulowana przez PHA i Con A.Pacjenci o obnizonej reaktywnosci (nowotwór i SIE; n-6) srednio c.p.m. + S.E#M« Czynnik mitogeniczny 1. Zwiazek A PHA 2 pg/ml PHA 10^ig/ml Con A 25 ^Ig/rai Kontrola 3034 + 1293 5267 + 1392 804 + 307 Dawka ^ig/ml/ 0,1 2877 + 964 5802 + 1504 1097 + 354 1.0 4344 + 1153 6323 + 1161 935 + 363 10,0 I 4716 + 1287 6968 +1669 1023 + 361 T a b 1 i ca 6 Ostra toksycznosc zwiazków o ogólnym wzorze 1 w czasie 24 godzin Przyklad nr IX XXIII X XXV XXIV XXVI XIII XXVII XIV XV XXVIII XVI XXIX XI XLIV XVIII XVII XX XXXIV XXII XXI XLV XXII r r2~ H H H H H H H H H H H H H H H H H metyl etyl cykloheksyl izopropyl allil cykloheksyll r r1 metyl etyl propyl butyl 1-propyl 1-amyl 2-chloroetyl 2-bromo-etyl 1-chloro-2- -OH-propyl 3-chloro-pro¬ pyl 3-bromo-pro¬ pyl 2-hydroksy- -etyl 1-oksypropyl allil metallil benzyl propargil allil . allil allil allil allil allil LD50 mg/kg p.o. 2320 + 220 3080 + 290 2800 + 260 2700 +310 2260 + 210 2260 + 241 1120 + 140 1050 + 280 1240 + 160 1210 + 180 980 + 640 3280 + 460 2860 + 180 2380 + 320 1640 + 210 2420 + 260 90 + 7,6 600 + 54 780 + 62 450 + 51 280 + 26 380 + 41 400+38 * — i. 1680 + 320 + 75 i 84 + 65 + ^2 ± 36 + 40 + P. 210 30 6,3 7,6 5.1 4 4 610 145 636 Tablica 7 Dzialanie przeciwnowotworowe i immunostymulacyjne zwiazków o wzorze 1 Zwiazek badany Przyklad nr IX XXIII X xxv XXIV XXVI XIII XXVII XIV XV XXVIII XVI XXIX XI XLIV XVIII XVII XX XXXIV XXII XXI XLV i XXII Przeciwnowo- tworowe dzia¬ lanie srednie srednie srednie srednie srednie srednie silne silne silne I silne silne srednie srednie silne srednie wzrost slabe silne srednie silne silne silne I slabe Immunostymula¬ cyjne dziala¬ nie srednie silne srednie srednie j srednie srednie slabe slabe slabe slabe slabe silne srednie silne srednie 0 slabe slabe srednie slabe slabe slabe slabe Toksyczne dzialanie srednie 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 srednie 0 0 0 0 0 0 Kompozycje farmaceutyczne zawieraja jako aktywny skladnik co najmniej jeden zwia¬ dl zek o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupe C^^-alkilowa, C2-6 alkanylowa, Cp ,- al- kinylowa, C, g cykloalkilowa, aralkilowa lub arylowa, przy czym wymienione grupy ewentu¬ alnie sa podstawione dowolnie przez jedna lub wiecej grup hydroksylowych, merkaptanowych i/lub atom chlorowca, R oznacza atom wodoru, grupe C. r alkilowa, Cp •- alkenylowa, Cp /- alkinylowa lub C,_£ cykloalkiIowa, X oznacza atom chlorowca• Kompozycje farmaceutyczne ewentualnie wytwarza sie znanymi metodami przemyslu farmaceutycznego. Aktywne skladniki o ogólnym wzorze 1 podaje sie korzystnie w formie kapsulek zmieszane z konwencjonalnymi, stosowanymi zwykle srodkami pomocniczymi np. srodkami dajacymi poslizg i innymi. Kapsulki wytwarza sie przy pomocy automatycznych ma¬ szyn kapslujacych. Kompozycje farmaceutyczne, ewentualnie przyrzadza sie równiez w pos¬ taci ampulek z proszkiem, pozajelitowych kompozycji do iniekcji i infuzji. Kompozycje te ewentualnie wytwarza sie równiez znanymi metodami. Jako rozpuszczalnik ewentualnie sto¬ suje sie np. wode destylowana lub roztwór fizjologiczny soli.Aktywne skladniki o ogólnym wzorze 1 mozna równiez podawac w postaci masci, szczegól¬ nie masci lipofilowych. Aktywne skladniki o ogólnym wzorze 1 posiadajace silny zapach, ewentualnie poddawane sa mikrootorbieniu np. przez wytworzenie cyklodekstrynowych kom¬ pleksów inkluzyjnych.Kompozycje farmaceutyczne moga równiez zawierac jako dodatek do zwiazku o ogólnym wzorze 1 Jedna lub wiecej znanych biologicznie czynnych substancji jako skladnik aktywny.145636 11 Kompozycje farmaceutyczne mozna stosowac w terapii zarówno u ludzi jak i u zwie¬ rzat. W przypadku stosowania jako srodka immunostymulacyjnego preferowana dawka doustna lub doodbytnicza wynosi okolo 0,5-25 mg/kg. Do dzialan miejscowych preferuje sie sto¬ sowanie wyzszych dawek* Wytwarzane sposobem wedlug wynalazku nowe zwiazki posiadaja dzialanie przeciwno- wotworowe i immunostymulacyjne.Szczególy sposobu wedlug wynalazku wyjasniaja ponizsze przyklady bez ogranicze¬ nia zakresu wynalazku do tych przykladów.Materialy wyjsciowe Przyklad I. Wytwarzanie weglanu N-amlnoiminometylo-tiomocznika 84,0 g (1,0 mola) dicyano-diamidu i 300 ml wody umieszcza sie w autoklawie. Do zamknietego autoklawu wprowadza sie 34,0 g ( 1 mol) gazowego siarkowodoru w nastepujacy sposób: w temperaturze 20 C wprowadza sie tyle siarkowodoru aby cisnienie w autoklawie osiagnelo 1,5 x 105 Pa. Wstrzymuje sie doplyw gazu i ogrzewa powoli autoklaw w tempe¬ raturze 80°C. W miedzyczasie wprowadza sie gazowy siarkowodór w takim tempie aby cisnie- 5 nie w autoklawie wynosilo stale 1,5 x 10 Ra. Po wprowadzeniu calej ilosci gazowego siarkowodoru autoklaw utrzymuje sie w temperaturze 80°C az do obnizenia cisnienia do 0,3 x 10 - 0,4 x W'* Pa. Mieszanine reakcyjna oziebia sie do temperatury 20°C, prze¬ plukuje strumieniem azotu i odsacza. Klarowny przesacz oziebia sie do temperatury 0°C i wprowadza gazowy ditlenek wegla. Wytracony bialy krystaliczny weglan N-aminoiminomety- lo- tiomocznika odsacza sie, przemywa zimna woda i suszy w temperaturze 60 - 80°C.Otrzymuje sie w ten sposób 100 g zadanego zwiazku; wydajnosc wynosi 67tf; temperatura topnienia: 127 - 129°C. Widmo w podczerwieni otrzymanego w ten sposób produktu jest porównywalne z widmem próbki wzorcowej.Przyklad II. Wytwarzanie weglanu N-ajninoiminometylo-N'-metylo-tiomocznlka Do roztworu 5,9 g (0,1 mola) zasady guanidynowej w 30 ml acetonu dodaje sie roz¬ twór 7,3 g (0,1 mola) izotiocyanianu metylu w 10 ml acetonu. Roztwór izotiocyanianu doda¬ je sie do roztworu guanidyny z taka szybkoscia aby temperatura mieszaniny nie przekroczy¬ la 40°C. Mieszanine reakcyjna pozostawia sie w temperaturze 40°C w czasie 4 godzin, a nastepnie usuwa rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostaly jasno zólty olej zawiesza sie w wodzie do otrzymania opalizujacego roztworu. Do roztworu wprowadza sie gazowy ditlenek wegla, zadany zwiazek wytraca sie w postaci bialych krysztalów, o tem¬ peraturze topnienia 132 - 134°C. Wydajnosc wynosi 12,0 g (73,5#).Przyklady III-YIII. W sposób analogiczny Jak w przykladzie II wytwarza sie nastepujace zwiazki: III. Weglan N-aminoiminometylo-N'-etylo-tiomocznika IV. Weglan N-aminoiminometylo-N*-n-propylo-tiomocznika V. Weglan N-aminoiminometylo-N'-izopropylo-tiomocznika VI. Weglan N-aminoiminometylo-N'-n-butylo-tiomocznika VII. Weglan N-aminoiminometylo-N*-allilo-tiomocznika VIII.Weglan N-aminoiminometylo-N#-cykloheksylo-tiomocznika W ponizszych przykladach podano sposób wytwarzania produktów koncowych o ogól¬ nym wzorze 1.Przyklad IX. ifytwarzanie jodku N-aminoiminometylo-S-metyloizotiouro- niowego 14,9 g (0,05 mola) weglanu N-aminoiminometylo-tlomocznika zawiesza sie w 50 ml bezwodnego etanolu. Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 17,0 g (0f12 mola) jodku metylu.Mieszanine reakcyjna ogrzewa sie powoli do wrzenia, wydziela sie przy tym ditlenek wegla.Mieszanine reakcyjna ogrzewa sie do wrzenia w czasie 30 minut i oziebia do temperatury pokojowej. Mieszanine przesacza sie celem usuniecia ewentualnego krystalicznego osadu.Klarowny przesacz odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem a pozostaly olej krystali¬ zuje Z' octanu etylu. Zólte krysztaly odsacza sie 1 suszy w temperaturze 40 - 50°C. Otrzy-12 145 636 muje sie w ten sposób 22f1 g zadanego produktu o temperaturze topnienia 124 - 125°C; wy¬ dajnosc wynosi 85#.Przyklad X. Wytwarzanie bromku N-aminoiminometylo-S-n-propylo-izotiouro- niowego 1^t9 g (0,05 mola) weglanu N-aminoiminometylo-tiomocznika zawiesza sie w 50 ml bezwodnego etanolu. Do zawiesiny dodaje sie 14,8 g (0,12 mola) bromku n-propylu. Miesza¬ nine ogrzewa sie powoli z mieszaniem do wrzenia, wydziela sie przy tym ditlenek wegla.Mieszanine reakcyjna ogrzewa sie do wrzenia przez 45 minut i oziebia do temperatury po¬ kojowej. Mieszanine przesacza sie celem usuniecia wytraconych ewentualnie substancji.Klarowny przesacz odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i oleista pozostalosc krystalizuje sie z octanu etylu. Odsacza sie biale krysztaly i suszy w temperaturze 40 - 50°C. Otrzymuje sie w ten sposób 19f5 g zadanego produktu o temperaturze topnienia 122 - 124°C; wydajnosc wynosi 81 #.Przyklad XI. Wytwarzanie bromku N-arainoiminometylo-S-allilo-izotiouro- niowego 14,9 g (0,05 mola) weglanu N-aminoiminometylo-tiomocznika dodaje sie do 50 ml bezwodnego etanolu. Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 14,5 g (0,12 mola) bromku allilu.Mieszanine reakcyjna ogrzewa sie powoli do wrzenia z intensywnym mieszaniem. Mieszaninne reakcyjna utrzymuje sie we wrzeniu pod chlodnica zwrotna w czasie 30 minut i oziebia do temperatury pokojowej. Mieszanine przesacza sie celem usuniecia wytraconych ewentualnie substancji. Przesacz odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i oleista pozostalosc krystalizuje sie z octanu etylu. Wytracone krysztaly odsacza sie i suszy w temperaturze 40 - 50°C. il ten sposób otrzymuje sie 19,6 g zadanego zwiazku o temperaturze topnienia 123 - 125°C; wydajnosc wynosi 8296.Przyklad XII. Wytwarzanie chlorku N-aminoiminometylo-S-alliloizotiouro- niowego 1^»9 g (0,05 mola) weglanu N-aminoiminometylo-tiomocznika dodaje sie do 50 ml bezwodnego etanolu. Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 9,18 g (0,12 mola) chlorku allilu i mieszanine reakcyjna ogrzewa sie powoli do wrzenia z intensywnym mieszaniem. Mieszani¬ ne reakcyjna utrzymuje sie we wrzeniu pod chlodnica zwrotna w czasie 1 godziny i oziebia do temperatury pokojowej. Mieszanine przesacza sie celem usuniecia wytraconej ewentual¬ nie substancji. Przesacz odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista pozostalosc krystalizuje sie z octanu etylu, wytracone krysztaly odsacza sie i suszy w temperaturze 40 - 50°C. Ji ten sposób otrzymuje sie 15,7 g zadanego zwiazku o temperaturze topnienia 125 - 127°C; wydajnosc wynosi 81$*.Przyklad XIII. Wytwarzanie bromku N-aminoiminometylo-S-/2-chloroetylo/- -izotiouroniowego 14,9 g (0,05 mola) weglanu N-aminoiminometylo-tiomocznika dodaje sie do 50 ml bezwodnego etanolu. Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 17,2 g (0,12 mola) 1-bromo-2-chlo- ro-etanu i mieszanine reakcyjna ogrzewa sie do wrzenia z intensywnym mieszaniem. Miesza¬ nine reakcyjna utrzymuje sie we wrzeniu pod chlodnica zwrotna w czasie 90 minut i ozie¬ bia do temperatury pokojowej. Mieszanine przesacza sie celem usuniecia wytraconej ewentu¬ alnie substancji. Klarowny przesacz odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista pozostalosc krystalizuje sie z octanu etylu. Wytracone biale krysztaly odsacza sie i su¬ szy w temperaturze 40 - 50°C. Otrzymuje sie w ten sposób 17,2 g zadanego zwiazku o tem¬ peraturze topnienia 142 - 143°C; wydajnosc wynosi 6696. % Przyklad XIV. Wytwarzanie bromku N-aminoiminometylo-S-/l-chloro-2-hydrok- sy-propylo/-izotiouroniowego 14,9 g (0,05 mola) weglanu N-aminoiminometylo-tiomocznika dodaje sia do 50 ml bezwodnego etanolu. Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 20,8 g (0,12 mola) 1-bromo-2-hy- droksy-3-chloro-propanu. Mieszanine reakcyjna ogrzewa sie powoli do wrzenia z intensywnym mieszaniem. Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie we wrzeniu pod chlodnica zwrotna przez 90145 636 13 minut i oziebia do temperatury pokojowej. Mieszanine przesacza sie celem usuniecia ewentualnie wytraconej substancji. Klarowny przesacz odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista pozostalosc krystalizuje sie z octanu etylu. Wytracone lekko kremo¬ we krysztaly odsacza sie i suszy w temperaturze 40 - 50°C. Otrzymuje sie w ten sposób 17,8 g zadanego zwiazku o temperaturze topnienia 118 - 119°C; wydajnosc wynosi 6196.Przyklad XV. Wytwarzanie bromku N-aminoiminometylo-S-/3-chloro-propylo/- -izotiouroniowego 14,9 g (0,05 mola) weglanu N-aminoiminometylo-tiomocznika dodaje sie do 80 ml acetonitrylu. Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 18,9 g (0,12 mola) 1-bromo-3-chloro- -propanu i ogrzewa mieszanine reakcyjna powoli do wrzenia przy intensywnym mieszaniu.Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie we wrzeniu pod chlodnica zwrotna przez 90 minut, stala substancje usuwa sie przez przesaczenie goracej mieszaniny reakcyjnej i pozostawia przesacz do ochlodzenia do temperatury pokojowej. Wytracone biale krysztaly odsacza sie i suszy w temperaturze 40 - 50°C. Otrzymuje sie w ten sposób 17,3 g zadanego zwiazku* o temperaturze topnienia 129 - 131°C; wydajnosc wynosi 65%.Przyklad XVI. Wytwarzanie chlorku N-aminoiminometylo-S-/2-hydroksyety- lo/-izotiouroniowego 14,9 g (0,05 mola) weglanu N-aminoiminometylo-tiomocznika dodaje sie do 50 ml bezwodnego etanolu. Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 9,7 g (0,12 mola) etylenochloro- hydryny i ogrzewa mieszanine reakcyjna do wrzenia przy intensywnym mieszaniu. Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie we wrzeniu pod chlodnica zwrotna przez 90 minut i nastepnie oziebia do temperatury pokojowej. Mieszanine przesacza sie celem usuniecia wytraconej ewentualnie substancji i odparowuje klarowny przesacz pod zmniejszonym cisnieniem. Oleis¬ ta pozostalosc krystalizuje sie z octanu etylu. Krysztaly odsacza sie i suszy w tempera¬ turze 40 - 50°C. Otrzymuje sie w ten sposób 13,5 g zadanego zwiazku o temperaturze top¬ nienia 134 - 136°C; wydajnosc wynosi 68%.Przyklad XVII. Wytwarzanie bromku N-aminoiminometylo-S-glicydylo-izotio- uroniowego 14,9 g (0,05 mola) weglanu N-aminoiminometylo-tiomocznika dodaje sie do 80 ml acetonitrylu. Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 16,5 g (0,12 mola) epibromohydryny i mieszanine reakcyjna ogrzewa powoli do wrzenia z intensywnym mieszaniem. Mieszanine re¬ akcyjna utrzymuje sie we wrzeniu pod chlodnica przez 2 godziny i przesacza na goraco.Klarowny przesacz pozostawia sie do oziebienia do temperatury pokojowej. Wytracone biale krysztaly odsacza sie i suszy w temperaturze 40 - 50°C. Otrzymuje sie w ten sposób 13,5 g zadanego zwiazku o temperaturze topnienia 138 - 139°C; wydajnosc wynosi 53%.Przyklad XVIII, wytwarzanie chlorku N-aminoiminometylo-S-benzylo-tiouro- niowego 14,9 g (0,05 mola) weglanu N-aminoiminometylo-tiomocznika dodaje sie do 50 ml bez¬ wodnego etanolu. Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 15,2 g (0,12 mola) chlorku benzylu i mieszanine reakcyjna ogrzewa sie do wrzenia z intensywnym mieszaniem. Mieszanine reak¬ cyjna utrzymuje sie we wrzeniu pod chlodnica zwrotna w ciagu 1 godziny i oziebia do tem¬ peratury pokojowej. Mieszanine przesacza sie celem usuniecia wytraconej ewentualnie subs¬ tancji. Klarowny przesacz odparowuje, sie pod zmniejszonym cisnieniem 1 oleista pozosta¬ losc krystalizuje z octanu etylu. Wytracone biale krysztaly odsacza sie 1 suszy w tempe¬ raturze 40 - 50°C. W ten sposób otrzymuje sie 19,1 g zadanego zwiazku o temperaturze top¬ nienia 159 - 161°C; wydajnosc wynosi 78*.Przyklad XIX. Sole izotiouroniowe wytworzone wedlug sposobów podanych w przykladach IX - XVIII ewentualnie przekryatalizowuje sie w opisany ponizej sposób. Spo¬ sób przedstawiono na przykladzie chlorku N-aminoiminometylo-S-allilo-izotiouronlowego. 10. g chlorku N-amlnoimlnometylo-S-allllo-izotiouroniowego dodaje sie do 60 ml mieszaniny etanolu i metanolu w stosunku 5:1* Niewielka ilosc nlerozpuszczonych kryszta¬ lów usuwa sie przez przesaczenie goracej mieszaniny. Przesacz ewentualni* klaruje sie14 145 636 weglanem aktywowanym. Klarowny przesacz pozostawia sie do ochlodzenia do temperatury po¬ kojowej, w tym czasie wytraca sie bialy krystaliczny osad. Mieszanine oziebia sie do tem¬ peratury 0 - 5°C, pozostawia sie w tej temperaturze przez jedna godzine a nastepnie prze¬ sacza. Osad przemywa sie lodowato zimnym etanolem i suszy w temperaturze 40 - 50°C.Otrzymuje sie w ten sposób 8,1 g zadanego zwiazku; wydajnosc wynosi 81%.Przyklad XX. Wytwarzanie chlorku N-aminoiminometylo-N'-metylo-S-allilo- - izotiouroniowego 16,3 g (0,05 mola) weglanu N-amino iminometylo-N*-metylotiomocznika wytworzonego wedlug sposobu podanego w przykladzie II dodaje sie do 50 ml bezwodnego etanolu. Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 9,18 g (0,12 mola) chlorku allilu i ogrzewa do wrzenia z intensywnym mieszaniem. Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie we wrzeniu pod chlodnica zwrotna przez 1 godzine i oziebia do temperatury pokojowej. Mieszanine przesacza sie ce¬ lem usuniecia wytraconej ewentualnie substancji. Klarowny przesacz odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista pozostalosc krystalizuje sie z octanu etylu. Bialy krystaliczny osad odsacza sie i suszy w temperaturze 40 - 50°C. Otrzymuje sie w ten sposób 13,6 g zadanego zwiazku o temperaturze topnienia 137 - 139°C; wydajnosc wynosi 61%.Przyklad XXI. Wytwarzanie chlorku N-aminoiminometylo-N'-izopropylo-S- -allilo-izotiouroniowego 19,1 g (0,05 mola) weglanu N-amino iminometylo-N '-izopropylo-tiomocznika wytworzo¬ nego wedlug sposobu podanego w przykladzie V dodaje sie do 50 ml bezwodnego etanolu.Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 9,18 g (0,12 mola) chlorku allilu i mieszanine reakcyjna ogrzewa sie do wrzenia przy intensywnym mieszaniu i utrzymuje sie we wrzeniu pod chlodnica zwrotna przez godzine, oziebia do temperatury pokojowej. Mieszanine prze¬ sacza sie celem usuniecia wytraconej ewentualnie substancji. Klarowny przesacz odparowu¬ je sie pod zmniejszonym cisnieniem i oleista pozostalosc krystalizuje z octanu etylu.Wytracony bialy krystaliczny osad odsacza sie i suszy w temperaturze 40 - 50°C. Otrzy¬ muje sie w ten sposób 13,3 g zadanego zwiazku o temperaturze topnienia 134 - 135°C; wy¬ dajnosc wynosi 56%.Przyklad XXII. wytwarzanie chlorku N-aminoiminometylo-N'-cykloheksylo- allilo-izotiouroniowego 23,1 g (0,05 mola) weglanu N-aminoiminometylo-N'-cykloheksylo-tiomocznika wytwo¬ rzonego wedlug sposobu opisanego w przykladzie VIII dodaje sie do 50 ml bezwodnego eta¬ nolu. Do otrzymanej zawiesiny dodaje sie 9,18 g (0,12 mola) chlorku allilu i mieszanine reakcyjna ogrzewa sie do wrzenia z intensywnym mieszaniem i utrzymuje sie we wrzeniu pod chlodnica zwrotna przez godzine, ochladza do temperatury pokojowej. Mieszanine prze¬ sacza sie celem usuniecia wytraconej ewentualnie substancji i klarowny przesacz odparo¬ wuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista pozostalosc krystalizuje sie z octanu e- tylu. Wytracone biale krysztaly odsacza sie i suszy w temperaturze 40 - 50°C. Otrzymuje sie w ten sposób 20,85 g zadanego zwiazku o temperaturze topnienia 129 - 130°C; wydaj¬ nosc wynosi 85%.Przyklady XXIII - XXXI. V sposób analogiczny do podanego w przykladzie XII wytwarza sie nastepujace zwiazki izotiouroniowe o ogólnym wzorze 1: XXIII. Bromek N-aminoiminometylo-S-etylo-izotiouroniowy, temperatura topnienia: 123 - 124°C.XXIV. Bromek N-aminoiminometylo-S-izopropylo-izotiouroniowy, temperatura topnie¬ nia: 120 - 122°C.XXV. Bromek N-aminoiminometylo-S-n-butylo-izotiouroniowy, temperatura topnie¬ nia: 116 - 118°C.XXVI. Bromek N-aminoiminometylo-S-izoamylo-izotiouroniowy, temperatura topnie¬ nia: 111 - 113°C.XXVII. Bromek N-amino iminometylo-S-/2-bromo-etylo/-izot iouroniowy, temperatura topnienia: 129 - 131°C145636 15 XXVIII* Bromek N-amlnoiininometylo-S-/3-bromo-propylo/-lzotIouronio%#yf temperatu¬ ra topnienia 127 - 129°C.XXIX. Bromek N-aminoiminometylo-S-/3-hydroksy-propylo/-izotiouroniowyf tempe¬ ratura topnienia: 132 - 135°C.XXX* Bromek N-aminoiminometylo-S-/3-merkapto-propylo/-izotiouroniowy» tempe¬ ratura topnienia: 141 - 142°C* XXXI. Bromek N-aminoiminometylo-S-propargilo-izotiouroniowyf temperatura top¬ nienia: 131 - 133°C.Przyklady XXXII - XL* VT sposób analogiczny do podanego w przykladzie XX wytwarza sie nastepujace zwiazki: XXXII* Bromek N-aminoiminometylo-N'-metylo-S-/2-hydroksy-etylo/-izotiouroniowyf temperatura topnienia: 147 - 148°C* XXXIII* Bromek N-aminoiminometylo-N '-etylo-S-/2-chloroetylo/-izotiouroniowy. temperatura topnienia: 143 - 144°C* XXXIV. Chlorek N-aminoiminometylo-N'-etylo-S-allilo-izotiouroniowy, temperatu¬ ra topnienia: 138 - 139°C.XXXV* Bromek N-aminoiminometylo-N *-izopropylo-S-/3-chloropropylo/-izotiouro- niowy. temperatura topnienia: 140 - 142°C* XXXVI* Chlorek N-aminoiminometylo-N'-izopropylo-S-metallilo-izotiouroniowy9 temperatura topnienia: 138 - 139°C* XXXVII* Bromek N-aminoiminometylo-N*-cykloheksylo-S-n-propylo-izotiouroniowyf temperatura topnienia: 133 - 135°C.XXXVIII* Chlorek N-aminoiminometylo-N'-cykloheksylo-S-metallilo-izotiouroniowy. temperatura topnienia: 130 - 132°C* XXXIX* Bromek N-aminoiminometylo-N'-cykloheksylo-S-glicydylo-izotiouroniowyf temperatura topnienia: 143 - 145°C* XL. Chlorek N-aminoiminometylo-N'-cykloheksylo-S-benzylo-izotiouroniowyf temperatura topnienia: 147 - 149°C.Temperatury topnienia i widma w podczerwieni zwiazków o ogólnym wzorze 1 podano zbiorczo w Tablicy 6* Tablica 8 P^ 1 H H I H H H H H r " " r1 • 2 metyl n-propyl allil 2-chloroetyl 1-chloro-2-hy- droksypropyl 3-chloro-propyl 2-hydroksy-etyl i j X 3 j Br Br lub Cl Br Br Br ex 0p(°C) i* 124 - 125 122 - 124 123 - 125 142 - 143 118 - 119 129 - 131 134 - 136 t ¦ Charakterystyczne piki widma IR 5 1 3300, 1570 3300, 2850, 3290, 1640, 1090, 650 3300, 920 3300, 1685, 3300, 2900, 3310, 2990, 3120, 1685, 3120, 2925, 1685, 1570, 3260, 3160, 1605, 1550, 980, 910, 3110, 2925, 720, 3110, 3000, 1610, 720 3275, 3165, 2825, 1680, 3280, 3110, 1675, 1610 730 I 3105, 1375, 705, 1640, I 2850, I 3105, 695 3000,16 145 636 cd. Tablicy 8 I 1 H H H H H H H H H H H metyl metyl etyl etyl I izo¬ propyl izo- I propyl izo¬ propyl cyklo- heksyl cyklo- heksyl cyklo- heksyl cyklo- heksyl cyklo- heksyl i' 2 glicydyl benzyl etyl izopropyl n-butyl izoamyl 2-bromo-etyl 3-bromo-propyl 3-hydroksy-propyl 3-merkapto-propyl propargil allil 2-hydroksy-ety1 2-chloro-etyl allil ! allil metaliii 3-chloro-propyl allil n-propyl metallil glicydyl benzyl i i Br Cl Br Br Br Br Br Br Br Br Br Cl Br Br Cl Cl Cl Br Cl Br Cl Br Cl 1 4 ~ 138 159 123 120 116 111 129 127 132 141 131 137 147 143 138 134 138 140 129 133 130 143 147 - 139 - 161 - 124 - 122 - 118 - 113 - 131 - 129 - 135 - 142 - 133 - 139 - 148 - 144 - 139 - 135 - 139 - 142 - 130 - 135 i - 132 - 145 ! - 149 I 5 I 3300, 1690, 3290, 1680, 3300, 3300, 1365 3315, 2850, 3305, 2960, 3300, 1090, 3305, 3590, 1680 3320, 2920, 3310, 1680 3305, 1640 3585, 1375, 3305, 765 3310, 1650, 3305, 1655, 3305, 1650, 3320, 1690, 3315, 2830, 3320, 2925 3315, 885 3325, 1690, 3300, 1675, 3275, 1600, 3280, 1590, 3120, 3120, 3300, 1690, 3300, 2845, 3205, 715 3215, 3300, 3305, 2570, 3300, 3290, 3300, 1360 3285, 3300, 990, 3295, 985, 3295, 890 3300, 775 3305, 1695, 3300, 3300, 3315, 870 3275, 1590, 3110, 865 3115, 1485, 1685, 1680, 3210, 1450 3205, 1695, 2910, 2920, 3220, 3210, 1690 3200, 2960, 3285, 2965, 3210, 905 3200, 895 3200, 3195, 3200, 985, 3210, 3215, 3210, 3120, 750 3000, 3005, 755 1570 1380, 3180, 3175, 1470 1670, 1665 2925, 3180, 2180, 2690, 1680, 1660, 3180, 3170, 3175, 3160, 3170, I 900 3175, 3180, 3190, 3000,145 636 17 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych soli izotiouroniowych o ogólnym wzorze 1f w którym R oznacza grupe Cj^-alkilowa, C^^-alkenylowa, C2-^-alkinylowai C,_£-cykloalkilowa, aralkilowa lub arylcwa, wymienione grupy ewentualnie podstawione sa jedna lub wiecej grupa hydroksylowa, grupa merkaptanowa i/lub atomem chlorowca albo grupa glicydylowa, 2 R oznacza atom wodoru, grupe C^_^-alkilowa, C2_^-alkenyIowa, Cp^r-alkinylowa lub C,_£- -cykloalkilowa; X oznacza atom chlorowca z zastrzezeniem, ze jesli R oznacza atom wo- doru R Jest rózne od grupy metylowej, etylowej albo benzylowej, znamienny 2 tym, ze zwiazek o ogólnym wzorze 2, w którym R ma znaczenie podane powyzej, lub je¬ go sól weglanowa poddaje sie reakcji ze zwiazkiem o ogólnym wzorze R - Y, w którym R ma znaczenie podane powyzej, a Y oznacza atom chlorowca i ewentualnie tak otrzymany zwiazek przeprowadza sie w sól w reakcji z kwasem. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przeprowadza sie w reakcje w obecnosci organicznego rozpuszczalnika, korzystnie alkoholu, alifatycznego ketonu, nitrylu i/lub eteru.H-N-C-NH-C =N-R . HX 2 II I, NH S-R1 WZ0R 1 H9N-C-NH-C-NH-R 1 II II NH S WZÓR 2 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL