PL147727B1 - Method of spilitting dna at arbitrary selected place - Google Patents

Description

*** 0,01/ug/, jak pokazano na rysunku fig.5. W tya proessla wystajacy koniec Taq I poddaje sie llgacjl do Xbal, pozostajacego wystajacego konca, chociaz nie jest on calkowicie sparowany zasadowo wg Watsona-Crlckat i "»T CTAGA i * TCTAGA ? — 1 AGC TCT ¦¦ - ¦ AGCTCT ¦ Czesc tej Mieszaniny reakcyjnej powstalej w wyniku ligacji transformowano do komórek E, coli 294, jak to opisano w czesci I zamieszczonej powyzej, ogrzewano i hodowano na plytkach LB zawierajecych ampicyline* Wyselekcjonowane 24 kolonie hodowano w 3 ml pozyw¬ ki LB 1 wyodrebniono plazmid. Odkryto, ze 6 z nich posiadalo miejsce Xbal zregenerowane po¬ przez DNA E, coli katalizujacy, reperacja 1 replikacja: ¦'TCTAGA TCTAGA ¦ ¦ AGCTCT ¦¦AGATCT ' ¦ Stwierdzono, ze plazmidy te poddajac sia cieciu zarówno przez EcoRl jak i Hpal, daja w wyniku spodziewane fragmenty. Jeden plazmid 14, oznaczony jako pTR14, zastosowano do ekspresji heterologicznego polipeptydu, jak przedstawiono nizej.Plazmid pHGH 107 /18 na rysunku fig,6, D.V, Goeddel i wspólpr*. Nature, 281, 544, 1979/ zawiera gen ludzkiego hormonu wzrostu, zbudowany z 23 aainokwasowych kodonów wytworzo¬ nych z fragmentów syntetycznego ONA 1 163 aainokwasowych kodonów otrzymanych z komplementar¬ nego ONA produkowanego w drodze odwróconej transkrypcji informacyjnego RNA ludzkiego hormonu wzrostu• Ten gen 21, chociaz traci kodony sekwencji "pre" ludzkiego hormonu wzrostu, zawiera kodon ATG inicjacji translacji, Gen wyizolowano z 10 iig pHGH 107 po dzialaniu EcoRl i kolejno fragmentem polime- razy I Klenowa E. coli i dTTP i dATP, w sposób opisany powyzej* Po ekstrakcji fenolem i chloroformem i wytraceniu etanolem, na plazmid podzialano BaaHI /patrz rysunek fig*6/« Fragment 21, zawierajacy ludzki hormon wzrostu /HGH/ wyizolowano za pomoca PAGE i elektro- elucji* Wytworzony fragment DNA chociaz zawiera pierwsze 350 nukleotydów strukturalnego genu odpowiadajacego za odpornosc na tetracykline, ale nie posiada tetracyklinowego ukladu pro- motor-operator tak, ze po pózniejszym klonowaniu w plazmid ekspresji* plazmidy zawierajace lneercja mogly byc zlokalizowane dzieki przywróceniu opornosci wobec tetracykliny* Poniewaz koniec EcoRl fragmentu 21 zostal zapelniony za pomoca dzialania polimeraza I Klanowa, fragment ten posiada jeden koniec tepy 1 Jeden koniec lepki, zapewniajacy lepsza orientacje w przypadku ineercji tego ostatniego do plazmidu ekspresji /patrz rysunek flg*6/« Przygotowano nastepnie plazmid ekspresji pTrpl4 w celu otrzymania fragmentu zawie¬ rajacego gen HGH wytworzony jak wyzej* W tya celu pTrpl4 trawiono Xbal i powstale lepkie konce poddano dzialaniu poliaerazy I Klanowa z zastosowaniem dATP, dTTP, dGTP i dCTP* Po ekstrakcji fenolem 1 chloroformem 1 wytraceniu etanolem otrzymany DNA 16 poddano dzialaniu BamHI 1 wytworzony duzy fragment plazmidu 17 wyodrebniono stosujac PAGE i elektroelucje.Fragment 17 otrzymany z plazmidu pTrpl4 posiadal jeden koniec tepy i jeden koniec lepki, pozwalajac na rekombinacje wlasciwie zorientowana z fragmentem 21 zawierajacym gen HGH, po¬ przednio opisany.Fragmenty 21 zawierajace gen HGH i fragment 17 pTrpl4 Xba-BamHI polaczono 1 zwia¬ zano razem w warunkach podobnych do opisanych powyzej* Zapelniono konce Xbal 1 EcoRl zwiazano razem w drodze laczenia tepych konców w celu odtworzenia miejsca Xbal 1 EcoRIt Xbal zapelnione EcoRl zapelnione" Inicjacja genu HGH -i ¦ TCTAG AATTCTATG T CTAG AATTCTATG—— AGATC TTAAGATAC AGATCTTAA GATAC . Xbal EcoRl147 727 13 Konstrukcja taka odbudowuje równiaz gen odpornosci na tetracykliny* Poniewaz plazald pHGH 107 wykazuje odpornosc na tetrecykllne z proaotora lezacego *w góre", odliczajec od genu HGH /lec proaotor/ to te konstrukcja 22, oznaczone jeko pHGH 207, pozwela na ekspresje genu odpornosci tetrecykllnowej pod kontrole tryptofenowego ukladu proaotor-operetor* Dlate¬ go aleszenlnf powetele w wyniku ligecjl trensforaoweno do E* coli 294 1 kolonie eelekcjono- wano na plytkach LB eawierajecych 5 xjg/al tetrecykliny* W celu uzyskanie bezposredniej ekspresji ludzkiego horaonu wzrostu z plazaidu pHGH 207, calkowite ilosc koeórkowaj proteiny otrzynenej z hodowli E* coli 294/pHGH 207, które hodowano do optycznej gestosci równej 1 ne podlozu LB zewie rajecya 10 ug/nl aapicyliny, rozcienczono dziesieciokrotnie na podlozu M9 1 hodowano ponownie do uzyskenie optycznej gestosci 1, poddano elektroforezie SOS na zelu, jek w przypadku opisany* w czesci I zaaieez- czonej powyzej i porównano z danyai z podobnej elektroforezy uzyskenyal dla ludzkiego horaonu wzrostu otrzymanego przez Innych badaczy /0*V* Goeddel i wspól* Natura, 281, 544 /1979/* Ryeunek fig*7 przedstewie fotografie otrzyaanego zeberwionego zelu, gdzies Passa 117 zawie¬ raja, proteinowe zneczniki o róznej znanej wielkosci* Pasmo 2 jeet pesasa kontrolnya rozdzie¬ laj ecya cale ilosc komórkowej proteiny z hodowli E. coli 294/pBR322f Paeao 3 przedetewla roz¬ dziel protein z hodowli E* coli 294/pHGH 107 prowadzonej ne podlozu LB} Peeao 4 przedstawia rozdzial proteiny z hodowli E* coli 294/pHGH 107 prowadzonej na podlozu M9| Paeao 5 przedeta- wia rozdzial protein z hodowli E* coli 294/pHGH 207 prowadzonej ne podlozu LBf Pesao 6 przedstawia rozdzial protein z hodowli E* coli 294/pHGH 207 prowedzonej ne podlozu M9* Gesty prezek w pasale 6 odpowiada ludzkiemu horaonowl wzrostu, co wynika z porównania z podobnymi prazkami w Pasmach 2 - 4* 3ak juz wspoaniano w opisie, organizm E* coli 294/pHGH 207 wzraetajec na podlozu LB bogatym w tryptofan produkuje eniejeze ilosc ludzkiego horaonu wzrostu, w wyniku interakcji tryptofenowego ukledu represor-operator, a w przypedku wzrostu ne podlozu N9 produkuje o wiele wiecej HGH niz E* coli 294/pHGH 107 dzieki wprowadzeniu silniejszego systemu VS try¬ ptofenowego proaotor-operetor w porównaniu z ukladem Lec-promotor-operator w pHGH 107* III* Tworzenie plezaidu o szerokiej ekspresji w celu bezposredniej ekepreeji genów heterologicznych zechodzacej pod kontrole ukladu tryptofenowego proaotor-operetor* Plazmid pHGH 207 wytworzony w poprzednim rozdziele, zostal uzyty do wytworzenia fragmentu DNA, zawierajecego kontrolne elementy tryptofenowego operonu /z usunietym atenua- torea/ i stworzenia plazmidowego "wektora ekspresji" odpowiedniego do bezposredniej ekepreeji róznych strukturalnych insercji genu* Strategia wytworzenia plezaidu o szerokiej ekepreeji polega na usunieciu tryptofenowego obszaru kontroli z pHGH 207 w drodze trawienia EcoRI i inssrcji do plazaidu pBRH 1 wytrawionego EcoRI uzytego w czesci I powyzej* pBRHl jak juz wczesniej wspoaniano, Jeet plazmidem odpornym na dzialanie aapicyliny, zawlerejecya gen od¬ pornosci wobec tetracykliny, który jeet jednak wrazliwy na tetrecykllne z powodu nieobecnos¬ ci odpowiedniego ukladu operetor-promotor* Powetaly plazald pHKYl, którego konstrukcje bardziej ezczególowo opisano ponizaj 1 pokazano na rysunku fig*8, jeet odporny zarówno na ampicyline jak i na tetrecykllne, zawiera tryptofanowy uklad proaotor-operetor* brak au Jednek tryptofenowego etenuetoreii zawiera unikalne aiejsce Xbal dyatalne w stosunku do tryptofenowego ukladu proaotor-operetor* Trypto¬ fanowy operetor-promotor 1 unikelne aiejece Xbel ee ograniczone aiejscemi EcoRI tak, ze fragment zawierejecy proaotor-operetor Xbal aozna usunec w celu insercji do innych struktu¬ ralnie plazmidów, zawierejecych gen* Z drugiej etrony strukturalne heterologlczne geny aozne wprowadzic, albo w aiejece Xbal lub /po czesciowym trawieniu EcoRI/ do aiejsce EcoRI, dystal- nego w stosunku do obszeru tryptofanowej kontroli, w kazdym przypedku tak, aby doetac sie pod kontrole ukledu tryptofenowego operetor-promotor* Plazmid pHGH 207 poddeno trewieniu z EcoRI i wyodrebniono EcoRI fregment 23, zawiera¬ jecy trp proaotor, etoeujec PAGE z kolejno nastepujace elektroelucje* Plazald pBRHI trawiono EcoRI i na odciete konce dzialano bakteryjne elkallczne fosfa¬ taze /BAP/ /1/jg, w 50 aM tria pH 8 i 10 aM MgCl2, 30 minut, temperature 65°c/ w celu usu¬ niecia grup foeforenowych na wystajecych koncach EcoRI* Nadaier bakteryjnej elkelicznej foe- fatazy ueunieto etoeujec eketrekcje fenolea, chloroforaea 1 wytrecenie etenolea*14 147 727 Powstaly liniowy DNA 7a* z powodu braku grup fosforanowych na Jego wystajacych koncach w trakcie procesu llgacjl bedzie akceptowal jedynie lnsercje, których komplementar¬ ne lepkie konce sa fosforylowane, ale nie bedzie ulegal san recyrkulacjif pozwalajec na latwiejsze wykrycie plazmidów, zawierajecych lnsercje* Fragment EcoRI otrzymany z pHGH 207 i liniowego ONA otrzymanego z pBRHl poleczono w obecnosci llgezy TA w sposób opisany 1 zwiazano* Czesc powstalej mieszaniny trasforaowano do E* coli szczep 294, jak powyzej opisa¬ no 1 hodowano na plytkach na podlozu L8 zawierajecym 5 ug/ml tetracykliny i wyselekcjonowano 12 kolonii odpornych na dzialanie tetracykliny* Wyizolowano plazmid z kazdej kolonii i zbadano na obecnosc insercji DNA za pomoce analizy restrykcyjnej endonukleezy z zastosowa¬ niem EcoRI i Xbal* Oeden plazmid zawierejecy wstawke oznaczono jako pHKY 1* IV* Tworzenie plazmidu zawierajecego tryptofanowy operon, zdolnego do ekspresji podatnej na specyficzne rozszczepienie proteiny powstalej w wyniku fuzji 1 skladajecej sie z 6 aminokwasów peptydu trp lidera i ostatniej trójki trp E polipeptydu /oznaczonego LE*/ i z produktu heterologlcznego strukturalnego genu* Tworzenie plazmidu zdolnego do ekspresji LE#proteiny powstalej w wyniku fuzji przebiega w naetepujecych etapachs a/ przyjecie fragmentu genu, zawierajecego kodony do dystalnego obszaru LE'poli¬ peptydu, posiadajecego lepkie konce Bgl II i EcoRI odpowiednio przy koncu 5*1 koncu 3#kodu- jecej nici, b/ wyeliminowanie z plazmidu SOM 7 <£ 2 kodonów dystalnego obszaru fragmentu genu LE#1 fragmentu trp 0 genu i insercja fragmentu utworzonego w etapie 1, odbudowanie sekwencji LE*kodonu tuz obok heterologlcznego genu odpowiadajecego za eoaatostatyne* 1. 3ak przedstawiono na rysunku flg*9a plazmid pSom7 A 2 trawiono Hind III z kolejnym trawieniem za pomoce lambda egzonukleazy /egzonukleazy 5* do 3*/ w warunkach dobra¬ nych tak, aby nastepilo trawienie poza miejscem restrykcji Bgl II w obrebie kodujecego LE#* 20 ug pSoM 7 & ?. wytrawionego Hind III rozpuszczono w buforze /20 mM bufor glicynowy, pH 9,6, 1 mM MgClgt 1 "M J* -merkaptoetanolu/* Na powstale mieszanine dzialano 5 jednostkami lambda egzonukleazy w clegu 60 minut w temperaturze pokojowej* Otrzymane mieszanine reakcyjna ekstra¬ howano fenolem, ekstrahowano chloroformem i wytracono etanolem.W celu ostatecznego utworzenia reszty EcoRI przy dystalnya koncu fragmentu genu LE# 32 zsyntetyzowano priaer pCCTGTGCATGAT stosujec ulepszone metode trójestru fosforowego /R*Crea i wspólpr*, Proc*Nat*l Acad. Sci. USA 75, 5765 /1978/ i hybrydyzowano z pojedynczo zakonczo¬ nym koncem fragmentu genu LR* otrzymanego w wyniku trawienia w obecnosci lambda egzonukleazy* Hybrydyzacje przeprowadzono w opisany ponizej sposób* 20/ug produktu trawienia Hind III plazmidu pSom 7 2, na który dzialano lambda egzonukleazy* rozpuszczono w 20 yul wody i poleczono z 6/ul roztworu zawierajecego okolo 80 plkomoli opieanego powyzej 5#-fosforylooligonukleotydu* Zeyntetyzowany fragment zhybrydyzowano z koncem 3* sekwencji kodujecej LE#i pozo¬ stale czesc wolnej nici zapelniono atosujec procedure z polimeraza I Klenowa opisana powyzej, z zastosowaniem dATP, dTTP, dGTP i dCTP.Mieszanine reakcyjne ogrzano do temperatury 50°C, a nastepnie schlodzono wolno do 10°C, po czym dodano 4 yul enzymu Klenowa* Mieszanine reakcyjne inkubowano 16 minut w tempera¬ turze pokojowej, nastepnie 30 minut w temperaturze 37°C, po czym reakcje zatrzymano dodajec 5/ul, 0,25 aolarnego roztworu EOTA* Mieszanine reakcyjne ekstrahowano fenolem, chloroformem, a nastepnie wytrecono etanolem* DNA poddano nastepnie rozszczepieniu enzymem restrykcyjnym Bgl II* Fragmenty rozdzielono za pomoce PAGE* Autoradiogrem zelu wykazuje obecnosc fragmentu 32 znaczonego P o spodziewanej dlugosci okolo 470 bp, który wyodrebniono za pomoce elektro- elucji* 3ak Juz wczesniej zauwazono ten fragment LE#/d/ posiada koniec Bgl II i tepy koniec pokrywajecy sie z poczetkiem primeru* Plazmid pTh*C 1 opisany w czesci I /C/ nosi w sobie strukturalny gen tymozyny alfa 1 zaczepiony przy jego 5* koncu nici kodujecej w miej ecu EcoRI i przy 3* koncu w miejscu BamHI* Oak widac z rysunku fig«9, gen tymozyny zawiera równiez miejsce Bgl II* Plazmid pTh •£ 1 zawiera równiez gen specyficznej odpornosci na ampicyline* W celu utworzenia plaz-147 727 15 nldu zdolnego do przyjecia fragmentu LE# /d/ sporzadzonego jak podano wyzeJ, pTh t£ 1 poddano trawieniu EcoRI z kolejnym etapea reakcji polimerazy I Klenowa z dTTP i dATP w celu uzyskania tepych zakonczen EcoRI* W wyniku trawienia Bgl II otrzymanego produktu powstaje liniowy fragment DNA 33, zawierajecy gen odpowiedzialny za odpornosc wobec ampicyliny, 1 na przeciwleglych kon¬ cach lepke pozostalosc Bgl II 1 tepy koniec* Powstaly produkt noze ulec recyrkularyzacji w reakcji z fragmentem LE# /d/v zawieraja,cyn lepki koniec Bgl II i tepy koniec w obecnosci T. ligazy, tworzec plazmid pTrp24 /rysunek fig#9b/* W taki sposób uwalnia sie miejsce EcoRI w polozeniu, w którym nastepuje ligacja tepego konca* Jak przedstawiono na rysunku fig.10, kolejne trawienie pTrp 24 za pomoce Bfl II i EcoRI, polaczone z PAGE 1 elektroelucje daje w wyniku fragment, poaiedajecy kodony polipeptydu LE# /d/ z koncem lepkim Bgl II i z koncem lepkim EcoRI przylegajacym do Jego 3* kodujacego konca* Fragment LE*/d/ 38 moze byc klonowany do miejsca Bgl II plazmidu pSom 7 2 w calu utworzenia proteiny powstalej z fuzji polipeptydu LE* i sornatostatyny pod kontrole tryptofanowego ukladu promotor-operator, jak to pokazano na rysunku fig.10* W calu dokonania tego pozadane jest /l/ czesciowe trawienie EcoRI pSom 7 A 2 w celu ciecia miejsca 'EcoRI dystalnego w stosunku do tryptofanowego ukladu promotor-operator. Jak pokazano na rysunku fig*10,i /2/ dalszy wybór sekwencji primera /rysunek fig.9/ w celu pozostawienia systemu odczytywania kodonu i odbudowania miejsca ciecia EcoRI* W tym celu, 16 ug plazmidu pSom 7 A2 rozpuszczono w 200 /ul buforu zawierajecego 20 mM tris, pH 7,5, 5 mM MgCl2# 0,02 detergentu NP^, 100 mM NaCl i podzialano 0,5 jednost¬ kami EcoRI* Mieszanine reakcyjne pozostawiono na 15 minut w temperaturze 37°C, a nastepnie ekstrahowano fenolem, ekstrahowano chloroformem 1 wytrecono etanolem, a nastepnie trawiono Bgl II* Powstaly wiekszy fragment 36 wyodrebniono za pomoce PAGE, a nastepnie elektroelucji* Fragment ten zawiera kodony vLe#/P/< polozonego blizej konca LE'polipeptydu, tzn* w góre liczec od miejsca Bgl II. Fragment 36 poddano nastepnie wiezaniu z fragmentem 38 w obecnosci T. DNA llgazy z utworzeniem plazmidu pSom 7 A 2 A 4, który w wyniku transformacji do E* coli 294 tak jsk opisano wyzej wydajnie produkuje proteine powstale w wyniku fuzji w pelni zre¬ konstruowanego polipeptydu LE#i somatostatyny pod kontrole tryptofanowego ukladu promotor - operator* Proteine powstale w wyniku fuzji, z której mozna odszczepic w specyficzny sposób somatostatyne, dzieki obecnosci aetioniny r\M koncu 5' sekwencji somatostatyny, rozdzielono za pomoce SDS elektroforezy na zelu poliakryloamidowym w sposób opisany powyzej* Produkt w postaci tej proteiny tworzy najbardziej wyrazny prezek w Pasmie 6 przedstawionym na rysunku fig*ll, dyskutowane bardziej szczególowo w czesci VI* V* Tworzenie systemu ekspresji dla fuzji trp LE# polipeptydu, w którym wprowadza sie odpornosc na tetracykline pod kontrole tryptofanowego proaotora-operatora* Strategia tworzenia nosnika ekspresji zdolnego do otrzymywania szerokiego wach¬ larza bakteriologicznego polipeptydowych genów dla ekspresji w postaci trp LR* powstalych w wyniku fuzji protein pod kontrole tryptofanowego operonu wymaga konstrukcji plazmidu o nastepujecych wlasciwosciacht 1* Odpornosc na tetracykline, która zaniklaby w przypadku gdyby uklad promotor- operator kontrolujecy geny warunkujece te opornosc zostal usuniety* 2* Usuwanie ukladu promotor-operator kontrolujacego odpornosc na tetracykline i recyrkularyzowanie przez ligacje do heterologicznego genu i tryptofanowego ukladu promotora- operatora we wlasciwej fazie odczytywania, przez co przywraca sie odpornosc na tetracykline, dzieki czemu mozliwa jest identyfikacja plazmidów, zawierajecych wleczony heterologiczny gen* W zwiazku z charakterem planowanych insercji, obiekt powinien tworzyc liniowe czesci DNA, posiadajece pozostalosc Pst przy Jego koncu 3* 1 pozostalosc Bgl II przy jego 5* koncu, przyleczajec gen zdolny do specyficznej odpornosci na tetracykline w przypadku podda¬ nia kontroli ukladu promotor-operator* 3ak przedstawiono na rysunku figury 12, plazmid pBR322 poddano trawieniu Hlnd III i wystajece konca Hind III kolejno trawiono nukleaze SI* Trawienie SI nukleaze polega na dzialaniu na 10 /ug pBR322 rozszczepionego Hlnd III w 30/til buforu SI /0,3 M NaCl, 1 mM ZnCl^,16 147 727 25 mM octanu sodu, pH 4,6/ 300 Jednostkami nukleazy SI w clegu 30 minut w teropstaturza 15°C* Reakcje przerwano dodajec 1ul roztworu haaujecego dzialania 30 x SI nukleszy /0,8 H zasady Tria, 50 mM EDTA/, Mieszanina ekstrahowano fenolem, chloroforaea 1 wytracono proteina etanole** a nastepnie trawiono EcoRI Jak oplaano wyzej i otrzymano duzy frag&ant 46 stopu¬ jac PAGE i elektroelucje. Otrzymany fragment poaiada pierwszy EcoRI lepki koniec i drugi tepy koniec, którego nic kodujaca zaczyna eie od nukleotydu tymidyny* Nizej przedstawia eie Jak wytrawiona pozostalosc SI trawiona Hind III, zaczyna¬ jaca eie od tymidyny moze byc przylaczona do pozostalosci Bgl II, na które dzialano polimo- raza Klanowa w calu rekonstrukcji restrykcyjnego miejeca Bgl II• Plazmid pSom 7 A 2 przygotowany w sposób podany w czesci I poddano trawieniu Bgl II i wytworzono Bgl II lepkie konce przemieniono w dwunlciowe za pomoce procedury z zasto¬ sowaniem polimerazy Klanowa I, atoeujec wszystkie 4 dezoksynukleotydowe trój fosforany* Rozazczepienie EcoRI powetalego produktu z kolejnym stosowaniem PAGE i elaktroalucji malego fragmentu 42 daje liniowe czesc DNA zawierajacego tryptofanowy uklad promotor-operator i kodony LE* aakwancjl polozonej "w góre* w atoaunku do miejsca Bgl II /LE*/P/» Produkt posia¬ dal koniec EcoRI 1 tepy koniec, powataly w wyniku wypelniania w aleJecu Bgl II, Miejece Bgl II ' rekonstruuje elf w wyniku polaczenia tepego konca fragmentu 42 z tepym koncem fragmentu 46* W ten epoeób dwa fragmenty ulegly ligacJi w obecnosci T. DNA llgazy, tworzac zamkniety plazmid pHKY 10 /patrz rysunek fig.12/, który namnozyl sie w wyniku transformacji do komórek E, coli azczepu 294, Komórki odporne na dzialania tetracykliny noezace zrekoabinowany plazmid pHKY 10 rozmnozono, plazmidowy DNA wyekstrahowano i trawiono kolejno Bgl II i Pet, a nastepnie za pomoce PAGE i elektroelucjl wyodrebniono wielki fragment, liniowe czesc DNA poeiadajece lepkie konce Pat i Bgl II, Tan fragment DNA 49 zawiera poczatek replikacji i kolejno próbowany znajduje zastosowanie w roli pierwszego skladnika w konstrukcji plazmidów, w których zarówno geny kodujeca trp LE# polipeptydy protein powstalych w wyniku fuzji Jak i gen odpornosci tatracyklinowej ae pod kontrole tryptofanowogo ukladu promotor-operator* Plazmid pSOm 7 A 2 A 4, otrzymany sposobem opisanym wczesniej w czesci IV, mozna poddac przemianom w calu uzyskania drugiego ekladnika syeteau umozliwiejecego otrzymywanie szerokiego wachlarza heterologicznych genów strukturalnych, Oak pokazano na ryaunku fig, 13, plazmid poddano czesciowemu trawieniu EcoRI /patrz czesc IV/ z kolejnym trawieniem Pet i wyodrebniono fragment 51 zawierajecy uklad trp promotor-operator, atoaujec PAGE i alektroelucje. Czesciowe trawienie EcoRI bylo konieczne dla otrzymania fragmentu, który zoetel odezczapiony w eeeiedztwie konca 5# genu somatosta- tyny, ale nie zoatal odezczapiony w aiajacu EcoRI wystepujacym pomiedzy genem odpowiadajecya za odpornosc ampicylinowe i ukladem trp oparator-proaotor. Odpornosc amplcyllnowa stracone w wyniku ciecia Pat I w ep gania moglaby byc zachowana w wyniku ligacjl z fragmentem 61, Trzeci ekladnlk, atrukturalny gen tyaozyny alfa 1, otrzymano w wyniku trawienia EcoRI 1 BamHI plazmidu pThoCi, Fragment 52 oczyszczono za pomoce PAGE i elektroelucjl.Trzy fragmenty genowe 49, 51 i 52 mozna teraz poddac ligacji w odpowiednia ukla¬ dzie. Jak pokazano na ryaunku fig, 13, z wytworzeniem plazmidu pTh<^7Al A4, który mozna wyeelekcjonowac dzieki zachowaniu odpornosci na tetracykline i ampicyline. Plazmid po trans¬ formacji do E,coli azczepu 294 i hodowli w warunkach opisanych w czesci I, wykazuje ekspres¬ je trp LE# pollpeptydowej proteiny, która powstala w wyniku fuzji,i z której mozna specyficz¬ nie odszczepic tymozyne alfa 1, dzialaniem bromocyjanu, W przypadku, kiedy inne strukturalne heterologiczne geny poaiadajece konce EcoRI i BemHI podda eie podobnej ligacji ze skladnika¬ mi pochodzacymi z pHKy 10 1 pSom 7A2 ^4, to równiez w wydajny sposób bedzie mozna otrzy¬ mac trp LE* polipeptydowe proteiny powetala w wyniku fuzji. Rysunek fig,ll ilustruje rozdzial za pomoce elektroforezy SDS na poliakrylowya zelu celosci komórkowych protein z traneforman- tów E, coli azczepu 294, najciemniejaze prezkl w kazdym przypadku oznaczaje proteiny powstale w wyniku fuzji, wytworzona pod kontrole ayateau tryptofanowogo promotor-operator. Na rysunku fig,11 paaao 1 Jeet pasmem kontrolnym, które segreguje cale ilosc proteiny komórkowej z £• coli 294/pBR322, Pasmo 2 zawiera aoaatoatatynowy produkt powetaly w wyniku fuzji, z plaz¬ midem pSom 7A264 otrzymanego sposobem z czesci IV, Pasmo 3 przedstawia produkt ekspresji pSom 7^U4 zawierajecy aomatoatatyne, Paaao 4 zawiera produkt ekspresji pTh oC 7A1A4,147 727 17 podczas gdy pasmo 5 zawiera produkt ekspresji plazmidu otrzymanego podczas reakcji ligacji fragmentów otrzymanych z pHKY-10 1 pSoa 7 A 2 A 4 z genea strukturalnym ogranlczonya EcoRI /BaaHI kodujacym ludzka prolneuline i przygotowanym przez nas* Pasmo 5 i 7, odpowied¬ nio, zawieraja, w postaci najciemniejszego prazka, trp L£# polipeptydowa. proteine powstale w wyniku fuzji, z której mozna odszczepic lancuch B i A ludzkiej insuliny* Strukturalne geny insuliny B i A otrzymano w drodze trawienie EcoRI i BaaHI odpowiednio plazmidów pIBI i PIA11, których konstrukcja opisana w D*V* Goeddel i wspólpr*, Proc*Net#l Acad* Sci. USA 76, 106 /1979/» Pasmo 8 zawiera znaczniki wielkosci* Jakkolwiek w niniejszya opi9ie wynalazku posluzono sie E. coli, to w roli komórek- gospodarza mozna zastosowac inne enterobacteriacae w celu ekspresji i jako zródla trp operonów, sposród których mozna wymienic jako przykladowe Salmonella typhlmurium i Serratia marcesans* Zastrzezenia patentowe 1. Sposób rozszczepiania dwuniciowego DNA w dowolnie wybranym miejscu, .znamienny tym, ze a/ przeksztalca sie dwuniclowy DNA w Jednoniclowy w regionie otaczajecym wybrane miejsce rozszczepienia, b/ do jednonlclowego regionu utworzonego w etapie a/ hybrydyzuje sie komplementarny primer bedecy jednoniciowym DNA, którego koniec 5* jest usytuowany naprzeciw nukleotydu przyleglego do wybranego miejsca rozszczepienia, c/ odbudowuje sie te czesc drugiej nici, wyeliminowanej w etapie a/ rozmieszczonej w kierunku 3* od tego priaera na drodze reakcji z pollmeraze DNA w obecnosci dezoksytrlfosforanów adeniny, tyminy, guaniny i cytozyny oraz d/ trawi sie pozostale pojedyncze nic DNA wystajace poza wybranym miejscem rozszczepienia* 2* Sposób wedlug zastrz*l, znamienny tym, ze etap c/ i d/ przeprowadza sie równoczesnie na drodze reakcji z polimeraze DNA, która polimeryzuje w kierunku 5* 3#, Jest egzonukleityczna w kiarunku 3* ¦ ) 5# i nieegzonukleityczna w kierunku 5# ¦¦ 3#* 3* Sposób wedlug zastrz*2, znamienny tym, ze stosuje eie polineraze I Klonowa*147 727 pCATG.AATTCATG 3 GTACTTASGTACp- * +H DNA Ligoza [EcoRI.PAGE Trpp.0 L^EcoRI 5 7 1 Eco R] EcoRIEcoRI [+T4 DNA Ligoza JJ' EcoRI-^Lex_i^JL I pSOMh Eco RI \ / *v—y +T4 DNA Ligazo o-4f Ap" D-SOM-fuzja PSOM742 FIG. 2147 727 afc - $$k —• .#• ~ "•*"•'¦* lQ3r -*-"i"' i-iilw '*H*IU ^«y fc^w, $?3v J^_"_ jpjf ;g;- tójf # i F/&.3.Togi lrp mRNA Togi AATGAGCTGTTGACAATTMTCATCGAACTAGTTAA^ I T 1 rybOSOmowe SSW^tadon '"T lrp operator lrp promotor migocji translacji EcoRI trp ;p.o 'LE' FIG.A Togi Eco RI _ATG! Tagi Togi D' Togi —j-EcoRI Togi TogI czesciowe trawienie, FAGE \ trp po 12 T Togi _T AGC147 727 EcoRI AATTC G Trp p.o 12 EcoRI Togi T AGC 1 \v£J 1 ^^ 13 ^ + HDNA Ligozo L° vTAGI-XboI *<£.-& Xbal **\ wypelnienie Bom HI I PHS32 (brakujacy Eco RI-XboI BomHI FIG. 5 pTrpK Ap' HGHgen jEcoRI 19 I Wenow Pol I ldATP.dTTP 2Q BomHI, PAGE 4 17 wypelnienie Eco RI wypelnienie AATTC -JftH3fiQ -RnmHT BomHI TTAAG 21 +V* DNA Ligaza FIG.6147 727 12 3 4 5 6 7 HCH &*2 ^.HGH gen EcoRI.PAGE Eco RI Trp p.o Eco RI (5'P) 9Q T(5'P) AL XboI 6 pBRHi EcoRI,BAP EcoRI EcoRI /DH5' A 2o.I+T4 DNA Ligoza FIG.8147 727 |'-90M fuzja Hindl pS0M?A2 (a ITrowienieA egzonuWeoza 5' do 3' dopelhiajqcej nici dla uzyskonio LE'strukturalnego genu (b)Ameal oligonucleotide, 32pCCTGTGCATGAT (26), do dystahego kofico nici kodujacej LE' (c)Klenow PoU frdoJpolimerazal^dNTP^s (i egzonukleozo 3'do 5') ^rp3"^3'HindI rBgllprimer 3'HindI Bal U koniec ^^ -Tepy koniec GATCT ATCATGCACAGG A——TAGlACGTGTCCp32 J*9'[J ~ 29 FttGE — ApK FIG.9a Gen tymozyny KlenCM Poil fcoRI 01 ?dTTP.dATP , 30 PTha I TCP* c LE'(d) Bali G 29 ¦31: •32 BgU,PAGE ^T EcoRI tgftpSK wyp*ienie ^ Bgll Ap' Bali pTrp2C FIG.9b147 727 -if' D^SOMfuzjo H pS0M7A2 lEcoRI l czesciowe trawienie 35 |BglI,PAGE $f EcoRl TSEcoRI \Q" VV J h / EcoRl A 34 pTrp24 jBgll 2Z' EcoRI,fi<\GE BglU LE'(d) 38 +T*. ONA Ligaza LE-SOM fuzjo 29 PSOM7a2M FIG.10 :EcoRI 3 4 3 6 7 ( /=/&JJ.147 727 a?OQ|£ "sF^^^a CL < CMi o Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 egz.Cena 400 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.